JP2009539367A - Ｆｋｂｐ−ｌおよびその使用 - Google Patents

Ｆｋｂｐ−ｌおよびその使用 Download PDF

Info

Publication number
JP2009539367A
JP2009539367A JP2009513764A JP2009513764A JP2009539367A JP 2009539367 A JP2009539367 A JP 2009539367A JP 2009513764 A JP2009513764 A JP 2009513764A JP 2009513764 A JP2009513764 A JP 2009513764A JP 2009539367 A JP2009539367 A JP 2009539367A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
fkbp
polypeptide
seq
fragment
derivative
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2009513764A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2009539367A5 (ja
JP5474535B2 (ja
Inventor
トレイシー・ロブソン
アンドレア・バレンタイン
マーティン・オルーク
デイビッド・ハースト
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Almac Discovery Ltd
Original Assignee
Almac Discovery Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Almac Discovery Ltd filed Critical Almac Discovery Ltd
Publication of JP2009539367A publication Critical patent/JP2009539367A/ja
Publication of JP2009539367A5 publication Critical patent/JP2009539367A5/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP5474535B2 publication Critical patent/JP5474535B2/ja
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4412—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y502/00—Cis-trans-isomerases (5.2)
    • C12Y502/01—Cis-trans-Isomerases (5.2.1)
    • C12Y502/01008—Peptidylprolyl isomerase (5.2.1.8), i.e. cyclophilin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Dermatology (AREA)

Abstract

血管新生および／または腫瘍転移を調整するためにＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドを使用する方法および組成物が開示される。ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドは、癌等の、血管新生によって媒介される障害の治療に使用することができる。

Description

関連出願に対する優先権主張
本出願は、２００６年６月９日に出願されたＲｏｂｓｏｎらの英国特許出願第０６１１４０５．２号に対する優先権を主張する。Ｒｏｂｓｏｎらの英国特許出願第０６１１４０５．２号の全開示は参照によって本明細書に組み込まれる。
本発明は、ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチド、ＦＫＢＰ−Ｌペプチド、ＦＫＢＰ−Ｌペプチド誘導体、およびその使用に関する。
血管新生は、既存の血管系からの新しい血管の形成であり、可溶性因子を介した複雑なシグナル伝達によってコントロールされている可能性がある。血管新生と関連する病状は、癌（Folkman J. (1971) N. Engl. J. Med. 285:1182；Folkman J. (1999) Nature Med. 1: 27-31）、動脈硬化症（Lip, G.Y., Blann, A.D. (2004) Ann Med. 36(2) 119-125）、乾癬（Powell, J. (1999) Curr. Opin. Pediatr. 11: 457-463）、子宮内膜症（Olive, D.L., Lindheim, S.R., Pritts, E.A. (2004) Best Pract. Res. Clinc. Obstet. Gynaecol. 18(2) 319-328）、および糖尿病性網膜症のようないくつかの眼障害（Folkman J. (1999) Nature Med. 1: 27-31）を含み得る。新しい血管が栄養素を提供して、活性細胞を支援し、肉芽組織形成を促し、かつ壊死組織片のクリアランスを促進するので、血管新生はまた創傷の修復に必要である可能性がある。肉芽組織塊の約６０％は、必要な酸素を同様に供給して、回復および血管成長を刺激する血管から構成される可能性がある。血管新生因子は創傷液中に存在し、回復を促進するが、抗血管新生因子は回復を阻害することが十分に立証されている。腫瘍では、内皮細胞が、血管新生を刺激する可溶性因子にさらされると、それらは、増殖での大量の増加、すでにある血管基底膜を経由しての分解および浸潤、ならびにその血管からの新しい場所への遊走を含む数種の生理学的変化を受ける可能性がある。新しい場所で、内皮細胞は再び増殖し、極めて混乱した腫瘍血管系を最終的に形成する前に毛細血管を形成する（Garcea G, Lloyd TD, Gescher A, Dennison AR, Steward WP, Berry DP. (2004) Eur J Cancer. Jun;4099):1302-13）。活性化された内皮細胞は特有のパターンの遺伝子発現を示す可能性があり、これは血管新生に関連する主要な細胞機能の一時的変異に至る。これらは、局所的な細胞周囲マトリックス分解に至るタンパク質分解のバランスの調節、細胞外マトリックス相互作用に関連する接着分子の合成、および最も重要である、細胞遊走に関連する細胞骨格の再編成を含む（Garcea G, Lloyd TD, Gescher A, Dennison AR, Steward WP, Berry DP. (2004) Eur J Cancer. Jun;4099):1302-13）。
新規な抗血管新生化合物は、活性化された内皮細胞中でアップレギュレートされることが確認されている様々な内皮マーカーを阻害することが示された。これらは受容体、マトリックス金属タンパク質、および接着タンパク質を含み得る。これらの阻害剤の成功率は非常に高かった。最近では、新規な抗血管新生化合物Ａｖａｓｔｉｎ、ＶＥＧＦ抗体がＦＤＡの承認を通過し、抗血管新生は、今や、癌の治療に使用される第４のモダリティーとして認識されるようになった（Abdollhi A., Hlatky L., Huber P.E. (2005) Drug Resistance Updates, Feb-Apr; 8:59-74）。これらの療法は、従来の化学療法治療に対して以下の利点を有する可能性がある。第１に、血管新生は主に癌胎児性のメカニズムであり、したがって、長期の治療後でも、投与された場合に最小限の副作用が期待されるはずである。第２に、腫瘍関連血管新生は生理学的な宿主メカニズムであり、その薬理学的阻害は、結果的に、抵抗性の発達に至らないはずである。最後に、腫瘍塊それ自体は標的にするのが難しく、供給血管系を裏打ちする内皮細胞は、しばしば、脆弱なものとしてみなされる。
血管新生促進化合物もまた治療効果がある可能性がある。たとえば、創傷の修復を促進する可能性がある血管新生促進化合物は、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ−ベータ、アンジオポエチン、および肥満細胞トリプターゼ等の血管新生サイトカインを含む。
新規なポリペプチドおよびその遺伝子が最近同定され、部分的に特徴づけられた。この新しいポリペプチドはＦＫＢＰ−Ｌ、ＤＩＲ１、またはＷＩＳＰ３９と命名された。この遺伝子はストレス応答で役割を有するものとして実証された（Robson, T., Lohrer, H., Bailie, J.R., Hirst, D.G., Joiner, M.C., Arrand, J.E. (1997) Biochemical J. Transactions 25, 335-341）。ＦＫＢＰ−Ｌ遺伝子の抑制により細胞のＸ線およびＵＶ誘発性酸化的細胞損傷を予防することができることもまた示された（Robson, T., Joiner, M.C., McCullough, W., Price, M.E., McKeown, S.R., Hirst, D.G. (1999) Radiation Research 152, 451-461; Robson, T., Price, M.E., Moore, M.L., Joiner, M.C., McKelvey-Martin, V.J., McKeown, S.R., Hirst, D.G., (2000) Int. J. Radiat）。ＦＫＢＰ−Ｌはまた、ｐ２１およびＨｓｐ９０と三量体複合体を形成することによって、新しく合成されたｐ２１（サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、および細胞周期の決定的な調節因子）を安定化する可能性がある（Jascur, T. et al (2005) Molecular Cell, Vol. 17, 237-249）。
血管新生および細胞遊走を調整することができる新しい治療薬を提供する必要がある。そのような治療薬は、独立の治療として、または他の治療剤と共に使用するのに重要である可能性がある。
本発明の実施形態は、血管新生および細胞遊走を調整するためのＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドの使用に関する。本発明は様々な形で具体化することができる。
たとえば、ある実施形態では、ＦＫＢＰ−Ｌおよびその断片は血管新生を調整するために使用することができる。また、いくつかの実施形態では、ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドは、細胞遊走および／または腫瘍細胞の転移を調整するために使用することができる。ＦＫＢＰ−Ｌの作用はＣＤ４４によって媒介され得る。したがって、ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドは、ある実施形態では、血管新生、細胞遊走、および／またはＣＤ４４を発現する細胞の転移を調整するために使用することができる。
いくつかの実施形態では、本発明は、細胞遊走および／または血管新生および／または腫瘍転移の少なくとも１つによって媒介されるまたはそれと関連する障害を治療する方法を含む。その方法は、治療有効量の（ｉ）単離ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチド、ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドの生物活性断片、またはＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドの生物活性誘導体もしくはその断片を含む活性化合物あるいは（ｉｉ）そのようなＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをその必要のある対象に投与することを含んでもよい。
他の実施形態では、本発明は、細胞遊走、血管新生、および／または腫瘍転移の少なくとも１つによって媒介されるまたはそれと関連する障害の治療の際に使用するための薬剤の製造における、（ｉ）単離ＦＫＢＰ−ＬポリペプチドもしくはＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドの生物活性断片またはＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドの生物活性誘導体もしくはその断片を含む活性化合物あるいは（ｉｉ）そのようなＦＫＢＰ−Ｌポリペプチド、断片、もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドの使用を含む。
本発明のさらなる特徴を以下に記載する。本発明は、以下の特許請求の範囲、説明、および図面に記載される細部へのその適用に限定されないことを理解されたい。本発明は、他の実施形態が可能であり、様々な形で実施するまたは実行することが可能である。
（図面の簡単な説明）
本発明は、以下の非限定的な図面を参照することによってよりよく理解することができる。
図１、パネルＡ〜Ｃは、本発明の代替の実施形態に従った完全長ＦＫＢＰ−Ｌの代替アミノ酸配列、ＦＫＢＰ−Ｌの断片を示す。
図２、パネルＡ〜Ｅは、本発明の代替の実施形態に従ったＦＫＢＰ−Ｌならびにその欠失突然変異体および変異体のいくつかをコードするポリヌクレオチド配列を示す。
図３は、本発明の一実施形態に従った、ＨＭＥＣ−１創傷閉鎖に対する、一時的に形質移入されたＦＫＢＰ−Ｌ ｃＤＮＡ（配列番号：３１）の阻害効果を示す。
図４は、本発明の一実施形態に従った、インビトロ創傷閉鎖アッセイでのＨＭＥＣ−１遊走に対する完全長Ｈｉｓタグ付きＦＫＢＰ−Ｌ組換えポリペプチド（配列番号：１）の効果の用量反応グラフを示す。
図５は、赤血球凝集素（ＨＡ）タグ付き完全長ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドが、本発明の一実施形態に従って、ＨＭＥＣ−１細胞から活発に分泌されることを示す。
図６は、本発明の一実施形態に従った、ＨＭＥＣ−１創傷閉鎖に対する完全長ＦＫＢＰ−Ｌ組換えポリペプチドの経時的な阻害効果を示す。
図７は、本発明の一実施形態に従った、Ｍａｔｒｉｇｅｌマトリックス基底膜上でのＨＭＥＣ−１管形成に対する完全長ＦＫＢＰ−Ｌ組換えポリペプチドの効果の用量反応グラフを示す。
図８は、本発明の実施形態に従った、マウススポンジアッセイを使用した、インビボでの血管新生に対する完全長組換えタンパク質ＦＫＢＰ−Ｌの効果を示し、パネルＡは、ウシ線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）単独での細胞の処理を示し、パネルＢは、完全長ＦＫＢＰ−ＬポリペプチドとｂＦＧＦでの細胞の処理を示す。
図９は、本発明の代替の実施形態に従って、ｂＦＧＦ単独と比較して、ｂＦＧＦおよび完全長組換えＦＫＢＰ−Ｌポリペプチド（配列番号：１）での処理に際して見られた血管の数の低下を示す。
図１０は、本発明の代替の実施形態に従った、血管新生のエキソビボラット大動脈輪外植片モデルに対する完全長ＦＫＢＰ−Ｌ組換えポリペプチドの効果の用量反応を示す。
図１１は、本発明の代替の実施形態に従った、２４時間（パネルＡ）および４８時間（パネルＢ）後のＭＴＴアッセイでのＨＭＥＣ−１の生存率または増殖に対する様々な濃度の完全長組換えＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドの効果を示す。
図１２は、本発明の実施形態に従った、完全長ＦＫＢＰ−Ｌ組換えポリペプチドへの暴露の際の遊走性内皮細胞の細胞骨格の形態の変化を示し、ＨＭＥＣ−１微小管は抗チューブリンを使用して染色した。
図１３は、本発明の実施形態に従った、完全長ＦＫＢＰ−Ｌ組換えポリペプチドへの暴露の際の遊走性内皮細胞の細胞骨格の形態の変化を示し、ＨＭＥＣ−１中間径フィラメントは抗ビメンチンを使用して染色した。
図１４は、本発明の代替の実施形態に従ったＰＣ３（パネルＡ）、ＭＤＡ（パネルＢ）、およびＨＴ２９（パネルＣ）腫瘍細胞遊走に対する完全長組換えポリペプチドＦＫＢＰ−Ｌの効果を示す。
図１５は、本発明の実施形態に従った、インビボでのＤＵ１４５ヒト前立腺腫瘍異種移植片細胞成長に対するＦＫＢＰ−Ｌ ｃＤＮＡ構築物の直接的な腫瘍内注射の効果を示す。
図１６は、細胞遊走の阻害が、本発明の実施形態に従って、ＨＭＥＣ−１および５つの腫瘍細胞株ＤＵ１４５、ＰＣ３、ＨＴ２９、ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−２３１中のＣＤ４４の発現に相互に関連することを示す。
図１７は、本発明の実施形態に従った、ＤＵ１４５（ＣＤ４４ −ｖｅ）（パネルＡ）、ＨＴ２９（ＣＤ４４ ＋ｖｅ）（パネルＢ）、ＰＣ３（ＣＤ４４ ＋ｖｅ）（パネルＣ）、ＭＤＡ（ＣＤ４４ ＋ｖｅ）（パネルＤ）、およびＭＣＦ−７（ＣＤ４４ −ｖｅ）（パネルＥ）腫瘍細胞遊走に対する完全長組換えＦＫＢＰ−Ｌの効果を示す。
図１８は、ｓｉＲＮＡ標的アプローチを介したＰＣ３細胞中のＣＤ４４のノックダウンが、本発明の実施形態に従って、ＰＣ３遊走のＦＫＢＰ−Ｌ媒介性の阻害を阻害することを示す。
図１９は、ＦＫＢＰ−Ｌが、本発明の実施形態に従って、創傷ＨＭＥＣ−１単層中の内因性ＣＤ４４と相互作用することができることを示す。
図２０は、ＦＫＢＰ−Ｌ欠失突然変異体を示し、パネルＡおよびＢは、ＦＫＢＰ−Ｌ欠失突然変異体の数種の配列決定結果を示し、パネルＣは、本発明の代替の実施形態に従った、創傷閉鎖に対する、一時的に形質移入されたＦＫＢＰ−Ｌ欠失突然変異体の阻害効果を示す。
図２１は、本発明の代替の実施形態に従った創傷切屑アッセイを使用した、ＦＫＢＰ−Ｌの活性ドメインをわたる完全長組換えＦＫＢＰ−Ｌ（配列番号：１）、候補ペプチドＦＫＢＰ−Ｌ １〜５７（１〜５７）（配列番号：６）、およびＦＫＢＰ−Ｌ ２４ｍｅｒ（２４ｍｅｒ）（配列番号：１０）の評価を示す。
図２２は、本発明の代替の実施形態に従った管形成アッセイでの合成基底膜Ｍａｔｒｉｇｅｌを使用した内皮細胞間接触の形成に対する、ＦＫＢＰ−Ｌの活性ドメインをわたる完全長組換えＦＫＢＰ−Ｌ（配列番号：１）、候補ペプチドＦＫＢＰ−Ｌ １〜５７（１〜５７）（配列番号：６）、およびＦＫＢＰ−Ｌ ２４ｍｅｒ（２４ｍｅｒ）（配列番号：１０）の評価を示す。
図２３は、本発明の代替の実施形態に従ってラット大動脈輪アッセイを使用した血管新生の出芽に対する、ＦＫＢＰ−Ｌの活性ドメインをわたるＦＫＢＰ−Ｌ ２４ｍｅｒペプチド（配列番号：１０）（パネルＡ）およびＦＫＢＰ−Ｌ ５７ｍｅｒ（配列番号：６）（パネルＢ）のペプチドの効果を示す。
図２４、パネルＡおよびＢは、本発明の代替の実施形態に従ってラット大動脈輪アッセイを使用した血管新生の出芽についての平均長、最大長（ｍａｘ ｌｅｎｇｔｈ）、および血管の数（ｎｏ．ｏｆ ｖｅｓｓｅｌｓ）に対するＦＫＢＰ−Ｌの活性ドメインをわたる候補ペプチド（つまり、ＦＫＢＰ−Ｌ ２４ｍｅｒペプチド、配列番号：１０；ＦＫＢＰ−Ｌ ５７ｍｅｒ、配列番号：６；および完全長組換えＨｉｓタグ付きＦＫＢＰ−Ｌ、配列番号：１）の効果を示す。
図２５は、本発明の代替の実施形態に従った修飾Ｂｏｙｄｅｎチャンバーシステムでの内皮細胞（ＨＭＥＣ−１）ならびに腫瘍細胞の浸潤（ＭＤＡ２３１およびＰＣ３）に対するＦＫＢＰ−Ｌ ２４ｍｅｒ（配列番号：１０）の効果を示す。
図２６は、本発明の代替の実施形態に従った内皮（ＨＭＥＣ−１）細胞接着に対するＦＫＢＰ−Ｌ ２４ｍｅｒ（配列番号：１０）の効果を示す。
図２７は、本発明の代替の実施形態に従った、ＭＤＡ−２３１（パネルＡ）およびＰＣ３（パネルＢ）腫瘍細胞遊走に対するＦＫＢＰ−Ｌ ２４ｍｅｒ（配列番号：１０）の効果を示す。
図２８は、本発明の代替の実施形態に従って、ＦＫＢＰ−Ｌ ２４ｍｅｒが血管新生抑制性阻害剤であることを示し、パネルＡは、７日目のＦＫＢＰ−Ｌ ２４ｍｅｒの追加の効果を示し、パネルＢは、大動脈輪をＦＫＢＰ−Ｌ ２４ｍｅｒに最初にさらし、次いで２４ｍｅｒを除去した実験を示す。
図２９は、ＦＫＢＰ−Ｌ ２４ｍｅｒがマウススポンジアッセイを使用したインビボ血管新生を阻害することを示す；本発明の代替の実施形態に従った、ｂＦＧＦおよび完全長組換えＦＫＢＰ−Ｌポリペプチド（ｒＦＫＢＰ−Ｌ）（配列番号：１）またはＦＫＢＰ−Ｌ ２４ｍｅｒ（２４ｍｅｒ）（配列番号：１０）ポリペプチドと組み合わせられたｂＦＧＦと比較して、ｂＦＧＦ単独での治療に際して見られた血管の数を示す。
図３０は、本発明の実施形態に従った、ＦＫＢＰＬ ２４ｍｅｒペプチド（配列番号：１０）によるマウス内皮細胞（２Ｈ−１１）遊走の阻害を示す。
図３１は、本発明の代替の実施形態に従って、ＦＫＢＰ−Ｌ ２４ｍｅｒペプチド（配列番号：１０）が、毎日のＩＰ注射後のインビボでのＤＵ１４５腫瘍成長を阻害すること（パネルＡ）；生存率を増加させること（パネルＢ、Ｃ、およびＤ）；ならびに有毒でないこと（パネルＥ）を示す。
図３２は、本発明の代替の実施形態に従ってＭＴＴアッセイを使用した、ＨＭＥＣ−１細胞の生存率または増殖に対するＦＫＢＰ−Ｌ ２４ｍｅｒペプチド（配列番号：１０）の効果を示す。
