JP2008543281A - 肝臓星状細胞特異的プロモーターおよびその使用 - Google Patents
肝臓星状細胞特異的プロモーターおよびその使用 Download PDFInfo
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Abstract
【選択図】図4
Description
本出願は、2005年6月9日に出願された米国仮出願第60/688733号からの優先権を主張し、これは、参照により完全に援用される。
本発明は、一般に、肝臓星状細胞(HSC)における導入遺伝子発現を遂行するための方法および試薬、トランスジェニックHSC、並びに抗線維特性をもつ化合物を同定するための試薬に関する。
本発明者らは、本明細書において、hGFAP遺伝子から2.2kbのプロモーター断片をHSCにおける導入遺伝子発現を駆動するために使用してもよいこと、およびさらに、この発現は、前線維形成因子に応答してアップレギュレートされることを報告する。これらの結果は、hGFAP遺伝子由来の2.2kbのプロモーターがHSC特異的発現を駆動することができることだけでなく、該プロモーターがHSCにおける導入遺伝子転写の誘導の役割を担うさらなる制御配列を含むことを証明する。
本発明者らは、驚くべきことに、ヒトGFAPプロモーターの断片がHSCにおいて活性であることを発見した。より具体的には、hGFAP遺伝子(アクセッション番号M67446)のヌクレオチド-2163〜+47(配列番号:1)に対応する2.2kbの断片は、ラットT6 HSC細胞において導入遺伝子発現を駆動することができるが、HepG2肝細胞、C3A細胞(HepG2のクローン誘導体)またはHeLa細胞においてはできない。HSC細胞培養において、hGFAPプロモーターに作動可能に結合された導入遺伝子の発現は、前線維性因子、トランスフォーミング成長因子-β1(TGF-β1)、血小板由来成長因子-BB(PDGF-BB)およびリポ多糖(LPS)により、用量依存的様式で誘導される。
2.2kbのhGFAP-lacZ導入遺伝子の構築
プラスミドベクターpcDNA4/TO/LacZ(Invitrogen、CA, USA)をクローニングバックボーンとして使用した。これは、大腸菌(E. coli)β-ガラクトシダーゼをコードする配列およびZeocin耐性遺伝子を提供する。この実験に使用した2.2kbのヒトGFAPプロモーターは、元来はインビトロ(Besnard et al. (1991), J Biol Chem. 266(28):18877)およびインビボ(Brenner et al. (1994), J Neurosci. 14: 1030)の両方におけるそのアストロサイト特異的発現に関してマップされた。pcDNA4/TO/lacZベクターのCMVTetO2プロモーターを2.2kbのGFAPプロモーターと置き換えて、これをBglII/HindIII消化によってもう一つの導入遺伝子GFAP-GFP-S65T(Zhuo et al.(1997), Developmental Biology 187:36)から切除した。プロモーター/コード領域連結部配列をDNAシーケンシングによって検証した。生じる9.5kbのプラスミド(図1に図示したとおり)は、我々のベクター保管所においてpcDNA4/GFAP2.2-LacZと命名した。
ラットHSC-T6株化細胞(Vogel et al. (2000), J Lipid Res. 41(6):882)は、Alex Hui博士(Chinese University of Hong Kong)を介してNew YorkのMount Sinai School of Medicine のScott Friedman博士から寛容に贈呈された。HepG2、C3A(HepG2のクローナル誘導体)、HeLaおよびNIH/3T3は、ATCC(American Type Culture Collection VA、USA)に由来した。C6は、JCRB(Japanese Collection of Research Bioresources, Osaka, Japan)に由来した。すべての細胞培地および試薬は、特に明記しない限り、Invitrogen(Carlsbad、California、USA)から購入した。すべての株化細胞は、10% FBSおよび1mlあたり100単位ペニシリン/100マイクログラム ストレプトマイシンを補ったDMEM(ダルベッコ修正イーグル培地)(完全DMEM)中で37℃にて5%のCO2の加湿雰囲気においてルーチン的に培養した。細胞は、週2回、トリプシン処理(0.05%のトリプシン/0.53mM EDTA)によって1:3の比にルーチン的に分けた。
