RU2810191C1 - Нуклеиновая кислота, предназначенная для снижения массы тела млекопитающего, экспрессионный вектор для экспрессии в клетках млекопитающего, способ его доставки и способ снижения массы тела млекопитающего - Google Patents
Нуклеиновая кислота, предназначенная для снижения массы тела млекопитающего, экспрессионный вектор для экспрессии в клетках млекопитающего, способ его доставки и способ снижения массы тела млекопитающего Download PDFInfo
- Publication number
- RU2810191C1 RU2810191C1 RU2023127016A RU2023127016A RU2810191C1 RU 2810191 C1 RU2810191 C1 RU 2810191C1 RU 2023127016 A RU2023127016 A RU 2023127016A RU 2023127016 A RU2023127016 A RU 2023127016A RU 2810191 C1 RU2810191 C1 RU 2810191C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- expression vector
- body weight
- expression
- mammal
- foxp4
- Prior art date
Links
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 title claims abstract description 66
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 45
- 230000037396 body weight Effects 0.000 title claims abstract description 32
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 22
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 22
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 22
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims description 35
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 title claims description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 27
- 108010048992 Transcription Factor 4 Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 102000009523 Transcription Factor 4 Human genes 0.000 claims abstract 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 49
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 claims description 32
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 claims description 26
- 101000861403 Homo sapiens Forkhead box protein P4 Proteins 0.000 claims description 21
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 20
- 102100027579 Forkhead box protein P4 Human genes 0.000 claims description 19
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 19
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 10
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 10
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 9
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 abstract description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 abstract description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 42
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 35
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 35
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 16
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 15
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 10
- 102100023489 Transcription factor 4 Human genes 0.000 description 9
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 9
- 108010050258 Mitochondrial Uncoupling Proteins Proteins 0.000 description 8
- 102000015494 Mitochondrial Uncoupling Proteins Human genes 0.000 description 8
- 210000003486 adipose tissue brown Anatomy 0.000 description 8
- 238000011161 development Methods 0.000 description 8
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 8
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 8
- 108010072151 Agouti Signaling Protein Proteins 0.000 description 7
- 101150022052 UCP1 gene Proteins 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 7
- 102100024594 Histone-lysine N-methyltransferase PRDM16 Human genes 0.000 description 6
- 101100120553 Homo sapiens FOXP4 gene Proteins 0.000 description 6
- 101000686942 Homo sapiens Histone-lysine N-methyltransferase PRDM16 Proteins 0.000 description 6
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 102000006822 Agouti Signaling Protein Human genes 0.000 description 5
- 241000484025 Cuniculus Species 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- 102100021244 Integral membrane protein GPR180 Human genes 0.000 description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- -1 PDGF Proteins 0.000 description 5
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 5
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 5
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 5
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 5
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 5
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 5
- AQQSXKSWTNWXKR-UHFFFAOYSA-N 2-(2-phenylphenanthro[9,10-d]imidazol-3-yl)acetic acid Chemical compound C1(=CC=CC=C1)C1=NC2=C(N1CC(=O)O)C1=CC=CC=C1C=1C=CC=CC=12 AQQSXKSWTNWXKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000016970 Follistatin Human genes 0.000 description 4
- 108010014612 Follistatin Proteins 0.000 description 4
- 101100521059 Homo sapiens PRDM16 gene Proteins 0.000 description 4
- 101001067833 Homo sapiens Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase A Proteins 0.000 description 4
- 108010008364 Melanocortins Proteins 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 101150063753 PRDM16 gene Proteins 0.000 description 4
- 102100034539 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase A Human genes 0.000 description 4
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000002865 melanocortin Substances 0.000 description 4
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 4
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 4
- 210000000229 preadipocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 4
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 4
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 102100039939 Growth/differentiation factor 8 Human genes 0.000 description 3
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 3
- 108010056852 Myostatin Proteins 0.000 description 3
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 3
- 210000000593 adipose tissue white Anatomy 0.000 description 3
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 102000005606 Activins Human genes 0.000 description 2
- 108010059616 Activins Proteins 0.000 description 2
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000852 Forkhead Transcription Factors Proteins 0.000 description 2
- 102000004315 Forkhead Transcription Factors Human genes 0.000 description 2
- 101150095249 Fst gene Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 2
- 101000899111 Homo sapiens Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 2
- 206010020710 Hyperphagia Diseases 0.000 description 2
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 2
- 102100023915 Insulin Human genes 0.000 description 2
- 102000004378 Melanocortin Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108090000950 Melanocortin Receptors Proteins 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 2
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 2
- 108091034131 VA RNA Proteins 0.000 description 2
- 208000008383 Wilms tumor Diseases 0.000 description 2
- 208000026448 Wilms tumor 1 Diseases 0.000 description 2
- 102100022748 Wilms tumor protein Human genes 0.000 description 2
- 101710127857 Wilms tumor protein Proteins 0.000 description 2
- 239000000488 activin Substances 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 210000001593 brown adipocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 2
- 230000004098 cellular respiration Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 230000037323 metabolic rate Effects 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000009753 muscle formation Effects 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 230000037081 physical activity Effects 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 2
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 2
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 2
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 2
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000636 white adipocyte Anatomy 0.000 description 2
- UBWXUGDQUBIEIZ-UHFFFAOYSA-N (13-methyl-3-oxo-2,6,7,8,9,10,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl) 3-phenylpropanoate Chemical compound CC12CCC(C3CCC(=O)C=C3CC3)C3C1CCC2OC(=O)CCC1=CC=CC=C1 UBWXUGDQUBIEIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000649044 Adeno-associated virus 9 Species 0.000 description 1
- 102000014777 Adipokines Human genes 0.000 description 1
- 108010078606 Adipokines Proteins 0.000 description 1
- 108010080691 Alcohol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- 101710186200 CCAAT/enhancer-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100032141 Cell death activator CIDE-A Human genes 0.000 description 1
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 description 1
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000005636 Cyclic AMP Response Element-Binding Protein Human genes 0.000 description 1
- 108010045171 Cyclic AMP Response Element-Binding Protein Proteins 0.000 description 1
- 102100023033 Cyclic AMP-dependent transcription factor ATF-2 Human genes 0.000 description 1
- 102100023580 Cyclic AMP-dependent transcription factor ATF-4 Human genes 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 208000032928 Dyslipidaemia Diseases 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 1
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 1
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100031706 Fibroblast growth factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 1
- 101001066288 Gallus gallus GATA-binding factor 3 Proteins 0.000 description 1
- 102100033295 Glial cell line-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- 102000034615 Glial cell line-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- 108091010837 Glial cell line-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 1
- 102100039619 Granulocyte colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 101150068639 Hnf4a gene Proteins 0.000 description 1
- 101000775570 Homo sapiens Cell death activator CIDE-A Proteins 0.000 description 1
- 101000974934 Homo sapiens Cyclic AMP-dependent transcription factor ATF-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000905743 Homo sapiens Cyclic AMP-dependent transcription factor ATF-4 Proteins 0.000 description 1
- 101000997829 Homo sapiens Glial cell line-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 1
- 101000746367 Homo sapiens Granulocyte colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 1
- 101001123331 Homo sapiens Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000837845 Homo sapiens Transcription factor E3 Proteins 0.000 description 1
- 101000837829 Homo sapiens Transcription factor IIIA Proteins 0.000 description 1
- 102000002746 Inhibins Human genes 0.000 description 1
- 108010004250 Inhibins Proteins 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 239000005909 Kieselgur Substances 0.000 description 1
- 208000003947 Knee Osteoarthritis Diseases 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 101000844802 Lacticaseibacillus rhamnosus Teichoic acid D-alanyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 208000017170 Lipid metabolism disease Diseases 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 102000009151 Luteinizing Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010073521 Luteinizing Hormone Proteins 0.000 description 1
- 101150078498 MYB gene Proteins 0.000 description 1
- 108020005196 Mitochondrial DNA Proteins 0.000 description 1
- 102100032970 Myogenin Human genes 0.000 description 1
- 108010056785 Myogenin Proteins 0.000 description 1
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 102000003982 Parathyroid hormone Human genes 0.000 description 1
- 108090000445 Parathyroid hormone Proteins 0.000 description 1
- 101710111198 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase A Proteins 0.000 description 1
- 102100028960 Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha Human genes 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 101710098940 Pro-epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108091027981 Response element Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 101100368917 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) taz1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101001008392 Serratia marcescens Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 description 1
- 101001062859 Sus scrofa Fatty acid-binding protein, adipocyte Proteins 0.000 description 1
- 238000010459 TALEN Methods 0.000 description 1
- 101001023030 Toxoplasma gondii Myosin-D Proteins 0.000 description 1
- 108010043645 Transcription Activator-Like Effector Nucleases Proteins 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102100028507 Transcription factor E3 Human genes 0.000 description 1
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010017070 Zinc Finger Nucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000000478 adipokine Substances 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 230000036528 appetite Effects 0.000 description 1
- 235000019789 appetite Nutrition 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 230000010072 bone remodeling Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000002487 chromatin immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229940119679 deoxyribonucleases Drugs 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000003467 diminishing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009266 disease activity Effects 0.000 description 1
- 208000016097 disease of metabolism Diseases 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 235000004280 healthy diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000020169 heat generation Effects 0.000 description 1
- 235000009200 high fat diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 229940084986 human chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 1
- 201000001421 hyperglycemia Diseases 0.000 description 1
- 230000001969 hypertrophic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003016 hypothalamus Anatomy 0.000 description 1
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000000893 inhibin Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 229940040129 luteinizing hormone Drugs 0.000 description 1
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003818 metabolic dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 230000008437 mitochondrial biogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000037257 muscle growth Effects 0.000 description 1
- 230000003387 muscular Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 239000000199 parathyroid hormone Substances 0.000 description 1
- 229960001319 parathyroid hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000007310 pathophysiology Effects 0.000 description 1
- 239000000816 peptidomimetic Substances 0.000 description 1
- 238000001050 pharmacotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229940068977 polysorbate 20 Drugs 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 229940126586 small molecule drug Drugs 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 1
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 230000002889 sympathetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001179 synovial fluid Anatomy 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000035924 thermogenesis Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к генотерапевтическим методам с использованием гена транскрипционного фактора 4 FOXP (FOXP4), и может быть использовано в медицине для снижения массы тела млекопитающего. Предложены кодирующая FOXP4 нуклеиновая кислота, содержащий ее экспрессионный вектор, способ его доставки в жировые отложения млекопитающего и способ снижения массы тела млекопитающего. Изобретение обеспечивает получение средства для эффективного снижения массы тела млекопитающих. 4 н. и 4 з.п. ф-лы, 3 ил., 2 табл., 3 пр.
