KR20130134628A

KR20130134628A - Ａ형 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20130134628A
Application number: KR1020120058264A
Authority: KR
Inventors: 김형규; 최영기
Original assignee: 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2012-05-31
Filing date: 2012-05-31
Publication date: 2013-12-10
Also published as: KR101471245B1

Abstract

본 발명은 A형 인플루엔자 바이러스 증식과 관련된 숙주의 Staufen1 단백질의 용도에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 A형 인플루엔자 바이러스의 NS1 단백질과 숙주의 Staufen1 단백질 간의 결합을 방해하는 물질을 유효성분으로 포함하는 A형 인플루엔자 바이러스(IAV) 감염 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 Staufen1 단백질의 RBD3-RBD4 사이의 링커(linker) 영역은 숙주의 Staufen1과 A형 인플루엔자 바이러스의 NS1 단백질과의 상호작용에 관여한다. 위 상호작용의 방해는 A형 인플루엔자 바이러스의 복제를 막는 중요한 수단이 될 수 있으며, 그에 따라 항바이러스제의 개발에 중요한 표적으로 사용될 수 있다. 따라서 본 발명의 조성물은 A형 인플루엔자 바이러스 감염을 효과적으로 억제하여 그에 의한 질병을 예방 및 치료할 수 있다.

Description

Ａ형 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 및 치료용 조성물{Composition for prevention and treatment of influenza Ａ viral diseases}

본 발명은 A형 인플루엔자 바이러스 증식과 관련된 숙주의 Staufen1 단백질의 용도에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 A형 인플루엔자 바이러스의 NS1 단백질과 숙주의 Staufen1 단백질 간의 결합을 방해하는 물질을 유효성분으로 포함하는 A형 인플루엔자 바이러스(IAV) 감염 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

A형 인플루엔자 바이러스는 인체의 보건을 위협하는 주된 병원균 중의 하나이다. 바이러스 백신은 인플루엔자 바이러스 감염을 예방하는 1차적인 방법이다. 하지만, 일단 전국적으로 유행하기 시작한 경우에는 그 균주에 맞는 백신을 개발하여 생산하는데 적어도 세 달의 시간이 소요된다. 따라서, 백신 접종을 하지 않거나 백신을 구할 수 없는 사람들에게는 항바이러스제가 새롭게 나타나는 바이러스를 방어하는 중요한 대체수단이 될 수 있다.

바이러스 핵단백질(nucleoprotein) (NP) 및 비구조단백질 1(non-structural protein 1) (NS1)은 최근 약물의 표적으로 각광받고 있다. 소분자 화합물인 뉴클레오진(nucleozin)은 NP의 축적을 야기하는 것으로 보인다[R.Y. Kao, et al, Identification of influenza A nucleoprotein as an antiviral target, Nat. Biotechnol. 28 (2010) 600605]. 한편, 바이러스 감염의 초기 단계부터 숙주 세포 내에서 NS1이 가진 여러 기능들은 항바이러스 화합물의 설계 및 발견에 중요한 역할을 한다. 예를 들어, 위 화합물들 중 일부는 NS1 단백질과 dsRNA의 상호작용을 저해하기 위한 목적으로 설계되거나[H. Ai, et al, Discovery of novel influenza inhibitors targeting the interaction of dsRNA with the NS1 protein by structure-based virtual screening, Int. J. Bioinf. Res. Appl. 6 (2011) 449460], 본래의 면역 기능을 회복시키도록 설계되거나[D. Basu, et al, Novel influenza virus NS1 antagonists block replication and restore innate immune function, J. Virol. 83 (2009) 18811891], 또는 RNase L-의존적 방식에서 반복적인 복제를 막도록 설계된다[M.P. Walkiewicz, et al, Novel inhibitor of influenza non-structural protein 1 blocks multi-cycle replication in an RNase L-dependent manner, J. Gen. Virol. 92 (2010) 6070]. 또한, NS1의 CPSF30 결합부위가 잠재적인 항바이러스 표적이 될 수 있다는 연구결과도 있었다[K.Y. Twu, et al, The CPSF30 binding site on the NS1A protein of influenza A virus is a potential antiviral target, J. Virol. 80 (2006) 39573965.].

바이러스 단백질들을 표적으로 하는 여러 약들이 지금까지 개발되고 있기는 하지만, 이들은 바이러스 유전체의 빈번한 돌연변이나 바이러스가 약물에 대하여 획득한 저항성에 대해 별로 효과적이지 않았다. 따라서 이러한 단점을 극복하기 위하여 A형 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 숙주의 반응과 관련된 보존적이고 중요한 기작을 명확히 밝힐 필요가 있다. 지금까지 여러 연구들이 바이러스 단백질과 숙주 단백질 사이의 상호작용을 조사하거나[S.D. Shapira, et al, A physical and regulatory map of host-influenza interactions reveals pathways in H1N1 infection, Cell 139 (2009) 12551267], 유전제 수준의 RNA 간섭 연구를 통해[R. Konig, et al, Human host factors required for influenza virus replication, Nature 463 (2009) 813817 및 A. Karlas, et al, Genome-wide RNAi screen identifies human host factors crucial for influenza virus replication, Nature 463 (2010) 818822] 바이러스 복제에 필요한 숙주의 인자(factor)들을 분리하였다.

Drosophila에서 최초로 분리된 dsRNA-결합 단백질인 Staufen은 난모세포의 발달에 있어서 일부 mRNA들의 전후측 분포를 조절하는 중요한 단백질이다[D. St Johnston, The intracellular localization of messenger RNAs, Cell 81 (1995) 161170]. 두 개의 Staufen 상동체(homologs), Staufen1 (Stau1) [L. Wickham, et al, Mammalian staufen is a double-stranded-RNA- and tubulin-binding protein which localizes to the rough endoplasmic reticulum, Mol. Cell. Biol. 19 (1999) 22202230] 과 Staufen2 (Stau2) [T. Duchaine, et al, A novel murine Staufen isoform modulates the RNA content of Staufen complexes, Mol. Cell. Biol. 20 (2000) 55925601]가 포유동물에서 분리되었다. 거의 모든 조직에서 발현되는 Stau1과는 달리, Stau2는 뇌에 특이적인 단백질이다. Stau1은 두 개의 아이소형(isoforms)이 있다. 63 kDa (Stau163) 변이체는 N-말단 영역에서 55 kDa (Stau155) 변이체 보다 81개의 아미노산 잔기만큼 더 길다[L. Wickham, et al, 1999]. 초기 연구에서는 두 Staufen 아이소형들의 기능이 리보뉴클레오프로테인(ribonucleoprotein) (RNP) 복합체나 RNA-운반 과립체(RNA-transporting granules)를 형성하여 RNA들을 특정 영역으로 이동시키는 것으로 생각되었다[M. Kohrmann, et al, Microtubule-dependent recruitment of Staufen-green fluorescent protein into large RNA-containing granules and subsequent dendritic transport in living hippocampal neurons, Mol. Biol. Cell 10 (1999) 29452953 및 S.J. Tang, et al, A role for a rat homolog of staufen in the transport of RNA to neuronal dendrites, Neuron 32 (2001) 463475]. RNA-운반 과립체 이외에도, Stau1은 다양한 RNA 과립체(granules)나 세포내 프로세싱 기관에서 발견되었다[P. Anderson, N. Kedersha, RNA granules, J. Cell Biol. 172 (2006) 803808]. 또한, Stau1은 NMD (non-sense mediated mRNA decay)[Y.K. Kim, et al, Mammalian Staufen1 recruits Upf1 to specific mRNA 3so as to elicit mRNA decay, Cell 120 (2005) 195208.] 및 번역 조절[S. Dugre-Brisson, G. et al, Interaction of Staufen1 with the 5end of mRNA facilitates translation of these RNAs, Nucleic Acids Res. 33 (2005) 47974812]에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. Stau1은 주로 조면소포체(RER)에 위치하는 것으로 알려져 있으나[L. Wickham, et al, 1999], 그것의 핵 내 위치(localization)에 관한 최근의 연구는 핵세포질 순환(nucleocytoplasmic shuttling) 등의 기능을 시사한다[C. Martel, et al, Staufen1 is imported into the nucleolus via a bipartite nuclear localization signal and several modulatory determinants, Biochem. J. 393 (2006) 245254].