T6、C6およびHeLa細胞には、製造業者(Invitrogen、CA, USA)によって提供される説明書にしたがってリポフェクトアミン2000キットを使用して直線化した0.5〜1.0μgのプラスミドベクターを安定にトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後、培地を交換し、後述したとおりのさらなるアッセイを行う前の少なくとも6週間、選択のための250〜500μg/mlのZeocin(商標)を補充した。安定なトランスフェクト細胞を維持するための終濃度は、500μg/ml Zeocin(商標)であった。あるいは、HepG2、C3AおよびNIH/3T3には、FuGene 6キット(Roche Diagnostics)を使用して環状プラスミドを一過性にトランスフェクトした。
安定なトランスフェクタントのゲノム内への導入遺伝子完全性および組込みを確認するために、NucleoSpin血液キット(Macherey & Nagel, Duren, Germany)を使用して、500μg/ml Zeocin選択下で少なくとも2月間、安定な細胞クローンからゲノムDNAを単離した。ポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)ストラテジーを使用して、フォワードプライマー5'-ACTCCTTCATAAAGCCCTCG-3'[配列番号:2](GFAPプロモーターに対して相補的)およびリバースプライマー5'-AACTCGCCGCACATCTGAACTTCAGC-3'[配列番号:3](lacZコード配列に対して相補的)で、挿入された構築物の構造保全を検証した。Platinum PCR SuperMix High fidelity (Invitrogen, CA, USA)を使用して、サーマルサイクラーでのDNA増幅を行った。PCR産物は、0.5×TAE緩衝液中でのRunOne電気泳動系(EmbiTec、CA, USA)において1%のアガロースゲルで解析した。終了したゲルをAlphaDigiDocフォトシステム(Alpha Innotech、CA, USA)で記録した。予想されるPCR産物は、944bpのサイズであった。
総細胞RNAは、製造業者の説明書にしたがってNucleoSpin RNAIIキット(Macherey-Nagel, Duren, Germany)を使用することにより、6穴プレート中で培養した細胞から抽出した。RNA濃度は、ND-100分光光度計(Nanodrop Technologies、DE、USA)で決定した。50ナノグラムの総RNAを使用して、ユーザーズ・マニュアルにしたがってワンステップRT-PCR(Qiagen、Hilden、Germany)を行った。使用したプライマーは、以下の通りであった:フォワード5’-TCAGCTTGGAGTTGATCCCGTCG-3’[配列番号:4] およびリバース5’-AACAAACGGCGGATTGACCGTAATGG-3’[配列番号:5]。反応条件は、50℃30分(cDNA)合成、95℃15分(変性)、94℃10秒、55℃10秒、72℃19秒を35サイクル(PCR)であった。産物サイズ(337bp)は、3%のアガロースゲル中で検証した。β-アクチン(332bp)を参照として使用された。
細胞染色(InvivoGen、CA, USA)のためのlacZリポーターアッセイキットを使用して、安定および一過性の両方の形質移入体におけるリポーター遺伝子活性を検出した。青い最終産物の発色を種々の時間的間隔(15、30、60、90、および120分)にてモニターした。染色結果は、デジタルカメラ(DP12)をオリンパス倒立明視野顕微鏡(IX51)に装着して記録した。
