CN117414373A - miR-92b作为靶标在开发肾纤维化药物或制备肾纤维化动物模型中的应用 - Google Patents
miR-92b作为靶标在开发肾纤维化药物或制备肾纤维化动物模型中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了miR‑92b作为靶标在开发肾纤维化药物或制备肾纤维化动物模型中的应用。本发明提供了miR‑92b相关生物材料的应用，其特征在于：所述应用为在制备肾纤维化药物中的应用。miR‑92b相关生物材料可为miR‑92b、miR‑92b的前体RNA、miR92b类似物或转录得到miR‑92b或miR‑92b的前体RNA的特异DNA分子。miR‑92b的相关生物材料可用于肾纤维化的治疗和/或预防，以miR‑92b为抑制靶标的生物材料可用于肾纤维化动物模型的制备。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及miR-92b作为靶标在开发肾纤维化药物或制备肾纤维化动物模型中的应用，具体来说，涉及miR-92b作为促进靶标在开发肾纤维化药物中的应用或miR-92b作为抑制靶标在制备肾纤维化动物模型中的应用。
背景技术
肾纤维化是几乎所有进行性慢性肾脏疾病(CKD)的共同病理特征，包括糖尿病肾病(DKD)和阻塞性肾病，其过程极大地削弱了肾脏的再生潜能，导致期功能下降。目前，尚无经批准的治疗肾纤维化的有效方法。因此，提高对肾纤维化的细胞和分子机制的理解是至关重要的，不仅对这一过程的发病机制有新的认识，而且对纤维化肾病患者的治疗也有合理的策略。
在肾纤维化过程中，转化生长因子-β(TGF-β)在间质慢性炎症改变和细胞外基质(ECM)积累中起关键作用。TGF-β1可通过激活标准的(基于smad)和非标准的(非基于smad)信号通路诱导肾纤维化，导致肌成纤维细胞激活，ECM过度产生，并抑制ECM降解。活化的SMAD复合体进入细胞核并转录纤维化相关蛋白，如I型胶原(COL1A1)和平滑肌肌动蛋白(SMA)。在纤维化过程中，SMAD3需要磷酸化才能实现核易位和靶基因的转录调控。
微小RNA(miRNA)是研究最多的一类非编码小RNA。
调控TGF-B 1信号通路活性的关键microRNA尚未被阐明。
发明内容
本发明的目的是提供miR-92b作为靶标在开发肾纤维化药物或制备肾纤维化动物模型中的应用。
本发明提供了miR-92b相关生物材料的应用，其特征在于：所述应用为在制备肾纤维化药物中的应用。
示例性的，miR-92b相关生物材料可为miR-92b(一种miRNA)。
示例性的，miR-92b相关生物材料可为miR-92b的前体RNA。
示例性的，miR-92b相关生物材料可为miR92b类似物。
示例性的，miR-92b相关生物材料可为特异DNA分子；所述特异DNA分子转录得到miR-92b。
示例性的，miR-92b相关生物材料可为特异DNA分子；所述特异DNA分子转录得到miR-92b的前体RNA。
示例性的，miR-92b相关生物材料可为特异DNA分子；所述特异DNA分子转录得到的RNA中具有miR-92b。
示例性的，miR-92b相关生物材料可为特异DNA分子；所述特异DNA分子转录得到RNA中具有miR-92b的前体RNA。
示例性的，miR-92b相关生物材料可为重组质粒或重组病毒。
示例性的，所述重组质粒可为具有以上任一所述的特异DNA分子的重组质粒。
示例性的，所述重组病毒可为具有以上任一所述的特异DNA分子的重组病毒。
示例性的，所述重组病毒可为重组腺相关病毒。
示例性的，所述重组病毒可为重组AVV9病毒。
miR-92b如SEQ ID NO：1所示(单链RNA分子)。
miR-92b的前体RNA如SEQ ID NO：2所示(单链RNA分子)。
miR92b类似物(miR92b mimic)为双链RNA分子，一条链为如SEQ ID NO：5所示，另一条链如SEQ ID NO：6所示。
示例性的，所述特异DNA分子如SEQ ID NO：4所示。
本发明还保护一种应用，其特征在于：所述应用为以miR-92b为抑制靶标的生物材料在制备肾纤维化动物模型中的应用。
本发明还保护一种应用，其特征在于：所述应用为以动物基因组中的miR-92b编码基因为敲除靶标的生物材料在制备肾纤维化动物模型中的应用。
示例性的，以动物基因组中的miR-92b编码基因为敲除靶标的生物材料可为利用crispr/cas9技术进行敲除的生物材料。
示例性的，以动物基因组中的miR-92b编码基因为敲除靶标的生物材料可为利用crispr/cas9双靶点进行敲除的生物材料。
所述敲除靶标具体如SEQ ID NO：3所示。
以miR-92b为抑制靶标的生物材料具体可为miR-92b抑制剂。