일련의 연구들에서, 사람의 Stau1은 NS1의 결합 파트너로 동정되었다[A.M. Falcon, et al, Interaction of influenza virus NS1 protein and the human homologue of Staufen in vivo and in vitro, Nucleic Acids Res. 27 (1999) 22412247]. RNA 간섭에 의한 Stau1의 특이적 하향조절(down-regulation)은 바이러스 증식을 감소시키는 것으로 보이며, 이는 Stau1의 A형 인플루엔자 바이러스 복제와의 관련성을 시사한다[S. de Lucas, et al, Human Staufen1 protein interacts with influenza virus ribonucleoproteins and is required for efficient virus multiplication, J. Virol. 84 (2010) 76037612]. 그러나, 지금까지 Stau1의 NS1과의 상호작용에 관여하는 특이적 도메인은 거의 알려진 바가 없다.

국제특허 WO 96/40948 국제특허 WO 2004 043404

이에 본 발명자들은 Stau1과 NS1 사이의 상호작용을 위한 특이적 영역을 밝히기 위해 실험하던 중, RBD3와 RBD4 사이의 링커(linker) 영역이 위 결합에 필요한 것을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 Staufen1 단백질의 새로운 표적을 이용한 A형 인플루엔자 바이러스(IAV) 감염의 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 A형 인플루엔자 바이러스 단백질 NS1의 숙주 단백질 Staufen1에 대한 결합을 방해하는 물질을 유효성분으로 포함하는 A형 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 물질에는, 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 Staufen1의 링커(linker) 영역 또는 A형 인플루엔자 바이러스의 NS1과 상호작용하여, Staufen1과 NS1의 상호작용을 방해함으로써 인플루엔자 바이러스의 증식을 억제하는 물질이 포함될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 A형 인플루엔자 바이러스의 NS1과 상호작용하는 물질에는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드가 포함될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 A형 인플루엔자 바이러스 단백질 NS1의 숙주 단백질 Staufen1에 대한 결합을 방해하는 물질에는 Staufen1을 암호화하는 유전자 내의 서열번호 1의 염기서열을 갖는 링커(linker) 영역의 발현을 억제하는 물질이 포함될 수 있다.

이에 제한되는 것은 아니나, 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 물질은 뉴클레오티드, 안티센스, siRNA 올리고뉴클레오타이드, 천연 추출물, 펩티드, 항체, 단백질, 또는 화합물의 형태일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스 감염 질환은, 예를 들어, 감기, 독감, 인후염, 기관지염, 또는 폐렴일 수 있다.

본 발명에 의해 숙주의 Staufen1 단백질에 존재하는 RBD3와 RBD4 사이의 36개의 아미노산으로 이루어진 링커(linker) 영역이 Staufen1과 A형 인플루엔자 바이러스의 NS1 단백질과의 상호작용에 관여한다는 사실이 확인되었다. 위 상호작용의 방해는 A형 인플루엔자 바이러스의 복제를 막는 중요한 수단이 될 수 있으며, 그에 따라 항바이러스제의 개발에 중요한 표적으로 사용될 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 조성물은 A형 인플루엔자 바이러스 감염을 효과적으로 억제하여 그에 의한 질병을 예방 및 치료할 수 있다.

도 1은 Stau1이 RBD3 및 4 사이의 링커 영역을 통해 NS1과 상호작용한다는 것을 보여준다. (A) NS1과 상호작용하는 Stau1의 두 개의 아이소형. Myc-표지 NS1 및 FLAG-표지 Stau1⁶³ 또는 Stau1⁵⁵ 을 배양된 293T 세포에서 공동발현시키고, 항-Myc 항체를 사용하여 세포 용해물을 면역침전에 사용하였다. 공동침전된 단백질을 항-FLAG 항체를 이용한 웨스턴 블랏팅으로 시각화하였다. (B) Stau1 돌연변이 단백질들과 그들의 NS1과의 상호작용을 나타낸 것이다(+: 상호작용 검출; -: 미검출). RBD는 RNA-결합 도메인을 의미하며, TBD는 튜뷸린(tubulin)-결합 도메인임. (C) RBD2 및 그것의 연결된 링커 영역은 Stau1-NS1 상호작용에 반드시 필요하지는 않았음. (D) Stau1의 NS1과의 상호작용은 RBD3 및 4 사이의 링커 영역에 의해 매개된다. (E) Stau1의 NS1과의 상호작용은 양 단백질들의 RNA 결합과는 무관하다. 면역침전에 앞서 세포 용해물을 50 /ml의 RNase A로 전처리하였다. 우측 패널은 RNase A 처리의 효율을 나타낸다.
도 2는 Stau1과 NS1의 상호작용이 RBD3L의 투여량에 비례하여 억제됨을 보여준다. 배양된 HEK 293T 세포들을 NS1, 및 RBD3L을 포함하거나 포함하지 않는 Stau1 발현 벡터로 함께 트랜스펙션시켰다. 대조군 세포들은 1 의 빈 벡터로 트랜스펙션시켰다. (A) co-IP 분석의 대표적 결과. 아래 패널은 각각의 단백질의 발현 수준을 나타냄. (B) 데이터를 분석한 막대그래프. co-IP 어세이의 밴드 강도는 밀도계측분석(densitometric analysis)으로 정량하였다. RBD3L (1 ) 발현에 대한 밴드 강도는 각각의 대조군에 대한 백분율로 나타냈다(***p < 0.001, ns: not significant compared with controls).
도 3은 RBD3L 발현이 Stau1과 NS1이 공동으로 위치하는 것(colocalization)을 감소시킨다는 결과이다. 배양된 A549 세포들을 GFP-Stau1, Myc-NS1, 및 RBD3L 또는 RBD2(대조군)로 트랜스펙션시켰다. 배양 24시간 후에, 세포들을 고정하고, 항-Myc 항체로 면역 염색하였다. 핵을 염색하기 위해 DAPI를 사용하였다. Stau1과 NS1의 공동위치(colocalization)를 세포질과 핵 모두에서 측정하였다. (A) 면역염색된 A549 세포들의 대표 이미지. (B) 데이터를 분석한 막대그래프. 대조군에 대한 Stau1과 NS1의 상대적인 공동위치를 평균 ± SEM (%)로 나타내었다(***p < 0.001, ns: not significant compared with controls).
도 4는 RBD3L 발현이 바이러스 복제를 감소시킴을 보여준다. A549 세포들을 FLAG-표지 Stau1, RBD3L, RBD2, 또는 빈 플라스미드 벡터 대조군으로 트랜스펙션시키고, 24시간 동안 배양하였다. 그 후 A/WSN/1933 (H1N1) 바이러스로 감염시켰다(0.01 MOI). 감염된 세포 배양액에서 바이러스 역가(titers)는 다른 시간에(12, 24, 36, 및 72 h p.i.) MDCK 세포내 적정으로 측정되었고, log₁₀ TCID₅₀/100 로 표시하였다. 데이터는 세 번의 독립적인 적정의 평균 ± SEM(paired t-test: *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 compare relative virus titers of compared with control transfections).

