KR100852284B1

KR100852284B1 - 형광 이미징법을 이용한 ５－ｈｔ６ 수용체 리간드 고효율검색법

Info

Publication number: KR100852284B1
Application number: KR1020060064037A
Authority: KR
Inventors: 임혜원; 윤태영; 김현지; 윤형문
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2006-07-07
Filing date: 2006-07-07
Publication date: 2008-08-14
Also published as: KR20080004994A

Abstract

본 발명은 형광 이미징법을 이용한 5-HT₆ 수용체 리간드 고효율 검색방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 기존의 방사선 동위원소법이나 재현성이 없는 형광이미징법의 5-HT₆ 수용체 리간드 검색방법의 단점을 극복하여 96-웰 플레이트 형태로 형광 이미징법을 이용한 5-HT₆ 수용체 리간드 고효율 검색법(high-throughput screening, HTS)과, YTH(yeast two-hybrid) 검색법을 이용한 5-HT₆ 수용체에 결합하는 Fyn 단백질 발견을 통한 Fyn 단백질이 5-HT₆ 수용체의 기능을 증가시킴을 HTS의 활용법에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 우울증, 인지 기능, 알츠하이머 병 등과 관련된 뇌질환의 예방 및 치료에 유용하다.

5-HT6 수용체, 형광 이미징법, 고효율 검색법, YTH(yeast two-hybrid) 검색법, Fyn 단백질

Description

형광 이미징법을 이용한 ５－ＨＴ６ 수용체 리간드 고효율 검색법{Cell-based high-throughput screening method of 5-HT6 receptors using fluorescence calcium imaging}

도 1은 FDSS6000 고효율 검색(HTS) 기기의 사진 및 기기 구성도를 나타낸 것이다.

도 2는 플루오-4(Fluo-4) 형광 염료를 이용한 FDSS6000 검색 방법에서 96-웰 상에서의 5-HT₆ 수용체와 여러 가지 키메릭(chimeric) G 단백질을 발현한 HEK293 세포에서 5-HT 자극에 의한 5-HT₆ 수용체 활성을 통한 칼슘 시그널를 나타낸 것이다 [왼쪽 도면은 5-HT₆ 수용체와 여러 가지 키메릭(chimeric) G 단백질을 발현한 것을 나타낸 것이고, 이와 같은 방식으로 오른쪽 도면은 5-HT₇ 수용체와 각각의 키메릭(chimeric) G 단백질을 발현한 결과를 나타내는 것이다. 즉, 5-HT₆과 5-HT₇ 수용체에 대한 여러 가지 키메릭(chimeric) G 단백질간의 5-HT 자극에 의한 각 수용체의 활성을 통한 칼슘 시그널을 나타낸 것이고 5-HT₇보다 5-HT₆ 수용체 시스템의 효능이 우수함].

도 3은 96-웰 상의 in vitro 세포기반 HTS 검색법상 5-HT₆ 수용체 선택적 리간드 검색을 위한 고효율 검색 재현성 및 시그널 효율성을 증명하는 Z'(시그널 윈도우) 값에 관한 그래프를 나타낸 것이다.

도 4는 FDSS6000 기기를 이용한 세포기반 고효율 검색법으로 구한 5-HT₆ 수용체에 대한 활성제와 길항제에 대한 농도-의존성을 보여주는 그래프이다.

도 5는 YTH(yeast two-hybrid) 검색법을 이용한 5-HT₆ 수용체 결합 Fyn 단백질 발견 결과

도 6은 5-HT₆ 수용체-Fyn 단백질 결합의 GST-풀 다운(full down) 및 CO-IP(co-immnonoprecipitation) 결과이다.

도 7은 FDSS6000 기기를 이용한 세포기반 고효율 검색법을 이용하여 5-HT₆수용체 결합 단백질인 Fyn에 의한 5-HT₆ 수용체 활성 조절을 보여주는 그래프이다.

본 발명은 형광 이미징법을 이용한 5-HT₆ 수용체 리간드 고효율 검색방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 기존의 방사선 동위원소법이나 재현성이 없는 형광이미징법의 5-HT₆ 수용체 리간드 검색방법의 단점을 극복하여 96-웰 플레이트 형 태로 형광 이미징법을 이용한 5-HT₆ 수용체 리간드 고효율 검색법(high-throughput screening, HTS)과, YTH(yeast two-hybrid) 검색법을 이용한 5-HT₆ 수용체에 결합하는 Fyn 단백질 발견을 통한 Fyn 단백질이 5-HT₆ 수용체의 기능을 증가시킴을 HTS의 활용법에 관한 것이다.

신약 개발 분야에서 약물의 타겟으로 세포막 수용체(cell-surface receptors)가 전체의 60%를 차지하고 그 중에서도 GPCR(G-protein coupled receptors)을 작용점으로 하는 약물이 2000년도의 경우에는 상위 100대 품목 중에서 26개였다. GPCR을 작용점으로 갖는 약물들은 치료 유용성 및 시장성 측면에서 다른 어떤 계열의 약물들보다도 성공적으로 개발되고 있다. 그러나, 기존 GPCR을 타켓으로 하는 기존 분석법은 대부분 방사선 동위 원소를 이용한 시간 및 비용이 많이 드는 방법으로 좀 더 많은 화합물(more compound)을 좀 더 많은 GPCR(more targets)에 분석하기 위해서는 비방사선 & 속도(non-radiometric & speedy) 분석법이 필요하다. 특히, GPCR은 세포막에 존재하는 7-TM(7-transmembrane)으로 구성된 막 단백질들로 단백질 차제의 3차원적 배열 및 활성 부위를 유지해야하는, 즉 세포의 활성이 유지되는 상태에서인 세포기반 HTS(high-throughput screening) 법이 요구된다.