示例性的，miR-92b抑制剂为SEQ ID NO：7所示的单链RNA分子。
本发明通过实验验证了如下内容：miR-92b敲除加重UUO模型小鼠和uIRI模型小鼠的肾纤维化；过表达miR-92b抑制UUO模型小鼠的肾纤维化。因此，miR-92b的相关生物材料可用于肾纤维化的治疗和/或预防，以miR-92b为抑制靶标的生物材料可用于肾纤维化动物模型的制备(与现有技术中的UUO模型以及uIRI模型相比，该模型具有更加严重的肾纤维化症状)。在发现miR-92b对肾纤维化的相关功能的基础上，发明人进一步通过生物信息学分析、RNA测序分析、荧光素酶报告基因测定、qPCR分析和western blotting等实验方法，证实了miR-92b直接靶向TGF-β受体1(TGFBR1)，从而通过抑制TGF-β/SMAD3信号通路改善肾纤维化。
附图说明
图1为实施例1的步骤二中Masson染色和天狼星红染色的结果。
图2为实施例1的步骤二中目标基因的相对表达量的结果。
图3为实施例1的步骤二中Western Blot检测目标蛋白的结果(COL1A1、COL3A1、CTGF)。
图4为实施例1的步骤二中免疫荧光染色和免疫组化检测的结果。
图5为实施例1的步骤二中Western Blot检测目标蛋白的结果(E-cadherin、α-SMA)。
图6为实施例1的步骤三中Masson染色和天狼星红染色的结果。
图7为实施例1的步骤三中免疫荧光染色和免疫组化检测的结果。
图8为实施例1的步骤三中Western Blot检测目标蛋白的结果。
图9为实施例1的步骤三中目标基因的相对表达量的结果。
图10为实施例1的步骤四中Masson染色和天狼星红染色的结果。
图11为实施例1的步骤四中免疫荧光染色和免疫组化检测的结果。
图12为实施例1的步骤四中Western Blot检测目标蛋白的结果。
图13为实施例1的步骤四中目标基因的相对表达量的结果。
图14为实施例2的步骤一中Western Blot检测目标蛋白的结果(p-SMAD3、SMAD3、COL1A1、α-SMA)。
图15为实施例2的步骤一中目标基因的相对表达量的结果。
图16为实施例2的步骤一中Western Blot检测目标蛋白的结果(SMAD3和H3)。
图17为实施例2的步骤一中细胞SMAD3免疫荧光染色的结果。
图18为实施例2的步骤二中Western Blot检测目标蛋白的结果(p-SMAD3、SMAD3、COL1A1、α-SMA)。
图19为实施例2的步骤二中目标基因的相对表达量的结果。
图20为实施例2的步骤二中Western Blot检测目标蛋白的结果(SMAD3和H3)。
图21为实施例2的步骤二中细胞SMAD3免疫荧光染色的结果。
图22为实施例3中qPCR分析确定TGFBR1的mRNA水平的结果。
图23为实施例3中，以实施例1的步骤二的四组小鼠为对象，Western Blot检测TGFBR1和β-actin的结果以及定量PCR检测TGFBR1基因的结果。
图24为实施例3中，以实施例1的步骤四的三组小鼠为对象，Western Blot检测TGFBR1和β-actin的结果以及定量PCR检测TGFBR1基因的结果。
图25为实施例4中Masson染色和天狼星红染色的结果。
图26为实施例4中免疫荧光染色和免疫组化检测的结果。
图27为实施例4中Western Blot检测目标蛋白的结果。
图28为实施例4中目标基因的相对表达量的结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
每个独立实验重复三次。采用SPSS软件(22.0版)使原始数据服从正态分布，并采用非参数检验的1样本K-S分析。数值以平均值±SD表示。采用双尾非配对Student’s t检验对两组进行比较。对于两组以上的比较，采用单因素方差分析(ANOVA)和Bonferroni事后检验。采用Spearman相关检验计算相关系数。为避免偏倚，所有统计分析均采用盲法。以*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001表示有统计学意义。
MiR-92b成熟miRNA如SEQ ID NO：1所示。
MiR-92b前体RNA如SEQ ID NO：2所示。
M92KO小鼠：以C57BL/6J小鼠为出发小鼠，利用crispr/cas9双靶点进行靶向敲除，获得纯合型敲除小鼠，即为M92KO小鼠。与C57BL/6J小鼠相比，M92KO小鼠的差异仅在于基因组DNA中缺失了SEQ ID NO：3所示的区段(纯合型即一对同源染色体发生了相同缺失)。
所有小鼠护理以及使用程序均符合美国国立卫生研究院实验室动物护理和使用指南。所有小鼠实验均经暨南大学第二临床医学院深圳人民医院伦理委员会(中国深圳)批准。