본 발명은 A형 인플루엔자 바이러스 증식과 관련된 숙주의 Staufen1 (Stau1)단백질의 특정 영역에 관한 것이다.

인플루엔자 바이러스 단백질 NS1이 사람의 Stau1과 C-말단 영역을 통해 상호작용한다는 사실은 이전의 연구 결과 밝혀진바 있다(A.M. Falcon, et al, Interaction of influenza virus NS1 protein and the human homologue of Staufen in vivo and in vitro, Nucleic Acids Res. 27 (1999) 2241-2247). 그러나 Stau1은 두 개의 스플라이스(splice) 변이체들을 갖기 때문에, 어떠한 형태의 변이체가 NS1의 결합 상대인지는 위 연구에서 명확히 밝혀지지 않았다. 이에 본 발명자들은 NS1의 결합상대를 밝히기 위해 먼저 각각의 Stau1 변이체를 HEK 293T 세포에서 NS1과 공동발현시킨 후, 일련의 co-IP 어세이를 사용하여 단백질 간 상호작용을 확인하였다. 웨스턴 블랏팅 결과, Stau1⁶³ 및 Stau1⁵⁵ 모두 NS1과 상호작용하는 것으로 나타났으며, 이는 위 상호작용이 N-말단 잔기들에 의해 영향받거나 매개되지 않는다는 것을 보여준다(도 1A).

Stau1에서 바이러스 단백질 NS1과의 상호작용에 관여하는 특정 영역을 찾기 위해, 본 발명자들은 일부 영역들을 제거한 돌연변이들을 만들고(도 1B), 위 돌연변이들이 NS1과 상호작용하는지를 co-IP 어세이를 통해 알아보았다. 도 1C에 나타낸 바와 같이, C-말단쪽을 제거한 돌연변이들 중 RBD3를 갖고 있는 것들은 NS1과 결합할 수 있었다. 하지만, RBD3 영역만을 발현시킨 경우(RBD3)에는 바이러스 단백질을 함께 침전시키기에 충분하지 못했다. 숙주-바이러스 단백질 상호작용을 회복시키기 위해서는 RBD3와 RBD4 사이의 링커 영역(RBD3L)의 추가적인 발현이 필요했으며(도 1D), 이는 Stau1이 NS1과 결합하는데 있어서 이 링커 영역이 중요한 역할을 한다는 것을 보여준다.

흥미롭게도 RBD3와 RBD4 사이의 링커 영역에는 염기성 아미노산들이 많았다. 이 영역의 총 36개의 아미노산들(서열번호 2) 중에서 10개가 염기성 아미노산이었으며, 이 영역은 이분적인(bipartite) 핵 위치 신호(nuclear/nucleolus localization signal, NLS) 영역과 중복되는 위치였다[C. Martel, et al, Staufen1 is imported into the nucleolus via a bipartite nuclear localization signal and several modulatory determinants, Biochem. J. 393 (2006) 245-254]. 따라서 위 영역을 제거한 돌연변이들은 Stau1에서 NLS를 제거한 효과도 함께 보일 것으로 예측되었다. 즉, 위 상호작용이 없어질 경우 각각의 돌연변이들은 NS1과 서로 다른 위치에 존재할 가능성이 있다. 이러한 가능성을 배제하기 위해, 본 발명자들은 모든 돌연변이들의 위치(localization)를 비교해 보았다. 그 결과, 위 돌연변이들은 전장(full-length) Stau1 (Full) 또는 GFP-표지 Stau1 (GFP-Stau)과 유사하게 세포질(cytosol)에서 주로 발견되었다. 그러나 RBD3와 링커 영역이 없는 RBD2 또는 RBD3 상당량은 세포질뿐만 아니라 핵에서도 발견되었다. 반면에 RBD3 영역만을 포함하고 링커 영역이 없는 RBD3는 주로 세포질에 위치하였다(도 5 참조). 위 결과들은 RBD3가 주요한 세포질 분비 신호로 작용한다는 이전의 연구 결과와 일치하는 것이다[C. Martel, et al, 2006]. 한편, 바이러스 감염 또는 DNA 트랜스펙션(transfection)의 초기 단계에서 NS1은 대부분 핵에 위치하지만, NS1 단백질이 세포질에 위치하며 핵과 세포질을 순환(nucleocytoplasmic shuttling)한다는 연구결과가 있다[B.G. Hale, R.E., et al, The multifunctional NS1 protein of influenza A viruses, J. Gen. Virol. 89 (2008) 2359-2376]. 실제로, 본 발명자들은 트랜스펙션 후 24시간째 거의 같은 양의 NS1을 세포질 내에서 발견하였다(도 6 참조). 위 결과들은 Stau1-NS1 상호작용의 방해가 각각의 단백질의 상이한 위치(localization) 때문에 나타나는 현상은 아니라는 점을 설명해준다.

추가로, 두 단백질 모두 다른 RNA 분자들과 관련되어 있다는 연구결과가 알려져 있으므로, 본 발명자들은 위 단백질들이 RNA 분자에 의존적인 방식으로 서로 상호작용하는지를 실험하였다. 하지만 RNase 처리는 Stau1-NS1 상호작용에 큰 영향을 미치지 못했다. 본 발명의 결과는 Staufen1과 NS1 사이의 상호작용이 Stau1 및 NS1의 RNA-결합과는 무관하게 일어난다는 것을 보여준다.

또한, RBD3L의 발현이 Stau1-NS1 상호작용을 억제하는지를 알아보기 위해, FLAG-Stau1을 여러 농도(1, 0.5, 또는 0.1 )의 FLAG-RBD3L과 함께 또는 단독으로 발현시킨 293T 세포에서 Myc-NS1을 면역침전시켰다. FLAG 항체에 대한 웨스턴 블랏팅 결과, RBD3L의 추가적인 발현은 Stau1과 NS1의 공동침전(coprecipitation)을 투여량에 비례적으로 감소시켰다(도 2). 특히 1의 RBD3L을 처리한 경우, NS1과 함께 침전된 Stau1의 양은 대조군에 비해 약 30% 감소하였으며, 이는 RBD3L이 잠재적으로 숙주-바이러스 단백질 상호작용을 경쟁적인 결합에 의해 억제할 수 있다는 것을 보여준다(도 2B).