따라서 본 기술에서는 GPCR의 신호전달기전에서 수용체를 인식하는 부분은 유지하고 다양한 이펙터(effector)에 작용하는 G-단백질 부분을 PLC(phospholipase C)/IP₃ 기전을 인식하는 부분으로 치환한 키메릭(chimeric) G-단백질을 이용하여 모 든 GPCR들이 GPCR/Gq/PLC/Ca²⁺ 신호기전으로 작동하게 하여 가장 빠르게 리간드를 검색 할 수 있는 Ca²⁺-센싱 HTS법을 구축하고 그 중에서도 cAMP를 증가시키는 Gs류 계열의 GPCR을 위한 검색법을 타겟으로 하였다.

GPCR 관련 수용체 중에서, 세로토닌(5-HT) 수용체는 현재까지 5-HT₁부터 5-HT₇까지 각 각의 아형까지 포함하여 총 15 종이 알려져 왔고, 이들은 우울증, 정신 분열증, 불안증, 수면장애 등의 정신질환과 인지 기능 및 알츠하이머 병에 관련이 있는 것으로 밝혀져 왔다[Hoyer & Martin, Neuropharm. 1997]. 가장 먼저 발견된 5-HT₁ 수용체를 다량 발현시킨 쥐들은 스트레스 상황에 직면했을 때 더 활동적으로 마치 항우울제를 복용한 것처럼 행동했다고 연구자들은 밝혔다[Heisler et al., PNAS, 1998]. 또한, 5-HT₁ 수용체와 결합하여 우울증 유발에 핵심적인 역할을 하는 것으로 보이는 단백질은 아주 최근 결과인 '사이언스' 최신호(2006년 1월)에 발견되었고 구체적으로 p11이라고 불리는 단백질이 우울증과 관련된 뇌의 신경전달물질인 세로토닌에 대한 세포의 반응을 조절한다는 사실을 발견했다고 밝혔다[Svenningsson et al., Science, 2006].

그 중에서 5-HT₆ 수용체는 가장 최근에 염기서열이 밝혀진 세로토닌 수용체로서 아직까지 정확한 적응증은 밝혀지지 않지만 주로 우울증, 인지기능, 알츠하이머 병 등에 관련이 있다고 알려져 있다. 현재까지 5-HT₆ 수용체에 작용하는 약 물로는 크로자핀(clozapine)과 같은 향정신병 약물이 비선택적으로 결합하는 것으로 알려져 있고, 5-HT₆ 수용체에 선택성을 갖는 화합물로는 SB258585가 있으나 이 화합물은 아직까지 관련 질환의 치료용으로 사용이 되고 있지 않다. 따라서 5-HT₆ 수용체의 선택적 리간드 개발이 이루어 지지 못하는 상황에서 5-HT₆ 수용체가 우울증, 인지기능, 알츠하이머 병 등에 관련된 뇌세포에서 정확한 기능 및 신호전달기전은 전혀 알려지지 않고 있는 실정이다.

이에, 본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 연구 노력한 결과, 종래의 방사선 동위원소를 이용한 cAMP를 측정하는 시간 및 비용이 많이 드는 방법이 아닌, 키메릭 G-단백질이나 G15 또는 G16 단백질을 이용하여 5-HT₆ 수용체 신호전달 기전을 기존의 수용체/Gs/아데닐레이트 사이크라제(adenylate cyclase)/cAMP 증가 기전이 아닌 수용체/Gq/PLC/Ca²⁺ 신호기전으로 작동하게 하여 빠르게 형광염료를 이용하여 칼슘변화를 측정하는 형광 이미징법에 기초한 5-HT₆ 수용체 타겟 빠른 세포기반 고효율 검색법을 구축하고자 하며 이러한 고효율 검색법은 5-HT₆ 수용체에 결합하는 선택적 리간드 개발뿐만 아니라 5-HT₆ 수용체와 결합하는 핵심적인 단백질을 이용한 광범위 특성 연구를 위한 고효율 검색방법을 확립함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 따라서 본 발명은 5-HT₆ 수용체 세포기반 고효율 검색법의 다양한 G-단백질을 이용한 선택적 조절 물질 개발에 유용하고 그 개발기간을 단축시키는 고효율 검색 방법을 형광 이미징 HTS 측정법을 이용하여 96-웰 플레이트 형태로 확립한 5-HT₆ 수용체 선택적 리간드 HTS 검색법과 YTH(yeast two-hybrid) 검색법을 이용하여 확보된 5-HT₆ 수용체 결합단백질 Fyn을 이용한 HTS 활용법을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명은 형광 이미징법을 이용하여 96-웰 플레이트 형태로 확립한 5-HT₆ 수용체 선택적 리간드 고효율 검색법을 그 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 YTH(yeast two-hybrid) 검색법을 이용하여 확보된 5-HT₆ 수용체 결합단백질 Fyn을 이용한 HTS 활용법을 포함한다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

5-HT₆ 수용체 선택적 리간드 검색법을 구축하는 과정으로서,

(1) 5-HT₆ 수용체와 키메릭 G-단백질을 트랜스펙션(transfection)하고 조건 비교 실험을 통해서 최적의 리간드 검색을 위한 세포주와 G-단백질을 선정하는 단계;