図4〜10において報告した細胞抽出物中のβ-ガラクトシダーゼ活性を定量化するために、製造業者の説明書にしたがって酵素アッセイキット(E2000、Promega、WI、USA)を使用して、96穴形式で、β-ガラクトシダーゼの比活性を測定した。簡潔には、細胞を1×PBS緩衝液(pH7.4)で2回洗浄し、リポーター溶解緩衝液で室温にて15分間溶解して、細胞スクレーパーを使用して収集した。総細胞抽出物を適切に希釈し(5〜10倍)、酵素活性についてアッセイした。特異的β-ガラクトシダーゼ活性は、標準的β-ガラクトシダーゼから確立した標準曲線(キットと共に提供された)を使用してミリリットルあたりのミリ単位(mU/ml)で表した。タンパク質濃度は、BCAタンパク質アッセイキット(Pierce、IL、USA)で測定して、特異的β-ガラクトシダーゼ活性をmU/mlからmU/μg総細胞タンパク質にさらに変換するために使用した。6回の独立した実験をそれぞれの時間および濃度データポイントについて行った。
細胞を完全DMEMおよび500μg/ml Zeocin中の12穴プレートに播種した。サイトカイン処理の12時間前に、細胞を低血清(0.5% FBS)DMEM中で培養させるために培地を交換した。70〜80%コンフルエンスの細胞を種々の濃度(0、0.1、1および10ng/ml)の組換えヒトTGF-β1、PDGF-BB(BioVision, CA, USA)、並びに0、0.1、1および10μg/mlのリポ多糖(LPS、大腸菌(E. coli)、Sigma)と共に、それぞれに0、2、8、16、24、48および72時間インキュベートした後、これらをβ-ガラクトシダーゼ活性アッセイ法およびリアルタイムRT-PCR GFAPアッセイ法のために収集した。
総RNAは、Taqman逆転写試薬を使用してcDNAに逆転写した(Cat. # N808-0234)。合計400ngのRNAの合計7.7μlのヌクレアーゼフリー水溶液を2μlの10X逆転写酵素緩衝液、4.4μlの25mM塩化マグネシウム、4μlのデオキシNTP混合物、1μlのランダムヘキサマー、0.4μlのRNase阻害剤および0.5μlの逆転写酵素(50U/μl)に20μlの最終反応体で添加した。反応は、25℃にて10分(アニーリング)、48℃にて30分(cDNA合成)および95℃にて5分(酵素変性)の間行った。
全ての定量的結果は、平均±SEして示した。実験データを、両側スチューデントt検定を使用して解析して不等分散を推定した。P値≦0.05を統計学的に有意であるとみなした。
トランスジェニックGFAP-GFPマウスの産生および遺伝子タイピングは、前述したように行った(Zhuo (1997), Developmental Biology 187:36)。マウスを0.1Mリン酸緩衝液塩類溶液(PBS、pH 7.4)および4% パラホルムアルデヒドで灌流した。肝臓を収集して、4℃にて30%のショ糖中に一晩浸漬させた。次いで、クリオスタット(Leica Microsystems、Germany)を使用して、肝臓を凍結切片に包埋させた。GFPおよびGFAP免疫染色のためには、マウス抗GFPモノクローナル抗体(Clontech、USA)およびウサギ抗GFAPポリクローナル抗体(DakoCytomation、Denmark;Z-0334)を使用した。凍結切片を0.15Mの1×PBS中で5分間洗浄し、続いて0.1%(v/v)Triton X-100および10% 非免疫ヤギ血清を含むPBSのブロッキング溶液中で4℃にて4時間インキュベートした。次いで、凍結切片を0.15Mの1×PBS中で3回それぞれ15分間洗浄した。次いで、肝臓切片を抗GFP抗体(1:200)および抗GFAP抗体(1:200)と共に0.01%(v/v)のTriton X-100および1%の非免疫ヤギ血清を含む1×PBS中で4℃にて一晩インキュベートした。1×PBS中での3×15分すすぎの後、切片をFITC(Sigma Chemicals、USA)抱合ヤギ抗マウスIgGおよびTexas-赤(Abcam、U.K.)抱合ヤギ抗ウサギIgGと共に0.01%(v/v)のTriton X-100および1%の非免疫ヤギ血清を含むPBS中にて1:100希釈にて室温で2時間インキュベートした。1×PBS中で3×15分のすすぎの後に、切片を10マイクロリットルの蛍光培地にカバーガラスして、共焦点レーザー走査顕微鏡(Olympus、Japan)で撮影した。