한편, Stau1은 세포질 내 조면소포체 및 리보좀에 위치하는 것으로 보고되어 왔으나[L. Wickham, et al. 1999 및 R.M. Marion, et al. 1999], NS1-발현 세포들에서는 핵에 위치한다는 연구결과가 있었다[A.M. Falcon, et al. 1999]. 최근에는 Stau1이 이분적인 핵 위치 신호(bipartite nuclear localization signal)에 의해 핵 및 인(nucleolus)으로 유입된다는 보고가 있다[C. Martel, et al. 2006]. 이에 본 발명자들은 RBD3L의 발현 이후에 세포질과 핵에서 Stau1 및 NS1의 위치(colocalization)를 측정하였다. 배양된 A549 세포들을 GFP- Stau1, Myc-NS1, 및 FLAG-RBD3L 또는 FLAG-RBD2(음성대조군)로 트랜스펙션시키고, 24시간 후에 항-Myc 항체로 면역염색하였다. 그 후 공초점 현미경을 통해 Stau1 및 NS1의 세포질과 핵 안에서의 위치를 관찰한 결과(도 3A), 이전의 보고들과 일치하였다[A. M. Falcon, et al. 1999 및 S. de Lucas, et al. 2010]. 흥미롭게도, RBD2가 아니라 RBD3L의 공동발현은 세포질(도 3B, CTL: 100.0 ± 3.84%, N = 22, RBD2: 90.3 ± 5.06%, N = 13, RBD3L: 72.4 ± 6.71%, N = 14; ***p < 0.001, ns: not significant compared with controls)과 핵(도 3B, CTL: 100.0 ± 4.33%, N = 26, RBD2: 89.86 ± 7.31%, N = 16, RBD3L: 63.97 ± 8.40%, N = 15; ***p < 0.001, ns: not significant compared with controls) 모두에서 Stau1이 NS1과 함께 위치(colocalization)하는 경향을 상당히 감소시켰다. 위 결과들은 RBD3L이 생체 내에서 Stau1과 NS1의 상호작용을 방해한다는 것을 의미한다.

마지막으로 본 발명자들은 Stau1과 NS1 사이의 상호작용을 방해하는 것이 바이러스 복제에 어떠한 영향을 미치는지를 조사하였다. 트랜스펙션시킨 A549 세포들(FLAG-표지 Stau1, RBD3L, RBD2, 또는 빈 벡터 대조군 플라스미드)을 24시간 후에 A/WSN/1933 바이러스로 감염시켰다(0.01 MOI). 지정된 시간 간격으로 채취한 바이러스 감염 샘플의 적정(titration) 결과 RBD3L-발현 세포들에서는, 24시간째를 제외하고, 실험한 거의 모든 시간에서 빈 벡터로 트랜스펙션시킨 대조군 세포들에 비하여 약 10배 정도 바이러스 적정량이 감소하였다(paired t-tests, 36 h: *p < 0.05, 48 h: **p < 0.01, 72 h: ***p < 0.001, N = 3) (도 4). 하지만, 전장(full-length) Stau1에 비하여, RBD3L 그룹에서의 바이러스 적정은 48 h p.i부터 상당한 편차가 있었다. 반면에, RBD2-트랜스펙션 세포들은 실험한 전체 시간 동안 대조군 벡터로 처리한 것과 유사한 바이러스 적정 결과를 나타냈다. 이러한 결과들은 Stau1의 RNAi-매개 하향조절(down-regulation)이 인플루엔자 바이러스 복제를 상당히 감소시킨다는 이전의 연구 결과와 일치하는 것으로 보인다[S. de Lucas, et al. 2010]. 하지만, 본 발명의 실험 결과는 Stau1과 NS1 사이의 상호작용을 특이적으로 방해함으로써 인플루엔자 바이러스 생산을 잠재적으로 감소시킬 수 있다는 것을 밝힌 점에서 차이가 있다. 추가적으로, 바이러스 생산 감소의 또 다른 가능성으로, RBD3L 발현이 Stau1과 NS1 사이의 상호작용에 있어서 입체적 방해 효과를 가져올 수 있다는 점을 들 수 있다.

위와 같이 본 발명자들은 인플루엔자 A 바이러스의 NS1 단백질이 사람 Stau1 단백질에 결합하는데 필요한 부위로서 Stau1의 RBD3와 RBD4 사이의 링커(linker) 영역을 동정하였다. 이 영역에는 염기성 아미노산들이 많이 존재하며, 그것은 Stau1을 핵 안으로 보내는 이분적 핵 위치 신호(bipartite nuclear/nucleolus localization signal) 영역과 중복되어 있다. 바이러스 NS1 단백질은 핵의 안과 밖을 순환(shuttling)할 수 있으나, Stau1의 핵 내 유입은 그것의 핵 유입 도메인과 세포질 분비를 촉진하는 특정 분자 결정인자 사이의 균형에 의해 조절될 수 있다. 따라서 본 발명자들은 링커 영역에서 NS1과의 결합이 그것의 핵 내 유입에 대한 자극이 될 것이라고 가정하였다. 인플루엔자 바이러스 구성물이 Stau1과 상호작용할 경우 바이러스는 숙주 단백질이 RNP 패키징을 향상시켜 mRNA가 적절히 위치(localization) 및 발현할 수 있도록 한다[S. de Lucas, et al. 2010]. Stau1을 RNA 간섭(interference)으로 억제할 경우 바이러스 입자 생산은 감소하며, 이는 효과적인 바이러스 복제에 Stau1이 필요함을 의미한다[S. de Lucas, et al. 2010]. 본 발명은 RBD3L 영역의 발현이 Stau1-NS1 단백질 상호작용의 감소를 가져오며, 그 결과 A549 세포에서 바이러스 생산이 감소함을 증명하였다. 따라서, 본 발명은 항바이러스제의 새로운 표적인 RBD3L-유사 펩티드 또는 화합물을 제공한다.

그러므로 본 발명은 A형 인플루엔자 바이러스 단백질 NS1의 숙주 단백질 Staufen1에 대한 결합을 방해하는 물질을 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공할 수 있다. 본 명세서에서 상기 "예방"이란 조성물의 투여에 의해 인플루엔자 바이러스 감염을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 포함하는 의미로 사용되며, "치료"란 조성물의 투여에 의해 인플루엔자바이러스 감염에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 포함하는 의미로 사용된다. 상기 A형 인플루엔자 바이러스는 이에 제한되는 것은 아니나 바람직하게는 인플루엔자 H1N1 바이러스일 수 있다. 또한, 상기 인플루엔자 바이러스의 감염에 의해 생길 수 있는 질병에는 독감, 감기, 인후염, 기관지염, 폐렴, 조류독감, 돼지독감, 염소독감 등이 포함된다.