(2) 상기 선정된 세포주에서 5-HT₆ 수용체와 상기 선정된 G-단백질을 FBS(fetal bovine serum)가 포함된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 상에 트랜스펙션한 조건 하에서 96-웰 플레이트에 상기 선정된 세포주를 도입하여 형광성 표지 염료로 표지하고, 별도로 5-HT₆ 수용체를 활성화시킬 농도의 5-HT₆ 수용체 활성제를 포함하는 96-웰 플레이트와 버퍼만을 포함하는 96-웰 플레이트 각각 준비하여, 상기 5-HT₆ 수용체 활성제를 포함하는 96-웰 플레이트와 버퍼만을 포함하는 96-웰 플레이트에 대한 Ca²⁺ 시그널을 이용하여 Z'(시그널 윈도우) 값을 구하고 5-HT₆ 수용체에 대한 스트리닝의 효율성을 판단하는 단계; 및

(3) 상기 (2) 단계의 조건 및 세포주가 포함된 96-웰 플레이트 외 별도로 5-HT₆ 수용체를 활성화시킬 상이한 농도의 5-HT₆ 수용체 활성제를 포함하는 96-웰 플레이트를 준비하여, 5-HT₆ 수용체 활성에 따른 Ca²⁺ 시그널을 형광 이미징법으로 구한 후, 상기 활성제에 대한 반응을 그래프로 그리고 상기 그래프로부터 시험 물질의 EC₅₀ 값을 구하여 5-HT₆수용체의 활성제를 검색하는 단계

혹은, (3) 상기 (2) 단계의 조건 및 세포주가 포함된 96-웰 플레이트 외 별도로 5-HT₆ 수용체를 활성화시킬 5-HT₆ 수용체 활성제와 5-HT₆ 수용체 길항제를 각각 포함하는 2개의 96-웰 플레이트를 준비하여, 처리 시간 및 농도 조건에 따른 5-HT₆ 수용체 활성 억제에 대한 Ca²⁺ 시그널을 형광 이미징법으로 구한 후, 상기 억제 제에 대한 반응을 그래프로 그리고 상기 그래프로부터 시험 물질의 IC₅₀ 값을 구하여 5-HT₆수용체의 길항제를 검색하는 단계

를 포함하는, 형광 이미징법을 이용한 5-HT₆수용체의 선택적 조절 물질(활성제 또는 길항제)의 고효율 검색방법을 제공한다.

상기 내용을 구체적으로 설명하면, 첫 번째 단계에서는 HEK293, Cos-7, CHO 각각의 세포주에서 5-HT₆ 수용체와 각각의 키메릭 G-단백질양의 비율을 1 ~ 3 : 3 ~ 1의 비율로 DNA의 양을 조절하여 트랜스펙션한다. 그리고 나서 5-HT₆ 수용체의 내재화를 억제하기 위해 FBS 농도 또는 FBS 유무에 따른 인큐베이션 시간에 따라 비교 실험한다. 최종 결과로 HEK293 세포주에서 5-HT₆ 수용체와 Gα15의 단백질양의 비율을 1:1로 트랜스펙션한 후 1% FBS가 포함된 DMEM 상에 16시간 이상동안 인큐베이션한 조건이 최상의 조건임을 밝혔다.

두 번째 단계에서 HEK293 세포주에서 5-HT₆ 수용체와 Gα15의 단백질양의 비율을 1:1로 1% FBS가 포함된 DMEM 상에 트랜스펙션한 조건 하에서 96-웰 플레이트에 상기 선정된 세포주(HEK293)를 도입하여 형광성 표지 염료로 표지하고, 별도로 5-HT₆ 수용체를 활성화시킬 농도 10^-5M의 5-HT₆ 수용체 활성제를 포함하는 96-웰 플레이트와 버퍼만을 포함하는 96-웰 플레이트 준비하여, 10^-5M의 5-HT₆ 수용체 활성 제를 포함하는 96-웰 플레이트와 버퍼만을 포함한 96-웰 플레이트 대한 Ca²⁺ 시그널을 이용하여 Z'(시그널 윈도우) 값을 구하고 5-HT₆ 수용체에 대한 스트리닝의 효율성을 판단한다.

5-HT₆ 수용체의 활성제를 검색을 위한 세 번째 단계는 HEK293 세포주에서 5-HT₆ 수용체와 Gα15의 단백질양의 비율을 1:1로 1% FBS가 포함된 DMEM 상에 트랜스펙션한 조건 하에서 96-웰 플레이트에 상기 선정된 세포주(HEK293)를 도입하여 형광성 표지 염료로 표지하고, 별도로 5-HT₆ 수용체를 활성화시킬 상이한 농도(10^-11~ 10^-5M)의 5-HT₆ 수용체 활성제를 포함하는 96-웰 플레이트를 준비하여, 5-HT₆ 수용체 활성에 따른 Ca²⁺ 시그널을 형광 이미징법으로 구한 후, 상기 활성제에 대한 반응을 그래프로 그리고 상기 그래프로부터 시험 물질의 EC₅₀ 값을 구함으로써 5-HT₆ 수용체의 활성제 검색이 가능하다.

