PT2040728E

PT2040728E - Fkbp-l e seus usos como inibidores de angiogénese

Info

Publication number: PT2040728E
Application number: PT77331189T
Authority: PT
Inventors: Tracy Robson; Martin O'rourke; Andrea Valentine; David Hirst
Original assignee: Almac Discovery Ltd
Priority date: 2006-06-09
Filing date: 2007-06-08
Publication date: 2015-10-29
Also published as: EP2040728B1; CN101489575A; US20090192085A1; IL195580A0; US9381228B2; HUE028099T2; NZ573425A; JP2009539367A; CN101489575B; US20160340401A1; AU2007255196B2; NZ600690A; PL2040728T3; AU2007255196A1; ZA200810323B; SI2040728T1; US20160340402A1; DK2040728T3; WO2007141533A3; IL195580A

Description

DESCRIÇÃO "FKBP-L e seus usos como inibidores de angiogénese"

REIVINDICAÇÃO DE PRIORIDADE DE PEDIDOS RELACIONADOS

Este pedido reivindica prioridade do pedido de patente UK n2 0611405.2 de Robson et ai., apresentado a 9 de junho de 2006.

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a polipéptidos de FKBP-L, péptidos de FKBP-L, fragmentos e derivados de péptidos de FKBP-L e seus usos.

Antecedentes da invenção A angiogénese é a formação de novos vasos sanguíneos a partir de vasculatura pré-existente e pode ser controlada por sinalização intrincada através de fatores solúveis. As patologias associadas com angiogénese podem incluir cancro (Folkman J. (1971) N. Engl. J. Med. 285:1182; Folkman J. (1999) Nature Med. 1: 27-31), arteriosclerose (Lip, G.Y., Blann, A.D. (2004) Ann Med. 36(2) 119-125), psoríase (Powell, J. (1999)

Curr. Opin. Pediatr. 11: 457-463), endometriose (Olive, D.L.,

Lindheim, S.R., Pritts, E.A. (2004) Best Pract. Res. Clinc. Obstet. Gynaecol. 18(2) 319-328) e algumas doenças oculares tais como retinopatia diabética (Folkman J. (1999) Nature Med. 1: 27-31) . A angiogénese pode também ser necessária para cicatrização dado que os novos vasos proporcionam nutrientes para suportar as células ativas, promover formação de tecido de granulação e facilitar a depuração de resíduos. Aproximadamente 60% da massa de tecido de granulação pode ser composta por vasos sanguíneos que também fornecem o oxigénio necessário para estimular a reparação e o crescimento de vasos. Está bem documentado o facto dos fatores angiogénicos estarem presentes no fluido de feridas e promoverem a cicatrização enquanto os fatores antiangiogénicos inibem a cicatrização. Em tumores, quando as células endoteliais estão expostas a factores solúveis que estimulam a angiogénese, estas podem sofrer várias alterações fisiológicas incluindo um aumento enorme da proliferação, degradação e invasão através da membrana basal do vaso existente e migração afastando-se do vaso sanguíneo para uma nova localização. Na nova localização, as células endoteliais podem proliferar novamente e formar túbulos capilares antes de formar finalmente uma vasculatura de tumor altamente desorganizada (Garcea G, Lloyd TD, Gescher A, Dennison AR, Steward WP, Berry DP. (2004) Eur J Cancer. junho; 4099) :1302-13) . As células endoteliais ativadas podem apresentar um padrão distinto de expressão génica, que leva a modificação das funções celulares principais envolvidas em angiogénese. Estas incluem a regulação do equilíbrio proteolítico levando a degradação da matriz pericelular localizada, síntese de moléculas de adesão envolvidas em interação de matriz extracelular e com mais importância, reorganização do citoesqueleto envolvida em migração celular (Garcea G, Lloyd TD, Gescher A, Dennison AR, Steward WP, Berry DP. (2004) Eur J Cancer, junho; 4099):1302-13).

Provou-se que novos compostos antiangiogénicos inibem uma gama de marcadores endoteliais, que foram identificados como sendo regulados positivamente em células endoteliais ativadas. Estes podem incluir recetores, metaloproteínas da matriz e proteínas de adesão. A taxa de sucesso destes inibidores tem sido bastante elevada. Recentemente o novo composto antiangiogénico Avastin, um anticorpo contra VEGF, obteve aprovação pela FDA e a antiangiogénese é agora reconhecida como a quarta modalidade utilizada no tratamento de cancro (Abdollhi A., Hlatky L., Huber P.E. (2005) Drug Resistance Updates, fevereiro-abril; 8:59-74). Estas terapias podem apresentar as seguintes vantagens relativamente a tratamentos de quimioterapia convencionais. Primeiramente, a angiogénese é principalmente um mecanismo oncofetal, devendo portanto esperar-se efeitos secundários mínimos aquando da administração, mesmo após tratamento prolongado. Em segundo lugar, a angiogénese associada a tumor é um mecanismo fisiológico do hospedeiro e a sua inibição farmacológica não deve, consequentemente, levar ao desenvolvimento de resistência. Finalmente, é difícil ter como alvo a própria massa de tumor, nas quais as células endoteliais que revestem a vasculatura fornecedora são frequentemente classificadas como vulneráveis.

Os compostos proangiogénicos podem também ser terapêuticos. Por exemplo, os compostos proangiogénicos que podem promover cicatrização de feridas incluem citocinas angiogénicas tais como FGF, VEGF, TGF-beta, angiopoietina e triptase de mastócitos.

Recentemente identificaram-se e caracterizaram-se parcialmente um polipéptido novo e o seu gene. Este novo polipéptido foi denominado FKBP-L, DIR1 ou WISP39. Demonstrou-se que este gene tem um papel nas respostas ao stress (Robson, T., Lohrer, H., Bailie, J.R., Hirst, D.G., Joiner, M.C., Arrand, J.E. (1997) Biochemical J. Transactions 25, 335-341). Demonstrou-se igualmente que a repressão do gene FKBP-L pode proteger contra danos celulares oxidativos induzidos por raios-X e por UV (Robson, T., Joiner, M.C., McCullough, W., Price, M.E., McKeown, S.R., Hirst, D.G. (1999) Radiation Research 152, 451-461; Robson, T., Price, M.E., Moore, M.L., Joiner, M.C., McKelvey-Martin, V.J., McKeown, S.R., Hirst, D.G., (2000) Int. J. Radiat) . O FKBP-L pode também estabilizar p21 (urn inibidor de cinase dependente de ciclina e um regulador critico do ciclo celular) recentemente sintetizada, por formação de um complexo trimérico com p21 e Hsp90 (Jascur, T. et ai (2005) Molecular Cell, Vol. 17, 237-249). Há uma necessidade de proporcionar novos agentes terapêuticos que possam inibir angiogénese e migração celular. Tais agentes terapêuticos podem ser importantes como tratamentos apenas baseados em tais agentes ou podem ser usados conjuntamente com outros agentes terapêuticos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

As concretizações da presente invenção referem-se ao uso de polipéptidos de FKBP-L para modular angiogénese e migração celular. A presente invenção pode ser concretizadas numa variedade de formas.

Por exemplo, em determinadas concretizações, o FKBP-L e seus fragmentos podem ser usadas para modular angiogénese. Igualmente, em algumas concretizações, podem usar-se os polipéptidos de FKBP-L para modular migração celular e/ou metástase de células de tumor. A ação de FKBP-L pode ser mediada por CD44. Assim, o polipéptido de FKBP-L pode ser usado, em determinadas concretizações, para modular angiogénese, migração celular e/ou metástase de células que expressam CD44.

De acordo com a invenção, proporciona-se um composto ativo compreendendo um polipéptido de FKBP-L isolado ou um fragmento biologicamente ativo de um polipéptido de FKBP-L ou um derivado biologicamente ativo de um polipéptido de FKBP-L ou (ii) um polinucleótido que codifica tal polipéptido de FKBP-L, fragmento ou derivado para uso como um inibidor de angiogénese ou para uso no tratamento de doenças oculares mediadas por angiogénese, em que o derivado biologicamente ativo de um polipéptido de FKBP-L compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70% idêntica à sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 28. Há caracteristicas adicionais da invenção que serão descritas aqui seguidamente. A invenção é capaz de outras concretizações e de ser levada à prática ou efetuada de várias formas.

DESCRIÇÃO SUCINTA DOS ESQUEMAS A presente invenção pode ser melhor compreendida por referência aos esquemas seguintes. A figura 1, painéis A-C, apresenta sequências de aminoácidos alternativas para FKPB-L completo, fragmentos de FKBP-L de acordo com concretizações alternativas da presente invenção. A figura 2, painéis A-E, apresenta sequências de polinucleótidos que codificam para FKBP-L e alguns dos seus mutantes de deleção e variantes de acordo com concretizações alternativas da presente invenção. A figura 3 apresenta os efeitos de inibição de ADNc de FKBP-L (SEQ ID NO: 31) transfetado transitoriamente no fecho de ferida em HMEC-1 de acordo com uma concretização da presente invenção. A figura 4 ilustra um gráfico dose-resposta do efeito de um polipéptido recombinante de FKBP-L completo com marcador de His (SEQ ID NO: 1) na migração de HMEC-1 num ensaio de fecho de ferida in vitro de acordo com uma concretização da presente invenção . A figura 5 ilustra que um polipéptido de FKBP-L completo com marcador de hemaglutinina (HA) é excretado ativamente a partir de células de HMEC-1 de acordo com uma concretização da presente invenção. A figura 6 ilustra o efeito de inibição do polipéptido recombinante de FKBP-L completo sobre o fecho de ferida em HMEC-1 ao longo do tempo de acordo com uma concretização da presente invenção. A figura 7 ilustra um gráfico dose-resposta do efeito do polipéptido recombinante de FKBP-L completo sobre a formação de tubo de HMEC-1 em membrana basal de matriz de Matrigel de acordo com uma concretização da presente invenção. A figura 8 ilustra o efeito da proteína recombinante FKBP-L completa sobre angiogénese in vivo usando o ensaio de esponja de ratinho, de acordo com uma concretização da presente invenção em que o painel A apresenta o tratamento de células com factor de crescimento de fibroblastos bovino (bFGF) sozinho e o painel B apresenta o tratamento de células com bFGF com polipéptido de FKBP-L completo. A figura 9 apresenta uma redução do número de vasos observados após tratamento com bFGF e polipéptido de FKBP-L recombinante completo (SEQ ID NO: 1) comparativamente com bFGF sozinho, de acordo com concretizações alternativas da presente invenção. A figura 10 ilustra uma dose-resposta do efeito de polipéptido de FKBP-L recombinante completo no modelo de angiogénese de explante de anel aórtico de rato ex vivo de acordo com concretizações alternativas da presente invenção. A figura 11 apresenta o efeito de polipéptido de FKBP-L recombinante completo numa gama de concentrações na viabilidade ou proliferação de HMEC-1 no ensaio MTT após 24 horas (painel A) e 48 horas (painel B) de acordo com concretizações alternativas da presente invenção. A figura 12 apresenta alterações na morfologia do citoesqueleto de células endoteliais em migração após exposição ao polipéptido de FKBP-L recombinante completo de acordo com uma concretização da presente invenção, em que se coraram os microtúbulos HMEC-1 usando antitubulina. A figura 13 apresenta alterações na morfologia do citoesqueleto de células endoteliais em migração após exposição ao polipéptido de FKBP-L recombinante completo de acordo com uma concretização da presente invenção, em que se coraram os filamentos intermediários HMEC-1 com antivimentina. A figura 14 ilustra o efeito do polipéptido de FKBP-L recombinante completo na migração de células de tumor PC3 (painel A), MDA (painel B) e HT29 (painel C) de acordo com concretizações alternativas da presente invenção. A figura 15 ilustra o efeito da injeção intratumoral direta de uma construção de ADNc de FKBP-L no crescimento celular in vivo do xenoenxerto de tumor de próstata humano DU145 de acordo com uma concretização da presente invenção. A figura 16 mostra que a inibição da migração celular está correlacionada com a expressão de CD44 em HMEC-1 e nas cinco linhas celulares de tumor DU145, PC3, HT29, MCF-7, MDA-231 de acordo com uma concretização da presente invenção. A figura 17 apresenta o efeito de FKBP-L recombinante completo em migração de células de tumor DU145 (CD44 -ve) (painel A), HT29 (CD44 +ve) (painel B), PC3 (CD44 +ve) (painel C), MDA (CD44 +ve) (painel D) e MCF-7 (CD44 - ve) (painel E), de acordo com uma concretização da presente invenção. A figura 18 mostra que a eliminação de CD44 em células PC3 através de uma abordagem de ARNsi dirigido ao alvo inibe a inibição mediada por FKBP-L da migração de PC3 de acordo com uma concretização da presente invenção. A figura 19 mostra que FKBP-L pode interagir com CD44 endógeno em monocamadas de HMEC-1 feridas de acordo com uma concretização da presente invenção. A figura 20 ilustra mutantes de deleção de FKBP-L, onde os painéis A e B ilustram os resultados de sequenciação de vários dos mutantes de deleção de FKBP-L e o painel C ilustra os efeitos de inibição de mutantes de deleção de FKBP-L transfetados transitoriamente no fecho de ferida, de acordo com concretizações alternativas da presente invenção. A figura 21 apresenta uma avaliação de FKBP-L recombinante completo (SEQ ID NO: 1), péptidos candidatos de FKBP-L 1-57 (1-57) (SEQ ID NO: 6) e 24 mero de FKBP-L (24 mero) (SEQ ID NO: 10) que abrangem o domínio ativo de FKBP-L, usando o ensaio de raspagem de ferida de acordo com concretizações alternativas da presente invenção. A figura 22 apresenta uma avaliação de FKBP-L recombinante completo (SEQ ID NO: 1), péptidos candidatos FKBP-L 1-57 (1-57) (SEQ ID NO: 6) e o 24 mero de FKBP-L (24 mero) (SEQ ID NO: 10) que abrangem o domínio ativo de FKBP-L, na formação de contactos célula a célula endoteliais usando a membrana basal sintética Matrigel no ensaio de formação de tudo de acordo com concretizações alternativas da presente invenção. A figura 23 apresenta o efeito do péptido de 24 mero de FKBP-L (SEQ ID NO: 10) (painel A) e do péptido de 57 mero de FKBP-L (SEQ ID NO: 6) (painel B) que abrange o domínio ativo de FKBP-L, na germinação angiogénica usando o ensaio de anel aórtico de rato de acordo com concretizações alternativas da presente invenção. A figura 24, painéis A e B, apresenta o efeito de péptidos candidatos que abrangem o domínio ativo de FKBP-L (i.e, péptido de 24 mero de FKBP-L, SEQ ID NO: 10; o 57 mero de FKBP-L, SEQ ID NO: 6; e FKBP-L recombinante completo com marcador de His, SEQ ID NO: 1) no comprimento médio, comprimento máximo (comp max.) e número de vasos (n2 de vasos) em germinação angiogénica usando o ensaio de anel aórtico de rato de acordo com concretizações alternativas da presente invenção. A figura 25 apresenta o efeito do 24 mero de FKBP-L (SEQ ID NO: 10) em invasão de células endoteliais (HMEC-1) e de tumor (MDA231 e PC3) num sistema de câmara de Boyden modificado de acordo com concretizações alternativas da presente invenção. A figura 26 apresenta o efeito do 24 mero de FKBP-L (SEQ ID NO: 10) na adesão de células endoteliais (HMEC-1) de acordo com concretizações alternativas da presente invenção. A figura 27 apresenta o efeito do 24 mero de FKBP-L (SEQ ID NO: 10) na migração de células tumorais MDA-231 (painel A) e PC3 (painel B) , de acordo com concretizações alternativas da presente invenção. A figura 28 mostra que o 24 mero de FKBP-L é um inibidor angiostático, em que o painel A apresenta o efeito da adição do 24 mero de FKBP-L no dia 7 e o painel B apresenta uma experiência na qual os anéis aórticos foram inicialmente expostos ao 24 mero de FKBP-L e seguidamente removeu-se o 24 mero, de acordo com concretizações alternativas da presente invenção. A figura 29 ilustra que o 24 mero de FKBP-L inibe angiogénese in vivo usando o ensaio de esponja de ratinho; apresenta-se o números de vasos observados após tratamento com bFGF sozinho comparativamente com bFGF e polipéptido de FKBP-L recombinante completo (rFKBP-L) (SEQ ID NO: 1) ou bFGF em combinação com o polipéptido de 24 mero de FKBP-L (24 mero) (SEQ ID NO: 10), de acordo com concretizações alternativas da presente invenção. A figura 30 ilustra inibição da migração de células endoteliais de ratinho (2H-11) pelo péptido 24 mero de FKBPL (SEQ ID NO: 10) de acordo com uma concretização da presente invenção. A figura 31 mostra que o péptido de 24 mero de FKBP-L (SEQ ID NO: 10) inibe o crescimento de tumor DU145 in vivo após injeção IP diária (painel A) ; aumenta a sobrevida (painéis B, C e D); e não é tóxico (painel E), de acordo com concretizações alternativas da presente invenção. A figura 32 apresenta o efeito do péptido de 24 mero de FKBP-L (SEQ ID NO: 10) na viabilidade ou proliferação de células HMEC-1 usando o ensaio de MTT de acordo com concretizações alternativas da presente invenção. A figura 33 apresenta o efeito de péptidos candidatos que abrangem o domínio ativo de FKBP-L na viabilidade ou proliferação de células HMEC-1 após administração durante 24 horas (painel A) ou 48 horas (painel B) usando o ensaio de MTT de acordo com concretizações alternativas da presente invenção. A figura 34, painéis A-L, apresenta a resposta de várias versões modificadas/truncadas do 24 mero de FKBP-L: 24 mero de FKBP-L modificado com PEG (péptido 1), um 24 mero de FKBP-L com um ácido piroglutâmico no terminal N (péptido 2) e formas truncadas do péptido de 24 mero de FKBP-L (péptidos 3-12). Comparam-se todos com o péptido 24 mero no ensaio in vitro de raspagem de ferida em HMEC-1 de acordo com concretizações alternativas da presente invenção. A figura 35 apresenta a purificação de FKBP-L recombinante de acordo com concretizações alternativas da presente invenção, em que o painel A apresenta um gel de SDS PAGE efetuado em condições redutoras que apresenta proteína FKBP-L recombinante purificada antes e após diálise (pistas 1 e 2 respetivamente); e o painel B apresenta uma comparação por SDS PAGE de FKBP-L recombinante dialisada antes e após tratamento com DTT (pistas 3 e 4) . A pista 3 é uma amostra não reduzida, a pista 4 é amostra reduzida com DTT 50 mM. O painel C apresenta uma purificação adicional de FKBP-L recombinante por filtração em gel. Os esquemas inseridos mostram análise de PAGE nativo de ambas as bandas da purificação por filtração em gel conjuntamente com proteína dialisada, com (+) e sem (-) DTT 100 mM. A figura 36 apresenta uma análise de cromatografia de permeação em gel de FKBP-L recombinante de acordo com concretizações alternativas da presente invenção. A figura 37 apresenta a reticulação por glutaraldeído de FKBP-L recombinante na presença ( + ) e ausência (-) de DTT 100 mM de acordo com concretizações alternativas da presente invenção. A pista c é o controlo (sem DTT).

DESCRIÇÃO DETALHADA

Definições

Salvo indicação em contrário, todas as expressões técnicas e cientificas aqui utilizadas têm o mesmo significado tal como vulgarmente entendido pelo perito na especialidade. Os executantes são especialmente aconselhados a consultar Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel) para definições e expressões na especialidade. As abreviaturas para os resíduos de aminoácidos são os códigos padrão de 3 letras e/ou 1 letra utilizados na especialidade em referência a um dos 20 L-aminoácidos comuns.

Apesar das gamas numéricas e dos parâmetros que estabelecem o âmbito alargado da invenção serem aproximações, os valores numéricos estabelecidos nos exemplos específicos são relatados de forma tão precisa quanto possível. Contudo, qualquer valor numérico contém inerentemente determinados erros que resultam necessariamente do desvio padrão verificado nas respetivas medições de ensaio. Além disso, todas as gamas aqui divulgadas devem ser consideradas como abrangendo quaisquer e todas as subgamas nelas adicionadas. Por exemplo, deve considerar-se que uma gama mencionada como "de 1 a 10" inclui quaisquer e todas as subgamas entre o valor mínimo de 1 e o valor máximo de 10 (incluindo ambos estes valores); ou seja, todas as subgamas que se iniciam com um valor mínimo de 1 ou mais, e.g. 1 a 6,1 e que terminam com um valor máximo de 10 ou menos, e.g., 5,5 a 10.

Considera-se adicionalmente que, tal como usado neste fascículo, as formas singulares "um", "uma" e "o", "a" incluem os referentes no plural exceto se for expressa e inequivocamente limitado a um referente. A expressão "ou" é usada indiferentemente com a expressão "e/ou" salvo se o contexto indicar claramente o contrário.

Igualmente, as expressões "parte" e "fragmento" usam-se indiferentemente em referência a porções de um polipéptido, ácido nucleico ou outra construção molecular.

Tal como aqui utilizada, usa-se a expressão "polipéptido de FKBP-L biologicamente ativo" (e.g., fragmento e/ou polipéptidos modificados) em referência a um polipéptido que apresenta uma quantidade e um tipo de atividade que é igual ou semelhante à do polipéptido de FKBP-L completo. Neste contexto "atividade biológica" de um polipéptido de FKBP-L, fragmento ou derivado inclui qualquer uma de atividade antiangiogénica, inibição de crescimento de célula de tumor e/ou proliferação, inibição de migração de célula de tumor e/ou metástase. A atividade biológica de fragmentos ou derivados de FKBP-L pode ser ensaiada em comparação com FKBP-L completo usando qualquer um dos ensaios in vitro ou in vivo descritos nos exemplos anexos, tal como por exemplo os ensaios de fecho de ferida ou de raspagem de ferida, ensaio de migração de células in vitro, ensaio de Matrigel (tm) para adesão célula-célula, ensaio de esponja de ratinho, ensaio de explante de anel aórtico, ensaio de proliferação de MTT, ensaio de formação de tubo de HMEC-1 e ensaio de crescimento de células de tumor in vivo. A este respeito, podem efetuar-se substituições deliberadas de aminoácidos no polipéptido com base na semelhança de polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade ou hidrofilicidade dos resíduos, desde que se mantenha a especificidade de atividade (i.e., função).

Tal como aqui utilizado um "indivíduo" pode ser um animal. Por exemplo, o indivíduo pode ser um mamífero. Igualmente, o indivíduo pode ser um humano. Em concretizações alternativas, o indivíduo pode ser do sexo masculino ou do sexo feminino. Em determinadas concretizações, o indivíduo pode ser um doente, em que um doente é um indivíduo que está sob cuidados médicos e/ou procura ativamente cuidados médicos para uma doença. "Polipéptido" e "proteína" são aqui utilizados indiferentemente para descrever moléculas de proteína que podem compreender proteínas parciais ou completas. A expressão "péptido" usa-se para denominar uma proteína que não é completa ou uma proteína muito curta salvo indicação em contrário pelo contexto.

Tal como conhecido na especialidade, "proteínas", "péptidos", "polipéptidos" e "oligopéptidos" são cadeias de aminoácidos (tipicamente L-aminoácidos) cujos carbonos alfa estão ligados através de ligações peptídicas formadas por uma reação de condensação entre o grupo carboxilo do carbono alfa de um aminoácido e o grupo amino do carbono alfa de outro aminoácido. Tipicamente, os aminoácidos que constituem uma proteína estão numerados por ordem, com início no resíduo do terminal amino e aumentado no sentido do resíduo do terminal carboxilo da proteína.

Tal como aqui utilizada, a expressão "a montante" refere-se a um resíduo que é N-terminal relativamente a um segundo resíduo em que a molécula é uma proteína, ou a 5' relativamente a um segundo resíduo em que a molécula é um ácido nucleico. Igualmente e tal como aqui utilizada, a expressão "a jusante" refere-se a um resíduo que está a C-terminal relativamente a um segundo resíduo em que a molécula é uma proteína, ou a 3' relativamente a um segundo resíduo em que a molécula é um ácido nucleico.

Um "ácido nucleico" é um polinucleót ido tal como ácido desoxirribonucleico (ADN) ou ácido ribonucleico (ARN). A expressão é utilizada para incluir ácidos nucleicos em cadeia simples, ácidos nucleicos em cadeia dupla e ARN e ADN constituídos a partir de análogos de nucleótidos ou de nucleósidos. A expressão "vetor" refere-se a uma molécula de ácido nucleico que pode ser usada para transportar uma segunda molécula de ácido nucleico para uma célula. Numa concretização, o vetor permite replicação de sequências de ADN inseridas no vetor. 0 vetor pode compreender um promotor para melhorar a expressão da molécula de ácido nucleico em pelo menos algumas células hospedeiras. Os vetores podem replicar-se autonomamente (extracromossomicamente) ou podem ser integrados no cromossoma de uma célula hospedeira. Numa concretização, o vetor pode compreender um vetor de expressão capaz de produzir uma proteína derivada de pelo menos uma parte de uma sequência de ácidos nucleicos inserida no vetor.

Tal como conhecido na especialidade, as condições para hibridar sequências de ácidos nucleicos entre si podem ser descritas como situadas na gama desde baixo até alto rigor. De um modo geral, as condições de hibridação altamente rigorosas referem-se à lavagem dos híbridos em tampão com baixa concentração salina e a temperaturas elevadas. A hibridação pode ser com ADN ligado a um filtro usando soluções de hibridação que são padrão na especialidade tal como NaHPCq 0,5 M, dodecilsulfato de sódio (SDS) a 7%, a 65 °C e lavagem em NaHPCh 0,25 M e SDS a 3,5% seguido de lavagem com 0,1 x SSC/ SDS a 0,1% a uma temperatura na gama desde temperatura ambiente até 68 °C dependendo do comprimento da sonda (consultar e.g. Ausubel, F.M. et al., Short Protocols in Molecular Biology, 4a ed., capítulo 2, John Wiley & Sons, N.Y) . Por exemplo, uma lavagem com rigor elevado compreende lavagem em 6x SSC/pirof osf ato de sódio a 0,05% a 37 °C para uma sonda de oligonucleót idos com 14 bases ou a 48 °C para uma sonda de oligonucleót ido com 17 bases ou a 55 °C para uma sonda de oligonucleót ido com 20 bases ou a 60 °C para uma sonda de oligonucleót idos com 25 bases ou a 65 °C para uma sonda de nucleótidos com cerca de 250 nucleótidos de comprimento. As sondas de ácidos nucleicos podem ser marcadas com radionucleótidos por marcação terminal com, por exemplo, [ -32P]ATP ou incorporação de nucleótidos marcados radioquimicamente tais como [ 32P]dCTP por marcação com um iniciador aleatório. Alternativamente, podem marcar-se as sondas por incorporação de nucleótidos biotinilados ou marcados com fluoresceína e a sonda é detetada usando anticorpos contra estreptavidina ou anti-fluoresceína.

As expressões "identidade" ou "percentagem de identidade" referem-se a identidade de sequência entre duas sequências de aminoácidos ou entre duas sequências de ácidos nucleicos. A percentagem de identidade pode ser determinada pelo alinhamento de duas sequências e refere-se ao número de resíduos idênticos (i.e., aminoácido ou nucleótido) em posições partilhadas pelas sequências comparadas. O alinhamento e comparação de sequências pode efetuar-se usando os algoritmos que são padrão na especialidade (e.g. Smith e Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443; Pearson e Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85:2444) ou por versões computorizadas desses algoritmos (Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, WI) disponível ao público como BLAST e FASTA. Pode igualmente usar-se ENTREZ, disponível através de National Institutes of Health, Bethesda MD, para comparação de sequências. Quando se utilizam os programas BLAST e Gapped BLAST, podem usar-se os parâmetros por omissão dos programas respetivos (e.g., BLASTN; disponível no portal da Internet do National Center for Biotechnology Information). Numa concretização, a percentagem de identidade das duas sequências pode ser determinada usando GCG com um peso de falha de 1, de modo a que cada falha de aminoácido seja pesada como se fosse uma única disparidade de aminoácido entre as duas sequências. Ou, pode usar-se o programa ALIGN (versão 2.0), que é parte do pacote utilitário de alinhamento de sequências GCG (Accelrys, San Diego, CA).

As propriedades de ligação de uma proteína compreendendo um recetor ou um ligando podem expressar-se em termos de especificidade de ligação, que pode ser determinada como uma medida comparativa relativamente a outras substâncias conhecidas que se ligam ao recetor. Os ensaios padrão para quantificar ligação e determinar afinidade de ligação são conhecidos na especialidade e incluem, e.g., diálise de equilíbrio, ligação de equilíbrio, filtração em gel, ressonância plasmónica de superfície, o uso de parceiros de ligação marcados, ELISA e ensaios de ligação indireta (e.g., ensaios de inibição competitiva). Por exemplo, tal como é bem conhecido na especialidade, pode determinar-se a constante de dissociação de uma proteína pondo em contacto a proteína com um parceiro de ligação e medindo a concentração de proteína ligada e livre como uma função da sua concentração.

Tal como aqui utilizada, a expressão "resíduos conservados" refere-se a aminoácidos que são os mesmos entre uma pluralidade de proteínas com a mesma estrutura e/ou função. Uma região de resíduos conservados pode ser importante para a estrutura ou função da proteína. Assim, os resíduos contíguos conservados tal como identificados numa proteína tridimensional podem ser importantes para a estrutura ou função da proteína. Para encontrar resíduos conservados ou regiões conservadas de estrutura tridimensional, pode efetuar-se uma comparação de sequências para a mesma proteína ou para proteínas semelhantes de espécies diferentes ou de indivíduos da mesma espécie.

Tal como aqui utilizada, a expressão "semelhante" ou "homóloga" em referência a sequências de aminoácidos ou de nucleótidos significa um polipéptido com um grau de homologia ou identidade com a sequência de aminoácidos de tipo selvagem. As comparações de homologia podem ser efetuadas visualmente ou mais habitualmente, com o auxilio de programas de comparação de sequências que estão facilmente disponíveis. Estes programas de computador disponíveis comercialmente podem calcular a percentagem de homologia entre duas ou mais sequências (e.g. Wilbur, W. J. e Lipman, D. J., 1983, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 80:726-730). Por exemplo, podem considerar-se sequências homólogas aquelas que incluem sequências de aminoácidos que em concretizações alternativas são pelo menos 70% idênticas, 75% idênticas, 80% idênticas, 85% idênticas, 90% idênticas, 95% idênticas, 96% idênticas, 97% idênticas ou 98% idênticas entre si.

Tal como aqui utilizada, a expressão pelo menos 90% idêntica a outra inclui sequências que variam entre 90 a 99,99% de identidade com as sequências indicadas e inclui todas as gamas intermédias. Assim, a expressão pelo menos 90% idêntica a outra inclui sequências que são 91, 91,5, 92, 92,5, 93, 93,5, 94, 94,5, 95, 95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99, 99,5 porcento idênticas à sequência indicada. De igual modo, a expressão "pelo menos 70% idêntica" inclui sequências que variam entre 70 e 99,99% idênticas, com todas as gamas intermédias. A determinação da percentagem de identidade é determinada usando os algoritmos aqui descritos.

Tal como aqui utilizado, um "domínio" de polipéptido ou de proteína compreende uma região ao longo de um polipéptido ou de uma proteína que compreende uma unidade independente. Os domínios podem ser definidos em termos de estrutura, sequência e/ou atividade biológica. Numa concretização, um domínio de polipéptido pode compreender uma região de uma proteína que se enrola de modo a ser substancialmente independente da restante proteína. Os domínios podem ser identificados usando bases de dados de domínios tais como PFAM, PRODOM, PROSITE, BLOCKS, PRINTS, SBASE, ISREC PROFILES, SAMRT e PROCLASS, não se lhes limitando.

Tal como aqui utilizada, a expressão "ligado" identifica uma ligação covalente entre dois grupos diferentes (e.g., sequência de ácidos nucleicos, polipéptidos, domínios de polipéptido) que podem ter um ou mais átomos intercalados entre os dois grupos que estão ligados. Tal como aqui utilizado, "ligado diretamente" identifica uma ligação covalente entre dois grupos diferentes (e.g., sequência de ácidos nucleicos, polipéptidos, domínios de polipéptido) que não tem quaisquer átomos intercalados entre os dois grupos que estão ligados.

Tal como aqui utilizado, "domínio de ligação de ligando" refere-se a um domínio de uma proteína responsável pela ligação a um ligando. A expressão domínio de ligação de ligando inclui homólogos de um domínio de ligação de ligando ou partes deste. A este respeito, podem efetuar-se substituições deliberadas de aminoácidos no local de ligação de ligando com base em semelhanças de polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade ou hidrofilicidade dos resíduos, desde que seja mantida a especificidade de ligação do domínio de ligação de ligando.

Tal como aqui utilizado, um "local de ligação de ligando" compreende resíduos numa proteína que interagem diretamente com um ligando ou resíduos envolvidos no posicionamento do ligando em grande proximidade daqueles resíduos que interagem diretamente com o ligando. A interação de resíduos no local de ligação de ligando pode definir-se pela proximidade espacial entre os resíduos e um ligando no modelo ou estrutura. A expressão local de ligação de ligando inclui homólogos de um local de ligação de ligando ou suas partes. A este respeito, podem efetuar-se substituições deliberadas de aminoácidos no local de ligação de ligando com base na semelhança de polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade ou hidrofilicidade dos resíduos, desde que seja mantida a especificidade de ligação do local de ligação de ligando. Um local de ligação de ligando pode existir em um ou mais domínios de ligação de ligando de uma proteína ou de um polipéptido.

Tal como aqui utilizada, a expressão "interage" refere-se a uma condição de proximidade entre duas moléculas ou partes de uma única molécula (e.g., domínios diferentes num péptido). A interação pode ser não covalente, por exemplo, em resultado de ligações de hidrogénio, interações de van der Waals ou interações eletrostáticas ou hidrofóbicas ou pode ser covalente.

Tal como aqui utilizado, um "ligando" refere-se a uma molécula ou composto ou entidade que interage com um local de ligação de ligando, incluindo substratos ou análogos ou suas partes. Tal como aqui descrito, a expressão "ligando" pode referir-se a compostos que se ligam à proteína de interesse. Um ligando pode ser um agonista, um antagonista ou um modulador. Ou um ligando pode não ter um efeito biológico. Ou um ligando pode bloquear a ligação de outros ligandos inibindo assim um efeito biológico. Os ligandos podem incluir moléculas pequenas que são inibidores, não se lhes limitando. Estas moléculas pequenas podem incluir péptidos, peptidomiméticos, compostos orgânicos e semelhantes. Os ligandos podem também incluir polipéptidos e/ou proteínas.