図３３は、本発明の代替の実施形態に従ってＭＴＴアッセイを使用した、２４時間（パネルＡ）または４８時間（パネルＢ）の投与に際してのＨＭＥＣ−１細胞の生存率または増殖に対する、ＦＫＢＰ−Ｌの活性ドメインをわたる候補ペプチドの効果を示す。
図３４、パネルＡ〜Ｌは、ＦＫＢＰ−Ｌ ２４ｍｅｒの多種多様の修飾／切断型バージョン：ＰＥＧ修飾ＦＫＢＰ−Ｌ ２４ｍｅｒ（ペプチド１）、Ｎ末端ピログルタミン酸を有するＦＫＢＰ−Ｌ ２４ｍｅｒ（ペプチド２）、および２４ｍｅｒＦＫＢＰ−Ｌペプチドの切断型形態（ペプチド３〜１２）の応答を示す。すべて、本発明の代替の実施形態に従って、インビトロＨＭＥＣ−１創傷切屑アッセイでの２４ｍｅｒペプチドと比較する。
図３５は、本発明の代替の実施形態に従った組換えＦＫＢＰ−Ｌの精製を示し、パネルＡは、透析前および後（それぞれレーン１および２）の精製組換えＦＫＢＰ−Ｌタンパク質を示す、還元条件下で実行したＳＤＳ ＰＡＧＥゲルを示し、パネルＢは、ＤＴＴでの処理前および後（レーン３および４）の透析組換えＦＫＢＰ−ＬのＳＤＳ ＰＡＧＥ比較を示す。レーン３は非還元サンプルであり、レーン４は５０ｍＭ ＤＴＴで還元したサンプルである。パネルＣは、ゲル濾過による組換えＦＫＢＰ−Ｌのさらなる精製を示す。挿入図は、１００ｍＭ ＤＴＴあり（＋）およびなし（−）のゲル濾過精製からの両ピークの未変性ＰＡＧＥ分析を透析タンパク質と共に示す。
図３６は、本発明の代替の実施形態に従った組換えＦＫＢＰ−Ｌのゲル浸透クロマトグラフ分析を示す。
図３７は、本発明の代替の実施形態に従った、１００ｍＭ ＤＴＴの存在（＋）および不在（−）下でのグルタルアルデヒド架橋の組換えＦＫＢＰ−Ｌを示す。レーンｃはコントロール（ＤＴＴなし）である。
定義
他に定義されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語はすべて当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。実施者は、当技術分野の定義および用語について、Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel)を特に参照する。アミノ酸残基についての略語は、２０種の一般的なＬ−アミノ酸のうちの１つを指すために当技術分野で使用される標準の３文字および／または１文字のコードである。
本発明の広範な範囲を記載する数的な範囲およびパラメーターは近似値であるにもかかわらず、特定の実施例に記載される数値は可能な限り正確に報告される。しかしながら、いかなる数値も、それぞれの試験測定値に見つけられる標準偏差に必然的に起因するある種の誤差を本質的に含有する。そのうえ、本明細書に開示されるすべての範囲は、そこに包括されるあらゆるおよびすべての部分範囲を包含することを理解されたい。たとえば、「１〜１０」の一定の範囲は、１の最小値および１０の最大値の間の（およびそれらを含む）あらゆるおよびすべての部分範囲；すなわち１以上の最小値で始まる、たとえば１〜６．１および１０以下の最大値で終わる、たとえば５．５〜１０のすべての部分範囲を含むと考えられるべきである。加えて、「本明細書に組み込まれる」として言及されたいかなる参考文献も、その全体が組み込まれるものとして理解されたい。
本明細書で使用される、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、はっきりと明確に１つの指示対象に限定されない限り、複数の指示対象を含むことにさらに留意されたい。用語「または（ｏｒ）」は、文脈が明白に示さない限り、用語「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」と区別なく使用される。
さらに、「部分」および「断片」という用語は、ポリペプチド、核酸、または他の分子構築物の一部分を指すために区別なく使用される。
本明細書で使用されるように、用語「生物活性ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチド」（たとえば断片および／または修飾ポリペプチド）は、完全長ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドと同じまたは類似する量および種類の活性を表すポリペプチドを指すために使用される。この文脈では、ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチド、断片、または誘導体の「生物活性」は、抗血管新生活性、腫瘍細胞成長および／または増殖の阻害、腫瘍細胞遊走および／または転移の阻害のうちのいずれか１つを含む。ＦＫＢＰ−Ｌ断片または誘導体の生物活性は、たとえば創傷閉鎖または創傷切屑アッセイ、インビトロ細胞遊走アッセイ、細胞間接着についてのＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）アッセイ、マウススポンジアッセイ、大動脈輪外植片アッセイ、ＭＴＴ増殖アッセイ、ＨＭＥＣ−１管形成アッセイ、インビボ腫瘍細胞成長アッセイ等の添付する実施例に記載されるインビトロまたはインビボアッセイのうちのいずれかを使用して完全長ＦＫＢＰ−Ｌと比較して試験されてもよい。この点に関して、活性（つまり機能）の特異性が保持される限り、意図的なアミノ酸置換が、残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、または親水性の類似性に基づいてポリペプチド中でなされてもよい。
本明細書で使用されるように、「対象」は動物であってもよい。たとえば、対象は哺乳動物であってもよい。さらに、対象はヒトであってもよい。代替の実施形態では、対象はオスまたはメスのいずれかであってもよい。ある実施形態では、対象は患者であってもよく、患者は、障害または疾患について診療下にあるおよび／または積極的に診療を求めている個人である。
「ポリペプチド」および「タンパク質」は、部分的なまたは完全長タンパク質を含み得るタンパク質分子を記載するために区別なく本明細書で使用される。用語「ペプチド」は、文脈が他に示さない限り、完全長ではないタンパク質または非常に短いタンパク質を示すために使用される。
当技術分野で知られているように、「タンパク質」、「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「オリゴペプチド」は、あるアミノ酸のアルファ炭素のカルボキシル基およびもう一つのアミノ酸のアルファ炭素のアミノ基の間の縮合反応によって形成されたペプチド結合を通してアルファ炭素が連結されたアミノ酸（典型的にＬ−アミノ酸）の鎖である。典型的に、タンパク質を構成するアミノ酸は、順に番号をつけられ、アミノ末端残基から開始して、タンパク質のカルボキシ末端残基に向かう方向に増加する。
本明細書で使用されるように、用語「上流」は、分子が核酸である場合に第２の残基に対してＮ末端の残基または分子がタンパク質である場合に第２の残基に対して５’の残基を指す。さらに、本明細書で使用されるように、用語「下流」は、分子が核酸である場合に第２の残基に対してＣ末端の残基または分子がタンパク質である場合に第２の残基に対して３’の残基を指す。
「核酸」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）等のポリヌクレオチドである。その用語は、一本鎖核酸、二本鎖核酸、ならびにヌクレオチド類似体またはヌクレオシド類似体から作製されたＲＮＡおよびＤＮＡを含むように使用される。
用語「ベクター」は、細胞中に第２の核酸分子を輸送するために使用されてもよい核酸分子を指す。一実施形態では、ベクターは、ベクター中に挿入されたＤＮＡ配列の複製を考慮に入れる。ベクターは、少なくともいくつかの宿主細胞中で核酸分子の発現を増強するためにプロモーターを含んでもよい。ベクターは、自律的に（染色体外）複製してもよくまたは宿主細胞染色体中に統合されてもよい。一実施形態では、ベクターは、ベクター中に挿入された核酸配列の少なくとも一部分に由来するタンパク質を産生することが可能な発現ベクターを含んでもよい。
当技術分野で知られているように、互いに核酸配列をハイブリダイズするための条件は、低ストリンジェンシーから高ストリンジェンシーまで及ぶものとして記載することができる。一般に、高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、高温の低塩バッファー中でハイブリッドを洗浄することを指す。ハイブリダイゼーションは、フィルター結合ＤＮＡに対して、６５℃で、０．５Ｍ ＮａＨＰＯ４、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の、当技術分野で標準のハイブリダイゼーション溶液を使用し、０．２５Ｍ ＮａＨＰＯ４、３．５％ＳＤＳ中で洗浄し、その後プローブの長さに依存して室温から６８℃まで及ぶ温度で０．１×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ中で洗浄して実行してもよい（たとえばAusubel, F.M. et al., Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed., Chapter 2, John Wiley & Sons, N.Yを参照されたい）。たとえば、高ストリンジェンシー洗浄は、１４塩基オリゴヌクレオチドプローブについては３７℃でのまたは１７塩基オリゴヌクレオチドプローブについては４８℃でのまたは２０塩基オリゴヌクレオチドプローブについては５５℃でのまたは２５塩基オリゴヌクレオチドプローブについては６０℃でのまたは長さが２５０ヌクレオチドについてのヌクレオチドプローブについては６５℃での６×ＳＳＣ／０．０５％ピロリン酸ナトリウム中での洗浄を含む。核酸プローブは、たとえば［γ−３２Ｐ］ＡＴＰでの末端標識またはランダムプライマー標識による［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ等の放射標識ヌクレオチドの組み込みによって放射性ヌクレオチドで標識してもよい。あるいは、プローブは、ビオチン化ヌクレオチドまたはフルオレセイン標識ヌクレオチドの組み込みによって標識し、プローブをストレプトアビジンまたは抗フルオレセイン抗体を使用して検出してもよい。
用語「同一性」または「パーセント同一」は、２つのアミノ酸配列の間のまたは２つの核酸配列の間の配列同一性を指す。同一性パーセントは２つの配列を整列させることにより決定することができ、比較された配列によって共有される位置での同一残基（つまりアミノ酸またはヌクレオチド）の数を指す。配列アラインメントおよび配列比較は、当技術分野で標準のアルゴリズム（たとえばSmith and Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443; Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85:2444）を使用してまたはＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡとして公的に入手可能な、これらのアルゴリズムのコンピューター化バージョン（Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, WI）によって行われてもよい。さらに、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤを通して入手可能なＥＮＴＲＥＺを配列比較に使用してもよい。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（たとえばＢＬＡＳＴＮ；Ｉｎｔｅｒｎｅｔ ｓｉｔｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎで入手可能）のデフォルトパラメーターを使用してもよい。一実施形態では、２つの配列の同一性パーセントは、１のギャップ重みでＧＣＧを使用して決定されてもよく、各アミノ酸ギャップが、２つの配列の間の単一アミノ酸ミスマッチとなるように重み付けされる。またはＧＣＧ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ社、サンディエゴ、ＣＡ）配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部分であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）を使用してもよい。
受容体またはリガンドのいずれかを含むタンパク質の結合特性は、結合特異性の用語で表現することができ、受容体に結合する他の知られている物質と比較した相対的な度合として決定されてもよい。結合を定量化し、結合親和性を決定するための標準のアッセイは当技術分野で知られており、たとえば平衡透析、平衡結合、ゲル濾過、表面プラズモン共鳴、標識結合パートナーの使用、ＥＬＩＳＡ、および間接的結合アッセイ（たとえば競合的阻害アッセイ）を含む。たとえば、当技術分野でよく知られているように、タンパク質の解離定数は、タンパク質を結合パートナーと接触させ、結合タンパク質および遊離タンパク質の濃度をその濃度の関数として測定することにより決定することができる。
本明細書で使用されるように、用語「保存残基」は、同じ構造および／または機能を有する複数のタンパク質の間で同じであるアミノ酸を指す。保存残基の領域はタンパク質の構造または機能にとって重要である可能性がある。したがって、三次元タンパク質中で同定される連続した保存残基は、タンパク質の構造または機能にとって重要である可能性がある。３次元構造の保存残基または保存領域を見つけるために、異なる種からの同じもしくは類似するタンパク質についての配列または同じ種の個体の配列の比較がなされてもよい。
本明細書で使用されるように、用語「類似物」または「相同体」は、アミノ酸またはヌクレオチドの配列を指す場合、野生型アミノ酸配列とある程度の相同性または同一性を有するポリペプチドを意味する。相同性比較は、目によってまたはより普通には、容易に入手可能な配列比較プログラムの援助によって行うことができる。これらの市販で入手可能なコンピュータープログラムは、２つ以上の配列の間の相同性パーセントを算出することができる（たとえばWilbur, W. J. and Lipman, D. J., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:726-730）。たとえば、相同配列は、代替の実施形態で、互いに、少なくとも７０％同一である、７５％同一である、８０％同一である、８５％同一である、９０％同一である、９５％同一である、９６％同一である、９７％同一である、または９８％同一であるアミノ酸配列を含むよう使用されてもよい。
本明細書で使用されるように、それに対して少なくとも９０％同一という用語は、示された配列に対して９０〜９９．９９％の同一性に及ぶ配列を含み、すべての中間の範囲を含む。したがって、それに対して少なくとも９０％同一という用語は、示された配列に対して９１、９１．５、９２、９２．５、９３、９３．５、９４、９４．５、９５、９５．５、９６、９６．５、９７、９７．５、９８、９８．５、９９、９９．５の同一パーセントである配列を含む。同様に、「少なくとも７０％同一」という用語は、中間のすべての範囲と共に、７０〜９９．９９％の同一に及ぶ配列を含む。同一性パーセントの決定は本明細書に記載されるアルゴリズムを使用して決定される。
本明細書で使用されるように、ポリペプチドまたはタンパク質の「ドメイン」は、独立したユニットを含むポリペプチドまたはタンパク質に沿った領域を含む。ドメインは、構造、配列、および／または生物活性の点から定義し得る。一実施形態では、ポリペプチドドメインは、タンパク質の残りから実質的に独立した様式で折り畳まるタンパク質の領域を含んでもよい。ドメインは、これらに限定されないが、ＰＦＡＭ、ＰＲＯＤＯＭ、ＰＲＯＳＩＴＥ、ＢＬＯＣＫＳ、ＰＲＩＮＴＳ、ＳＢＡＳＥ、ＩＳＲＥＣ ＰＲＯＦＩＬＥＳ、ＳＡＭＲＴ、およびＰＲＯＣＬＡＳＳ等のドメインデータベースを使用して同定することができる。
本明細書で使用されるように、用語「連結された」は、連結されている２つのグループの間に１つまたは複数の介在原子を有していてもよい２つの異なるグループ（たとえば核酸配列、ポリペプチド、ポリペプチドドメイン）の間の共有結合と同一であると見なされる。本明細書で使用されるように、「直接連結された」は、連結されている２つのグループの間にいかなる介在原子も有していない２つの異なるグループ（たとえば核酸配列、ポリペプチド、ポリペプチドドメイン）の間の共有結合と同一であると見なされる。
本明細書で使用されるように、「リガンド結合ドメイン」は、リガンドの結合を担うタンパク質のドメインを指す。用語リガンド結合ドメインは、リガンド結合ドメインまたはその部分の相同体を含む。この点に関して、リガンド結合ドメインの結合特異性が保持される限り、意図的なアミノ酸置換が、残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、または親水性の類似性に基づいてリガンド結合部位中でなされてもよい。
本明細書で使用されるように、「リガンド結合部位」は、リガンドと直接相互作用するタンパク質中の残基またはリガンドと直接相互作用するそれらの残基に近接させてリガンドを位置付けることに関与する残基を含む。リガンド結合部位中の残基の相互作用は、モデルまたは構造中の、リガンドに対する残基の空間的近接によって定義され得る。用語リガンド結合部位は、リガンド結合部位またはその部分の相同体を含む。この点に関して、リガンド結合部位の結合特異性が保持される限り、意図的なアミノ酸置換が、残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、または親水性の類似性に基づいてリガンド結合部位中でなされてもよい。リガンド結合部位は、タンパク質またはポリペプチドの１つまたは複数のリガンド結合ドメイン中に存在していてもよい。
本明細書で使用されるように、用語「相互作用する」は、２つの分子または単一分子の部分（たとえばペプチド中の異なるドメイン）の間の近接状態を指す。相互作用は、たとえば水素結合、ファンデルワールス相互作用、または静電気的もしくは疎水的相互作用の結果としての非共有結合であってもよく、またはそれは共有結合であってもよい。
本明細書で使用されるように、「リガンド」は、基質またはその類似体もしくは一部分を含む、リガンド結合部位と相互作用する分子または化合物または実体を指す。本明細書に記載されるように、用語「リガンド」は、対象とするタンパク質に結合する化合物を指してもよい。リガンドは、アゴニスト、アンタゴニスト、または修飾因子であってもよい。または、リガンドは生物学的効果を有していなくてもよい。または、リガンドは他のリガンドの結合をブロックし、それによって、生物学的効果を阻害できる。リガンドは、これらに限定されないが、低分子阻害剤を含んでもよい。これらの低分子は、ペプチド、ペプチドミメティック、有機化合物などを含んでもよい。リガンドはまた、ポリペプチドおよび／またはタンパク質を含んでもよい。
本明細書で使用されるように、「調整する」は、対象とする分子の生物活性を変化させるまたは変えることを指す。「修飾因子」化合物は、対象とする分子の活性を増加させてもよくもしくは減少させてもよくまたは物理的もしくは化学的特徴または機能的もしくは免疫学的特性を変化させてもよい。本発明の修飾因子化合物は、天然のおよび／または化学的に合成されたもしくは人工のＦＫＢＰ−Ｌペプチド、ペプチドミメティック、修飾ペプチド（たとえばホスホペプチド、環状ペプチド、Ｄ−アミノ酸および非天然アミノ酸を含有するペプチド、ステープルドペプチド、放射標識を含有するペプチド）、または抗体、炭水化物、単糖、オリゴ糖、多糖、糖脂質、ヘテロ環化合物、ヌクレオシドもしくはヌクレオチドもしくはその一部分、および／または低有機分子もしくは低無機分子に連結されたペプチド（たとえばＰＥＧまたは他の安定化基で修飾したペプチド）を含んでもよい。したがって、本発明のＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドはまた、化学的に修飾されたペプチドまたは異性体およびラセミ形態を含む。
「アゴニスト」は、受容体に結合して、関連する受容体に特異的な薬理学的応答を誘発する複合体を形成する化合物を含む。
「アンタゴニスト」は、アゴニストにまたは受容体に結合して、実質的な薬理学的応答を起こさず、かつアゴニストによって誘発される生物学的応答を阻害することができる複合体を形成する化合物を含む。
用語「ペプチドミメティック」は、分子の間の相互作用でペプチドの代用物として働く構造物を指す（Morgan et al., 1989, Ann. Reports Med. Chem., 24:243-252）。ペプチドミメティックは、アミノ酸および／またはペプチド結合を含有していてもまたはしていなくてもよいが、ペプチド、アゴニスト、またはアンタゴニストの構造的および機能的特徴を保持する合成構造物を含んでもよい。ペプチドミメティックはまた、ペプトイド、オリゴペプトイド（Simon et al., 1972, Proc. Natl. Acad, Sci., USA, 89:9367）；および本発明のペプチドまたはアゴニストまたはアンタゴニストに対応するアミノ酸のすべての可能な配列に相当する設計された長さのペプチドを含有するペプチドライブラリーを含む。