또한, 5-HT₆ 수용체의 길항제를 검색을 위한 세 번째 단계는 HEK293 세포주에서 5-HT₆ 수용체와 Gα15의 단백질양의 비율을 1:1로 FBS가 포함된 DMEM 상에 트랜스펙션한 조건 하에서 96-웰 플레이트에 상기 선정된 세포주를 도입하여 형광성 표지 염료로 표지하고, 별도로 5-HT₆ 수용체를 활성화시킬 5-HT₆ 수용체 활성제와 5-HT₆ 수용체 길항제를 각각 포함하는 2개의 96-웰 플레이트를 준비하여, 5-HT₆ 수 용체 길항제의 농도를 10^-10~ 10^-5M로 준비하고 이를 먼저 96-웰 플레이트 상의 세포주에 1분 30초간 처리한 후, 1μM의 5-HT를 처리하여 1분 30초간 5-HT₆ 수용체 활성 억제에 대한 Ca²⁺ 시그널을 형광 이미징법으로 구한 후, 상기 억제제에 대한 반응을 그래프로 그리고 상기 그래프로부터 시험 물질의 IC₅₀ 값을 구함으로써 5-HT₆ 수용체 길항제를 검색할 수 있다.

다음으로, 5-HT₆ 수용체의 선택적 신호전달에 관여하는 결합 단백질을 이용한 광범위 특성 연구를 위한 검색 방법으로서,

YTH(Yeast two-hybrid) 검색법을 이용하여 5-HT₆ 수용체와 Fyn 단백질이 결합함을 in vivo 및 in vitro 분석법으로 확인하였고,

상기 조건의 HTS 시스템에서 Fyn 단백질의 과발현으로 5-HT₆ 수용체의 활성이 증가함을 확인하였다.

본 발명에서 사용될 수 있는 5-HT₆ 수용체의 활성제로는 세로토닌(5-HT), 카복사미도트립타민(carboxamidotryptamine, 5-CT), 메톡시트립타민(methoxytriptamine), 트립타민(triptamine) 등, 5-HT₆ 수용체의 길항제로의 예로는 SB258585, 클로자핀(Clozapine) 등을 언급할 수 있고, 사용될 수 있는 형광성 표지 염료의 예는 플루오-4(fluo-4) 염료이다. 또한, 본 발명에서 사용될 수 있는 세포주로는 HEK293, COS7, CHO-K1, CHO-G5A 등이 있다.

현재 형광 이미징법을 이용한 HTS 측정법은 일본 및 미국, 유럽 등에서는 대형 제약회사를 중심으로 G-단백질 커플링된 수용체(GPCRs)를 타켓으로 하는 약물개발에 활용되고 있지만, 96웰 상에서 재현성 있게 구축하는 본 발명과 같은 검색법은 당업자라도 용이한 발명이 아니다. 특히, 5-HT₆ 수용체 검색법도 비슷한 형광이미징 HTS 기기인 FLIPR를 사용하여 구축된 방법이 논문에 발표되었으나[Zhang et al., Eur. J. Pharmacol., 2003], 같은 조건인 HEK293 세포/5-HT₆ 수용체/Gαqs5/에서 시그널이 전혀 재현되지 않으므로, 다양한 G-단백질과 세로토닌 수용체의 탈감각을 억제하는 조건에서 누구나 재현할 수 있는 조건을 구축하여 그 방법을 HTS 재현성 요소인 Z'(시그널 윈도우) 값으로 증명하였고 선택적 리간드뿐만 아니라 결합단백질 활성 검색에도 응용하였다.

이하, 실시예를 들어 본 발명을 상세히 기술할 것이나 본 발명의 범위를 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예

다음에서 형광 이미징 HST 측정을 위해 이용된 기기는 일본 Hamamatsu Photonics 회사의 FDSS6000 HTS 기기이다. 이 기기는 형광 및 발광 이중 검출기(dual detector), 디지털 CCD 카메라, 필터 휠을 탑재하고 3 가지 이상의 약물을 실시간으로 주입할 수 있는 약물 투여 시스템(drug application system)을 내장하 고 있는 신형 세포 기반 HTS 기기이다.

1) 발명에 사용된 세포와 배양 방법

발명에 사용된 세포주는 HEK293 세포주로 세포주들의 배양용액은 둘베코 개질 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM)에 10% 소 태아 혈청 (fetal bovine serum), 1% 페니실린/스트렙토마이신(v/v)을 넣어 사용하고 세포는 95% 공기/5% CO₂의 습한 조건의 배양기에서 온도 36.5 ℃에서 배양하였다. 배양용액은 3 ~ 4일에 한번씩 교체하고 세포는 일주일마다 분주해 주었다.

첫 번째 단계로서 세포주와 G-단백질을 선정하기 위한 과정은 다음과 같다.

각각의 HEK 293, Cos-7, CHO 세포주에서 5-HT₆ 수용체와 각각의 키메릭 G-단백질양의 비율을 1:1, 1:3, 3:1 등의 비율로 DNA의 양을 조절하여 트랜스펙션을 수행하였다. 또한, 트랜스펙션 이후 5-HT₆ 수용체의 내재화(internalization)를 감소시키기 위한 FBS 농도와 인큐베이션 시간을 비교하였다. 최종 비교한 결과 HEK 293 세포주에서 5-HT₆ 수용체와 G15의 단백질양의 비율을 1:1로 트랜스펙션한 후 1% FBS가 포함된 DMEM상에 16시간 이상동안 인큐베이션하는 조건을 택하였다.