Tal como aqui utilizado, "modular" refere-se a modificar ou alterar a atividade biológica de uma molécula de interesse. Um composto "modulador" pode aumentar ou diminuir a atividade ou alterar as características físicas ou químicas ou as propriedades funcionais ou imunológicas da molécula de interesse. Um composto modulador da presente invenção pode incluir péptidos FKBP-L, peptidomiméticos, péptidos modificados (e.g., fosfopéptidos, péptidos cíclicos, péptidos contendo D-aminoácidos e aminoácidos não naturais, péptidos agrafados, péptidos contendo um radiomarcador) ou péptidos ligados a anticorpos, hidratos de carbono, monossacáridos, oligossacáridos, polissacáridos, glicolípidos, compostos heterocíclicos, nucleósidos ou nucleótidos ou suas partes e/ou pequenas moléculas orgânicas ou inorgânicas (e.g., péptidos modificados com PEG ou outros grupos estabilizadores) naturais e/ou sintetizados quimicamente ou artificiais. Assim, os polipéptidos de FKBP-L da invenção também incluem péptidos modificados quimicamente ou isómeros e formas racémicas.

Um "agonista" compreende um composto que se liga a um recetor para formar um complexo que desencadeia uma resposta farmacológica específica do recetor envolvido.

Um "antagonista" compreende um composto que se liga a um agonista ou a um recetor para formar um complexo que não dá origem a uma resposta farmacológica substancial e pode inibir a resposta biológica induzida por um agonista. A expressão "peptidomimético" refere-se a estruturas que servem como substitutas de péptidos em interações entre moléculas (Morgan et ai., 1989, Ann. Reports Med. Chem., 24:243-252) . Os peptidomiméticos podem incluir estruturas sintéticas que podem ou não conter aminoácidos e/ou ligações peptidicas mas que retêm as caracteristicas estruturais e funcionais de um péptido ou agonista ou antagonista. Os peptidomiméticos também incluem peptóides, oligopeptóides (Simon et ai., 1972, Proc. Natl. Acad, Sei., USA, 89:9367); e bibliotecas de péptidos contendo péptidos de um comprimento pretendido representando todas as possíveis sequências de aminoácidos correspondentes a um péptido ou agonista ou antagonista da invenção.

Tal como aqui utilizada, a expressão "EC50" define-se como a concentração de um agente que resulta em 50% de um efeito biológico medido. Por exemplo, o EC50 de um agente terapêutico com um efeito biológico mensurável pode compreender o valor ao qual o agente apresenta 50% do efeito biológico.

Tal como aqui utilizada, a expressão "IC50" define-se como a concentração de um agente que resulta em 50% de inibição de um efeito medido. Por exemplo, o IC50 de um antagonista da ligação pode compreender o valor ao qual o antagonista reduz em 50% a ligação do ligando a um local de ligação de ligando.

Tal como aqui utilizado, uma "quantidade eficaz" significa a quantidade de um agente que é eficaz para produzir um efeito pretendido num indivíduo. A expressão "quantidade terapeuticamente eficaz" denota essa quantidade de um fármaco ou agente farmacêutico que desencadeará a resposta terapêutica pretendida por parte de um animal ou humano. A dose real compreendida na quantidade eficaz pode depender da via de administração, do tamanho e saúde do indivíduo, da doença a ser tratada e fatores semelhantes. A expressão "transportador farmaceuticamente aceitável" tal como aqui utilizada pode referir-se a compostos e composições que são adequados para uso em indivíduos humanos ou animais como por exemplo, para composições terapêuticas administradas para o tratamento de uma doença de interesse. A expressão "composição farmacêutica" é aqui usada para nomear uma composição que pode ser administrada a um hospedeiro mamífero, e.g., oralmente, parentericamente, topicamente, por aerossol de inalação, intranasalmente ou por via retal em formulações de dosagem unitária contendo transportadores, diluentes, adjuvantes, veículos e semelhantes, convencionais e não tóxicos. A expressão "parentérico" tal como aqui utilizada, inclui injeções subcutâneas, intravenosas, intramusculares, injeção intracisterna ou técnicas de infusão.

Uma formulação "estável" é aquela na qual o polipéptido ou proteína presente na formulação retém essencialmente a sua estabilidade física e química e atividade biológica durante o armazenamento. Estão disponíveis na especialidade várias técnicas analíticas para medir a estabilidade de proteína e foram revistas em Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pub. (1991) e Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993). A estabilidade pode ser medida a uma temperatura selecionada e durante um intervalo de tempo selecionado. Para um rastreio rápido, a formulação de interesse pode ser mantida a 40 °C durante 1 semana e até 1 mês, findo o qual se mede a estabilidade. A extensão de agregação após liofilização e armazenagem pode ser usada como um indicador da estabilidade do péptido e/ou proteína. Por exemplo, uma formulação "estável" é aquela na qual menos de cerca de 10% e preferentemente menos de cerca 5% do polipéptido ou proteína está presente como um agregado na formulação. Pode determinar-se um aumento na formação de agregados após liofilização e armazenagem da formulação liofilizada. Por exemplo, uma formulação liofilizada "estável" pode ser aquela em que o aumento de agregados na formulação liofilizada é menos que cerca de 5% ou menos que cerca de 3%, quando a formulação liofilizada é incubada a 40 °C durante pelo menos uma semana. A estabilidade da formulação de proteínas de fusão pode ser medida usando um ensaio de atividade biológica tal como um ensaio de ligação tal como aqui descrito.

Polipéptidos de FKBP-L como moduladores de migração celular, angiogénese e metástase de tumor A presente invenção reconhece que FKBP-L, fragmentos de FKBP-L e seus derivados biologicamente ativos, podem inibir migração celular e podem apresentar propriedades de modulação de angiogénese potente. As concretizações da presente invenção referem-se a péptidos derivados de FKBP-L e à sua utilização. A presente invenção pode ser concretizada de vários modos.

Assim, em determinadas concretizações, os polipéptidos de FKBP-L da presente invenção podem apresentar propriedades antiangiogénicas. Igualmente, em algumas concretizações, os polipéptidos de FKBP-L da presente invenção podem ser usados para modular migração celular e/ou metástase de células de tumor. A ação dos polipéptidos de FKBP-L da presente invenção pode, em determinadas concretizações, ser mediada por CD44. Assim, em algumas concretizações da presente invenção, podem usar-se os polipéptidos de FKBP-L para modular angiogénese, migração celular e/ou metástase de células que expressam CD44.

Em determinadas concretizações, a invenção pode ser usada para tratar doenças mediadas por migração celular ou associadas a migração celular. Por exemplo, podem usar-se péptidos de FKBP-L para inibir ou combater invasão por tumor e metástase. Ou, em algumas concretizações, podem usar-se péptidos de FKBP-L para inibir a migração de células envolvidas na cicatrização de feridas. Ainda noutras concretizações, podem usar-se péptidos de FKBP-L para inibir angiogénese para assim tratar doenças mediadas por angiogénese.

Assim, descreve-se aqui o uso para tratar uma doença mediada ou associada a pelo menos um de migração celular, angiogénese ou metástase de tumor, em que o método compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de: (i) um composto ativo compreendendo um polipéptido de FKBP-L isolado ou um fragmento biologicamente ativo de um polipéptido de FKBP-L ou um derivado biologicamente ativo de um polipéptido de FKBP-L ou (ii) um polinucleótido que codifica tal polipéptido de FKBP-L, fragmento ou derivado, a um doente que dele necessite.

Por exemplo, descreve-se aqui o uso num método de modular angiogénese ou metástase de tumor, em que o método compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto ativo compreendendo um polipéptido de FKBP-L isolado ou um fragmento biologicamente ativo de um polipéptido de FKBP-L ou um derivado biologicamente ativo de um polipéptido de FKBP-L ou um polinucleótido que codifica tal polipéptido de FKBP-L, fragmento ou derivado, a um doente que dele necessite.

Em outras concretizações, a presente invenção compreende o uso de: (i) um composto ativo compreendendo um polipéptido de FKBP-L isolado ou um fragmento biologicamente ativo de um polipéptido de FKBP-L ou um derivado biologicamente ativo de um polipéptido de FKBP-L ou um seu fragmento ou (ii) um polinucleótido que codifica tal polipéptido de FKBP-L, fragmento ou derivado no fabrico de uma composição ou medicamento para o tratamento de uma doença mediada ou associada com pelo menos um de migração celular e/ou angiogénese. Por exemplo, numa concretização, a presente invenção compreende o uso de (i) um composto ativo compreendendo um polipéptido de FKBP-L isolado ou um fragmento biologicamente ativo de um polipéptido de FKBP-L ou um derivado biologicamente ativo de um polipéptido de FKBP-L ou um seu fragmento ou (ii) um polinucleótido que codifica tal polipéptido de FKBP-L, fragmento ou derivado no fabrico de um medicamento para uso como um inibidor de angiogénese. Várias doenças que são mediadas ou associadas a angiogénese e/ou migração celular podem tratar-se com as composições e/ou medicamentos da presente invenção. Assim, em concretizações alternativas, o medicamento pode ser usado no tratamento de pelo menos um de inflamação associada a angiogénese, doenças oculares mediadas por angiogénese, cicatrização de feridas ou cancro.

Também se descreve aqui o uso de (i) um composto ativo compreendendo um polipéptido de FKBP-L isolado ou um fragmento biologicamente ativo de um polipéptido de FKBP-L ou um derivado biologicamente ativo de um polipéptido de FKBP-L ou (ii) um polinucleótido que codifica tal polipéptido de FKBP-L, fragmento ou derivado no fabrico de um medicamento para uso no tratamento de inflamação associada a angiogénese. A doença associada a angiogénese é uma doença ocular, por exemplo, descrevem-se aqui degeneração da mácula e outras doenças oculares. Também se descrevem doenças associadas com angiogénese, tais como arteriosclerose, artrite, psoriase ou endometriose. Ou, a presente invenção pode compreender o uso de (i) um composto ativo compreendendo um polipéptido de FKBP-L isolado ou um fragmento biologicamente ativo de um polipéptido de FKBP-L ou um derivado biologicamente ativo de um polipéptido de FKBP-L ou (ii) um polinucleótido que codifica tal polipéptido de FKBP-L, fragmento ou derivado no fabrico de um medicamento para uso no tratamento de doenças oculares mediadas por angiogénese. Por exemplo, em concretizações alternativas, o péptido ou polinucleótido de FKBP-L pode ser usado para o fabrico de um medicamento para o tratamento de doença degenerativa da mácula ou retinopatia diabética. Também se descreve o uso de (i) um composto ativo compreendendo um polipéptido de FKBP-L isolado ou um fragmento biologicamente ativo de um polipéptido de FKBP-L ou um derivado biologicamente ativo de um polipéptido de FKBP-L ou (ii) um polinucleótido que codifica tal polipéptido de FKBP-L, fragmento ou derivado no fabrico de um medicamento para uso no tratamento de pelo menos um de arteriosclerose, psoriase, artrite ou endometriose.

Em determinadas concretizações, a invenção proporciona usos em métodos de tratamento de cancro. Por exemplo, em algumas concretizações, a presente invenção proporciona o uso num método para tratar cancro compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto ativo compreendendo um polipéptido de FKBP-L isolado, um fragmento biologicamente ativo de um polipéptido de FKBP-L ou um derivado biologicamente ativo de um polipéptido de FKBP-L ou um polinucleót ido que codifica tal polipéptido de FKBP-L, seu fragmento ou derivado, para pelo menos um de tratar cancro, inibir migração de células de tumor e/ou metástase ou inibir crescimento de células de tumor e/ou proliferação. Numa concretização, a inibição de migração de células de tumor e metástase é por inibição de angiogénese. Por exemplo, a presente invenção pode compreender o uso de (i) um composto ativo compreendendo um polipéptido de FKBP-L isolado ou um fragmento biologicamente ativo de um polipéptido de FKBP-L ou um derivado biologicamente ativo de um polipéptido de FKBP-L ou (ii) um polinucleótido que codifica tal polipéptido de FKBP-L, fragmento ou derivado no fabrico de um medicamento para uso no tratamento de cancro. Em determinadas concretizações, os compostos e composições da presente invenção podem evitar crescimento de células de tumor e/ou metástases.

Numa concretização, a inibição de migração de células de tumor e metástase é por inibição de angiogénese. Assim, numa concretização, a presente invenção pode compreender o uso de (i) um composto ativo compreendendo um polipéptido de FKBP-L isolado ou um fragmento biologicamente ativo de um polipéptido de FKBP-L ou um derivado biologicamente ativo de um polipéptido de FKBP-L ou (ii) um polinucleótido que codifica tal polipéptido de FKBP-L, fragmento ou derivado no fabrico de um medicamento para uso como um inibidor de migração de células de tumor e/ou metástase. Ainda noutras concretizações, a presente invenção pode compreender o uso de (i) um composto ativo compreendendo um polipéptido de FKBP-L isolado ou um fragmento biologicamente ativo de um polipéptido de FKBP-L ou um derivado biologicamente ativo de um polipéptido de FKBP-L ou (ii) um polinucleótido que codifica tal polipéptido de FKBP-L, fragmento ou derivado no fabrico de um medicamento para uso como inibidor de crescimento de células de tumor e/ou proliferação. A expressão polipéptidos de FKBP-L é usada na especificação de acordo com o seu significado mais lato. Designa as proteínas de ocorrência natural tal como apresentadas em SEQ ID NOS: 1, 2 e 29 conjuntamente com homólogos devidos a polimorfismos, outras variantes, mutantes e partes do referido polipéptido que retêm as suas atividades de modulação de angiogénese. Por exemplo, em determinadas concretizações, o polipéptido de FKBP-L compreende SEQ ID NO: 1 com uma sequência de terminal N (consultar os resíduos de aminoácidos em negrito em SEQ ID NO: 1 tal como apresentado na figura 1) que inclui o marcador de poli-histidina com seis resíduos de histidina ligados ao terminal N da proteína ou SEQ ID NO: 2 com uma treonina na posição 181 e uma glicina na posição 186 da sequência de tipo selvagem. Ou, pode usar-se um polipéptido de SEQ ID NO: 29 (n-de acesso GENBank NP_071393; NM_022110; [gi:34304364]) . Apresentam-se na figura 1 exemplos de construções de outros polipéptidos de FKBP-L (e.g., fragmentos e outras modificações) da presente invenção. Igualmente, na figura 2 proporcionam-se exemplos de construções de polinucleótidos que codificam para construções de polipéptido de FKBP-L.

As concretizações da presente invenção compreendem um polipéptido de FKBP-L isolado ou um fragmento biologicamente ativo de um polipéptido de FKBP-L ou um derivado biologicamente ativo de tal polipéptido de FKBP-L ou fragmento para uso como um medicamento. Assim, as concretizações alternativas da presente invenção compreendem o uso de um péptido de FKBP-L ou nucleótido que codifica um péptido de FKBP-L tal como aqui descrito em que o polipéptido de FKBP-L compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 10 ou a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO: 29 ou a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma de SEQ ID NOs: 3 a 7 ou 11 a 28 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma de SEQ ID NOs: 1 a 29. Ou, pode usar-se uma sequência que compreende pelo menos 18 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 10 (e.g., SEQ ID NOs: 11, 16, 23) . As referências aqui a péptidos (e seus usos) que se apresentam tal como modificados, tal como SEQ ID NOs: 12, 13 e 28, devem ser interpretadas como abrangendo péptidos com sequências de aminoácidos idêntica sem as modificações listadas (e seus usos), salvo indicação em contrário.

Tal como aqui descrito, os usos e composições da presente invenção podem utilizar um polipéptido de FKBP-L completo ou fragmentos do polipéptido. Assim, determinadas concretizações da presente invenção compreendem um derivado de FKBP-L que compreende ou consiste de uma parte eficaz da sequência de aminoácidos do terminal N de FKBP-L de ocorrência natural. Esta sequência pode compreender ou consistir de uma parte N-terminal ativa do polipéptido de FKBP-L. Em concretizações alternativas, o polipéptido pode compreender ou consistir dos aminoácidos 1 a 57 de SEQ ID NO: 2 (i.e., SEQ ID NO: 6) ou aminoácidos 34-57 de SEQ ID NO:2 (i.e., SEQ ID NO: 10) . Ou, o péptido pode compreender ou consistir de uma sequência que compreende pelo menos 18 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 10 (e.g., SEQ ID NOs: 11, 16 ou 23). Numa concretização alternativa, o polipéptido usado nos usos e composições da presente invenção pode compreender ou consistir de uma das sequências de aminoácidos apresentadas em qualquer uma de SEQ ID NOs: 1-7, 10-29. Em determinadas concretizações, a presente invenção compreende um fragmento biologicamente ativo de FKBP-L, em que o referido polipéptido inclui não mais de 200 aminoácidos consecutivos da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO: 29.

Tal como aqui descrito, os péptidos podem ser modificados (e.g., para conter marcadores de PEG e/ou de His ou outras modificações) . Ou, a presente invenção pode compreender polipéptidos isolados com uma sequência pelo menos 70% ou 75% ou 80% ou 85% ou 90% ou 95% ou 96% ou 97% ou 98% ou 99% idêntica às sequências de aminoácidos apresentadas em qualquer uma de SEQ ID NOS: 1-29. Ou, o péptido isolado ou o péptido usado para a preparação de um medicamento pode compreender ou consistir de uma sequência com pelo menos 70% ou 75% ou 80% ou 85% ou 90% ou 95% ou 96% ou 97% ou 98% ou 99% de identidade com pelo menos 18 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 10 (e.g., SEQ ID NOs: 11, 16, 23). O derivado de FKBP-L da invenção pode ter comprimento variável desde que retenha a sua atividade antiangiogénica/proangiogénica e pode ser usado de acordo com vários aspetos da invenção descritos anteriormente. Também se descrevem aqui equivalentes funcionais de FKBP-L. Por exemplo, um equivalente funcional pode compreender ou consistir de uma molécula pequena que se pode ligar a CD44 e/ou evitar a ligação de um ligando (e.g. MIF) a um complexo contendo CD44 e CD74. Ou, um equivalente funcional pode compreender ou consistir de uma molécula pequena que atuará de um modo semelhante a FKBP-L e aos seus derivados de péptido para inibição pelo menos de migração celular, angiogénese e/ou metástase. A dose do polipéptido de FKBP-L administrado pode variar dependendo da doença a tratar. Em concretizações alternativas, a dosagem a obter in vivo seria equivalente a um teor in vitro superior a lCh12 M ou ICh11 M ou lCh10 M ou lCh9 M ou lCh8 M ou lCh 7 M ou lCh6 M ou lCh5 M. Assim, a dosagem a obter in vivo pode ser equivalente a um teor in vitro de ICh12 M a lCh5 M ou lCh11 M a ICh6 M ou ICh10 M a ICh7 M ou ICh9 M a ICh7 M ou gamas deste tipo. Em concretizações alternativas, a dosagem usada pode ser equivalente a um teor in vitro de 1-10000 ngrnl-1 ou 10-5000 ngml~ 1 ou 100-1000 ngrnl-1. Ou, em determinadas concretizações, a dosagem pode compreender entre 0,00001 e 500 mg/kg/dia ou desde 0,0001 a 300 mg/kg/dia ou desde 0,003 a 100 mg/kg/dia ou desde 0,03 a 30 mg/kg/dia ou desde 0,1 mg/kg/dia a 10 mg/kg/dia ou desde 0,3 mg/kg/dia a 3 mg/kg/dia.

Numa concretização, o polipéptido de FKBP-L é administrado a um indivíduo que dele necessita. Tal como aqui utilizado, um indivíduo que dele necessita é um indivíduo que pode beneficiar da administração de FKBP-L.

Ainda noutras concretizações, a presente invenção compreende uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica uma proteína ou polipéptido compreendendo a sequência de aminoácidos tal como estabelecida em qualquer uma de SEQ ID NOs: 1-29 ou um seu fragmento biologicamente ativo e o uso de tais moléculas para a preparação de medicamentos e/ou como agentes terapêuticos. Numa concretização, um fragmento biologicamente ativo compreende ou consiste de pelo menos 18 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 10 (e.g., SEQ ID NOS:ll, 16, 23) .

Por exemplo, as concretizações da presente invenção compreendem o uso de um polinucleótido que codifica um péptido de FKBP-L, um fragmento biologicamente ativo de um péptido de FKBP-L ou um seu derivado biologicamente ativo, em que o polinucleótido que codifica o polipéptido de FKBP-L, fragmento ou derivado compreende a sequência de nucleótidos apresentada em qualquer uma de SEQ ID NOs: 30-39.

De igual modo, a presente invenção compreende ácidos nucleicos isolados que codificam para péptidos de FKBP-L. A molécula de ácido nucleico pode compreender uma molécula de ácido nucleico com a sequência tal como estabelecida em SEQ ID NOs: 30-39 ou um seu fragmento, em que a molécula de ácido nucleico codifica para um polipéptido com a sequência de SEQ ID NOs: 1-28 ou um fragmento desses polipépt idos. Numa concretização, um fragmento compreende ou consiste de pelo menos 18 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 10 (e.g., SEQ ID NOS: 11, 16, 23) . Em determinadas concretizações, podem usar-se moléculas de ácido nucleico degeneradas, compreendendo uma variação degenerada na terceira posição do codão de aminoácido de tal modo que o mesmo aminoácido é codificado pela sequência degenerada, para codificar os polipéptidos de FKBP-L, fragmentos e/ou derivados da presente invenção. Assim, em determinadas concretizações, a presente invenção pode compreender moléculas de ácido nucleico isoladas com uma sequência pelo menos 70% ou 75% ou 80% ou 85% ou 90% ou 95% ou 96% ou 97% ou 98% ou 99% idêntica às SEQ ID NOS: 30-39 ou seus fragmentos.

Também se descrevem iniciadores que podem ser usados para produzir fragmentos de polinucleótidos de SEQ ID NO: 31, em que tais fragmentos codificam para os péptidos de FKBP-L apresentados na figura 1, incluindo iniciadores de oligonucleótidos compreendendo as sequências tal como estabelecidas em SEQ ID NOS: 45-58 ou uma sequência pelo menos 70% ou pelo menos 80% ou pelo menos 85% ou pelo menos 90% ou pelo menos 95% ou pelo menos 96% ou pelo menos 97% ou pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica a estas.

Ainda noutras concretizações, a presente invenção compreende vetores contendo as moléculas de ácido nucleico isoladas da presente invenção. Em determinadas concretizações, a presente invenção também compreende células transfetadas com tais vetores, de modo a que um polipéptido de FKBP-L seja expresso. Tais concretizações são aqui descritas com maior detalhe.

Também se descreve aqui uma molécula de ácido nucleico isolada que é antissentido relativamente à cadeia de codificação do gene FKBP-L ou a parte desta e o uso de tais moléculas para a preparação de medicamentos e/ou como agentes terapêuticos, incluindo um polinucleótido que é pelo menos 70% ou 75% ou 80% ou 85% ou 90% ou 95% ou 96% ou 97% ou 98% ou 99% idêntico a uma sequência de ácidos nucleicos que é antissentido relativamente à cadeia de codificação de um ARNm que codifica um polipéptido de FKBP-L da invenção.

Podem usar-se as moléculas antissentido para promover vantajosamente angiogénese e/ou migração celular e no tratamento de doenças mediadas ou associadas com pelo menos um de angiogénese ou migração celular. Por exemplo, descreve-se aqui o uso de um oligonucleótido antissentido ou ARNsi capaz de regular negativamente especificamente a expressão de FKBP-L no fabrico de um medicamento para uso como um modulador para promover angiogénese e também no uso de um oligonucleótido antissentido ou ARNsi capaz de regular negativamente especificamente a expressão de FKBP-L no fabrico de um medicamento para uso como um modulador para promover pelo menos um de hematopoiese ou vasculogénese. Também se descreve aqui o uso de um oligonucleótido antissentido ou ARNsi capaz de regular negativamente especificamente a expressão de FKBP-L no fabrico de um medicamento para uso para promover cicatrização de feridas. Também se descreve aqui o uso de um oligonucleótido antissentido ou ARNsi capaz de regular negativamente especificamente a expressão de FKBP-L no fabrico de um medicamento para uso no tratamento de pelo menos um de úlcera péptica, uma fratura óssea ou queloides.

Descreve-se aqui também o uso de um oligonucleótido antissentido ou ARNsi capaz de regular negativamente especificamente a expressão de FKBP-L no fabrico de um medicamento para uso no tratamento de parodontite ou periodontopatia mediada por angiogénese, igualmente o uso de um oligonucleótido antissentido ou ARNsi capaz de regular negativamente especificamente a expressão de FKBP-L no fabrico de um medicamento para uso no tratamento ou regulação do sistema reprodutivo, tal como ovulação, menstruação e placentação. Também se descreve o uso de um oligonucleótido antissentido ou ARNsi capaz de regular negativamente especificamente a expressão de FKBP-L no fabrico de um medicamento para uso no tratamento ou regulação de disfunção no cérebro e sistema nervoso, tal como a que pode ser causada por AVC. 0 uso de um oligonucleótido antissentido ou ARNsi capaz de regular negativamente especificamente a expressão de FKBP-L pode portanto ser útil no tratamento de determinados tipos de demência e/ou atraso mental.

Discutem-se mais detalhadamente seguidamente aspetos adicionais de determinadas concretizações da presente invenção. FKBP-L modula migração celular, angiogénese e metástase

Em determinadas concretizações, podem usar-se FKBP-L e seus fragmentos para modular angiogénese. Numa concretização, podem usar-se FKBP-L ou seus fragmentos para inibir angiogénese. Por exemplo, a transfeção de células com FKBP-L pode inibir migração de células endoteliais e angiogénese (figura 3) indicando que a proteína FKBP-L é potencialmente uma proteína antimigratória. A natureza dependente da dose do efeito de FKBP-L na migração celular apresenta-se na figura 4. Assim, pode observar-se que uma dose de lCb6 M de FKBP-L completa com marcador de His é eficaz para evitar migração celular.

Em determinadas concretizações, FKBP-L pode ser excretada de determinados tipos de células tal como células endoteliais (figura 5) e células de tumor. Assim, numa concretização, a ação antiangiogénica de FKBP-L pode ser através de ativação de recetor. A excreção de FKBP-L a partir de células endoteliais indica que tanto a aplicação de proteína FKBP-L como a sobrexpressão de FKBP-L usando uma construção de ADNc podem ser ambas capazes de exercer efeitos antiangiogénicos observados tanto in vitro como in vivo.

Em determinadas concretizações, FKBP-L apresenta um efeito sobre a migração celular ao longo de um período de tempo fisiologicamente relevante. Por exemplo, células HMEC-1 tratadas com polipéptido de FKBP-L completa recombinante com marcador de His (SEQ ID NO: 1) podem apresentar diminuição no fecho de feridas de até 2 a 3 dias (figura 6) . Assim, a aplicação da proteína FKBP-L pode ser durante horas, dias ou semanas tal como necessário para inibir migração de células e/ou angiogénese. 0 efeito de FKBP-L sobre a migração de células e/ou angiogénese pode, em determinadas concretizações, ser eficaz para quaisquer células que são influenciadas por migração celular e/ou angiogénese. Assim, tal como descrito detalhadamente nos exemplos aqui, FKBP-L completa recombinante (e.g., SEQ ID NO: 1) apresenta ação antimigratória numa vasta gama de dosagem e numa variedade de modelos para angiogénese, incluindo fecho de ferida em HMEC-1 (figuras 3, 4 e 6) e formação de tubo em HMEC-1 (figura 7), ensaio de esponja de ratinho (figuras 8, 9A e 9B) e modelo de explante de anel aórtico (figura 10) .

De igual modo, numa concretização, o efeito de FKBP-L na mobilidade celular e/ou angiogénese não é devido a toxicidade do composto. Assim, quando as células são expostas a FKBP-L completa recombinante durante até 48 horas, pode não ocorrer qualquer indicação de toxicidade (figura 11A e 11B).

Podem existir vários mecanismos pelos quais FKBP-L atua na célula. Numa concretização, o mecanismo de inibição de migração mediada por FKBP-L pode ser dirigido ao citoesqueleto (figuras 12 e 13) . Por exemplo, em determinadas concretizações, FKBP-L pode levar a disrupção ou outras alterações nos filamentos do citoesqueleto.

Os efeitos antiangiogénicos de FKBP-L indicam que FKBP-L pode ter atividade antitumorigénica e/ou antimetastática. Por exemplo, tal como apresentado na figura 14, painéis A, B e C, o polipéptido de FKBP-L completo recombinante pode inibir migração de células de tumor de um modo dependente da dose, indicando que FKBP-L pode ser útil como um agente terapêutico para reduzir invasão de células de tumor e metástase de células de tumor que dependem da migração para metastizar. Em determinadas concretizações, o tratamento de tumores in vivo com uma construção de expressão que codifica um polipéptido de FKBP-L completo por terapia génica (figura 15) leva a uma redução do crescimento do tumor.

Interação de FKBP-L com genes envolvidos em angiogénese Vária vias bioquímicas podem ser moduladas por FKBP-L. Em determinadas concretizações, FKPB-L pode levar a um aumento na expressão de determinados genes associados a angiogénese e/ou migração celular. Por exemplo, em determinadas concretizações, a transfeção com um ácido nucleico de FKPB-L antissentido pode levar a um aumento na expressão de PI3K, proteína ativadora de Rho GTPase-oligofrenina 1, ROCK, proteína 1B associada a microtúbulos, proteína 1 do tipo MMP e/ou proteína 1 membro da superfamília de ligandos TNF (consultar exemplo 12 aqui). Sabe-se que a expressão elevada de RhoA, RhoC, ROCK I e ROCK II está associada a progressão de tumor e sugeriu-se que a sinalização de Rho e ROCK contribui para as alterações morfológicas e comportamento metastático de algumas células de tumor. Assim, a sobrexpressão de FKBP-L pode inibir angiogénese e a repressão de FKBP-L usando oligonucleótidos antissentido pode promover angiogénese por ativação de genes associados a angiogénese, tais como Rho e ROCK.

Interação de FKBP-L com CD44 CD74 é expressa em células apresentadoras de antigénio. Uma função primária de CD74 é a seleção intracelular de moléculas de MHC de classe II. CD74 é expressa em carcinomas de origem renal, pulmonar, gástrica e tímica e por determinados sarcomas. Adicionalmente, CD74 pode expressar-se em resposta a determinados genes de tumor. Por exemplo, a expressão superficial de CD74 induzida por INF- em linhas de carcinoma de mama pode ser aumentada por proteína de retinoblastoma. Assim, a expressão restrita de CD74 em tecidos normais e a sua rápida internalização, pode tornar CD74 num agente terapêutico atraente tanto para cancro como para doenças imunológicas. 0 fator de inibição de macrófagos (MIF) pode também estar envolvido em tumorigénese. Observam-se níveis elevados de MIF em tumores humanos e correlacionam-se com a determinação do grau e o prognóstico. Além disso, o MIF pode estar envolvido em angiogénese, crescimento de tumor e metástase através de uma via dependente de Rho (Amin et al., 2006, Blood, 107:2252-2261; Ren et al. , 2006, Oncogene, 25:3501-3508; Sun et al. , 2005,

Clin. Cancer Res., 11:1050-1058; Sun et al., 2003, Int. J. Mol. Med., 12:633-641) . A transdução de sinal de MIF pode ser iniciada por ligação a CD74 (Leng et al., 2003, J. Exp. Med., 197:14 67-147 6) . Pensa-se igualmente que a ativação de CD74 necessita de interação com CD44 (Naujokas et al. , 1993, Cell, 74:257-268; e Naujokas et al. , 1995, Immunity, 3:359-372) .

Provou-se também que MIF interage num complexo tanto com CD74 como com CD44 e a inibição deste complexo resulta na diminuição da proliferação de células de cancro da bexiga (Meyer-Siegler et al., 2004, BMC Cancer, 12 de julho; 4:34; consultar também Leng et al., 2006, Cell Res., 16:162-168). A formação de um complexo entre MIF, CD44 e CD74 pode ser importante para a sinalização biológica mediada por MIF (Shi et al., Immunity, 2006, 25(4):595-606).

Em determinadas concretizações, FKBP-L pode atuar por interação com CD44. Numa concretização, FKBP-L pode ligar-se a CD44 e evitar que ocorra interação entre CD44 e CD74. Se FKBP-L ou uma sua parte, for capaz de deslocar CD74 de CD44, o polipéptido de FKBP-L pode evitar a formação do complexo de CD44-CD74-MIF que é necessário para transdução de sinal induzido por MIF. Ou, noutras concretizações, FKBP-L pode atuar por mecanismos alternativos.

Pensa-se que CD44 é expressa pela maioria das células epiteliais e tem sido implicada em angiogénese (Cao et ai., 2006, Am. J. Pathol., 169:325-336). Assim, numa concretização, CD44 pode ser necessária para inibição por FKBP-L de migração de células endoteliais e/ou angiogénese. De igual modo, numa concretização, CD44 pode ser necessária para inibição por FKBP-L de migração de células de tumor. Assim, tal como apresentado nas figuras 16 e 17A-17E, FKBP-L completa recombinante, em determinadas concretizações, pode inibir migração de células de tumor em linhas celulares de tumor que expressam CD44 (i.e., positivas para CD44 ou CD44 +ve), mas não em linhas celulares de tumor negativas para CD44 (CD44 -ve), sugerindo que FKBP-L pode inibir metástases de tumor num subconjunto de linhas celulares de tumor positivas para CD44. As células de HMEC-1 também são positivas para CD44 (não apresentado). Numa concretização, a inativação de CD44 (e.g., usando um ARNsi especifico de CD44) resulta na prevenção de inibição de migração de células de tumor mediada por FKBP-L (e.g., figura 18), demonstrando que CD44 pode estar envolvida em inibição por FKBP-L de migração de células de tumor e/ou metástase.

Numa concretização, FKBP-L pode interagir diretamente com CD44. Por exemplo, FKBP-L sobrexpressa exogenamente (e.g., SEQ ID NO: 1 gerada a partir de SEQ ID NO: 31) pode interagir com CD44 endógena em monocamadas feridas (figura 19; exemplo 16). Numa concretização, não há interação significativa entre FKBP-L endógena e CD44 em monocamadas não feridas, sugerindo que é necessária a expressão de um nivel critico de FKBP-L antes que se possa detetar a interação com CD44. Além disso, esta interação pode apenas ocorrer em células endoteliais que estão preparadas para migração (i.e. em monocamadas feridas).

Assim, em concretizações, FKBP-L completa é ativa contra células endoteliais microvasculares positivas para CD44 (figura 16) e pode portanto ter como alvo essas células no interior de tumores sólidos para evitar o crescimento adicional para o exterior de microvasos que suportam o crescimento de tumor. Como tal, FKBP-L pode ter como alvo a vasculatura em vez de um tipo específico de tumor e pode ser ativa contra uma maioria, se não todos, os tumores sólidos e as micrometástases. Igualmente, tal como discutido em maior detalhe seguidamente, os péptidos de FKBP-L apresentam uma atividade semelhante. Por exemplo, os aminoácidos 34-57 de FKBP-L (i.e., o "24 mero" de FKBP-L), os aminoácidos 1-57 de FKBP-L (i.e., o "1-57 mero" de FKBP-L) e outros péptidos de FKBP-L do terminal N da proteína FKBP-L podem inibir migração de células de tumor que expressam CD44. Assim, o polipéptido de FKBPL e seus derivados podem inibir migração de células endoteliais e/ou migração de células de tumor com implicações em angiogénese e invasão de uma forma que é consistente com interação entre FKBP-L e CD44.