本明細書で使用されるように、用語「ＥＣ５０」は、測定された生物学的効果の５０％をもたらす作用物質の濃度として定義される。たとえば、測定可能な生物学的効果を有する治療剤のＥＣ５０は、作用物質が５０％の生物学的効果を表す値を含んでもよい。
本明細書で使用されるように、用語「ＩＣ５０」は、測定された効果の５０％の阻害をもたらす作用物質の濃度として定義される。たとえば、結合についてのアンタゴニストのＩＣ５０は、アンタゴニストがリガンド結合部位へのリガンド結合を５０％低下させる値を含んでもよい。
本明細書で使用されるように、「有効量」は、対象での所望の効果をもたらすために有効である作用物質の量を意味する。用語「治療有効量」は、求められている、動物またはヒトの治療反応を誘発する薬品または医薬品の量を示す。有効量を含む実際の用量は、投与の経路、対象の大きさおよび健康状態、治療されている障害などに依存してもよい。
本明細書で使用される用語「薬学的に許容し得る担体」は、ヒトまたは動物の対象での使用、たとえば、対象とする障害または疾患の治療のために投与された治療組成物に適した化合物および組成物を指してもよい。
用語「医薬組成物」は、従来の無毒担体、希釈剤、佐剤、ビヒクルなどを含有する単位投薬製剤で、たとえば経口的に、非経口的に、局所的に、吸入スプレーによって、鼻腔内に、または直腸に哺乳動物宿主に投与されてもよい組成物を示すために本明細書で使用される。
本明細書で使用される用語「非経口」は、皮下注射、静脈内、筋肉内、槽内の注射または注入技術を含む。
「安定した」製剤は、その中のポリペプチドまたはタンパク質が、保管に際してその物理的および化学的安定性ならびに生物活性を本質的に保持する製剤である。タンパク質安定性を測定するための多様な分析技術が当技術分野で利用可能であり、Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991)およびJones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993)で検討されている。安定性は、選択された期間、選択された温度で測定することができる。迅速な検査のために、対象とする製剤を１週間〜１カ月の間４０℃で保つことができ、その時間に安定性を測定する。凍結乾燥および保管の後の凝集の程度は、ペプチドおよび／またはタンパク質の安定性の指標として使用することができる。たとえば、「安定した」製剤は、約１０％未満、好ましくは約５％未満のポリペプチドまたはタンパク質が製剤中で凝集物として存在する製剤である。凍結乾燥製剤の凍結乾燥および保管の後の凝集物形成の増加を決定することができる。たとえば、「安定した」凍結乾燥製剤は、凍結乾燥製剤が少なくとも１週間４０℃でインキュベートされる場合に、凍結乾燥製剤中の凝集物の増加が、約５％未満または約３％未満である凍結乾燥製剤であってもよい。融合タンパク質製剤の安定性は、本明細書に記載される結合アッセイ等の生物活性アッセイを使用して測定されてもよい。
細胞遊走、血管新生、および腫瘍転移の修飾因子としてのＦＫＢＰ−Ｌポリペプチド
本発明は、ＦＫＢＰ−Ｌ、ＦＫＢＰ−Ｌの断片、ならびに修飾ＦＫＢＰ−Ｌおよびその断片が細胞遊走を阻害することができ、強力な血管新生調整特性を持っている可能性があることを認める。本発明の実施形態は、ＦＫＢＰ−Ｌ由来のペプチドおよびそれらの使用に関する。本発明は様々な形で具体化することができる。
したがって、ある実施形態では、本発明のＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドは抗血管新生特性を示してもよい。また、いくつかの実施形態では、本発明のＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドは、細胞遊走および／または腫瘍細胞の転移を調整するために使用することができる。本発明のＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドの作用は、ある実施形態では、ＣＤ４４によって媒介され得る。したがって、本発明のいくつかの実施形態では、ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドは、血管新生、細胞遊走、および／またはＣＤ４４を発現する細胞の転移を調整するために使用することができる。
ある実施形態では、本発明は、細胞遊走によって媒介されるまたはそれと関連する障害を治療するために使用されてもよい。たとえば、ＦＫＢＰ−Ｌペプチドは腫瘍浸潤および転移を阻害するまたは阻止するために使用することができる。または、いくつかの実施形態では、ＦＫＢＰ−Ｌペプチドは、創傷治癒に関連する細胞の遊走を阻害するために使用することができる。さらに他の実施形態では、ＦＫＢＰ−Ｌペプチドは、血管新生を阻害して、それによって、血管新生によって媒介された障害を治療するために使用することができる。
したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、細胞遊走、血管新生、または腫瘍転移の少なくとも１つによって媒介されるまたはそれと関連する障害を治療する方法を提供し、その方法は、治療有効量の（ｉ）単離ＦＫＢＰ−ＬポリペプチドもしくはＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドの生物活性断片またはＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドの生物活性誘導体もしくはその断片を含む活性化合物あるいは（ｉｉ）そのようなＦＫＢＰ−Ｌポリペプチド、断片、または誘導体をコードするポリヌクレオチドをその必要のある患者に投与することを含む。
たとえば、いくつかの実施形態では、本発明は、血管新生または腫瘍転移を調整する方法を提供し、その方法は、治療有効量の単離ＦＫＢＰ−ＬポリペプチドもしくはＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドの生物活性断片を含む活性化合物またはＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドの生物活性誘導体もしくはその断片あるいはそのようなＦＫＢＰ−Ｌポリペプチド、断片、または誘導体をコードするポリヌクレオチドをその必要のある対象に投与することを含む。
他の実施形態では、本発明は、細胞遊走および／または血管新生の少なくとも１つによって媒介されるまたはそれと関連する障害を治療するための組成物または薬剤の製造における、（ｉ）単離ＦＫＢＰ−ＬポリペプチドもしくはＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドの生物活性断片またはＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドの生物活性誘導体もしくはその断片を含む活性化合物あるいは（ｉｉ）そのようなＦＫＢＰ−Ｌポリペプチド、断片、または誘導体をコードするポリヌクレオチドの使用を含む。たとえば、一実施形態では、本発明は、血管新生の阻害剤として使用するための薬剤の製造における、（ｉ）単離ＦＫＢＰ−ＬポリペプチドもしくはＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドの生物活性断片またはＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドの生物活性誘導体もしくはその断片を含む活性化合物あるいは（ｉｉ）そのようなＦＫＢＰ−Ｌポリペプチド、断片、または誘導体をコードするポリヌクレオチドの使用を含む。
血管新生および／または細胞遊走によって媒介されるまたはそれと関連する種々様々の障害は、本発明の組成物および／または薬剤で治療することができる。したがって、代替の実施形態では、薬剤は、血管新生関連の炎症、血管新生によって媒介される眼障害、創傷治癒、または癌の少なくとも１つの治療に使用することができる。
したがって、一実施形態では、本発明は、血管新生関連の炎症の治療用薬剤の製造における、（ｉ）単離ＦＫＢＰ−ＬポリペプチドもしくはＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドの生物活性断片またはＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドの生物活性誘導体もしくはその断片を含む活性化合物あるいは（ｉｉ）そのようなＦＫＢＰ−Ｌポリペプチド、断片、または誘導体をコードするポリヌクレオチドの使用を含む。
他の実施形態では、血管新生と関連する障害は、眼障害、たとえば、黄斑変性および本明細書に記載される他の眼障害である。あるいは、血管新生と関連する障害は、動脈硬化症、関節炎、乾癬、または子宮内膜症である。したがって、代替の実施形態では、本発明は、眼障害、動脈硬化症、関節炎、乾癬、または子宮内膜症の少なくとも１つの治療の方法を提供し、その方法は、治療有効量の単離ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチド、ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドの生物活性断片またはＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドの生物活性誘導体もしくはその断片を含む活性化合物あるいはそのようなＦＫＢＰ−Ｌポリペプチド、その断片、または誘導体をコードするポリヌクレオチドをその必要のある対象に投与することを含む。または、本発明は、血管新生によって媒介される眼障害の治療用薬剤の製造における、（ｉ）単離ＦＫＢＰ−ＬポリペプチドもしくはＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドの生物活性断片またはＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドの生物活性誘導体もしくはその断片を含む活性化合物あるいは（ｉｉ）そのようなＦＫＢＰ−Ｌポリペプチド、断片、または誘導体をコードするポリヌクレオチドの使用を含む。たとえば、代替の実施形態では、ＦＫＢＰ−Ｌペプチドまたはポリヌクレオチドは、黄斑変性疾患または糖尿病性網膜症を治療するための薬剤の製造に使用することができる。または、本発明は、動脈硬化症、乾癬、関節炎、または子宮内膜症の少なくとも１つの治療用薬剤の製造における、（ｉ）単離ＦＫＢＰ−ＬポリペプチドもしくはＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドの生物活性断片またはＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドの生物活性誘導体もしくはその断片を含む活性化合物あるいは（ｉｉ）そのようなＦＫＢＰ−Ｌポリペプチド、断片、または誘導体をコードするポリヌクレオチドの使用を含んでよい。
ある実施形態では、本発明は、癌の治療の方法を提供する。たとえば、いくつかの実施形態では、本発明は、治療有効量の単離ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチド、ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドの生物活性断片を含む活性化合物またはＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドの生物活性誘導体もしくはその断片あるいはそのようなＦＫＢＰ−Ｌポリペプチド、その断片、または誘導体をコードするポリヌクレオチドを、癌の治療、腫瘍細胞の遊走および／もしくは転移の阻害、または腫瘍細胞の成長および／もしくは増殖の阻害の少なくとも１つのために投与することを含む、癌を治療する方法を提供する。一実施形態では、腫瘍細胞の遊走および転移の阻害は血管新生の阻害によるものである。たとえば、本発明は、癌の治療用薬剤の製造における、（ｉ）単離ＦＫＢＰ−ＬポリペプチドもしくはＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドの生物活性断片またはＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドの生物活性誘導体もしくはその断片を含む活性化合物あるいは（ｉｉ）そのようなＦＫＢＰ−Ｌポリペプチド、断片、または誘導体をコードするポリヌクレオチドの使用を含んでもよい。ある実施形態では、本発明の化合物および組成物は、腫瘍細胞の成長および／または転移を予防することができる。一実施形態では、腫瘍細胞の遊走および転移の阻害は血管新生の阻害によるものである。したがって、一実施形態では、本発明は、腫瘍細胞の遊走および／または転移の阻害剤として使用するための薬剤の製造における、（ｉ）単離ＦＫＢＰ−ＬポリペプチドもしくはＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドの生物活性断片またはＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドの生物活性誘導体もしくはその断片を含む活性化合物あるいは（ｉｉ）そのようなＦＫＢＰ−Ｌポリペプチド、断片、または誘導体をコードするポリヌクレオチドの使用を含んでもよい。さらに他の実施形態では、本発明は、腫瘍細胞の成長および／または増殖の阻害剤として使用するための薬剤の製造における、（ｉ）単離ＦＫＢＰ−ＬポリペプチドもしくはＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドの生物活性断片またはＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドの生物活性誘導体もしくはその断片を含む活性化合物あるいは（ｉｉ）そのようなＦＫＢＰ−Ｌポリペプチド、断片、または誘導体をコードするポリヌクレオチドの使用を含んでもよい。
発現ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドは、その最も広範な意味に従って明細書で使用される。明細書は、多形性による相同体、他の変異体、突然変異体、およびそれらの血管新生調整活性を保持する上述のポリペプチドの部分と一緒に、配列番号１、２、および２９に示される自然発生タンパク質を明示する。たとえば、ある実施形態では、ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドは、タンパク質のＮ末端に付けられた６つのヒスチジン残基のポリヒスチジンタグを含むＮ末端配列を有する配列番号：１（図１に示される配列番号：１の太字フォントのアミノ酸残基を参照されたい）または野生型配列の位置１８１にトレオニンおよび位置１８６にグリシンを有する配列番号：２を含む。または、配列番号：２９のポリペプチド（ＧＥＮＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０７１３９３；ＮＭ＿０２２１１０；［ｇｉ：３４３０４３６４］）が使用されてもよい。本発明の他のＦＫＢＰ−Ｌポリペプチド（たとえば断片および他の修飾体）の例となる構築物を図１に示す。さらに、ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチド構築物の例となる構築物を図２に提供する。
本発明の実施形態は、薬剤として使用するための、単離ＦＫＢＰ−ＬポリペプチドもしくはＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドの生物活性断片またはそのようなＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドの生物活性誘導体もしくは断片を含む。したがって、本発明の代替の実施形態は、本明細書に記載されるように、ＦＫＢＰ−ＬペプチドまたはＦＫＢＰ−Ｌペプチドをコードするヌクレオチドの使用を含み、ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドは、配列番号：１０に示されるアミノ酸配列または配列番号：１、配列番号：２、もしくは配列番号：２９に示されるアミノ酸配列または配列番号：３〜７もしくは１１〜２８のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列または配列番号：１〜２９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。または、配列番号：１０の少なくとも１８個の連続したアミノ酸を含む配列（たとえば配列番号：１１、１６、２３）が使用されてもよい。配列番号：１２、１３、および２８等の修飾されたものとして示されるペプチドへの（およびその使用への）本明細書での言及は、他に述べられない限り、挙げられた修飾を有さない同一アミノ酸配列のペプチド（およびその使用）を包含すると解釈されるべきである。
本明細書に記載されるように、本発明の方法および組成物は、完全長ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドまたはポリペプチドの断片を利用してもよい。したがって、本発明のある実施形態は、自然発生ＦＫＢＰ−ＬのＮ末端アミノ酸配列の有効な部分を含むまたはそれからなるＦＫＢＰ−Ｌ誘導体を含む。この配列は、ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドの活性Ｎ末端部分を含んでもよく、またはそれからなってもよい。代替の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号：２のアミノ酸１〜５７（つまり配列番号：６）または配列番号：２のアミノ酸３４〜５７（つまり配列番号：１０）を含んでもよく、またはそれからなってもよい。または、ペプチドは、配列番号：１０の少なくとも１８個の連続したアミノ酸を含む配列（たとえば配列番号：１１、１６、または２３）を含んでもよく、またはそれからなってもよい。代替の実施形態では、本発明の方法および組成物に使用されるポリペプチドは、配列番号：１〜７および１０〜２９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列のうちの１つを含んでもよく、またはそれからなってもよい。ある実施形態では、本発明は、ＦＫＢＰ−Ｌの生物活性断片を含み、前記ポリペプチドは、配列番号：１、配列番号：２、または配列番号：２９に示されるアミノ酸配列の連続する２００個以下のアミノ酸を含む。
本明細書に記載されるように、ペプチドは、修飾されてもよい（たとえばＰＥＧおよび／もしくはＨｉｓタグ付きまたは他の修飾を含有するように）。または、本発明は、配列番号：１〜２９のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列と少なくとも７０％または７５％または８０％または８５％または９０％または９５％または９６％または９７％または９８％または９９％同一である配列を有する単離ポリペプチドを含んでもよい。または、単離ペプチドまたは薬剤の調製に使用されるペプチドは、配列番号：１０の少なくとも１８個の連続したアミノ酸（たとえば配列番号：１１、１６、２３）と少なくとも７０％または７５％または８０％または８５％または９０％または９５％または９６％または９７％または９８％または９９％の同一性を有する配列を含んでもよく、またはそれからなってもよい。
本発明のＦＫＢＰ−Ｌ誘導体は、その抗血管新生／血管新生促進活性を保持する限り、可変長であってもよく、上記に記載される本発明の多種多様の態様に依って使用することができる。ＦＫＢＰ−Ｌの機能的等価物もまた本発明によって包含される。たとえば、ある実施形態では、機能的等価物は、ＣＤ４４に結合し、および／またはＣＤ４４およびＣＤ７４を含有する複合体に対するリガンド（たとえばＭＩＦ）の結合を予防することができる低分子を含んでもよく、またはそれからなってもよい。または、機能的等価物は、ＦＫＢＰ−Ｌおよびそのペプチド誘導体と類似した形で作用して、少なくとも１つの細胞遊走、血管新生、および／または転移を阻害する低分子を含んでもよく、またはそれからなってもよい。
投与されるＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドの用量は治療されている障害に応じて変動してもよい。代替の実施形態では、インビボで達成される投薬量は、１０−１２Ｍまたは１０−１１Ｍまたは１０−１０Ｍまたは１０−９Ｍまたは１０−８Ｍまたは１０−７Ｍまたは１０−６Ｍまたは１０−５Ｍを超えるインビトロレベルと当量となる。したがって、インビボで達成される投薬量は、１０−１２Ｍ〜１０−５Ｍまたは１０−１１Ｍ〜１０−６Ｍまたは１０−１０Ｍ〜１０−７Ｍまたは１０−９Ｍ〜１０−７Ｍまたはその中の範囲のインビトロレベルと当量であってもよい。代替の実施形態では、使用される投薬量は、約１〜１００００ｎｇｍｌ−１、約１０〜５０００ｎｇｍｌ−１、または約１００〜１０００ｎｇｍｌ−１のインビトロレベルと当量であってもよい。または、ある実施形態では、投薬量は、約０．００００１〜５００ｍｇ／ｋｇ／日または約０．０００１〜３００ｍｇ／ｋｇ／日または約０．００３〜１００ｍｇ／ｋｇ／日または約０．０３〜３０ｍｇ／ｋｇ／日または約０．１ｍｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日または約０．３ｍｇ／ｋｇ／日〜３ｍｇ／ｋｇ／日を含んでもよい。