Description
Группа изобретений относится к области молекулярной биотехнологии и экспериментальной медицины, в частности к молекулярной медицине, касается нуклеиновой кислоты, предназначенной для снижения массы тела млекопитающего, плазмидного экспрессионного вектора для экспрессии в клетках млекопитающего, способа его доставки и способа снижения массы тела млекопитающего. Группа изобретений может быть использована как терапевтический способ снижения массы тела при ожирении.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
В настоящее время проводят исследования молекулярных механизмов развития ожирения, что обусловливает прогресс в разработке новых стратегий лечения этого заболевания, в частности генной терапии. Генная терапия ожирения предусматривает доставку полинуклеотидной последовательности, которая определяет экспрессию терапевтических генов в соответствующих клетках с целью восстановления гомеостаза. Основные методы генной терапии включают доставку вирусных векторов, невирусные носители, способствующие доставке наследственной информации, а также технологии редактирования генома, такие как нуклеазы с цинковыми пальцами, системы кластеризованных коротких палиндромных повторов с регулярными промежутками (CRISPR) и эффекторные нуклеазы, подобные активаторам транскрипции (Angelidi A.M. et al., 2022) [1].
Выяснение молекулярных механизмов развития ожирения обусловливает прогресс в разработке новых стратегий лечения этого заболевания. Ожирение на данный момент считается одной из серьезных неразрешенных проблем медицины, в том числе из-за распространенности инфекционных заболеваний среди людей с повышенным индексом массы тела проявляется эффект двойной нагрузки на систему общественного здравоохранения (Pugliese et al., 2022) [2].
Известно, что массу тела можно контролировать с помощью сочетания здорового питания и физической активности, однако гипертрофическое ожирение часто осложнено другими сопутствующими заболеваниями, такими как сахарный диабет 2 типа (СД2), сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ), артериальная гипертензия и различные формы артрита (de Resende Guimarães et al., 2019) [3]. В случае, когда больным противопоказаны интенсивные физические нагрузки могут быть разработаны альтернативные подходы для борьбы с ожирением. Одним из таких подходов может стать стимуляция перехода белых жировых клеток в более катаболически активные бежевые (бурые) с помощью нутриентов и препаратов на основе малых молекул, а также перепрограммирование с использованием инструментов генной терапии.
Показано, что постоянная симпатическая стимуляция приводит к образованию локусов, экспрессирующих разобщающий белок термогенин (UCP1), в белой жировой ткани (Cinti S. et al., 1997) [4]. Этот процесс называется побурением (Bartelt and Heeren, 2014) [5]. Бежевые адипоциты морфологически напоминающие бурые адипоциты, которые содержат множество липидных капель и большое количество митохондрий, были обнаружены в белой жировой ткани (Phillips K.J., 2019) [6]. Поскольку аналогично клеткам бурой жировой ткани бежевые клетки экспрессируют UCP1, они способны к термогенезу (Harms M., 2013) [7], (Rui L., 2017) [8]. Учитывая особую роль, которую бурая жировая ткань играет в системном метаболизме, регуляция экспрессии гена UCP1 может иметь ключевое значение (Seale P. et al., 2007) [9].
Из уровня техники известны следующие источники информации.
Известно, что транскрипционный регулятор PRDM16 действует путем связывания со специфическими регуляторными последовательностями генов, таких как: UCP1, CIDEA, а также путем взаимодействия с другими белками, такими как PGC-1α (Seale P. et al., 2007) [9].
В опубликованном ранее исследовании (Tang R. et al., 2020) было предложено несколько потенциальных мер для обращения вспять метаболической дисфункции, связанной с ожирением. В частности, за счёт улучшения количества или качества скелетных мышц. Масса скелетных мышц модулируется миостатином, членом суперсемейства трансформирующего фактора роста-β (TGF-β) и мощным негативным регулятором мышечного роста, а уровень миостатина повышается при ожирении и снижается при физических нагрузках. Фоллистатин (FST), белок, который связывает миостатин и активин, может способствовать усилению формирования мышц и одновременно подавлять воспаление. В исследовании было показано, что доставка FST аденоассоциированным вирусом 9 (AAV9) усиливает формирование мышц и смягчает метаболическое воспаление и остеоартрит коленного сустава, вызванный диетой с высоким содержанием жиров у мышей. AAV-опосредованная доставка FST продемонстрировала снижение уровня воспалительных адипокинов и цитокинов, вызванных ожирением, системно и в синовиальной жидкости суставов. Независимо от диеты, мыши, получавшие генную терапию FST, были защищены от посттравматического остеоартрита и ремоделирования костей, вызванного травмой суставов. В совокупности эти результаты позволяют предположить, что генная терапия FST может обеспечить многофакторный терапевтический подход к вызванному травмой остеоартритe и метаболическому воспалению при ожирении [10].
Известно, что транскрипционный фактор FOXP4 имеет сайты связывания в регуляторных последовательностях гена UCP1. In silico поиск выявил предполагаемый мотив связывания факторов Forkhead в диапазоне от -479 до -472 от сайта начала транскрипции гена UCP1, кроме того было продемонстрировано, что FOXP4 связывается с этим ответным элементом по данным хроматиновой иммунопреципитации (ChIP) на дифференцированных клетках 10T1/2 (Perie L. et al., 2021) [11].
Известно техническое решение, описанное в американском патенте на изобретение US10711281B2, от 02.08.2013 «Adeno-associated viral (AAV) vectors useful for transducing adipose tissue» (Аденоассоциированные вирусные (AAV) векторы, полезные для преобразования жировой ткани) [12], в котором показано использование аденоассоциированных вирусных векторов (ААВ), которые позволяют доставлять представляющие интерес полинуклеотидные последовательности к конкретным типам жировых клеток и обеспечивать экспрессию трансгена. Использование специфичных для жировой ткани регуляторных элементов по изобретению ограничивает экспрессию представляющих интерес полинуклеотидов либо клетками белой жировой ткани, либо бурой жировой ткани. Другие композиции по изобретению предлагается использовать для введения организм млекопитающих, в том числе и людей, в соответствии с обычными процедурами для фармацевтических субстанций. ААВ по данному изобретению могут представлять собой композицию, адаптированную для внутривенного, подкожного введения или внутривенную смесь с физиологически приемлемым носителем для мышечного введения людям. В примерах реализации изобретения предложено использование различных трансгенов, включая гены секретируемых белков (VEGF, NGF, BDNF, GDNF, EGF, PDGF, aFGF, bFGF, GCSF, эритропоэтин, гормон роста, паратиреоидный гормон, фолликулостимулирующий гормон, лютеинизирующий гормон, хорионический гонадотропин человека, активины, ингибины, интерлейкины, цитокины, BMP), а также широкий репертуар генов транскрипционных факторов jun, fos, max, mad, SRF, AP1, AP2, myb, MyoD, миогенин, ETS -домен содержащие белки, TFE3, E2F, ATF1, ATF2, ATF3, ATF4, ZF5, NFAT, CREB, HNF-4, SP1, C/EBP (CCAAT-связывающие белки), регулируемый интерфероном фактор (IRF-1), WT1 (Wilms tumor 1), STAT, GATA-связывающие белки (например, GATA-3).
Недостатком технического решения является отсутствие в изобретении полинуклеотидных последовательностей, которые могли быть использованы в качестве экспрессионных векторов, кодирующих полипептидные молекулы для лечения заболеваний, связанных с жировой тканью, таких как, например, ожирение и сахарный диабет 2 типа. В том числе не приведены полинуклеотидные последовательности, которые могли быть использованы непосредственно для снижения массы тела.