Fragmentos de FKBP-L

As concretizações da presente invenção reconhecem que determinadas regiões do terminal N da proteína FKBP-L podem apresentar atividade biológica. Assim, em determinadas concretizações, as construções de expressão que expressam FKBP-L completa de tipo selvagem (WT) ou, em concretizações alternativas, mutantes de truncagem, tal como 48, 58, 86, 151, 20®.p rse lhes limitando, podem inibir o fecho de ferida (figura 20) . A sequência de aminoácidos de cada uma destas construções apresenta-se na figura 1. Por exemplo, em determinadas concretizações, WT-FKBP-L e 58 inibiram fecho de ferida em 36,2% e 48,8% respetivamente. Pode existir uma quantidade mínima de sequência que é requerida para que haja atividade. Por exemplo, em determinadas concretizações, FKBP-L 34 truncado pode não apresentar inibição significativa de fecho de ferida, sugerindo que o domínio ativo está deletado neste mutante. Estas experiências podem portanto indicar que o domínio ativo se localiza entre os aminoácidos 34 e 57 de FKBP-L completa (e.g., SEQ ID NO: 2).

Assim, tal como apresentado na figura 20A-20C, em determinadas concretizações, o domínio importante para a sua atividade antiangiogénica pode estar localizado entre os aminoácidos 34 e 57 (i.e. no terminal N) de FKBP-L.

Em determinadas concretizações, a parte de FKBP-L entre os aminoácidos 34 e 57 apresenta a mesma atividade biológica que FKBP-L completa. Em algumas concretizações, o 24 mero de FKBP- L pode apresentar potência aumentada comparativamente com a FKBP-L completa. Por exemplo, o péptido de 24 mero de FKBP-L (SEQ ID NO: 10) pode apresentar atividade biológica semelhante ou mais potente comparativamente com FKBP-L recombinante completa (e.g., SEQ ID NO: 1) relativamente a inibição de migração de células endoteliais/fecho de ferida (figura 21), a inibição da formação de contactos célula a célula endoteliais no ensaio de formação de tubo de Matrigel (figura 22), germinação angiogénica (figuras 23A, 23B, 24A e 24B), a capacidade das células invadirem (figura 25) e/ou a capacidade das células aderirem (figura 26) . Em determinadas concretizações, contudo, o 24 mero de FKBP-L e o 1-57 mero de FKBP-L apresentam potência aumentada comparativamente com FKBP-L completa (consultar e.g., figuras 21, 22 e 24).

Em determinadas concretizações, a atividade biológica de FKBP-L pode necessitar de CD44. Por exemplo, o péptido de 24 mero de FKBP-L (SEQ ID NO: 10) pode atuar de modo semelhante a FKBP-L recombinante completa (rFKBP-L) e inibir migração de células de tumor MDA-231 e PC3. Estas células de tumor são ambas positivas para CD44 (CD44 +ve) (i.e., expressam a proteína CD44) (figura 27A e 27B) indicando que o 24 mero de FKBP-L pode também ser capaz de inibir metástases de tumor num subconjunto de linhas celulares de tumor CD44 +ve. Numa concretização, FKBP-L e os seus derivados podem inibir migração de células de tumor e invasão e migração de células endoteliais de uma forma que é consistente com a existência de interação entre FKBP-L e CD44.

Também em determinadas concretizações, o péptido de 24 mero de FKBP-L (SEQ ID NO: 10) é um inibidor angiostático (figura 28A e 28B). Assim, o 24 mero de FKPB-L pode inibir o desenvolvimento de vasos quando os vasos são maduros ou recentemente embebidos. Contudo, numa concretização, o polipéptido de FKBP-L pode atuar por um mecanismo estático com o qual para o desenvolvimento de vasos quando adicionado, mas tem um efeito entre pequeno e residual quando é removido.

De igual modo, em determinadas concretizações, o 24 mero de FKBP-L inibe angiogénese in vivo usando o ensaio de esponja de ratinho (figura 29) e também inibe migração de células endoteliais de ratinho in vitro (figura 30) numa vasta gama de doses, demonstrando que este péptido humano é também ativo em ratinho. Tal é corroborado pelos dados proporcionados nas figuras 29 e 31.

De modo semelhante à proteína FKBP-L completa, o péptido de 24 mero de FKBP-L (SEQ ID NO: 10) pode, em determinadas concretizações, inibir crescimento de células de tumor in vivo (figura 31A). De igual modo, ratinhos tratados com o 24 mero de FKBP-L apresentaram sobrevivência significativamente aumentada (figura 31 B-D). Assim, tal como apresentado na figura 31A, o tratamento por injeção i.p. com o péptido de 24 mero de FKBP-L a doses de 0,3 mg/kg/dia ou 3xl0~3 mg/kg/dia retardou significativamente o crescimento de tumores DU145 em ratinhos SCID comparativamente com tumores tratados com veiculo sozinho. Numa concretização, os tumores tratados com estas doses de péptido de 24 mero de FKBP-L apresentam evidências de um centro necrótico tal como é tipico dos efeitos observados com antiangiogénicos.

Numa concretização, a atividade do péptido de 24 mero de FKBP-L, tal como a de FKBP-L completa, não é devida a toxicidade do péptido (figuras 31E, 32 e 33).

Em determinadas concretizações, partes ou fragmentos do péptido de 24 mero de FKBP-L (SEQ ID NO: 10) podem ser usadas como agentes terapêuticos. O exemplo 29 (figura 34) proporciona exemplos de fragmentos de péptido de 24 mero de FKBP-L que podem ter atividade e potência semelhantes a FKBP-L 24, FKBP-L 1-57 e FKBP-L completa.

Derivados de FKBP-L

Tal como descrito anteriormente, um derivado de FKBP-L para uso na invenção significa um polipéptido modificado por variação da sequência de aminoácidos de FKBP-L, e.g. SEQ ID NO:l, SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO:29 ou um seu fragmento ou um polipéptido que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico a este ou aqueles péptidos que foram modificados pela adição de um grupo funcional (e.g., PEG) . A geração de tais péptidos pode ser efetuada por manipulação do ácido nucleico que codifica o polipéptido ou por alteração da própria proteína.

Na SEQ ID NO: 2, a inserção de FKBP-L (originalmente clonada em PUC18 de Cambridge Bioscience e agora clonada em pcDNA3.1); tinha duas mutações pontuais inseridas comparativamente com a sequência que está depositada na base de dados PUBMED (SEQ ID NO: 29). Ocorre uma mutação pontual às 540 pb (a contar do codão de iniciação): TCT para ACT que consequentemente converte uma serina (S) numa treonina (T) (aminoácido: 181). Ocorre igualmente uma mutação pontual às 555 pb (a contar do codão de iniciação): AGG para GGG que consequentemente converte uma arginina (R) numa glicina (G) (aminoácido: 186) . Ambos os polipéptidos de FKBP-L (SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 29) apresentam atividade biológica.

Os derivados de FKBP-L incluem análogos da sequência de aminoácidos natural de FKBP-L e podem envolver inserção, adição, deleção e/ou substituição de um ou mais aminoácidos, ao mesmo tempo que proporcionam um polipéptido capaz de efetuar efeitos angiogénicos semelhantes às partes correspondentes aos mutantes truncados, 48 (SEQ ID NO:7), 58 (SEQ ID NO:6), 86 (SEQ ID NO: 5), 151 (SEQ ID NO:4) ou 200 (SEQ ID NO:3) (figura 1).

Também se incluem nos derivados de FKBP-L da presente invenção os polipéptidos derivados de 58 (SEQ ID NO:6), incluindo 24 mero de FKBP-L (SEQ ID NO 10) e os péptidos 1-17 (SEQ ID NOs: 12-28) apresentados na figura 1.

Assim, em determinadas concretizações, o domínio do terminal N (aminoácidos 34-57) de FKBP-L é importante para as propriedades antiangiogénicas. A figura 20C e o exemplo 17 apresentam um estudo no qual se compararam vários fragmentos de FKBP-L relativamente à eficácia na inibição da migração de células comparativamente com os controlos negativos com tempos de experiência iguais. Numa concretização, o fragmento 58 apresenta atividade de inibição máxima de entre os fragmentos ensaiados. A parte do polipéptido de FKBP-L que proporciona inibição de angiogénese pode encontrar-se no polipéptido compreendendo a parte de FKBP-L que é comum aos péptidos ativos 48 (SEQ ID NO:7) e 58 (SEQ ID NO:6). Este poléptido pode compreender a SEQ ID NO: 10 (figura 1).

Assim, os derivados de FKBP-L usados nos métodos e composições da presente invenção também incluem fragmentos ou derivados biologicamente ativos da FKBP-L de ocorrência natural. Em determinadas concretizações, os fragmentos são selecionados do domínio do terminal N de FKBP-L. Numa determinada concretização, os fragmentos selecionam-se dos aminoácidos 1 a 85 de FKBP-L completa (e.g., SEQ ID NOs: 2 ou 29) . Preferentemente tais análogos envolvem a inserção, adição, deleção e/ou substituição de 5 ou menos aminoácidos, com maior preferência de 4 ou menos, ainda com maior preferência de 3 ou menos, com a maior preferência 1 ou 2 aminoácidos apenas.

Os derivados de FKBP-L de acordo com a invenção também incluem péptidos multiméricos incluindo tais sequências de polipéptido de FKBP-L, análogos ou fragmentos e.g. SEQ ID NOs: 1-7, SEQ ID NO: 10-28 e profármacos incluindo tais sequências. Por exemplo, em determinadas concretizações FKBP-L ou fragmentos de FKBP-L podem formar multímeros pela formação de pontes dissulfureto entre os monómeros.

Os derivados do polipéptido de FKBP-L da invenção podem incluir o polipéptido ligado a um parceiro de acoplamento, e.g., uma molécula efetora, um marcador, um fármaco, uma toxina e/ou uma molécula transportadora ou de transporte. As técnicas para acoplar os polipéptidos da invenção a parceiros de acoplamento tanto peptidilo como não-peptidilo são bem conhecidas na especialidade.

Um "fragmento" de um polipéptido de FKBP-L significa uma parte de resíduos de aminoácido com pelo menos 6 aminoácidos.

Os derivados de FKBP-L da invenção incluem péptidos de fusão. Por exemplo, os derivados podem compreender péptidos de polipéptido da invenção ligados, por exemplo, a anticorpos que dirigem os péptidos para os tecidos doentes, por exemplo, tecido de tumor ou de retina. O polipéptido de FKBP-L ou seus análogos podem ser fundidos com o domínio constante de imunoglobulinas (IgA, IgE, IgG, IgM) ou suas partes (CHI, CH2, CH3 ou qualquer de suas combinações), resultando em polipéptidos quiméricos. Estes polipéptidos ou proteínas de fusão podem facilitar a purificação e podem apresentar uma semivida aumentada in vivo. Tais proteínas de fusão podem ser mais eficazes na ligação e neutralização de outras moléculas do que os polipéptidos monoméricos ou seus fragmentos sozinhos. Consultar, e.g., Fountoulakis et ai., J. Biochem., 270:3958-3964 (1995).

As proteínas de fusão da invenção também incluem polipéptidos de FKBP-L fundidos com albumina, por exemplo albumina sérica humana recombinante ou seus fragmentos ou variantes (consultar, e.g., patente US N2 5876969, patente EP 0413622 e patente US N2 5766883) . O uso de polinucleótidos que codificam tais proteínas de fusão aqui descritas está também abrangido pela invenção. O uso de um polinucleótido fundido a um agente citotóxico está também abrangido pela invenção. Neste caso o polipéptido de FKBP-L pode ligar-se a um recetor e o fármaco citotóxico pode ser internalizado.

Por exemplo, em concretizações alternativas, os derivados podem incluir: PEGuilação específica do local (ou semelhante) do péptido para aumentar a semivida; ou incorporação de aminoácidos não naturais e modificações do esqueleto para estabilizar contra proteólise; ou derivados cíclicos (para proporcionar resistência proteolítica); ou para bloquear os terminais N e C para evitar ou reduzir as atividades de exopeptidase e/ou proteinase; ou para ligar conjuntamente cópias múltiplas de péptidos quer em cadeias contíguas através de cadeias ligantes, que numa abordagem do tipo dendrímero para aumentar a "avidez" relativamente ao CD44 da superfície celular. Por exemplo, podem usar-se derivados triméricos de 24 mero ligados covalentemente como derivados de FKBP-L. Ou, pode ligar-se o 24 mero de FKBP-L a um domínio que forma homotrímeros para formar trímeros não covalentes. Ou, podem usar-se como derivados de FKBP-L os derivados de biotina dos péptidos que formarão complexos tetraméricos com estreptavidina. Ou, FKBP-L ou fragmentos de FKBP-L podem formar multímeros pela formação de ligações dissulfureto entre monómeros. Além disso, FKBP-L pode formar oligómeros através de associações não covalentes, possivelmente através dos domínios de repetição de tetratricopéptido previstos no interior da sequência de proteína.

Análogos de péptido inverso

Também se descrevem aqui análogos inversos ou retro-análogos de proteínas FKBP-L naturais ou suas partes ou seus derivados sintéticos. Consultar, por exemplo, EP 0497 366, U.S. 5 519 115 e Merrifield et al. , 1995, PNAS, 92:3449-53. Tal como descrito em EP 0497 366, os péptidos inversos são produzidos por inversão da sequência de aminoácidos de um péptido de ocorrência natural ou sintético. Tais péptidos inversos podem reter a mesma estrutura tridimensional geral (e. g., hélice alfa) do que o péptido parental exceto relativamente à conformação à volta dos locais internos sensíveis a protéase e as características dos terminais N e C. Os péptidos inversos pretendem não apenas reter a atividade biológica do péptido "normal" não inversos, mas podem também apresentar propriedades melhoradas, incluindo atividade biológica aumentada. (Consultar Iwahori et al., 1997, Biol. Pharm. Buli. 20: 267-70) . Os derivados para uso na presente invenção podem consequentemente compreender péptidos inversos de proteínas FKBP-L naturais e sintéticas.

Os péptidos (incluindo péptidos inversos e fragmentos de quaisquer deles) podem ser gerados completa ou parcialmente por síntese química ou por expressão a partir de ácido nucleico. Os péptidos para uso na presente invenção podem ser facilmente preparados de acordo com métodos de síntese bem estabelecidos e padronizados de síntese de péptidos em fase líquida ou preferentemente em fase sólida e bem conhecidos na especialidade (consultar, por exemplo, J. M. Stewart e J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2a edição, Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois (1984), em M. Bodanzsky e A. Bodanzsky, The Practice of Peptide Synthesis, Springer Verlag, New York (1984). Péptidos multiméricos

Tal como descrito anteriormente, os péptidos podem estar na forma de multímeros. Assim, são abrangidos pelos âmbito da invenção os multímeros de 2, 3 ou mais unidades monoméricas individuais de polipéptidos de FKBP-L ou dois ou mais fragmentos de FKBP-L.

Numa concretização, tais multimeros podem ser usados para preparar um péptido monomérico por preparação de um péptido multimérico que inclui a unidade monomérica e um local clivável (i.e., um local clivável enzimaticamente) e seguidamente clivagem do multimero para proporcionar um monómero pretendido.

Numa concretização, o uso de multimeros pode aumentar a afinidade de ligação para um recetor.

Os multimeros podem ser homómeros ou heterómeros. Tal como aqui usada, a expressão homómero refere-se a um multimero contendo apenas polipéptidos correspondentes a uma sequência de aminoácidos especifica (e.g., SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 29) ou variantes, variantes de splicing, proteínas de fusão ou outros análogos ou derivados de FKBP-L aqui descritos. Estes homómeros podem conter péptidos de FKBP-L com sequências de aminoácidos idênticas ou diferentes. Por exemplo, os multimeros podem incluir apenas péptidos de FKBP-L com uma sequência de aminoácidos idêntica ou podem incluir sequências de aminoácidos diferentes. O multimero pode ser um homodímero (e.g., contendo apenas péptidos de FKBP-L, podendo estes por sua vez apresentar sequências de aminoácidos idênticas ou diferentes), homotrimeros ou homotetrâmeros.

Tal como aqui utilizada, a expressão heterómero refere-se a um multimero contendo um ou mais polipéptidos heterólogos (i.e., péptidos ou polipéptidos não FKBP-L) além dos (poli)péptidos de FKBP-L aqui descritos.

Os multimeros podem ser o resultado de associações hidrofóbicas, hidrofílicas, iónicas e/ou covalentes e/ou podem ser ligados indiretamente através de, por exemplo, formação de lipossomas. Assim, numa concretização, os multimeros formam-se quando os péptidos de FKBP-L aqui descritos entram em contacto entre si em solução. Noutra concretização, formam-se heteromultimeros quando (poli)péptidos de FKBP-L e não FKBP-L entram em contacto com anticorpos contra os (poli)péptidos aqui descritos (incluindo anticorpos contra a sequência de (poli)péptido heteróloga numa proteína de fusão aqui descrita) em solução. Noutras concretizações, os multimeros aqui descritos podem ser formados por associações covalentes com e/ou entre os péptidos de FKBP-L (e opcionalmente péptidos não FKBP-L) aqui descritos.

Tais associações covalentes podem envolver um ou mais resíduos de aminoácidos contidos na sequência de FKBP-L (e.g., a mencionada em SEQ ID NOs: 1-28. Numa concretização, as associações covalentes são consequência de manipulação química ou recombinante. Alternativamente, tais associações covalentes podem envolver um ou mais resíduos de aminoácidos contidos na sequência de polipéptido heterólogo numa proteína de fusão de FKBP-L. Num exemplo, as associações covalentes são entre a sequência heteróloga contida numa proteína de fusão aqui descrita (consultar, e.g., patente US n2 5478925) . Noutro exemplo específico, as associações covalentes de proteínas de fusão aqui descritas são usando sequências de polipéptidos heterólogos de outra proteína que é capaz de formar multímeros com associação covalente, por exemplo, oesteoprotegerina (consultar, e.g., Publicação Internacional n2 WO 98/49305). Noutra concretização, dois ou mais polipéptidos aqui descritos são ligado conjuntamente através de ligantes peptídicos. Os exemplos incluem os ligantes peptídicos descritos na patente US n2 5073627. As proteínas compreendendo múltiplos péptidos de FKBP-L separados por ligantes peptídicos podem ser produzidas utilizando tecnologia convencional de ADN recombinante.

Podem também preparar-se multímeros por fusão de (poli)péptidos de FKBP-L com uma sequência de polipéptido de cremalheira de leucina ou de cremalheira de isoleucina. Entre as cremalheiras de leucina conhecidas estão os péptidos e seus derivados de ocorrência natural que dimerizam ou trimerizam. Os exemplos de domínios de cremalheira de leucina adequados para produzir as proteínas multiméricas solúveis aqui descritas são os que se descrevem no pedido PCT WO 94/10308. As proteínas de fusão recombinantes compreendendo um polipéptido aqui descrito fundidas com uma sequência de polipéptido que dimeriza ou trimeriza em solução podem ser expressas em células hospedeiras adequadas e a proteína de fusão multimérica solúvel resultante pode ser recuperada a partir do sobrenadante de cultura usando técnicas conhecidas na especialidade.

Os multímeros podem ser igualmente gerados usando técnicas químicas conhecidas na especialidade. Por exemplo, os polipéptidos a ser incluídos nos multímeros aqui descritos podem ser reticulados quimicamente usando moléculas ligantes e técnicas de otimização do comprimento de moléculas ligantes conhecidas na especialidade (consultar, e.g., patente US n2 5478925) . Adicionalmente, os multímeros podem ser gerados usando técnicas conhecidas na especialidade para formar uma ou mais reticulações intermoleculares entre os resíduos de cisteína localizados no interior da sequência dos polipéptidos que se pretende incluir no multímero (consultar, e.g., patente US n2 5478925) . Além disso, os polipéptidos aqui descritos podem ser rotineiramente modificados por adição de cisteína ou biotina ao terminal C ou ao terminal N do polipéptido e podem aplicar-se técnicas conhecidas na especialidade para gerar multímeros contendo um ou mais destes polipéptidos modificados (consultar, e.g., patente US n2 5478925) . Adicionalmente, podem usar-se técnicas conhecidas na especialidade para preparar lipossomas contendo dois ou mais péptidos C-12-C que se pretenda incluir no multímero (consultar, e.g., patente US n2 5478925) .

Alternativamente, aqueles multímeros que contenham apenas aminoácidos de ocorrência natural podem ser formados usando técnicas de engenharia genética conhecidas na especialidade. Alternativamente, aqueles que incluem modificações pós-tradução ou outras podem ser preparados por uma combinação de técnicas recombinantes e modificações químicas. Numa concretização, os péptidos FKBP-L são produzidos de forma recombinante usando tecnologia de proteína de fusão aqui descrita ou conhecida de outro modo na especialidade (consultar, e.g., patente US n2 5478925. Por exemplo, podem gerar-se polinucleótidos que codificam para um homodímero aqui descrito por ligação de uma sequência de polinucleótido que codifica um péptido de FKBP-L aqui descrito com uma sequência que codifica um polipéptido ligante e seguidamente adicionalmente a um polinucleótido sintético que codifica para o produto de tradução do polipéptido na orientação inversa do terminal C original para o terminal N (isenta da sequência líder) (consultar, e.g., patente US n2 5478925). As técnicas recombinantes aqui descritas ou conhecidas de outro modo na especialidade podem ser aplicadas para gerar (poli)péptidos de FKBP-L recombinantes que contêm um domínio transmembranar (ou péptido hidrofóbico ou de sinalização) e que podem ser incorporados em lipossomas por técnicas de reconstituição de membrana (consultar, e.g., patente US n2 5478925) .

Profármacos

Pretende-se que os polipéptidos aqui descritos, pelo menos em algumas concretizações, sejam administrados a um humano ou outro mamífero para tratar ou prevenir uma doença associada a angiogénese. Os péptidos são tipicamente administrados parentericamente, e.g., por injeção intravenosa, subcutânea ou intramuscular ou através da cavidade intranasal e podem ser facilmente metabolizados por protéases plasmáticas. Em alguns casos, o péptido de FKBP-L pode ser entregue em microcápsulas de poli(DL-lactídeo-co-glicolídeo) - libertação controlada ao longo de 30 dias. Têm sido desenvolvidos vários profármacos que permitem administração parentérica e oral de péptidos terapêuticos. Os péptidos ou polipéptidos podem ser conjugados com várias partes, tais como partes poliméricas, para modificar as propriedades fisico-químicas dos fármacos de péptido, por exemplo, para aumentar resistência a degradação ácida e enzimática e para melhorar penetração de tais fármacos através das membranas da mucosa. Por exemplo, Abuchowski e Davis descreveram vários métodos para derivatizar enzimas para proporcionar produtos solúveis em água, não imunogénicos e estabilizados in vivo ("Soluble polymers-Enzyme adducts", Enzymes as Drugs, Ed. Holcenberg e Roberts, J. Wiley and Sons, New York, N.Y. (1981)) .

Assim, em determinadas concretizações, podem conjugar-se os péptidos de FKBP-L com polímeros, tais como dextranos, polivinilpirrolidonas, glicopéptidos, polietilenoglicol e poliaminoácidos. Os polipéptidos conjugados resultantes retêm as suas atividades biológicas e solubilidade em água para aplicações parentéricas. Numa concretização, podem acoplar-se os péptidos de FKBP-L a polietilenoglicol ou a polipropilenoglicol com um peso molecular de 500 a 20 000 dalton para proporcionar uma composição de polipéptido solúvel em água não imunogénica e fisiologicamente ativa (consultar e.g., patente U.S. n2 4 179 337 e Garman, A.J. e Kalindjian, S.B., FEBS Lett., 1987, 223, 361-365). O polietilenoglicol ou polipropilenoglicol pode proteger o polipéptido de perda de atividade e a composição pode ser injetada no sistema circulatório de um mamífero sem que ocorra substancialmente qualquer resposta imunogénica. Noutras concretizações, acopla-se o FKBP-L a um oligómero que inclui partes lipofílicas e hidrofílicas (consultar e.g., patentes U.S. n2 5681811, 5438040 e 5359030) .

Os profármacos podem preparar-se por exemplo, preparando primeiramente um reagente de anidrido maleico a partir de MPEG5000 polidisperso seguido de conjugação deste reagente com os polipéptidos aqui divulgados. A reação de aminoácidos com os anidridos maleicos é bem conhecida. A hidrólise da ligação maleilamida para tornar a formar o fármaco contendo amina é auxiliada pela presença do grupo carboxilo livre na vizinhança e a geometria do ataque é estabelecida pela ligação dupla. Os péptidos podem ser libertados (por hidrólise dos profármacos) em condições fisiológicas.

Os polipéptidos podem também ser acoplados a polímeros, tais como PEG polidisperso através de uma ligação degradável, por exemplo, a ligação degradável apresentada (relativa ao interferão -2b peguilado) em Roberts, M.J., et ai., Adv. Drug Delivery Rev., 2002, 54, 459-476.

Os polipéptidos podem também ligar-se a polímeros tais como PEG usando estratégias de eliminação de benzilo (BE) 1,6 ou 1,4 (consultar, por exemplo, Lee, S., et ai., Biocon jugate Chem., (2001), 12, 163-169; Greenwald, R.B., et ai., patente U.S. n2 6 180 095, 2001; Greenwald, R.B., et ai., J. Med. Chem., 1999, 42, 3657-3667); o uso de lactonização com fecho de trimetilo (TML) (Greenwald, R.B., et ai., J. Med. Chem., 2000, 43, 475-487); o acoplamento de PEG de ácido carboxílico a um ligante de ácido carboxílico terminado em hidroxilo (Roberts, M.J., J. Pharm. Sei., 1998, 87(11), 1440-1445) e profármacos de PEG envolvendo famílias de feniléteres de MPEG e benzamidas de MPEG ligadas a um fármaco contendo amina através de um arilearbamato (Roberts, M.J., et al., Adv. Drug Delivery Rev., 2002, 54, 459-476), incluindo uma estrutura de profármaco envolvendo uma relação meta entre o carbamato e a amida ou éter de PEG (patente U.S. n2 6413507 de Bently, et al.); e profármacos envolvendo um mecanismo de redução por oposição a um mecanismo de hidrólise (Zalipsky, S., et al. , Bioconjugate Chem., 1999, 10 (5), 703-707) .

Os polipéptidos de FKBP-L da presente invenção têm grupos amino, amido, hidroxilo e/ou carboxilico livres e estes grupos funcionais podem ser usados para converter os péptidos em profármacos. Os profármacos incluem compostos em que um resíduo de aminoácido ou uma cadeia de polipéptido de dois ou mais (e.g., dois, três ou quatro) resíduos de aminoácidos estão ligados covalentemente através de ligações peptídicas a grupos amino, amido, hidroxilo ou de ácido carboxilico livres de vários polímeros, por exemplo, polialquilenoglicóis tal como polietilenoglicol.

Os profármacos também incluem compostos em que PEG, carbonatos, carbamatos, amidas e ésteres alquílicos estão ligados covalentemente aos péptidos anteriores através dos ácidos carboxílicos do terminal C. Por exemplo, o péptido 1 tal como aqui usado é um péptido de FKBP-L com grupos PEG no terminal C. Assim, concretizações da presente invenção compreendem adição de PEG específica do local.

Podem usar-se inibidores de enzimas para abrandar a velocidade de degradação de proteínas e péptidos no trato gastrointestinal. Ou, o pH no trato digestivo pode ser manipulado para inativar enzimas digestivas locais. Ou, podem usar-se facilitadores de permeação para melhorar a absorção de péptidos através do aumento dos seus transportes paracelular e transcelular. Ou, podem usar-se nanopartículas como transportadores particulados para facilitar absorção intacta pelo epitélio intestinal, especialmente, placas de Peyer e para aumentar a resistência à degradação enzimática. Noutras concretizações, podem usar-se emulsões líquidas para proteger o fármaco de degradação química e enzimática no lúmen intestinal ou podem usar-se formulações de micelas para fármacos fracamente solúveis em água.

Assim, em concretizações alternativas, podem proporcionar-se os polipéptidos numa cápsula ou comprimido adequados com um revestimento entérico de modo a que o péptido não seja libertado no estômago. Alternativa ou adicionalmente, pode proporcionar-se o polipéptido como um profármaco, tal como os profármacos descritos anteriormente. Numa concretização, os polipéptidos estão presentes nestes dispositivos de entrega de fármacos como profármacos.

Os profármacos compreendendo os polipéptidos da invenção ou profármacos a partir dos quais se libertam ou se conseguem libertar os péptidos da invenção (incluindo análogos e fragmentos) são considerados análogos da invenção. 0 uso de péptidos ou profármacos de péptidos marcados isotopicamente está também abrangido pela invenção. Tais péptidos ou profármacos de péptidos são idênticos aos péptidos ou profármacos de péptidos da invenção, exceto no facto de um ou mais átomos serem substituídos por um átomo com uma massa atómica ou número de massa diferente da massa atómica ou número de massa habitualmente encontrados na natureza. Os exemplos de isótopos que podem ser incorporados nos compostos da invenção incluem isótopos de hidrogénio, carbono, azoto, oxigénio, fósforo, enxofre, flúor, iodo e cloro, tais como 2H, 3H, 13C, 14C, 15N, 180, 170, 125I e 35S, respetivamente. Os polipéptidos da presente invenção, seus profármacos e/ou os profármacos que contêm os isótopos anteriormente mencionados e/ou outros isótopos de outros átomos estão abrangidos pelo âmbito desta invenção. Determinados compostos marcados isotopicamente da presente invenção, por exemplo aqueles nos quais se incorporam isótopos radioativos tais como 3H e 14C, são úteis em ensaios de distribuição de tecidos de fármacos e/ou substratos. Os isótopos tritiados, i.e., 3H e os isótopos de carbono 14, i.e., 14C, são particularmente preferidos devido à sua facilidade de preparação e deteção. Além disso, a substituição por isótopos mais pesados tais como deutério, i.e., 2H, pode proporcionar determinadas vantagens terapêuticas resultantes de maior estabilidade metabólica, por exemplo aumento da semivida in vivo ou requisitos de menores dosagens e portanto, podem ser preferidos em algumas circunstâncias. Os péptidos ou seus profármacos marcados isotopicamente podem ser geralmente preparados efetuando-se procedimentos bem conhecidos, incluindo substituir um reagente marcado isotopicamente facilmente disponível por um reagente não marcado isotopicamente, e.g., um aminoácido marcado. Ácidos nucleicos

Os péptidos para uso na presente invenção podem ser produzidos por uso de um ácido nucleico num sistema de expressão. Por exemplo, num aspeto, os ácidos nucleicos que podem ser usados na invenção incluem qualquer polinucleótido isolado que codifique para os polipéptidos da invenção. Numa concretização preferida, o polinucleótido compreende qualquer uma das sequências de ácidos nucleicos tal como apresentadas em SEQ ID NOs: 30-39 (figura 2). As sequências que codificam para fragmentos de FKBP-L adicionais, e.g., SEQ ID NOs: 10-28, podem ser derivadas da sequência de ácidos nucleicos completa e incluem sequências de ácidos nucleicos degeneradas, tal como é conhecido na especialidade. Os exemplos 1, 2 e 17 proporcionam descrições de vetores que podem ser usados para expressar polipéptidos de FKBP-L da presente invenção.

As moléculas de ácido nucleico que codificam para os polipéptidos de FKBP-L para uso na presente invenção podem compreender ADN ou ARN. As construções de ácido nucleico podem ser produzidas de forma recombinante, sintética ou por quaisquer meios disponíveis aos peritos na especialidade, incluindo clonagem usando técnicas padrão. A molécula de ácido nucleico pode ser inserida em qualquer vetor apropriado. Um vetor compreendendo um ácido nucleico da invenção constitui um aspeto adicional da presente invenção. Numa concretização, o vetor é um vetor de expressão e o ácido nucleico está ligado operacionalmente a uma sequência de controlo que é capaz de proporcionar expressão do ácido nucleico numa célula hospedeira. Podem usar-se vários vetores. Por exemplo, os vetores adequados podem incluir vírus (e. g. vírus vaccinia, adenovirus, etc.), baculovírus); vetores de levedura, fago, cromossomas, cromossomas artificiais, plasmídeos, ADN de cosmídeos e lipossomas, poliplexos ou células (e.g. células estaminais mesenquimais, macrófagos).

Os vetores podem ser usados para introduzir os ácidos nucleicos da invenção numa célula hospedeira. Pode usar-se uma grande variedade de células hospedeiras para expressão do ácido nucleico da invenção. As células hospedeiras adequadas para uso na invenção podem ser procarióticas ou eucarióticas. Estas incluem bactérias, e.g. E. coli, levedura, células de inseto e células de mamífero. As linhas celulares de mamífero que podem ser usadas incluem células de ovário de hamster chinês (CHO), células de rim de hamster bebé, células de melanoma de ratinho NSO, linhas celulares de macaco e humanas e seus derivados e muitas outras, não se lhes limitando.

Pode usar-se uma estirpe de célula hospedeira que modula a expressão, modifica e/ou processa especificamente o produto génico. Tal processamento pode envolver glicosilação, ubiquitinação, formação de ligações dissulfureto e modificações pós-tradução de um modo geral.

Para detalhes adicionais relacionados com técnicas conhecidas e protocolos para manipulação de ácido nucleico, por exemplo, na preparação de construções de ácido nucleico, mutagénese, sequenciação, introdução de ADN em células e expressão génica e análise de proteínas, consultar, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology, 2a ed., Ausubel et al. ed., John Wiley & Sons, 1992 e Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 3a edição Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2000.

Composições farmacêuticas A invenção proporciona adicionalmente composições farmacêuticas compreendendo um polipéptido de FKBP-L (ou ácido nucleico que codifica um polipéptido de FKBP-L). As composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção e para uso de acordo com a presente invenção podem compreender, além do ingrediente ativo, um excipiente, transportador, tampão, estabilizante ou outros materiais farmaceuticamente aceitáveis e bem conhecidos dos peritos na especialidade. Tais materiais não devem ser tóxicos e não devem interferir com a eficácia dos ingredientes ativos. A natureza exata do transportador ou outro material dependerá da via de administração, que pode ser, por exemplo, oral, intravenosa ou tópica. A formulação pode ser um liquido, por exemplo, uma solução fisiológica de sal contendo um tampão diferente de fosfato a pH 6,8-7,6 ou um pó liofilizado.

Dose

As composições são preferentemente administradas a um indivíduo numa "quantidade terapeuticamente eficaz", sendo tal suficiente para apresentar benefícios ao indivíduo. A quantidade realmente administrada e a velocidade e distribuição temporal da administração, dependerá da natureza e gravidade do que se está a tratar. A prescrição de tratamento, e.g. decisões sobre a dosagem etc., é em última análise da responsabilidade e segue o critério dos médicos de família e de outros médicos e tem tipicamente em consideração a doença a tratar, a situação de cada doente individual, o local de entrega, o método de administração e outros fatores conhecidos dos médicos.