상기 본 발명의 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 및 치료용 조성물은 약학적 조성물일 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 뉴클레오티드, 안티센스, siRNA, 올리고뉴클레오타이드, 펩티드, 단백질, 화합물 및/또는 천연추출물을 유효성분으로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 또는 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열을 가지는 안티센스 또는 siRNA(small interference RNA) 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 포함할 수 있다. 본 발명에서 상기 "안티센스 올리고뉴클레오타이드란 용어는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 본 발명의 안티센스 서열은 Stau1 mRNA에 상보적이고 Stau1 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하며, Stau1 mRNA의 번역, 세포질내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다.

또한, 상기 안티센스 핵산은 효능을 증진시키기 위하여 하나 이상의 염기, 당 또는 골격(backbone)의 위치에서 변형될 수 있다(De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol., 5, 3, 343-55, 1995). 핵산 골격은 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬, 시클로알킬, 단쇄 헤테로아토믹, 헤테로시클릭 당간 결합 등으로 변형될 수 있다. 또한, 안티센스 핵산은 하나 이상의 치환된 당 모이어티(sugar moiety)를 포함할 수 있다. 안티센스 핵산은 변형된 염기를 포함할 수 있다. 변형된 염기에는 하이포크잔틴, 6-메틸아데닌, 5-메틸피리미딘(특히 5-메틸시토신), 5-하이드록시메틸시토신(HMC), 글리코실 HMC, 젠토비오실 HMC, 2-아미노아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 5-브로모우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6 (6-아미노헥실)아데닌, 2,6-디아미노퓨린 등이 있다. 또한, 본 발명의 안티센스 핵산은 상기 안티센스 핵산의 활성 및 세포 흡착성을 향상시키는 하나 이상의 모이어티(moiety) 또는 컨쥬게이트(conjugate)와 화학적으로 결합될 수 있다. 콜레스테롤 모이어티, 콜레스테릴 모이어티, 콜릭산, 티오에테르, 티오콜레스테롤, 지방성 사슬, 인지질, 폴리아민, 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 아다맨탄 아세트산, 팔미틸 모이어티, 옥타데실아민, 헥실아미노-카르보닐-옥시콜에스테롤 모이어티 등의 지용성 모이어티 등이 있고 이에 제한되지는 않는다. 지용성 모이어티를 포함하는 올리고뉴클레오티드와 제조 방법은 본 발명의 기술 분야에서 이미 잘 알려져 있다(미국특허 제5,138,045호, 제5,218,105호 및 제5,459,255호). 상기 변형된 핵산은 뉴클레아제에 대한 안정성을 증가시키고 안티센스 핵산과 표적 mRNA와의 결합 친화력을 증가시킬 수 있다.

안티센스 올리고뉴클레오타이드는 통상의 방법으로 시험관에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 합성되도록 할 수 있다. 시험관에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 일예는 RNA 중합효소 I를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한 가지 예는 인식부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 이런 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.

상기 "siRNA라는 용어는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱을 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다(국제공개 특허번호 00/44895, 01/36646, 99/32619, 01/29058, 99/07409 및 00/44914 참조). siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운(knock-down) 방법으로서 또는 유전자치료 방법으로 제공된다. 본 발명의 siRNA 분자는, 센스 가닥과 안티센스 가닥이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조를 가질 수 있으며, 또한, 본 발명의 siRNA 분자는 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다. 나아가 siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 또한, siRNA 말단 구조는 Stau1 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하고, 점착 말단 구조는 3'-말단 돌출 구조와 5'-말단 돌출 구조 모두 가능하다. 또한, 본 발명의 siRNA 분자는 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥 사이에 짧은 뉴클레오티드 서열이 삽입된 형태를 가질 수 있으며, 이 경우 뉴클레오타이드 서열의 발현에 의해 형성된 siRNA 분자는 분자내 혼성화에 의하여 헤어핀 구조를 형성하게 되며, 전체적으로는 스템-앤드-루프 구조를 형성하게 된다. 이 스템-앤드-루프 구조는 인 비트로 또는 인 비보에서 프로세싱되어 RNAi를 매개할 수 있는 활성의 siRNA 분자를 생성한다.

siRNA를 제조하는 방법은 시험관에서 siRNA를 직접 합성한 뒤, 형질전환 과정을 거쳐 세포 안으로 도입시키는 방법과 siRNA가 세포 안에서 발현되도록 제조된 siRNA 발현 벡터 또는 PCR-유래의 siRNA 발현 카세트 등을 세포안으로 형질전환 또는 감염(infection)시키는 방법이 있다.

또한, 유전자 특이적인 siRNA를 포함하는 본 발명의 조성물은 siRNA의 세포내 유입을 촉진시키는 제제를 포함할 수 있다. siRNA의 세포내 유입을 촉진시키는 제제에는 일반적으로 핵산 유입을 촉진하는 제제를 사용할 수 있으며, 이러한 예로는, 리포좀을 이용하거나 콜레스테롤, 콜레이트 및 데옥시콜산을 비롯한 다수의 스테롤류 중 1종의 친유성 담체와 함께 배합할 수 있다. 또한 폴리-L-라이신(poly-L-lysine), 스퍼민(spermine), 폴리실아잔(polysilazane), 폴리에틸레민(PEI: polyethylenimine), 폴리디하이드로이미다졸레늄(polydihydroimidazolenium), 폴리알리라민(polyallylamine), 키토산(chitosan) 등의 양이온성 고분자(cationic polymer)를 이용할 수도 있고, 숙실화된 PLL(succinylated PLL), 숙실화된 PEI(succinylated PEI), 폴리글루타믹산(polyglutamic acid), 폴리아스파틱산(polyaspartic acid), 폴리아크릴산(polyacrylic acid), 폴리메타아크릴산(polymethacylic acid), 덱스트란 설페이트(dextran sulfate), 헤파린(heparin), 히아루릭산(hyaluronic acid) 등의 음이온성 고분자(anionic polymer)를 이용할 수 있다.

또한, 상기 Stau1 단백질의 발현 및 활성을 조절하는 물질로서 Stau1 단백질에 특이적인 항체를 사용할 경우, 상기 항체는 기존의 치료제와 직접 또는 링커 등을 통하여 간접적으로 커플링(예를 들어, 공유결합)시킬 수 있다. 항체와 결합될 수 있는 치료제로는 이에 제한되지는 않으나, 131I, 90Y, 105Rh, 47Sc, 67Cu, 212Bi, 211At, 67Ga, 125I, 186Re, 188Re, 177Lu, 153Sm, 123I, 111In 등과 같은 방사성핵종(radionuclide); 메토트렉세이트(methotrexate), 아드리아마이신(adriamycin), 및 인터페론과 같은 림포카인(lympokine) 등의 생물학적 반응 변형체 또는 약물; 리신, 아브린, 디프테리아 등과 같은 독소; 이형기능성 항체(heterofunctional antibodies), 즉 다른 항체와 결합되어서 그 복합체가 암 세포와 효능 세포(예를 들면, T 세포와 같은 K 세포(killer cell) 모두에 결합하는 항체; 및 자연적인, 즉, 비-연관 또는 비-복합된 항체와 결합될 수 있다.