2) 발명에 사용된 트랜스펙션 방법

본 발명에 사용된 트랜스펙션 방법은 100 mm에 그 전날 5 x 10⁶ cells로 seeding하고 다음날 LipofectAMINE 2000(Invitrogen)을 이용하여 제시된 절차에 따 라서 5-HT₆ 수용체와 키메릭 G-단백질을 1:1의 중량비로 트랜스펙션하였다. 또한, 이와 별도로 5-HT₆ 수용체의 결합 단백질이 5-HT₆ 수용체의 활성에 어떠한 영향을 주는지에 대한 실험을 하기 위해 사용된 트랜스펙션 방법은 100 mm에 그 전날 5 x 10⁶ cells로 seeding하고 다음날 LipofectAMINE 2000(Invitrogen)을 이용하여 제시된 절차에 따라서 5-HT₆ 수용체와 키메릭 G-단백질과 결합 단백질을 1:1:1의 중량비로 트랜스펙션하였다.

3) FDSS6000용 96-웰 플레이트 세포 배양 조건 및 형광 칼슘 측정법

① 96-웰 플레이트 상에서 세포 배양 조건 형광 칼슘 측정법

FDSS6000 HTS 기기를 이용한 형광 이미징법은 플레이트 아래쪽에서 빛이 투과하여 형광측정이 가능한 96-웰 플레이트(Nunc cat#165305)를 사용하므로 세포를 부유(suspension) 또는 부착(attachment)의 두 조건에서 모두 시험할 수 있다. 본 실험에서는 부착(attachment)된 상태에서 실험을 하였다.

부착 조건에서는 활성 검색 18 ~ 24 시간 전에 폴리-L-라이신(0.02 ㎎/㎖)으로 처리된 96-웰 플레이트에 96-웰 세포 분배기(Titertek 제품)를 이용하여 그 전날 트랜스펙션한 세포를 분주하였다. 한 웰당 세포 수는 5 x 10⁴cells/well의 밀도로 분주해 주었다. HTS 시그널의 재현성을 높이기 위해 수용체 내재화(internalization) 억제 전략을 시도하기 위해서 세럼 스타베이션(serum starvation)을 시켰다. 본 발명에서는 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM)에 1% 소 태아 혈청(fetal bovine serum), 1% 페니실린/스트렙토마이신(v/v)을 넣어 사용하고 세포는 95% 공기/5% CO₂의 습한 조건의 배양기에서 온도 36.5 ℃에서 배양하였다. 실험 당일 96-웰 플레이트에 부착된 세포들은 96-웰 플레이트 자동 세척기기(Bio Tek)를 이용하여 HEPES 완충용액(150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 2 mM CaCl₂, 10 mM HEPES, 10 mM 글루코스, pH 7.4)에서 3회 세척한 후 4 μM 플루오-4/AM와 0.001% 플루로닉(Pluronic) F-127 포함하는 HEPES 완충용액의 실온 조건에서 형광 염료로 표지하고 1시간 반응시킨 다음, HEPES 완충용액으로 다시 2회 세척한 후 최종 부피를 81 ㎕로 조정 후 FDSS6000 기기 측정로 측정하였다. 이는 가장 재현성이 있고 높은 수치의 측정값을 나타냄으로써 이상의 검색조건에서 아래의 실험들을 수행하였다.

② FDSS6000 형광 칼슘 측정법 및 약물 플레이트 준비

칼슘 영상화 기술은 칼슘농도에 민감한 아세톡시메틸-에스테르 형태의 플루오-4/AM을 형광성 칼슘 표지물로 사용하였다. 구체적으로, FDSS6000에 장착된 크세논 램프 4개의 광원을 비추어 컴퓨터 제어 필터 휠(computer-controlled filter wheel)에 의해 여기 파장 480 nm을 선택적으로 세포에 노출시켰다. 매 1.23초 간격으로 데이터를 얻었으며, 515 nm 고대역 통과 여파기(long-pass filter)를 통과하여 들어온 방출 형광(emitter fluorescence light)은 기기 안에 내장된 냉각 CCD 카메라를 지나 디지털 형광 분석기에 의해 96-웰 상에서의 웰 각 각에 대해 평균 480 nm 값으로 얻었다. 모든 영상 데이터와 분석은 하마마쯔 포노닉스(Hamamatsu Photonics)에서 제공된 FDSS6000 전용 프로그램을 이용하였다.

먼저, Z'(시그널 윈도우) 값을 구하고 5-HT₆ 수용체에 대한 스트리닝의 효율성을 판단하기 위하여, 상기 트랜스펙션한 조건 하에서 세포주가 준비된 96-웰 플레이트 외에 별도로 5-HT₆ 수용체를 활성화시킬 농도(10^-5M)의 5-HT₆ 수용체 활성제를 포함하는 96-웰 플레이트와 버퍼(HEPES 완충용액)만을 포함하는 96-웰 플레이트 각각 준비하여, 상기 5-HT₆ 수용체 활성제를 포함하는 96-웰 플레이트와 버퍼만을 포함하는 96-웰 플레이트에 대한 Ca²⁺ 시그널을 구하였다.