一実施形態では、ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドはその必要のある対象に投与される。本明細書で使用されるように、その必要のある対象は、ＦＫＢＰ−Ｌの投与によって利益を得る可能性がある対象である。
さらに他の実施形態では、本発明は、配列番号：１〜２９のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列またはその生物活性断片を含むタンパク質またはポリペプチドをコードする単離核酸分子ならびに薬剤の調製のためのおよび／または治療剤としてのそのような分子の使用を含む。一実施形態では、生物活性断片は、配列番号：１０の少なくとも１８個の連続したアミノ酸（たとえば配列番号：１１、１６、２３）を含むまたはそれからなる。
たとえば、本発明の実施形態は、ＦＫＢＰ−Ｌペプチド、ＦＫＢＰ−Ｌペプチドの生物活性断片、またはその生物活性誘導体をコードするポリヌクレオチドの使用を含み、ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチド、断片、または誘導体をコードするポリヌクレオチドは、配列番号：３０〜３９のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含む。
さらに、本発明は、ＦＫＢＰ−Ｌペプチドをコードする単離核酸を含む。核酸分子は、配列番号：３０〜３９に記載される配列を有する核酸分子またはその断片を含んでもよく、核酸分子は、配列番号：１〜２８の配列を有するポリペプチドまたはこれらのポリペプチドの断片をコードする。一実施形態では、断片は、配列番号：１０の少なくとも１８個の連続したアミノ酸（たとえば配列番号：１１、１６、２３）を含み、またはそれからなる。ある実施形態では、同じアミノ酸が縮重配列によってコードされるようにアミノ酸コドンの第３の位置に縮重変異を含む縮重核酸分子は、本発明のＦＫＢＰ−Ｌポリペプチド、断片、および／または誘導体をコードするために使用することができる。したがって、ある実施形態では、本発明は、配列番号：３０〜３９またはその断片と少なくとも７０％、または７５％、または８０％、または８５％、または９０％、または９５％、または９６％、または９７％、または９８％、または９９％同一である配列を有する単離核酸分子を含んでもよい。
本発明はまた、配列番号：３１のポリヌクレオチド断片を産生するために使用することができるプライマーを含み、そのような断片は、図１に示されるＦＫＢＰ−Ｌペプチドをコードする。したがって、代替の実施形態では、本発明は、配列番号：４５〜５８に記載される配列またはそれと少なくとも７０％、もしくは少なくとも８０％、もしくは少なくとも８５％、もしくは少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％、もしくは少なくとも９６％、もしくは少なくとも９７％、もしくは少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーを含む。
さらに他の実施形態では、本発明は、本発明の単離核酸分子を含有するベクターを含む。ある実施形態では、本発明はまた、ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドが発現するように、そのようなベクターで形質移入した細胞を含む。そのような実施形態は本明細書により詳細に記載される。
さらに他の実施形態では、本発明は、ＦＫＢＰ−Ｌ遺伝子またはその部分のコード鎖に対してアンチセンスな単離核酸分子、ならびに薬剤の調製のためおよび／または治療剤としてのそのような分子の使用を含む。したがって、他の実施形態では、本発明は、本発明のＦＫＢＰ−ＬポリペプチドをコードするｍＲＮＡのコード鎖に対してアンチセンスな核酸配列と少なくとも７０％、または７５％、または８０％、または８５％、または９０％、または９５％、または９６％、または９７％、または９８％、または９９％同一であるポリヌクレオチドを含む。
ある実施形態では、アンチセンス分子は、血管新生および／または細胞遊走を有利に促進するのに、また血管新生または細胞遊走の少なくとも１つによって媒介されるまたはそれと関連する障害の治療に使用することができる。たとえば、一実施形態では、本発明は、血管新生を促進するための修飾因子として使用するための薬剤の製造における、ＦＫＢＰ−Ｌの発現を特異的にダウンレギュレートすることができるアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡの使用を含む。さらに、ある実施形態では、本発明は、造血または血管形成の少なくとも１つを促進するための修飾因子として使用するための薬剤の製造における、ＦＫＢＰ−Ｌの発現を特異的にダウンレギュレートすることができるアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡの使用を含む。一実施形態では、本発明は、創傷治癒を促進するのに使用するための薬剤の製造における、ＦＫＢＰ−Ｌの発現を特異的にダウンレギュレートすることができるアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡの使用を含む。さらに、本発明は、消化性潰瘍、骨折、またはケロイドの少なくとも１つの治療用薬剤の製造における、ＦＫＢＰ−Ｌの発現を特異的にダウンレギュレートすることが可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡの使用を含んでもよい。
他の実施形態では、本発明は、血管新生によって媒介される歯肉炎（ｐａｒｏｄｅｎｔｉｔｉｓ）または歯牙支持組織疾患の治療用薬剤の製造における、ＦＫＢＰ−Ｌの発現を特異的にダウンレギュレートすることができるアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡの使用を含む。他の実施形態では、本発明は、排卵、月経、および胎盤形成等の生殖系の治療または調節で使用するための薬剤の製造における、ＦＫＢＰ−Ｌの発現を特異的にダウンレギュレートすることができるアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡの使用を含んでもよい。他の実施形態では、本発明は、発作によって引き起こされる可能性があるような脳および神経系の機能不全の治療または調節で使用するための薬剤の製造における、ＦＫＢＰ−Ｌの発現を特異的にダウンレギュレートすることが可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡの使用を含んでもよい。したがって、ＦＫＢＰ−Ｌの発現を特異的にダウンレギュレートすることができるアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡの使用は、ある種類の認知症および／または精神遅滞の治療に有用である可能性がある。
本発明のある実施形態のさらなる態様が下記に、より詳細に論じられる。
ＦＫＢＰ−Ｌは、細胞遊走、血管新生、および転移を調整する
ある実施形態では、ＦＫＢＰ−Ｌおよびその断片は血管新生を調整するために使用されてもよい。一実施形態では、ＦＫＢＰ−Ｌまたはその断片は血管新生を阻害するために使用されてもよい。たとえば、ＦＫＢＰ−Ｌでの細胞の形質移入は、内皮細胞遊走および血管新生を阻害する可能性があり（図３）、これは、ＦＫＢＰ−Ｌタンパク質が可能性のある抗遊走性タンパク質であることを示す。細胞遊走に対するＦＫＢＰ−Ｌの用量依存的な自然の効果が図４に示される。したがって、１０−６Ｍの完全長Ｈｉｓタグ付きＦＫＢＰ−Ｌの用量が細胞遊走を予防するのに有効であることを理解することができる。
ある実施形態では、ＦＫＢＰ−Ｌは、内皮細胞（図５）および腫瘍細胞等のある種類の細胞から分泌されてもよい。したがって、一実施形態では、ＦＫＢＰ−Ｌの抗血管新生作用は受容体活性化を介するものであってもよい。内皮細胞からのＦＫＢＰ−Ｌの分泌は、ＦＫＢＰ−Ｌタンパク質の適用またはｃＤＮＡ構築物を使用するＦＫＢＰ−Ｌの過剰発現により、インビトロおよびインビボの両方で観察される抗血管新生効果を共に発揮することができる可能性があることを示す。
ある実施形態では、ＦＫＢＰ−Ｌは、生理学的に妥当な期間にわたり細胞遊走に対する効果を示す。たとえば、完全長Ｈｉｓタグ付き組換えＦＫＢＰ−Ｌポリペプチド（配列番号：１）で処理されたＨＭＥＣ−１細胞は、２〜３日以内の間に創傷閉鎖の減少を示す可能性がある（図６）。したがって、ＦＫＢＰ−Ｌタンパク質の適用は、細胞遊走および／または血管新生を阻害するのに必要とされる数時間、数日間、または数週間であってもよい。
細胞遊走および／または血管新生に対するＦＫＢＰ−Ｌの効果は、ある実施形態では、細胞遊走および／または血管新生によって影響を及ぼされる任意の細胞に有効であってもよい。したがって、本明細書の実施例に詳細に記載されるように、完全長組換えＦＫＢＰ−Ｌ（たとえば配列番号：１）は、ＨＭＥＣ−１創傷閉鎖（図３、４、および６）ならびにＨＭＥＣ−１管形成（図７）、マウススポンジアッセイ（図８、９Ａ、および９Ｂ）、ならびに大動脈輪外植片モデル（図１０）を含む、血管新生についての種々様々のモデルで、広範な用量範囲にわたり抗遊走性作用を示す。
さらに、一実施形態では、細胞移動性および／または血管新生に対するＦＫＢＰ−Ｌの効果は、化合物の毒性によるものではない。したがって、細胞が、４８時間以内の間、組換え完全長ＦＫＢＰ−Ｌにさらされる場合、そのＦＫＢＰ−Ｌは、毒性を示さない可能性がある（図１１Ａおよび１１Ｂ）。
ＦＫＢＰ−Ｌが細胞に作用する種々様々のメカニズムが存在する可能性がある。一実施形態では、ＦＫＢＰ−Ｌ媒介性の遊走の阻害のメカニズムは細胞骨格を対象とするものであってもよい（図１２および１３）。たとえば、ある実施形態では、ＦＫＢＰ−Ｌは、細胞骨格のフィラメントの破壊または他の変化に至るものであってもよい。
ＦＫＢＰ−Ｌの抗血管新生効果は、ＦＫＢＰ−Ｌが抗腫瘍形成および／または抗転移活性を有している可能性があることを示す。たとえば、図１４、パネルＡ、Ｂ、およびＣに示されるように、完全長組換えＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドは用量依存的な様式で腫瘍細胞遊走を阻害する可能性があり、ＦＫＢＰ−Ｌが転移するための遊走に依存する腫瘍細胞浸潤および腫瘍細胞の転移を低下させるための治療剤として有用である可能性があることを示す。ある実施形態では、遺伝子治療による、完全長ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドをコードする発現構築物でのインビボでの腫瘍の処理（図１５）は腫瘍成長に低下に至る。
血管新生に関連する遺伝子とのＦＫＢＰ−Ｌの相互作用
種々様々の生化学的経路がＦＫＢＰ−Ｌによって調整され得る。ある実施形態では、ＦＫＰＢ−Ｌは、血管新生および／または細胞遊走と関連するある種の遺伝子の発現の増加に至ってもよい。たとえば、ある実施形態では、アンチセンスＦＫＰＢ−Ｌ核酸での形質移入は、ＰＩ３Ｋ、Ｒｈｏ ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質−オリゴフレニン１、ＲＯＣＫ、微小管関連タンパク質１Ｂ、ＭＭＰ様１タンパク質、および／またはＴＮＦリガンドスーパーファミリーメンバー１タンパク質の発現の増加に至ってもよい（本明細書の実施例１２を参照されたい）。ＲｈｏＡ、ＲｈｏＣ、ＲＯＣＫ Ｉ、およびＲＯＣＫ ＩＩ発現の上昇は腫瘍進行と関連することが知られており、ＲｈｏおよびＲＯＣＫのシグナル伝達はいくつかの腫瘍細胞の形態学的変化および転移性の活動の一因となることが示唆された。したがって、ある実施形態では、ＦＫＢＰ−Ｌの過剰発現は血管新生を阻害することができ、アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用するＦＫＢＰ−Ｌ抑制は、ＲｈｏおよびＲＯＣＫ等の血管新生と関連する遺伝子の活性化による血管新生を促進することができる。
ＣＤ４４とのＦＫＢＰ−Ｌの相互作用
ＣＤ７４は抗原提示細胞中で発現される。ＣＤ７４の主な機能はＭＨＣクラスＩＩ分子の細胞内の選別である。ＣＤ７４は、腎、肺、胃、および胸腺発生の癌腫でならびにある肉腫によって発現される。加えて、ＣＤ７４は、ある腫瘍遺伝子に応じて発現される可能性がある。たとえば、乳癌株中でのＩＮＦ−γ−誘発性のＣＤ７４の表面発現は、網膜芽細胞腫タンパク質によって増強される可能性がある。したがって、正常組織によるＣＤ７４の限られた発現およびその迅速な内部移行は、ＣＤ７４を癌および免疫疾患の両方に対する魅力的な治療剤にする可能性がある。
マクロファージ抑制因子（ＭＩＦ）もまた腫瘍形成に関連する可能性がある。高レベルのＭＩＦは、ヒト腫瘍で見られ、類別および予後と相互に関連する。そのうえ、ＭＩＦは、Ｒｈｏ依存性経路を介して血管新生、腫瘍成長、および転移に関連する可能性がある（Amin et al., 2006, Blood, 107:2252-2261; Ren et al., 2006, Oncogene, 25:3501-3508; Sun et al., 2005, Clin. Cancer Res., 11:1050-1058; Sun et al., 2003, Int. J. Mol. Med., 12:633-641）。ＭＩＦ情報伝達は、ＣＤ７４に対する結合により開始され得る（Leng et al., 2003, J. Exp. Med., 197:1467-1476）。ＣＤ７４の活性化はＣＤ４４との相互作用を必要とすることもまた考えられる（Naujokas et al., 1993, Cell, 74:257-268; and Naujokas et al., 1995, Immunity, 3:359-372）。ＭＩＦは、ＣＤ７４およびＣＤ４４の両方と複合体中で相互作用することが示され、この複合体の阻害は、膀胱癌細胞中での増殖の減少をもたらす（Meyer-Siegler et al., 2004, BMC Cancer, July 12; 4:34;Leng et al., 2006, Cell Res., 16:162-168もまた参照されたい）。
ＭＩＦ、ＣＤ４４、およびＣＤ７４の間の複合体の形成は、ＭＩＦ媒介性の生物学的シグナル伝達にとって重要である可能性がある（Shi et al., Immunity, 2006, 25(4):595-606）。
ある実施形態では、ＦＫＢＰ−ＬはＣＤ４４と相互作用することにより作用してもよい。一実施形態では、ＦＫＢＰ−ＬはＣＤ４４に結合し、ＣＤ４４がＣＤ７４と相互作用するのを予防してもよい。ＦＫＢＰ−Ｌまたはその部分がＣＤ４４からＣＤ７４をはずすことができる場合、ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドは、ＭＩＦ誘発性情報伝達に必要とされるＣＤ４４−ＣＤ７４−ＭＩＦの複合体の形成を予防してもよい。または、他の実施形態では、ＦＫＢＰ−Ｌは代替メカニズムによって作用してもよい。
ＣＤ４４はほとんどの上皮細胞によって発現されると考えられており、血管新生に関係している（Cao et al., 2006, Am. J. Pathol., 169:325-336）。したがって、一実施形態では、ＣＤ４４は、内皮細胞遊走および／または血管新生のＦＫＢＰ−Ｌ阻害に必要とされてもよい。さらに、一実施形態では、ＣＤ４４は腫瘍細胞遊走のＦＫＢＰ−Ｌ阻害に必要とされ得る。したがって、図１６および１７Ａ〜１７Ｅに示されるように、完全長組換えＦＫＢＰ−Ｌは、ある実施形態では、ＣＤ４４陰性（ＣＤ４４ −ｖｅ）腫瘍細胞株ではなく、ＣＤ４４を発現する腫瘍細胞株（つまりＣＤ４４陽性またはＣＤ４４ ＋ｖｅ）中で腫瘍細胞遊走を阻害することができ、ＦＫＢＰ−Ｌが、ＣＤ４４陽性腫瘍細胞株のサブセット中の腫瘍転移を阻害する可能性があることを示唆する。ＨＭＥＣ−１細胞もまたＣＤ４４について陽性である（示さず）。一実施形態では、ＣＤ４４の不活性化（たとえばＣＤ４４に特異的なｓｉＲＮＡを使用）は、腫瘍細胞遊走のＦＫＢＰ−Ｌ媒介性の阻害の予防をもたらし（たとえば図１８）、ＣＤ４４が、腫瘍細胞の遊走および／または転移のＦＫＢＰ−Ｌ阻害に関連する可能性があることを実証する。
一実施形態では、ＦＫＢＰ−ＬはＣＤ４４と直接相互作用してもよい。たとえば、外因的に過剰発現されたＦＫＢＰ−Ｌ（たとえば配列番号：３１から生成された配列番号：１）は、創傷単層（図１９；実施例１６）中の内因性ＣＤ４４と相互作用する可能性がある。一実施形態では、非創傷単層中の内因性ＦＫＢＰ−ＬおよびＣＤ４４の間に有意な相互作用はなく、ＣＤ４４との相互作用が検出され得る前に決定的なレベルのＦＫＢＰ−Ｌが発現される必要があることを示唆する。さらに、この相互作用は、遊走の刺激を受けた内皮細胞中（つまり創傷単層中）でのみ生じる可能性がある。
したがって、実施形態では、完全長ＦＫＢＰ−ＬはＣＤ４４陽性微小血管内皮細胞に対して活性であり（図１６）、したがって、腫瘍成長を支援するさらなる微小血管伸長を予防するために固形腫瘍内のこれらの細胞を標的にすることができる。そのため、ＦＫＢＰ−Ｌは、特定の腫瘍の種類ではなく血管系を標的にする可能性があり、すべてでないとしても大多数の固形腫瘍および微小転移に対して活性である可能性がある。さらに、下記に、より詳細に論じられるように、ＦＫＢＰ−Ｌペプチドは類似する活性を表す。たとえば、ＦＫＢＰ−Ｌのアミノ酸３４〜５７（つまりＦＫＢＰ−Ｌ「２４ｍｅｒ」）、ＦＫＢＰ−Ｌのアミノ酸１〜５７（つまりＦＫＢＰ−Ｌ「１〜５７ｍｅｒ」）、およびＦＫＢＰ−Ｌタンパク質のＮ末端からの他のＦＫＢＰ−Ｌペプチドは、ＣＤ４４を発現する腫瘍細胞の遊走を阻害する可能性がある。したがって、ＦＫＢＰＬポリペプチドおよびその誘導体は、ＣＤ４４と相互作用するＦＫＢＰ−Ｌと一致した形で、血管新生および浸潤に対する影響を有する内皮細胞遊走および／または腫瘍細胞遊走を阻害することができる。
ＦＫＢＰ−Ｌの断片
本発明の実施形態は、ＦＫＢＰ−Ｌタンパク質のＮ末端のある領域が生物活性を表す可能性があることを認める。したがって、ある実施形態では完全長野生型（ＷＴ）ＦＫＢＰ−Ｌまたは代替の実施形態ではこれらに限定されないがΔ４８、Δ５８、Δ８６、Δ１５１、Δ２００等の切断型突然変異体を発現する発現構築物は創傷閉鎖を阻害してもよい（図２０）。これらの構築物のそれぞれのアミノ酸配列を図１に示す。たとえば、ある実施形態では、ＷＴ−ＦＫＢＰ−ＬおよびΔ５８は、３６．２％および４８．８％、創傷閉鎖をそれぞれ阻害した。活性に必要とされる最低数の配列がある可能性がある。たとえば、ある実施形態では、切断型ＦＫＢＰ−ＬΔ３４は創傷閉鎖を有意に阻害しない可能性があり、活性ドメインがこの突然変異体で欠失していることを示唆する。したがって、これらの実験は、完全長（たとえば配列番号：２）ＦＫＢＰ−Ｌのアミノ酸３４および５７の間に活性ドメインが存在することを示す可能性がある。
したがって、図２０Ａ〜２０Ｃに示されるように、ある実施形態では、その抗血管新生活性にとって重要なドメインは、ＦＫＢＰ−Ｌのアミノ酸３４〜５７の間に（つまりＮ末端に）位置する可能性がある。
ある実施形態では、アミノ酸３４および５７の間のＦＫＢＰ−Ｌの部分は完全長ＦＫＢＰ−Ｌと同じ生物活性を示す。いくつかの実施形態では、ＦＫＢＰ−Ｌ ２４ｍｅｒは完全長ＦＫＢＰ−Ｌと比較して効力の増加を表す可能性がある。たとえば、ＦＫＢＰ−Ｌ ２４ｍｅｒペプチド（配列番号：１０）は、内皮細胞遊走／創傷閉鎖の阻害（図２１）、Ｍａｔｒｉｇｅｌ管形成アッセイでの内皮細胞間接触の形成の阻害（図２２）、血管新生の出芽（図２３Ａ、２３Ｂ、２４Ａ、および２４Ｂ）、細胞が浸潤する能力（図２５）、ならびに／または細胞が接着する能力（図２６）に関して、完全長組換えＦＫＢＰ−Ｌ（たとえば配列番号：１）と比較して、類似するまたはより強力な生物活性を示す可能性がある。しかしながら、ある実施形態では、ＦＫＢＰ−Ｌ ２４ｍｅｒおよびＦＫＢＰ−Ｌ １〜５７ｍｅｒは、完全長ＦＫＢＰ−Ｌと比較して効力の増加を表す（たとえば図２１、２２、および２４を参照されたい）。
ある実施形態では、ＦＫＢＰ−Ｌの生物活性はＣＤ４４を必要とし得る。たとえば、ＦＫＢＰ−Ｌ ２４ｍｅｒペプチド（配列番号：１０）は、完全長組換えＦＫＢＰ−Ｌ（ｒＦＫＢＰ−Ｌ）と類似する様式で作用し、ＭＤＡ−２３１およびＰＣ３腫瘍細胞遊走を阻害する可能性がある。これらの腫瘍細胞は、共にＣＤ４４陽性（ＣＤ４４ ＋ｖｅ）であり（つまりＣＤ４４タンパク質を発現し）（図２７Ａおよび２７Ｂ）、ＦＫＢＰ−Ｌ ２４ｍｅｒがＣＤ４４ ＋ｖｅ腫瘍細胞株のサブセット中で腫瘍転移を阻害することができる可能性があることを示す。一実施形態では、ＦＫＢＰ−Ｌおよびその誘導体は、ＣＤ４４と相互作用するＦＫＢＰ−Ｌと一致する様式で腫瘍細胞の遊走および浸潤ならびに内皮細胞遊走を阻害することができる。