Em concretizações alternativas, uma gama de dose do 24 mero de FKBPL seria de 30 mg/kg/dia a 0,00003 mg/kg/dia ou 3 mg/kg/dia a 0,0003 mg/kg/dia, a 0,3 mg/kg/dia, a 0,03 mg/kg/dia. Estas doses são equivalentes a de 10~5 M a ICO12 M ou de ICO6 M a ICO11 M ou ICO7 M - ICO10 M in vitro, respetivamente.

Administração

A. Péptidos de FKBP-L

Os polipéptidos da presente invenção e para uso na presente invenção podem ser administrados sozinhos mas serão preferentemente administrados como uma composição farmacêutica, que compreenderá geralmente um excipiente, diluente ou transportador farmacêutico adequado selecionado dependendo da via de administração pretendida.

Os polipéptidos podem ser administrados a um doente que necessite de tratamento através de qualquer via adequada. A dose exata dependerá de um número de fatores, incluindo a natureza exata do péptido.

Algumas vias de administração adequadas incluem administração oral, retal, nasal, tópica (incluindo bucal e sublingual), subcutânea, vaginal ou parentérica (incluindo subcutânea, intramuscular, intravenosa, intradérmica, intratecal e epidural), não se lhes limitando.

Para injeção intravenosa ou injeção no local do problema, o ingrediente ativo estará na forma de uma solução aquosa parentericamente aceitável que está isenta de pirógenos e tem pH, isotonicidade e estabilidade adequadas. Os peritos na especialidade são perfeitamente capazes de preparar soluções adequadas usando, por exemplo, veículos isotónicos tais como injeção de cloreto de sódio, injeção de Ringer, injeção de Ringer lactato. Podem incluir-se conservantes, estabilizadores, tampões, antioxidantes e/ou outros aditivos, tal como necessário.

As composições farmacêuticas para administração oral podem estar na forma de comprimidos, cápsulas, pós ou líquidos. Um comprimido pode compreender um transportador sólido tal como gelatina ou um adjuvante. As composições farmacêuticas líquidas compreendem geralmente um transportador líquido tal como água, vaselina, óleos animais ou vegetais, óleo mineral ou óleo sintético. Podem incluir-se solução de soro fisiológico, dextrose ou outra solução de sacarídeo ou glicóis tais como etilenoglicol, propilenoglicol ou polietilenoglicol. A composição pode também ser administrada através de microesferas, lipossomas, outros sistemas de entrega de micropartícuias ou formulações de libertação controlada colocadas em determinados tecidos incluindo sangue. Os exemplos adequados de transportadores de libertação controlada incluem matrizes de polímero semipermeáveis na forma de artigos partilhados, e.g. supositórios ou microcápsulas. As matrizes de libertação controlada implantáveis ou em microcápsulas incluem polilactídeos (patente U.S. n2 3 773 919; EP-A-0058481) copolímeros de ácido L-glutâmico e gama etil-L-glutamato (Sidman et ai, Biopolymers 22(1): 547-556, 1985), poli(2-hidroxietilmetacrilato) ou etilenovinilacetato (Langer et ai, J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277, 1981 e Langer, Chem. Tech. 12:98-105, 1982) . Preparam-se lipossomas contendo os polipéptidos por métodos bem conhecidos: DE 3 218 121A; Epstein et ai, PNAS USA, 82: 3688-3692, 1985; Hwang et ai, PNAS USA, 77: 4030-4034, 1980; EP-A-0052522; E-A-0036676; EP-A-0088046; EP-A-0143949; EP-A-0142541;JP-A-83-11808; patentes US n2 4 485 045 e 4 544 545. Normalmente, os lipossomas são do tipo unilamelar pequenos (cerca de 200-800 angstrom) nos quais o teor em líquido é superior a cerca de 30 de percentagem molar em colesterol, sendo a proporção selecionada ajustada para a velocidade ótima de libertação de polipéptido.

Encontram-se exemplos das técnicas e protocolos mencionados anteriormente e outras técnicas e protocolos que podem ser usados de acordo com a invenção em Remington'' s Pharmaceutical Sciences, 16a edição, Oslo, A. (ed), 1980.

De igual modo, podem usar-se terapias dirigidas ao alvo para entregar o agente ativo e.g. polipéptido mais especificamente, e.g. a um tecido neoplásico ou tecido de retina, pelo uso de sistemas de direção ao alvo tais como anticorpo ou ligandos específicos de células.

Noutras concretizações, podem tratar-se péptidos recombinantes purificados ou sintéticos com agentes para ligar partes à proteína que podem facilitar reticulação. Estas partes podem ser agentes de reticulação fotoativáveis tais como benzofenona ou agentes de reticulação química tais como maleimida ou ésteres ativados. Assim por exemplo, é possível fazer reagir resíduos de cisteína de FKBPL com derivados de maleimida de benzofenona ou derivados de maleimida de fenilazida para reticulação fotoativável ou com agentes de reticulação heterobifuncionais contendo maleimida e um éster ativado, por exemplo. Tal como é conhecido na especialidade, há uma variedade de agentes de reticulação heterobifuncionais e homobifuncionais que podem ser ligados a FKBPL e seguidamente usados para reticular com outras biomoléculas através de reações de formação de amidas, tioéteres, hidrazona, oxima etc. Numa concretização, é possível introduzir estes agentes de reticulação em péptidos sintéticos e de uma forma específica do local usando procedimentos de síntese química total. Alternativamente, podem introduzir-se grupos fotoativáveis especificamente no terminal C ou podem introduzir-se agentes de reticulação em FKBPL recombinante de uma forma especifica usando abordagens de ligação de proteína. O péptido de FKBP-L pode também ser administrado com agentes terapêuticos adicionais tal como descrito aqui em maior detalhe.

B. Ácidos nucleicos que codificam para FKBP-L

Numa concretização, insere-se a sequência de codificação de um polipéptido de FKBP-L ou um ácido nucleico num vetor de expressão. Pode então ligar-se à sequência de ADNc, uma sequência de regulação compreendendo um promotor que é operacional na célula hospedeira de interesse usando técnicas moleculares. Podem também usar-se outras sequências de regulação, tal como uma ou mais sequências facilitadoras, um intrão com locais de dador e de aceitador de splicing funcionais, uma sequência de sinalização para dirigir a excreção do polipéptido recombinante, uma sequência de poliadenilação, outras sequências de terminação de transcrição e uma sequência homóloga ao genoma da célula hospedeira. Podem adicionar-se outras sequências ao vetor, tal como uma origem de replicação, assim como se pode otimizar a expressão do produto pretendido. De igual modo, pode incluir-se um marcador selecionável no vetor para seleção da sua presença nas células hospedeiras transformadas.

As sequências de regulação podem ser derivadas de várias origens. Por exemplo, uma ou mais destas podem ser normalmente associadas com a sequência de codificação ou podem ser derivadas ou homólogas de sistemas de regulação presentes na célula hospedeira de interesse. Os vários componentes do vetor de expressão podem ser ligados conjuntamente diretamente ou através de ligantes que constituem locais de reconhecimento por enzimas de restrição tal como é conhecido na especialidade.

Qualquer promotor que permitiria a expressão do ácido nucleico que codifica o polipéptido de FKBP-L pode ser usado na presente invenção. Por exemplo, as sequências de promotor de mamífero que se podem usar são aquelas de vírus de mamíferos que são altamente expressas e que têm uma vasta gama de hospedeiros. 0 promotor pode ser um promotor que é expresso constitutivamente na maioria das células de mamífero. Os exemplos de elementos adequados que tornam possível a expressão constitutiva em eucariotas são promotores que são reconhecidos pela ARN polimerase III ou promotores víricos, facilitador de CMV, promotor de CMV, promotor de SV40 ou promotores de LTR, e.g. de MMTV (vírus de tumor de mama de ratinho (e.g., Lee et al. , 1981, Nature, 214, 228-232) e outras sequências de promotores e ativadores víricos, derivados de, por exemplo, HBV, HCV, HSV, HPV, EBV, HTLV ou VIH. Outros exemplos de elementos que tornam possível a expressão regulada em eucariotas são o operador de tetraciclina em combinação com um repressor correspondente (Gossen M., et al., 1994, Curr. Opin. Biotechnol., 5, 516-20). Numa concretização, a expressão da sequência de FKBP-L pode ocorrer sob o controlo de promotores específicos dos tecidos.

Alternativamente, o promotor pode ser um promotor que é ligado num ponto temporal específico do ciclo celular ou da fase de desenvolvimento. Por exemplo, as construções podem compreender elementos de regulação que tornam possível expressão específica de tecido em eucariotas, tal como sequências promotoras ou ativadoras de promotores ou facilitadores desses genes que codificam para proteínas que são apenas expressas em determinados tipos de células. Os exemplos de elementos de regulação que tornam possível expressão específica de ciclo celular em eucariotas são promotores dos seguintes genes: cdc25A, cdc25B, cdc25C, ciclina A, ciclina E, cdc2, E2F-1 até E2F-5, B-myb ou DHFR (consultar e.g., patente U.S. n2 6 856 185; patente U.S. n2 6 903 078; e Zwicker J. e Muller R., 1997, Trends Genet., 13, 3-6) . O uso de promotores regulados pelo ciclo celular pode ser usado quando a expressão dos polipéptidos ou ácidos nucleicos usados de acordo com a invenção deve ser restringida às células em proliferação. Outros exemplos incluem promotores controlados por hipoxia, radiação, calor ou semelhantes.

Noutra concretização, pode combinar-se um elemento facilitador com uma sequência de promotor. Tais facilitadores podem não apenas amplificar, mas também regular a expressão do gene de interesse. Os elementos facilitadores adequados para uso nos sistemas de expressão de mamífero são, por exemplo, os derivados de vírus que têm uma vasta gama de hospedeiros, tal como o facilitador de gene precoce de SV40, os facilitadores/promotores derivados da LTR do vírus do sarcoma de Rous e de citomegalovírus humano. Adicionalmente, outros facilitadores adequados incluem aqueles que podem ser incorporados em sequências de promotor que se tornarão ativas apenas na presença de um indutor, tal como uma hormona, um ião metálico ou um substrato de enzima, tal como é conhecido na especialidade.

Noutra concretização da presente invenção, pode colocar-se uma sequência de terminação de transcrição a 3' do codão de paragem de tradução da sequência de codificação do gene de interesse. Assim, a sequência de terminação, conjuntamente com o promotor, flanquearia a sequência de codificação. 0 vetor de expressão pode também conter uma origem de replicação de modo a que o vetor se possa manter como um replicão, capaz de replicação autónoma e manutenção estável num hospedeiro. Tal origem de replicação inclui aquelas que permitem que um vetor de expressão seja reproduzido com um número de cópias elevado na presença das proteínas apropriadas no interior das células, por exemplo, ο 2μ e sequências de replicação autónoma que são eficazes em levedura e a origem de replicação do antigénio T vital de SV40, que é eficaz em células COS-7. Os sistemas de replicação de mamífero podem incluir aqueles que derivam de vírus animais que necessitam de fatores que atuam em trans para se replicar. Por exemplo, pode usar-se o sistema de replicação dos papovavírus, tal como SV40, podem usar-se os vírus de polioma que se replicam num número de cópias extremamente elevado na presença do antigénio T vital apropriado ou podem usar-se aqueles derivados de vírus do papiloma bovino ou vírus de Epstein-Barr.

Em alguns casos o vetor de expressão pode ter mais do que um sistema de replicação, permitindo assim que este se mantenha, por exemplo, em células de mamífero para expressão e num hospedeiro procariótico para clonagem e amplificação (consultar e.g., patente U.S. n2 5 677 278) .

Numa concretização, o vetor de expressão pode ser concebido para se integrar no genoma da célula hospedeira como um vetor de integração. 0 vetor de integração aqui pode conter pelo menos uma sequência de polinucleótidos que é homóloga ao genoma da célula hospedeira que permite a integração do vetor. Por exemplo, numa concretização, podem usar-se sequências de inserção de bacteriófagos ou de transposão.

Em determinadas concretizações da presente invenção, podem incluir-se um ou mais marcadores selecionáveis no vetor de expressão para permitir a seleção de células hospedeiras que foram transformadas. Os marcadores selecionáveis que podem ser expressos numa célula hospedeira incluem genes que podem tornar a célula hospedeira resistente a fármacos tais como tunicamicina, G418, ampicilina, cloranfenicol, eritromicina, canamicina (neomicina) e tetraciclina. Podem usar-se também marcadores selecionáveis que incluem genes biossintéticos, tais como aqueles das vias biossintéticas de histidina, triptofano e leucina, tais como ade2, his4, leu2, trpl ou que proporcionam às células hospedeiras a capacidade de crescer na presença de compostos tóxicos, tais como um metal.

Podem usar-se vários métodos para transferir um polinucleótido que codifica para polipéptido de FKBP-L e/ou um ácido nucleico que codifica ADN antissentido de FKBP-L ou ARNsi de FKBP-L para células hospedeiras. Assim, as formulações da presente invenção podem compreender componentes especificas que facilitam a transferência de ácidos nucleicos para células.

Por exemplo, para permitir introdução de ácidos nucleicos numa célula eucariótica e/ou procariótica por transfeção, transformação ou infeção, o ácido nucleico pode estar presente como um plasmideo, como parte de um vetor virico ou não virico. Os vetores viricos adequados podem incluir baculovirus, virus de vaccinia, lentivirus (consultar e.g., Siprashvili e Khavari, Mol. Ther., 2004, 9, 93-100), adenovirus, virus adenoassociados e virus de herpes. Os exemplos de vetores com atividade de terapia génica são vetores viricos, por exemplo vetores de adenovirus ou vetores retroviricos (Lindemann et al., 1997, Mol. Med., 3, 466-76; Springer et al., 1998, Mol. Cell., 2, 549-58). De igual modo, os vetores de expressão eucarióticos são adequados na forma isolada para uso em terapia génica como ADN nu que pode penetrar em determinadas células (Hengge et al., 1996, J. Clin. Invest., 97, 2911-6; Yu et al., 1999, J. Invest. Dermatol., 112, 370-5) . Pode obter-se outra forma de vetores de terapia génica por aplicação do ácido nucleico descrito anteriormente a partículas de ouro e disparo destas para o tecido, preferentemente para a pele ou células com o auxílio de uma denominada pistola de genes (Wang et al., 1999, J. Invest.

Dermatol., 112, 775-81, Tuting et al., 1998, J. Invest.

Dermatol., Ill, 183-8) .

Em concretizações alternativas, podem usar-se lipossomas para facilitar transferência de um polinucleótido que codifica FKBP-L para células. Os lipossomas são vesículas pequenas produzidas artificialmente com uma membrana de bicamada lipídica constituída por fosfolípido (Jeschke, M.G. et al., Gene Ther., 12, 1718-24 (2005); patente U.S. n2 6 576 618). Podem incluir-se ácidos nucleicos, proteínas e outros materiais biológicos em lipossomas para entrega a células de mamífero através de fusão com a membrana plasmática das células. Os lipossomas podem ser um sistema de entrega interessante porque são não víricos, estáveis e podem interagir com a membrana celular.

Os lipossomas podem ser constituídos por lípidos catiónicos, aniónicos ou neutros e suas misturas (Luo, D. e Saltzman, W.M., Nat. Biotech., 18, 33-37 (1999)). Para transferência de ADN, os lípidos podem também ser modificados quimicamente para incorporar grupos químicos para facilitar condensação ou libertação de ADN. Os lípidos catiónicos, tais como detergentes de amónio quaternário, derivados catiónicos de colesterol e diacilglicerol e derivados de lípidos de poliaminas, podem ser preferidos para transfeção celular porque diminuem a carga negativa total do ADN e facilitam a sua interação com membranas celulares (Nishikawa, M. e Huang, L., Hum. Gene Ther., 12, 861-70 (2001)). Podem adicionar-se lípidos neutros, tais como dioleoilfosfitiletanolamina (DOPE), dilaurato de glicerol, polioxietileno-10-esteariléter (POE-10) e colesterol como ' lípidos auxiliares' em complexos de lípido catiónicos e ADN para facilitar a libertação do ADN do endossoma após absorção endocítica do complexo. Podem também usar-se auxiliares que aumentam a transferência de ADN, tal como polímeros ou proteínas que estão ligados ao ADN ou moléculas sintéticas de péptido-ADN que tornam possível transportar ADN para o núcleo de uma célula de forma mais eficaz (consultar e.g., Niidome, T. e Huang, L., Gene Ther., 9, 1647-52 (2002)).

Assim, podem usar-se polímeros catiónicos, tal como polilisina ou protamina, em complexos lípido-ADN uma vez que causam condensação compacta de ADN, que evita agregação de complexos e degradação por nuclease. Por exemplo, misturar lipossomas de 1,2-dioleoil-3-(trimetilamónio)propano) (DOTAP) com sulfato de protamina antes de misturar com ADN plasmídico produziu pequenas partículas de 135 nm que eram estáveis e resultaram num nível elevado de expressão génica em vários tecidos (e.g., pulmão, fígado, coração) (Li, S. et al., Gene Ther., 5, 930-37 (1998)). A inclusão de colesterol como um lípido auxiliar pode aumentar a eficácia de transfeção de complexos lipossoma-péptido-ADN. De igual modo, podem pré-compactar-se os ADN dos genes de luciferase ou de -galactosidase com péptidos curtos derivados de histona humana ou protamina antes da adição de um lípido catiónico (Lipofectamina RPR 115335 ou RPR 120535) ou polímero (polietilenimina) para obter eficácia de transfeção melhorada, mesmo na presença de soro (consultar e.g., Schwartz, B. et al., Gene Ther., 6, 282-92 (1999)).

Tal como é conhecido na especialidade, os lipossomas podem ser produzidos por aquecimento de lípidos para formar uma fase de lípido (Wu, H. et al., Int. J. Pharmaceut., 221, 23-24 (2001)) . Pode então misturar-se uma fase aquosa contendo água, sais ou tampão com a fase de lípido por passagem da mistura para trás e para a frente entre seringas em condições de arrefecimento, seguido de sonicação até se atingir um tamanho final de lipossoma entre 100 e 140 nm. O ADN ou proteína a incluir no lipossoma é então adicionado (como uma solução) por mistura por inversão. A escolha de lípidos usados, a sua razão de concentrações, a concentração de ADN usada na formação dos lipossomas e a quantidade de lipossomas adicionados necessitará geralmente de determinação empírica para otimização. Podem adicionar-se ao ADN auxiliares para facilitar a transferência de ADN, tal como péptidos, antes da adição à mistura de lipossoma mas o auxiliar de ADN deve manter uma solubilidade aquosa suficientemente elevada para ser adequadamente encapsulado no interior da fase lipídica externa do lipossoma.

Alternativamente, podem preparar-se vesículas unilamelares pequenas por tratamento com ultrassons de uma suspensão de lipossomas constituída por lípidos catiónicos, tal como Cytofectin GS 2888, misturada com brometo de 1,2- dioleiloxipropil-3-trimetilamónio (DOTMA) ou brometo de dioleoilfosfatidiletanolamina (DPOE). Após mistura por inversão, o ADN ou proteína podem estar ligados ionicamente à superfície dos lipossomas numa razão que mantém uma carga global positiva do complexo enquanto apresenta ADN complexado com 100% dos lipossomas. De igual modo, podem usar-se detergentes de tiol catiónicos dimerizáveis para preparar lipossomas para entrega de ADN (consultar e.g., Dauty, E. et al., J. Am. Chem. Soc.r 123, 9227-34 (2001)) . Após oxidação, os grupos tiol no lipido podem converter-se a dissulfuretos e causar a formação do complexo ADN-lípido para formar uma partícula nanométrica estável que se pode ligar eletrostaticamente a proteoglicanos de sulfato de heparina aniónicos da superfície celular para absorção celular. Uma vez dentro da célula, o ambiente de redução proporcionado pela glutationa intracelular reduz os dissulfuretos de volta a tióis e liberta o ADN.

Anticorpos terapêuticos

Descreve-se aqui também um uso terapêutico de um anticorpo com especificidade imunológica para FKBP-L (ou fragmentos ou seus equivalentes funcionais, tal como discutido seguidamente) para regular negativamente especificamente a atividade de FKBP-L in vivo. Tais anticorpos são úteis no tratamento de condições de doença que beneficiam de regulação negativa especifica da atividade de FKBP-L, em particular doenças que beneficiam de estimulação/regulação positiva de angiogénese. Também se descreve aqui o uso de um anticorpo com especificidade imunológica para FKBP-L (ou um fragmento ou seu equivalente funcional) para promover angiogénese e também o uso de um anticorpo com especificidade imunológica para FKBP-L (ou um fragmento ou seu equivalente funcional) para promover cicatrização de feridas. A expressão "anticorpo" tal como aqui usada abrange anticorpos de ocorrência natural purificados ou isolados de qualquer isotipo com a especificidade imunológica necessária, assim como anticorpos produzidos sinteticamente ou seus análogos estruturais. As preparações de anticorpo podem ser policlonais ou monoclonais. A referência a tal "anticorpo" tal como descrito anteriormente inclui não apenas moléculas de anticorpo completas, mas também os seus fragmentos que retêm uma capacidade de ligação de antigénio (i.e. FKBP-L) substancial. Não é necessário que quaisquer funções de efetor sejam mantidas em tais fragmentos, apesar de poderem ser incluídas. Os fragmentos de anticorpo adequados que podem ser usados incluem, entre outros, fragmentos F(ab' j, scAb, Fv, scFv e nanoanticorpos etc. Os fragmentos de anticorpo que contêm o idiotipo da molécula podem ser gerados por técnicas conhecidas, por exemplo, tais fragmentos incluem o fragmento F(ab' )2, não se lhe limitando, que pode ser produzido por digestão com pepsina da molécula de anticorpo; os fragmentos de Fab' que podem ser geradas por redução de pontes dissulfureto dos fragmentos F(ab' )2 e os fragmentos Fab que podem ser gerados por tratamento da molécula de anticorpo com papaina e um agente redutor. Podem preparar-se outros fragmentos de anticorpo com a atividade de ligação de antigénio necessária por técnicas de expressão recombinante conhecidas geralmente na especialidade.

Podem produzir-se por engenharia recombinante anticorpos monoclonais humanizados quiméricos e completamente humanizados. Por adição da cadeia constante humana a fragmentos F (ab' )2 é possível criar um anticorpo monoclonal humanizado que é útil em aplicações de imunoterapia nas quais os doentes que produzem anticorpos contra Ig de ratinho estariam de outro modo em desvantagem. Breedveld F.C. Therapeutic Monoclonal Antibodies. Lancet 26 de fevereiro de 2000; 335, P735-40. Podem preparar- se vantajosamente anticorpos monoclonais terapêuticos recombinantes por expressão recombinante em células hospedeiras de mamífero (e.g. células CHO).

Os anticorpos monoclonais com especificidade imunológica para FKBP-L podem ser preparados por imunização de um animal hospedeiro adequado (e.g. ratinho ou coelho) com um antigénio de provocação adequado (e.g. FKBP-L completo ou um seu epítopo).

Usos terapêuticos

Os polipéptidos e ácidos nucleicos da invenção e para uso na invenção podem ser usados no controlo e/ou tratamento de uma vasta variedade de condições clínicas em mamíferos, incluindo humanos. Os polipéptidos e métodos da invenção podem ser usados no tratamento de uma condição ou doença para a qual os agentes antiangiogénicos podem ser terapeuticamente úteis.

Tal como aqui utilizado, "tratamento" ou "terapia" inclui qualquer regímen que possa beneficiar um humano ou animal não humano. O tratamento pode ser respeitante a uma condição existente ou pode ser profilático (tratamento preventivo). 0 tratamento pode incluir efeitos curativos, de alivio ou profiláticos.

Podem inibir-se migração celular, angiogénese e indicações relacionadas (e.g., crescimento de tumor e/ou metástase) por administração de uma quantidade eficaz de um polipéptido de FKBP-L ou de um ácido nucleico que codifica o referido péptido a um doente com necessidade de tal tratamento. Os usos podem ser usados para tratar tumores, várias doenças autoimunes, doenças hereditárias e doenças oculares.

Os usos terapêuticas aqui descritos envolvem tipicamente administrar uma quantidade eficaz dos péptidos, ácidos nucleicos ou composições incluindo o polipéptido ou ácido nucleico da invenção a um doente. A dose exata a ser administrada variará de acordo com o uso das composições e da idade, sexo e condição do doente e pode ser facilmente determinada pelo médico assistente. As composições podem ser administradas como uma dose única ou de forma continua ao longo de um período de tempo. As doses podem ser repetidas tal como adequado.

Descreve-se aqui o tratamento de doenças mediadas por angiogénese incluindo hemangioma, tumores sólidos, leucemia, metástase de linfoma, telangiectasia, psoríase, endometriose, arteriosclerose, escleroderma, granuloma piogénico, angiogénese do miocárdio, doença de Crohn, neovascularização da placa, colaterais coronárias, colaterais cerebrais, malformações arteriovenosas, angiogénese de membro isquémico, doenças da córnea, rubeose, glaucoma neovascular, retinopatia diabética, fibroplasia retrolental, artrite, neovascularização diabética, degeneração macular, úlcera péptica, doenças relacionadas com Helicobacter, fraturas, queloides e vasculogénese. Descrevem-se mais detalhadamente seguidamente as doenças específicas que podem ser tratadas e compostos e composições úteis nestes métodos.

Carcinomas/Tumores

Os tumores que podem ser tratados incluem aqueles tumores cujo crescimento é promovido por angiogénese. Numa concretização tais tumores podem expressar CD44. Os carcinomas que podem ser tratados usando os compostos, composições e métodos da invenção podem incluir carcinoma colorretal, carcinoma gástrico, do tipo de anel de sinete, carcinoma esofágico, de tipo intestinal, do tipo mucinoso, carcinoma pancreático, carcinoma do pulmão, carcinoma da mama, carcinoma renal, carcinoma da bexiga, carcinoma da próstata, carcinoma dos testículos, carcinoma dos ovários, carcinoma do endométrio, carcinoma da tiroide, carcinoma do fígado, carcinoma da laringe, mesotelioma, carcinomas neuroendócrinos, tumores neuroectodérmicos, melanoma, gliomas, neuroblastomas, sarcomas, leiomiossarcoma, MFII, fibrossarcoma, lipossarcoma, MPNT e condrossarcoma.

Para tratamento de cancro, pode administrar-se FKBP-L com outros agentes quimioterapêuticos e/ou quimiopreventivos conhecidos na especialidade. Tais agentes podem incluir antiangiogénicos, endostatina, angiostatina e inibidores de VEGF, talidomida e outros ou fármacos citotóxicos tais como adriamicina, daunomicina, cis-platina, etoposídeo, taxol, taxotere e alcaloides, tais como vincristina, inibidores de farnesiltransferase e antimetabolitos tal como metotrexato, não se lhes limitando. Em concretizações alternativas, podem usar-se péptidos de FKBP-L ou polinucleótidos que codificam os polipéptidos de FKBP-L com agentes terapêuticos de cancro tal como os seguintes: (a) inibidores de crescimento de cancro incluindo, bortezomib, erlotinib, gefitinib, imatinib e sorafenib, não se lhes limitando; (b) abordagens de terapia génica, e.g., usando construções de ácido nucleico que codificam para gene de supressão de tumor ou ARNsi para oncogenes; (c) vacinas contra cancro; (d) interferão; (e) Aldesleucina; (f) anticorpos monoclonais incluindo 90Y-Ibritumomab tiuxetano, ADEPT, Alemtuzumab, Bevacizumab, Cetuximab, Gemtuzumab, iodol31 tositumomab, Panitumumab, Rituximab, Trastuzumab, não se lhes limitando; (g) fármacos de quimioterapia incluindo Ansacrina, Bleomicina, Bussulfano, Capecitabina, Carboplatina, Carmustina, Clorambucilo, Cisplatina, Cladribina, Crisantaspase, Ciclofosfamida, Citarabina, Dacarbazina, Dactinomicina, Daunorrubicina, Docetaxel, Doxorrubicina, Epirrubicina, Etoposídeo, Fludarabina, Fluorouracilo, Gemcitabina, implantes de Gliadel, Hidroxicarbamida, Idarrubicina, Ifosfamida, Irinotecano, Leucovorina, doxorrubicina em lipossomas, daunorrubicina em lipossomas, Lomustina, Melfalano, Mercaptopurina, Mesna, Metotrexato, Mitomicina, Mitoxantrona, Oxaliplatina, Paclitaxel, Pemetrexed, Pentostatina, Procarbazina, Raltitrexed, Estreptozocina, Tegafururacilo, Temozolomida, Teniposideo, Tiotepa, Tioguanina, Topotecano, Treossulfano, Vinblastina, Vincristina, Vindesina e Vinorrelbina, não se lhes limitando; (h) radioterapia; (i) terapias hormonais incluindo Anastrozole, Bicalutamida, Buserelina, Ciproterona, Dietilestilbestrol, Exemestano, Flutamida, Fulvestrant, Goserelina (mama), Goserelina (próstata), Letrozol, Leuprorrelina, Medroxiprogesterona, acetato de megestrol, Tamoxifeno, Toremifeno e Triptorrelina, não se lhes limitando; (j) terapias de apoio incluindo bisfosfonatos, transfusões de sangue, eritropoietina, hematopoietina, fatores de crescimento, troca de plasma, transfusões de plaquetas e esteroides, não se lhes limitando; e (k) outros tratamentos incluindo terapia de oxigénio hiperbárico, tratamento de hipertermia e terapia fotodinâmica, não se lhes limitando. Podem usar-se tais terapias com tratamento com FKBP-L quer sozinhas quer como terapias complementares.

Doenças oculares mediadas por angiogénese

Descreve-se aqui várias doenças oculares que são mediadas por angiogénese e podem ser tratadas usando os compostos ativos, composições e métodos aqui descritos. Um exemplo de uma doença mediada por angiogénese é a doença neovascular ocular, que se caracteriza por invasão de novos vasos sanguíneos nas estruturas do olho e é a causa mais comum de cegueira. Na degeneração macular relacionada com a idade, os problemas visuais associados são causados por um crescimento para dentro dos capilares coroidais através de defeitos na membrana de Bruch com proliferação de tecido fibrovascular por baixo do epitélio pigmentar da retina. Na forma mais grave de degeneração macular relacionada com a idade (conhecida como ARMD "húmida") ocorre angiogénese anómala sob a retina resultando em perda irreversível da visão. A perda da visão é devida à formação de cicatrizes da retina após sangramento a partir dos novos vasos sanguíneos. Os tratamentos atuais para ARMD "húmida" utilizam terapia baseada em laser para destruir os vasos sanguíneos causadores de problemas. Contudo, este tratamento não é ideal dado que o laser pode provocar cicatrizes permanentes da retina sobreposta e os vasos sanguíneos causadores de problemas muitas vezes tornam a crescer. Uma estratégia de tratamento alternativa para degeneração macular é o uso de agentes antiangiogénese para inibir a formação de novos vasos sanguíneos ou angiogénese que causa a perda de visão mais grave de degeneração macular. 0 dano angiogénico está também associado a retinopatia diabética, retinopatia da prematuridade, rejeição do implante de córnea, glaucoma neovascular e fibroplasia retrolental. Outras doenças associadas a neovascularização da córnea incluem ceratoconjuntivite epidémica, deficiência em vitamina A, queratite atópica, queratite límbica superior, pterígio, síndrome do olho seco, ceratotomia radial, penfigoide e rejeição do implante de córnea, não se lhes limitando. As doenças associadas a neovascularização da retina ou do coroide incluem retinopatia diabética, degeneração macular, miopia presumível, fossetas óticas, descolamento crónico da retina, síndromes de hiperviscosidade, lesão e complicações pós-laser, não se lhes limitando. Outras doenças incluem doenças relacionadas com rubeose (neovascularização do ângulo) e doenças causadas pela proliferação anómala de tecido fibrovascular ou fibroso incluindo todas as formas de vitreorretinopatia proliferativa, não se lhes limitando.

Assim, em determinadas concretizações da invenção, os compostos ativos, composições e métodos da invenção podem ser usados no tratamento de doenças oculares mediadas por angiogénese, por exemplo, degeneração macular.

Inflamação

Descreve-se aqui o uso no tratamento de outras doenças mediadas por angiogénese, tal como inflamação associada a angiogénese incluindo várias formas de artrite tal como artrite reumatoide e osteoartrite. Nestes métodos, o tratamento com combinações dos compostos aqui descritos com outros agentes úteis para tratar as doenças, tal como inibidores de cicloxigenase-2 (COX-2), que são bem conhecidos pelos peritos na especialidade.

Os vasos sanguíneos do revestimento sinovial das articulações podem sofrer angiogénese. As células endoteliais formam novas redes vasculares e libertam fatores e espécies reativas de oxigénio que levam ao crescimento de pannus e à destruição de cartilagem. Pensa-se que estes factores contribuem ativamente para a artrite reumatoide e também para a osteoartrite. A ativação dos condrócitos por fatores relacionados com angiogénese contribui para a destruição das articulações e também promove formação de osso novo. Os usos podem ser usados como intervenção terapêutica para evitar destruição de osso e formação de osso novo.

Pensa-se que a angiogénese está também envolvida em inflamação crónica. Os exemplos de doenças que podem ser tratadas usando os compostos, composições e métodos aqui descritos incluem colite ulcerativa, doença de Crohn, bartonelose e aterosclerose.

Terapias de combinação

No tratamento de uma doença específica usando um polipéptido ou ácido nucleico da invenção, no tratamento de uma doença específica, os péptidos ou ácidos nucleicos podem ser combinados com vários agentes terapêuticos existentes usados para essa doença.

Os polipéptidos de FKBP-L podem também ser usados em combinação com agentes anticancro tais como antiangiogénicos, endostatina, angiostatina e inibidores de VEGF e outros ou fármacos citotóxicos tais como adriamicina, daunomicina, cis-platina, etoposídeo, taxol, taxotere e alcaloides, tais como vincristina, inibidores de farnesil transferase e antimetabolitos tais como metotrexato. Descrevem-se aqui outros agentes anticancro e métodos terapêuticos tal como um inibidor de crescimento de cancro, terapia génica, uma vacina anticancro, interferão, Aldesleucina, um anticorpo monoclonal, um fármaco de quimioterapia, radioterapia, terapia hormonal ou outras terapias de apoio que podem ser usadas com FKBP-L.