GFAP-lacZでの非GFAP発現株化細胞の一過性トランスフェクション
いくつかの一般に使用される非GFAP発現株化細胞における2.2kbのhGFAP-lacZ導入遺伝子の考えられるあらゆる異常な発現があるかどうかを調査するために、本発明者らは、ポジティブ対照としてCMV-lacZプラスミド(Invitrogen)を用いて、円形の導入遺伝子で3種の株化細胞(HepG2、C3AおよびNIH/3T3)を一過性にトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を選択薬剤のない完全DMEM培地中で2日間成育させた後、全3種の株化細胞をX-gal染色法によってβ-ガラクトシダーゼの発現について調べた。CMV-lacZをトランスフェクトした3種の株のそれぞれにおいて、およそ10〜30%細胞が2時間のX-gal染色後に青い染色を示した(lacZ発現の指標)。これに対して、GFAP-lacZをトランスフェクトした3つの株のいずれにおいても、1つの細胞も何らの青い染色を示さなかった。これは、これらの株化細胞におけるGFAPプロモーターによって駆動されるlacZ発現が全くないことを示す。全3種の株化細胞についての2回の独立した実験からの代表的イメージを図2に示してある。X-gal染色の24時間後、HepG2由来の少数の細胞がトランスフェクトした群およびトランスフェクトしていない群の両方において同様に青い色を示し(データ示さず)、導入遺伝子とは無関係である内因性ガラクトシダーゼ様活性を指し示している。青い細胞は、トランスフェクトしたC3AおよびNIH/3T3において観察されなかった。
GFAPプロモーターが特異的に肝臓星状細胞型において遺伝子発現を指揮することができるかどうかは、未知であった。本発明者らは、ラットアストロサイトC6株化細胞およびヒトHeLa株化細胞をそれぞれポジティブおよびネガティブ対照として使用してGFAP-lacZ導入遺伝子をラット肝臓星状株化細胞T6に安定にトランスフェクトすることによって、この可能性を試験することに決めた(Vogel et al. (2000), J Lipid Res. 41(6):882)。少なくとも6週間の250〜500mg/mlのZeocin中での選択後、いくつかの独立した安定な細胞クローンがそれぞれの株化細胞について得られた。その後、ゲノムDNAを解析のためにPCRによって単離して、導入遺伝子完全性および宿主ゲノム内への良好な組込みについて調べた。PCR結果は、944bpの予想される産物サイズの存在によって証明されるように(図3A)、すべての株化細胞において無傷の導入遺伝子組込みを確認した。さらにまた、総RNAを安定なトランスフェクタントから単離して、lacZ転写物について検証するためにRT-PCRを行った。337bpの予測されるサイズにおける特異的バンドの存在により、ポジティブ対照C6株において、およびさらに重要なことに我々の標的T6株でも同様にlacZ転写を示したが、ネガティブ対照株HeLaでは示さなかった(図3B)。β-アクチン試料は、等量のRNA添加のための対照として図3Cに示してある。次に、3種の株化細胞のそれぞれから1つのクローンを、1時間のX-gal染色のためにランダムに選択した。図4に示したように、C6およびT6細胞は、ポジティブであり、HeLaは、青色染色がネガティブであった。したがって、初めて、GFAPに基づいたリポーター遺伝子が、肝臓星状株化細胞において特異的に発現することが示された。今後、2.2kbのhGFAP-lacZ導入遺伝子が安定にトランスフェクトされたT6細胞クローン(T6/lacZ/C1クローンと命名した)は、下記に記述した追実験のために使用した。
活性化されたHSCにおける前線維性および炎症誘発性の特性をもつ分子によるGFAP-lacZ発現の可能性ある誘導を決定するために、T6/lacZ/C1細胞を完全DMEM培地中において種々の濃度(0、0.1、1および10ng/ml)のTGF-β1、PDGF-BBおよびLPSのそれぞれで72時間処理した。次いで、細胞を1時間X-galで染色して撮影した。未処置のものと比較したときに、前線維性のTGF-β1(図5)および炎症誘発性LPS(図7)で処理した細胞は、より強度の青色染色を0.1〜10ng/mlから示し、その一方で、前増殖性PDGF-BB(図6)は、あまりはっきりした反応を示さなかった。真に定量的なデータを得るために、溶液アッセイ法を使用して、下記の実験においてTGF-β1によるβ-ガラクトシダーゼ活性の起こりうるアップレギュレーションを測定した。