В американском патенте на изобретение US9074012B2, от 07.07.2015 «Molecular control of brown fat differentiation and energy expenditure» (Молекулярный контроль дифференциации бурого жира и расхода энергии) [13], выбранном за наиболее близкий аналог (прототип) описаны способы и композиции для индукции дифференцировки клеток бурого жира посредством изменения экспрессии гена PRDM16 или активности белка PRDM16. Также предложены способы профилактики или лечения ожирения или расстройства, связанного с ожирением, у субъекта посредством стимуляции экспрессии гена PRDM16 или активности белка PRDM16. Кроме того, представлены способы идентификации соединений, которые способны изменять экспрессию гена PRDM16 или активность белка PRDM16. Описанное изобретение основано на том факте, что экспрессия гена PRDM16 может индуцировать дифференцировку бурого жира у млекопитающих. Повышенная активность бурой жировой ткани у млекопитающих индуцирует экспрессию митохондриальных генов, что стимулирует митохондриальный биогенез и клеточное дыхание. Усиление клеточного дыхания (как общего, так и разобщённого) приводит к увеличению тепловыделения и увеличению затрат энергии. Повышенный расход энергии стимулируют скорость метаболизма млекопитающих. Посредством стимуляции скорости метаболизма можно использовать PRDM16 в качестве мишени для лечения и/или предотвращения ожирения или расстройств, связанных с ожирением.
Недостатком технического решения (прототипа) является то, что предложены способы для модуляции экспрессии или активности PRDM16: пептид, пептидомиметик, небольшие молекулы, антисмысловые нуклеиновые кислоты, но не геннотерапевтические подходы, предполагающие доставку копии гена для увеличения его экспрессии.
В результате проведенного анализа уровня техники можно сделать вывод о том, что предлагаемая группа изобретений может быть признана соответствующей критериям патентоспособности «новизна» и «изобретательский уровень» до даты испрашиваемого приоритета.
Целью предлагаемого технического решения является создание нуклеиновой кислоты, плазмидного экспрессионного вектора и способов, позволяющих обеспечить снижения массы тела млекопитающего.
Техническим результатом от реализации заявленной группы изобретений является эффективное снижение массы тела млекопитающих, а также увеличение эффективности существующих решений и способов терапии ожирения. Изобретение может быть использовано при терапии наследственного ожирения.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Указанный технический результат реализуется заявленной группой изобретений, включающей следующие объекты:
(a) нуклеиновая кислота, предназначенная для снижения массы тела млекопитающего, содержащая последовательность гена (FOXP4) транскрипционного фактора 4 FOXP SEQ ID NO: 1 и способная стимулировать экспрессию гена UCP1;
(b) экспрессионный вектор для экспрессии в клетках млекопитающего, содержащий упомянутую нуклеиновую кислоту, представляющий собой экспрессионный вектор на основе генома аденоассоциированного вируса, представляющий собой плазмидный экспрессионный вектор с последовательностью SEQ ID NO: 2, и способный стимулировать экспрессию гена UCP1;
(c) способ доставки упомянутого экспрессионного вектора в жировые отложения млекопитающего, включающий введение экспрессионного вектора путём инъекции в жировую ткань шприцем в дозе от 1*1010 до 5*1012 вирусных геномов/кг жировой ткани;
(d) способ снижения массы тела массы млекопитающего, включающий доставку упомянутого экспрессионного вектора в жировые отложения млекопитающего.
Экспрессионный вектор для экспрессии в клетках млекопитающего, содержащий заявленную нуклеиновую кислоту.
Способ доставки экспрессионного вектора в жировые отложения млекопитающего, включающий введение экспрессионного вектора путём инъекции.
Способ снижения массы тела массы млекопитающего, включающий доставку экспрессионного вектора в жировые отложения млекопитающего.
Группа изобретений объединена единым изобретательским замыслом.
В основе предлагаемого изобретения лежит способность трансгена при доставке с использованием аденоассоциированных вирусных векторов в жировую ткань организма млекопитающего вызывать переход белых жировых клеток в более катаболически активные бежевые жировые клетки.
Следствием этого становится обеспечиваемое настоящей группой изобретений эффективное снижение массы тела массы млекопитающего.
ОБЪЕКТ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящей группе изобретений описаны нуклеиновая кислота, предназначенная для снижения массы тела млекопитающего (применимо к таким модельным животным, как мыши, а также собаки, что определяет релевантность по отношению к людям), содержащая последовательность гена (FOXP4) транскрипционного фактора 4 FOXP SEQ ID NO: 1 и способная стимулировать экспрессию гена UCP1, экспрессионный вектор для экспрессии в клетках млекопитающего, представляющий собой последовательность SEQ ID NO: 2, содержащий упомянутую нуклеиновую кислоту, способ доставки упомянутого экспрессионного вектора в жировые отложения млекопитающего и способ снижения массы тела массы млекопитающего.
Указанный технический результат достигается совокупностью существенных признаков, представленной в формуле изобретения.
Технический результат обеспечивается за счет того, что нуклеиновая кислота, предназначенная для снижения массы тела млекопитающего, содержит последовательность гена (FOXP4) транскрипционного фактора 4 семейства FOXP SEQ ID NO: 1.
Также технический результат обеспечивается за счет того, что экспрессионный вектор для экспрессии в клетках млекопитающего содержит вышеупомянутую нуклеиновую кислоту.
Ещё в одном дополнительном примере реализации изобретения предложен вышеупомянутый экспрессионный вектор на основе генома аденоассоциированного вируса.
Ещё в одном дополнительном примере реализации изобретения предложен вышеупомянутый экспрессионный вектор, представляющий собой плазмидный экспрессионный вектор с последовательностью SEQ ID NO: 2, который может содержать элементы генома аденоассоциированного вируса в соответствии с физической и генетической картой, представленной на фиг. 1:
- участок начала репликации ori;
- левый инвертированный концевой повтор ITR;
- цитомегаловирусный промотор CMV promoter;
- последовательность интрона гена β-глобина человека;
- последовательность, кодирующую последовательность гена (FOXP4) транскрипционного фактора 4 семейства FoxP SEQ ID No:1;
- последовательность сигнала полиаденилирования poly(A);
- правый инвертированный концевой повтор ITR;
- промотор гена устойчивости к ампициллину;
- ген устойчивости к антибиотику ампициллину AmpR.
Также технический результат обеспечивается за счет того, что способ доставки вышеупомянутого экспрессионного вектора в жировые отложения млекопитающего включает введение экспрессионного вектора путём инъекции.
Ещё в одном дополнительном примере реализации изобретения предложен способ доставки экспрессионного вектора в жировые отложения млекопитающего, включающий введение экспрессионного вектора путём инъекции в жировую ткань.
Ещё в одном дополнительном примере реализации изобретения предложен способ доставки экспрессионного вектора в жировые отложения млекопитающего, включающий введение в жировую ткань млекопитающего шприцем в дозе от 1*1012 до 5*1012 вирусных геномов/кг жировой ткани.
Также технический результат обеспечивается за счет того, что способ снижения массы тела массы млекопитающего включает доставку вышеупомянутого экспрессионного вектора в жировые отложения млекопитающего.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР, ТАБЛИЦ, ИНЫХ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Изобретение иллюстрируются следующими графическими материалами.
На фигуре 1 представлена структурная карта плазмидного экспрессионного вектора pAAV-FOXP4, экспрессирующего нуклеотидную последовательность гена FOXP4.
На фигуре 2 показано изменение экспрессии генов в результате трансдукции ААВ (или AAV, т.е. аденоассоциированный вирус).
На фигуре 3 показано снижение массы животных после введения ААВ - отображена сравнительная динамика относительной массы тела мышей Agouti yellow, представляющих собой модель ожирения и диабета 2-го типа, после введения аденоассоциированного вектора, экспрессирующего последовательность, кодирующую FOXP4.
Таблица 1 - Олигонуклеотиды для ПЦР и их последовательности.
Таблица 2 - Олигонуклеотиды для клонирования и их последовательности.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Определения и общая терминология
Далее будут приведены ссылки на определенные варианты осуществления изобретения, примеры которых проиллюстрированы предлагаемыми объектами изобретения. Подразумевается, что изобретение охватывает все альтернативы, модификации и эквиваленты, которые могут быть включены в объем настоящего изобретения, как определено в формуле изобретения.
Специалисту в данной области известны многие способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в данном документе, которые могут быть использованы при практическом осуществлении настоящей группы изобретений.
Настоящая группа изобретений не ограничивается изложенными в данном документе способами и материалами. В случае, если один или несколько из включенных литературных ссылок, патентов и аналогичных материалов отличается от или противоречит данной заявке, включая, в частности, определенные термины, использование терминов, описанные приемы и т.п., преимущественную силу имеет настоящая заявка.
Далее следует принять во внимание, что определенные признаки изобретения, которые для ясности описаны в контексте отдельных вариантов осуществления изобретения, могут быть представлены также совместно в одном варианте. И наоборот, разнообразные признаки изобретения, которые для краткости описаны в контексте одного варианта осуществления изобретения, могут быть представлены отдельно или в любой подходящей подкомбинации.