Terapêutica de oligonucleótidos antissentido e ARNsi A. ARN antissentido

Os oligonucleótidos antissentido são fragmentos curtos de ADN ou ARN que têm sequências complementares a uma parte do ARNm ou a todo o ARNm. Sendo complementares a um ARNm alvo específico, os oligonucleótidos antissentido ligam-se especificamente a esse ARNm. Sabe-se modificar quimicamente tais moléculas antissentido para facilitar uma ligação forte. Quando ocorre ligação a capacidade do ARNm ser lido pela maquinaria de tradução da célula é inibida e a síntese da proteína que codifica é bloqueada. Ao contrário de um knockout do gene, este inibição necessita da presença contínua da molécula antissentido; assim, é reversível e podem conceber-se inibidores específicos de um gene de interesse com base apenas no conhecimento da sequência génica. Descreve-se aqui uma molécula de ácido nucleico isolada que é antissentido relativamente à cadeia de codificação de um ácido nucleico da invenção. Também se descreve uma molécula de ácido nucleico com uma sequência de nucleótidos que é antissentido relativamente à cadeia de codificação de um ARNm que codifica para o polipéptido da invenção. 0 ácido nucleico antissentido pode ser complementar a uma cadeia de codificação completa ou apenas a uma parte desta, a toda ou a parte da região de codificação de proteína (ou quadro de leitura aberta). Uma molécula de ácido nucleico antissentido pode ser antissentido relativamente a toda ou a parte de uma região que não é de codificação da cadeia de codificação de uma sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido da invenção. As regiões que não são de codificação ("regiões não traduzidas a 5' e a 3' ") são as sequências 5' e 3' que flanqueiam a região de codificação e não são traduzidas para aminoácidos.

Um oligonucleótido antissentido pode ter, por exemplo, cerca de 5, 10, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 nucleótidos ou mais de comprimento. Pode construir-se um ácido nucleico antissentido usando síntese química e reações de ligação enzimática usando procedimentos conhecidos na especialidade.

Por exemplo, um ácido nucleico antissentido (e.g., um oligonucleótido antissentido) pode ser sintetizado quimicamente usando nucleótidos de ocorrência natural ou nucleótidos com diferentes modificações concebidas para aumentar a estabilidade biológicas das moléculas ou para aumentar a estabilidade fisica da cadeia dupla formada entre os ácidos nucleicos antissentido e em sentido, e.g., podem usar-se derivados de fosforotiolato e nucleótidos substituídos com acridina. Os exemplos de nucleótidos modificados que podem ser usados para gerar o ácido nucleico antissentido incluem 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-iodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxi-hidroxilmetil)uracilo, 5-carboxi-metilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, di-hidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metil-guanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3- metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5' -metoxicarboximetiluracilo, 5- metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v) , wibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, metiléster do ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético (v) , 5-metil-2-tiouracilo, 3-(3-amino-3-previsto N-2-carboxiuracilo, (acp3)w e 2,6-diaminopurina. Alternativamente, o ácido nucleico antissentido pode ser produzido biologicamente usando um vetor de expressão no qual se subclonou um ácido nucleico numa orientação antissentido (i.e., o ARN transcrito a partir do ácido nucleico inserido terá uma orientação antissentido relativamente ao ácido nucleico alvo de interesse, descrito adicionalmente na subsecção seguinte). As moléculas de ácido nucleico antissentido podem ser tipicamente administradas a um doente. Alternativamente, poderão ser geradas localmente de modo a que hibridem com ou que se liguem a ARNm celular e/ou ADN genómico que codifica um polipéptido da invenção selecionado para assim inibir expressão, e.g., por inibição de transcrição e/ou tradução. A hibridação pode ser por complementaridade convencional de nucleótidos para formar uma cadeia dupla estável ou por exemplo, no caso de uma molécula de ácido nucleico antissentido que se liga a cadeias duplas de ADN, através de interações específicas no sulco maior da cadeia dupla. Um exemplo de uma via de administração de moléculas de ácido nucleico antissentido inclui a injeção direta num local de tecido. Alternativamente, as moléculas de ácido nucleico antissentido podem ser modificadas para terem como alvo células selecionadas e seguidamente serem administradas sistemicamente. Por exemplo, para administração sistémica, as moléculas antissentido podem ser modificadas de modo a que se liguem especificamente a recetores ou antigénios expressos numa superfície celular selecionada, e.g., por ligação das moléculas de ácido nucleicos antissentido a péptidos ou anticorpos que se ligam a recetores ou antigénios da superfície celular. Para atingir concentrações intracelulares suficientes das moléculas antissentido, preferem-se construções de vetor nas quais a molécula de ácido nucleico antissentido é colocada sob o controlo de um promotor pol II ou pol III forte.

Os oligonucleótidos contendo açúcares naturais (D-ribose e D-2-desoxirribose) e ligações fosfodiéster (PO) são rapidamente degradados por nucleases séricas e intracelulares, o que limita a sua utilidade como agentes terapêuticos eficazes. As estratégias químicas para melhorar a estabilidade às nucleases incluem modificação da parte de açúcar, da parte de base e/ou modificação ou substituição da ligação fosfodiéster internucleótido. Até à data, os análogos mais vastamente estudados são os oligodesoxinucleótidos fosforotiolato (PS) , nos quais um dos átomos de oxigénio que não estão em ponte no esqueleto fosfodiéster é substituído por um enxofre (Eckstein, F. Ann. Rev. Biochem. 1985,54,367). Descreve-se um exemplo de alvo de FKBP-L antissentido em Robson et ai. (Consultar Robson et ai., (1999) Radiation Research 152, 451-461; Robson, T., et ai., (2000) Int. J. Radiat). B. ARNsi

Os ARN interferentes pequenos (ARNsi) são ferramentas poderosas para dirigir a eliminação de expressão génica pós-transcrição em células de mamífero (Elbashir et al.r Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 2001, 411: 494-8).

Os ARNsi compreendem tipicamente uma região específica de alvo em cadeia dupla que corresponde ao gene alvo a ser regulado negativamente (i.e. FKBP-L). Esta região especifica de alvo em cadeia dupla tipicamente tem um comprimento na gama de 19 a 25 pares de bases. Especificamente, em concretizações não limitativas, podem usar-se os ARNsi com uma região especifica de alvo em cadeia dupla de 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 pares de bases correspondentes ao gene alvo a ser regulado negativamente (FKBP-L). A região especifica de alvo tem tipicamente uma sequência 100% complementar a uma parte do gene alvo (FKBP-L). Contudo, considerar-se-á que não é necessária 100% de identidade de sequência para que ocorra inibição funcional de ARN. Verificou-se igualmente que as sequências de ARN com inserções, deleções e mutações pontuais relativamente à sequência alvo eram eficazes para inibição de ARN. A expressão "correspondente a", quando usada em referência a uma correspondência de sequência entre a parte do ARNsi especifica de alvo e a região alvo do gene alvo (FKBP-L), deve ser portanto assim interpretada como não necessitando absolutamente de uma identidade de sequência de 100%. Contudo, a % de identidade de sequência entre o ARN em cadeia dupla e a região alvo será geralmente de pelo menos 90% ou pelo menos 95% ou pelo menos 99%.

Assim, os ARNsi capazes de regular negativamente especificamente a expressão of FKBP-L podem incluir uma parte em cadeia dupla que compreende ou consiste de 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 pares de bases consecutivos da sequência de nucleótidos apresentada em SEQ ID NO:l, SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO:29 ou uma parte em cadeia dupla de 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 bases consecutivas que é pelo menos 90% ou pelo menos 95% ou pelo menos 99% idêntica a uma parte da sequência de nucleótidos apresentada em SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:29 ou que incluem um ou mais nucleótidos não complementares comparativamente com uma parte da sequência de nucleótidos apresentada em SEQ ID NO:l ou SEQ ID NO:2. O ARNsi pode ser concebido para ter como alvo qualquer região adequada do produto de transcrição de ARNm de FKBP-L. Estão disponíveis algoritmos para conceção de ARNsi, baseados essencialmente nas características da sequência primária do ARNsi (e.g., Reynolds A, et al. Nat Biotechnol. Março de 2004; 22(3) :326-30. Epub 1 de fevereiro de 2004). Descreve-se um exemplo de ARNsi que tem como alvo FKBP-L em Jascur et al. 2006, Molecular Cell, 17:237-239. A expressão "regulação negativa da expressão génica" refere-se a uma redução mensurável ou observável da expressão génica ou a uma abolição completa de expressão génica detetável, ao nível do produto de proteína e/ou produto de ARNm obtido do gene alvo (e.g. FKBP-L). A regulação negativa da expressão génica é "específica" quando a regulação negativa do gene alvo (e.g. FKBP-L) ocorre sem efeitos manifestos sobre outros genes.

Os ARNsi podem incluir sequências protuberantes em cadeia simples em uma ou em ambas as extremidades, flanqueando a região específica de alvo em cadeia dupla correspondente a FKBP-L. Numa concretização específica, o ARNsi pode conter nucleótidos protuberantes a 3' , tal como duas timidinas (dTdT) ou duas uridinas (UU) protuberantes a 3' .As TT ou UU protuberantes a 3' podem estar incluídas nos ARNsi se a sequência do gene alvo imediatamente a montante da sequência incluída na parte em cadeia dupla do ARNds for AA. Tal permite que as TT ou UU protuberantes no ARNsi hibridem com o gene alvo. Apesar de poderem estar também incluídas TT ou UU protuberantes a 3' na outra extremidade do ARNsi, não é essencial que a sequência alvo a jusante da sequência incluída na parte em cadeia dupla do ARNsi tenha AA. A parte específica de alvo em cadeia dupla do ARNsi é formada tipicamente a partir de duas cadeias de ARN hibridadas completamente constituídas por ribonucleótidos em ligação fosfodiéster. Contudo, também se consideram ARNsi que são quimeras de ARN/ADN. Estas quimeras incluem, por exemplo, o ARNsi compreendendo um ARN em cadeia dupla com bases de ADN (e.g. dTdT) protuberantes a 3' , tal como discutido anteriormente e também "ARN" em cadeia dupla que são polinucleótidos nos quais uma ou mais das bases de ARN ou ribonucleótidos ou mesmo todos os ribonucleótidos na cadeia total, são substituídos por bases de ADN ou desoxinucleótidos. Noutras concretizações, o esqueleto das cadeias de "ARN" no ARNsi podem ser modificados, por inclusão de nucleobases não naturais e/ou ligações de esqueleto não naturais (consultar por exemplo Soutschek et al. Nature. 11 de novembro de 2004; 432 (7014) : 173-8; Zimmermann TS, et al. Nature 441, 111-4). Como exemplo, podem incluir-se modificações 2-O-metil para estabilizar os ARNsi (tal como descrito por Soutschek et al. ibid.) .

Os ARNsi podem ser preparados de forma conhecida especificamente na especialidade. Por exemplo, podem sintetizar-se ARNsi in vitro usando técnicas químicas ou enzimáticas de síntese de polinucleótidos bem conhecidas na especialidade. Numa abordagem as duas cadeias separadas do ARNsi podem ser sintetizadas separadamente e seguidamente hibridadas para formar cadeias duplas.

Sabe-se que os ARNsi não modificados "exógenos" são eficazes no silenciamento de genes in vivo sem necessidade de reagentes adicionais (Filleur S, et al. Cancer Res 63, 3919-22; Duxbury MS, et al. Oncogene 23, 465-73) . Pode usar-se ARNsi conjuntamente com transportadores ou veículos de entrega tais como atelocolágeno (Nozawa H, et al. Cancer Sei. Outubro de 2006; 97(10) :1115-24; Takeshita F, et al. Proc Natl Acad Sei U S A. 23 de agosto de 2005; 102 (34) : 12177-82. Epub a 9 de agosto de 2005) ou nanopartícuias (Schiffelers RM, et al. Nucleic Acids Res. 1 de novembro de 2004;32 (19) :el49) ou transportadores baseados em lípidos incluindo, por exemplo, emulsões de óleo em água, micelas e lipossomas que promovem a absorção. Os veículos de entrega (e.g. lipossomas e nanopartícuias) podem ser dirigidos a um tecido específico por acoplamento do veículo a um ligando específico tal como anticorpo monoclonal, açúcar, glicolípido ou proteína.

Em vez de serem formados por duas cadeias separadas de ARN e hibridadas conjuntamente, os "ARNsi" podem ter uma estrutura em haste-ansa ou em gancho de cabelo dobradas para trás, em que as sequências hibridadas que formam a parte específica de alvo do ARNsi estão ligadas covalentemente. As sequências hibridadas podem estar presentes numa única cadeia de ARN. Os ARN com esta estrutura são típicos se o ARNds for sintetizado por expressão in vivo ou por transcrição in vitro. A natureza e sequência exatas da "ansa" que liga as duas cadeias de ARN não é geralmente importante exceto em que não deve impedir a capacidade da parte da molécula em cadeia dupla mediar ARNi. Não é necessário que a estrutura em "ansa" seja formada necessariamente por ácido nucleico.

Podem sintetizar-se ARNsi (ou estruturas precursoras que podem ser processadas para produzir ARNsi, por exemplo por ação da enzima endógena "dicer") por expressão intracelular numa célula ou organismo hospedeiros a partir de um vetor de expressão adequado. São conhecidos na especialidade vários sistemas de vetores de expressão não viricos (e.g. plasmídeo) ou viricos para expressão in vivo de ARNsi. De um modo geral, os ARNsi são expressos como hastes com ansa, que podem ser rapidamente processadas no interior da célula para produzir o ARNsi "livre" (consultar revisão de Tuschl, Nature Biotechnology, vol. 20(5), 446-448, 2002) . Os sistemas de vetor para expressão de ARNsi baseiam-se muitas vezes em promotores de Pol III de ARN, uma vez que estes são particularmente adequados para expressão rigorosa de sequências de ARN muito curtas. Descrevem-se sistemas de vetor adequados em, por exemplo, Brummelkamp, T.R. et al. , Science, vol. 296, 550-553, 2002; Lee, N.S. et al., Nature Biotechnology, vol. 20, 500-505, 2002; Miyagashi, M e Taira, K. Nature Biotechnology, vol. 20, 497-500, 2002; Paul, C.P. et al., Nature Biotechnology, vol. 20, 505-508, 2002, cujos conteúdos são aqui incorporados por referência.

Os ARNsi podem ser formulados em composições farmacêuticas compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz do ácido nucleico em combinação com quaisquer transportadores padrão fisiológica e/ou farmaceuticamente aceitáveis conhecidos na especialidade.

Direção ao alvo

As terapias de direção ao alvo podem usar-se para entregar o agente ativo e.g. polipéptido mais especificamente a tecidos ou células em particular, usando sistemas de direção ao alvo tais como ligandos específicos de anticorpo ou de célula. Estes sistemas de direção ao alvo podem ser ligados covalentemente à sequência de péptido ou a um veículo de entrega de fármaco (tal como um lipossoma, microesfera, micropartícuia, microcápsulas e semelhantes). Os polipéptidos podem também ser dirigidos ao alvo de leitos de tumor em crescimento (que estão associados a leitos de capilares) por incorporação dos péptidos em micropartícuias ou outros veículos de entrega de fármacos que têm um tamanho adequado de modo a passarem através das veias mas a alojarem-se nos leitos de capilares. Quando se encontram alojados nos leitos, os polipéptidos podem ser libertados localmente (em vez de serem libertados sistemicamente) numa localização onde apresentam utilidade máxima. Tal como descrito anteriormente, a presente invenção estende-se adicionalmente a métodos de terapia génica usando os nucleótidos da invenção.

Noutra concretização, podem usar-se os péptidos de FKBP-L para dirigir agentes citotóxicos a células de tumor. Assim, numa concretização, pode conjugar-se o péptido de FKBP-L a um agente citotóxico usando métodos conhecidos na especialidade. 0 péptido de FKBP-L pode então, por interação com CD44, entregar o agente citotóxico a células que expressam CD44. Quando o agente citotóxico é um agente que é capaz de inibir preferentemente crescimento de células de tumor, o agente pode ser ativo contra células de tumor CD44 +ve.

Atividade antiangiogénica ou proangiogénica

Determinadas concretizações da presente invenção podem compreender avaliação de atividade angiogénica das composições da invenção. Pode medir-se a atividade angiogénica por quaisquer meios conhecidos na especialidade ou tal como aqui descrito. Por exemplo, pode ensaiar-se a atividade angiogénica usando ensaios padrão, tal como o ensaio de Matrigel e os ensaios usados nos exemplos.

EXEMPLOS A invenção pode ser melhor compreendida por referência aos exemplos seguintes. A designação "N" proporciona o número de experiências individuais efetuadas para o exemplo específico.

Exemplo 1: A transfeção transitória de FKBP-L inibe o fecho da ferida (N = 3)

Efetuaram-se experiências para determinar o efeito de FKBP-L (SEQ ID NO: 1; figura 1) no fecho de ferida. 0 ensaio de migração in vitro usado nestes estudos é uma versão modificada do método descrito por Ashton et ai (1999) The J. of Biol. Chem., 1999, 274: 50, 35562-35570. Plaquearam-se células endoteliais microvasculares humanas (HMEC1) em câmaras individuais numa lâmina de vidro e cultivaram-se até 90% de confluência.

Transfetou-se a monocamada com uma construção de expressão de mamífero FKBP-L/pcDNA contendo uma construção de expressão com uma inserção com a sequência de nucleótidos de SEQ ID NO: 31, na presença de lipofectina (Invitrogen, UK). Para preparar a construção de expressão, excisou-se o fragmento de ácido nucleico de SEQ ID NO: 31 de uma construção pUC18 recombinante usando BamHl e ligou-se no local de restrição BamHl de pcDNA3.1 (Invitrogen). A expressão da inserção de FKBP-L gera o polipéptido recombinante completo de SEQ ID NO: 2. Após 6 horas, removeram-se os reagentes de transfeção e feriu-se a monocamada com uma ponta de pipeta, ressuplementou-se com MCDB-131 e incubou-se durante 7 horas.

Fixou-se a monocamada em solução de paraformaldeído tamponada com PBS a 4% durante 10 minutos. Avaliou-se cegamente a extensão de fecho da "ferida" por microscopia por um investigador independente e quantificou-se usando uma grade ocular calibrada (1 mm/graduação de 100 pm) a uma ampliação de 20x (Olympus BX 50). Comparou-se a extensão de fecho nas lâminas tratadas com FKBP-L com o tamanho da ferida ao tempo zero.

Apresentam-se os resultados destas experiências na figura 3. Verificou-se que a transfeção transitória com FKBP-L produz um péptido equivalente a SEQ ID NO: 2 e inibiu significativamente a capacidade de migração de HMEC-1 comparativamente a controlo de apenas lipofectina e de vetor vazio. FKBP-L inibe a migração de HMEC-1 em 50% comparativamente aos controlos (Lipo - reagentes de lipofectina; pcDNA - apenas vetor) às 7 h após ferimento. Estes dados sugerem que a proteína FKBP-L é potencialmente uma proteína antimigratória.

Exemplo 2: A proteína FKBP-L recombinante completa inibe migração de células endoteliais no ensaio de fecho de ferida (N=3) O ensaio de migração in vitro usado nestes estudos é uma versão modificada do método descrito por Ashton et al (1999).

Plaquearam-se HMEC-1 em câmaras individuais numa lâmina de vidro e cultivaram-se durante a noite até 90% de confluência. Removeu-se o meio e feriu-se a monocamada. Ressuplementou-se a monocamada com meio fresco e adicionou-se o volume necessário de proteína FKBP-L recombinante completa marcada com his (SEQ ID NO: 1) para obter a concentração final necessária.

De modo a gerar a proteína FKBPL recombinante completa, subclonou-se o ADNc de FKBPL (polinucleótido SEQ ID:31; variante de polipéptido variante Thrl82, Glyl86; SEQ ID NO:l) de pcDNA3.1/FKBPL para os locais BamH.1 e PstI do vetor pRSET-A (Invitrogen) e expressou-se em BL21 (DE3) para obter a proteína correspondente marcada com poli-histidina no terminal N (his-tag) (SEQ ID NO: 1). Induziu-se a expressão até DO de 0,6 com IPTG 0,2 mM, cultivando as células durante a noite a 15 °C. Sedimentaram-se as células por centrifugação e armazenaram-se a -20 °C. Purificou-se a proteína usando purificação IMAC padrão, seguida por dessalinização para remover gualguer contaminação de proteínas de E. coli (consultar o exemplo 32 para uma descrição completa). A proteína recombinante completa expressa tem um peso molecular calculado de 38 kDa; verificou-se que a FKBP-L marcada com His, que tem um peso molecular calculado de 42220 Da, tem um peso molecular de 42 kDa, tal como avaliado por eletroforese em gel de SDS poliacrilamida (SDS-PAGE).

Incubaram-se as monocamadas durante 7 horas após exposição a proteína FKBP-L recombinante e seguidamente fixaram-se em paraformaldeído tamponado com PBS a 4%. Avaliou-se cegamente a extensão de fecho da "ferida" por microscopia por um investigador independente e quantificou-se usando uma grade ocular calibrada (1 mm/graduação de 100 ym) a uma ampliação de 20x (Olympus BX 50). A extensão de fecho nas lâminas tratadas com FKBP-L foi comparada a controlos com tratamento simulado e o mesmo tempo de experiência e calculou-se a % de inibição de fecho da ferida comparativamente a controlos com o mesmo tempo de experiência.

Os resultados destas experiências apresentam-se na figura 4. Pode verificar-se que o tratamento com proteína FKBP-L recombinante resultou numa inibição significativa de migração, com uma concentração ótima de 750 ngml-1 induzindo uma inibição de 60% da migração de HMEC-1 na área desnudada da monocamada, comparativamente a controlos com o mesmo tempo de experiência. As observações desta experiência corroboram os resultados verificados com FKBP-L com transfeção transitória (figura 3) .

Os resultados também sugerem que FKBP-L pode inibir a migração de células endoteliais quando expressa intercelularmente (tal como na figura 3 anterior usando uma construção de expressão) ou extracelularmente (i.e., por adição de proteína recombinante ao meio de cultura de tecidos) . Tal implica que FKBP-L inibe a migração de células endoteliais por dois mecanismos diferentes ou que FKBP-L é excretada da célula. Tal como aqui apresentado, FKBP-L é de facto excretada.

Exemplo 3 : A proteína FKBP-L é excretada de células HMEC-1 (N=l)

Plaquearam-se células endoteliais microvasculares humanas (HMEC1) em placas de cultura de plástico de 35 mm e cultivaram-se até 100% de confluência. Transfetou-se a monocamada com uma construção de expressão de mamífero FKBP-L/pcDNA marcada com hemaglutanina (HA) na presença de lipofectina (Invitrogen, UK). Tal resultaria na expressão de SEQ ID NO: 2 com um marcador HA.

De modo a gerar o plasmídeo de FKBPL marcado com HA, excisou-se o ADNc de FKBPL (polinucleótido SEQ ID NO:31; variante de polipéptido variante Thrl82, Glyl86; SEQ ID NO:2) de pUC18 por digestão com BamHl, tornaram-se as extremidades planas e clonou-se direcionalmente para um local Sail com extremidade plana do vetor de expressão de mamífero pCMV-HA (Clontech, UK). Tal resulta na expressão de SEQ ID NO: 2, com um marcador HA no terminal N para produzir uma proteína de 44 kDa.

Após 6 horas, removeram-se os reagentes de transfeção e feriu-se a monocamada (os controlos não foram feridos) com uma ponta de pipeta, ressuplementou-se com MCDB-131 e incubou-se durante 7 horas adicionais. Recolheu-se o meio para análise e lavaram-se então as células duas vezes com PBS e recolheram-se para 100 μΐ de tampão Laemmli 2X (Sigma) e aqueceu-se a 100 °C durante 10 minutos. Tanto os lisados celulares, como o meio de cultura foram sujeitos a transferência "slot" para membrana de nitrocelulose e sondaram-se com anticorpo monoclonal anti-HA (Clontech) (diluição de 1:1000) de modo a detetar a proteína FKBP-L marcada com HA e seguidamente sondou-se com anticorpo secundário contra Ig de coelho ligado a HRP (diluição de 1:7500) (Amersham Biosciences). Detetou-se a ligação de anticorpo com reagente de deteção de substrato quimioluminescente SuperSignal® West Pico (Pierce).

Os resultados são apresentados na figura 5. A figura 5 é uma hibridação "slot"/"Western" que apresenta a transfeção de uma construção de ADNc de FKBP-L marcada com HA para monocamadas HMEC-1 normais ou monocamadas feridas que resulta em excreção, para o meio, da proteína FKBP-L marcada com HA, 24 h após transfeção. As transferências "Western" foram sondadas com anticorpo contra HA.

Estes dados indicam que, em condições de cultura normais, a proteína FKBP-L é excretada ativamente, o que corrobora a hipótese de que FKBP-L pode estar a mediar os seus efeitos antiangiogénicos através de ativação de recetor. Os dados também proporcionam uma explicação porque tanto a proteína recombinante, como a sobrexpressão de proteína usando uma construção de ADNc são ambas capazes de exercer efeitos antiangiogénicos verificados tanto in vitro, como in vivo.

Exemplo 4 : O efeito de proteína FKBP-L recombinante completa no ensaio de fecho da ferida medido em função do tempo (N = 3)

Efetuaram-se os seguintes estudos para determinar o efeito de uma proteína FKBP-L recombinante completa marcada com His no ensaio de fecho de ferida medido em função do tempo. Uma vez mais, o ensaio de migração in vitro usado nestes estudos é uma versão modificada do método descrito por Ashton et ai (1999). Plaquearam-se HMEC-1 em câmaras individuais numa lâmina de vidro e cultivaram-se durante a noite até 90% de confluência. Removeu-se o meio e feriu-se a monocamada. Ressuplementou-se a monocamada com meio fresco e adicionou-se o volume necessário de FKBP-L recombinante completa marcada com his (i.e., SEQ ID NO: 1) para obter a concentração final necessária de 750 ngml-1.

Removeram-se as lâminas a pontos de tempo fixos até fecho completo da ferida, seguidamente fixaram-se em paraformaldeído tamponado com PBS a 4%. A extensão de fecho da "ferida" foi avaliada cegamente por microscopia por um investigador independente e quantificou-se usando uma grade ocular calibrada (1 mm/graduação de 100 pm) a uma ampliação de 2 0x (Olympus BX 50). Comparou-se a extensão de fecho nas lâminas tratadas com FKBP-L a controlos com tratamento simulado e o mesmo tempo de experiência e calculou-se a % de inibição de fecho da ferida comparativamente a controlos com o mesmo tempo de experiência.

Os resultados destas experiências apresentam-se na figura 6. Pode verificar-se que, globalmente, o fecho da ferida foi inibido significativamente nas células HMEC-1 tratadas com FKBP-L (750 ngml-1) comparativamente a controlos. Verificou-se 50% de fecho da ferida no controlo às 7 horas, enquanto só se verificou 50% de fecho da ferida na monocamada tratada com FKBP-L 16 horas após o ferimento inicial, resultando num atraso significativo de 9 horas. Verificou-se fecho completo da ferida às 16 horas nas experiências de controlo, contrariamente a monocamadas tratadas com FKBP-L que permaneceram abertas até às 34 horas. Estes resultados indicam que o efeito de uma única administração de FKBP-L pode ser um método extremamente eficaz de atrasar o fecho da ferida neste modelo in vitro.

Exemplo 5: O efeito de proteína FKBP-L recombinante completa na formação de contactos célula a célula endoteliais na membrana basal sintética Matrigel (N = 3)

Nesta experiência, avaliou-se o efeito de proteína FKBP-L recombinante completa com marcador His (SEQ ID NO: 1) na formação de contactos célula a célula endoteliais. As amostras foram estudadas em triplicado. O ensaio de formação de túbulo in vitro usado nestes estudos é uma versão modificada do método descrito por Ashton et al (1999). Sucintamente, efetuaram-se os ensaios usando placas multipoços de 24 poços com camada fina de matriz BD BioCoat™ Matrigel™ (BD Discovery Labware, Oxford, UK). Re-hidratou-se a Matrigel™ com 500 μΐ de meio isento de soro MCDB-131 e incubou-se a 37 °C durante 30 minutos. Removeu-se o excesso de meio e inoculou-se HMEC-1 a uma densidade de 1 x 105 e incubaram-se as placas a 37 °C em CO2 a 5%/ar a 95% durante 1 hora.

Adicionaram-se concentrações crescentes de proteína FKBP-L recombinante (SEQ ID NO: 1) a cada poço individual em triplicado (250-1000 ngml-1) e incubou-se a placa durante 18 horas adicionais. Avaliou-se o grau de formação de túbulos entre células HMEC-1 adjacentes em cada poço em cinco campos de visão, por contagem do número de contactos célula a célula entre células HMEC-1 diferentes na área determinada. Um investigador independente avaliou cada poço e compararam-se os poços tratados com FKBP-L com controlos com tratamento simulado.

Os resultados apresentam-se na figura 7. Verificou-se que a proteína FKBP-L recombinante inibiu a capacidade de HMEC-1 formarem contactos célula a célula ou túbulos em Matrigel, de uma forma dependente da dose. A concentração ótima para este efeito foi de 750 ngml-1, com uma eficácia de 80% e uma potência EC50 de 314 ngml-1. Estes resultados indicam, que nestas doses, FKBP-L é antiangiogénica, prevenindo a formação de tubo pelas células HMEC-1.

Exemplo 6: O efeito do polipéptido de FKBP-L recombinante completo em angiogénese in vivo usando o ensaio de esponja em ratinho (N=l; dois ratinhos por grupo)

Esta experiência mediu os efeitos de FKBP-L em angiogénese usando dois outros modelos in vitro, o ensaio de esponja em ratinho e o modelo de anel aórtico.

Nestas experiências, implantaram-se subcutaneamente esponjas de poliéter em ratinhos pretos C57 e injetaram-se em dias alternados com 10 ng de fator de crescimento de fibroblastos bovino (bFGF) ou 10 ng de bFGF + 5 pg de polipéptido de FKBP-L recombinante completo marcado com His (SEQ ID NO: 1). Após 14 dias de tratamento, recolheram-se as esponjas, seccionaram-se e coraram-se com hematoxilina e eosina.

Os resultados apresentam-se nas figuras 8 e 9. Na figura 8A, podem ver-se eritrócitos, que aparecem como células cinzento escuro e estão indicados por setas, dentro dos microvasos de esponjas tratadas com bFGF. Igualmente, pode verificar-se que existe uma elevada quantidade de crescimento celular para o interior (que aparece a cinzento claro). Tanto os eritrócitos, como o crescimento celular para o interior são muito menos óbvios em esponjas também tratadas com FKBP-L (figura 8B) . Apresentam-se na figura 9 as contagens de vasos em esponjas de 2 ratinhos por grupo, contados de uma forma cega a uma ampliação de 40X. As esponjas tratadas com FKBP-L tinham significativamente menos vasos do que as tratadas apenas com bFGF (p=0,0008) .

Os resultados indicam que o polipéptido de FKBP-L recombinante completo pode inibir angiogénese in vivo e que este polipéptido pode ter valor terapêutico potencial num cenário clinico.

Exemplo 7: O efeito de polipéptido de FKBP-L recombinante completo no modelo de angiogénese de explante de anel aórtico ex-vivo, investigando o efeito no comprimento médio, comprimento máximo e número dos vasos formados (N = 3)

Eutanizaram-se ratos Wistar machos e removeu-se a aorta torácica asseticamente e seccionou-se em anéis de 1 cm de espessura. Lavaram-se os anéis dez vezes em meio estéril para remover quaisquer bactérias e embeberam-se em Matrigel em placas de 24 poços. Suplementaram-se os poços com 2 ml de meio e concentrações crescentes de proteína FKBP-L recombinante completa marcada com His (SEQ ID 1). Incubou-se a placa durante 8 dias e após incubação, fixou-se a Matrigel e os anéis em paraformaldeído tamponado com PBS a 4% e armazenou-se em PBS. Avaliou-se cegamente a extensão do desenvolvimento de vasos microscopicamente por um investigador independente e quantificou-se usando uma grade ocular calibrada (1 mm/graduação de 100 pm) a uma ampliação de 20x (Olympus BX 50). Mediu-se a extensão do comprimento de vaso, comprimento de vaso máximo e número de vasos em cada campo de visão e comparou-se a controlos simulados com o mesmo tempo de experiência e calculou-se a percentagem (%) de inibição.

Os resultados destas experiências apresentam-se na figura 10. Verificou-se que FKBP-L é um inibidor de angiogénese potente dependente da dose neste modelo ex vivo. O comprimento de vaso médio e o comprimento máximo de vasos formados foram significativamente inibidos a 1000 ngml-1 apresentando 63% e 70% de inibição, respetivamente, comparativamente a controlos com o mesmo tempo de experiência. O número de vasos formados a partir do explante aórtico foi inibido otimamente em 65% após tratamento com proteína FKBL-L a 500 ngml-1.

Exemplo 8: O efeito do polipéptido de FKBP-L recombinante completo na viabilidade ou proliferação de HMEC-1 usando o ensaio de MTT (N = 3)

Estas experiências avaliaram se os efeitos antiangiogénicos da proteína FKBP-L completa eram devidos a toxicidade do polipéptido. Usou-se um ensaio de MTT para medir a viabilidade/proliferação celular. Sucintamente, inocularam-se células HMEC-1 (2,5 X 103) em placas de 96 poços e deixaram-se fixar durante 5 horas. Trataram-se as células com concentrações crescentes de proteína FKBP-L recombinante marcada com His (SEQ ID NO: 1) e incubaram-se durante 24 (figura 11A) e 48 horas (figura 11B). Após incubação, as células foram expostas a uma solução de 3-(-4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT) a 5 mgml-1 durante 4 horas. Aspiraram-se as células e adicionou-se 200 μΐ de DMSO para reduzir o sal e induzir uma alteração de cor. Analisaram-se os poços colorimetricamente a 550 nm e compararam-se os resultados com células de controlo não tratadas. Repetiu-se a experiência três vezes.

Os resultados apresentam-se nas figuras 11A e 11B. Verificou-se que FKBP-L não tinha qualquer efeito significativo na proliferação de células HMEC-1 comparativamente a controlos com o mesmo tempo de experiência a qualquer dos intervalos de tempo medidos, o que sugere que os efeitos antiangiogénicos verificados nos ensaios anteriores não foram causados por inibição do crescimento celular ou por toxicidade mediada por FKBP-L.

Exemplo 9: Alterações da morfologia citoesquelética de células endoteliais em migração por exposição a polipéptidos de FKBP-L recombinantes completos a 750 mgml-1 (N=2)

Efetuou-se análise imuno-histoquímica para avaliar a morfologia citoesquelética após tratamento com FKBP-L por coloração de tubulina e vimentina. Inocularam-se HMEC-1 em lâminas de câmara de quatro poços e incubaram-se durante a noite até se formarem monocamadas confluentes. Removeu-se o meio de cada poço e feriu-se a monocamada, tal como descrito anteriormente. Ressuplementaram-se as células com meio contendo proteína FKBP-L recombinante marcada com His (i.e., SEQ ID NO: 1) a 750 ngml-1. Incubaram-se as células durante 5 horas e removeram-se as câmaras das lâminas e lavaram-se as células quatro vezes em PBS, seguido por fixação em paraformaldeído tamponado com PBS a 4%, tratadas com Triton X a 0,1%, durante 20 minutos. Lavaram-se as células três vezes em PBS e bloquearam-se durante 20 minutos em BSA a 2% contendo Triton X a 0,1%. Lavaram-se as células bloqueadas em PBS e incubaram-se com um dos seguintes anticorpos monoclonais primários: (A) anti--tubulina (1:500); e (B) anti-vimentina (1:200), durante 90 minutos. Lavaram-se as células com PBS, seguido por 1 hora de incubação com anticorpo secundário anti-ratinho conjugado a FITC (1:30) à temperatura ambiente. Montaram-se as células com Vectashield contendo iodeto de propídio e selaram-se para evitar desidratação. Cobriram-se as lâminas com folha de alumínio e armazenaram-se a 4 °C para análise usando microscopia confocal de fluorescência.