상기 본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등과 같은 경구 투여용 담체 및 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르 브산과 같은 항산화제가있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995). 본 발명에 따른 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 적합한 형태로 제형화 될 수 있다. 즉, 본 발명의 약학적 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 또는 경구 투여용 형태로 제조될 수 있으며, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로는 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화될 수 있다. 또한, 경구 투여용 제형으로는, 이에 한정되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 환약 및 캡슐 등이 있다.

상기와 같은 방법으로 제형화된 약학적 조성물은 유효량으로 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있는데, 상기 투여란 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 물질의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 상기 유효량이란 환자에게 투여하였을 때, 예방 또는 치료 효과를 나타내는 양을 말한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 환자의 질환 종류 및 중증도, 연령, 성별, 체중, 약물에 대한 민감도, 현재 치료법의 종류, 투여방법, 표적 세포 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 종래의 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 바람직하게는 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1~10000/체중kg/day, 더욱더 바람직하게는 10~1000/체중kg/day의 유효용량으로 하루에 수회 반복 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

한편, 본 발명은 상기 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 및 치료용 조성물을 약제학적으로 유효한 양으로 인플루엔자 바이러스 감염의 발병 또는 발병 가능성이 있는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 치료방법을 제공한다. 바람직하게 상기 인플루엔자 바이러스는 A형 인플루엔자 바이러스일 수 있으며, 상기 인플루엔자 바이러스 감염 질환은 독감, 감기, 인후염, 기관지염, 폐렴일 수 있다. 상기 "개체"란 인플루엔자 바이러스에 이미 감염되었거나 감염될 수 있는 사람을 포함한 모든 동물을 의미한다.

또한, 본 발명의 조성물은 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 및 개선용 식품 조성물의 형태로 제공될 수 있다. 본 발명의 조성물은 다른 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 당업계의 통상적인 방법에 따라 적절하게 혼합될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에 본 발명의 조성물은 원료 조성물 중 0.01 ~ 10 중량%, 바람직하게는 0.05 ~ 1중량%의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하로도 사용될 수 있다. 상기 식품의 종류에는 특별한 제한이 없으며, 예를 들어, 육류, 빵, 과자류, 쵸코렛, 캔디류, 면류, 껌류, 낙농제품, 음료수, 차, 알콜 음료, 비타민 복합제, 건강식품 등을 모두 포함한다. 상기 음료의 경우 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서

함유할 수 있으며, 그 외 본 발명의 식품조성물에는 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등이 함유될 수 있다.

또한, 본 발명은 Staufen1을 이용하여 A형 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 및 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은, (a) 실험대상에 A형 인플루엔자 바이러스를 감염시키는 단계; (b) 상기 실험대상에 후보물질을 투여하는 단계; 및 (c) A형 인플루엔자 바이러스의 NS1과 실험대상의 Staufen1의 상호작용을 확인하는 단계를 포함한다.

상기 본 발명의 스크리닝 방법에 있어서, 상기후보물질은 Stau1 유전자의 발현양, Stau1 단백질의 양, Stau1 단백질의 활성, 또는 NS1과의 결합에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 후보물질은 화학물질, 뉴클레오티드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA), 펩티드, 단백질 및 천연 추출물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 후보물질이 처리된 세포 등의 시료에서 Stau1 유전자의 발현양, Stau1 단백질의 양, Stau1 단백질의 활성, 또는 NS1과의 결합을 측정할 수 있으며, 측정 결과, Stau1 유전자의 발현양, Stau1 단백질의 양, Stau1 단백질의 활성 또는 NS1과의 결합이 억제되는 것이 관찰되면 상기 후보물질은 인플루엔자 감염 질환을 치료 또는 예방할 수 있는 물질로 판정될 수 있다.

상기에서 Stau1 유전자의 발현양, Stau1 단백질의 양, Stau1 단백질의 활성 또는 NS1과의 결합을 측정하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 수행될 수 있는데, 예를 들면, 이에 제한되지는 않으나, 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 면역블랏(immunoblot) 분석, 면역조직화학염색법, 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion) 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay) 등을 이용하여 수행할 수 있다.

일반적으로 사용되는 키나아제 분석 시스템은 기질에 섞인 인산염의 양을 정량적으로 검출하는 방식으로 이루어지는데, 상기 분석은 하나 이상의 세정 단계를 포함하는 이종분석과 세정 단계 없이 시약 및 화합물만을 혼합하고 측정하는 동종분석으로 나눌 수 있다. 이종 분석의 예로는 ELISA, DELFIA, SPA 및 플래쉬플레이트 분석 등이 있다. ELISA 분석은 키나아제에 의해 인산화될 수 있는 펩티드를 사용한다. DELFIA 분석은 고체상 분석으로서, 항체를 란탄족으로 표지하고, 결합되지 않은 항체를 세척한 후, 란탄족 형광을 측정하는 방식으로 이루어진다. SPA 및 플래쉬플레이트 분석은 방사선 표지된 기질을 포착하기 위해서 일반적으로 비오틴/아비딘 상호작용을 활용한다. 동종 분석의 예로는 TR-FRET, FP, ALPHA 및 유전자 분석이 있다. TR-FRET 분석은 유로퓸 및 APC 사이의 형광 공명 에너지 전달과 중복 스펙트럼을 사용한 분석방법이다(Schobel, U. et al. (1999) Bioconjugate Chem. 10, 1107-1114). 형광 편광(FP) 분석은 용액 내 형광 기질 펩티드를 여기시키는 편광 빛을 사용하는 분석방법이다. ALPHA 분석은 인산화 펩티드에 의해 근접한 공여체 및 수용체 비드 사이의 단일선 산소의 이동을 이용한 분석방법이다. 유전자 분석의 예로는 two-hybrid 시스템 분석을 들 수 있다(Fields and Sternglanz (1994) Trends in Genetics, 10, 286-292; Colas and Brent (1998) TIBTECH, 16, 355-363).

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

세포배양, 바이러스 및 트랜스펙션

사람 배아 신장(HEK) 293T 및 사람 폐암(A549) 세포들을 7-10% 소 태아 혈청(GIBCO)이 첨가된 DMEM (Dulbeccomodified Eaglemedium) 배지(GIBCO, Grand Island, NY)에서 5% 이산화탄소를 가하며 37로 배양하였다. MDCK (Madin-Darby canine kidney) 세포들은 5% 소 태아 혈청 (FBS)을 함유한 Eagle salts와 함께 MEM (minimum essential medium)배지에서 배양하였다. 인플루엔자 A 바이러스 A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1) 및 A/WSN/1933 (H1N1)을 37에서 11일된 유정란에 감염시켰다. 인산칼슘법이나 Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여 세포들을 각각의 플라스미드 제작물로 트랜스펙션시키고, 발현 유도를 위해 12-48시간 동안 배양하였다.

모든 데이터는 평균±SEM으로 표시하였다. 두 그룹간의 통계적 유의성은 paired 또는 unpaired Studentt-tests로 분석하였다.