Если представлен диапазон значений, то следует понимать, что каждое промежуточное значение, до десятых долей единицы нижнего предела, если из контекста явно не следует иное между верхней и нижней границами этого диапазона и любые другие указанные или промежуточные значения в этом установленном интервале охватываются настоящим изобретением. Верхние и нижние пределы этих меньших диапазонов могут быть независимо включены в меньшие диапазоны, что также входит в объем изобретения, с учетом любого конкретно исключенного предела в указанном диапазоне. Когда указано, что диапазон включает один или оба предела, диапазоны, исключающие любое из обоих включенных пределов, также входят в объем изобретения.
Все публикации, патенты и заявки на патенты включены в настоящий документ посредством ссылки. Хотя в вышеприведенном описании это изобретение было описано в отношении некоторых предпочтительных вариантов его осуществления, и многие детали были изложены в целях иллюстрации, для специалистов в данной области техники будет очевидно, что изобретение допускает дополнительные варианты осуществления и что некоторые детали, описанные в данном документе, могут значительно изменяться без отклонения от сущности изобретения.
Использование терминов в единственном числе в контексте описания изобретения должно толковаться как охватывающее как единственное, так и множественное число, если иное не указано в данном документе или явно не противоречит контексту.
Термины «состоящий из», «имеющий», «включающий» и «содержащий» следует толковать как неограничивающие термины, т.е. означающие «включая, но не ограничиваясь», если не указано иное.
Использование любых и всех примеров или иллюстративного языка (например, «такой как»), представленных в данном документе, предназначено просто для лучшего описания изобретения и не налагает ограничения на объем изобретения, если иное не заявлено.
Никакие формулировки в описании не следует истолковывать как указывающие на какой-либо не заявленный элемент как существенный для практического применения изобретения.
Здесь описаны варианты осуществления этого изобретения, включая лучший из известных изобретателям способа осуществления изобретения. Разновидности этих вариантов осуществления могут стать очевидными для специалистов в данной области техники после прочтения предшествующего описания. Изобретение включает в себя все модификации и эквиваленты признаков, изложенных в прилагаемой формуле изобретения, как это разрешено действующим законодательством. Более того, любая комбинация вышеописанных признаков во всех их возможных вариациях охватывается изобретением, если иное не указано в данном документе или иным образом явно не противоречит контексту.
Для описания настоящего изобретения используются следующие термины.
Все технические и научные термины, использованные в данном документе, имеют такое значение, какое обычно понимается специалистами в области, к которой относится изобретение, если не указано иное. Все патенты и публикации, на которые имеются ссылки в данном документе, полностью включены в изобретение посредством ссылки.
Сокращения, используемые в настоящем описании, включая приведенные в иллюстративных схемах и последующих примерах, хорошо известны среднему специалисту.
Некоторые из терминов и сокращений используют как нижеследующие:
AAВ - аденоассоциированный вирус (AAV).
Диабет 2 типа - это метаболическое заболевание, характеризующееся хронической гипергликемией (повышенным содержанием глюкозы в крови) и сниженной чувствительностью тканей к инсулину.
Клетки 3T3-L1 - линия преадипоцитов мыши, способная к дифференцировке.
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота.
РНК - рибонуклеиновая кислота.
Нуклеиновая кислота - высокомолекулярное органическое соединение, образованное остатками нуклеотидов.
ПЦР - полимеразная цепная реакция, используется для амплификации ДНК.
ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция с этапом обратной транскрипции.
Плазмида pAAV-MCS - это плазмидный экспрессионный вектор, содержащий регуляторные элементы, фланкированные ITR.
Сайты рестрикции - короткие последовательности нуклеотидов в ДНК, распознающиеся и расщепляемые эндонуклеазами рестрикции.
Транскрипты PPIA - транскрипты гена пептидилпролилизомеразы А, проявляющие высокую стабильность экспрессии.
Экспрессия гена - процесс, в ходе которого наследственная информация о последовательности нуклеотидов в ДНК (последовательность гена) преобразуется в функциональный продукт - РНК или белок.
Экспрессионный вектор - генетическая конструкция, содержащая промотор и другие регуляторные последовательности, обеспечивающие эффективную транскрипцию рекомбинантного гена.
Экспрессионный вектор pAAV-FOXP4 - это плазмидный экспрессионный вектор на основе pAAV-MCS, экспрессирующий нуклеотидную последовательность гена FOXP4.
Agouti yellow - это сублиния мышей породы agouti с мутацией, снижающей активность меланокортиновых рецепторов, с возрастом вызывает гиперфагию, ожирение и диабет второго типа у мышей (Ay мыши).
CMV - цитомегаловирус, элементы генома которого используются для регуляции экспрессии трансгенов.
FOXP4 - транскрипционный фактор 4 семейства FoxP (forkhead box P).
MW - молекулярная масса вещества в Дальтонах.
PBS - фосфатно-солевой буфер (Phosphate Buffered Saline).
SEQ ID NO: 1 - Homo sapiens forkhead box P4 (FOXP4), последовательность, кодирующая транскрипционный фактор 4, семейства FoxP (4 транскриптный вариант, мРНК последовательность ID: NM_001405824.1).
SEQ ID NO: 2 - последовательность экспрессионного вектора, содержащего элементы генома аденоассоциированного вируса, в соответствии с представленной на Фиг. 1 физической и генетической картой.
UCP1 - термогенин, разобщающий белок 1, ядерно-кодируемый митохондриальный переносчик протонов и жирных кислот.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ПРОЦЕДУРЫ
Заявлена нуклеиновая кислота, предназначенная для снижения массы тела млекопитающего, содержащая последовательность гена (FOXP4) транскрипционного фактора 4 FOXP SEQ ID NO:1, экспрессионный вектор для экспрессии в клетках млекопитающего, содержащий упомянутую нуклеиновую кислоту, представляющий собой экспрессионный вектор, например, на основе генома аденоассоциированного вируса, в частности, плазмидный экспрессионный вектор с последовательностью SEQ ID NO:2, способ доставки экспрессионного вектора в жировые отложения млекопитающего, включающий введение экспрессионного вектора в жировую ткань млекопитающего шприцем, например, в дозе от 1*1010 до 5*1012 вирусных геномов/кг жировой ткани, способ снижения массы тела массы млекопитающего, включающий доставку экспрессионного вектора в жировые отложения млекопитающего.
Осуществляют продукцию аденоассоциированного вирусного вектора с использованием экспрессионного вектора по данному изобретению. Аденоассоциированные вирусные векторы (AAV) получают путем трансфекции суспензионных клеток HEK293. Для трансфекции суспензионные культуры клеток доращивают до концентрации 1*106 клеток/мл. Трансфекцию осуществляют путём внесения трансфекционной смеси в среду для культивирования. Трансфекционную смесь готовят исходя из массы вносимой плазмидной ДНК (пДНК) 1,5 мкг на миллион клеток путем смешивания последовательно добавляемых пДНК pAAV-FOXP4, pHelper (Cell Biolabs, pHelper содержит аденовирусные гены E2A, E4 и VA РНК) и вектора pRC8 (содержит последовательность капсидного белка аденоассоциированного вируса) и раствора полиэтиленимина (PEI, линейный полимер с MW 40000), взятых из массового соотношения пДНК:PEI 1:5.
После предварительного добавления компоненты разбавляют бессывороточной средой, содержимое пробирок перемешивают пипетированием, инкубируют при комнатной температуре в течение 10 минут и вносят в среду для культивирования. Трансфицированные клетки инкубируют в течение 4-5 дней при температуре 37°C в шейкерном CO2-инкубаторе. Далее проводится выделение вирусных векторов, включающее в себя лизис клеточной культуры, осветление и стерильная фильтрация осветлённых лизатов и хроматографическая очистка. Хроматографическая очистка проводится с использованием аффинного сорбента.
Далее осуществляют тангенциальную фильтрацию для перевода в фосфатную буферную систему. В полученном растворе определяют содержание вирусных геномов с использованием полимеразной цепной реакции.
Далее осуществляют введение раствора аденоассоциированных вирусных векторов путём инъекции в жировую ткань млекопитающего шприцем (BD Micro-Fine Plus), в дозе от 1*1010 до 5*1012 вирусных геномов/кг жировой ткани.
Материалы и методы
Культивирование суспензионной культуры HEK293
Суспензионные клеточные культуры выращивают на синтетических средах, в частности BalanCD HEK293, не содержащей животных компонентов (Irvine Scientific) в диапазоне концентраций клеток от 1*105 до 3*106 клеток/мл. Клетки HEK293 культивируют в пластиковых колбах Эрленмейера (Corning) и инкубируют при 37°C во влажной модифицированной атмосфере (95% воздуха, 5% CO2). Клетки пассируют дважды в неделю путем добавления свежей среды до достижения концентрации 1*105 клеток/мл.
Продукция аденоассоциированного вируса.