β-ガラクトシダーゼ活性アッセイキット(Promega、WI、USA)を使用して、ネガティブ基礎対照として非トランスフェクトT6を用いて、T6/lacZ/C1クローンにおける導入遺伝子発現レベルを測定した。完全DMEM培地中で70〜80%コンフルエンスまで増殖したときに、T6/lacZ/C1細胞では、正常T6細胞のものの約5倍の、およそ0.5mU/μgの平均読み(reading)を得た。T6細胞における基礎読みは、サイトカインまたはLPS(データ示さず)の添加による影響を受けなかった。比較目的のために、2.2kbのhGFAP-lacZ導入遺伝子を含むランダムに選択したC6クローン(C6/lacZ/C4と命名した)におけるβ-ガラクトシダーゼ活性は、T6/lacZ/C1細胞におけるものの3倍の、約2mU/μgの活性を有することが測定された。TGF-β1(0〜10ng/ml)と共にインキュベートしたときに、C6/lacZ/C4細胞では未処置の対照の130〜200%の誘導動態を得た。同様の条件下で、T6/lacZ/C1は、類似の結果を示した(下記のデータを参照されたい)。これらのデータは、サイトカインにより導入遺伝子誘導を定量化するための現在のアッセイ法の使用を確認した。
TGF-β1に応答する特異的導入遺伝子を定量化するために、本発明者らは、最初に血清中濃度および培養期間が導入遺伝子発現に対して有するであろう起こりうる効果を評価するための実験をセットアップした。T6/lacZ/C1細胞を最初に、高血清(10% FBS)でのDMEM中で培養し、次いで、一部の細胞を、TGF-β1(1ng/ml)の添加の前に12時間、低血清(0.5% FBS)でのDMEMによって欠乏させた。種々の時間(0、2、8、24、48および72時間)でのインキュベーション後、細胞をβ-ガラクトシダーゼ活性アッセイ法のために収集した。驚くべきことに、導入遺伝子発現は、12時間のあいだに、単に10%〜0.5%まで血清中濃度を低下させることによって、0.29mU/μg〜0.42mU/μg(または、24%の増大)へ有意に(P<0.001)増加した。0時間にてTGF-β1の添加後(0.5% FBSである培地へ)、導入遺伝子発現レベルが2および8時間にて迅速に上昇し、最終的には24時間にてピークに達し、0.52mU/μgの比活性であった。48時間にて、発現レベルは、0時間と同レベルに低下した。72時間後に、レベルは、0時間(P<0.001)にける値の58%まで低下した。アッセイ結果を図8に示した。
GFAPが、デスミン、SMAAおよびビメンチンに加えて、クローンT6細胞において発現されたことが公知であった(Vogel et al.(2000)J Lipid Res. 41(6):882)。当然、内因性GFAPも同様にT6/lacZ/C1細胞において発現されるはずである。内因性GFAP発現が、種々の時間経過の間にT6/lacZ/C1細胞においてTGF-β1によってどのように調節されるかを調査するために、本発明者らは、リアルタイムRT-PCR法を使用し、ラットGFAP mRNAレベルを定量化した。上記の酵素アッセイ実験のために記述したように、細胞を同じように培養し、TGF-β1(1ng/ml)で種々の時間(0、2、8、16、24、48および72時間)処理した。総RNAは、異なる細胞から単離して、材料および方法に記載したように定量化し、結果を図11に示した。0時間における基礎レベル(1に規準化した)と比較したときに、GFAP mRNAレベルは、16時間にて短時間であるが有意な抑制(0.5倍)(P<0.005)、次いで48および72時間にてそれぞれ基礎レベルの7および8.5倍まで鋭く増加した以外は、最初の24時間以内は安定したままであった。
Claims (44)