HK2细胞：人近端小管上皮细胞。HK2细胞培养采用的培养基：含10％牛血清、100U/mL青霉素、100mg/mL链霉素和NEAA(NEAA指的是非必须氨基酸，即L-丙氨酸、L-谷氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸和甘氨酸)的MEM培养基。HK2细胞培养条件：37℃，5％ CO2。
miR92b类似物(miR92b mimic)为双链RNA分子；
一条链为(SEQ ID NO：5)：5'-uauugcacucgucccggccucc-3'；
另一条链为(SEQ ID NO：6)：5'-AGGCCGGGACGAGUGCAAUAUU-3'。
mimic对照物为双链RNA分子；
一条链为：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’；
另一条链为：5’-acgugacacguucggagaat-3’。
miR-92b抑制剂(miR-92bi)为单链RNA分子；
序列为(SEQ ID NO：7)：5'-GGAGGCCGGGACGAGUGCAAUA-3'。
抑制剂对照物为单链RNA分子；
序列为：5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’。
实施例中，RNA分子利用Lipofectamine 3000进行瞬时转染。
PCR检测各个基因的引物如下：
检测β-actin基因：GGCTGTATTCCCCTCCATCG；CCAGTTGGTAACAATGCCATGT。
检测Tgf-β1基因：CTCCCGTGGCTTCTAGTGC；GCCTTAGTTTGGACAGGATCTG。
检测Fn1基因：ATGTGGACCCCTCCTGATAGT；GCCCAGTGATTTCAGCAAAGG。
检测Col1a1基因：GCTCCTCTTAGGGGCCACT；CCACGTCTCACCATTGGGG。
检测Col3a1基因：CTGTAACATGGAAACTGGGGAAA；CCATAGCTGAACTGAAAACCACC。
检测Col1a2基因：GTAACTTCGTGCCTAGCAACA；CCTTTGTCAGAATACTGAGCAGC。
检测Ctgf基因：GGGCCTCTTCTGCGATTTC；ATCCAGGCAAGTGCATTGGTA。
Western Blot检测的目标蛋白的相应一抗分别为：β-actin抗体(Abcam，Cat#ab8226)、CTGF抗体(Abcam，Cat#ab6992)、COL1A1抗体(Novus，Cat#sc-293182)、COL3A1抗体(Novus，Cat#sc-514601)、α-SMA抗体(Abcam，Cat#ab7817)、、E-cadherin抗体(武汉三鹰，Cat#20874-1-AP)。
实施例1、miR-92b的敲除和过表达对肾纤维化的影响
一、MiR-92b和肾纤维化相关性的发现
以野生型小鼠和模型小鼠(模型小鼠即将野生型小鼠进行UUO诱导得到的肾纤维化小鼠)为研究对象，比较肾组织中的miRNA丰度。结果显示，与野生型小鼠相比，模型小鼠肾脏中miR-92b表达水平显著下调。
以接受肾活检的非CKD患者与CKD患者的肾组织为研究对象，比较miRNA丰度。结果显示，与非CKD患者的肾组织相比，CKD患者的肾组织中miR-92b表达水平显著下调。
二、MiR-92b敲除加重UUO模型(即单侧输尿管梗阻模型)的肾纤维化
WT模型组：8周龄雄性C57BL/6J小鼠腹腔注射2％戊巴比妥钠溶液(4ml/kg体重)进行麻醉；麻醉后，使小鼠俯卧在实验台上并暴露一侧输尿管，在输尿管肾门附近的两点结扎并在中间切断输尿管，然后缝合伤口；缝合后，小鼠置于标准笼中进行恢复。
M92KO模型组：采用8周龄雄性M92KO小鼠，其他同WT模型组。
WT假手术组：不结扎且不切断输尿管，其他同WT模型组。
M92KO假手术组：不结扎且不切断输尿管，其他M92KO模型组。
术后第7天，处死小鼠。
处死小鼠后，取肾脏组织，用4％多聚甲醛固定后进行石蜡包埋，然后切成5μm厚的切片。取石蜡切片，分别进行Masson染色和天狼星红染色。使用ImageJ软件(NIH,http://rsbweb.nih.gov/ij/)对染色区域进行定量，获得纤维化区域占比(％)。Masson染色的照片见图1的A，定量结果见图1的C(N＝6)。天狼星红染色的照片见图1的B，定量结果见图1的D(N＝6)。
处死小鼠后，取肾脏组织，提取总RNA，反转录后得到cDNA。以cDNA为模板，利用定量PCR检测目标基因，根据β-actin mRNA表达进行归一化，采用2-ΔΔct算法获得目标基因的相对表达量。目标基因分别为：Tgf-β1基因(编码纤维化因子TGF-β1)、Fn1基因(编码纤维化因子Fn1)、Col1a1基因(编码纤维化因子COL1A1)、Col3a1基因(编码纤维化因子COL3A1)。结果见图2(N＝6)。