상기 측정값으로 조건을 확립한 후,

활성제 실험을 위한 방법으로

세포가 준비된 96-웰 플레이트와는 별도로 5-HT₆수용체를 활성화시킬 상이한 농도(10^-11~ 10^-5M)의 5-HT₆ 수용체 활성제를 포함한 1 개의 96-웰 약물 플레이트를 준비하였다. 대부분의 세포 기반 HTS 기기의 경우 약물 주입에 필요한 액체 애플리케이션 시스템은 있지만 액체 흡입 시스템은 없기 때문에 검색하고자 하는 5-HT 및 다른 활성제 약물을 5 배의 고농도로 HEPES 완충용액에 20 ㎕씩 준비하여 최종 부피인 100 ㎕(부착 상태 배양세포 80 + 5X 5-HT 및 다른 활성제 약물)에서 1/5 희석되어 측정하였다.

또한, 길항제 실험을 위한 방법으로

세포가 준비된 96-웰 플레이트와는 별도로 1 μM의 5-HT₆ 수용체 활성제 및 10^-10~ 10^-5M의 길항제 약물을 각각 포함한 2개의 96-웰 약물 플레이트를 준비하였다. 대부분의 세포 기반 HTS 기기의 경우 약물 주입에 필요한 액체 애플리케이션 시스템은 있지만 액체 흡입 시스템은 없기 때문에 검색하고자 하는 길항제 약물 및 5-HT을 5배의 고농도로 HEPES 완충용액에 27 ㎕씩 준비하여 최종 부피인 135 ㎕(부착 상태 배양세포 81 ㎕ + 5 μM 5-HT + 5X 길항제 약물)에서 1/5 희석되어 측정하였다.

4) FDSS6000 형광칼슘 영상화 기술을 이용한 5-HT₆수용체의 선택적 조절 물질 검색 방법

96-웰상의 in vitro 세포기반 HTS 검색법상 5-HT₆수용체의 선택적 조절 물질 검색법의 재현성을 확인하기 Z'(시그널 윈도우) 값을 구하는 것이 필수적이기 때문에[Zhang et al, Journal of Biomolecular Screening, 1999], 본 발명에서도 Z'값을 구했고 그 값이 7개 플레이트(7회 반복 실험) 이상에서 0.5 이상(Z' value = 0.57)의 우수한 HTS 방법임을 보여 주었다(도 3). 구체적인 FDSS6000을 이용한 검색 5-HT₆수용체의 선택적 조절 물질 검색 방법 조건으로 기존의 논문에서는 약물 전처리 시간이 20분 이상으로 약물 투여시의 반응을 검지할 수 없는 시스템이 지만 본 발명에서는 길항제 투여 시간이 1분 30초로 짧고 약물 투여과정에서도 칼슘 시그널을 측정하는 실시간 검색법으로 길항제 개발뿐만 아니라 활성제도 개발이 가능한 시스템이다.

첫 번째로, 활성제 실험을 위한 방법으로는

최종적으로 25초 기준 측정, 90초간 약물 처리 조건 하에서 기존의 5-HT₆수용체 활성제인 5-HT, 5-CT, 메톡시트립타민(methoxytriptamine), 트립타민(triptamine)을 각각의 농도 범위에서 형광표지 염료인 플루오-4(도 4)를 이용하여 에 5-HT₆수용체 활성에 대한 Ca²⁺ 시그널을 %로 구하였다. 480 nm에서 최고 비율값의 면적을 100%로 잡고 각기 다양한 활성제의 활성 효과를 구한 후 HEK293 세포에 대한 농도-의존성 그래프와 이로부터 EC₅₀ 값을 구하였다(도 4-1). 또한, 상기 조건으로 5-HT₆수용체의 선택적 신호 전달에 관여하는 결합 단백질의 특성 연구에도 사용하였다(도 7).

두 번째로, 길항제 실험을 위한 방법으로

최종적으로 25초 기준 측정, 90초 길항제 전처리, 90초 1 μM 5-HT₆ 수용체 활성제 처리 조건 하에서 기존의 5-HT₆수용체 선택적 길항제로 알려진 SB258585와 크로자핀에 대하여 각 농도 범위에서 형광표지 염료인 플루오-4(도 4)를 이용하여 5-HT₆수용체 활성 억제에 대한 Ca²⁺ 시그널을 %로 구하였다. 즉, 대조약 물(SB258585, 크로자핀)이나 시험물질을 처리하지 않은 대조군에서의 480 nm 비율값의 면적을 100%로 잡고 대조약물이나 시험물질의 억제 효과를 구한 후 HEK293 세포에 대한 농도-의존성 그래프와 이로부터 IC₅₀ 값을 구하였다(도 4-2).

5) YTH(Yeast two-hybrid) 검색법으로 수용체 결합 단백질로의 Fyn 발견

YTH(Yeast two-hybrid) 검색법은 Matchmaker GAL4 two-hybrid system 3을 사용하여 수행하였다. 우선, bait pGBKT7 벡터에 클로닝된 5-HT₆ 수용체와 prey pACT2 벡터에 클로닝된 인간 뇌 cDNA 라이브러리를 각각 yeast strain AH109와 yeast strain Y187에 형질전환하여 그 단백질들을 발현시켰다. 다음으로 두 형질전환된 효모 균주들을 메이팅(mating)하여 영양결핍 메디아 아데닌, 히스티딘, 루이신, 트립신(-Ade, -His, -Leu, -Trp)에서 일차적인 선별을 하고 X-gal indicator plates에서 갈락토시다아제(galactosidase)를 코딩하는 ADE2, HIS3, MEL1 리포터 유전자를 사용하여 이차 선별과정을 거친 후 positive clone들에서 플라스미드를 추출하여 DNA 시퀀싱을 통해 결합하는 단백질을 찾아내었다. 그 중에서 Fyn을 선별하였으며, False positive인지 확인하기 위해서 그 유전자를 Y187에 형질전환하였다. 5-HT₆ 수용체를 발현시키는 AH109와 메이팅하고, 위에서 명시한 바와 같이 진행하여 5-HT₆ 수용체의 결합단백질임을 재확인하였다.