Os resultados apresentam-se na figura 12 (coloração das células com anti-tubulina) e figura 13 (coloração das células com anti-vimentina). Nas HMEC-1 em migração de controlo, os microtúbulos (corados usando anti- tubulina) (figura 12: controlo) apresentam uma estrutura linear regular na direção da ferida, auxiliando assim o processo de migração direcional. Podem observar-se regiões de coloração densa à frente do núcleo e este centro de organização de microtúbulos (MTOC) é um bom indicador da ocorrência de migração direcional na altura de fixação. Contrariamente, nas células tratadas com FKBP-L (figura 12: FKBP-L) os microtúbulos parecem ter pouco alinhamento na direção da ferida. Pode verificar-se que os microtúbulos parecem ligeiramente tortuosos ou finos e alinhados da esquerda para a direita, o MTOC parece localizado no lado da célula indicando ausência de qualquer migração direcional ativa. A figura 13 apesenta os filamentos intermediários das HMEC-1 coradas usando anti-vimentina. As células de controlo (não tratadas) parecem uma vez mais estar organizadas, alongadas e apontando na direção da ferida, sugerindo uma vez mais que as células estão em migração ativa (figura 13: controlo). Contrariamente, os filamentos intermediários em HMEC-1 tratadas com FKBP-L que não estão em migração, parecem altamente desorganizados, mesmo aglomerados e não apresentam qualquer indicação de estarem em migração ativa para a ferida (figura 13: FKBP-L).

Os resultados desta investigação confocal sugerem que o mecanismo de inibição de migração mediada por FKBP-L pode ser dirigido ao citoesqueleto.

Exemplo 10: O efeito de FKBP-L recombinante completa em migração de células de tumor PC3, HT29 e MDA (N=3)

Nestas experiências avaliou-se o efeito de FKBP-L recombinante na migração de células de tumor. O ensaio de migração in vitro usado nestes estudos é uma versão modificada do método descrito por Ashton et ai (1999), consultar anteriormente. Plaquearam-se células de tumor PC3, MDA231 e HT29 em câmaras individuais numa lâmina de vidro e cultivaram-se durante a noite até 90% de confluência. Removeu-se o meio e feriram-se as monocamadas. Ressuplementou-se a monocamada com meio fresco e adicionou-se o volume necessário de proteína FKBP-L recombinante marcada com His (SEQ ID NO: 1) para obter as concentrações finais apresentadas. Incubaram-se as monocamadas durante 24 horas e seguidamente fixaram-se em paraformaldeído tamponado com PBS a 4%. A extensão de fecho da "ferida" foi avaliada cegamente por microscopia por um investigador independente e quantificou-se usando uma grade ocular calibrada (1 mm/graduação de 100 ym) a uma ampliação de 20x (Olympus BX 50) . A extensão de fecho nas lâminas tratadas com FKBP-L foi comparada com controlos com tratamento simulado com o mesmo tempo de experiência e calculou-se a percentagem de inibição de fecho de ferida comparativamente a controlos com o mesmo tempo de experiência.

Apresentam-se os resultados na figura 14, painéis A, B e C. Verificou-se que o polipéptido de FKBP-L recombinante inibe a migração de células de tumor de uma forma dependente da dose. Esta constatação indica que FKBP-L pode ser útil como um agente terapêutico para reduzir a invasão de células de tumor e metástases.

Exemplo 11: 0 efeito de injeção direta de uma construção de ADNc de FKBP-L no crescimento de células de tumor da próstata humano DU145 in vivo. (N=l, 4-7 ratinhos por grupo de tratamento)

Efetuaram-se experiências para determinar o efeito de injeção intratumoral direta de uma construção de ADNc de FKBP-L no crescimento de células de tumor da próstata DU145 humanas in vivo.

Cultura celular

Obtiveram-se células Dul45 (carcinoma da próstata) de Cancer Research, UK e cultivaram-se em meio RPMI 1640 (Invitrogen) suplementado com soro de vitelo fetal a 10%. Todas as linhas celulares foram cultivadas até monocamadas, incubadas a 37 °C sob CO2 a 5%.

Construção de plasmídeo de ADN

Construiu-se o plasmídeo FKBP-L/pcDNA3.1 por excisão do ADNc de FKBPL usando BamHl (polinucleótido SEQ ID NO:31) de pUC18 e seguidamente ligação direcional de FKBP-L para o local de restrição de BamHl de pcDNA3.1 (Invitrogen), tal como descrito no exemplo 1. Construiu-se o plasmídeo de endostatina (para uso como um controlo antiangiogénico positivo) hEndo XV/pcDNA3.1 por digestão do plasmídeo pBLAST hENDO XV (InVivoGen) com Hpal (Promega) e EcoV (Invitrogen) para libertar a inserção hEndo XV. Ligou-se a inserção hEndo XV direcionalmente para o local de restrição ECoRV de pcDNA3.1 (Invitrogen).

Modelo de xenoenxerto de cancro da próstata

Usaram-se dezanove (19) ratinhos machos (Harlan) imunocomprometidos (imunodeficiência combinada grave).

Deixaram-se os ratinhos adaptarem-se e colocaram-se em gaiolas em grupos de 5 ou menos, numa unidade de tratamento com barreira. Cultivaram-se células Dul45 (carcinoma da próstata) tal como previamente descrito. Recolheram-se células subconfluentes e ajustou-se a concentração de células para 5xl07 células/ml em PBS. Rapou-se o dorso de cada ratinho. Após administração de anestésico, cada ratinho recebeu injeções intradérmicas de 5xl06 células de tumor Dul45 (100 μΐ) bilateralmente na traseira do dorso, com uma agulha de calibre 26. Deixaram-se crescer os tumores até atingirem um volume de 100-125 mm3. Dividiram-se aleatoriamente os ratinhos em quatro regimes de tratamento: (a) não tratados (4 ratinhos); (b) vetor vazio (pcDNA3.1) (4 ratinhos); (c) hEndo XV/pcDNA3.1 (4 ratinhos); e (d) FKBP-L/pcDNA3.1 (7 ratinhos). Os ratinhos receberam injeções intratumorais de complexos de Lipofectamina 2000 (Invitrogen):plasmídeo, duas vezes por semana, de 3 em 3 ou de 4 em 4 dias. Sucintamente, prepararam-se complexos de Lipofectamina 2000rplasmídeo para cada injeção por animal tal como se segue: adicionou-se 25 μΐ de plasmídeo (1 pg/μΐ) a 25 μΐ de optimem (Invitrogen) e adicionou-se 10 μΐ de Lipofectamina 2000 (Invitrogen) a 40 μΐ de optimem. Incubaram-se as duas soluções à temperatura ambiente durante 5 minutos. Combinaram-se as 2 soluções e deixaram-se incubar à temperatura ambiente durante 20 minutos adicionais antes da injeção intratumor no tumor. Mediram-se os tumores antes de cada tratamento. O volume de tumor foi calculado como: 4/37Ur3 (em que r = ½ GMP e

Os resultados apresentam-se na figura 15. Ambos os tumores tratados com FKBP-L e com endostatina apresentaram evidência de um centro necrótico, i.e. tinham uma aparência em coroa cilíndrica. Tal é típico dos efeitos verificados com antiangiogénicos. Os controlos atingiram o seu tempo de quadruplicação de volume a ~35 dias, contudo o crescimento de tumores tratados com FKBP-L foi inibido mais de 3 meses (100 dias) após tratamento inicial, com tumores apenas com 10% do seu volume inicial.

Assim, verificou-se que a injeção intratumoral de uma construção de expressão de FKBP-L inibe o crescimento de xenoenxerto de tumor humano DU145 e é comparável, se não mesmo superior, aos efeitos verificados com endostatina atualmente aprovada pelo menos em alguns países (e.g., China) para tratamento de cancro do pulmão. Uma vez mais, tal mostra o potencial valor terapêutico de terapia génica de FKBP-L num cenário clínico.

Exemplo 12: Genes regulados em células L132 por oligonucleótidos antissentido de FKBP-L associados a angiogénese/migração

Análise de micromatriz de ADNc

Isolou-se ARN total de células L132, 8 h após exposição a FKBP-L antissentido (FKBP-L antissentido: 5' ATG GCC AGG CTC CCG CTC 3' ) (SEQ ID NO: 40) ou apenas lipofectina como controlo. Extraiu-se ARNm Poli A+ de amostras de ARN total usando o kit Qiagen Oligotex (Qiagen, UK) , de acordo com as instruções do fabricante. Estas amostras de ARNm (800 ng por amostra) foram enviadas para Incyte Genomics, EUA onde se efetuou uma análise de micromatriz UniGEM 2.0.

Os chips Lifearray de Incyte permitem interrogar até 10000 genes simultaneamente, resultando na comparação de níveis de expressão génica em duas amostras diferentes. Sucintamente, efetuou-se uma reação de transcrição reversa padrão para converter ambas as amostras de ARNm em ADNc marcado com corante de cianina. Usou-se ARNm de células L132 tratadas com oligonucleótidos antissentido de FKBP-L após 8 h, para gerar uma sonda marcada com Cyanine 3 (verde) e usou-se ARNm de células L132 tratadas com lipofectina apenas após 8 horas para produzir uma sonda marcada com Cyanine 5 (vermelha). As duas amostras de sondas fluorescentes foram aplicadas simultaneamente a um único chip de micromatriz contendo numerosas sondas de ADNc imobilizadas num suporte sólido em localizações específicas, onde reagiram competitivamente com as moléculas de ADNc na matriz. Após incubação, lavou-se a micromatriz numa série de banhos para assegurar a remoção de qualquer amostra não hibridada. A micromatriz foi então capturada como uma imagem que foi obtida usando um digitalizador para deteção de sinal de fluorescência. Estes dados foram gerados pelo digitalizador sobre a intensidade de cada mancha por excitação dos fluorocromos na matriz. Cada elemento do chip foi digitalizado para o marcador fluorescente Cy3 (verde) e seguidamente para Cy5 (vermelho) para criar imagens eletrónicas para ambos os canais de corante. Analisaram-se as imagens de matriz finais usando o pacote de utilitários Incyte GEMTools.

Os genes que são regulados positivamente estão associados a um aumento de angiogénese (tabela 1). Sabe-se que a expressão elevada de RhoA, RhoC, ROCK I e ROCK II está associada a progressão de tumor para estágios mais avançados e foi sugerido que a sinalização de Rho e de ROCK contribuem para as alterações morfológicas e comportamento metastático de algumas células de tumor. Tal é consistente com a hipótese de que a sobrexpressão de FKBP-L inibe angiogénese e que a repressão de FKBP-L usando oligonucleótidos antissentido poderia promover angiogénese por ativação de Rho e de ROCK. Os dados implicam que o silenciamento de FKBPL com ARNsi antissentido ou dirigido ao alvo poderia promover angiogénese e poderia ser usado para promover a cicatrização de feridas crónicas.

Tabela 1

Genes expressos diferencialmente após exposição a oligonucleótidos antissentido de FKBP-L

Exemplo 13: A inibição de migração celular é dependente de CD44 em HMEC-1 e em linhas celulares de tumor DU145, PC3, HT29, MCF-7, MDA-231. RT-PCR para detetar expressão de ARNm de CD74

Inocularam-se células Dul45, HMEC-1, HT29, PC3, MCF-7 e MDA-231 em frascos de cultura de tecidos T25 e deixaram-se crescer até atingirem 70% de confluência. Isolou-se ARN das células usando o kit RNAgueous (Ambion, n2 de catálogo AM1912), de acordo com as instruções do fabricante. Tratou-se o ARN com Turbo DNA-free™ (Ambion, n2 de catálogo 1906) de acordo com as instruções do fabricante, de modo a remover ADN contaminante.

Preparou-se ADNc a partir de amostras de ARN usando o kit de transcrição reversa ImProm II™ (Promega, n2 de catálogo A3800). Sucintamente, preparou-se 0,5 ug de ARN, 0,5 pg de iniciador de oligo dT a 5 μΐ com água isenta de nuclease, incubou-se a 70 °C durante 5 min antes de incubar em gelo durante 5 min. Adicionaram-se então os seguintes reagentes: água isenta de nuclease (5,3 μΐ) , 5X tampão de reação ImProm II™ (4 μΐ) , MgCÍ2 25 mM (3,2 μΐ) mistura de dNTP 10 mM (1 μΐ) transcriptase reversa ImProm II™ (1 μΐ) e inibidor de ribonuclease RNasin recombinante (0,5 μΐ) . As reações de transcrição reversa foram incubadas a 25 °C durante 5 min, 42 °C durante lhe finalmente 70 °C durante 15 min.

Para cada reação de PCR: combinou-se ADNc (2 μΐ), tampão de PCR 10X (5 μΐ) , mistura de dNTP 10 mM (2 μΐ) , MgCÍ2 50 mM (2 μΐ), polimerase de ADN Taq (5 U/μΙ) (0,25 μΐ) (Invitrogen n2 de catálogo 18038-018), água de qualidade para biologia molecular (34,75 μΐ) e 2 μΐ dos iniciadores direto e inverso adequados (10 μΜ) (consultar a tabela 2). As amostras foram amplificadas usando o seguinte programa de temperatura: 1 ciclo de 94 °C durante 1 min, 40 (CD74) ou 25 (GAPDH) ciclos de 94 °C durante 45 s, 55 °C durante 30 s e 72 °C durante 90 s; seguido por 1 ciclo de 72 °C durante 10 min.

Tabela 2:sequências de iniciadores para CD74 e GAPDH

Transferência "Western" para detetar MIF e CD44

Todas as linhas celulares, incluindo a linha celular endotelial de ratinho 2H-11 (apenas para ensaio de MIF), foram avaliadas para o seu estado de CD44 e MIF usando análise de transferência "western". Recolheram-se as células em tampão laemmli (Sigma) e aqueceu-se a 90 °C durante 10 min. Sujeitaram-se as amostras a eletroforese de SDS-PAGE usando o sistema Xcell

SureLock Mini-cell (Invitrogen) , transferiu-se para membranas de nitrocelulose, bloqueou-se durante 1 h à temperatura ambiente em solução de leite a 1% e sondou-se com anticorpo monoclonal anti-CD44H (R&D Systems, n2 de catálogo BBA10) a uma diluição de 1:500 ou com anticorpo anti-MIF (R&D Systems, n2 de catálogo AF-289-PB) a uma diluição de 1:500 e anticorpo anti- -actina (Sigma, n2 de catálogo A 4700) a uma diluição de 1:5000. Seguidamente sondaram-se as transferências com anticorpo secundário para Ig de ratinho ligado a HRP (GE Healthcare, UK, n2 de catálogo NA931V) a uma diluição de 1:3500 para sondagem de CD44 ou anticorpo secundário contra -actina ou contra Ig de cabra ligado a HRP (Santa Cruz Biotechnology, n2 de catálogo sc-2020) para sondagem de MIF. A ligação de anticorpo foi detetada usando o substrato quimioluminescente SuperSignal West Pico (Pierce, n2 de catálogo 34080) .

Os resultados apresentam-se na figura 16. Verificou-se que CD74 e MIF foram expressos em todas as linhas celulares avaliadas anteriormente para inibição de fecho das feridas mediada por FKBP-L. Contudo, CD44 estava presente em PC3, MDA-231, HT29 e HMEC-1, mas ausente em Dul45 e MCf-7. A ausência de CD44 correlacionou-se com a incapacidade de FKBP-L inibir o fecho das feridas em DU145 e MCF-7 (apresentado no exemplo 14, seguidamente). Os dados corroboram a hipótese de que FKBP-L se liga a CD44 e interfere com a ligação de CD74/MIF, resultando em inibição das respostas de sinalização angiogénica destes receptores.

Exemplo 14: O efeito de polipéptido de FKBP-L recombinante completo na migração de células de tumor PC3 (CD44 +ve), MDA (CD44 +ve), HT29 (CD44 +ve), MCF-7 (CD44 -ve) e DU145 (CD44 -ve) (N=3) O ensaio de migração in vitro usado nestes estudos é uma versão modificada do método descrito por Ashton et al. (1999) consultar anteriormente. Plaquearam-se PC3 (linha de células de tumor da próstata; positivas para CD44; CD44 +ve), MDA231 (linha de células de tumor da mama; CD44 +ve), HT29 (linha de células de tumor colorretal; CD44 +ve), MCF-7 (linha de células de tumor da mama; negativas para CD44; CD44 -ve) e DU145 (linha de células de tumor da próstata; CD44 -ve) para câmaras individuais numa lâmina de vidro e cultivaram-se durante a noite até 90% de confluência. Removeu-se o meio e feriram-se as monocamadas. Ressuplementou-se a monocamada com meio fresco e adicionou-se o volume necessário de proteína FKBP-L recombinante marcada com His (SEQ ID NO: 1) para obter a concentração final necessária. Incubaram-se as monocamadas durante 24 h e seguidamente fixaram-se em paraformaldeído tamponado com PBS a 4%. A extensão de fecho da "ferida" foi avaliada cegamente por microscopia por um investigador independente e quantificada usando uma grade ocular calibrada (1 mm/graduação de 100 pm) a uma ampliação de 20x (Olympus BX 50). Comparou-se a extensão de fecho em lâminas tratadas com FKBP-L com controlos com tratamento simulado com o mesmo tempo de experiência e calculou-se a % de inibição de fecho da ferida com controlos com o mesmo tempo de experiência.

Avaliaram-se também as linhas celulares para o seu estado CD44 usando análise de transferência "western" (figura 16) . Recolheram-se as células em tampão laemmli (Sigma) e aqueceram-se a 90 °C durante 10 min. Sujeitaram-se as amostras a eletroforese de SDS-PAGE usando o sistema Xcell SureLock Mini-cell (Invitrogen), transferiram-se para membranas de nitrocelulose, bloquearam-se durante 1 h à temperatura ambiente em solução de leite a 1% e sondou-se com anticorpo monoclonal anti-CD44H (R&D Systems, n2 de catálogo BBA10) a uma diluição de 1:500 e anticorpo anti- -actina (Sigma, n2 de catálogo A 4700) a uma diluição de 1:5000 e seguidamente sondaram-se com anticorpo secundário para Ig de ratinho ligado a HRP (GE Healthcare, UK, n2 de catálogo NA931V) a uma diluição de 1:3500 para sondagem de CD44 ou anticorpo secundário para -actina ou para Ig de cabra ligado a HRP (Santa Cruz Biotechnology, n2 de catálogo sc-2020) para sondagem de MIF. A ligação de anticorpo foi detetada usando o substrato quimioluminescente SuperSignal West Pico (Pierce, n2 de catálogo 34080) .

Os resultados do ensaio de fecho da ferida são apresentados na figura 17A-17E. Pode verificar-se que FKBP-L recombinante pode inibir migração de células de tumor em linhas de células de tumor CD44 +ve, mas não em linhas de células de tumor CD44 - ve. Os dados sugerem que FKBP-L poderia inibir metástases de tumor num subconjunto de linhas de células de tumor CD44 +ve.

Exemplo 15: Silenciamento de CD44 em células PC3, através de uma abordagem de ARNsi dirigido ao alvo, inibe a inibição mediada por FKBP-L da migração de PC3 (N=2)

Transfetaram-se células PC3 durante 72 h com ARNsi de controlo não dirigido ao alvo (ARNsi de SCR) (Dharmacon, n2 de catálogo D-001210-01-05) ou ARNsi dirigido a CD44 (ARNsi de CD44) (Dharmacon, n2 de catálogo 009999). Sucintamente, inocularam-se 1,2 x 106 células PC3 em duas placas P90 e incubaram-se a 37 °C durante 24 h. Para transfeção, adicionou-se 150 μΐ de ARNsi de controlo não dirigido ao alvo ou ARNsi dirigido a CD44 (2 μΜ) a 450 μΐ de meio isento de soro (tubo 1). Adicionou-se 18 μΐ de reagente de transfeção Dharmafect 2 (Dharmacon, n2 de catálogo T-2002-03) a 582 μΐ de meio isento de soro em duplicado (tubo 2) . Incubaram-se todos os tubos à temperatura ambiente durante 5 min. Misturou-se o conteúdo dos tubos 1 e 2 e incubou-se durante 20 min adicionais à temperatura ambiente. Durante este período de incubação, lavaram-se duas placas P90 de células PC3 e adicionou-se 4,8 ml de meio completo a cada placa. Adicionou-se então a mistura de transfeção de ARNsi adequada gota a gota e incubaram-se as placas durante 72 h a 37 °C. Inocularam-se então as células transfetadas para lâminas de câmara (1,25 x 105 células /câmara) e incubou-se durante 24 h adicionais a 37 °C. Feriram-se as monocamadas e adicionou-se FKBP-L recombinante completa marcado com His (SEQ ID NO: 1) (1500 ng/ml) ou meio completo às monocamadas. Fixou-se a monocamada após 24 h adicionais e avaliou-se a extensão de fecho da ferida cegamente usando uma grade calibrada. Calculou-se a percentagem de inibição de fecho de ferida em monocamadas tratadas com FKBP-L em comparação com monocamadas não tratadas. FKBP-L inibiu a migração das células tratadas com ARNsi de SCR em 21,7%, mas não apresentou qualquer efeito em células tratadas com ARNsi de CD44.

Efetuou-se análise de transferência "western" para confirmar o silenciamento de CD44 em células PC3. Recolheram-se as células 144 h após transfeção com ARNsi de controlo não dirigido ao alvo (50 nM) ou com ARNsi dirigido a CD44 (50 nM) para meio laemmli (Sigma) e aqueceu-se a 90 °C durante 10 min. Sujeitaram-se as amostras a eletroforese de SDS-Page usando o sistema Xcell SureLock Mini-cell (Invitrogen), transferiram-se para membranas de nitrocelulose, bloquearam-se durante 1 h à temperatura ambiente em solução de leite a 1% e sondou-se com anticorpo monoclonal anti-CD44H (R&D Systems, n2 de catálogo BBA10) a uma diluição de 1:500 e anticorpo anti- -actina (Sigma, n2 de catálogo A 4700) a uma diluição de 1:5000. Seguidamente sondou-se a transferência com anticorpo secundário contra Ig de ratinho ligado a HRP (GE Healthcare, UK, n2 de catálogo NA931V) a uma diluição de 1:3500. A ligação de anticorpo foi detetada usando o substrato quimioluminescente SuperSignal West Pico (Pierce, n2 de catálogo 34080).

Os resultados apresentam-se na figura 18. verificou-se que FKBP-L pode inibir migração na linha de células CD44 +ve, PC3, na presença do ARNsi de controlo. Silenciando CD44 com ARNsi de CD44 (consultar a pista de ARNsi de CD44), verificou-se que a inibição de migração mediada por FKBP-L é dependente da presença de CD44. Estes dados também se correlacionam com a necessidade de CD44 endógena em linhas celulares, tais como HMEC-1, PC3, MDA-231 e HT29, de modo a promover inibição de migração mediada por FKBP-L. Tal inibição de migração mediada por FKBP-L não é detetada em linhas celulares sem CD44, ou seja MCF-7 e DU145.

Exemplo 16: FKBP-L interatua com CD44 endógeno em monocamadas de HMEC-1 feridas

Inocularam-se quatro placas de cultura de tecidos P90 com células HMEC-1, de modo a ficarem 90% confluentes após 24 h. Transfetaram-se as quatro placas P90 de células HMEC-1 com a construção de ADN FKBP-L/pcDNA3.1. Sucintamente, prepararam-se complexos lipofectina:plasmideo FKBP-L/pcDNA3.1 em cada placa p90 da seguinte forma: adicionou-se 4 pq de plasmideo a optimem (Invitrogen) até um volume final de 400 μΐ e adicionou-se 40 μΐ de lipofectina (Invitrogen) a 360 μΐ de optimem. Incubaram-se as duas soluções à temperatura ambiente durante 45 min. Combinaram-se as 2 soluções e deixaram-se incubar à temperatura ambiente durante mais 15 min. Durante este período de incubação, lavaram-se as placas P90 duas vezes com PBS e adicionou-se 3,2 ml de Optimem a cada placa. Adicionaram-se suavemente os complexos lipofectina/plasmídeo às placas e incubaram-se a 37 °C durante 6 h. Removeu-se então o meio de transfeção das células e substituiu-se por meio completo. Incubaram-se as células durante mais 18 h a 37 °C. Feriram-se as monocamadas de HMEC-1 (3 feridas por placa P90) e incubaram-se a 37 °C durante 7 h. Lavaram-se então as células duas vezes com PBS gelado e recolheram-se em tampão de lise celular (PBS, Igepal a 1%, desoxicolato de sódio a 0,5%, SDS a 0,1%, molibdato de sódio 10 mM, 1 comprimido isento de EDTA); 300 μΐ por placa P90. Incubou-se o lisado celular a 4 °C com rotação durante 30 min. Centrifugou-se o lisado celular a 13000 rpm durante 20 min a 4 °C, de modo a remover os resíduos de células. O sobrenadante foi então preclarifiçado por incubação com pérolas de agarose G prelavadas durante 1 h a 4 °C, com rotação. O lisado celular preclarifiçado foi dividido em 3, adicionou-se 1/3 a conjugado de agarose G-anticorpo contra CD44, adicionou-se 1/3 a conjugado de agarose G-anticorpo contra FKBP-L e adicionou-se 1/3 a pérolas prelavadas (controlo negativo). Incubaram-se as misturas de anticorpo-agarose G/lisado celular durante a noite a 4 °C, com rotação. Lavaram-se então as pérolas 3 vezes com tampão de lise celular gelado e 3 vezes com PBS gelado. Reconstituíram-se então as pérolas em 60 μΐ de tampão laemmli.

Efetuou-se análise de transferência "western" das amostras imunoprecipitadas para confirmar interações entre FKBP-L e CD44. Aqueceram-se as amostras a 90 °C durante 10 min. Sujeitaram-se as amostras a eletroforese de SDS-Page usando o sistema Xcell SureLock Mini-cell (Invitrogen), transferiram-se para membranas de nitrocelulose, bloquearam-se durante 1 h à temperatura ambiente em solução de leite a 1% e sondou-se com anticorpo monoclonal anti-CD44H (R&D Systems, n2 de catálogo BBA10) a uma diluição de 1:500 e anticorpo anti-FKBP-L (Proteintech) a uma diluição de 1:1000 e seguidamente sondaram-se com anticorpo secundário contra Ig de ratinho (CD44) ou de coelho (FKBP-L) ligado a HRP (GE Healthcare, UK, n2 de catálogo NA931V) a 1:3500. A ligação de anticorpo foi detetada usando o substrato quimioluminescente SuperSignal West Pico (Pierce, n2 de catálogo 34080) .

Os resultados apresentam-se na figura 19. Assim, verificou-se usando imunoprecipitação, que FKBP-L sobrexpressa exogenamente interatua com CD44 endógeno em monocamadas feridas. Só se detetou interação entre FKBP-L endógena e CD44 em monocamadas feridas, mas não em monocamadas não feridas (dados não apresentados). Tal sugere que é necessário que seja expresso um nível crítico de FKBP-L antes de se poder detetar interação com CD44. Adicionalmente, esta interação apenas ocorre em células endoteliais que são estimuladas para migração, i.e. em monocamadas feridas.

Exemplo 17: 0 domínio N-terminal de FKBP-L é importante para as propriedades antiangiogénicas de FKBP-L (N-3)

Preparação das construções mutantes de truncagem de FKBP-L

Para construir as 5 construções de plasmídeo de mutantes de truncagem de FKBP-L ( 34FKBP-L/pcDNA3.1, 40FKBP-L/pcDNA3.1, 48FKBP-L/pcDNA3.1, 58FKBP-L/pcDNA3.1, 86FKBP-L/pcDNA3.1, 151FKBP-L/pcDNA3.1 e 200FKBP-L/pcDNA3.1); introduziram-se codões de paragem nas posições de aminoácidos 34, 40, 48, 58, 86, 151 ou 200 por mutagénese dirigida ao local (kit Quikchange, Stratagene).

Para cada reação de mutagénese dirigida ao local: combinou-se pcDNA3.1/FKBP-L/DIR1 (10 ng) , tampão de reação 10X (5 μΐ) , dNTP 10 mM (2 μΐ), ADN polimerase Pfu Turbo (2,5 U/μΙ) (1 μΐ) água de qualidade para biologia molecular (37 μΐ) , QuikSolution (3 μΐ) e 1 μΐ dos iniciadores direto e inverso adequados (125 ng/μΐ). Amplificaram-se as amostras usando o seguinte programa de temperatura: 1 ciclo de 95 °C durante 1 minuto, 18 ciclos de 95 °C durante 50 segundos, 60 °C durante 50 segundos e 68 °C durante 16 minutos; seguido por 1 ciclo de 68 °C durante 7 minutos.

Tabela 3 - Iniciadores usados para preparar construções mutantes de FKBP-L de truncagem de FKBP-L

Adicionou-se a endonuclease de restrição Dpn I (10 U/μΙ) (1 μΐ) diretamente a cada reação de amplificação e incubou-se a 37 °C durante 1 hora para digerir o ADN parental (não mutado) . Transformaram-se as reações de amplificação digeridas para células ultracompetentes XL-10-Gold e plaquearam-se para placas de ágar-ágar LB contendo ampicilina (100 pg/ml). Selecionou-se uma colónia e cultivou-se em 200 ml de meio LB contendo ampicilina (100 yg/ml). Purificou-se cada construção de ADN mutante de FKBP-L truncada usando o kit Qiagen Plasmid Maxi. Confirmaram-se as alterações de sequências nas construções mutadas por sequenciação de ADN automatizada (Fusion Antibodies Ltd) (consultar e.g., figura 20A e 20B).

As sete construções de mutantes de truncagem de FKBP-L foram transfetadas para expressar os polipéptidos (SEQ ID NOS: 3-9) apresentados na figura 1.

Ensaio de migração in vitro O ensaio de migração in vitro usado nestes estudos é uma versão modificada do método descrito por Ashton et al (1999). Plaquearam-se HMEC-1 em câmaras individuais numa lâmina de vidro e cultivaram-se até 90% de confluência. A monocamada foi transfetada com 1 yg de construções de FKBP-L de tipo selvagem/pcDNA (para expressar o polipéptido de SEQ ID 1), 34FKBP-L/pcDNA3.1, 40FKBP-L/pcDNA3.1, 48FKBP-L/pcDNA3.1, 58FKBP-L/pcDNA3.1, 86FKBP-L/pcDNA3.1, 151FKBP-L/pcDNA3.1 ou 200FKBP-L/pcDNA3.1 (para expressar os polipéptidos apresentados na figura 1) na presença de lipofectina. Após 6 horas, removeram-se os reagentes de transfeção e feriu-se a monocamada com uma ponta de pipeta, ressuplementou-se com MCDB-131 e incubou-se durante 7 horas.

Fixou-se a monocamada em solução de paraformaldeído tamponado com PBS a 4% durante 10 minutos. A extensão de fecho da "ferida" foi avaliada cegamente por microscopia por um investigador independente e quantificada usando uma grade ocular calibrada (1 mm/graduação de 100 ym) a uma ampliação de 20x (Olympus BX 50).

Os resultados apresentam-se na figura 20C. Verificou-se que FKBP-L completa de tipo selvagem e os mutantes truncados 48, 58, 86, 151, 200 inibirem o fecho da ferida. WT-FKBP-L e 58 inibiram o fecho da ferida em 36,2,6% e 48,8% respetivamente. 34 e 40 não conseguiram inibir significativamente o fecho da ferida, sugerindo que o domínio ativo foi deletado nestes mutantes e que o domínio antiangiogénico ativo situa-se entre os aminoácidos 34 e 57 de FKBP-L completa.

Exemplo 18: Avaliação de péptidos candidatos que abrangem o domínio ativo de FKBP-L usando o ensaio de raspagem da ferida: comparação com FKBP-L recombinante (N=3) 0 ensaio de migração in vitro usado nestes estudos é uma versão modificada do método descrito por Ashton et ai. (1999) consultar anteriormente. Plaquearam-se HMEC-1 em câmaras individuais numa lâmina de vidro e cultivaram-se até 90% de confluência durante a noite. Removeu-se o meio e feriu-se a monocamada. Ressuplementou-se a monocamada com meio fresco e adicionou-se o volume necessário dos seguintes péptidos para conseguir uma gama de dose de lCh14-lCh6 M.

As monocamadas foram incubadas durante 7 h e seguidamente fixadas em paraformaldeído tamponado com PBS a 4%. A extensão de fecho da "ferida" foi avaliada cegamente por microscopia por um investigador independente e quantificada usando uma grade ocular calibrada (1 mm/graduação de 100 pm) a uma ampliação de 20x (Olympus BX 50). A extensão de fecho nas lâminas tratadas com FKBP-L foi comparada a controlos com tratamento simulado com o mesmo tempo de experiência e calculou-se a % de inibição de fecho da ferida com controlos com o mesmo tempo de experiência.

Os resultados destas experiências são apresentados na figura 21. Na gama de dose baixa (lCh14-lCh9 Μ) o 24 mero e o 1-57 mero de FKBP-L foram inibidores potentes do fecho da ferida. Verificou-se inibição máxima entre lCh10 e lCh9 M e a EC50 foi muito semelhante para ambos os péptidos. Ambos os péptidos apresentaram potência aumentada comparativamente à proteína recombinante completa numa base mole/mole. Em conclusão, o 24 mero e o 1-57 mero são inibidores potentes de migração de células endoteliais.

Exemplo 19: Avaliação de péptidos candidatos abrangendo o domínio ativo de FKBP-L na formação de contactos célula a célula endoteliais usando a membrana de base sintética Matrigel no ensaio de formação de tubo: comparação com FKBP-L recombinante (N=3) Métodos: 0 ensaio de formação de túbulo in vitro usado nestes estudos é uma versão modificada do método descrito por Ashton et ai. (1999). Sucintamente, efetuaram-se ensaios usando placas de multipoços de 24 poços BD BioCoat™ Matrigel™ Matrix Thin Layer (BD Discovery Labware, Oxford, UK). Re-hidratou-se a Matrigel™ com 500 μΐ de meio isento de soro MCDB-131 e incubou-se a 37 °C durante 30 min. Removeu-se o excesso de meio e inocularam-se HMEC-1 a uma densidade de 1 x 105 e incubaram-se as placas a 37 °C sob CO2 a 5%/ar a 95% durante 1 h. Usaram-se concentrações crescentes de 24 mero de FKBP-L (SEQ ID NO: 10) e 1-57 mero (SEQ ID NO: 6) de 10-14-10-6 M.

Incubou-se a placa durante mais 18 h. Avaliou-se o grau de formação de túbulos entre células HMEC-1 adjacentes em cada poço em cinco campos de visão, por contagem do número de contactos célula a célula entre células HMEC-1 diferentes na área especificada. Um investigador independente avaliou cada poço e os poços tratados com FKBP-L foram comparados a controlos com tratamento simulado.