处死小鼠后，取肾脏组织，在含有蛋白酶抑制剂和蛋白磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液中裂解，提取总蛋白。将总蛋白提取液与上样缓冲液混合，95℃煮沸5分钟，然后用12％SDS-PAGE进行凝胶电泳。然后将凝胶转移到PVDF膜上，用脱脂牛奶进行封闭，然后进行Western Blot。Western Blot检测的目标蛋白为：COL1A1、COL3A1、CTGF和β-actin(内参)。Western Blot的照片见图3的A，COL1A1参比β-actin的定量结果见图3的B(N＝6)，COL3A1参比β-actin的定量结果见图3的C(N＝6),CTGF参比β-actin的定量结果见图3的D(N＝6)。
处死小鼠后，取肾脏组织，用4％多聚甲醛固定后进行石蜡包埋，然后切成5μm厚的切片。取石蜡切片，利用免疫荧光染色检测E-cadherin，利用免疫组化检测α-SMA。使用ImageJ软件(NIH,http://rsbweb.nih.gov/ij/)对染色区域进行定量，获得阳性区域占比(％)。免疫荧光染色方法：取石蜡切片，用一抗工作液4℃孵育过夜，然后用二抗工作液常温孵育1小时。免疫荧光染色中：一抗工作液是将E-cadherin抗体(武汉三鹰生物，Cat##20874-1-AP；RRID：AB_10697811)用PBS缓冲液稀释至100倍体积得到的，二抗工作液是将Alexa Fluor 488标记的二抗(invitrogen，Cat#A-11008；RRID:AB_143165)用PBS缓冲液稀释至400倍体积得到的。免疫组化的方法：取石蜡切片，进行脱蜡和抗原修复，然后用一抗工作液4℃孵育过夜，然后用二抗工作液室温孵育20分钟，然后用链霉亲和素-辣根过氧化物酶孵育30分钟，然后用DAB底物显影，然后用苏木精染色，然后用中性树脂封片。免疫组化中：一抗工作液是将α-SMA抗体(武汉三鹰生物，Cat#14395-1-AP；RRID:AB_2223009)用PBS缓冲液稀释至100倍体积得到的，二抗工作液是即用型生物素化二抗(中杉金桥，Cat#PV9001)。免疫荧光染色检测E-cadherin的照片见图4的A，免疫组化检测α-SMA的照片见图4的B，定量结果见图4的C(N＝6)。
处死小鼠后，取肾脏组织，在含有蛋白酶抑制剂和蛋白磷酸酶抑制剂混合物的裂解缓冲液中裂解，提取总蛋白。将总蛋白提取液与上样缓冲液混合，95℃煮沸5分钟，然后用12％ SDS-PAGE进行凝胶电泳。然后将凝胶转移到PVDF膜上，用脱脂牛奶进行封闭，然后进行Western Blot。Western Blot检测的目标蛋白为：E-cadherin、α-SMA和β-actin(内参)。Western Blot的照片见图5的A，用β-actin均一化后α-SMA和E-cadherin的相对丰度结果见图5的B(N＝6)。
根据图1可见：与WT假手术组相比，WT模型组小鼠的肾切片可见明显的肾纤维化；与WT模型组相比，M92KO模型组小鼠的肾切片表现出更明显的肾纤维化。根据图2可见：与WT假手术组相比，WT模型组小鼠肾脏中的纤维化因子表达显著上调；与WT模型组相比，M92KO模型组小鼠肾脏中的纤维化因子表达进一步显著上调。根据图3、图4和图5可见：与WT假手术组相比，WT模型组小鼠肾脏中COL1A1、COL3A1和CTGF水平升高，E-cadherin水平降低，α-SMA水平升高；与WT模型组相比，M92KO模型组小鼠肾脏中COL1A1、COL3A1和CTGF水平进一步升高，E-cadherin水平进一步降低，α-SMA水平进一步升高。结果表明，miR-92b缺失增加了UUO模型的肾脏纤维化的程度。
三、MiR-92b敲除加重uIRI模型(即单侧缺血再灌注损伤模型)的肾纤维化
模型组：8周龄雄性C57BL/6J小鼠腹腔注射2％戊巴比妥钠溶液(4ml/kg体重)进行麻醉；麻醉后，将小鼠置于加热垫上(体温保持在37℃)，剖腹并暴露一侧肾蒂，用小鼠微动脉夹夹住肾动脉45分钟，然后取下小鼠微动脉夹让肾脏进行再灌注，然后缝合伤口；缝合后，小鼠置于标准笼中进行恢复。
M92KO组：采用8周龄雄性M92KO小鼠，其他同模型组。
假手术组：不夹闭肾动脉，其他同模型组。
术后24天，处死小鼠。
处死小鼠后，取肾脏组织，用4％多聚甲醛固定后进行石蜡包埋，然后切成5μm厚的切片。取石蜡切片，分别进行Masson染色和天狼星红染色。使用ImageJ软件(NIH,http://rsbweb.nih.gov/ij/)对染色区域进行定量。Masson染色的照片见图6的A，定量结果见图6的C(N＝6)。天狼星红染色的照片见图6的B，定量结果见图6的D(N＝6)。