Продукцию аденоассоциированного вируса проводят путем транзиентной трансфекции суспензионной культуры клеток HEK293. Для трансфекции наращивают клетки HEK293 до концентрации 1*106 клеток/мл. Трансфекцию осуществляют путём внесения трансфекционной смеси в среду для культивирования. Трансфекционную смесь готовят исходя из массы вносимой плазмидной ДНК (пДНК) 1,5 мкг на миллион клеток путем смешивания последовательно добавляемых пДНК pAAV-FOXP4, pHelper (Cell Biolabs, pHelper содержит аденовирусные гены E2A, E4 и VA РНК) и вектора pRC8 (содержит последовательность капсидного белка аденоассоциированного вируса) в одну центрифужную пробирку и раствора PEI (линейный полимер с MW 40000, Polysciences) в концентрации 1 мкг/мл, взятой из соотношения пДНК:PEI 1:5 в другую. После предварительного добавления компоненты разбавляют бессывороточной средой, содержимое пробирок перемешивают пипетированием и инкубируют при комнатной температуре в течение 10 минут.
Для наработки вирусного продукта осуществляют инкубацию для культивирования суспензионной клеточной культуры при температуре 37,0°С, влажности 70 %, содержании СО2 5 %, перемешивании 120 об/мин. Через 96-120 часов после трансфекции осуществляют химический лизис клеточной суспензии с использованием 10% полисорбата 20 в течение 1 часа при 37,0°С и перемешивании 250 об/мин. После химического лизиса проводят ферментативную обработку эндонуклеазой Serratia marcescens (собственного производства, 20 единиц активности на мл клеточной культуры) с целью гидролиза свободных нуклеиновых кислот. Полученные лизаты осветляют добавлением диатомита (0,01 г/мл Celite HyFlo Super Cel, Roth), перемешиванием в течение 5 минут при 37.0°C, с последующей стерилизующей фильтрацией лизатов через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм. AAV очищают с использованием аффинного сорбента POROS CaptureSelect AAVX Affinity Resin (Thermo Fisher Scientific) на хроматографе Bio-Rad Quest 10 Plus. Полученный элюат нейтрализуют до pH 7.
Для дальнейшего использования вирусного продукта осуществляют тангенциальную фильтрацию для перевода в PBS на фильтрах с отсечкой 100000 Дальтон (Vivaspin Turbo 15, Sartorius).
Культивирование клеток 3T3-L1.
Клетки выращивают на среде Игла в модификации Дульбекко (DMEM с высоким содержанием глюкозы, 4,5 г/л, Paneco) с добавлением 10% бычьей телячьей сыворотки (NBCS, новозеландское происхождение, Gibco) и 2 мМ L-глутамина (Paneco). Клетки 3T3-L1 высевают на обработанные клеточной культурой пластиковые чашки и инкубируют при 37°C во влажной модифицированной атмосфере (95% воздуха, 5% CO2). Клетки пассируют один раз в неделю по достижении примерно 70% конфлюентности, а среду (DMEM+10%BCS) заменяют каждые 3 дня.
Трансдукция ААV клеток 3T3-L1.
После посева клеток в 48-луночный культуральный планшет (Corning) рассчитывали необходимый объем вирусного элюата (в диапазоне от 10 000 до 100 000 вирусных геномов на клетку). Таким образом, для трансдукции 100 000 клеток с 40 000 вирусных геномов на клетку в лунку вносят 4*109 вирусных геномов. Необходимый объем вирусного элюата добавляют сразу после посева.
Количественная ПЦР.
Тотальную РНК выделяли с помощью реагента для выделения нуклеиновых кислот Лира+ (Биолабмикс) в соответствии с рекомендациями производителя. ДНК гидролизировали безрибонуклеазным набором дезоксирибонуклеаз (Invitrogen), синтезировали комплементарную ДНК используя обратную транскриптазу OT-M-MMuLV-RH (Биолабмикс) и Oligo(dT) в качестве затравки (Invitrogen). Количество выделенной РНК оценивали спектрофотометрически на приборе NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific). Для проведения количественной полимеразной цепной реакции использовали синтезированную кДНК, готовую смесь 5X SYBR Green qPCR Master Mix (Евроген) и специфические олигонуклеотиды на StepOne Plus (Thermo Fisher Scientific). Олигонуклеотиды были синтезированы в соответствии с последовательностями UCP1_For, UCP1_Rev, FOXP4_For, FOXP4_Rev, PPIA_For, PPIA_Rev, указанными в Таблице 1.
| Таблица 1 - Олигонуклеотиды для ПЦР и их последовательности | |
| Название олигонуклеотида | Последовательность олигонуклеотида |
| UCP1_For | 5’ GTACACCAAGGAAGGACCGA 3’ |
| UCP1_Rev | 5’ TTTATTCGTGGTCTCCCAGC 3’ |
| FOXP4_For | 5’ GCCTACTTCCGAAGAAACACG 3’ |
| FOXP4_Rev | 5’ CCGCTCATCCACAGTCCAC 3’ |
| PPIA_For | 5’ CAGACAAAGTTCCAAAGACAG 3’ |
| PPIA_Rev | 5’ CATTATGGCGTGTAAAGTCAC 3’ |
Определяли пороговые циклы (Ct) для положительного контроля (PPIA) и изучаемых генов и рассчитывали относительные уровни РНК исходя из метода сравнения Ct, где ΔCt - это разница между Ct изучаемого гена и Ct PPIA. Величины ΔCt использовали для расчета 2-ΔCt. Все результаты количественной ПЦР получали в трипликатах.
Результаты
Предложенная по данному изобретению нуклеиновая кислота предназначена для снижения массы тела млекопитающего и содержит последовательность гена транскрипционного фактора 4 семейства FOXP (FOXP4) SEQ ID NO: 1. Результат достигается путём создания последовательности нуклеотидов для экспрессии гена FOXP4 в клетках жировой ткани.
В другой неограничивающей реализации изобретения предложен экспрессионный вектор для экспрессии в клетках млекопитающего, содержащий вышеупомянутые нуклеиновые кислоты.
Ещё в одном примере реализации изобретения предложен вышеупомянутый экспрессионный вектор, представляющий собой, например, плазмидный экспрессионный вектор с последовательностью SEQ ID NO: 2, содержащий элементы генома аденоассоциированного вируса, в соответствии, например, с представленной на Фиг. 1 физической и генетической картой следующие элементы:
- участок начала репликации ori;
- левый инвертированный концевой повтор ITR;
- цитомегаловирусный промотор CMV promoter;
- последовательность интрона гена β-глобина человека;
- последовательность, кодирующую последовательность гена (FOXP4) транскрипционного фактора 4 семейства FoxP SEQ ID No:1;
- последовательность сигнала полиаденилирования poly(A);
- правый инвертированный концевой повтор ITR;
- промотор гена устойчивости к ампициллину;
- ген устойчивости к антибиотику ампициллину AmpR.
На фигуре 1 представлена структурная карта плазмидного экспрессионного вектора pAAV-FOXP4, экспрессирующего нуклеотидную последовательность гена FOXP4. ДНК с нуклеотидной последовательностью FOXP4 была синтезирована и встроена в плазмиду pAAV-MCS по сайтам рестрикции (EcoRI и HindIII) под контролем CMV промотора.
В другой неограничивающей реализации изобретения предложен способ доставки вышеупомянутого экспрессионного вектора в жировые отложения млекопитающего, включающий введение экспрессионного вектора путём инъекции шприцем, например, в дозе от 1*1010 до 5*1012 вирусных геномов/кг жировой ткани.
В другой неограничивающей реализации изобретения предложен способ снижения массы тела массы млекопитающего, включающий доставку вышеупомянутого экспрессионного вектора в жировые отложения млекопитающего.
Сущность и промышленная применимость заявленной группы изобретений поясняются следующими примерами, ни в коей мере не уменьшая притязания по формуле изобретения во всех частных формах воплощения признаков.
Пример 1
Для осуществления заявленного технического результата был создан экспрессионный вектор, представляющий собой плазмидный экспрессионный вектор, содержащий элементы генома аденоассоциированного вируса, в соответствии с представленной на Фиг. 1 физической и генетической картой. На первом этапе использовали прямой праймер для FOXP4 и обратный праймер FOXP4 (pAAV_EcoRI_FOXP4_For и pAAV_HindIII_FOXP4_Rev, последовательность в Таблице 2), в качестве матрицы использовали полученную ранее плазмиду pCS2+FOXP4. Программа амплификации: предварительное плавление ДНК при 98°С в течение 30 секунд, 15 циклов амплификации, включающих плавление в течение 10 секунд при 98°С, отжиг в течение 30 секунд при 55°С и элонгацию при 72°С в течение 30 секунд, конечную элонгацию при 72°С в течение 3 минут.
| Таблица 2 - Олигонуклеотиды для клонирования и их последовательности | |
| Название олигонуклеотида | Последовательность олигонуклеотида |
| pAAV_EcoRI_FOXP4_For | 5’ CATCTGAATTCATGATGGTGGAGTCTGCATC 3’ |
| pAAV_HindIII_FOXP4_ Rev | 5’ CATCTAAGCTTTAGGACATGTCCTCTCCTCC 3’ |
Для последующих манипуляций использовали очищенный продукт ПЦР 1 этапа. Полученный в результате амплификации фрагмент кодирующей последовательности гена FOXP4 встраивали в вектор pAAV-CMV-MCS. Реакцию рестрикции проводили по методике, рекомендуемой производителем pAAV-CMV-MCS с использованием эндонуклеаз рестрикции EcoRI и HindIII (New England Biolabs Inc., США). Для лигирования использовали 10X T4 DNA Ligation Buffer и T4 DNA Ligase (New England Biolabs Inc., США). Реакцию лигирования очищенного после рестрикиции фрагмента и вектора проводили согласно рекомендованному протоколу производителя в объёме 20 мкл при 16°С в течение 16 часов (ночи). Инактивирование фермента проводили при 65°С в течение 10 минут.