< 실시예 2>

Stau1 의 NS1 과의 결합 부위 동정

<2-1> 플라스미드 제작

전장(full-length) 및 일부가 제거된 Stau1을 발현하는 플라스미드를 제작하기 위하여(도 1), 전장 Stau1 cDNAs (Stau1⁵⁵ 및 Stau1⁶³)를 PCR로 증폭시킨 후, pCMV-Tag2B 벡터(Stratagene, La Jolla, CA)의 HindIII/XhoI (NEB, Ipswich, MA) 부위에 삽입시킴으로써, FLAG-표지된 Staufen1 또는 돌연변이들에 대한 다양한 Stau1 발현벡터들을 만들었다. 이들은 CMV 프로모터의 조절하에 있었다. 위 PCR에 사용한 프라이머는 표 1과 같다.

Myc-표지된 NS1 발현 플라스미드(Myc-PR8-NS1)를 만들기 위하여, 공지의 방법에 따라 바이러스 RNA 추출물로부터 합성한 cDNA 주형으로부터 A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1)의 NS1 유전자를 증폭시켰다[J.H. Lee, et al. Direct interaction of cellular hnRNP-F and NS1 of influenza A virus accelerates viral replication by modulation of viral transcriptional activity and host gene expression, Virology 397 (2009) 89-99]. 증폭물(amplicons)을 EcoRI/KpnI (NEB)으로 절단한 후, pcDNA3.1-Myc-His 플라스미드 벡터(Invitrogen)에 삽입하였다.

GFP-표지된 Stau1⁶³ 발현 플라스미드는 증폭된 전장 사람 Stau1⁶³을 pEGFP-C1 발현벡터(Clontech Laboratories, Mountain View, CA)의 XhoI/KpnI (NEB) 제한효소 부위에 삽입하여 만들었다.

<2-2> 면역침전

공동면역침전(coimmunoprecipitation) (co-IP) 분석을 위하여, 용해버퍼(150 mM NaCl, 1% IGEPAL CA-630, 50 mM TrisCl [pH 8.0])를 가하여 293T 세포 용해물을 준비한 후, 각각의 항체 2-3으로 면역침전시키고, 50 의 protein A-Sepharose (Amersham Biosciences, Tokyo, Japan)로 배양하였다. 면역침전물을 1 ml의 냉동(ice-cold)용해버퍼로 세 번 세척하고, 1 ml의 50 mM TrisCl (pH 8.0)로 한 번 세척하였다. 그 후, 8% SDS-PAGE 분석을 하였다. 웨스턴 블랏 분석을 위하여, 블랏(blot)을 모노클로날 항-Myc 항체(1:2000) 또는 항-FLAG 항체(1:2000)로 배양하였다. 대조군으로, 상기 블랏을 스트리핑(stripping) 버퍼(Thermo Scientific, Rockford, IL)로 세척하고, 다시 검출하였다(re-probed).

<2-3> 웨스턴 블럿

웨스턴 블랏팅 결과, Stau1⁶³ 및 Stau1⁵⁵ 모두 NS1과 상호작용하는 것으로 나타났다(도 1A). C-말단쪽을 제거한 돌연변이들 중 RBD3를 갖고 있는 것들은 NS1과 결합할 수 있었다(도 1C). 하지만, RBD3 영역만을 발현시킨 경우(RBD3)에는 바이러스 단백질을 함께 침전시키기에 충분하지 못했다. 숙주-바이러스 단백질 상호작용을 회복시키기 위해서는 RBD3와 RBD4 사이의 링커 영역(RBD3L)의 추가적인 발현이 필요했다(도 1D).

<실시예 3>

Stau1 및 NS1의 세포 내 위치(localization)

<3-1> 공초점 현미경 관찰 및 공동위치(colocalization) 분석

배양한 A549 세포들을 제작한 GFP-표지 전장 Stau1, Myc-표지 NS1, 및 대조군으로 pCMV-Tag2B 벡터, 또는 제작한 RBD2-함유 링커 영역(RBD2) 또는 RBD3-함유 링커 영역(RBD3L)으로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 24시간 후에, 위 배양물을 고정하고, 모노클로날 항-Myc 항체(9E10, Sigma, St. Louis, MO)로 면역염색한 후, 이어서 Cy3-연결 항-마우스 IgG 항체(Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) 및 DAPI (4,6-Diamidino-2-phenyindole) (Sigma)로 염색하였다. 추가적으로 RBD2 또는 RBD3L의 발현을 평가하기 위하여, 배양물을 모노클로날 항-FLAG 항체(M2, Sigma)로 면역염색하였다.

면역염색된 이미지들은 공초점 현미경(TCS-SP2 AOBS, Leica Microsystems, Heidelberg, Germany)으로 관찰하였고, 공동위치(colocalization)는 NIH 이미지 분석 프로그램(ImageJ ver. 1.42q)의 colocalization threshold 모드에서 분석하였다.

그 결과, 본 발명의 돌연변이들은 세포질(cytosol)에서 주로 발견되었으나, RBD3와 링커 영역이 없는 RBD2 또는 RBD3 상당량은 세포질뿐만 아니라 핵에서도 발견되었다. 반면에 RBD3 영역만을 포함하고 링커 영역이 없는 RBD3는 주로 세포질에 위치하였다(도 5 참조). 한편, 트랜스펙션 후 24시간째 거의 같은 양의 NS1을 세포질 내에서 발견할 수 있었다(도 6 참조).

또한, RBD3L의 발현 이후에 세포질과 핵에서 Stau1 및 NS1의 위치(colocalization)를 측정하였다. 배양된 A549 세포들을 GFP- Stau1, Myc-NS1, 및 FLAG-RBD3L 또는 FLAG-RBD2(음성대조군)로 트랜스펙션시키고, 24시간 후에 항-Myc 항체로 면역염색하였다. 그 후 공초점 현미경을 통해 Stau1 및 NS1의 세포질과 핵 안에서의 위치를 관찰하였다(도 3A). RBD3L의 공동발현은 세포질(도 3B, CTL: 100.0 ± 3.84%, N = 22, RBD2: 90.3 ± 5.06%, N = 13, RBD3L: 72.4 ±6.71%, N = 14; ***p < 0.001, ns: not significant compared with controls)과 핵(도 3B, CTL: 100.0 ± 4.33%, N = 26, RBD2: 89.86 ± 7.31%, N = 16, RBD3L: 63.97 ±8.40%, N = 15; ***p < 0.001, ns: not significant compared with controls) 모두에서 Stau1이 NS1과 함께 위치(colocalization)하는 경향을 상당히 감소시켰다.

<실시예 4>

Stau1 및 NS1의 RNA와의 관련성 분석

본 발명자들은 Stau1 및 NS1 단백질이 RNA 분자에 의존적인 방식으로 서로 상호작용하는지를 알아보기 위하여 RNase를 처리하였다. RNase 절단을 위하여, 공지의 방법에 따라 세포 용해물을 용해 버퍼 안에서 50 /ml의 RNase A (TypeXII-A, Sigma)로 4에서 15분간 배양하였다[C. Brendel, et al. Characterization of Staufen 1 ribonucleoprotein complexes, Biochem. J. 384 (2004) 239-246]. 총 RNA를 Trizol 시약(Invitrogen)을 사용하여 용해물의 1/10 부피부터 정제하고, 10% 아가로오스 젤 전기영동으로 분석하였다. 다른 언급이 없는 한, 모든 시료들은 Sigma Aldrich사에서 구입하였다.