处死小鼠后，取肾脏组织，用4％多聚甲醛固定后进行石蜡包埋，然后切成5μm厚的切片。取石蜡切片，利用免疫荧光染色检测E-cadherin，利用免疫组化检测α-SMA。使用ImageJ软件(NIH,http://rsbweb.nih.gov/ij/)对染色区域进行定量，获得阳性区域占比(％)。免疫荧光染色和免疫组化的方法同步骤二。免疫荧光染色检测E-cadherin的照片见图7的A，定量结果见图7的C(N＝6)。免疫组化检测α-SMA的照片见图7的B，定量结果见图7的D(N＝6)。
处死小鼠后，取肾脏组织，在含有蛋白酶抑制剂和蛋白磷酸酶抑制剂混合物的裂解缓冲液中裂解，提取总蛋白。将总蛋白提取液与上样缓冲液混合，95℃煮沸5分钟，然后用12％ SDS-PAGE进行凝胶电泳。将凝胶转移到PVDF膜上，用脱脂牛奶进行封闭，然后进行Western Blot。Western Blot检测的目标蛋白为：COL1A1、COL3A1、α-SMA和β-actin(内参)。Western Blot的照片见图8的A，COL1A1参比β-actin的定量结果见图8的B(N＝6)，COL3A1参比β-actin的定量结果见图8的C(N＝6),α-SMA参比β-actin的定量结果见图8的D(N＝6)。
处死小鼠后，取肾脏组织，提取总RNA，反转录后得到cDNA。以cDNA为模板，利用定量PCR检测目标基因，根据β-actin mRNA表达进行归一化，采用2-ΔΔct算法获得目标基因的相对表达量。目标基因分别为：Col1a1基因、Col1a2基因(编码COL1A2)、Col3a1基因、Fn1基因或Ctgf基因(编码CTGF)。结果见图9(N＝6)。
根据图6可见：与假手术组相比，模型组小鼠的肾切片可见明显的肾纤维化；与模型组相比，M92KO组小鼠的肾切片表现出更明显的肾纤维化。根据图7可见：与假手术组相比，模型组小鼠肾脏中E-cadherin水平降低，α-SMA水平升高；与模型组相比，M92KO组小鼠肾脏中E-cadherin水平进一步降低，α-SMA水平进一步升高。根据图8可见：与假手术组相比，模型组小鼠肾脏中COL1A1、COL3A1和α-SMA水平升高；与模型组相比，M92KO组小鼠肾脏中COL1A1、COL3A1和α-SMA水平进一步升高。根据图9可见：与假手术组相比，模型组小鼠肾脏中的纤维化因子表达显著上调；与模型组相比，M92KO组小鼠肾脏中的纤维化因子表达进一步显著上调。结果表明，miR-92b的缺失增加了uIRI模型肾脏纤维化的程度。
四、MiR-92b过表达减轻UUO模型肾纤维化
M92OE组：8周龄雄性C57BL/6J小鼠尾静脉注射200μL AAV9-miR92b病毒液，然后正常饲养2周；然后，腹腔注射2％戊巴比妥钠溶液(4ml/kg体重)进行麻醉；麻醉后，使小鼠俯卧在实验台上并暴露小鼠的一侧输尿管，然后在输尿管肾门附近的两点结扎并在中间切断输尿管，然后缝合伤口；缝合后，将小鼠置于标准笼中进行恢复。
Ctrl组：用等体积AAV9病毒液代替AAV9-miR92b病毒液，其他同M92OE组。
假手术组：不注射AAV9-miR92b病毒液且不结扎和切断输尿管，其他同M92OE组。
AAV9-miR92b病毒液是将AAV9-miR92b病毒悬浮于0.15mol/L NaCl水溶液得到的，病毒浓度为1×1012vg/mL。AAV9病毒液是将AAV9病毒悬浮于0.15mol/L NaCl水溶液得到的，病毒浓度为1×1012vg/mL。AAV9-miR92b病毒(上海吉凯基因医学科技股份有限公司产品)：重组病毒，以AAV9病毒为载体表达SEQ ID NO：4所示DNA分子。AAV9病毒(上海吉凯基因医学科技股份有限公司产品)：AAV9-miR92b病毒的对照病毒；与AAV9-miR92b重组病毒的基因组DNA的差异仅在于缺失了SEQ ID NO：4所示DNA分子。
术后10天，处死小鼠。
处死小鼠后，取肾脏组织，用4％多聚甲醛固定后进行石蜡包埋，然后切成5μm厚的切片。取石蜡切片，分别进行Masson染色和天狼星红染色。使用ImageJ软件(NIH,http://rsbweb.nih.gov/ij/)对染色区域进行定量，获得纤维化区域占比(％)。Masson染色的照片见图10的A，定量结果见图10的C(N＝6)。天狼星红染色的照片见图10的B，定量结果见图10的D(N＝6)。
处死小鼠后，取肾脏组织，用4％多聚甲醛固定后进行石蜡包埋，然后切成5μm厚的切片。取石蜡切片，利用免疫荧光染色检测E-cadherin，利用免疫组化检测α-SMA。使用ImageJ软件(NIH,http://rsbweb.nih.gov/ij/)对染色区域进行定量，获得阳性区域占比(％)。免疫荧光染色和免疫组化的方法同步骤二。免疫荧光染色检测E-cadherin的照片见图11的A，定量结果见图11的C(N＝6)。免疫组化检测α-SMA的照片见图11的B，定量结果见图11的D(N＝6)。