Трансформацию клеток проводили по стандартному протоколу [14]. Для проведения трансформации аликвоту химически компетентных клеток Escherichia coli DH5α извлекали из морозильной камеры (-80°С) и помещали в лёд для медленного оттаивания. К оттаявшим клеткам добавляли по 5 мкл охлажденной лигазной смеси и инкубировали во льду 30 мин. Проводили тепловой шок в течение 30 сек при 42°С на водяной бане, затем перемещали пробирку с клетками в лед и инкубировали 2 мин. Затем добавляли к клеткам по 1 мл предварительно нагретой до 37°С питательной среды SOC и инкубировали в термостате в течение 1 часа при 37°С и перемешивании со скоростью 180-200 об/мин. Высевали суспензию трансформированных клеток на предварительно подсушенные в термостате при 37°С чашки Петри с LB-агаром и ампициллином по 100 мкл на чашку. Культивировали клетки в термостате при 37°С в течение 16-18 часов.
Для анализа колоний трансформированных клеток проводили ПЦР-скрининг с использованием специфических олигонуклеотидных затравок pAAV_EcoRI_FOXP4_For и pAAV_HindIII_FOXP4_ Rev (Таблица 1) и готовой смеси для ПЦР ScreenMix (Евроген, Россия). Реакционную смесь готовили согласно рекомендациям производителя. В качестве матрицы для ПЦР использовали термолизаты отдельных колоний бактерий. Для этого клетки каждой из 8 колоний отбирали с поверхности питательной среды уколом наконечника микропипетки и переносили в пробирку с 20 мкл воды. Пробирки с суспензией бактерий нагревали при 95°С в течение 5 минут. В ПЦР брали по 2 мкл суспензии. Проводили ПЦР со следующими параметрами: предварительное плавление ДНК при 95°С в течение 3 минут, 25 циклов амплификации, включающих плавление в течение 20 секунд при 95°С, отжиг в течение 20 секунд при 55°С и элонгацию при 72°С в течение 2 минут, конечную элонгацию при 72°С в течение 5 минут. Клоны, для которых методом ПЦР было подтверждено наличие вставки корректного размера, передавали на секвенирование. Отбирали клоны с корректной последовательностью по результатам секвенирования.
В результате культивирования отобранных клонов получили плазмидный экспрессионный вектор, представляющий собой последовательность SEQ ID NO: 2, который содержал последовательность FOXP4.
Пример 2
Для осуществления заявленного технического результата была продемонстрирована способность созданного экспрессионного вектора, представляющего собой плазмидный экспрессионный вектор, содержащий элементы генома аденоассоциированного вируса, в соответствии с представленной на Фиг. 1 физической и генетической картой осуществлять продукцию аденоассоциированных вирусных векторов. После продукции была проведена хроматографическая очистка аденоассоциированных вирусных векторов, в результате которой был получен элюат AAV8-FOXP4, содержащий 6,67*1012 копий вирусных геномов.
Для осуществления заявленного технического результата была продемонстрирована способность полученного рекомбинантного аденоассоциированного вирусного вектора трансдуцировать клетки преадипоцитов мыши 3T3-L1 и, тем самым, влиять на экспрессию генов. В частности, была продемонстрирована способность аденоассоциированного вектора по изобретению вызывать экспрессию гена FOXP4, что свидетельствует об эффективности трансдукции преадипоцитов мыши AAV8-FOXP4 и функциональности экспрессионной конструкции. Кроме того, показана способность аденоассоциированного вирусного вектора по изобретению стимулировать экспрессию гена UCP1, кодирующего термогенин, характерный для клеток бурой жировой ткани разобщающий белок (Фиг. 2). На фиг. 2 представлены результаты оценки количества транскриптов соответствующих генов в клетках культуры преадипоцитов мыши 3T3-L1 после трансдукции аденоассоциированными вирусными векторами, несущими плазмидный экспрессионный вектор pAAV-FOXP4, экспрессирующим последовательность, кодирующую FOXP4. По оси ординат - относительное количество транскриптов, нормализованное на количество транскриптов PPIA.
Пример 3
Для осуществления заявленного технического результата, способности аденоассоциированного вирусного вектора по данному изобретению снижать массу млекопитающих была выбрана сублиния мышей с мутацией гена agouti, снижающей активность меланокортиновых рецепторов, Agouti yellow (Ay мыши). Данная мутация вызывает гиперфагию, ожирение и диабет второго типа у мышей, и моделирует развитие наследственно-обусловленного ожирения по меланокортиновому типу.
Ожирение, как мультифакторное заболевание, обусловлено не только средовыми факторами, но и генетическими. Среди людей, как и среди грызунов, встречаются монолокусные формы ожирения, к числу которых относится меланокортиновое ожирение (Waalen, 2014) [15]. Развитие такой наследственной формы ожирения вызвано мутациями, нарушающими функцию центральной меланокортиновой системы гипоталамуса, которая регулирует аппетит и расходование энергии. Использование экспериментальных животных моделей, которые моделируют развитие ожирения по меланокортиновому типу релевантно, поскольку среди генетически обусловленных типов ожирения у человека такой тип часто встречается наиболее часто (Waalen, 2014) [15].
Для эксперимента использованы самки мышей C57/6J генотипа Ay/a одинакового возраста и веса. Генотип Ay/a характеризуется доминантной мутацией гена agouti и развитием меланокортинового ожирения после 10-ти недельного возраста. Мыши Ay/a постепенно набирают массу тела и отличаются по весу от мышей дикого типа того же возраста. Для исследования были использованы 4- месячные мыши Ay/a (30-35 г; n=8).
Мышам с генотипом Agouti yellow осуществляли введение раствора аденоассоциированных вирусных векторов путём инъекции в жировую ткань (отложения жировой ткани в районе 4 пары молочных желёз) млекопитающего шприцем (BD Micro-Fine Plus), в дозе 1*1012 вирусных геномов / кг жировой ткани. Мышам из контрольной группы осуществляли введение пустых капсидов аденоассоциированного вируса. После введения вышеупомянутых аденоассоциированного вектора, экспрессирующего последовательность, кодирующую FOXP4, а также пустых капсидов в жировые отложения млекопитающего, осуществляли измерение массы тела экспериментальных и контрольных животных. Наблюдали последовательное снижение массы тела в группе с введением аденоассоциированного вектора по изобретению в ходе еженедельного измерения в течение месяца после введения.
Полученные результаты и примеры аналогичны на всем заявленном диапазоне дозы экспрессионного вектора от 1*1010 до 5*1012 вирусных геномов/кг жировой ткани.
Объекты заявленной группы изобретений в дальнейшем будут образовывать основу для следующего этапа разработки лекарственных средств. На следующем этапе эти последовательности подвергают общепризнанному пути разработки лекарственных средств. Путь разработки лекарственных средств определяет потенциальную ценность предлагаемых объектов путем оценки ряда факторов, включая биодоступность, токсикологию, фармакологию и эффективность на животных моделях, перед тем как они будут признаны возможными для тестирования на человеке.
Предлагаемые объекты заявленной группы изобретений, отвечающие целевому профилю, могут быть востребованы фармацевтическими компаниями для создания на их основе терапевтического препарата для лечения заболеваний, связанных с ожирением, включая диабет 2 типа.
Эквиваленты.
Специалистам в данной области будут очевидны, или они смогут достоверно установить при помощи обычных экспериментальных методик, многочисленные эквиваленты конкретных вариантов реализации, описанные в настоящем документе. Предполагается, что такие эквиваленты входят в объем охраны следующей формулы изобретения.
Резюмируя вышесказанное, заявленная группа изобретений может быть признана соответствующей критерию патентоспособности «Промышленная применимость» во всех частных формах воплощения признаков формулы изобретения до даты испрашиваемого приоритета и обеспечивает достижение технического результата, который заключается в эффективном снижении массы тела млекопитающих, а также увеличении эффективности существующих решений и способов терапии ожирения.
Источники литературы:
1. Angelidi A.M. et al. "Novel Noninvasive Approaches to the Treatment of Obesity: From Pharmacotherapy to Gene Therapy", Endocr Rev. 2022 May 12;43(3):507-557, doi: 10.1210/endrev/bnab034.
2. Pugliese et al. "Obesity and infectious diseases: pathophysiology and epidemiology of a double pandemic condition", Int. J. Obes 46, 449-465 (2022), https://doi.org/10.1038/s41366-021-01035-6.
3. De Resende Guimarães MFB et al. "High prevalence of obesity in rheumatoid arthritis patients: association with disease activity, hypertension, dyslipidemia and diabetes, a multi-center study", Adv. Rheumatol, 2019 Oct 16;59(1):44, doi: 10.1186/s42358-019-0089-1.