さらに、ある実施形態では、ＦＫＢＰ−Ｌ ２４ｍｅｒペプチド（配列番号：１０）は血管新生抑制性阻害剤である（図２８Ａおよび２８Ｂ）。したがって、ＦＫＢＰ−Ｌ ２４ｍｅｒは、血管が成熟しているまたは新たに埋め込まれる場合、血管発達を阻害する可能性がある。しかしながら、一実施形態では、ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドは、追加された場合に血管発達を停止させ、除去された場合にほとんどまたは全く残効を有していないという点で静的メカニズムによって作用する可能性がある。
さらに、ある実施形態では、ＦＫＢＰ−Ｌ ２４ｍｅｒは、マウススポンジアッセイを使用したインビボ血管新生を阻害し（図２９）、さらに、広範な用量範囲にわたりインビトロでのマウス内皮細胞遊走阻害し（図３０）、このヒトペプチドはまたマウス中で活性であることを実証する。これは図２９および３１に提供されるデータによって支持される。
完全長ＦＫＢＰ−Ｌタンパク質に類似して、ＦＫＢＰ−Ｌ ２４ｍｅｒペプチド（配列番号：１０）は、ある実施形態で、インビボでの腫瘍細胞増殖を阻害する可能性がある（図３１Ａ）。さらに、ＦＫＢＰ−Ｌ ２４ｍｅｒで治療されたマウスは生存の有意な増加を示した（図３１Ｂ〜Ｄ）。したがって、図３１Ａに示されるように、０．３ｍｇ／ｋｇ／日または３×１０−３ｍｇ／ｋｇ／日のいずれかの用量の２４ｍｅｒＦＫＢＰ−Ｌペプチドでのｉ．ｐ．注射による治療は、ビヒクルのみで治療された腫瘍と比較して、ＳＣＩＤマウス中のＤＵ１４５腫瘍の成長を有意に遅らせた。一実施形態では、これらの用量の２４ｍｅｒＦＫＢＰ−Ｌペプチドで治療された腫瘍は、抗血管新生で見られる効果の典型的なものとしての壊死中心の徴候を示す。
一実施形態では、ＦＫＢＰ−Ｌ ２４ｍｅｒペプチドの活性は、完全長ＦＫＢＰ−Ｌと同様に、ペプチドの毒性によるものではない（図３１Ｅ、３２、および３３）。
ある実施形態では、ＦＫＢＰ−Ｌ ２４ｍｅｒペプチド（配列番号：１０）の部分または断片は治療剤として使用されてもよい。実施例２９（図３４）は、ＦＫＢＰ−Ｌ ２４、ＦＫＢＰ−Ｌ １〜５７、および完全長ＦＫＢＰ−Ｌに類似する活性および効力を有する可能性がある、ＦＫＢＰ−Ｌ ２４ｍｅｒのペプチド断片の例を提供する。
ＦＫＢＰ−Ｌ誘導体
上記に記載されるように、本発明での使用のためのＦＫＢＰ−Ｌ誘導体は、ＦＫＢＰ−Ｌのアミノ酸配列、たとえば配列番号：１、配列番号：２、もしくは配列番号：２９、またはその断片に変化を与えることにより修飾されるポリペプチドまたはそれに少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるポリペプチドまたは官能基（たとえばＰＥＧ）の追加によって修飾されたそのようなペプチドを意味する。そのようなペプチドの生成は、ポリペプチドをコードする核酸の操作によってまたはタンパク質自体を変えることによって実行されてもよい。
配列番号：２では、ＦＫＢＰ−Ｌ挿入断片（当初はＣａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社によってＰＵＣ１８中にクローニングされ、現在ｐｃＤＮＡ３．１中にクローニングされている）は；ＰＵＢＭＥＤデータベースに委託された配列（配列番号：２９）と比較して、２つの挿入された点突然変異を有した。したがってセリン（Ｓ）をトレオニン（Ｔ）に変換する５４０ｂｐ（開始コドンから）での点突然変異：ＴＣＴからＡＣＴがある（アミノ酸：１８１）。したがってアルギニン（Ｒ）をグリシン（Ｇ）に変換する５５５ｂｐ（開始コドンから）での点突然変異：ＡＧＧからＧＧＧもまたある（アミノ酸：１８６）。両ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチド（配列番号：２および配列番号：２９）は生物活性を表す。
ＦＫＢＰ−Ｌ誘導体は、天然ＦＫＢＰ−Ｌアミノ酸配列の類似体を含み、１つまたは複数のアミノ酸の挿入、追加、欠失、および／または置換を含んでもよいが、切断型突然変異体Δ４８（配列番号：７）、Δ５８（配列番号：６）、Δ８６（配列番号：５）、Δ１５１（配列番号：４）、またはΔ２００（配列番号：３）（図１）に対応する部分に類似する血管新生効果をもたらすことができるポリペプチドを提供する。さらに、Δ５８（配列番号：６）に由来するポリペプチドは、本発明のＦＫＢＰ−Ｌ誘導体に含まれ、図１に示されるＦＫＢＰ−Ｌ ２４ｍｅｒ（配列番号１０）およびペプチド１〜１７（配列番号：１２〜２８）を含む。
したがって、ある実施形態では、ＦＫＢＰ−ＬのＮ末端ドメイン（アミノ酸３４〜５７）は抗血管新生特性にとって重要である。図２０Ｃおよび実施例１７は、時間が一致するネガティブコントロールと比較して、細胞の遊走を阻害する有効性について多種多様のＦＫＢＰ−Ｌ断片を比較する研究を示す。一実施形態では、Δ５８断片は、試験された断片の最大の阻害活性を表す。
血管新生の阻害を提供するＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドの部分は、活性ペプチドΔ４８（配列番号：７）およびΔ５８（配列番号：６）に共通のＦＫＢＰ−Ｌの部分を含むポリペプチド中に見つけられる可能性がある。このポリペプチドは配列番号：１０（図１）を含んでもよい。
したがって、本発明の方法および組成物に使用されるＦＫＢＰ−Ｌ誘導体はまた、自然発生ＦＫＢＰ−Ｌの断片、部分、または突然変異体を含む。ある実施形態では、断片はＦＫＢＰ−ＬのＮ末端ドメインから選択される。ある実施形態では、断片は、完全長ＦＫＢＰ−Ｌ（たとえば配列番号：２または２９）のアミノ酸１〜８５から選択される。好ましくは、そのような類似体は、５つまたはより少数のアミノ酸、より好ましくは４つまたはより少数、さらに好ましくは３つまたはより少数、最も好ましくは１つまたは２つのアミノ酸のみの挿入、追加、欠失、および／または置換を含む。
本発明によるＦＫＢＰ−Ｌ誘導体はまた、そのようなＦＫＢＰ−Ｌポリペプチド、類似体、または断片配列、たとえば配列番号：１〜７、配列番号：１０〜２８を含む多量体ペプチドおよびそのような配列を含むプロドラッグを含む。たとえば、ある実施形態では、ＦＫＢＰ−ＬまたはＦＫＢＰ−Ｌの断片は、単量体の間のジスルフィド結合の形成によって多量体を形成してもよい。
本発明のＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドの誘導体は、結合パートナー、たとえばエフェクター分子、標識、薬品、毒素、および／または担体もしくは輸送分子に連結されたポリペプチドを含んでもよい。ペプチジルおよび非ペプチジル結合パートナーに本発明のポリペプチドを結合するための技術は当技術分野でよく知られている。
ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドの「断片」は、少なくとも６つのアミノ酸のアミノ酸残基のストレッチを意味する。
本発明のＦＫＢＰ−Ｌ誘導体は融合ペプチドを含む。たとえば、誘導体は、たとえば、疾患組織、たとえば腫瘍組織、網膜にペプチドを向ける抗体に連結された本発明のポリペプチドペプチドを含んでもよい。
ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドまたはそれらの類似体は、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）の定常ドメインまたはその部分（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、もしくはその任意の組み合わせ）と融合し、キメラポリペプチドをもたらしてもよい。これらの融合ポリペプチドまたはタンパク質は、精製を促進することができ、半減期の増加をインビボで示す可能性がある。そのような融合タンパク質は、単量体ポリペプチドまたはその断片単独よりも、他の分子に結合し、それを失活させるのにより効率的である可能性がある。たとえばFountoulakis et al., J. Biochem., 270:3958-3964 (1995)を参照されたい。
本発明の融合タンパク質はまた、アルブミン、たとえば組換えヒト血清アルブミンと融合されたＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドまたはその断片もしくは変異体を含む（たとえば米国特許第５８７６９６９号、欧州特許第０４１３６２２号、米国特許第５７６６８８３号を参照されたい）。
本明細書に記載されるそのような融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの使用もまた本発明によって包含される。細胞毒性剤に融合されたポリヌクレオチドの使用もまた本発明によって包含される。この事例では、ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドは受容体に結合し、細胞毒を内部移行することができる。
たとえば、代替の実施形態では、誘導体は、次のものを含んでもよい：半減期を増加させるためのペプチドの部位特異的なＰＥＧ化（など）；またはタンパク質分解に対して安定化するための非天然アミノ酸の組み込みおよびバックボーン修飾；または環状誘導体（タンパク質分解抵抗性を提供する）；またはエキソペプチダーゼおよび／もしくはプロテイナーゼ活性を予防するもしくは低下させるためのＮおよびＣ末端のブロック；または細胞表面ＣＤ４４との「結合力」を増加させるための、リンカー鎖を介した、連続した鎖でのもしくはデンドリマー型のアプローチでのペプチドの複数のコピーのつなぎ合わせ。たとえば、２４ｍｅｒの三量体共有結合誘導体はＦＫＢＰ−Ｌの誘導体として使用されてもよい。または、ＦＫＢＰ−Ｌ ２４ｍｅｒは、ホモ三量体を形成するドメインに付けて、非共有結合三量体を形成してもよい。または、ストレプトアビジンと四量体の複合体を形成するペプチドのビオチン誘導体がＦＫＢＰ−Ｌの誘導体として使用されてもよい。または、ＦＫＢＰ−ＬまたはＦＫＢＰ−Ｌの断片は、単量体の間のジスルフィド結合の形成によって多量体を形成してもよい。そのうえ、ＦＫＢＰ−Ｌは、非共有結合を通して、おそらくタンパク質配列内の予測されるテトラトリコペプチド反復ドメインを通してオリゴマーを形成してもよい。
逆のペプチド類似体
本発明での使用のための類似体は、天然ＦＫＢＰ−Ｌタンパク質、その部分、またはそれらの合成誘導体の逆向き類似体または逆類似体をさらに含む。たとえば、欧州特許第０４９７３６６号、米国特許第５５１９１１５号、およびMerrifield et al., 1995, PNAS, 92:3449-53を参照されたい、それらの開示は、参照によって本明細書に組み込まれる。欧州特許第０４９７３６６号に記載されるように、逆向きペプチドは、自然発生または合成ペプチドのアミノ酸配列を逆向きすることにより産生される。そのような逆向きペプチドは、内部のプロテアーゼ感受性部位のあたりの立体構造ならびにＮおよびＣ末端の特徴を除いて、親ペプチドと同じ一般的な三次元構造（たとえばアルファヘリックス）を保持する可能性がある。逆向きペプチドは、逆向きではない、「通常の」ペプチドの生物活性を保持するだけではなく、生物活性の増加を含む特性の増強を持つ可能性があるとされている。（Iwahori et al., 1997, Biol. Pharm. Bull. 20: 267-70を参照されたい）。したがって、本発明での使用のための誘導体は、天然および合成ＦＫＢＰ−Ｌタンパク質の逆向きペプチドを含んでもよい。
本発明での使用のためのペプチド（逆向きペプチドおよび断片のどちらも含む）は、化学合成によってまたは核酸からの発現によって全体としてまたは部分的に生成されてもよい。本発明での使用のためのペプチドは、当技術分野で知られている十分に確立された標準の液相または好ましくは固相ペプチド合成法に従って容易に調製することができる（たとえばM. Bodanzsky and A. Bodanzsky, The Practice of Peptide Synthesis, Springer Verlag, New York (1984)中のJ. M. Stewart and J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd edition, Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois (1984)を参照されたい。
多量体ペプチド
上記に記載されるように、ペプチドは多量体の形態をしていてもよい。したがって、２つ、３つ、もしくはそれ以上の個々のＦＫＢＰ−Ｌポリペプチド単量体ユニットまたはＦＫＢＰ−Ｌの２つもしくはそれ以上の断片の多量体は本発明の範囲内にある。
一実施形態では、そのような多量体は、単量体ユニットおよび切断可能な部位（つまり酵素で切断可能な部位）を含む多量体ペプチドを調製し、次いで多量体を切断して、所望の単量体を得ることによって単量体ペプチドを調製するために使用することができる。
一実施形態では、多量体の使用は、受容体に対する結合親和性を増加させることができる。
多量体はホモマーまたはヘテロマーとすることができる。本明細書で使用されるように、用語ホモマーは、特異的なアミノ酸配列（たとえば配列番号：１、配列番号：２、配列番号：１０、もしくは配列番号：２９）または変異体、スプライス変異体、融合タンパク質、または本明細書に記載される他のＦＫＢＰ−Ｌ類似体もしくは誘導体に対応するポリペプチドのみを含有する多量体を指す。これらのホモマーは、同一のまたは異なるアミノ酸配列を有するＦＫＢＰ−Ｌペプチドを含有していてもよい。たとえば、多量体は、同一アミノ酸配列を有するＦＫＢＰ−Ｌペプチドのみを含むことができるまたは異なるアミノ酸配列を含むことができる。多量体は、ホモ二量体（たとえば、ＦＫＢＰ−Ｌペプチドのみを含有する、これらは同様に同一のもしくは異なるアミノ酸配列を有していてもよい）、ホモ三量体、またはホモ四量体とすることができる。
本明細書で使用されるように、用語ヘテロマーは、本明細書に記載されるＦＫＢＰ−Ｌ（ポリ）ペプチドに加えて、１つまたは複数の異種ポリペプチド（つまり非ＦＫＢＰ−Ｌペプチドまたはポリペプチド）を含有する多量体を指す。
多量体は、疎水性結合、親水性結合、イオン性結合、および／もしくは共有結合の結果であってもよくならびに／またはたとえばリポソーム形成によって間接的に連結されてもよい。したがって、一実施形態では、多量体は、本明細書に記載されるＦＫＢＰ−Ｌペプチドが互いに溶液中で接触する場合に形成される。他の実施形態では、ヘテロ多量体は、ＦＫＢＰ−Ｌおよび非ＦＫＢＰ−Ｌ（ポリ）ペプチドが、本明細書に記載される（ポリ）ペプチドに対する抗体（本明細書に記載される融合タンパク質中の異種（ポリ）ペプチド配列に対する抗体を含む）に溶液中で接触する場合に形成される。他の実施形態では、本明細書に記載される多量体は、本明細書に記載されるＦＫＢＰ−Ｌペプチド（所望により非ＦＫＢＰ−Ｌペプチド）の間のおよび／またはそれとの共有結合によって形成されてもよい。
そのような共有結合は、ＦＫＢＰ−Ｌ配列（たとえば配列番号：１〜２８に記載される配列中に含有される１つまたは複数のアミノ酸残基を含むことができる。一実施形態では、共有結合は化学的または組換え操作の結果である。あるいは、そのような共有結合は、ＦＫＢＰ−Ｌ融合タンパク質中の異種ポリペプチド配列中に含有される１つまたは複数のアミノ酸残基を含むことができる。ある例では、共有結合は、本明細書に記載される融合タンパク質中に含有される異種配列の間にある（たとえば米国特許第５４７８９２５号を参照されたい）。他の特定の例では、本明細書に記載される融合タンパク質の共有結合は、共有結合多量体を形成することが可能な他のタンパク質、たとえばオステオプロテゲリンからの異種ポリペプチド配列を使用する（たとえば国際公開第９８／４９３０５号を参照されたい）。他の実施形態では、本明細書に記載される２つまたはそれ以上のポリペプチドはペプチドリンカーを通してつながれる。例として、米国特許第５０７３６２７号中に記載されるペプチドリンカーを含む。ペプチドリンカーによって隔てられた多数のＦＫＢＰ−Ｌペプチドを含むタンパク質は従来の組換えＤＮＡ技術を使用して産生することができる。
多量体はまた、ロイシンジッパーまたはイソロイシンジッパーポリペプチド配列にＦＫＢＰ−Ｌ（ポリ）ペプチドを融合させることにより調製されてもよい。知られているロイシンジッパーの中には、二量体化するまたは三量体化する自然発生ペプチドおよびその誘導体がある。本明細書に記載される可溶性多量体タンパク質を産生するのに適したロイシンジッパードメインの例はＰＣＴ出願国際公開第９４／１０３０８号に記載されるものである。溶液中で二量体化するまたは三量体化するポリペプチド配列に融合された、本明細書に記載されるポリペプチドを含む組換え融合タンパク質は、適した宿主細胞中で発現することができ、結果として生じる可溶性多量体融合タンパク質は、当技術分野で知られている技術を使用して培養上清から回収することができる。
多量体はまた、当技術分野で知られている化学的技術を使用して生成されてもよい。たとえば、本明細書に記載される多量体中に含有されることになるポリペプチドは、当技術分野で知られているリンカー分子およびリンカー分子長最適化技術を使用して化学的に架橋されてもよい（たとえば米国特許第５４７８９２５号を参照されたい）。加えて、多量体は、多量体中に含有されることが所望のポリペプチドの配列内に位置するシステイン残基の間に１つまたは複数の分子間架橋を形成するための当技術分野で知られている技術を使用して生成することができる（たとえば米国特許第５４７８９２５号を参照されたい）。さらに、本明細書に記載されるポリペプチドは、ポリペプチドのＣ末端またはＮ末端へのシステインまたはビオチンの追加によってルーチン的に修飾されてもよく、当技術分野で知られている技術は、１つまたは複数のこれらの修飾ポリペプチドを含有する多量体を生成するために適用されてもよい（たとえば米国特許第５４７８９２５号を参照されたい）。加えて、当技術分野で知られている技術は多量体中に含有されていることが所望される２つまたはそれ以上のＣ−１２−Ｃペプチドを含有するリポソームを調製するために使用することができる（たとえば米国特許第５４７８９２５号を参照されたい）。
あるいは、自然発生アミノ酸のみを含む多量体は、当技術分野で知られている遺伝子工学技術を使用して形成することができる。あるいは、翻訳後または他の修飾を含む多量体は、組換え技術および化学的修飾の組み合わせによって調製することができる。一実施形態では、ＦＫＢＰ−Ｌペプチドは、本明細書に記載されるまたはそうでなければ当技術分野で知られている融合タンパク質技術を使用して組換えで産生される（たとえばその全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第５４７８９２５号を参照されたい）。たとえば、本明細書に記載されるホモ二量体をコードするポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるＦＫＢＰ−Ｌペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を、リンカーポリペプチドをコードする配列に、次いでさらに、もとのＣ末端からＮ末端に逆方向にそのポリペプチドの翻訳産物をコードする合成ポリヌクレオチド（リーダー配列を欠く）にライゲーションすることによって生成することができる（たとえば米国特許第５４７８９２５号を参照されたい）。本明細書に記載されるまたはそうでなければ当技術分野で知られている組換え技術は、膜貫通ドメイン（または疎水性またはシグナルペプチド）を含有し、リポソーム中に膜再構成技術によって組み込むことができる組換えＦＫＢＰ−Ｌ（ポリ）ペプチドを生成するために適用することができる（たとえば米国特許第５４７８９２５号を参照されたい）。
プロドラッグ
本明細書に記載されるポリペプチドは、少なくともいくつかの実施形態では、血管新生と関連する障害を治療するまたは予防するためにヒトまたは他の哺乳動物に投与されることが意図される。ペプチドは、典型的に非経口的に、たとえば、静脈内、皮下、もしくは筋肉内注射によってまたは鼻腔内腔を介して投与され、血漿プロテアーゼによって容易に代謝される可能性がある。いくつかの場合では、ＦＫＢＰ−Ｌペプチドは、３０日間にわたって、ポリ（ＤＬ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）制御放出のマイクロカプセルで送達されてもよい。
治療効果のあるペプチドの非経口および経口投与を可能にする多種多様のプロドラッグが開発されている。ペプチドまたはポリペプチドは、ペプチド薬品の生理化学的特性を修飾するために、たとえば酸性分解および酵素的分解に対する抵抗性を増加させるためにならびに粘膜を横切ってそのような薬品が浸透するのを増強するために重合体成分等の多種多様の成分に抱合することができる。たとえば、ＡｂｕｃｈｏｗｓｋｉおよびＤａｖｉｓは、水溶性、非免疫原性、インビボ安定化産物を提供するために酵素を誘導体化する多種多様の方法を記載している（“Soluble polymers-Enzyme adducts,”Enzymes as Drugs, Eds. Holcenberg and Roberts, J. Wiley and Sons, New York, N.Y. (1981)）。