- 肝臓星状細胞においてトランスジェニック産物を発現するための方法であって、前記トランスジェニック産物をコードするDNA配列に作動可能に結合されたグリア原線維酸性タンパク質プロモーターを含むベクターを前記肝臓星状細胞にトランスフェクトすることを含み、前記グリア原線維酸性タンパク質プロモーターは、配列番号1に記載された配列からなるか、または配列番号:1に記載された配列の対立遺伝子変異体もしくは誘導体である方法。
- 前記グリア原線維酸性タンパク質プロモーター配列が配列番号:1に記載された配列からなる、請求項1に記載の方法。
- 前記トランスジェニック産物がマーカー分子である、請求項1または請求項2に記載の方法。
- 前記マーカー分子がマーカータンパク質である、請求項3に記載の方法。
- 前記マーカータンパク質がβ-ガラクトシダーゼである、請求項4に記載の方法。
- 前記トランスジェニック産物が治療的分子である、請求項1または請求項2に記載の方法。
- 前記治療的分子が治療的ポリペプチドである、請求項6に記載の方法。
- 前記治療的ポリペプチドがSmad 7か、Smad 3、Smad 4もしくはトランスフォーミング成長因子受容体または血小板由来成長因子受容体もしくはジフテリア(diptheria)毒素のドミナントネガティブ対立遺伝子である、請求項7に記載の方法。
- 前記治療的ポリペプチドが抗線維性ポリペプチドである、請求項7に記載の方法。
- 前記抗線維性ポリペプチドがインターロイキン10である、請求項9に記載の方法。
- 前記トランスジェニック産物が短鎖干渉RNAである、請求項1または請求項2に記載の方法。
- 前記短鎖干渉RNAがTGF-β1 mRNAの一部または血小板由来増殖因子mRNAの一部に対して相補的である、請求項11に記載の方法。
- 前記短鎖干渉RNAが細胞外基質タンパク質をコードするmRNAの一部に対して相補的である、請求項11に記載の方法。
- 前記細胞外基質タンパク質がコラーゲンα1(I)、インテグリン、ラミニンまたはフィブロネクチンである、請求項13に記載の方法。
- 前記肝臓星状細胞がHSC-T6、LX-1またはLX-2である、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 前記肝臓星状細胞がHSC-T6である、請求項15に記載の方法。
- 前記肝臓星状細胞がLX-2である、請求項15に記載の方法。
- 単離されたトランスジェニック肝臓星状細胞であって、前記細胞は、グリア原線維酸性タンパク質プロモーターに作動可能に結合された導入遺伝子を含み、前記プロモーターは、配列番号:1に記載された配列または配列番号:1に記載された配列の対立遺伝子変異体もしくは誘導体からなる細胞。
- 前記グリア原線維酸性タンパク質プロモーターが配列番号:1に記載された配列からなる、請求項18に記載の単離されたトランスジェニック肝臓星状細胞。
- 前記導入遺伝子がマーカー分子をコードする、請求項18または請求項19に記載の単離されたトランスジェニック肝臓星状細胞。
- 前記マーカー分子がマーカータンパク質である、請求項20に記載の単離されたトランスジェニック肝臓星状細胞。
- 前記マーカータンパク質がβで-ガラクトシダーゼある、請求項21に記載の単離されたトランスジェニック肝臓星状細胞。
- 前記導入遺伝子が治療的分子をコードする、請求項18または請求項19に記載の単離されたトランスジェニック肝臓星状細胞。
- 前記治療的分子が治療的ポリペプチドである、請求項23に記載の単離されたトランスジェニック肝臓星状細胞。
- 前記治療的ポリペプチドがSmad 7か、Smad 3、Smad 4もしくはトランスフォーミング成長因子受容体または血小板由来成長因子受容体もしくはジフテリア(diptheria)毒素のドミナントネガティブ対立遺伝子である、請求項24に記載の単離されたトランスジェニック肝臓星状細胞。
- 前記治療的ポリペプチドが抗線維性ポリペプチドである、請求項24に記載の単離されたトランスジェニック肝臓星状細胞。
- 前記抗線維性ポリペプチドがインターロイキン10である、請求項25に記載の単離されたトランスジェニック肝臓星状細胞。
- 前記導入遺伝子が短鎖干渉RNAをコードする、請求項18または請求項19に記載の単離されたトランスジェニック肝臓星状細胞。
- 前記短鎖干渉RNAがTGF-β1 mRNAの一部に対して相補的である、請求項28に記載の単離されたトランスジェニック肝臓星状細胞。