Os resultados apresentam-se na figura 22. Tanto o 24 mero de FKBP-L, como o 1-57 mero de FKBP-L inibiram a capacidade das HMEC-1 formarem contactos célula a célula ou túbulos em Matrigel, de uma forma dependente da dose. O 1-57 mero foi mais eficaz neste ensaio com um EC50=0,7 pM, comparativamente a 30 pM para o 24 mero. Em conclusão, os dados sugerem que o 24 mero de FKBP-L e o 1-57 mero de FKBP-L são inibidores potentes da formação de tubo endotelial.

Exemplo 20: O efeito de péptidos candidatos que abrangem o domínio ativo de FKBP-L na germinação angiogénica usando o ensaio de anel aórtico de rato. O efeito no comprimento médio, comprimento máximo e número de vasos formados (n=3); comparação com a proteína recombinante completa

Eutanizaram-se ratos "Wistar" machos e removeu-se asseticamente a aorta torácica e seccionou-se em anéis de 1 cm de espessura. Os anéis foram lavados dez vezes em meio estéril para remover quaisquer bactérias e embebidos em Matrigel em placas de 24 poços. Suplementaram-se os poços com 2 ml de meio e concentrações crescentes de 24 mero de FKBP-L (SEQ ID NO: 10) e 1-57 mero de FKBP-L (SEQ ID NO: 6) e FKBP-L recombinante (SEQ ID NO:1). A placa foi avaliada cegamente por um investigador independente e quantificada usando uma grade ocular calibrada (1 mm/graduação de 100 pm) a uma ampliação de 2 0x (Olympus BX 50) . Mediu-se a extensão do comprimento de vasos, comprimento máximo de vasos e número de vasos em cada campo de visão e comparou-se com controlos com tratamento simulado e o mesmo tempo de experiência e calculou-se a % de inibição.

Os resultados destas experiências são apresentados nas figuras 23-24. Verificou-se que tanto o 24 mero de FKBP-L, como o 1-57 mero de FKBP-L foram ativos neste ensaio quando avaliados pelos três parâmetros, i.e. extensão de comprimento de vasos, comprimento máximo de vasos e número de vasos (figura 23A e 23B, respetivamente). No entanto, neste ensaio o 24 mero foi o mais potente, especialmente em termos do número de vasos, com um IC50:0,2 pM comparativamente a 0,53 nM para o 1-57 mero e 1,56 nM para FKBP-L recombinante completa (figura 24A e 24B). O 24 mero também apresenta alguma atividade bifásica. Estes dados sugerem que o 24 mero pode ser o mais potente na inibição da germinação de vasos inicial e daí a diminuição do número de vasos. Em resumo, o 24 mero e o 1-57 mero de FKBP-L e a FKBP-L recombinante inibem potentemente a angiogénese.

Exemplo 21: 0 efeito do 24 mero de FKBP-L em invasão celular num sistema de câmara Boyden modificado (N=3) .

Este ensaio mede a capacidade das células migrarem e invadirem. As células endoteliais microvasculares necessitam de migrar e invadir a matriz extracelular (ECM) após estímulo angiogénico. Além disso, é necessário que as células de tumor migrem e invadam a ECM de modo a alastrar/metastizar outros locais. Avaliaram-se HMEC-1 (células endoteliais microvasculares; CD44+ve) e duas linhas de células tumorais, MDA-231 (mama; CD44+ve) e PC3 (próstata; CD44+ve) para o seu potencial invasivo na presença do 24 mero de FKBP-L.

Dividiram-se doze inserções de poços de placas de policarbonato em dois grupos, permanecendo metade não revestidas e metade revestidas com Matrigel a 100 pg/cm2. Deixaram-se as inserções revestidas secar durante a noite à temperatura ambiente numa câmara de cultura de tecidos estéril. Tripsinizou-se a linha celular necessária; HMEC-1, PC3 ou MDA231, ressuspendeu-se em meio fresco e calculou-se o número de células. Adicionaram-se 5xl05 células, num volume total de 500 μΐ, à inserção (câmara superior) e adicionou-se 1,5 ml de meio completo à câmara inferior como um estímulo para invasão. Adicionou-se 24 mero de FKBP-L tanto à câmara superior, como à inferior da placa à concentração necessária dos poços experimentais. Incubou-se a placa durante 24 h (PC3 ou MDA231) ou 48 h (HMEC-1).

Removeram-se cuidadosamente as inserções das suas placas de 12 poços e colocaram-se as inserções sem revestimento de Matrigel diretamente em fixador Carnoys. Limpou-se a superfície superior das inserções que estavam revestidas com Matrigel com um cotonete, para remover células não invasoras. Colocaram-se então as inserções em Carnoys e deixaram-se durante 10 min.

Removeram-se as inserções da solução de Carnoys e deixou-se secar ao ar durante 20 min. Coraram-se as inserções secas com Hoescht (50 ng.ml-1) durante 30 min, antes de lavar com água destilada.

Cortaram-se as inserções de policarbonato dos suportes e colocaram-se em meio de montagem numa lâmina de microscópio.

Aplicou-se uma lamela e selou-se com verniz das unhas. Armazenaram-se as lâminas a 4 °C até serem analisadas.

Capturaram-se dez imagens de cada inserção e analisou-se o número de células fluorescentes por imagem, através do utilitário Lucia Imaging. A razão de células visíveis nas inserções não revestidas comparativamente às células visíveis nas inserções revestidas com Matrigel foi expressa como % de invasão. A percentagem (%) de invasão no controlo foi então comparada com células tratadas com 24 mero.

Os resultados apresentam-se na figura 25. Pode verificar-se que o 24 mero de FKBP-L (SEQ ID NO: 10) é um inibidor potente de invasão de células HMEC-1, PC3 e MDA-231. Além de proporcionarem dados adicionais que corroboram a inibição da migração de HMEC-1, os dados indicam que o 24 mero de FKBP-L também pode inibir invasão através de Matrigel; uma etapa importante do processo angiogénico. Os dados também indicam que as metástases de tumores CD44+ve poderiam ser inibidas num cenário clínico.

Exemplo 22: O efeito do 24 mero de FKBP-L em adesão celular (N=3)

Este ensaio mede a capacidade das células aderirem. Esta é uma característica importante de angiogénese e metástase. Os mediadores importantes de recrutamento e aderência de leucócitos ao endotélio incluem E-selectina, VCAM-1 e ICAM-1 que são regulados positivamente durante inflamação, iniciando adesão de leucócitos ao endotélio e contribuindo ultimamente para progressão da doença ou lesão do tecido.

Prerrevestiu-se uma placa de 96 poços com uma camada fina de Matrigel que se deixou assentar durante a noite. Bloquearam-se os poços da placa com BSA a 0,5% durante 1 h a 37 °C num incubador de ar a 95%/CC>2 a 5%. Tripsinizaram-se células endoteliais microvasculares humanas (HMEC-1), ressuspenderam-se em meio fresco e inocularam-se a uma densidade de 20000 células por poço. Colocaram-se as placas a 4 °C durante 10 min para permitir a sedimentação das células no fundo dos poços. Adicionou-se a quantidade necessária de meio suplementado com o 24 mero de FKBP-L a cada poço e incubou-se a placa durante 1 h a 37 °C. Removeu-se o excesso de meio e células que não aderiram e lavaram-se os poços três vezes com PBS estéril. Suplementaram-se os poços com meio fresco e adicionou-se MTT (5 mgml-1) . Incubou-se a placa durante mais 4 h a 37 °C. Adicionou-se DMSO a cada poço para solubilizar o MTT a formazano e leu-se a placa a 540 nm, com a absorvância relativa dos poços de controlo comparada com poços suplementados com 24 mero de FBKP-L.

Os resultados apresentam-se na figura 26. Pode verificar-se que o 24 mero de FKBP-L é um inibidor potente de adesão de HMEC-1. Além de proporcionar dados adicionais que corroboram a inibição de migração e invasão de HMEC-1, este ensaio também indica que o 24 mero de FKBP-L pode inibir adesão, uma etapa importante do processo angiogénico e outros estados de doença.

Exemplo 23: O efeito do 24 mero de FKBP-L em migração de células de tumor MDA-231 e PC3 (N=3) O ensaio de migração in vitro usado nestes estudos é uma versão modificada do método descrito por Ashton et al. (1999) consultar anteriormente. Plaquearam-se células MDA231 (linha de células de tumor de mama; CD44 +ve) e PC3 (linha de células de tumor da próstata; CD44 +ve) em câmaras individuais numa lâmina de vidro e cultivaram-se durante a noite até 90% de confluência. Removeu-se o meio e feriram-se as monocamadas. Ressuplementou-se a monocamada com meio fresco e adicionou-se o volume necessário de 24 mero de FKBP-L (SEQ ID NO: 10) para obter a concentração final necessária (10~14-10~7 M) . Incubaram-se as monocamadas durante 24 h e seguidamente fixaram-se em paraformaldeido tamponado com PBS a 4%. A extensão de fecho da "ferida" foi avaliada cegamente por microscopia por um investigador independente e quantificada usando uma grade ocular calibrada (1 mm/graduação de 100 pm) a uma ampliação de 20x (Olympus BX 50) . A extensão de fecho nas lâminas tratadas com FKBP-L foi comparada a controlos com tratamento simulado com o mesmo tempo de experiência e calculou-se a % de inibição de fecho da ferida relativamente a controlos com o mesmo tempo de experiência.

Os resultados apresentam-se na figura 27A (células MDA-23) e 27B (células PC3). Verificou-se que o 24 mero de FKBP-L pode inibir migração de células de tumor MDA-231 e PC3. Estas são linhas de células de tumor CD44+ve, indicando uma vez mais que FKBP-L pode atuar através de CD44, de modo semelhante ao verificado para a proteína recombinante completa (figura 17). Os dados sugerem que o 24 mero de FKBP-L poderia inibir metástases de tumor num subconjunto de linhas de tumor CD4 4 +ve.

Exemplo 24: 0 24 mero de FKBP-L é um inibidor angiostático (N=3)

De modo a determinar se o 24 mero de FKBP-L exerceu um efeito permanente ou estático na germinação de células endoteliais, usou-se o ensaio de anel aórtico de rato. Eutanizaram-se ratos "Wistar" machos e removeu-se asseticamente a aorta torácica e seccionou-se em anéis de 1 cm de espessura. Os anéis foram lavados dez vezes em meio estéril para remover quaisquer bactérias e embebidos em Matrigel em placas de 24 poços. Suplementaram-se os poços com 2 ml de meio. As placas foram incubadas até 15 dias. Fotografaram-se os anéis em Matrigel todos os dias e recolocaram-se no seu incubador. Efetuaram-se duas experiências adicionais: (A) adição de 24 mero de FKBP-L ao meio, após crescimento dos vasos durante sete dias; e (B) adição de 24 mero de FKBP-L ao meio no estágio de embebimento inicial, com remoção subsequente após sete dias e substituição por meio fresco durante sete dias adicionais. A extensão de desenvolvimento de vasos foi quantificada usando uma grade ocular calibrada (1 mm/graduação de 100 pm) a uma ampliação de 20x (Olympus BX 50) e medida eletronicamente usando o utilitário de imagem Lucia. Mediu-se o comprimento de vaso e comparou-se com controlos com tratamento simulado e o mesmo tempo de experiência e calculou-se a percentagem (%) de inibição.

Os resultados apresentam-se na figura 28A e 28B. Nas condições de controlo verificou-se desenvolvimento de vasos entre os dias 3 e 14, atingindo um máximo de 1400 pm ao dia 14. Numa experiência paralela deixaram-se desenvolver os vasos durante sete dias (aprox. 800 pm), removeu-se o meio e ressuplementou-se com meio que continha 24 mero de FKBP-L 10~9 Μ. A adição do 24 mero causou inibição completa do desenvolvimento de vasos comparativamente a controlos com o mesmo tempo de experiência (figura 28A).

Numa experiência inversa (figura 28B), os anéis aórticos foram expostos inicialmente a meio suplementado com o 24 mero de FKBP-L e incubados durante sete dias. 0 24 mero de FKBP-L inibiu quase completamente o desenvolvimento de vasos. Removeu-se o meio suplementado com 24 mero de FKBP-L dos anéis e adicionou-se meio fresco, resultando em continuação do crescimento dos vasos.

Estas experiências sugerem que o 24 mero de FKBP-L inibe o desenvolvimento de vasos de uma forma angiostática e quando os vasos estão maduros ou embebidos de fresco.

Exemplo 25: 0 24 mero de FKBPL (SEQ IN NO: 10) inibe angiogénese in vivo usando o ensaio de esponja; comparação com FKBPL recombinante completa (N=l, 3 ratinhos por grupo)

Esta experiência avaliou a capacidade do 24 mero de FKBP-L para inibir angiogénese, usando o ensaio de esponja de ratinho. Implantaram-se subcutaneamente esponjas de poliéter em ratinho pretos C57 no dia 0 e injetaram-se em dias alternados com (a) 10 ng de controlo de bFGF (3 ratinhos) (b) 10 ng de fator de crescimento de fibroblastos bovino (bFGF) + 5 pg de FKBPL recombinante completa marcada com his (equivalente a 3,2 x 10~6 M in vitro) (3 ratinhos) (c) 10 ng de bFGF + 0,35 pg de 24 mero de FKBPL (equivalente molar de 5 pg de FKBPL recombinante completa) (3 ratinhos) ou (d) 0,11 ng de 24 mero de FKBPL (equivalente a 10~9 M in vitro) (3 ratinhos).

Todos os ratinhos foram sacrificados no dia 21. Removeram-se as esponjas, fixaram-se e embeberam-se em parafina. Coraram-se secções de cinco micra com hematoxilina e eosina. Contaram-se cegamente os vasos por 3 avaliadores independentes, usando uma ampliação de x40, em 10 campos por secção. A contagem média por esponja/ratinho foi então representada graficamente para cada avaliador.

Os resultados apresentam-se na figura 29. Pode verificar-se que a injeção apenas de bFGF resultou num número significativo de crescimento de vasos para a esponja (média de n2 de vasos/campo x40 = 10). Verificou-se uma diminuição de 50% do número de vasos nas esponjas tratadas conjuntamente com bFGF e 5 yg de FKBPL recombinante completa. Verificou-se uma diminuição de 80% do número de vasos nas esponjas tratadas conjuntamente com bFGF e 0,35 yg de 24 mero de FKBPL. Mesmo à dose mais baixa de 24 mero de FKBPL, o número de vasos diminuiu em 70% comparativamente a esponjas tratadas apenas com bFGF. Estes resultados mostram que o 24 mero de FKBPL pode inibir angiogénese in vivo, sugerindo potencial valor terapêutico num cenário clinico. Os dados também indicam que o 24 mero de FKBPL pode ser mais potente do que a proteína FKBPL completa na inibição de angiogénese.

Exemplo 26: Avaliação do péptido de 24 mero de FKBPL (SEQ IP NO: 10) numa linha de células endoteliais de ratinho usando o ensaio de raspagem de ferida

Esta experiência avaliou a capacidade do 24 mero de FKBP-L para inibir a migração de células endoteliais numa gama de doses de 10-14 M a 1CV7 Μ. O ensaio de migração in vitro usado nestes estudos é uma versão modificada do método descrito por Ashton et ai (1999) consultar anteriormente. Neste ensaio as células endoteliais de ratinho, 2H-11, foram obtidas de American Tissue Culture Collection e foram cultivadas em D-MEM contendo FCS a 10%. Foram plaqueadas em câmaras individuais numa lâmina de vidro e cultivadas durante a noite até 90% de confluência. Removeu-se o meio e feriu-se a monocamada. Ressuplementou-se a monocamada com meio fresco e adicionou-se o volume necessário do péptido de 24 mero de FKBPL para obter uma gama de dose de 10-14-10-7 M. Incubaram-se as monocamadas durante 7 horas e seguidamente fixaram-se em paraformaldeído tamponado com PBS a 4%. A extensão de fecho da "ferida" foi avaliada cegamente por microscopia por um investigador independente e quantificada usando uma grade ocular calibrada (1 mm/graduação de 100 ym) a uma ampliação de 20x (Olympus BX 50) . A extensão de fecho nas lâminas tratadas com o 24 mero de FKBP-L foi comparada a controlos com tratamento simulado com o mesmo tempo de experiência e calculou-se a % de inibição de fecho da ferida relativamente a controlos com o mesmo tempo de experiência.

Os resultados destas experiências apresentam-se na figura 30. Pode verificar-se que o 24 mero de FKBPL inibiu o fecho da ferida em células endoteliais de ratinho. A inibição máxima verificou-se entre 10~9 e 10-11 M. Os dados demonstram que o 24 mero de FKBPL inibe a migração de células endoteliais de ratinho e como tal pode ser um inibidor de migração celular, angiogénese e metástases. Os dados corroboram as experiências in vivo efetuadas em ratinhos aqui descritas (e.g. figuras 8, 9, 15, 29 e 31) .

Exemplo 27: O péptido de 24 mero de FKBP-L (QIRQQPRDPPTETLELEVSPDPAS) é um inibidor potente de crescimento de tumor DU145 in vivo após injeção IP diária (N=l, 6 ratinhos por grupo de tratamento)

Cultura celular

Obtiveram-se células Dul45 (carcinoma da próstata) de Cancer Research, UK e cultivaram-se em meio RPMI 1640 (Invitrogen), suplementado com soro fetal de vitelo a 10%. Todas as linhas celulares foram cultivadas em monocamadas, incubadas a 37 °C sob CO2 a 5%.

Modelo de xenoenxerto de cancro da próstata

Usaram-se 24 ratinhos (Harlan) machos imunocomprometidos (imunodeficiência combinada grave). Aclimataram-se os ratinhos e colocaram-se em gaiolas em grupos de 5 ou menos num isolador. Cultivaram-se células Dul45 (carcinoma da próstata), tal como descrito anteriormente. Recolheram-se células subconfluentes e ajustou-se a concentração celular a 5xl07 células/ml em PBS. Raspou-se o dorso de cada ratinho. Após administração do anestésico, cada ratinho recebeu injeções intradérmicas de 5xl06 células de tumor Dul45 (100 μΐ) bilateralmente no dorso traseiro, com uma agulha de calibre 26. Deixaram-se crescer os tumores até atingirem um volume de 150-175 mm3. Os ratinhos foram divididos aleatoriamente em quatro grupos de tratamento: (a) Controlo: apenas PBS (8 ratinhos); (b) péptido de 24 mero de FKBPL: 0,3 mg/kg/dia (6 ratinhos); (c) péptido de 24 mero de FKBPL: 3xl0~3 mg/kg/dia (6 ratinhos); e (d) péptido de 24 mero de FKBPL: 3x10~4mg/kg/dia (5 ratinhos).

Os ratinhos receberam injeções IP diariamente (100 μΐ) dos tratamentos anteriores. Registou-se o peso e o volume de tumor de cada ratinho de 2 em 2 dias. Calculou-se o volume de tumor como: comprimento x largura x altura x 0,5236. Vinte um dias após o tratamento inicial sacrificaram-se os seguintes animais: 0,3 mg/kg/dia de 24 mero de FKBPL (2 ratinhos), 3xl0~3 mg/kg/dia (2 ratinhos), 3xl0~4 mg/kg/dia (1 ratinho) e PBS (2 ratinhos). Excisaram-se os tumores e armazenaram-se em solução salina de formalina para análise histopatológica futura.

Os resultados apresentam-se na figura 31. Pode verificar-se que o tratamento com injeção i.p. com o péptido de 24 mero de FKBPL a doses de 0,3 mg/kg/dia ou de 3xl0~3 mg/kg/dia atrasou significativamente o crescimento de tumores DU145 em ratinhos SCID, comparativamente a tumores tratados apenas com veiculo (figura 31A) . Alguns dos tumores tratados com as doses mais eficazes de péptido de 24 mero de FKBPL apresentaram evidência de um centro necrótico, i.e. apresentavam uma aparência em coroa cilíndrica. Tal é típico dos efeitos observados com antiangiogénicos.

Apresenta-se um conjunto completo de dados na figura 31A. Note-se que se excluíram os dois animais tratados com controlo de PBS dos dados apresentados na figura 31A. O primeiro animal de controlo foi excluído porque o seu tumor foi comido por outro animal; o outro animal de controlo foi excluído porque o seu tumor foi erradamente implantado demasiado perto da cauda, o que se sabe que restringe o crescimento de tumor.

Representaram-se graficamente curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier usando o tempo para os tumores atingirem 3x o seu volume de tratamento como critério para sacrifício (figuras 31B-D) . Pode verificar-se nitidamente que os tumores de animais tratados com 24 mero de FKBPL, tanto a 0,3 mg/kg/dia (figura 31B) , como a 0,003 mg/kg/dia (figura 31D) atingiram 3x o seu volume de tratamento significativamente mais tarde do que os controlos. Todos exceto dois tumores (de 6) do grupo de tratamento de 0,3 mg/kg/dia e um (de 6) do grupo de tratamento de 0,003 mg/kg/dia não atingiram o triplo do seu volume durante a duração da experiência. No entanto, os tumores que atingiram 3x o seu volume de tratamento estavam nitidamente necróticos por inspeção grosseira. Assim, estes tumores também foram sensíveis, mas o seu maior tamanho foi causado por necrose extensa e não por células de tumor viáveis. Os tumores em animais tratados com a dose mais baixa de 0,0003 mg/kg/dia não foram significativamente diferentes dos controlos.

Nenhum dos animais perdeu peso após tratamento diário com 0 24 mero sugerindo gue é bem tolerado e não é gravemente tóxico (figura 31E).

Exemplo 28: O efeito de péptidos candidatos que abrangem o domínio ativo de FKBP-L na viabilidade ou proliferação de HMEC- 1 usando o ensaio de MTT (N = 3)

Usou-se um ensaio de MTT para medir viabilidade e/ou proliferação celular. Sucintamente, inocularam-se células HMEC-1 (2,5 X 103) em placas de 96 poços e deixaram-se aderir durante 5 h. Trataram-se as células com 24 mero de FKBP-L (SEQ ID NO: 10) (10-5-10-10 M) , 1-57 mero de FKBP-L (SEQ ID NO: 6) (IO-9 M e lCh10 M) ou meio (controlo) .

Após incubação, as células foram expostas a uma solução de 3-(-4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT) a 5 mgml-1 durante 4 h. Aspiraram-se as células e adicionou-se 200 μΐ de DMSO para reduzir o sal e induzir uma mudança de cor. Analisaram-se os poços colorimetricamente a 550 nm e compararam-se os resultados com células de controlo não tratadas.

Os resultados apresentam-se nas figuras 32 e 33. A figura 32 apresenta uma gama de doses para tratamento de células com o 24 mero de FKBP-L e as figuras 33A e 33B apresentam o efeito do 24 mero de FKBP-L e do 1-57 (57 mero) de FKBP-L após 24 horas e 48 horas, respetivamente. Pode verificar-se gue nenhum dos péptidos teve gualguer efeito significativo na proliferação de células HMEC-1 comparativamente a controlos com o mesmo tempo de experiência, em gualguer dos pontos temporais medidos, sugerindo gue os efeitos antiangiogénicos verificados nos ensaios anteriores não foram causados por inibição do crescimento celular ou por toxicidade mediada por péptido.

Exemplo 29: Análise dos péptidos truncados baseados em 24 mero de modo a avaliar a importância de cada péptido em termos de inibição de migração celular, usando o ensaio de raspagem de ferida 0 ensaio de migração in vitro usado nestes estudos é uma versão modificada do método descrito por Ashton et al. (1999) consultar anteriormente. Plaquearam-se HMEC-1 em câmaras individuais numa lâmina de vidro e cultivaram-se durante a noite até 90% de confluência. Removeu-se o meio e feriram-se as monocamadas. Ressuplementou-se a monocamada com meio fresco e adicionou-se o volume necessário de cada péptido (i.e., péptidos 1-17, SEQ ID NOS: 12-28; tabela 4 seguidamente) para obter a concentração final necessária (10_14-10-6 M) .

Para preparar o péptido 1, ligou-se o fluoróforo Alexa488 (Invitrogen) à funcionalidade sulfidrilo da cadeia lateral de um resíduo de cisteína que foi colocado no terminal C da sequência de 24 mero. Usou-se um espaçador PEG para ligar este resíduo de cisteína do terminal C ao terminal C da sequência de 24 mero. Tal foi efetuado durante a síntese do péptido por incorporação do bloco de montagem disponível comercialmente ácido Fmoc-8-amino-3,6-dioxaoctanóico, um espaçador de polietilenoglicol (NeoMPS) para obter um espaçador -PEG entre a sequência de 24 mero e a cisteína marcada com Alexa do terminal C. O espaçador PEG/fluoróforo tem a estrutura: -NH-(CH2)20-(CH2) 2O-(CH2) -CO-Cys-(Alexa488) . Os outros péptidos também foram preparados por incorporação de blocos de montagem disponíveis comercialmente para gerar os péptidos 2-17 seguidamente.

Incubaram-se as monocamadas durante 24 h e seguidamente fixaram-se em paraformaldeido tamponado com PBS a 4%. A extensão de fecho da "ferida" foi avaliada cegamente por microscopia por um investigador independente e quantificada usando uma grade ocular calibrada (1 mm/graduação de 100 pm) a uma ampliação de 20x (Olympus BX 50). A extensão de fecho nas lâminas tratadas com FKBP-L foi comparada a controlos com tratamento simulado com o mesmo tempo de experiência e calculou-se a % de inibição de fecho de ferida comparativamente a controlos com o mesmo tempo de experiência.

Os resultados para os péptidos 1-12 são apresentados nas figuras 34A-L, respetivamente, e na tabela 5.

Verificou-se que o péptido 12 apresentou atividade que foi aproximadamente igual à do 24 mero de FKBP-L. Estes dados sugerem que alguns péptidos derivados de FKBP-L apresentam uma resposta à dose bifásica. Os dados também sugerem que a subregião -QQPRDPPTETLELEVSPD- (SEQ ID NO: 11) pode ser um domínio antiangiogénico potente. Os dados indicam adicionalmente que um fragmento de SEQ ID NO: 10 incluindo 18 ou mais aminoácidos contíguos (consultar e.g., péptido 5, SEQ ID NO: 16; péptido 12, SEQ ID NO: 23 e SEQ ID NO: 11) podem ser ativos como um agente antiangiogénico. Na figura 1 apresentam-se péptidos adicionais incluindo este domínio.

Exemplo 30: Análise de FKBP-L recombinante purificado

Expressão de proteína FKBP-L recombinante

Expressou-se FKBP-L (variante Thrl81, Glyl86), clonada para os locais Bamtil e PstI do vetor pRSET-A, em BL21 (DE3) para obter a proteína correspondente marcada com poli-histidina no terminal N (SEQ ID NO: 1). A expressão foi induzida a DO de 0,6 com IPTG 0,2 mM, cultivando as células durante a noite a 15 °C. Sedimentaram-se as células por centrifugação e armazenaram-se a -20 °C.

Purificação de FKBP-L recombinante A purificação de proteína foi efetuada em condições desnaturantes, com uma etapa de re-enrolamento na coluna. Lisaram-se as células em tampão de lise (NaH2P04 100 mM, pH 8,0, Tris 10 mM, ureia 8 M, NaCl 150 mM, -mercaptoetanol 5 mM) por sonicação em gelo durante 3x 2 min, com arrefecimento. Removeram-se os resíduos celulares e material insolúvel por centrifugação a 31 100 rcf durante 20 min a 4 °C. Filtrou-se o sobrenadante com uma seringa de filtro com um filtro de 0,45 pm.

Equilibrou-se uma coluna de 5 ml de HisTrap HP com tampão de ligação (ureia 8 M, NaCl 0,5 M, tampão de fosfato de sódio 20 mM pH 8,0, -mercaptoetanol 5 mM) e carregou-se o lisado celular para a coluna. Lavou-se a coluna com 10 volumes de coluna de tampão de lavagem (ureia 8 M, NaCl 0,5 M, tampão de fosfato de sódio 20 mM, pH 8,0, imidazole 20 mM, mercaptoetanol 5 mM) , seguidamente re-equilibrou-se no tampão de ligação.

Re-enrolou-se a proteína ligada lentamente em 30 ml de um gradiente linear de 0-100% de tampão de re-enrolamento (imidazole 5 mM, NaCl 0,5 M, tampão de fosfato de sódio 20 mM, pH 7,4, -mercaptoetanol 1 mM) , seguido por 5 min a tampão de re-enrolamento a 100%.

Eluíram-se as proteínas ligadas em 30 ml de gradiente linear de tampão de eluição de 0-100% (imidazole 500 mM, NaCl 0,5 M, tampão de fosfato de sódio 20 mM, pH 7,4, -mercaptoetanol 1 mM) . Analisaram-se as frações por SDS PAGE e agruparam-se de acordo com os resultados. Para diminuir as concentrações de imidazole, NaCl e -mercaptoetanol, dialisou-se a proteína contra tampão de fosfato de sódio 20 mM, pH 7,4 com NaCl 150 mM (figura 35A) ou passou-se por uma coluna preparativa HiLoad 26/60 Superdex75 26/60 em tampão de fosfato de sódio 20 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, imidazole 5 mM (figura 35C e figura 36) . Compararam-se as amostras de FKBP-L recombinante por SDS PAGE (figuras 35A e 35B) e PAGE nativo (figura 35C, figura inserida) . HPLC analítico e espectrometria de massa

Adicionaram-se amostras de 50 pg de FKBP-L recombinante sem e com DTT 100 mM numa coluna analítica Jupiter 5u c5 com um gradiente de acetonitrilo de 0-73% durante 30 minutos. Recolheram-se os picos e analisaram-se por espectrometria de massa por eletrovaporização.

Análise de permeação em gel

Adicionaram-se os seguintes padrões de peso molecular a uma coluna Superosel2 10/300 GL em tampão (NaTLPCg 20 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, imidazole 5 mM): azul de dextrano, álcool desidrogenase, albumina de soro bovina, ovalbumina, anidrase carbónica e citocromo c. Usaram-se os volumes de eluição dos picos para calcular Kav para FKBP-L recombinante completa a partir do qual se pôde calcular a massa molecular a partir da curva de calibração.

Calculou-se Kav como:

Kav = (Ve-Vo) / (Vt-Vo) em que Ve é o volume de eluição, Vo é o volume vazio (volume de eluição para azul de dextrano) e Vt é o volume total da coluna. Representou-se graficamente Kav em função do logaritmo do peso molecular para obter uma reta, a partir da qual se extraiu a equação e se usou para estimar o peso molecular para um determinado Ve.

Para a análise, usaram-se amostras de 140 pg de FKBP-L recombinante com e sem DTT 100 mM nas mesmas condições e estimaram-se as massas moleculares a partir de Ve, tal como descrito anteriormente. Além disso, a coluna foi equilibrada em tampão +DTT 1 mM e analisou-se uma amostra adicional de FKBP-L pretratada com DTT nestas condições (figura 36).

Reticulação de proteína usando glutaraldeído

Adicionou-se uma concentração final de 1% de glutaraldeído a 25 pg de FKBP-L recombinante (dialisada) em 500 pl de tampão (NafbPCb 20 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, imidazole ~5 mM) durante 30 segundos. Parou-se a reação por adição de NaBTU, precipitou-se a proteína com desoxicolato de Na e TCA e analisou-se por SDS PAGE em condições redutoras (figura 37).

Estas experiências mostraram que a proteína FKBP-L recombinante aqui expressa, purificada e dialisada apresentou pureza de uma única banda por análise de SDS PAGE em condições redutoras (figura 35A) . A análise por SDS PAGE e análise por PAGE nativo de FKBP-L (figura 35B e figura 35C, respetivamente) em condições não redutoras (figura 35B pista 3 e figura 35C) e condições redutoras (figura 35B pista 4 e figura 35C) mostra que FKBP-L forma espécies multiméricas de maior peso molecular, através da formação de ligação dissulfureto intermolecular entre resíduos de cisteína no interior da proteína. A análise por HPLC analítico de FKBP-L recombinante seguida por espectrometria de massa por eletrovaporização proporcionou uma massa de 42 257 (valor esperado de 42 220) para FKBP-L reduzida, confirmando a identidade da proteína.

Usou-se análise de permeação em gel para tentar obter informação sobre a estrutura quaternária da FKBP-L recombinante (figura 36) . Nas condições descritas, a FKBP-L reduzida elui com um volume de eluição médio de 12 ml. A partir da calibração da coluna com uma série de padrões de peso molecular, um volume de eluição de 12 ml corresponde a uma massa de 99 KDa. De igual modo, a reticulação com glutaraldeído de FKBP-L recombinante na presença de DTT mostrou consistentemente uma banda na análise de SDS PAGE a 97 kDa (figura 37). Estes resultados indicam que FKBP-L pode formar espécies homodiméricas e/ou homotriméricas através de associação não covalente. Tal é consistente com a presença prevista de repetições de tetratricopéptido dentro da sequência de aminoácidos de FKBP-L, que se sabe que induzem trimerização noutras proteínas.

Exemplo 31: Geração de anticorpos contra FKBP-L FKBP-L (variante Thrl81, Glyl86, clonada para locais BamHI e PstI do vetor pRSET-A, foi expressa em BL21 (DE3) para obter a proteína correspondente marcada com poli-histidina no terminal N (SEQ ID NO: 1) . Transformou-se um clone com sequência verificada para células de E. coli BL21(DE3) e cultivadas até fase logarítmica e a expressão da proteína alvo foi induzida por adição de isopropil-b-D-tiogalactosídeo (IPTG, 1 mM) e incubada durante 4 horas adicionais a 37 °C. Ressuspenderam-se os sedimentos celulares e lisaram-se em NaH2P04 50 mM, pH 8,0, contendo ureia 8 M, NaCl 300 mM e imidazole 10 mM. Clarificou-se o lisado desnaturado impuro por centrifugação (10000 g, 60 minutos a 4 °C), antes de aplicação a uma coluna IMAC carregada com uma coluna de 1 ml HiTrap com iões Ni2+ (GE Healthcare) .

Lavou-se o material ligado não especificamente da coluna usando NalHhPCd 50 mM, pH 8,0, contendo ureia 8 M, NaCl 300 mM e imidazole 20 mM, seguido por re-enrolamento na coluna por redução da ureia de 8 para 0 M ao longo de 200 volumes de coluna. Lavou-se o material ligado à coluna re-enrolado com 20 volumes de coluna adicionais de NaBMPCt 50 mM, pH 8,0, NaCl 300 mM e imidazole 20 mM, seguidamente eluiu-se com NatMPCd 50 mM, pH 8,0, NaCl 300 mM e imidazole 250 mM. Recolheram-se as frações de proteína e dessalinizaram-se para PBS.

Imunizaram-se coelhos (seguindo as orientações padrão do United Kingdom Home Office) com administração da proteína recombinante e reforços de 3 em 3 semanas, até se completaram quatro reforços. Recolheu-se soro e avaliou-se contra FKPP-L recombinante (gerada como o antigénio) por análise de hibridação "western". Detetou-se uma banda de FKBPL de aproximadamente 39 kDa.