したがって、ある実施形態では、ＦＫＢＰ−Ｌペプチドは、デキストラン、ポリビニルピロリドン、糖ペプチド、ポリエチレングリコール、およびポリアミノ酸等の重合体に抱合されてもよい。結果として生じる抱合ポリペプチドは、非経口の適用のために水中でそれらの生物活性および可溶性を保持する。一実施形態では、ＦＫＢＰ−Ｌペプチドは、生理活性非免疫原性水溶性ポリペプチド組成物を提供するために、５００〜２０，０００ダルトンの分子量を有するポリエチレングリコールまたはポリプロプロピレングリコールに結合されてもよい（たとえば米国特許第４１７９３３７号およびGarman, A.J., and Kalindjian, S.B., FEBS Lett., 1987, 223, 361-365を参照されたい）。ポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコールは活性の損失からポリペプチドを保護する可能性があり、その組成物は、実質的に免疫原性応答を伴うことなく哺乳動物循環系に注射することができる。他の実施形態では、ＦＫＢＰ−Ｌは、親油性および親水性成分を含むオリゴマーに結合される（たとえば米国特許第５６８１８１１号、第５４３８０４０号、および第５３５９０３０号を参照されたい）。
プロドラッグは、たとえば第１に多分散ＭＰＥＧ５０００から無水マレイン酸試薬を調製し、次いで、この試薬を本明細書に開示されるポリペプチドに抱合することにより調製することができる。無水マレイン酸とのアミノ酸の反応はよく知られている。アミン含有薬品を改良するためのマレイルアミド結合の加水分解は、近隣の遊離カルボキシル基の存在およびその二重結合によって構成される攻撃に関しての幾何学的配置によって援助される。ペプチドは、生理学的条件下で放出され得る（プロドラッグの加水分解によって）。
ポリペプチドはまた、分解可能な連結、たとえば、Roberts, M.J., et al., Adv. Drug Delivery Rev., 2002, 54, 459-476に示される（ペグ化インターフェロンα−２ｂに関して）分解可能な連結を介した多分散ＰＥＧ等の重合体に結合することができる。
ポリペプチドはまた、１，６または１，４ベンジル脱離（ＢＥ）戦略（たとえばLee, S., et al., Bioconjugate Chem., (2001), 12, 163-169; Greenwald, R.B., et al., U.S. Patent No. 6,180,095, 2001; Greenwald, R.B., et al., J. Med. Chem., 1999, 42, 3657-3667.を参照されたい）；トリメチルロック（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ ｌｏｃｋ）ラクトン化（ＴＭＬ）の使用（Greenwald, R.B., et al., J. Med. Chem., 2000, 43, 475-487）；ヒドロキシ端カルボン酸リンカーへのＰＥＧカルボン酸の結合（Roberts, M.J., J. Pharm. Sci., 1998, 87(11), 1440-1445）、ならびにカルバメートおよびＰＥＧアミドまたはエーテルの間にメタの関係を含むプロドラッグ構造を含む（Ｂｅｎｔｌｙらの米国特許第６４１３５０７号）、アリルカルバメートを介してアミン含有薬品に連結された、ＭＰＥＧフェニルエーテルおよびＭＰＥＧベンズアミドのファミリーを含むＰＥＧプロドラッグ（Roberts, M.J., et al., Adv. Drug Delivery Rev., 2002, 54, 459-476）；ならびに加水分解メカニズムとは対照的に還元メカニズムを伴うプロドラッグ（Zalipsky, S., et al., Bioconjugate Chem., 1999, 10(5), 703-707）を使用して、ＰＥＧ等の重合体に連結させることができる。
本発明のＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドは、遊離アミノ基、アミド基、ヒドロキシ基、および／またはカルボキシル基を有し、これらの官能基はペプチドをプロドラッグに変換するために使用することができる。プロドラッグは、アミノ酸残基または２つもしくはそれ以上（たとえば２つ、３つ、もしくは４つ）のアミノ酸残基のポリペプチド鎖が、多種多様の重合体、たとえばポリエチレングリコール等のポリアルキレングリコールの遊離アミノ基、ヒドロキシ基、またはカルボン酸基と、ペプチド結合を通して共有結合でつながれた化合物を含む。
プロドラッグはまた、ＰＥＧ、カルボネート、カルバメート、アミド、およびアルキルエステルがＣ末端カルボン酸を通して上記のペプチドと共有結合した化合物を含む。たとえば、本明細書で使用されるペプチド１はＣ末端ＰＥＧ基を有するＦＫＢＰ−Ｌペプチドである。したがって、本発明の実施形態は部位特異的なＰＥＧの追加を含む。
ある実施形態では、酵素阻害剤が、胃腸管中でタンパク質およびペプチドの分解の速度を遅らせるために使用されてもよい。または、消化管中のｐＨが、局所の消化酵素を不活性化するために操作されてもよい。または、浸透エンハンサーが、ペプチドの吸収を、それらの傍細胞輸送および経細胞輸送を増加させることによって改善するために使用されてもよい。または、ナノ粒子が、腸管上皮、とりわけパイエル板による完全な吸収を促進するためにおよび酵素分解に対する抵抗性を増加させるために微粒子担体として使用されてもよい。他の実施形態では、液状エマルジョンが、腸管腔中での化学的分解および酵素的分解から薬品を保護するために使用されてもよく、またはミセル製剤が低水可溶化薬品に使用されてもよい。
したがって、代替の実施形態では、ポリペプチドは、腸溶コーティングを有する適切なカプセル剤または錠剤中に提供することができ、その結果、ペプチドは胃中で放出されない。あるいはまたは加えて、ポリペプチドは、上記に記載されるプロドラッグ等のプロドラッグとして提供することができる。一実施形態では、ポリペプチドは、プロドラッグとしてこれらの薬品デリバリーデバイス中に存在する。
本発明のポリペプチドを含むプロドラッグまたは本発明のペプチド（類似体および断片を含む）が放出されるもしくは放出可能なプロドラッグは本発明の類似体であると考えられる。
同位体標識されたペプチドまたはペプチドプロドラッグの使用もまた本発明によって包含される。そのようなペプチドまたはペプチドプロドラッグは、１つまたは複数の原子が、自然界で普通に見つけられる原子質量または質量数と異なる原子質量または質量数を有する原子と交換されなければ、本発明のペプチドまたはペプチドプロドラッグに同一である。本発明の化合物中に組み込むことができる同位体の例は、それぞれ２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、１７Ｏ、１２５Ｉ、および３５Ｓ等の水素、炭素、窒素、酸素、亜リン酸、硫黄、フッ素、ヨウ素、および塩素の同位体を含む。本発明のポリペプチド、そのプロドラッグ、ならびに／または上述の同位体および／もしくは他の原子の他の同位体を含有するプロドラッグは本発明の範囲内にある。本発明のある種の同位体標識化合物、たとえば３Ｈおよび１４Ｃ等の放射性同位体が組み込まれた化合物は薬品および／または基質の組織分布アッセイに有用である。トリチウム化、つまり３Ｈおよび炭素−１４、つまり１４Ｃの同位体は、調製および検出性のそれらの容易性のために特に好ましい。さらに、重水素、つまり２Ｈ等のより重い同位体での置換により、よりすぐれた代謝安定性に起因するある種の治療上の利点、たとえばインビボ半減期の増加または投薬必要量の低下を得ることができ、したがって、いくつかの状況で好ましい可能性がある。同位体標識ペプチドおよびそのプロドラッグは、非同位体標識試薬、たとえば標識アミノ酸の代わりに容易に入手可能な同位体標識試薬を用いることを含む、容易に知られている手順を実行することによって一般に調製することができる。
核酸
本発明での使用のためのペプチドは発現系での核酸の使用によって産生されてもよい。たとえば、一態様では、本発明で使用されてもよい核酸は、本発明のポリペプチドをコードする任意の単離ポリヌクレオチドを含む。好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号：３０〜３９に示される核酸配列のうちのいずれか１つを含む（図２）。ＦＫＢＰ−Ｌのさらなる断片、たとえば配列番号：１０〜２８をコードする配列は完全長核酸配列に由来してもよく、当技術分野で知られているように、縮重核酸配列を含んでもよい。実施例１、２、および１７は、本発明のＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドを発現するために使用されてもよいベクターの説明を提供する。
本発明での使用のためのＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドをコードする核酸分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含んでもよい。核酸構築物は、組換えで、合成的に、または標準の技術を使用するクローニングを含む、当業者らに入手可能な任意の手段によって産生されてもよい。
核酸分子は任意の適切なベクター中に挿入されてもよい。本発明の核酸を含むベクターは本発明のさらなる態様を形成する。一実施形態では、ベクターは発現ベクターであり、核酸は、宿主細胞中での核酸の発現を提供することが可能な制御配列に作動可能に連結される。種々様々のベクターを使用することができる。たとえば、適したベクターは、ウイルス（たとえばワクシニアウイルス、アデノウイルス等）、バキュロウイルス）；酵母ベクター、ファージ、染色体、人工染色体、プラスミド、コスミドＤＮＡ、およびリポソーム、ポリプレックス、または細胞（たとえば間葉系幹細胞、マクロファージ）を含んでもよい。
ベクターは、宿主細胞中に本発明の核酸を導入するために使用することができる。多種多様な宿主細胞は、本発明の核酸の発現のために使用することができる。本発明で使用される適した宿主細胞は原核生物であってもよくまたは真核生物であってもよい。それらは、細菌、たとえばイー・コリ、酵母、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む。使用できる哺乳動物細胞株は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ＮＳＯマウス黒色腫細胞、サルおよびヒトの細胞株およびその派生物、ならびにその他多くのものを含むが、これらに限定されない。
遺伝子産物の発現を調整する、その産物を修飾する、および／またはその産物を特異的に加工する宿主細胞系が使用されてもよい。そのような加工は、グリコシル化、ユビキチン化、ジスルフィド結合形成、および一般的な翻訳後修飾を含んでもよい。
たとえば核酸構築物の調製、突然変異誘発、配列決定、細胞中へのＤＮＡの導入、および遺伝子発現での核酸の操作のための知られている技術およびプロトコールならびにタンパク質の分析に関するさらなる詳細については、たとえば、Current Protocols in Molecular Biology, 2nd ed., Ausubel et al. eds. , John Wiley & Sons, 1992 and, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 3rd edition Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2000を参照されたい。
医薬組成物
本発明は、ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチド（またはＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドをコードする核酸）を含む医薬組成物をさらに提供する。本発明によるおよび本発明に従った使用のための医薬組成物は、有効成分に加えて、薬学的に許容し得る添加剤、担体、バッファー、安定剤、または当業者らによく知られている他の物質を含んでもよい。そのような物質は無毒であるべきであり、有効成分の効能に干渉するべきでない。担体または他の物質の厳密な性質は投与の経路に依存する。経路はたとえば経口、静脈内、または局所的であってもよい。
製剤は、液剤、たとえばｐＨ６．８〜７．６の非リン酸バッファーを含有する生理的食塩水または凍結乾燥粉末であってもよい。
用量
組成物は、好ましくは、「治療有効量」で個人に投与され、これは、個人に対する有益性を示すのに十分なものとする。投与される実際の量ならびに投与の速度および時間的経過は、治療されているものの性質および重症度に依存する。治療の処方、たとえば投薬量等に関する決定は、最終的に、一般開業医および他の医師の責任の範囲内にあり、彼らの判断によるものであり、典型的には、治療する障害、個々の患者の状態、デリバリーの部位、投与の方法、および開業医に知られている他の要因を考慮する。
代替の実施形態では、ＦＫＢＰＬ ２４ｍｅｒの用量範囲は、３０ｍｇ／ｋｇ／日〜０．００００３ｍｇ／ｋｇ／日、３ｍｇ／ｋｇ／日〜０．０００３ｍｇ／ｋｇ／日、または０．３ｍｇ／ｋｇ／日〜０．０３ｍｇ／ｋｇ／日となる。これらの用量は、それぞれインビトロで１０−５Ｍ〜１０−１２Ｍ、１０−６Ｍ〜１０−１１Ｍ、または１０−７Ｍ〜１０−１０Ｍに当量である。
投与
Ａ．ＦＫＢＰ−Ｌペプチド
本発明のポリペプチドおよび本発明での使用のためのポリペプチドは、単独で投与されてもよいが、好ましくは、医薬組成物として投与される。この医薬組成物は、投与の意図した経路に依存して選択された適した医薬添加剤、希釈剤、または担体を一般に含む。
ポリペプチドは任意の適した経路を介して治療を必要とする患者に投与されてもよい。厳密な用量は、ペプチドの厳密な性質を含む多くの要因に依存する。
投与のいくつかの適した経路は、経口、直腸、経鼻、局所的（頬側および舌下を含む）、皮下、腟内、または非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内、髄腔内、および硬膜外を含む）投与を含むが、これらに限定されない。
静脈内注射または病気の部位での注射については、有効成分は、発熱物質なしの、適したｐＨ、等張性、および安定性を有する、非経口的に許容し得る水溶液の形態となる。当業者らは、たとえば、塩化ナトリウム注射液、リンガー注射液、乳酸加リンガー注射液等の等張ビヒクルを使用して、適した溶液を調製することが十分に可能である。防腐剤、安定剤、バッファー、酸化防止剤、および／または他の添加剤を、必要に応じて含んでもよい。
経口投与のための医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、散剤、または液剤の形態であってもよい。錠剤は、ゼラチンまたは佐剤等の固形担体を含んでもよい。液剤医薬組成物は、一般に、水、石油、動物油もしくは植物油、鉱油、または合成油等の液剤担体を含む。生理的食塩水、ブドウ糖もしくは他の糖類溶液、またはエチレングリコール、プロピレングリコール、もしくはポリエチレングリコール等のグリコールを含んでもよい。
組成物はまた、マイクロスフェア、リポソーム、他の微粒子デリバリー系、または血液を含むある種の組織中に配置された徐放性製剤を介して投与されてもよい。徐放性担体の適した例は、等分された製品、たとえば坐剤、マイクロカプセルの形態の半透性重合体マトリックスを含む。移植可能なまたはマイクロカプセルの徐放性マトリックスは、ポリラクチド（米国特許第３７７３９１９号；ＥＰ−Ａ−００５８４８１）、Ｌ−グルタミン酸およびガンマエチル−Ｌ−グルタメートの共重合体（Sidman et al, Biopolymers 22(1): 547-556, 1985）、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、またはエチレン酢酸ビニル（Langer et al, J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277, 1981, and Langer, Chem. Tech. 12:98-105, 1982）を含む。ポリペプチドを含有するリポソームはよく知られている方法によって調製される：ＤＥ３２１８１２１Ａ；Epstein et al, PNAS USA, 82: 3688-3692, 1985；Hwang et al, PNAS USA, 77: 4030-4034, 1980；ＥＰ−Ａ−００５２５２２；Ｅ−Ａ−００３６６７６；ＥＰ−Ａ−００８８０４６；ＥＰ−Ａ−０１４３９４９；ＥＰ−Ａ−０１４２５４１；ＪＰ−Ａ−８３−１１８０８；米国特許第４４８５０４５号および第４５４４５４５号。たいていは、リポソームは、脂質含有量が約３０ｍｏｌコレステロールパーセントを超える小さな（約２００〜８００オングストローム）単層型であり、その選択された割合は、ポリペプチド漏出の最適な速度に合わせている。
上記に述べられる技術およびプロトコールならびに本発明に従って使用されてもよい他の技術およびプロトコールの例は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A. (ed), 1980に見出すことができる。
さらに、標的療法は、抗体または細胞特異的リガンド等の標的系の使用によって、より具体的にはたとえば新生物組織または網膜組織に、活性剤、たとえばポリペプチドを送達するために使用されてもよい。
他の実施形態では、精製組換えペプチドまたは合成ペプチドは、架橋を促進することができるタンパク質に部分を結合するために作用物質で処理することができる。これらの成分は、ベンゾフェノン等の光活性化可能な架橋剤またはマレイミドもしくは活性化エステル等の化学的架橋剤とすることができる。したがって、たとえば、ＦＫＢＰＬ中のシステイン残基を、光活性化可能な架橋のためのベンゾフェノンのマレイミド誘導体もしくはフェニルアジドのマレイミド誘導体とまたはたとえばマレイミドおよび活性化エステルを含有するヘテロ二官能性架橋物と反応させることが可能である。当技術分野で知られているように、ＦＫＢＰＬに付けることができた種々様々のヘテロおよびホモ二官能性架橋剤があり、次いで、アミド、チオエーテル、ヒドラゾン、オキシム等の形成反応を通して他の生体分子に架橋するために使用される。一実施形態では、完全な化学合成手順を使用して、部位特異的な様式で合成ペプチド中にこれらの架橋物を導入することが可能である。あるいは、光活性化可能な基は具体的にはＣ末端に導入されてもよく、または架橋物は、タンパク質ライゲーションアプローチを使用して特異的な様式で組換えＦＫＢＰＬ中に導入されてもよい。
ＦＫＢＰ−Ｌペプチドはまた、より詳細に本明細書に記載されるようにさらなる治療剤と共に投与されてもよい。
Ｂ．核酸コードＦＫＢＰ−Ｌまたはアンチセンス／ｓｉＲＮＡ ＦＫＢＰ−Ｌ
一実施形態では、ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドのコード配列または核酸は発現ベクター中に挿入される。次いで、対象とする宿主細胞中で作動可能なプロモーターを含む調節配列は、分子技術を使用してｃＤＮＡ配列に連結されてもよい。１つまたは複数のエンハンサー配列、機能的スプライス供与部位およびスプライス受容部位を有するイントロン、組換えポリペプチドの分泌を指示するためのシグナル配列、ポリアデニル化配列、他の転写終結配列、ならびに宿主細胞ゲノムに相同の配列等の他の調節配列もまた使用することができる。複製開始点等の他の配列は、所望の産物の発現を最適化するためにベクターに同様に追加することができる。さらに、選択可能なマーカーは、形質転換宿主細胞中のその存在の選択のためにベクター中に含まれていてもよい。
調節配列は多種多様の供給源に由来してもよい。たとえば、それらのうちの１つまたは複数は、通常、コード配列と関連し得る、または対象とする宿主細胞中に存在する調節因子系に由来してもよく、もしくはそれと相同であってもよい。発現ベクターの多種多様の成分は、直接または当技術分野で知られている制限酵素による認識の部位を構成するリンカーを介して一緒に連結させることができる。
ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドをコードする核酸の発現を可能にする任意のプロモーターを本発明で使用することができる。たとえば、使用することができる哺乳動物プロモーター配列は、高度に発現され、かつ広範な宿主範囲を有する哺乳動物ウイルスからのものとする。
プロモーターは、ほとんどの哺乳動物細胞中で恒常的に発現されるプロモーターであってもよい。真核生物中で可能な恒常的発現をなす適切なエレメントの例は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって認識されるプロモーターまたはたとえばＭＭＴＶ（マウス乳腺腫瘍ウイルス）からのウイルスプロモーター、ＣＭＶエンハンサー、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、もしくはＬＴＲプロモーター（たとえばLee et al., 1981, Nature, 214, 228-232）ならびにたとえばＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＳＶ、ＨＰＶ、ＥＢＶ、ＨＴＬＶ、またはＨＩＶに由来する他のウイルスプロモーターおよびアクチベーター配列である。真核生物中で可能な調節された発現をなす要素の他の例は、対応するリプレッサーと組み合わせたテトラサイクリンオペレーターである（Gossen M., et al., 1994, Curr. Opin. Biotechnol., 5, 516-20）。一実施形態では、ＦＫＢＰ−Ｌ配列の発現は組織特異的プロモーターの制御下で起こってもよい。