5-HT₆ 수용체의 사이토플라즈믹 도메인(cytoplasmic domain) 3개(C2, C3, C4)를 베이트(bait)로 하여 YTH 검색법으로 Fyn 온코진(oncogene)[non-receptor tyrosine kinase]이 5-HT₆ 수용체의 COOH-말단기인 C4 부분에 결합하다는 사실을 밝히고(도 5), in vitro 분석법인 GST 풀-다운 어세이(pull-down assay)를 진행한 결과 Fyn 단백질[NP_002028.1]은 신경세포 5-HT₆ 수용체와 Fyn의 SH3 도메인에 결합함을 확인하고 co-IP(co-immunoprecipitation) 등 in vivo 결합 어세이로 결합을 확인하였다 (도 6).

6) FDSS6000 형광칼슘 영상화 기술을 이용한 5-HT₆ 수용체 결합 단백질의 기능 분석 방법

YTH(Yeast two-hybrid) 검색법으로 발견된 5-HT₆수용체 결합 단백질인 Fyn을 본 발명에서 사용하였다. 트랜스펙션 방법은 100 mm에 그 전날 5 x 10⁶ cells로 seeding하고 다음날 LipofectAMINE 2000(Invitrogen)을 이용하여 제시된 절차에 따라서 5-HT₆ 수용체와 키메릭 G-단백질과 결합 단백질인 Fyn을 1:1:1의 중량비로 트랜스펙션하였다. 96 웰상 세포 분주시, 내재화된 수용체(internalized receptor)의 기초(basal) 수준을 낮추기 위해서 세럼 스타베이션(serum starvation)을 시켰다. FDSS6000으로 측정 결과 5-HT₆수용체 결합 단백질인 Fyn이 발현된 세포에서는 5-HT₆수용체의 Ca²⁺ 시그널 활성 정도가 증가함을 볼 수 있다(도 7). 이는 다른 5-HT₆수용체의 신호전달을 조절하는 결합 단백질의 동정에도 이 발명이 쓰일 수 있음을 보여주는 예시라 할 수 있겠다.

본 발명에서 확립된 HTS 검색방법을 증명하기 위해서는 기존의 5-HT₆ 수용체의 선택적 물질 검색방법인 FLIPR에서의 EC₅₀과 IC₅₀값과 비교한 결과(표 1), 비슷한 농도 범위의 값을 나타낸다. 기존의 것과 비교했을 때, FLIPR 방법은 20분간 전처리를 하지만 본 발명의 검색법은 실시간 측정이 가능하며, 세로토닌에 관련된 검색법을 확립했다는 점에서 의의가 있다. 또한, 이들 수용체와 결합하는 타겟 단백질 동정에도 이 검색법이 쓰일 수 있음을 볼 수 있다(도 7). 이에 의해, 본 발명에서 확립된 FDSS6000 고효율 검색방법은 5-HT₆ 수용체의 선택적 조절물질 개발과 신호전달을 조절하는 결합 단백질 동정 기간을 단축시키는 1차 검색 방법(primary screening method)으로 사용될 수 있음을 알 수 있다.

FDSS6000 HTS 검색 방법 및 FLIPR를 이용한 5-HT₆ 수용체의 EC₅₀값과 IC₅₀값 비교

화합물명	FDSS6000	FLIPR^*
EC₅₀
5-methoxytriptamine	10 nM	9 nM
5-HT	9 nM	12 nM
Triptamine	9.3 nM	86 nM
5-CT	88 nM	119 nM
IC₅₀
Clozapine	4.3 ㅅM	45 nM
SB258585	42 nM	NA
^Zhang et al, 2003. Characterization of the 5-HT₆ receptor coupled to Ca²⁺ signaling using an enabling chimeric G-protein. European Journal of Pharmacology* 472, 33-38.

이상에서 설명한 바와 같이, 5-HT₆ 수용체의 선택적 조절물질과 이들의 신호전달에 관여하는 선택적 결합 단백질의 광범위 특성 연구를 위한 고효율 검색법을 제공하는 본 발명에 따르면, 기존의 방사선 동위 원소법이나 이미 발표된 재현성이 없는 HTS법의 단점을 극복하여 5-HT₆ 수용체의 선택적 조절물질 개발과 타겟 단백질 동정기간을 단축시켜 신경 세포내에서 5-HT₆ 수용체의 정확한 기전규명을 가능하게 하여 우울증, 인지기능, 알츠하이머 병 등과 관련된 뇌질환의 예방 및 치료에 매우 유용하리라 기대된다.