处死小鼠后，取肾脏组织，在含有蛋白酶抑制剂和蛋白磷酸酶抑制剂混合物的裂解缓冲液中裂解，提取总蛋白。将总蛋白提取液与上样缓冲液混合，95℃煮沸5分钟，然后用12％ SDS-PAGE进行凝胶电泳。将凝胶转移到PVDF膜上，用脱脂牛奶进行封闭，然后进行Western Blot。Western Blot检测的目标蛋白为：COL1A1、COL3A1、α-SMA和β-actin(内参)。Western Blot的照片见图12的A，COL1A1参比β-actin的定量结果见图12的B(N＝6)，COL3A1参比β-actin的定量结果见图12的C(N＝6),α-SMA参比β-actin的定量结果见图12的D(N＝6)。
处死小鼠后，取肾脏组织，提取总RNA，反转录后得到cDNA。以cDNA为模板，利用定量PCR检测目标基因，根据GAPDH mRNA表达进行归一化，采用2-ΔΔct算法获得目标基因的相对表达量。目标基因为：Col1a1基因、Col1a2基因、Col3a1基因、Fn1基因或Ctgf基因。结果见图13(N＝6)。
根据图10可见：与假手术组相比，Ctrl组小鼠的肾切片可见明显的肾纤维化；与Ctrl组相比，M92OE组小鼠的肾纤维化程度降低。根据图11可见：与假手术组相比，Ctrl组小鼠肾脏中E-cadherin水平降低，α-SMA水平升高；与Ctrl组相比，M92OE组小鼠肾脏中E-cadherin水平升高，α-SMA水平降低。根据图12可见：与假手术组相比，Ctrl组小鼠肾脏中COL1A1、COL3A1和α-SMA水平升高；与Ctrl组相比，M92OE组小鼠肾脏中COL1A1、COL3A1和α-SMA水平降低。根据图13可见：与假手术组相比，Ctrl组小鼠肾脏中的纤维化因子表达显著上调；与Ctrl组相比，M92OE组小鼠肾脏中的纤维化因子表达显著下调。结果表明，miR-92b的过表达减轻了UUO模型的肾脏纤维化。
实施例2、MiR-92b调节TGF-β信号通路的激活
8周龄雄性C57BL/6小鼠(WT小鼠)和8周龄雄性M92KO小鼠作为研究对象，进行差异基因表达分析。与WT小鼠相比，M92KO小鼠肾脏中有1181个基因显著上调，950个基因显著下调(P<0.05)。IPA分析显示，“TGF-β信号通路”是受miR-92b敲除影响的首要途径。TGF-β被认为是受伤或病变组织中产生的主要细胞因子/生长因子，在那里它激活成纤维细胞并促进ECM的产生。TGF-β在质膜上结合由TGF-βI型和II型半受体组成的异二聚体受体，共同诱导SMAD2和SMAD3转录因子磷酸化，介导典型信号传导。磷酸化的SMAD2和SMAD3在细胞质中与Smad4相互作用，从那里转运到细胞核诱导基因转录。与WT小鼠相比，M92KO小鼠肾脏中TGFBR1和TGFBR2均上调。
利用TargetScan数据库预测miR-92b的下游靶点，预测了人类和小鼠中1292个下游保守靶基因。1292个基因的IPA显示，“TGF-β受体信号传导”和“骨骼发育不良中TGF-β受体信号传导”是TargetScan预测的顶级信号通路。
一、miR92b mimic及其对照物的转染试验
A组：HK2细胞转染mimic对照物(工作浓度为40nmol/L)，培养24小时。B组：HK2细胞转染miR92b mimic(工作浓度为40nmol/L)，培养24小时。C组：HK2细胞转染mimic对照物(工作浓度为40nmol/L)和TGF-β(工作浓度为2ng/mL)，培养24小时。D组：HK2细胞转染miR92bmimic(工作浓度为40nmol/L)和TGF-β(工作浓度为2ng/mL)，培养24小时。
进行Western blot检测。检测目标物为：p-SMAD3、SMAD3、COL1A1、α-SMA和β-actin(内参)。结果见图14(N＝3)。在TGF-β刺激下，HK2细胞中p-SMAD3/SMAD3升高，且COL1A1和α-SMA上调。miR92b mimic处理后，HK2细胞中p-SMAD3/SMAD3降低，且COL1A1和α-SMA下调。
定量PCR检测如下目标基因：COL1A1基因、E-cadherin基因和SERPINE1基因。结果见图15(自左至右依次对应COL1A1基因、E-cadherin基因和SERPINE1基因；N＝5)。在TGF-β刺激下，COL1A1基因和SERPINE1基因表达上调，E-cadherin基因表达下调。miR92b mimic处理可阻止TGF-β刺激引起的变化。