あるいは、プロモーターは、細胞周期または発達段階の特定の時期に作動されるプロモーターであってもよい。たとえば、構築物は、ある種の細胞型中でのみ発現されるタンパク質をコードするそれらの遺伝子のプロモーターまたはエンハンサーからのプロモーターまたはアクチベーター配列等の、真核生物中で可能な組織特異的発現をなす調節エレメントを含んでもよい。真核生物中で可能な細胞周期特異的発現をなす調節エレメントの例は以下の遺伝子のプロモーターである：ｃｄｃ２５Ａ、ｃｄｃ２５Ｂ、ｃｄｃ２５Ｃ、サイクリンＡ、サイクリンＥ、ｃｄｃ２、Ｅ２Ｆ−１〜Ｅ２Ｆ−５、Ｂ−ｍｙｂ、またはＤＨＦＲ（たとえば米国特許第６８５６１８５号；米国特許第６９０３０７８号；およびZwicker J. and Muller R., 1997, Trends Genet., 13, 3-6を参照されたい）。細胞周期調節プロモーターの使用は、本発明に従って使用されるポリペプチドまたは核酸の発現が増殖細胞に限られることとなる場合、使用されてもよい。他の例は、低酸素、放射線、熱などによって制御されるプロモーターを含む。
他の実施形態では、エンハンサーエレメントはプロモーター配列と結合することができる。そのようなエンハンサーは増幅してもよいだけではなく、対象とする遺伝子の発現を調節することができる。哺乳動物発現系での使用のための適したエンハンサーエレメントは、たとえば、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー、ラウス肉腫ウイルスのＬＴＲおよびヒトサイトメガロウイルスに由来するエンハンサー／プロモーター等の広範な宿主範囲を有するウイルスに由来するものである。加えて、他の適したエンハンサーは、当技術分野で知られているホルモン、金属イオン、または酵素基質等の誘発物質の存在下でのみ活性になるプロモーター配列中に組み込むことができるものを含む。
本発明の他の実施形態では、転写終止配列は、対象とする遺伝子のコード配列の翻訳停止コドンに対して３’に配置されてもよい。したがって、終結配列は、プロモーターと一緒に、コード配列の両側に位置する。
発現ベクターはまた、ベクターをレプリコンとして維持することができ、ベクターが宿主中で自律複製し、安定して維持し得るように、複製開始点を含有していてもよい。そのような複製開始点は、発現ベクターが、細胞内の適切なタンパク質の存在下で高コピー数で再生されることを可能にするもの、たとえば酵母中で有効な２μ複製配列および自己複製配列ならびにＣＯＳ−７細胞中で有効である、ＳＶ４０の致命的なＴ抗原の複製開始点を含む。哺乳動物複製系は、複製するためにトランス作用因子を必要とする動物ウイルスに由来するものを含んでもよい。たとえば、適切な致命的なＴ抗原の存在下で非常に高いコピー数まで複製する、ポリオーマウイルスであるＳＶ４０等のパポバウイルスの複製系が使用されてもよく、またはウシパピローマウイルスおよびエプスタイン−バーウイルスに由来するものが使用されてもよい。
いくつかの場合では、発現ベクターは１つを超える複製系を有することができ、したがって、そのベクターが、たとえば、発現のために哺乳動物細胞中でならびにクローニングおよび増幅のために原核生物宿主中で維持されることを可能にする（たとえば米国特許第５６７７２７８号を参照されたい）。
一実施形態では、発現ベクターは、統合ベクターとして宿主細胞ゲノム中に統合するために作製することができる。本明細書の統合ベクターは、ベクターが統合することを可能にする、宿主細胞ゲノムに対して相同の少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含有していてもよい。たとえば、一実施形態では、バクテリオファージまたはトランスポゾン挿入配列が使用されてもよい。
本発明のある実施形態では、１つまたは複数の選択可能なマーカーは、形質転換された宿主細胞の選択を考慮に入れるために発現ベクター中に含むことができる。宿主細胞中で発現することができる選択可能なマーカーは、宿主細胞を、ツニカマイシン、Ｇ４１８、アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン（ネオマイシン）、およびテトラサイクリン等の薬品に対して抵抗性にすることができる遺伝子を含む。選択可能なマーカーはまた、ａｄｅ２、ｈｉｓ４、ｌｅｕ２、ｔｒｐ１等のヒスチジン、トリプトファン、およびロイシン生合成経路の遺伝子等の生合成遺伝子を含み、または金属等の有毒化合物の存在下で成長するための能力を宿主細胞に提供する生合成遺伝子が使用されてもよい。
種々様々の方法は、ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび／またはＦＫＢＰ−ＬアンチセンスＤＮＡもしくはＦＫＢＰ−Ｌ ｓｉＲＮＡをコードする核酸を宿主細胞中に移入するために使用されてもよい。したがって、本発明の製剤は、細胞中への核酸の移入を促進する特異的な成分を含んでもよい。
たとえば、形質移入、形質転換、または感染による真核細胞および／または原核細胞中への核酸の導入を考慮に入れるために、核酸は、ウイルスまたは非ウイルスベクターの一部分としてプラスミドとして存在することができる。適したウイルスベクターは、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、レンチウイルス（たとえばSiprashvili and Khavari, Mol. Ther., 2004, 9, 93-100を参照されたい）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびヘルペスウイルスを含んでもよい。遺伝子治療活性を有するベクターの例は、ウイルスベクター、たとえばアデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターである（Lindemann et al., 1997, Mol. Med., 3, 466-76; Springer et al., 1998, Mol. Cell., 2, 549-58）。さらに、裸のＤＮＡはある種の細胞に浸透することができるので、真核生物発現ベクターは遺伝子治療の使用のために単離形態で適したものとなる（Hengge et al., 1996, J. Clin. Invest., 97, 2911-6; Yu et al., 1999, J. Invest. Dermatol., 112, 370-5）。遺伝子治療ベクターの他の形態は、上記に記載される核酸を金粒子に付加し、これらを組織、好ましくは皮膚にまたは細胞にいわゆる遺伝子銃を用いて撃ち込むことによって得ることができる（Wang et al., 1999, J. Invest. Dermatol., 112, 775-81, Tuting et al., 1998, J. Invest. Dermatol., 111, 183-8）。
代替の実施形態では、リポソームは、細胞中への、ＦＫＢＰ−Ｌをコードするポリヌクレオチドの移入を促進するために使用されてもよい。リポソームは、リン脂質から構成される脂質二重膜を有する人工的に作製された小さな小胞である（Jeschke, M.G. et al., Gene Ther., 12, 1718-24 (2005)；米国特許第６５７６６１８号）。核酸、タンパク質、および他の生物学的物質は、細胞の形質膜との融合を通した哺乳動物細胞へのデリバリーのためにリポソーム中に封入することができる。リポソームは、それらが非ウイルスであり、安定しており、細胞膜と相互作用することができるので、魅力的なデリバリー系となる可能性がある。
リポソームは、陰イオン性、陽イオン性、または中性脂質およびその混合物から構成することができる（Luo, D. & Saltzman, W.M., Nat. Biotech., 18, 33-37 (1999)）。ＤＮＡ移入については、脂質はまた、ＤＮＡ凝縮または放出を促進するよう化学基を組み込むために化学的に修飾することができる。四級アンモニウム界面活性剤、コレステロールおよびジアシルグリセロールの陽イオン性誘導体、およびポリアミンの脂質誘導体等の陽イオン性脂質は、それらがＤＮＡの総負電荷を減少させ、細胞膜とのその相互作用を促進するので、細胞形質移入に好都合となる可能性がある（Nishikawa, M. & Huang, L., Hum. Gene Ther., 12, 861-70 (2001)）。ジオレオイルフォスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジラウリン酸グリセロール、ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル（ＰＯＥ−１０）、およびコレステロール等の中性脂質は、陽イオン性脂質ＤＮＡ複合体中の「ヘルパー脂質」として、その複合体のエンドサイトーシスの取り込み後のエンドソームからのＤＮＡの放出を促進するために追加されてもよい。ＤＮＡに結合される重合体もしくはタンパク質または細胞の核中にＤＮＡをより効率的に輸送することを可能にする合成ペプチドＤＮＡ分子等の、ＤＮＡ移入を増加させる助剤もまた使用することができる（たとえばNiidome, T. & Huang, L., Gene Ther., 9, 1647-52 (2002)を参照されたい）。したがって、ポリリシンまたはプロタミン等の陽イオン性重合体は、それらがＤＮＡの密接な凝縮を引き起こすので、脂質ＤＮＡ複合体中で使用することができ、この凝縮は、複合体凝集およびヌクレアーゼ分解を予防する。たとえば、プラスミドＤＮＡと混合する前の、１，２−ジオレオイル−３−（トリメチルアンモニウム）プロパン（ＤＯＴＡＰ）リポソームの硫酸プロタミンとの混合により、安定した小さな１３５ｎｍ粒子が産生され、種々様々の組織（たとえば肺、肝臓、心臓）中で高レベルの遺伝子発現がもたらされた（Li, S. et al., Gene Ther., 5, 930-37 (1998)）。ヘルパー脂質としてのコレステロールの包含は、リポソームペプチドＤＮＡ複合体の形質移入効率を増加させる可能性がある。さらに、ルシフェラーゼまたはβ−ガラクトシダーゼの遺伝子ＤＮＡは、血清の存在下でも形質移入効率の増強を達成するために、陽イオン性脂質（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＰＲ１１５３３５もしくはＲＰＲ１２０５３５）または重合体（ポリエチレンイミン）の追加の前に、ヒトのヒストンまたはプロタミンに由来する短いペプチドで予め圧縮されてもよい（たとえばSchwartz, B. et al., Gene Ther., 6, 282-92 (1999)を参照されたい）。
当技術分野で知られているように、リポソームは、脂質を加熱して、脂質相を形成することによって作製されてもよい（Wu, H. et al., Int. J. Pharmaceut., 221, 23-24 (2001)）。次いで、水、塩、またはバッファーを含有する水相は、冷却条件下でシリンジの間で混合物を前後に通過させることによって脂質相と混合し、その後、１００〜１４０ｎｍの最終的なリポソームの大きさに達するまで超音波処理を続けてもよい。次いで、リポソーム中に含まれることとなるＤＮＡまたはタンパク質は転倒混和によって（溶液として）添加される。リポソームを作り出す際に使用される脂質の選考、それらの比、使用されるＤＮＡの濃度、および追加されるリポソームの量は、一般に、最適化のために経験的な決定を必要とする。ペプチド等のＤＮＡ移入を促進するための助剤は、リポソーム混合物に追加する前にＤＮＡと混合することができるが、ＤＮＡ助剤は、リポソームの外側の脂質相内に適切にカプセルに包まれるために十分に高い水可溶性を維持しなければならない。
あるいは、小さな単層小胞は、１，２−ジオレイルオキシプロピル−３−トリメチルアンモニウムブロミド（ＤＯＴＭＡ）またはジオレオイルホスファチジルエタノールアミンブロミド（ＤＯＰＥ）と混合された、Ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ ＧＳ ２８８８等の陽イオン性脂質から構成されるリポソーム懸濁液の超音波処理によって調製することができる。転倒混和の後、ＤＮＡが１００％のリポソームと複合体形成している一方で、ＤＮＡまたはタンパク質は、複合体上で陽性の総電荷を維持する比でリポソームの表面にイオン的に結合する可能性がある。さらに、二量体化することができる陽イオン性チオール界面活性剤はＤＮＡのデリバリーのためのリポソームを調製するために使用されてもよい（たとえばDauty, E. et al., J. Am. Chem. Soc., 123, 9227-34 (2001)を参照されたい）。酸化に際して、脂質中のチオール基はジスルフィドに変換することができ、ＤＮＡ脂質複合体を生じさせて、細胞の取り込みのために細胞表面の陰イオン性ヘパリン硫酸塩プロテオグリカンに静電気的に結合することができる安定したナノメートル粒子を形成する。いったん細胞内へ入ると、細胞内のグルタチオンによって提供される還元環境はジスルフィドをチオールに還元し戻し、ＤＮＡを放出する。
治療用抗体
他の実施形態では、本発明は、インビボでＦＫＢＰ−Ｌの活性を特異的にダウンレギュレートするための、ＦＫＢＰ−Ｌ（または下記に論じられるその断片または機能的等価物）に対して免疫学的特異性を有する抗体の治療上の使用に関する。そのような抗体は、ＦＫＢＰ−Ｌ活性の特異的なダウンレギュレーションから利益を得る疾患状態、特に血管新生の刺激／アップレギュレーションから利益を得る疾患／状態の治療に有用である。特定の実施形態では、本発明は、血管新生を促進するための、ＦＫＢＰ−Ｌ（またはその断片もしくは機能的等価物）に対して免疫学的特異性を有する抗体の使用を包含する。一実施形態は、創傷治癒を促進するための、ＦＫＢＰ−Ｌ（またはその断片もしくは機能的等価物）に対する免疫学的特異性を有する抗体の使用に関する。
本明細書で使用される用語「抗体」は、必要とされる免疫学的特異性を有する任意のアイソタイプの精製されたまたは単離された自然発生抗体および合成的に産生された抗体またはその構造的類似体を包含する。抗体の調製物はポリクローナルまたはモノクローナルであってもよい。上記に記載されるそのような「抗体」への言及は、完全抗体分子だけではなく実質的な抗原（つまりＦＫＢＰ−Ｌ）結合能を保持するその断片もまた含む。任意のエフェクター機能は含まれていてもよいが、そのような断片に保持される必要はない。使用されてもよい適した抗体断片は、とりわけ、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＡｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ断片、ナノ抗体等を含む。たとえば、分子のイディオタイプを含有する抗体断片は知られている技術によって生成することができ、そのような断片は、抗体分子のペプシン消化によって産生することができるＦ（ａｂ’）２断片；Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を還元することによって生成することができるＦａｂ’断片、ならびにパパインおよび還元剤で抗体分子を処理することによって生成することができるＦａｂ断片を含むが、これらに限定されない。必要とされる抗原結合活性を有する他の抗体断片は、当技術分野で一般に知られている組換え発現技術によって調製することができる。
キメラヒト化および完全ヒト化モノクローナル抗体は組換え工学によって作製することができる。Ｆ（ａｂ’）２断片へのヒト定常鎖の追加によって、マウスＩｇに対する抗体を作製する患者はそうでなければ不利益となる場合に、免疫療法の適用に有用なヒト化モノクローナル抗体を作り出すことが可能である。Breedveld F.C. Therapeutic Monoclonal Antibodies. Lancet 2000 Feb 26; 335, P735-40。組換え治療用モノクローナル抗体は、哺乳動物宿主細胞（たとえばＣＨＯ細胞）中で組換え発現によって有利に調製されてもよい。
ＦＫＢＰ−Ｌに対して免疫学的特異性を有するモノクローナル抗体は、適した誘発抗原（たとえば完全長ＦＫＢＰ−Ｌまたはそのエピトープ）での適した宿主動物（たとえばマウスまたはウサギ）の免疫化によって調製することができる。
治療上の使用
本発明のおよび本発明での使用のためのポリペプチドおよび核酸は、ヒトを含む哺乳動物での多種多様な臨床的状態の制御および／または治療に使用されてもよい。本発明のポリペプチドおよび方法は、抗血管新生剤または血管新生促進剤が治療的に有用である可能性がある状態または障害の治療に使用されてもよい。
本明細書で使用されるように、「治療」または「療法」は、ヒトまたは非ヒト動物に利益を与えることができる任意のレジメンを含む。その治療は、すでにある状態に関してのものであってもよくまたは予防的なものであってもよい（予防治療）。治療は、治癒的、緩和、または予防的効果を含んでもよい。
細胞遊走、血管新生、ならびに関連する徴候（たとえば腫瘍成長および／もしくは転移）は、有効量のＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドまたはそのようなペプチドをコードする核酸をそのような治療を必要とする患者に投与することによって阻害することができる。その方法は、腫瘍、多種多様の自己免疫障害、遺伝性障害、眼障害、および他の血管新生媒介性のまたは血管新生関連の障害を治療するために使用することができる。
あるいは、血管新生は、アンチセンスＦＫＢＰ−Ｌ核酸（たとえばｓｉＲＮＡ）またはＦＫＢＰ−Ｌに対する抗体をそのような治療を必要とする患者に投与することによって促されてもよい。その方法は、皮膚および骨等のほとんどの組織の創傷治癒を含む創傷治癒ならびに慢性潰瘍（糖尿病性またはその他）の治療を処理するために使用することができる。
本明細書に記載される治療上のおよび診断上の方法は、典型的に、有効量のペプチド、核酸、または本発明のポリペプチドもしくは核酸を含む組成物を患者に投与することを含む。投与されることとなる正確な用量は、組成物の使用に従ってならびに患者の年齢、性別、および状態で変動し、また治療する医者によって容易に決定することができる。組成物は、単一用量としてまたはある期間にわたって継続的な様式で投与されてもよい。投与は適切に繰り返されてもよい。
その組成物および方法は、血管腫、固形腫瘍、血管腫、リンパ腫転移、毛細血管拡張症、乾癬、子宮内膜症、動脈硬化症、強皮症、化膿性肉芽腫、心筋血管新生、クローン病、プラーク新血管新生、冠動脈側枝、大脳側枝、動静脈奇形、虚血性肢血管新生、角膜疾患、ルベオーシス、新生血管緑内障、糖尿病性網膜症、水晶体後線維増殖、関節炎、糖尿病性新血管新生、黄斑変性、消化性潰瘍、ヘリコバクター関連疾患、骨折、ケロイド、および血管形成を含む血管新生媒介性の障害を治療するために使用することができる。治療することができる特異的な障害ならびにこれらの方法で有用な化合物および組成物は下記に、より詳細に記載される。
癌腫／腫瘍
治療することができる腫瘍は、その成長が血管新生によって促される腫瘍を含む。一実施形態では、そのような腫瘍はＣＤ４４を発現し得る。本発明の化合物、組成物、および方法を使用して治療することができる癌腫は、結腸直腸癌、胃癌、印環型、食道癌、腸管型、粘液型、膵癌、肺癌、乳癌、腎癌、膀胱癌、前立腺癌、睾丸癌、卵巣癌、子宮内膜癌、甲状腺癌、肝癌、喉頭癌、中皮腫、神経内分泌癌、神経外胚葉腫瘍、黒色腫、神経膠腫、神経芽細胞腫、肉腫、平滑筋肉腫、ＭＦＩＩ、線維肉腫、脂肪肉腫、ＭＰＮＴ、および軟骨肉腫を含んでもよい。