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(1) 세포주에서 5-하이드록시트립타민(세로토닌) 수용체 6[5-HT₆ 수용체]와 키메릭 G-단백질 양의 비율을 1 ~3 : 3 ~ 1로 DNA 양을 조절하여 트랜스펙션을 수행한 후 FBS(fetal bovine serum) 농도와 인큐베이션 시간을 비교 실험하여 최적의 세포주와 G-단백질을 선정하는 단계;

(2) 상기 선정된 세포주에서 5-HT₆ 수용체와 상기 선정된 G-단백질을 FBS가 포함된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 상에 트랜스펙션한 조건 하에서 96-웰 플레이트에 상기 선정된 세포주를 도입하여 형광성 표지 염료인 플루오-4(fluo-4) 염료로 표지하고,

HTS(고효율검색법)의 재현성 요소인 Z'(시그널 윈도우) 값을 [Zhang et al, Journal of Biomolecular Screening, 1999]의 방법으로 구하여 0.5 이상(Z' value = 0.57)임을 확인하고, 5-HT₆ 수용체를 활성화시킬 농도(10^-5M)의 5-HT₆ 수용체 활성제를 포함하는 96-웰 플레이트와 버퍼(HEPES 완충용액)만을 포함하는 96-웰 플레이트 각각 준비하여, 상기 5-HT₆ 수용체 활성제를 포함하는 96-웰 플레이트와 버퍼만을 포함하는 96-웰 플레이트에 대한 Ca²⁺ 시그널을 구하여 5-HT₆ 수용체에 대한 스트리닝의 효율성을 판단하는 단계; 및

(3) 상기 (2) 단계의 조건 및 세포주가 포함된 96-웰 플레이트 외 별도로 5-HT₆ 수용체를 활성화시킬 상이한 농도(10^-11 ~ 10 ^-5 M)의 5-HT₆ 수용체 활성제를 포함하는 96-웰 플레이트를 준비하고,

5-HT₆ 수용체 활성을 칼슘농도에 민감한 아세톡시메틸-에스테르 형태의 플루오-4/AM을 형광성 칼슘 표지물로 사용하여 96-웰 상에서의 웰 각각에 대해 평균 480 nm 값을 측정하여 Ca²⁺ 시그널을 형광이미징법으로 구한 후,

상기 활성제에 대한 반응을 그래프로 그리고 상기 그래프로부터 시험 물질의 EC₅₀ 값을 구하여 5-HT₆수용체의 활성제를 검색하는 단계

를 포함하며,

상기 5-HT₆수용체의 활성제로는 5-HT, 5-CT, 메톡시트립타민(methoxytriptamine) 또는 트립타민(triptamine)인 것을 특징으로 하는 5-HT₆수용체의 활성제에 대한 고효율 검색방법.
(1) 세포주에서 5-하이드록시트립타민(세로토닌) 수용체 6[5-HT₆ 수용체]와 키메릭 G-단백질 양의 비율을 1 ~3 : 3 ~ 1로 DNA 양을 조절하여 트랜스펙션을 수행한 후 FBS(fetal bovine serum) 농도와 인큐베이션 시간을 비교 실험하여 최적의 세포주와 G-단백질을 선정하는 단계;

(2) 상기 선정된 세포주에서 5-HT₆ 수용체와 상기 선정된 G-단백질을 FBS(fetal bovine serum)가 포함된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 상에 트랜스펙션한 조건 하에서 96-웰 플레이트에 상기 선정된 세포주를 도입하여 형광성 표지 염료인 플루오-4(fluo-4) 염료로 표지하고,

HTS(고효율검색법)의 재현성 요소인 Z'(시그널 윈도우) 값을 [Zhang et al, Journal of Biomolecular Screening, 1999]의 방법으로 구하여 0.5 이상(Z' value = 0.57)임을 확인하고, 5-HT₆ 수용체를 활성화시킬 농도(10^-5M)의 5-HT₆ 수용체 활성제를 포함하는 96-웰 플레이트와 버퍼(HEPES 완충용액)만을 포함하는 96-웰 플레이트 각각 준비하여, 상기 5-HT₆ 수용체 활성제를 포함하는 96-웰 플레이트와 버퍼만을 포함하는 96-웰 플레이트에 대한 Ca²⁺ 시그널을 구하여 5-HT₆ 수용체에 대한 스트리닝의 효율성을 판단하는 단계; 및

(3) 상기 (2) 단계의 조건 및 세포주가 포함된 96-웰 플레이트 외 별도로 1 μM의 5-HT₆ 수용체 활성제와 10^-10 ~ 10 ^-5 M의 5-HT₆ 수용체 길항제를 각각 포함하는 2개의 96-웰 플레이트를 준비하고,

5-HT₆ 수용체 활성 억제를 칼슘농도에 민감한 아세톡시메틸-에스테르 형태의 플루오-4/AM을 형광성 칼슘 표지물로 사용하여 96-웰 상에서의 웰 각각에 대해 평균 480 nm 값을 측정하여 5-HT₆ 수용체 활성 억제에 대한 Ca²⁺ 시그널을 형광 이미징법으로 구한 후, 상기 길항제에 대한 반응을 그래프로 그리고 상기 그래프로부터 시험 물질의 IC₅₀ 값을 구하는 단계

를 포함하며,

상기 5-HT₆수용체의 길항제는 SB258585 또는 클로자핀(Clozapine)인 것을 특징으로 하는 5-HT₆수용체의 길항제에 대한 고효율 검색방법.
제 9 항 또는 제 10 항에 있어서, 상기 세포주는 HEK293, COS7, CHO-K1 또는 CHO-G5A인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 9 또는 청구항 10의 방법을 이용하여 단백질-티로신 키나아제 Fyn을 5-HT₆ 수용체, 키메릭 G-단백질과 1 : 1 : 1의 중량비로 트랜스펙션하여 발현시키고 내재화된 수용체(internalized receptor)의 기초(basal) 수준을 낮추기 위해서 세럼 스타베이션(serum starvation)을 시킨 후 5-HT₆수용체 활성을 측정하는 방법.