4. Cinti S. et al. "Immunohistochemical localization of leptin and uncoupling protein in white and brown adipose tissue", Endocrinology, 1997 Feb; 138(2):797-804, doi: 10.1210/endo.138.2.4908.
5. Bartelt A., Heeren J. "Adipose tissue browning and metabolic health",Nat. Rev. Endocrinol, (2014) 10:24-36, doi: 10.1038/nrendo.2013.204.
6. Phillips K.J. "Beige Fat, Adaptive Thermogenesis, and Its Regulation by Exercise and Thyroid Hormone", Biology (Basel), 2019 Jul 31;8(3):57, doi: 10.3390/biology8030057.
7. Harms M., Seale P. "Brown and beige fat: development, function and therapeutic potential", Nat. Med., 2013 Oct;19(10):1252-63, doi: 10.1038/nm.3361.
8. Rui L. "Brown and Beige Adipose Tissues in Health and Disease", Compr. Physiol, 2017 Sep 12;7(4):1281-1306, doi: 10.1002/cphy.c170001.
9. Seale P. et al. "Transcriptional control of brown fat determination by PRDM16", Cell Metab., 2007 Jul;6(1):38-54, doi: 10.1016/j.cmet.2007.06.001.
10. Tang R. et al. «Gene therapy for follistatin mitigates systemic metabolic inflammation and post-traumatic arthritis in high-fat diet-induced obesity», Sci. Adv., 2020 May 8;6(19):eaaz7492, doi: 10.1126/sciadv.aaz7492.
11. Perie L. et al. The forkhead box transcription factor FoxP4 regulates thermogenic programs in adipocytes. J. Lipid Res., 2021;62:100102, doi: 10.1016/j.jlr.2021.100102.
12. Патент на изобретение US10711281B2 (Universitat Autonoma de Barcelona (ES)), от 14.07.2020 «Adeno-associated viral (AAV) vectors useful for transducing adipose tissue».
13. Патент на изобретение US9074012B2 (Dana Farber Cancer Institute (US)), от 07.07.2015 «Molecular control of brown fat differentiation and energy expenditure» (прототип).
14. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. - М.: Мир, 1984. - 239-241 с.
15. Waalen J. The genetics of human obesity. Transl. Res. 2014;164(4):293-301. DOI 10.1038/nrg1556.
--->
<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing
1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">
<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Перечень
последовательностей Foxp4 с номером заявки.xml" softwareName="WIPO
Sequence" softwareVersion="2.3.0" productionDate="2023-10-25">
<ApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText>2023127016</ApplicationNumberText>
<FilingDate>2023-10-21</FilingDate>
</ApplicationIdentification>
<ApplicantName languageCode="ru">Автономная некоммерческая
образовательная организация высшего образования
"Научно-Технологический Университет
"Сириус""</ApplicantName>
<ApplicantNameLatin>Sirius University of Science and
Technology</ApplicantNameLatin>
<InventionTitle languageCode="ru">Нуклеиновая кислота,
предназначенная для снижения массы тела млекопитающего,
экспрессионный вектор для экспрессии в клетках млекопитающего, способ
его доставки и способ снижения массы тела
млекопитающего</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>2</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>2004</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..2004</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q2">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>atggtggaatctgcctcggagacaatcaggtcggctccatctggtcaga
atggcgtgggcagcctctctggacaagcagatggcagcagcggcggggccacagggacaactgcaagtgg
cacgggcagggaagtgaccacgggtgcagacagcaatggtgagatgagtcccgcagagctgctgcacttc
cagcagcaacaggctctccaagtggcccggcagttcctgctgcagcaggcctcaggcctgagctccccag
ggaacaatgacagcaaacagtctgcctctgctgtgcaggtgcctgtgtcggtggccatgatgtcgccgca
gatgcttaccccgcaacagatgcagcagatcctgtcgcccccgcagctgcaggccttgctccagcagcag
caagccctcatgctccagcagctacaggagtactacaagaagcagcaggagcagctccacctgcagctcc
tcacccagcagcaggctgggaaaccgcagcccaaagaggcactggggaacaagcagctggccttccagca
gcagctcctgcaaatgcaacagttgcagcagcagcacctgctcaacctgcagaggcaggggctggtcagc
ctgcagcccaaccaagcctcggggcccctccagacccttccgcaagcagctgtttgcccaacagacctgc
cccagctgtggaagggcgagggtgcccccgggcagcctgccgaggacagcgtcaagcaggaggggctgga
cctcactggcacggccgccaccgctacctcgtttgccgctccccccaaggtctcaccccccctctcccac
cataccctgcccaacggacagcctactgtgctcacatctcggagagacagctcttcccacgaggagaccc
ccggctcccaccccctgtacggacacggagagtgcaagtggccaggctgtgagaccctgtgtgaagacct
gggccagtttatcaaacacctcaacacagagcacgccctggatgaccggagtacagcccagtgccgggta
cagatgcaggtggtgcagcagctggagatccagctcgccaaggagagcgagcggctgcaggccatgatgg
cccacctgcacatgcggccctcggagcccaagcccttcagccagccagtgaccgtctctgcagcagactc
attcccagatggtctcgtgcaccccccgacctcggccgcagcccctgtcacccctctacggccccctggc
ctgggctctgcctccctgcatggtgggggcccagcccgtcggagaagcagtgacaagttctgctccccca
tctcctcagagctggcccagaatcatgagttctacaagaacgccgacgtccggccccccttcacctacgc
ctccctcatccgccaggccatcctggaaacccctgacaggcagctgaccctgaatgagatctataactgg
ttcaccaggatgttcgcctatttccgcagaaacactgccacctggaagaacgccgtgcgccacaacctca
gcctgcacaagtgcttcgtccgcgtggagaacgtcaagggtgccgtgtggactgtggacgagcgggagta
tcagaagcggagaccgccaaagatgacagggagccccaccctggtgaagaacatgatctctggcctcagc
tatggagcacttaatgccagctaccaggccgccctggccgagagcagcttccccctcctcaacagccctg
gcatgctgaaccctggctccgccagcagcctgctgcccctcagccacgatgacgtgggtgcccccgtgga
gccgctgcccagcaacggcagcagcagccctcctcgcctctccccgccccagtacagccaccaggtgcag
gtgaaggaggagccagcagaggcagaggaagacaggcagcccgggcctcccctgggcgcccctaacccca
gcgcctcggggcctccggaagacagggacctggaggaggagctgccgggagaagaactgtcctaa</INS
DSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>6636</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..6636</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q5">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cctgcaggcagctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaa
gcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggcc
aactccatcactaggggttcctgcggccgcacgcgtggagctagttattaatagtaatcaattacggggt
cattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgacc
gcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgtcaatagggactttc
cattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgc
caagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgacctt
atgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttgg
cagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtca
atgggagtttgttttgcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacg
caaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcg
cctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctccgcggatt
cgaatcccggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtaccgccta
tagagtctataggcccacaaaaaatgctttcttcttttaatatacttttttgtttatcttatttctaata
ctttccctaatctctttctttcagggcaataatgatacaatgtatcatgcctctttgcaccattctaaag
aataacagtgataatttctgggttaaggcaatagcaatatttctgcatataaatatttctgcatataaat
tgtaactgatgtaagaggtttcatattgctaatagcagctacaatccagctaccattctgcttttatttt
atggttgggataaggctggattattctgagtccaagctaggcccttttgctaatcatgttcatacctctt
atcttcctcccacagctcctgggcaacgtgctggtctgtgtgctggcccatcactttggcaaagaattgg
gattcgaacatcgattgaattccccggggatccatggtggaatctgcctcggagacaatcaggtcggctc
catctggtcagaatggcgtgggcagcctctctggacaagcagatggcagcagcggcggggccacagggac
aactgcaagtggcacgggcagggaagtgaccacgggtgcagacagcaatggtgagatgagtcccgcagag
ctgctgcacttccagcagcaacaggctctccaagtggcccggcagttcctgctgcagcaggcctcaggcc
tgagctccccagggaacaatgacagcaaacagtctgcctctgctgtgcaggtgcctgtgtcggtggccat
gatgtcgccgcagatgcttaccccgcaacagatgcagcagatcctgtcgcccccgcagctgcaggccttg
ctccagcagcagcaagccctcatgctccagcagctacaggagtactacaagaagcagcaggagcagctcc
acctgcagctcctcacccagcagcaggctgggaaaccgcagcccaaagaggcactggggaacaagcagct
ggccttccagcagcagctcctgcaaatgcaacagttgcagcagcagcacctgctcaacctgcagaggcag
gggctggtcagcctgcagcccaaccaagcctcggggcccctccagacccttccgcaagcagctgtttgcc
caacagacctgccccagctgtggaagggcgagggtgcccccgggcagcctgccgaggacagcgtcaagca
ggaggggctggacctcactggcacggccgccaccgctacctcgtttgccgctccccccaaggtctcaccc
cccctctcccaccataccctgcccaacggacagcctactgtgctcacatctcggagagacagctcttccc
acgaggagacccccggctcccaccccctgtacggacacggagagtgcaagtggccaggctgtgagaccct
gtgtgaagacctgggccagtttatcaaacacctcaacacagagcacgccctggatgaccggagtacagcc
cagtgccgggtacagatgcaggtggtgcagcagctggagatccagctcgccaaggagagcgagcggctgc
aggccatgatggcccacctgcacatgcggccctcggagcccaagcccttcagccagccagtgaccgtctc
tgcagcagactcattcccagatggtctcgtgcaccccccgacctcggccgcagcccctgtcacccctcta
cggccccctggcctgggctctgcctccctgcatggtgggggcccagcccgtcggagaagcagtgacaagt
tctgctcccccatctcctcagagctggcccagaatcatgagttctacaagaacgccgacgtccggccccc
cttcacctacgcctccctcatccgccaggccatcctggaaacccctgacaggcagctgaccctgaatgag
atctataactggttcaccaggatgttcgcctatttccgcagaaacactgccacctggaagaacgccgtgc
gccacaacctcagcctgcacaagtgcttcgtccgcgtggagaacgtcaagggtgccgtgtggactgtgga