결과적으로 RNase 처리는 Stau1-NS1 상호작용에 큰 영향을 미치지 못했다.

<실시예 5>

본 발명의 링커 영역의 Stau1-NS1 상호작용 억제효과

<5-1> 표적 유전자의 과발현과 바이러스 감염

Lipofectamine 2000 트랜스펙션 시약(Invitrogen)을 사용하여 A549 세포를 각각의 플라스미드(FLAG 플라스미드, FLAG-표지 전장 Staufen1, RBD3L, 및 RBD2)로 트랜스펙션시키고, 각각의 단백질의 발현을 유발시키기 위하여 24시간 동안 배양하였다. 트랜스펙션된 세포들을 1X PBS로 세척하고 이어서 A/WSN/1933 (H1N1) 바이러스로 감염시켰다(0.01 MOI). 부착되지 않은 바이러스들은 37에서 1.5시간 동안 배양한 후에 제거시키고 배양배지를 새롭게 보충하였다. 12, 24, 48, 및 72 h p.i.에서 바이러스 감염 세포들의 상층액을 수거하고, 바이러스를 MDCK 세포에서 공지의 방법에 따라 적정하였다[M.S. Song, et al. Virulence and Genetic Compatibility of Polymerase Reassortant Viruses Derived from the Pandemic

(H1N1) 2009 Influenza Virus and Circulating Influenza A Viruses, J. Virol. 85 (2011) 6275-6286].

<5-2> RBD3L의 발현이 Stau1-NS1 상호작용에 미치는 영향 분석

또한, RBD3L의 발현이 Stau1-NS1 상호작용을 억제하는지를 알아보기 위해, FLAG-Stau1을 여러 농도(1, 0.5, 또는 0.1 )의 FLAG-RBD3L과 함께 또는 단독으로 발현시킨 293T 세포에서 Myc-NS1을 면역침전시켰다. FLAG 항체에 대한 웨스턴 블랏팅 결과, RBD3L의 추가적인 발현은 Stau1과 NS1의 공동침전(coprecipitation)을 투여량에 비례적으로 감소시켰다(도 2). 특히 1의 RBD3L을 처리한 경우, NS1과 함께 침전된 Stau1의 양은 대조군에 비해 약 30% 감소하였다(도 2B).

<5-3> Stau1과 NS1 사이의 상호작용 방해에 따른 바이러스 복제에 미치는 영향 분석

본 발명자들은 Stau1과 NS1 사이의 상호작용을 방해하는 것이 바이러스 복제에 어떠한 영향을 미치는지를 조사하였다. 트랜스펙션시킨 A549 세포들(FLAG-표지 Stau1, RBD3L, RBD2, 또는 빈 벡터 대조군 플라스미드)을 24시간 후에 A/WSN/1933 바이러스로 감염시켰다(0.01 MOI). 지정된 시간 간격으로 채취한 바이러스 감염 샘플의 적정(titration) 결과 RBD3L-발현 세포들에서는, 24시간째를 제외하고, 실험한 거의 모든 시간에서 빈 벡터로 트랜스펙션시킨 대조군 세포들에 비하여 약 10배 정도 바이러스 적정량이 감소하였다(paired t-tests, 36 h: *p < 0.05, 48 h: **p < 0.01, 72 h: ***p < 0.001, N = 3) (도 4). 반면에, RBD2-트랜스펙션 세포들은 실험한 전체 시간 동안 대조군 벡터로 처리한 것과 유사한 바이러스 적정 결과를 나타냈다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Chungbuk National University <120> Composition for prevention and treatment of influenza A viral diseases <130> pn1204-169 <160> 14 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 108 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Staufen1 linker polynucleotide sequence <400> 1 aagaagttac cgcccctgcc tgcagttgaa cgagtaaagc ctagaatcaa aaagaaaaca 60 aaacccatag tcaagccaca gacaagccca gaatatggcc aggggatc 108 <210> 2 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Staufen1 linker region polypeptide sequence <400> 2 Lys Lys Leu Pro Pro Leu Pro Ala Val Glu Arg Val Lys Pro Arg Ile 1 5 10 15 Lys Lys Lys Thr Lys Pro Ile Val Lys Pro Gln Thr Ser Pro Glu Tyr 20 25 30 Gly Gln Gly Ile 35 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hStau63-D3-S primer <400> 3 cccaagctta tgaaacttgg aaaaaaacc 29 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hStau63-Xho-A primer <400> 4 ccgctcgagt cagcacctcc cacaca 26 <210> 5 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hStau63-RBD2-Xho-A primer <400> 5 ccgctcgagt caattgagat tttcttcttc gg 32 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hStau63-RBD3-D3-S primer <400> 6 cccaagctta tgaaatctga aataagtcaa gtg 33 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hStau63-RBD3-Xho-A primer <400> 7 ccgctcgagt cagatcccct ggccatattc 30 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hStau63-RBD4-Xho-A primer <400> 8 ccgctcgagt caggtgggct gcgcctgcg 29 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hStau63-TBD-Xho-A primer <400> 9 ccgctcgagt caatggctga tcagaggtgg 30 <210> 10 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hStau63-RBD3-Xho-A2 primer <400> 10 ccgctcgagt cacagctcct caagaacag 29 <210> 11 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RBD2-A primer <400> 11 gctaatcgga ttattgagat tttcttcttc gg 32 <210> 12 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RBD2-S primer <400> 12 gaaaatctca ataatccgat tagccgactg g 31 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hStau63-Xho-S primer <400> 13 ccgctcgagc tatgtctcaa gttcaagtgc 30 <210> 14 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hStau63-Kpn-A primer <400> 14 ggggtaccct aagaatacag atcactg 27

Claims

A형 인플루엔자 바이러스 단백질 NS1의 숙주 단백질인 Staufen1에 대한 결합을 방해하는 물질을 유효성분으로 포함하는 A형 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 및 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 물질은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 Staufen1의 링커(linker) 영역 또는 A형 인플루엔자 바이러스의 NS1과 상호작용하여 Staufen1과 NS1의 상호작용을 방해함으로써 인플루엔자 바이러스의 증식을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제2항에 있어서,
상기 A형 인플루엔자 바이러스의 NS1과 상호작용하는 물질은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,
상기 물질은 Staufen1을 암호화하는 유전자 내의 서열번호 1의 염기서열을 갖는 링커(linker) 영역의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제2항 또는 제4항에 있어서,
상기 물질은 뉴클레오티드, 안티센스, siRNA 올리고뉴클레오타이드, 천연 추출물, 펩티드, 항체, 단백질, 또는 화합물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,
상기 인플루엔자 바이러스 감염 질환은 감기, 독감, 인후염, 기관지염, 또는 폐렴인 것을 특징으로 하는 조성물.