对细胞核提取物中SMAD3和H3进行Western blot检测，SMAD3丰度参比H3丰度的结果见图16。细胞SMAD3免疫荧光染色的代表性图像见图17。miR-92b类似物处理可以抑制TGF-β刺激诱导的核SMAD3定位。
二、miR-92bi及其对照物的转染试验
基本同步骤一，差异仅在于用miR-92bi代替miR92b mimic，用抑制剂对照物代替mimic对照物。
结果见图18至21。miR-92b抑制剂(miR-92bi)增加了TGF-β介导的SMAD3磷酸化上调、COL1A1和α-SMA蛋白水平上调、COL1A1和SERPINE1 mRNA水平上调以及SMAD3的核积累。
实施例3、TGFBR1是miR-92b的直接靶点
利用StarBase(http://starbase.sysu.edu.cn/)，发现TGFBR1在人和小鼠中都是miR-92b的潜在靶点。
用miR92b mimic转染HK2细胞，分别于不同时间取样，采用qPCR分析确定TGFBR1的mRNA水平。用miR92b mimic和/或mimic对照物以不同剂量转染HK2细胞，采用qPCR分析确定TGFBR1的mRNA水平。结果见图22(N＝5)。图22左图中：柱形下面的第一行，+代表加入miR92bmimic，-代表不加入miR92b mimic；柱形下面的第二行，代表转染后时间(单位为h)。图22右图中：图柱形下面的第一行数字代表加入miR92bmimic浓度(0-80nmol/l)，图柱形下面的第二行数字代表加入mimic对照物的浓度(80-0nmol/l)。miR92b mimic以时间和剂量依赖的方式使TGFBR1 mRNA水平降低。
构建两个质粒，TGFBR1 3′-UTR-WT和TGFBR1-3′-UTR-mt。每个质粒与miR92bmimic和/或mimic对照物以不同剂量转染HK2细胞。检测荧光素酶活性。转染TGFBR1-3′-UTR-WT的细胞中，miR92b mimic以剂量依赖的方式降低了荧光素酶报告蛋白的活性。转染TGFBR1-3′-UTR-MT的细胞中，miR92b mimic对荧光素酶报告蛋白的活性没有影响。结果表明，TGFBR1是miR-92b的直接靶mRNA。
用miR92b mimic(或mimic对照物)处理HK2细胞，处理时加入或不加入TGF-β。用miR-92bi(或抑制剂对照物)处理HK2细胞，处理时加入或不加入TGF-β。处理后，利用Western blot检测细胞中的TGFBR1和β-肌动蛋白的蛋白水平。miR92b mimic处理抑制了TGF-β诱导的HK2细胞中TGFBR1的诱导上调，而miR-92bi处理增强了TGF-β诱导的HK2细胞中TGFBR1的诱导上调。
用miR-92bi(或抑制剂对照物)处理HK2细胞，处理时加入或不加入siRNA TGFBR1。western blotting检测TGFBR1、p-SMAD3、SMAD3、p-SMAD2、SMAD2和β-actin HK2。TGF-β存在下，siRNA TGFBR1处理降低了细胞中SMAD3的磷酸化，miR-92bi处理后没有进一步改变。qPCR分析COLL1A1、α-SMA mRNA表达水平，TGFBR1敲低抑制TGF-β诱导的α-SMA和COL1A1mRNA水平，而miR-92bi处理后α-SMA和COL1A1 mRNA水平没有变化。
用miR92b mimic(或mimic对照物)处理HK2细胞，处理时加入或不加入Ad TGFBR1(过表达Tgfbr1的腺病毒)。western blotting检测TGFBR1、p-SMAD3、SMAD3和β-actin水平。采用qPCR分析检测COLL1A1和α-SMA mRNA水平。Ad TGFBR1增加了TGF-β刺激下HK2细胞中Smad3的磷酸化和a-SMA和COL1A1的mRNA水平，这些变化不受miR-92b类似物处理的影响。
以实施例1的步骤二的四组小鼠为对象，处死后取肾组织；提取总蛋白，WesternBlot检测TGFBR1和β-actin，TGFBR1参比β-actin的定量结果见图23的左图；提取总RNA并反转录后得到cDNA，以cDNA为模板，利用定量PCR检测TGFBR1基因的相对表达量，见图23的右图。以实施例1的步骤四的三组小鼠为对象，处死后取肾组织；提取总蛋白，Western Blot检测TGFBR1和β-actin)，TGFBR1参比β-actin的定量结果见图23的左图；提取总RNA并反转录后得到cDNA，以cDNA为模板，利用定量PCR检测TGFBR1基因的相对表达量，见图24的右图。过表达抑制了UUO小鼠肾脏中Tgfbr1 mRNA和蛋白水平的上调，而敲除增强了UUO小鼠肾脏中Tgfbr1 mRNA和蛋白水平的上调。
综上所述，miR-92b通过直接结合Tgfbr1的3′-UTR抑制Tgfbr1的表达，从而调控TGF-β信号通路的激活。