cgagcgggagtatcagaagcggagaccgccaaagatgacagggagccccaccctggtgaagaacatgatc
tctggcctcagctatggagcacttaatgccagctaccaggccgccctggccgagagcagcttccccctcc
tcaacagccctggcatgctgaaccctggctccgccagcagcctgctgcccctcagccacgatgacgtggg
tgcccccgtggagccgctgcccagcaacggcagcagcagccctcctcgcctctccccgccccagtacagc
caccaggtgcaggtgaaggaggagccagcagaggcagaggaagacaggcagcccgggcctcccctgggcg
cccctaaccccagcgcctcggggcctccggaagacagggacctggaggaggagctgccgggagaagaact
gtcctaaaagcttgcctcgagcagcgctgctcgagagatctacgggtggcatccctgtgacccctcccca
gtgcctctcctggccctggaagttgccactccagtgcccaccagccttgtcctaataaaattaagttgca
tcattttgtctgactaggtgtccttctataatattatggggtggaggggggtggtatggagcaaggggca
agttgggaagacaacctgtagggcctgcggggtctattgggaaccaagctggagtgcagtggcacaatct
tggctcactgcaatctccgcctcctgggttcaagcgattctcctgcctcagcctcccgagttgttgggat
tccaggcatgcatgaccaggctcagctaatttttgtttttttggtagagacggggtttcaccatattggc
caggctggtctccaactcctaatctcaggtgatctacccaccttggcctcccaaattgctgggattacag
gcgtgaaccactgctcccttccctgtccttctgattttgtaggtaaccacgtgcggaccgagcggccgca
ggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgacca
aaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagctgcctgcagg
ggcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatacgtcaaagcaacca
tagtacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacac
ttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttcc
ccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaa
aaacttgatttgggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgt
tggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcgggcta
ttcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaa
tttaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttacaattttatggtgcactctcagtacaatctgctctg
atgccgcatagttaagccagccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgct
cccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtca
tcaccgaaacgcgcgagacgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataa
tggtttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttcta
aatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaagg
aagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgttt
ttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacat
cgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagc
acttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgcc
gcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcat
gacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgaca
acgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatc
gttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggc
aacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactgg
atggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgata
aatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccg
tatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagata
ggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaa
aacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatccctta
acgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttt
tttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatc
aagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttct
agtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatc
ctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttac
cggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgaccta
caccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggac
aggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggt
atctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggg
gcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgct
cacatgt</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
</ST26SequenceListing>
<---
Claims (8)
1. Нуклеиновая кислота, предназначенная для снижения массы тела млекопитающего, содержащая последовательность гена (FOXP4) транскрипционного фактора 4 FOXP SEQ ID NO: 1.
2. Экспрессионный вектор для экспрессии в клетках млекопитающего, содержащий нуклеиновую кислоту по п. 1.
3. Экспрессионный вектор для экспрессии в клетках млекопитающего по п. 2, представляющий собой экспрессионный вектор на основе генома аденоассоциированного вируса.
4. Экспрессионный вектор для экспрессии в клетках млекопитающего по п. 2, представляющий собой плазмидный экспрессионный вектор с последовательностью SEQ ID NO: 2.
5. Способ доставки экспрессионного вектора в жировые отложения млекопитающего, включающий введение экспрессионного вектора по любому из пп. 2-4 путём инъекции.
6. Способ доставки экспрессионного вектора в жировые отложения млекопитающего, включающий введение экспрессионного вектора по п. 5 путём инъекции в жировую ткань.
7. Способ доставки экспрессионного вектора в жировые отложения млекопитающего по п. 5, включающий введение в жировую ткань млекопитающего шприцем в дозе от 1⋅1010 до 5⋅1012 вирусных геномов/кг жировой ткани.
8. Способ снижения массы тела массы млекопитающего, включающий доставку экспрессионного вектора по любому из пп. 2-4 в жировые отложения млекопитающего.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2810191C1 true RU2810191C1 (ru) | 2023-12-22 |
Family
ID=
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9074012B2 (en) * | 2006-10-18 | 2015-07-07 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Molecular control of brown fat differentiation and energy expenditure |
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9074012B2 (en) * | 2006-10-18 | 2015-07-07 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Molecular control of brown fat differentiation and energy expenditure |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| PERIE L. et al., The forkhead box transcription factor FoxP4 regulates thermogenic programs in adipocytes, J. Lipid Res., 2021, v.62, 100102, p.1-10, WANG FUHUA ET AL., FOXP4 differentially controls cold-induced beige adipocyte differentiation and thermogenesis, Development, 2022, v.149, n.7, dev200260, p.1-11, ЕГОРОВ А.Д. АДЕНОАССОЦИИРОВАННЫЕ ВИРУСНЫЕ ВЕКТОРЫ ДЛЯ ДОСТАВКИ ГЕНОВ В КЛЕТКИ ЖИРОВОЙ ТКАНИ, СИНТЕТИЧЕСКАЯ БИОЛОГИЯ И БИОФАРМАЦЕВТИКА, Материалы всероссийской конференции, 2022, Новосибирск, Издательство: ООО "Офсет-ТМ", с.85. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6563334B2 (ja) | 高形質導入効率ｒＡＡＶベクター、組成物、および使用方法 | |
| JP2019519221A (ja) | 加齢関連疾患及び症状の遺伝子治療法 | |
| US10973931B2 (en) | Adeno-associated viral vectors for the gene therapy of metabolic diseases | |
| EP1470232A1 (en) | Physiologically regulated erythropoietin-expressing vector for the treatment of anaemia | |
| KR20210009317A (ko) | 미토콘드리아 dna 고갈 증후군을 포함하는 불균형 뉴클레오타이드 풀에 의해 초래된 질환에 대한 유전자 요법 | |
| AU2018213417A1 (en) | Multiple transgene recombinant adenovirus | |
| EP3610003A1 (en) | Method for producing recombinant virus | |
| Muhuri et al. | Novel combinatorial microRNA-binding sites in AAV vectors synergistically diminish antigen presentation and transgene immunity for efficient and stable transduction | |
| CN105916990B (zh) | 用于转导脂肪组织的腺相关病毒载体 | |
| WO2022139631A1 (en) | Aav5-based vaccine for induction of specific immunity and/or prevention of sars-cov-2-related infection | |
| RU2810191C1 (ru) | Нуклеиновая кислота, предназначенная для снижения массы тела млекопитающего, экспрессионный вектор для экспрессии в клетках млекопитающего, способ его доставки и способ снижения массы тела млекопитающего | |
| Niessen et al. | Novel diabetes mellitus treatment: mature canine insulin production by canine striated muscle through gene therapy | |
| US7863251B2 (en) | Hepatic stellate cell specific promoter and uses thereof | |
| Zhang et al. | Smad3 influences Smad2 expression via the transcription factor C/EBPα and C/EBPβ during bovine myoblast differentiation | |
| WO2023073526A1 (en) | Methods for improving adeno-associated virus (aav) delivery | |
| WO2021209743A1 (en) | Forskolin-inducible promoters and hypoxia-inducible promoters | |
| KR20210130578A (ko) | 폐섬유증 치료 또는 예방을 위한 세포 치료제 조성물 | |
| CN110904046A (zh) | Islr基因在制备治疗肥胖及改善胰岛素抵抗的药物中的应用 | |
| WO2024138812A1 (zh) | 在哺乳动物肌肉中特异性启动基因的启动子序列及其应用 | |
| US20240123086A1 (en) | Inducible single aav system and uses thereof | |
| TW202221119A (zh) | Dna結合域轉活化子及其用途 | |
| CN117883594A (zh) | 促进或激活f7基因表达的试剂在制备治疗和预防nafld的药物中的应用 | |
| CN117414373A (zh) | miR-92b作为靶标在开发肾纤维化药物或制备肾纤维化动物模型中的应用 | |
| Yin et al. | Gene Therapy for Sjögren’s Syndrome | |
| EP4127180A1 (en) | Forskolin-inducible promoters and hypoxia-inducible promoters |