- 前記短鎖干渉RNAがコラーゲンα1(I)mRNAの一部に対して相補的である、請求項28に記載の単離されたトランスジェニック肝臓星状細胞。
- 抗線維性薬剤を同定する方法であって、
a)請求項18〜22のいずれか1項に記載の単離されたトランスジェニック肝臓星状細胞を提供することと;
b)前記導入遺伝子の第1の発現レベルを検出することと;
c)前記単離されたトランスジェニック肝臓星状細胞を試験化合物に対して曝露することと;
d)前記導入遺伝子の第2の発現レベルを検出することと;および、
e)前記第1の発現レベルと前記第2の発現レベルを比較することと、
を含み、これにより、前記第2の発現レベルよりも大きい前記第1の発現レベルは、前記試験化合物が抗線維性試薬であることを示す方法。 - 前記導入遺伝子がマーカータンパク質をコードする、請求項31に記載の方法。
- 前記マーカータンパク質がβ-ガラクトシダーゼである、請求項32に記載の方法。
- 被験体における肝線維症に関連した障害を治療する方法であって、前記被験体にベクターの有効量を投与することを含み、前記ベクターは、グリア原線維酸性タンパク質プロモーターに作動可能に結合された治療的産物をコードするDNA配列を含み、前記グリア原線維酸性タンパク質プロモーターは、配列番号1に記載された配列からなるか、または配列番号:1に記載された配列の対立遺伝子変異体もしくは誘導体である方法。
- 前記グリア原線維酸性タンパク質プロモーターが配列番号1に記載された配列からなる、請求項34に記載の肝線維症に関連した障害を治療する方法。
- 前記被験体がヒト被験者である、請求項34または35に記載の方法。
- 肝線維症に関連した障害を治療するための、グリア原線維酸性タンパク質プロモーターに作動可能に結合された治療的産物をコードするDNA配列を含むベクターの使用であって、前記グリア原線維酸性タンパク質プロモーターは、配列番号1に記載された配列からなるか、または配列番号:1に記載された配列の対立遺伝子変異体もしくは誘導体である使用。
- 前記グリア原線維酸性タンパク質プロモーターが配列番号1に記載された配列からなる、請求項37に記載の使用。
- 肝線維症に関連した障害を治療するための医薬の製造のための、グリア原線維酸性タンパク質プロモーターに作動可能に結合された治療的産物をコードするDNA配列を含むベクターの使用であって、前記グリア原線維酸性タンパク質プロモーターは、配列番号1に記載された配列からなるか、または配列番号:1に記載された配列の対立遺伝子変異体もしくは誘導体である使用。
- 前記グリア原線維酸性タンパク質プロモーターが配列番号1に記載された配列からなる、請求項39に記載の使用。
- 肝線維症に関連した障害を治療するための、グリア原線維酸性タンパク質プロモーターに作動可能に結合された治療的産物をコードする配列を含むベクターであって、前記グリア原線維酸性タンパク質プロモーターは、配列番号1に記載された配列からなるか、または配列番号:1に記載された配列の対立遺伝子変異体もしくは誘導体であるベクターと生理学的な担体とを含む医薬品製剤。
- 前記グリア原線維酸性タンパク質プロモーターが配列番号1に記載された配列からなる、請求項41に記載の医薬品製剤。
- 被験体における肝線維症に関連した障害を治療する方法であって、前記被験体に対してトランスジェニックHSCの有効量を投与することを含み、前記トランスジェニックHSCは、治療的産物をコードする導入遺伝子を含み、前記導入遺伝子は、グリア原線維酸性タンパク質プロモーターに作動可能に結合されており、および前記プロモーターは、配列番号1に記載された配列からなるか、または配列番号:1に記載された配列の対立遺伝子変異体もしくは誘導体である方法。
- グリア原線維酸性タンパク質プロモーターに作動可能に結合された治療的産物をコードする配列を含むベクターであって、前記グリア原線維酸性タンパク質プロモーターは、配列番号1に記載された配列からなるか、または配列番号:1に記載された配列の対立遺伝子変異体もしくは誘導体であるベクターと、被験体の肝線維症に関連した障害を治療するための説明書とを含むキット。
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