实施例4、TGFBR1缺失抑制miR-92b全身敲除的UUO小鼠介导的肾损伤
A组：用AAV-Ctrl转染WT小鼠，在UUO手术后7天处死小鼠。
B组：用AAV-shTgfbr1转染WT小鼠，在UUO手术后7天处死小鼠。
C组：用AAV-shTgfbr1转染M92KO小鼠，在UUO手术后7天处死小鼠。
处死小鼠后，取肾脏组织，用4％多聚甲醛固定后进行石蜡包埋，然后切成5μm厚的切片。取石蜡切片，分别进行Masson染色和天狼星红染色。使用ImageJ软件(NIH,http://rsbweb.nih.gov/ij/)对染色区域进行定量，获得纤维化区域占比(％)。Masson染色的定量结果见图25的左图(N＝6)。天狼星红染色的定量结果见图25的右图(N＝6)。
处死小鼠后，取肾脏组织，用4％多聚甲醛固定后进行石蜡包埋，然后切成5μm厚的切片。取石蜡切片，利用免疫荧光染色检测E-cadherin，利用免疫组化检测α-SMA。使用ImageJ软件(NIH,http://rsbweb.nih.gov/ij/)对染色区域进行定量，获得阳性区域占比(％)。E-cadherin的结果见图26的左图(N＝6)，α-SMA的结果见图26的右图(N＝6)。
处死小鼠后，取肾脏组织，在含有蛋白酶抑制剂和蛋白磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液中裂解，提取总蛋白。将总蛋白提取液与上样缓冲液混合，95℃煮沸5分钟，然后用12％SDS-PAGE进行凝胶电泳。然后将凝胶转移到PVDF膜上，用脱脂牛奶进行封闭，然后进行Western Blot。Western Blot检测的目标蛋白为：β-actin(内参)、COL1A1、COL3A1和α-SMA。参比β-actin的定量结果见图27(N＝6)。
处死小鼠后，取肾脏组织，提取总RNA，反转录后得到cDNA。以cDNA为模板，利用定量PCR检测目标基因，根据GAPDH mRNA表达进行归一化，采用2-ΔΔct算法获得目标基因的相对表达量。目标基因即目标蛋白的编码基因。目标蛋白为：COL1A1、Col1a2、COL3A1、FN1、Ctgf。结果见图28(N＝6)。
转染AAV-shTgfbr1后，miR-92b敲除的UUO和WT的UUO小鼠肾脏中胶原沉积和促纤维化基因表达无显著差异。结果表明，TGFBR1是miR-92b在肾纤维化中的重要靶点。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (10)
1.一种应用，其特征在于：所述应用为miR-92b在制备肾纤维化药物中的应用；miR-92b如SEQ ID NO：1所示。
2.一种应用，其特征在于：所述应用为miR-92b的前体RNA在制备肾纤维化药物中的应用；miR-92b的前体RNA如SEQ ID NO：2所示。
3.一种应用，其特征在于：所述应用为miR92b类似物在制备肾纤维化药物中的应用；miR92b类似物为双链RNA分子，一条链为如SEQ ID NO：5所示，另一条链如SEQ ID NO：6所示。
4.一种应用，其特征在于：所述应用为特异DNA分子在制备肾纤维化药物中的应用；所述特异DNA分子转录得到miR-92b；miR-92b如SEQ ID NO：1所示。
5.一种应用，其特征在于：所述应用为特异DNA分子在制备肾纤维化药物中的应用；所述特异DNA分子转录得到miR-92b的前体RNA；miR-92b的前体RNA如SEQ ID NO：2所示。
6.一种应用，其特征在于：所述应用为特异DNA分子在制备肾纤维化药物中的应用；所述特异DNA分子转录得到的RNA中具有miR-92b；miR-92b如SEQ ID NO：1所示。
7.一种应用，其特征在于：所述应用为特异DNA分子在制备肾纤维化药物中的应用；所述特异DNA分子转录得到RNA中具有miR-92b的前体RNA；miR-92b的前体RNA如SEQ ID NO：2所示。
8.一种应用，其特征在于：所述应用为重组质粒或重组病毒在制备肾纤维化药物中的应用；所述重组质粒中具有权利要求4至7中任一所述的特异DNA分子；所述重组病毒中具有权利要求4至7中任一所述的特异DNA分子。
9.一种应用，其特征在于：所述应用为以miR-92b为抑制靶标的生物材料在制备肾纤维化动物模型中的应用。
10.一种应用，其特征在于：所述应用为以动物基因组中的miR-92b编码基因为敲除靶标的生物材料在制备肾纤维化动物模型中的应用。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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