As concretizações da presente invenção proporcionam assim métodos e composições compreendendo FKBP-L. Em determinadas concretizações, FKBP-L e os seus fragmentos de péptido são polipéptidos com utilidade clínica como agentes antiangiogénicos e/ou antimetastáticos para uso no tratamento de cancro e/ou outras condições em que seria expetável que tal terapia tivesse um resultado de prognóstico positivo. O polipéptido apresenta efeitos de inibição de crescimento demonstráveis em células de cancro selecionadas, indicativos de um potencial efeito terapêutico secundário ou primário em tumores especificados.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Almac Sciences Limited Robson, Tracy Valentine, Andrea 0' Rourke, Martin Hirst, David <120> FKBP-L e seus usos <130> 56178-343800 <150> UK 0611405.2 <151> 2006-06-09 <160> 58 <170> Patentln versão 3.3

<210> 1 <211> 385 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 Ο 0> 1

Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser Met Thr 15 10 15

Gly Gly Gin Gin Met Gly Arg Asp Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys Asp 20 25 30

Arg Trp Gly Ser Met Glu Thr Pro Pro Val Asn Thr He Gly Glu Lys 35 40 45

Asp Thr Ser Gin Pro Gin Gin Glu Trp Glu Lys Asn Leu Arg Glu Asn 50 S5 60

Leu Asp Ser Val Tie Gin lie Arg Gin Gin Pro Arg Asp Pro Pro Thr 65 70 75 80

Glu Thr Leu Glu Leu Glu Val Ser Pro Asp Pro Ala Ser Gin He Leu 85 50 95

Glu His Thr Gin Gly Ala Glu Lys Leu Val Ala Glu Leu Glu Gly Asp 100 105 110

Ser His Lys Ser His Gly Ser Thr Ser Gin Met Pro Glu Ala Leu Gin 115 120 125

Ala Ser Asp Leu Trp Tyr Cys Pro Asp Gly Ser Phe Val Lys Lys lie 130 135 140

Val lie Arg Gly His Gly Leu Asp Lys Pro Lys Leu Gly Ser Cys Cys 145 150 155 160

Arg Val Leu Ala Leu Gly Phe Pro Phe Gly Ser Gly Pro Pro Glu Gly 165 170 175

Trp Thr Glu Leu Thr Met Gly Val Gly Pro Trp Arg Glu Glu Thr Trp 180 185 190

Gly Glu Leu Ile Glu Lys Cys Leu Glu Ser Met Cys Gin Gly Glu Glu 195 200 205

Ala Glu Leu Gin Leu Pro Gly His Thr Gly Pro Pro Val Gly Leu Thr 210 215 220

Leu Ala Ser Phe Thr Gin Gly Arg Asp Ser Trp Glu Leu Glu Thr Ser 225 230 235 240

Glu Lys Glu Ala Leu Ala Arg Glu Glu Arg Ala Arg Gly Thr Glu Leu 245 250 255

Phe Arg Ala Gly Asn Pro Glu Gly Ala Ala Arg Cys Tyr Gly Arg Ala 260 265 270

Leu Arg Leu Leu Leu Thr Leu Pro Pro Pro Gly Pro Pro Glu Arg Thr 275 280 265

Val Leu His Ala Asn Leu Ala Ala Cys Gin Leu Leu Leu Gly Gin Pro 290 295 300

Gin Leu Ala Ala Gin Ser Cys Asp Arg Val Leu Glu Arg Glu Pro Gly 305 310 315 320

His Leu Lys Ala Leu Tyr Arg Arg Gly Val Ala Gin Ala Ala Leu Gly 325 330 335

Asn Leu Glu Lys Ala Thr Ala Asp Leu Lys Lys Val Leu Ala Ile Asp 340 345 350

Pro Lys Asn Arg Ala Ala Gin Glu Glu Leu Gly Lys Val Val Ile Gin 355 360 355

Gly Lys Asn Gin Αθρ Ala Gly Leu Ala Gin Gly Leu Arg Lys Met Phe 370 375 330

Gly 385

<210> 2 <211> 349 <212> PRT <213> Homo sapiens

Met Glu Thr Pro Pro Val Asn Thr lie Gly Glu Lys Asp Thr Ser Gin 15 10 15 <4Ο0> 2

Pro Gin Gin Glu Trp Glu Lys Asn Leu Arg Glu Asn Leu Asp Ser Val 20 25 30

He Gin lie Arg Gin Gin Pro Arg Asp Pro Pro Thr Glu Thr Leu Glu 35 40 45

Leu Glu Val Ser Pro Asp Pro Ala Ser Gin lie Leu Glu His Thr Gin 50 55 60

Gly Ala Glu Lys Leu Val Ala Glu Leu Glu Gly Asp Ser His Lys Ser 65 70 75 80

His Gly Ser Thr Ser Gin Met Pro Glu Ala Leu Gin Ala Ser Asp Leu 85 90 95

Trp Tyr Cys Pro Asp Gly Ser Phe Val Lys Lys lie Val lie Arg Gly 100 105 110

His Gly Leu Asp Lys Pro Lys Leu Gly Ser Cys Cys Arg Val Leu Ala 115 120 125

Leu Gly Phe Pro Phe Gly Ser Gly Pro Pro Glu Gly Trp Thr Glu Leu 130 135 140

Thr Met Gly Val Gly Pro Trp Arg Glu Glu Thr Trp Gly Glu Leu lie 145 150 155 160

Glu Lys Cys Leu Glu Ser Met Cys Gin Gly Glu Glu Ala Glu Leu Gin 165 170 175

Leu Pro Gly His Thr Gly Pro Pro Val Gly Leu Thr Leu Ala Ser Phe 180 185 190

Thr Gin Gly Arg Asp Ser Trp Glu Leu Glu Thr Ser Glu Lys Glu Ala 195 200 205

Leu Ala Arg Glu Glu Arg Ala Arg Gly Thr Glu Leu Phe Arg Ala Gly 210 215 220

Asn Pro Glu Gly Ala Ala Arg Cys Tyr Gly Arg Ala Leu Arg Leu Leu 225 230 . 235 240

Leu Thr Leu Pro Pro Pro Gly Pro Pro Glu Arg Thr Val Leu His Ala 245 250 255

Asn Leu Ala Ala Cys Gin Leu Leu Leu Gly Gin Pro Gin Leu Ala Ala 260 265 270

Gin Ser Cys Asp Arg Val Leu Glu Arg Glu Pro Gly His Leu Lys Ala 275 280 285

Leu Tyr Arg Arg Gly val Ala Gin Ala Ala Leu Gly Asn Leu Glu Lys 290 295 300

Ala Thr Ala Asp Leu Lys Lys Val Leu Ala He Asp Pro Lys Asn Arg 305 310 315 320

Ala Ala Gin Glu Glu Leu Gly Lys Val Val He Gin Gly Lys Asn Gin 325 330 335

Asp Ala Gly Leu Ala Gin Gly Leu Arg Lys Met Phe Gly 340 345

<210> 3 <211> 199 <212> PRT <213> Homo sapiens <4Ο0> 3

Met Glu Thr Pro Pro Val Asn Thr lie Gly Glu Lys Asp Thr Ser Gin 1 S 10 15

Pro Gin Gin Glu Trp Glu Lys Asn Leu Arg Glu Asn Leu Asp Ser Val 20 25 30 lie Gin lie Arg Gin Gin Pro Arg Asp Pro Pro Thr Glu Thr Leu Glu 35 40 45

Leu Glu Val Ser Pro Asp Pro Ala Ser Gin lie Leu Glu His Thr Gin 50 55 60

Gly Ala Glu Lys Leu Val Ala Glu Leu Glu Gly Asp Ser His Lys Ser 65 70 75 Θ0

His Gly Ser Thr Ser Gin Met Pro Glu Ala Leu Gin Ala Ser Asp Leu 05 90 95

Trp Tyr Cys Pro Asp Gly Ser Phe Val Lys Lys lie Val lie Arg Gly 100 105 110

His Gly Leu Asp Lys Pro Lys Leu Gly Ser Cys Cys Arg Val Leu Ala 115 120 125

Leu Gly Phe Pro Phe Gly Ser Gly Pro Pro Glu Gly Trp Thr Glu Leu 130 135 140

Thr Met Gly Val Gly Pro Trp Arg Glu Glu Thr Trp Gly Glu Leu lie 145 150 155 160

Glu Lys Cys Leu Glu Ser Met Cys Gin Gly Glu Glu Ala Glu Leu Gin 165 170 175

Leu Pro Gly His Thr Gly Pro Pro val Gly Leu Thr Leu Ala ser Phe 180 185 1 190

Thr Gin Gly Arg Asp Ser Trp 195

<210> 4 <211> 150 <212> PRT

Met Glu Thr Pro Pro Val Asn Thr lie Gly Glu Lys Asp Thr Ser Gin 15 10 15 <213> Homo sapiens <400> 4

Leu Glu Val Ser Pro Asp Pro Ala Ser Gin lie Leu Glu His Thr Gin 50 55 60

Gly Ala Glu Lys Leu Val Ala Glu Leu Glu Gly Asp Ser His Lys Ser 65 70 75 B0

His Gly Ser Thr Ser Gin Met Pro Glu Ala Leu Gin Ala Ser Asp Leu 65 90 95

Trp Tyr Cys Pro Asp Gly Ser Phe Val Lys Lys lie Val lie Arg Gly 100 105 110

His Gly Leu Asp Lys Pro Lys Leu Gly Ser Cys Cys Arg Val Leu Ala 115 120 125

Leu Gly Phe Pro Phe Gly Ser Gly Pro Pro Glu Gly Trp Thr Glu Leu 130 135 140

Thr Met Gly val Gly Pro 145 150

<210> 5 <211> 85 <212> PRT <213> Homo sapiens

Met Glu Thr Pro Pro Val Asn Thr lie Gly Glu Lys Asp Thr Ser Gin 15 10 15 <4Ο0> 5

Leu Glu Val Ser Pro Asp Pro Ala Ser Gin lie Leu Glu His Thr Gin 50 55 60

Gly Ala Glu Lys Leu Val Ala Glu Leu Glu Gly Asp Ser His Lys Ser 55 70 75 80

His Gly Ser Thr Ser 85

<210> 6 <211> 57 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6

Met Glu Thr Pro Pro Val Asn Thr lie Gly Glu Lys Asp Thr Ser Gin IS 10 15

Pro Gin Gin Glu Trp Glu Lys Asn Leu Arg Glu Asn Leu Asp Ser Val 20 25 30 lie Gin He Arg Gin Gin Pro Arg Asp Pro Pro Thr Glu Thr Leu Glu 35 40 45

Leu Glu Val Ser Pro Asp Pro Ala Ser 50 55

<210> 7 <211> 47 <212> PRT <213> Homo sapiens <4Ο0> 7

Met Glu Thr Pro Pro Val Aan Thr lie Gly Glu Lys Asp Thr Ser Gin IS 10 15

Pro Gin Gin Glu Trp Glu Lys Asn Leu Arg Glu Asn Leu Asp Ser Val 20 25 30

He Gin lie Arg Gin Gin Pro Arg Asp Pro Pro Thr Glu Thr Leu 35 40 45

<210> 8 <211> 39 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8

Met Glu Thr Pro Pro Val Asn Thr He Gly Glu Lys Asp Thr Ser Gin 15 10 15

Pro Gin Gin Glu Trp Glu Lys Asn Leu Arg Glu Asn Leu Asp Ser Val 20 25 30 lie Gin He Arg Gin Gin Pro 35

<210> 9 <211> 33 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9

Met Glu Thr Pro Pro Val Asn Thr lie Gly Glu Lys Asp Thr Ser Gin 15 10 15

Pro Gin Gin Glu Trp Glu Lys Asn Leu Arg Glu Asn Leu Asp Ser Val 20 25 30 lie

<210> 10 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 10

Gin lie Arg Gin Gin Pro Arg Asp Pro Pro Thr Glu Thr Leu Glu Leu 15 10 15

Glu Val Ser Pro Asp Pro Ala Ser 20

<210> 11 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 11

Gin Gin Pro Arg Asp Pro Pro Thr Glu Thr Leu Glu Leu Glu Val Ser 15 10 15

Pro Asp

<210> 12 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <221> LIGAÇÃO <222> (24)..(25) <223> Existe uma ligação PEG (polietilenoglicol) entre os resíduos 24 (serina) e 25 (cistina). <22 0> <221> M0D_RES <222> (25)..(25) <223> Existe um fluoróforo (Alexa488) ligado ao resíduo final (cistina) <4 Ο 0> 12

Gin lie Arg Gin Gin Pro Arg Asp Pro Pro Thr Glu Thr Leu Glu Leu 15 10 15

Glu Val Ser Pro Asp Pro Ala Ser Cys 20 25

<210> 13 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <221> M0D_RES <222> (1) . . (1) <223> 0 ácido glutâmico é modificado para ácido piroglutâmico (PyroGlu) <4 0 0> 13

Glu lie Arg Gin Gin Pro Arg Asp Pro Pro Thr Glu Thr Leu Glu Leu 15 10 15

Glu Val Ser Pro Asp Pro Ala Ser 20

<210> 14 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 14 lie Arg Gin Gin Pro Arg Asp Pro Pro Thr Glu Thr Leu Glu Leu Glu 15 10 15

Val Ser Pro Asp Pro Ala Ser 20

<210> 15 <211> 21 <212> PRT

Gin lie Arg Gin Gin Pro Arg Asp Pro Pro Thr Glu Thr Leu Glu Leu 15 10 15 <213> Homo sapiens <4 0 0> 15

Glu Val Ser Pro Asp 20

<210> 16 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 16

Gin lie Arg Gin Gin Pro Arg Asp Pro Pro Thr Glu Thr Leu Glu Leu 15 10 15

Glu Val

<210> 17 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 17

Gin lie Arg Gin Gin Pro Arg Asp Pro Pro Thr Glu Thr Leu Glu 15 10 15

<210> 18 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 18

Gin lie Arg Gin Gin Pro Arg Asp Pro Pro Thr Glu 1 *5 10 <210> 19

<211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 19

Gin Gin Pro Arg Asp Pro Pro Thr Glu Thr Leu Glu Leu Glu Val Ser 15 10 15

Pro Asp Pro Ala Ser 20

<210> 20 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20

Arg Asp Pro Pro Thr Glu Thr Leu Glu Leu Glu Val Ser Pro Asp Pro 15 10 15

Ala Ser

<210> 21 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21

Pro Thr Glu Thr Leu Glu Leu Glu Val Ser Pro Asp Pro Ala Ser 15 10 15

<210> 22 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22

Thr Leu Glu Leu Glu Val Ser Pro Asp Pro Ala Ser 15 10

<210> 23 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23

Arg Gin Gin Pro Arg Asp Pro Pro Thr Glu Thr Leu Glu Leu Glu Val 15 10 15

Ser Pro Asp

<210> 24 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24

Arg Gin Gin Pro Arg Asp Pro Pro Thr Glu Thr Leu Glu Leu Glu Val 1 5 10 15

Ser Pro

<210> 25 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25

Arg Gin Gin Pro Arg Asp Pro Pro Thr Glu Thr Leu Glu Leu Glu Val 15 10 15

Ser

<210> 26 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

Pro Arg Asp Pro Pro Thr Glu Thr Leu Glu Leu Glu Val Ser Pro Asp 15 10 15 <4Ο0> 26

<210> 27 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27

Arg Asp Pro Pro Thr Glu Thr Leu Glu Leu Glu Val Ser Pro Asp 15 10 15

<210> 28 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <221> M0D_RES <222> (1) . . (1)

<223> ACETILAÇÃO <22 0> <221> M0D_RES <222> (24) . . (24) <223> 0 resíduo final (serina) termina num grupo amida e não num grupo ácido. <400> 28

Gin lie Arg Gin Gin Pro Arg Asp Pro Pro Thr Glu Thr Leu Glu Leu 15 10 15

Glu Val Ser Pro Asp Pro Ala Ser 20

<210> 29 <211> 349 <212> PRT <213> Homo sapiens

Met Glu Thr Pro Pro Val Asn Thr lie Gly Glu Lys Asp Thr Ser Gin 15 10 15 <4Ο0> 29

Leu Glu Val Ser Pro Asp Pro Ala Ser Gin lie Leu Glu His Thr Gin 50 55 60

Gly Ala Glu Lys Leu Val Ala Glu Leu Glu Gly Asp Ser His Lys Ser 65 70 75 80

His Gly Ser Thr Ser Gin Met Pro Glu Ala Leu Gin Ala Ser Asp Leu 85 90 95

Trp Tyr Cys Pro Asp Gly Ser Phe Val Lys Lys He Val lie Arg Gly 100 105 110

His Gly Leu Asp Lys Pro Lys Leu Gly Ser Cys Cys Arg Val Leu Ala 115 120 125

Leu Gly Phe Pro Phe Gly Ser Gly Pro Pro Glu Gly Trp Thr Glu Leu 130 135 140

Thr Met Gly Val Gly Pro Trp Arg Glu Glu Thr Trp Gly Glu Leu He 145 150 155 160

Glu Lys Cys Leu Glu Ser Met Cys Gin Gly Glu Glu Ala Glu Leu Gin 165 170 175

Leu Pro Gly His Ser Gly Pro Pro Val Arg Leu Thr Leu Ala Ser Phe 180 185 190

Thr Gin Gly Arg Asp Ser Trp Glu Leu Glu Thr Ser Glu Lys Glu Ala 195 200 205

Leu Ala Arg Glu Glu Arg Ala Arg Gly Thr Glu Leu Phe Arg Ala Gly 210 215 220

Asn Pro Glu Gly Ala Ala Arg Cys Tyr Gly Arg Ala Leu Arg Leu Leu 225 230 235 240

Leu Thr Leu Pro Pro Pro Gly Pro Pro Glu Arg Thr Val Leu His Ala 245 250 255

Asn Leu Ala Ala Cys Gin Leu Leu Leu Gly Gin Pro Gin Leu Ala Ala 260 265 270

Gin Ser Cys Asp Arg Val Leu Glu Arg Glu Pro Gly His Leu Lys Ala 275 280 285

Leu Tyr Arg Arg Gly Val Ala Gin Ala Ala Leu Gly Asn Leu Glu Lys 290 295 300

Ala Thr Ala Asp Leu Lys Lys Val Leu Ala lie Asp Pro Lys Asn Arg 305 310 315 320

Ala Ala Gin Glu Glu Leu Gly Lys Val Val lie Gin Gly Lys Asn Gin 325 330 335

Asp Ala Gly Leu Ala Gin Gly Leu Arg Lys Met Phe Gly 340 345

<210> 30 <211> 1050 <212> ADN <213> Homo sapiens <4Ο0> 30 atggagacgc caccagtcaa tacaattgga gaaaaggaca cctctcagcc gcaacaagag 60 tgggaaaaga accttcggga gaaccttgat tcagttattc agattaggca gcagccccga 120 gaccctccta ccgaaacgct tgagctggaa gtaagcccag atccagccag ccaaattcta 180 gagcatactc aaggagctga aaaactggtt gctgaacttg aaggagactc tcataagtct 240 catggatcaa ccagtcagat gccagaggcc cttcaagctt ctgatctctg gtactgcccc 100 gatgggagct ttgtcaagaa gatcgtaatc cgtggccatg gcttggacaa acccaaacta 360 ggctcctgct gccgggtact ggctttgggg tttcctttcg gatcagggcc gccagagggc 420 tggacagagc taactatggg cgtagggcca tggagggagg aaacttgggg ggagctcata 480 gagaaatgct tggagtccat gtgtcaaggt gaggaagcag agcttcagct gcctgggcac 540 tctggacctc ctgtcaggct cacactggca tccttcactc aaggccgaga ctcctgggag 600 ctggagacta gcgagaagga agccctggcc agggaagaac gtgcaagggg cacagaacta 660 tttcgagctg ggaaccctga aggagctgcc cgatgctatg gacgggctct tcggctgctc 720 ctgactttac ccccacctgg ccctccagaa cgaactgtcc ttcatgccaa tctggctgcc 780 tgtcagttgt tgctagggca gcctcagttg gcagcccaga gctgtgaccg ggtgttggag 840 cgggagcctg gccatttaaa ggccctatac cgaagggggg ttgcccaggc tgcccttggg 900 aacctggaaa aagcaactgc tgacctcaag aaggtgctgg cgatagatcc caaaaaccgg 960 gcagcccagg aggaactggg gaaggtggtc attcagggga agaaccagga tgcagggctg 1020 gctcagggtc tgcgcaagat gtttggctga 1050

<210> 31 <211> 1050 <212> ADN <213> Homo sapiens atggagacge caccagtcaa tacaattgga gaaaaggaca cctctcagcc gcaacaagag 60 <4Ο0> 31 tgggaaaaga accttcggga gaaccttgat tcagttattc agattaggca gcagccccga 120 gaccctccta ccgaaacgct tgagctggaa gtaagcccag atccagccag ccaaattcta leo gagcatactc aaggagctga aaaactggtt gctgaacttg aaggagactc tcataagtct 240 catggatcaa ccagtcagat gccagaggcc cttcaagctt ctgatctctg gtactgcccc 300 gatgggagct ttgtcaagaa gatcgtaatc cgtggccatg gcttggacaa acccaaacta 360 ggctcctgct gccgggtact ggctttgggg tttcctttcg gatcagggcc gccagagggc 420 tggacagagc taactatggg cgtagggcca tggagggagg aaacttgggg ggagctcata 480 gagaaatgct tggagtccat gtgtcaaggt gaggaagcag agcttcagct gcctgggcac 540 actggacctc ctgtcgggct cacactggca tccttcactc aaggccgaga ctcetgggag 600 ctggagacta gcgagaagga agccctggcc agggaagaac gtgcaagggg cacagaacta 660 tctcgagctg ggaaceetga aggagctgcc cgatgctatg gacgggctct tcggctgctc 720 ctgactttac ccccacctgg ccctccagaa cgaactgtcc ttcatgccaa tctggctgcc 780 tgteagttgt tgctagggca gcctcagttg gcagcccaga gctgtgaccg ggtgttggag 840 cgggagcctg gccatttaaa ggccttatac cgaagggggg ttgcccaggc tgcccttggg 900 aacctggaaa aagcaactgc tgacctcaag aaggtgctgg cgatagatcc caaaaaccgg 960 gcagcccagg aggaactggg gaaggtggtc attcagggga agaaccagga tgcagggctg 1020 gctcagggtc tgcgcaagat gtttggctga 1050 <210> 32 <211> 102 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Homo Sapiens <400> 32 atggagacgc caccagtcaa tacaattgga gaaaaggaca cctctcagcc gcaacaagag 60 tgggaaaaga accttcggga gaaccttgat tcagttattt ag 182 <210> 33 <211> 119 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Homo Sapiens <400> 33 atggagacgc caccagtcaa tacaattgga gaaaaggaca cctctcagcc gcaacaagag 60 tgggaaaaga accttcggga gaaccttgat tcagttattc agattaggca gcagccccg 119 <210> 34 <211> 143 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Homo Sapiens <400> 34 atggagacgc caccagtcaa tacaattgga gaaaaggaca cctctcagcc gcaacaagag 60 tgggaaaaga accttcggga gaaccttgat tcagttattc agattaggca gcagccccga 120 gaccctccta ccgaaacgct tga 143 <210> 35 <211> 174 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Homo sapiens <4Ο0> 35 atggagacgc caccagtcaa tacaattgga gaaaaggaca cctctcagcc gcaacaagag 60 tgggaaaaga accttcggga gaaccttgat tcagttattc agattaggca gcagccccga 120 gaccctccta ccgaaacgct tgagctggaa gtaagcccag atccagccag ctaa 174 <210> 36 <211> 258 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Homo sapiens <400> 36 atggagacgc caccagtcaa tacaattgga gaaaaggaca cctctcagcc gcaacaagag 60 tgggaaaaga accttcggga gaaccttgat tcagttattc agattaggca gcagccccga 120 gaccctccta ccgaaacgct tgagctggaa gtaagcccag atccagccag ccaaattcta 180 gagcatactc aaggagctga aaaactggtt gctgaacttg aaggagactc tcataagtct 240

catggatcaa ccagttag 25B <210> 37 <211> 453 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Homo sapiens atggagacgc caccagtcaa tacaattgga gaaaaggaca cctctcagcc gcaacaagag 60 <4Ο0> 37 tgggaaaaga accttcggga gaaccttgat tcagttattc agattaggca gcagccccga 120 gaccctccta ccgaaacgct tgagctggaa gtaagcccag atccagccag ccaaattcta 180 gagcatactc aaggagctga aaaactggtt gctgaacttg aaggagactc tcataagtct 240 catggatcaa ccagtcagat gccagaggcc cttcaagctt ctgatctctg gtáctgcccc 300 * gatgggagct ttgtcaagaa gatcgtaatc cgtggccatg gcttggacaa acccaaacta 360 ggctcctgct gccgggtact ggctttgggg tttcctttcg gatcagggcc gccagagggc 420 tggacagagc taactatggg cgtagggcca tga 453 <210> 38 <211> 600 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Homo sapiens <400> 38 atggagacgc caccagtcaa tacaattgga gaaaaggaca cctctcagcc gcaacaagag 60 tgggaaaaga accttcggga gaaccttgat tcagttattc agattaggca gcagccccga 120 gaccctccta ccgaaacgct tgagctggaa gtaagcccag atccagccag ccaaattcta 180 gagcatactc aaggagctga aaaactggtt gctgaacttg aaggagactc tcataagtct 240 catggatcaa ccagtcagat gccagaggcc cttcaagctt ctgatctctg gtactgcccc 300 gatgggagct ttgtcaagaa gatcgtaatc cgtggccatg gcttggacaa acccaaacta 360 ggctcctgct gccgggtact ggctttgggg tttcctttcg gatcagggcc gccagagggc 420 tggacagagc taactatggg cgtagggcca tggagggagg aaacttgggg ggagctcata 480 gagaaatgct tggagtccat gtgtcaaggt gaggaagcag agcttcagct gcctgggcac 540 tctggacctc ctgtcaggct cacactggca tccttcactc aaggccgaga ctcctggtag 600

<210> 39 <211> 600 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Homo sapiens <400> 39 atggagacgc caccagtcaa tacaattgga gaaaaggaca cctctcagce gcaacaagag 60 tgggaaaaga accttcggga gaaccttgat tcagttattc agattaggca gcagccccga 120 gaccctecta ccgaaacgct tgagctggaa gtaagcccag atccagccag ecaaatteta 180 gagcatactc aaggagctga aaaactggtt gctgaacttg aaggagactc teataagtet 240 catggatcaa ccagtcagat gccagaggcc cttcaagctt ctgatctctg gtactgcccc 300 gatgggagct ttgtcaagaa gategtaate cgtggccatg gcttggacaa acccaaacta 360 ggctcctgct gccgggtact ggctttgggg tttcctttcg gatcagggcc gccagagggc 420 cggacagagc taactatggg cgtagggcca tggagggagg aaacttgggg ggagctcata 480 gagaaatget tggagtccat gtgtcaaggt gaggaageag agcttcagct gcctgggcac 540 actggacctc ctgtcgggct cacactggca tccttcactc aaggeegaga ctcctggtag 600 <210> 40 <211> 18 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Homo sapiens <400> 40 atggccaggc tcccgctc 18 <210> 41 <211> 18 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Homo sapiens <4Ο0> 41 cttcccaagc ctcccaag 18 <210> 42 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Homo sapiens <400> 42 agaagacggg tcctccagtt 20 <210> 43 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Homo sapiens <400> 43 gagtcaacgg atttggtcgt 20 <210> 44 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Homo sapiens <400> 44 ttgattttgg agggatctcg 20 <210> 45 <211> 39 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Homo sapiens <400> 45 gaaccttgat tcagttattt agattaggca gcagccccg 39 <210> 46 <211> 39 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Homo sapiens <400> 46 cggggctgct gcctaatcta aataactgaa tcaaggttc 39 <210> 47 <211> 38 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Homo sapiens <400> 47 cagattaggc agcagccctg agaccctcct accgaaac 38 <210> 48 <211> 38 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Homo sapiens <4Ο0> 48 gtttcggtag gagggtctca gggctgctgc ctaatctg 38 <210> 49 <211> 31 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Homo sapiens <400> 49 cctaccgaaa cgctttagct ggaagtaagc c 31 <210> 50 <211> 31 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Homo sapiens <400> 50 ggcttacttc cagctaaagc gtttcggtag g 31 <210> 51 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Homo sapiens <400> 51 cccagatcca gccagctaaa ttctagagca tac 33

<210> 52 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Homo sapiens <400> 52 gtatgctcta gaatttagct ggctggatct ggg 33 <210> 53 <211> 31 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Homo sapiens <400> 53 catggatcaa ccagttagat gccagaggcc c 31 <210> 54 <211> 31 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Homo sapiens <400> 54 gggcctctgg catctaactg gttgatccat g 31 <210> 55 <211> 29 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Homo sapiens <4Ο0> 55 ggcgtagggc catgaaggga ggaaacttg 29 <210> 56 <211> 29 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Homo sapiens <400> 56 caagtttcct cccttcatgg ccctacgcc 29 <210> 57 <211> 28 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Homo sapiens <400> 57 ccgagactcc tggtagctgg agactagc 28 <210> 58 <211> 28 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Homo sapiens <400> 58 gctagtctcc agctaccagg agtctcgg 28

Lisboa, 2015-10-08

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Composto ativo compreendendo um polipéptido de FKBP- L isolado ou um fragmento biologicamente ativo de um polipéptido de FKBP-L ou um derivado biologicamente ativo de um polipéptido de FKBP-L ou (ii) um polinucleótido que codifica tal polipéptido de FKBP-L, fragmento ou derivado para uso como um inibidor de angiogénese ou para uso no tratamento de doenças oculares mediadas por angiogénese, em que o derivado biologicamente ativo de um polipéptido de FKBP-L compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 70% idêntica à sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma de SEQ ID NOs: 1 a 28.
2. Composto ativo compreendendo um polipéptido de FKBP- L isolado ou um fragmento biologicamente ativo de um polipéptido de FKBP-L ou um derivado biologicamente ativo de um polipéptido de FKBP-L ou (ii) um polinucleótido que codifica tal polipéptido de FKBP-L, fragmento ou derivado para uso no tratamento de cancro ou para uso como um inibidor de migração de células de tumor e/ou metástase ou para uso como um inibidor de crescimento de células de tumor e/ou proliferação, em que o derivado biologicamente ativo de um polipéptido de FKBP-L compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 70% idêntica à sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma de SEQ ID NOs: 1 a 28.
3. Composto ativo para uso de acordo com a reivindicação 2, em que o polipéptido de FKBP-L, fragmento biologicamente ativo de um polipéptido de FKBP-L ou um derivado biologicamente ativo de um polipéptido de FKBP-L ou seu fragmento, se proporciona em combinação com pelo menos um agente quimioterapêutico ou quimiopreventivo adicional ou radioterapia.
4. Composto ativo para uso de acordo com a reivindicação 3, em que pelo menos um agente quimioterapêutico ou quimiopreventivo adicional compreende pelo menos um de antiangiogénico, endostatina, angiostatina, um inibidor de VEGF, um agente citotóxico, um alcaloide, um antimetabolito, um inibidor de crescimento de cancro, um agente terapêutico de terapia génica, uma vacina contra cancro, interferão, Aldesleucina, um anticorpo monoclonal, um fármaco de quimioterapia, radioterapia, terapia hormonal ou outra terapia de apoio.
5. Composto ativo para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 em que o polipéptido de FKBP-L compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 10 .
6. Composto ativo para uso de acordo com a reivindicação 5 em que o polipéptido de FKBP-L compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO: 29.
7. Composto ativo para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 em que o fragmento biologicamente ativo de FKBP-L compreende a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma de SEQ ID NOs: 3 a 7, 10 a 28.
8. Composto ativo para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 em que o derivado biologicamente ativo de um polipéptido de FKBP-L compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma de SEQ ID NOs: 1 a 28 ou uma sequência que consiste de pelo menos 18 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 10 ou uma sequência pelo menos 90% idêntica a esta.
9. Composto ativo para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 em que o polinucleótido que codifica o referido polipéptido de FKBP-L, fragmento ou derivado compreende a sequência de nucleótidos apresentada em qualquer uma de SEQ ID NOs: 30 a 39 ou pelo menos 54 nucleótidos contíguos de SEQ ID NO: 30 a 39 ou uma sequência pelo menos 90% idêntica a esta.
10. Polipéptido isolado que compreende a sequência de aminoácidos tal como apresentada em SEQ ID NO: 10 ou uma sequência pelo menos 90% idêntica a SEQ ID NO: 10 em que o referido polipéptido inclui não mais de 200 aminoácidos consecutivos da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:l, SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 29 e em que o referido polipéptido apresenta atividade antiangiogénica.
11. Polipéptido de acordo com a reivindicação 10 que compreende a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma de SEQ ID NOs: 3 a 28 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma de SEQ ID NOs: 3 a 28.
12. Polipéptido isolado que compreende um fragmento biologicamente ativo de FKBP-L, em que o referido fragmento consiste da sequência de aminoácidos apresentada em pelo menos uma de SEQ ID NOs: 3 a 7, 10 a 28, na ausência de qualquer outra sequência de aminoácidos de FKBP-L contígua.
13. Polipéptido isolado de acordo com a reivindicação 12 que consiste da sequência de aminoácidos apresentada em pelo menos uma de SEQ ID NOs: 3 a 7 ou 10 a 28.
14. Molécula de ácido nucleico isolada que codifica o polipéptido de qualquer uma das reivindicações 10 a 13.
15. Molécula de ácido nucleico isolada da reivindicação 14, compreendendo pelo menos os nucleótidos 100 a 172 de SEQ ID NO: 31 para codificar um péptido de SEQ ID NO: 10.
16. Vetor, tal como um vetor de expressão, compreendendo o ácido nucleico da reivindicação 14 ou reivindicação 15.
17. Célula hospedeira transfetada com um vetor de acordo com a reivindicação 16.
18. Método de produzir um polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 13, em que o método compreende cultivar uma célula hospedeira transformada com um vetor de expressão de acordo com a reivindicação 16 sob condições que permitem expressão do referido polipéptido e recuperação do polipéptido expresso.
19. Composição compreendendo um polipéptido isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 13, misturado com um transportador farmaceuticamente aceitável.
20. Polipéptido de FKBP-L isolado ou um fragmento biologicamente ativo de um polipéptido de FKBP-L ou um derivado biologicamente ativo de tal polipéptido de FKBP-L ou fragmento para uso como um medicamento, em que o derivado biologicamente ativo de um polipéptido de FKBP-L compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 70% idêntica à sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma de SEQ ID NOs: 1 a 28.
21. Polipéptido de FKBP-L isolado ou um fragmento biologicamente ativo de um polipéptido de FKBP-L para uso de acordo com a reivindicação 20 em que o referido polipéptido de FKBP-L ou fragmento é como definido em qualquer uma de reivindicações 10 a 13. Lisboa, 2015-10-08