癌の治療については、ＦＫＢＰ−Ｌは、当技術分野で知られている他の化学療法および／または化学的予防剤と共に投与されてもよい。そのような作用物質は、抗血管新生薬、エンドスタチン、アンジオスタチンおよびＶＥＧＦ阻害剤、サリドマイド、ならびにその他またはアドリアマイシン、ダウノマイシン、シスプラチン、エトポシド、タキソール、タキソテール、およびビンクリスチン等のアルカロイド等の細胞毒、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、ならびにメトトレキサート等の代謝拮抗薬を含むが、これらに限定されない。代替の実施形態では、ＦＫＢＰ−ＬペプチドまたはＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、次のもの等の癌治療薬と共に使用されてもよい：（ａ）ボルテゾミブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イマチニブ、およびソラフェニブを含むが、これらに限定されない癌成長阻害剤；（ｂ）たとえば、癌抑制遺伝子または癌遺伝子に対するｓｉＲＮＡをコードする核酸構築物を使用する遺伝子治療アプローチ；（ｃ）癌ワクチン；（ｄ）インターフェロン；（ｅ）アルデスロイキン；（ｆ）９０Ｙ−イブリツモマブチウキセタン、ＡＤＥＰＴ、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、ゲムツズマブ、ヨード１３１トシツモマブ、パニツムマブ、リツキシマブ、トラスツズマブを含むが、これらに限定されないモノクローナル抗体；（ｇ）アムサクリン、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クリサンタスパーゼ（Ｃｒｉｓａｎｔａｓｐａｓｅ）、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、グリアデル移植片、ヒドロキシカルバミド、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロイコボリン、リポソームドキソルビシン、リポソームダウノルビシン、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、ペントスタチン、プロカルバジン、ラルチトレキセド、ストレプトゾシン、テガフール−ウラシル、テモゾロミド、テニポシド、チオテパ、チオグアニン、トポテカン、トレオスルファン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、およびビノレルビンを含むがこれらに限定されない化学療法薬；（ｈ）放射線療法；（ｉ）アナストロゾール、ビカルタミド、ブセレリン、シプロテロン、ジエチルスチルベストロール、エキセメスタン、フルタミド、フルベストラント、ゴセレリン（乳房）、ゴセレリン（前立腺）、レトロゾール、リュープロレリン、メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール、タモキシフェン、トレミフェン、およびトリプトレリンを含むが、これらに限定されないホルモン療法；（ｊ）ビスホスホネート、輸血、エリトロポイエチン、造血剤、成長因子、血漿交換、血小板輸血、およびステロイドを含むが、これらに限定されない支持療法；ならびに（ｋ）高圧酸素療法、温熱治療、および光線力学療法を含むが、これらに限定されない他の治療。そのような療法は、単独でまたは補完療法としてＦＫＢＰ−Ｌ治療と共に使用されてもよい。
血管新生によって媒介される眼障害
多種多様の眼障害は、血管新生によって媒介され、本明細書に記載される活性化合物、組成物、および方法を使用して治療されてもよい。血管新生によって媒介される疾患の一例は、目の構造物中への新しい血管の浸潤によって特徴づけられる眼新生血管疾患であり、失明の最も一般的な原因である。加齢性黄斑変性では、関連する視覚的な問題は、網膜色素上皮の真下の血管結合組織の増殖と共に、ブルッフ膜の欠陥を通した脈絡膜毛細血管の内部成長によって引き起こされる。加齢性黄斑変性の最も重篤な形態（「ウェット」ＡＲＭＤとして知られている）では、異常性血管新生が網膜下で生じ、視覚の不可逆的損失をもたらす。視覚の損失は、新しい血管からの出血に付随する網膜の瘢痕による。「ウェット」ＡＲＭＤの現在の治療は、障害となっている血管を破壊するための、レーザーに基づいた療法を利用する。しかしながら、レーザーが覆っている網膜に永久に傷跡を残し得るので、また障害となっている血管が再成長することが多いので、この治療は理想的ではない。黄斑変性のための代替治療戦略は、黄斑変性から最も重篤な視覚損失を引き起こす新しい血管形成または血管新生を阻害するための抗血管新生剤の使用である。
血管新生損傷はまた、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、角膜移植片拒絶反応、新生血管緑内障、および水晶体後線維増殖に関連する。角膜新血管新生と関連する他の疾患は、流行性角結膜炎、ビタミンＡ欠乏、アトピー性角膜炎、上輪部角膜炎、翼状片乾性角膜炎、類天疱瘡放射状角膜切開、および角膜移植片拒絶反応を含むが、これらに限定されない。網膜／脈絡膜新血管新生と関連する疾患は、糖尿病性網膜症、黄斑変性、推定される近視、視窩、慢性網膜剥離、過粘稠度症候群、外傷、およびレーザー後合併症を含むが、これらに限定されない。他の疾患は、ルベオーシス（角の新血管新生）と関連する疾患および増殖性硝子体網膜症のすべての形態を含む、血管結合組織または線維組織の異常性の増殖によって引き起こされる疾患を含むが、これらに限定されない。
したがって、本発明のある実施形態では、本発明の活性化合物、組成物、および方法は、血管新生媒介性の眼障害、たとえば黄斑変性の治療に使用されてもよい。
炎症
ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドはまた、関節リウマチおよび骨関節炎等の関節炎の多種多様の形態を含む血管新生関連の炎症等の血管新生媒介性の障害を治療するために使用されてもよい。これらの方法では、治療は、本明細書に記載される化合物を、当業者らによく知られているシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）阻害剤等の、それらの障害を治療するのに有用な他の作用物質と組み合わせたものである。
関節の滑膜の裏打ち中の血管は血管新生を受け得る。内皮細胞は、パンヌス成長および軟骨破壊に至る、新しい血管の網様構造および放出因子および活性酸素種を形成する。これらの因子は、実際に、関節リウマチのおよび同様に骨関節炎の一因となると考えられる。血管新生関連の因子による軟骨の活性化は関節破壊の一因となり、さらに骨新形成を促進する。本明細書に記載される方法は、骨破壊および骨新形成を予防するための治療的介入として使用することができる。
病的血管新生はまた慢性炎症と関連すると考えられる。本明細書に記載される化合物、組成物、および方法を使用して治療することができる障害の例は、潰瘍性大腸炎、クローン病、バルトネラ症、およびアテローム性動脈硬化症を含む。
併用療法
本発明のポリペプチド、核酸、または方法を使用して特定の疾患を治療する際に、特定の疾患の治療では、ペプチドまたは核酸は、その疾患に使用される多種多様のすでにある治療剤と組み合わせられてもよい。
抗ヒスタミン（Ｈ１アンタゴニスト）との本明細書に記載されるＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドの組み合わせは、特に、喘息および鼻炎の予防および治療での使用に好都合となり得る。抗ヒスタミンの例は、クロルフェニラミン、ブロムフェニラミン、クレマスチン、ケトチフェン、アザタジン、ロラタジン、テルフェナジン、セチリジン、アステミゾール、タジフィリン（ｔａｚｉｆｙｌｌｉｎｅ）、レボカバスチン、ジフェンヒドラミン、テメラスチン、エトロチフェン、アクリバスチン、アゼラスチン、エバスチン、メキタジン、ＫＡ−３９８、ＦＫ−６１３、ミゾラスチン、ＭＤＬ−１０３８９６、レボセチリジン、フランカルボン酸モメタゾン、ＤＦ−１１１１３０１、ＫＣ−１１４０４、カレバスチン、ラマトロバン、デスロラタジン、ノベラスチンン、セレノチフェン（ｓｅｌｅｎｏｔｉｆｅｎ）、アリナスチン、Ｅ−４７１６、エフレチリジン、トリトカリン、ノルアステミゾール（ｎｏｒａｓｔｅｍｉｚｏｌｅ）、ＺＣＲ−２０６０、ＷＹ−４９０５１、ＫＡＡ−２７６、ＶＵＦ−Ｋ−９０１５、タゴリジン、ＫＣ−１１４２５、エピナスチン、ＭＤＬ−２８１６３テルフェナジン、ＨＳＲ−６０９、アクリバスチン、およびＢＭＹ−２５３６８である。
さらに、またはあるいは、本発明のポリペプチドは、抗生物質、抗菌類、抗ウイルス、抗ヒスタミン、非ステロイド系の抗炎症薬、または疾患修飾性抗リウマチ薬を含む１つまたは複数の他の治療剤と組み合わせて有利に用いられてもよい。
他の実施形態では、関節リウマチを治療するために、ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドは、ＴＮＦアルファ阻害剤、たとえば抗ＴＮＦモノクローナル抗体（レミケード、ＣＤＰ−８７０、およびＤ２ Ｅ７等）ならびにＴＮＦ受容体免疫グロブリン分子（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）等）、ＣＯＸ−２阻害剤（メロキシカム、セレコキシブ、ロフェコキシブ、バルデコキシブ、およびエトリコキシブ等）、低用量メトトレキサート、レフルノミド、ヒドロキシクロロキン、ｄ−ペニシラミン、オーラノフィン、または非経口もしくは経口金等の作用物質と組み合わせられてもよい。
他の実施形態では、ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドはまた、骨関節炎の治療のためのすでにある治療剤と組み合わせて使用されてもよい。組み合わせて使用されることとなる適した作用物質は、ピロキシカム等の標準の非ステロイド系抗炎症剤（以後ＮＳＡＩＤ）、ジクロフェナク、ナプロキセン、フルビプロフェン（ｆｌｕｂｉｐｒｏｆｅｎ）、フェノプロフェン、ケトプロフェン、およびイブプロフェン等のプロピオン酸、メフェナム酸等のフェナム酸、インドメタシン、スリンダク、アバゾン、フェニルブタゾン等のピラゾロン、アスピリン等のサリチル酸塩、セレコキシブ、バルデコキシブ、ロフェコキシブおよびエトリコキシブ等のＣＯＸ−２阻害剤、コルチコステロイドならびにヒアルガン（ｈｙａｌｇａｎ）およびシンビスク（ｓｙｎｖｉｓｃ）等のヒアルロン酸等の鎮痛薬ならびに関節内療法を含む。
ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドはまた、抗血管新生薬、エンドスタチン、アンジオスタチン、およびＶＥＧＦ阻害剤等の抗癌剤ならびその他またはアドリアマイシン、ダウノマイシン、シスプラチン、エトポシド、タキソール、タキソテール、およびビンクリスチン等のアルカロイド等の細胞毒、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、ならびにメトトレキサート等の代謝拮抗薬と組み合わせて使用されてもよい。ＦＫＢＰ−Ｌと共に使用されてもよい癌成長阻害剤、遺伝子治療、癌ワクチン、インターフェロン、アルデスロイキン、モノクローナル抗体、化学療法薬、放射線療法、ホルモン療法、または他の支持療法等の他の抗癌剤および治療方法は本明細書に記載される。
さらに、またはあるいは、ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドはまた、ビラセプト、ＡＺＴ、アシクロビル、およびファムシクロビル等の抗ウイルス薬ならびにゾバント、チファコギン（ｔｉｆａｃｏｇｉｎ）、ＮＯＸ−１００、および１３Ｒ２７０７７３等の防腐化合物と組み合わせて使用されてもよい。
ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドはまた、ロロキシフェン（ｒｏｌｏｘｉｆｅｎｅ）、ドロロキシフェン（ｄｒｏｌｏｘｉｆｅｎｅ）、ラソフォキシフェン、またはフォソマックス（ｆｏｓｏｍａｘ）等の抗骨粗鬆症剤ならびにＦＫ−５０６およびラパマイシン等の免疫抑制剤と組み合わせて使用されてもよい。
ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドはまた１つまたは複数の次のものと組み合わせられてもよい：（ａ）ロイコトリエン生合成阻害剤：ジロートン；ＡＢＴ−７６１；フェンレウトン；テポキサリン；Ａｂｂｏｔｔ−７９１７５；Ａｂｂｏｔｔ−８５７６１；Ｎ−（５−置換）−チオフェン−２アルキルスルホンアミド、２，６−ジ−ターシャル−ブチルフェノールヒドラゾンからなる群から選択される５−リポキシゲナーゼ（５−ＬＯ）阻害剤および５−リポキシゲナーゼ活性化タンパク質（ＦＬＡＰ）アンタゴニスト；Ｚｅｎｅｃａ社製ＺＤ−２１３８を含むメトキシテトラヒドロピランのクラス；化合物ＳＢ−２１０６６１およびそれが属するクラス；Ｌ−７３９，０１０が属するピリジニル置換２−シアノナフタレン化合物のクラス；Ｌ−７４６，５３０が属する２−シアノキノリン化合物のクラス；ＭＫ−５９１、ＭＫ−８８６、およびＢＡＹ Ｘ １００５が属するインドール化合物およびキノリン化合物のクラス；（ｂ）Ｌ−６５１，３９２が属する化合物のフェノチアジン−３−オンクラスからなる群から選択されるロイコトリエンＬＴＢ４、ＬＴＣ４、ＬＴＤ４、およびＬＴＥ４；ＣＧＳ−２５０１９ｃが属するアミジノ化合物のクラス；オンタゾラストが属するベンゾオキサゾールアミンのクラス；ＢＩＩＬ ２８４１２６０が属するベンゼンカルボキシミドアミドのクラス；ならびにザフィルルカスト、アブルカスト、モンテルカスト、プランルカスト、ベルルカスト（ＭＫ−６７９）、ＲＧ−１２５２５、Ｒｏ−２４５９９１３、イラルカスト（ＣＧＰ ４５７１５Ａ）、およびＢＡＹ Ｘ ７１９５が属する化合物のクラスに対する受容体アンタゴニスト；（ｃ）アイソフォームＰＤＥ４Ｄの阻害剤を含むＰＤＥ４阻害剤；（ｄ）５−リポキシゲナーゼ（５−ＬＯ）阻害剤；または５−リポキシゲナーゼ活性化タンパク質（ＦＬＡＰ）アンタゴニスト；（ｅ）５−リポキシゲナーゼ（５−ＬＯ）の二重阻害剤および血小板活性化因子（ＰＡＦ）のアンタゴニスト；（ｆ）ＬＴＢ４、ＬＴＣ４、ＬＴＤ４、およびＬＴＥ４のアンタゴニストを含むロイコトリエンアンタゴニスト（ＬＴＲＡ）；（ｇ）セチリジン、ロラタジン、デスロラタジン、フェキソフェナジン、アステミゾール、アゼラスチン、およびクロルフェニラミンを含む抗ヒスタミンＨ１受容体アンタゴニスト；（ｈ）胃保護Ｈ２受容体アンタゴニスト；（ｉ）プロピルヘキセドリン、フェニレフリン、フェニルプロパノラミン、プソイドエフェドリン、塩酸ナファゾリン、塩酸オキシメタゾリン、塩酸テトラヒドロゾリン、塩酸キシロメタゾリン、および塩酸エチルノルエビネフリンを含む、うっ血除去の使用のために経口的にまたは局所的に投与されるアルファ１およびアルファ２アドレナリン受容体アゴニスト血管収縮薬交感神経刺激薬；（ｊ）５−リポキシゲナーゼ（５−ＬＯ）の阻害剤と組み合わせたアルファ１およびアルファ２アドレナリン受容体アゴニスト；（ｋ）臭化イプラトロピウム；臭化チオトロピウム；臭化オキシトロピウム；ピレンゼピン；およびテレンゼピンを含む抗コリン作用薬；（Ｉ）メタプロテレノール、イソプロテレノール、イソプレナリン、アルブテロール、サルブタモール、ホルモテロール、サルメテロール、テルブタリン、オルシプレナリン、メシル酸ビトルテロール、およびピルブテロールを含む［３〜ベータ４アドレナリン受容体アゴニスト；（ｍ）テオフィリンおよびアミノフィリンを含むメチルキサンタニン；（ｎ）クロモグリク酸ナトリウム；（ｏ）ムスカリン受容体（Ｍ１、Ｍ２、およびＭ３）アンタゴニスト；（ｐ）ＣＯＸ−１阻害剤（ＮＴＨＥ）；ロフェコキシブを含むＣＯＸ−２選択的阻害剤；および一酸化窒素ＮＴＨＥ；（ｑ）インスリン様成長因子Ｉ型（ＩＧＦ−１）ミメティック；（ｒ）シクレソニド；（ｓ）プレドニゾン、プレドニゾロン、フルニソリド、トリアムシノロンアセトニド、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、ブデソニド、プロピオン酸フルチカゾン、およびフランカルボン酸モメタゾンを含む、全身性副作用が低減された吸入グルココルチコイド；（ｔ）トリプターゼ阻害剤；（ｕ）血小板活性化因子（ＰＡＦ）アンタゴニスト；（ｖ）内因性炎症性実体に対して活性なモノクローナル抗体；（ｗ）ＩＰＬ ５７６；（ｘ）エタネルセプト、インフリキシマブ、およびＤ２Ｅ７を含む抗腫瘍壊死因子（ＴＮＦアルファ）作用物質；（ｙ）レフルノミドを含むＤＭＡＲＤ；（ｚ）ＴＣＲペプチド；（ａａ）インターロイキン変換酵素（ＩＣＥ）阻害剤；（ｂｂ）ＩＭＰＤＨ阻害剤；（ｃｃ）ＶＬＡ−４アンタゴニストを含む接着分子阻害剤；（ｄｄ）カテプシン；（ｅｅ）ＭＡＰキナーゼ阻害剤；（ｆｆ）グルコース−６リン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤；（ｈｈ）多種多様の親水基を共に有するオーロチオ基の形態の金；（ｉｉ）免疫抑制薬、たとえばシクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート；（ｊｊ）抗痛風薬、たとえばコルヒチン；（ｋｋ）キサンチンオキシダーゼ阻害薬、たとえばアロプリノール；（ｌｌ）尿酸排泄薬、たとえばプロベネシド、スルフィンピラゾン、およびベンズブロマロン；（ｍｍ）抗腫瘍薬、とりわけビンブラスチンおよびビンクリスチン等のビンカアルカロイドを含む細胞分裂抑制薬；（ｎｎ）成長ホルモン分泌促進物質；（ｏｏ）マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、つまりストロメライシン、コラゲナーゼ、およびゼラチナーゼ、ならびにアグリカナーゼ；とりわけコラゲナーゼ−１（ＭＭＰ−１）、コラゲナーゼ−２（ＭＭＰ−８）、コラゲナーゼ−３（ＭＭＰ−１３）、ストロメライシン−１（ＭＭＰ−３）、ストロメライシン−２（ＭＭＰ−１０）、およびストロメライシン−３（ＭＭＰ−１１）の阻害剤；（ｐｐ）形質転換成長因子（ＴＧＦＰ）；（ｑｑ）血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；（ｒｒ）線維芽細胞成長因子（たとえば塩基性線維芽細胞成長因子）（ｂＦＧＦ）；（ｓｓ）粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）；（ｔｔ）カプサイシンクリーム；（ｕｕ）ＮＫＰ−６０８Ｃ；ＳＢ−２３３４１２（タルネタント）；およびＤ−４４１８からなる群から選択されるタヒキニンＮＫおよびＮＫ３受容体アンタゴニスト；ならびに（ｖｖ）ＵＴ−７７およびＺＤ−０８９２からなる群から選択されるエラスターゼ阻害剤。
創傷治癒
血管新生は創傷治癒で重要な工程である。上に記載される本発明のＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドに対するアンチセンスおよび／またはｓｉＲＮＡおよび／または阻害抗体の使用は、単独でまたは創傷治癒を促進するための他の療法と組み合わせて使用されてもよい。
したがって、本発明の実施形態はまた、創傷を治療するために有用な少なくとも１つの他の作用物質と本明細書に記載される少なくとも１つのＦＫＢＰ−Ｌ化合物の組み合わせを包含する。そのような作用物質は、当技術分野でよく知られており、たとえばKumar et al. Turk J Med Sci, 34 (2004) 147-160に記載される成長因子、サイトカイン阻害剤、プロテアーゼ、および接着分子等の創傷治癒に関連する生物活性化合物の中で選択することができる。たとえば、適した成長因子は、創傷治癒でのそれらの重要性について知られている因子であるＴＧＦβならびにそのアイソフォーム、ＰＤＧＦ、ＫＧＦ、ＶＥＧＦ、およびＥＧＦからなる群の中で選ぶことができる。ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドおよび誘導体はまた、免疫グロブリン様スーパーファミリー、カドヘリン、インテグリン、受容体タンパク質チロシンホスファターゼ、セレクチン、およびヒアルロン酸受容体と同様にマトリックスメタロプロテアーゼまたは接着分子と関連し得る。
あるいはまたは上記に記載される創傷治癒組成物のうちのいずれかと組み合わせて、消毒薬、抗生物質など等の創傷治癒を促進することで知られている他の作用物質もまた本発明の化合物と共に使用されてもよい。
ある実施形態では、より詳細に本明細書に記載されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは創傷治癒のための方法および組成物に使用されてもよい。
さらに、アンチセンスＦＫＢＰ−Ｌオリゴヌクレオチド、ＦＫＢＰ−Ｌ ｓｉＲＮＡ、またはＦＫＢＰ−Ｌに対する抗体は単独でまたは上記の有効成分と組み合わせて適用されてもよく、散剤としてまたは液剤もしくは分散液として局所的に適用されてもよく、多種多様な包帯剤の製造のために使用されてもよい。そのような包帯剤は、綿またはセルロース繊維等の典型的な包帯剤であってもよく、有孔または無孔の、シート形態で織られたまたは不織のセルロースもしくは酢酸セルロースまたはナイロンまたは再生セルロースまたはプラスチック基材等の基材上の１つまたは複数の被覆物として堆積させてもよい。ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドに対する抗体は、米国特許第３１９４７３２号に開示される手順のような知られている手順に従って、適切な接着性製剤、たとえばペクチン、ゼラチン、デンプン、無害性植物ガム等を使用して、適した基材、たとえば綿ガーゼ、プラスチックシート等に結合されてもよい。あるいは、本発明のＦＫＢＰ−Ｌ抗体は、創傷治癒に有益な湿性環境を促進する、水分保持半閉塞性包帯剤のようなより精巧な種類の創傷包帯剤に結合させることができる。
アンチセンスおよびｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド治療薬
Ａ．アンチセンスＲＮＡ
上記に記載されるように、本発明は、治療剤としてのアンチセンス核酸分子またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでもよい。一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは阻害剤ＲＮＡ（たとえばＲＮＡｉまたはｓｉＲＮＡ）を含んでもよい。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡの部分にまたはすべてに対する相補的配列を有するＤＮＡまたはＲＮＡの短い断片である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、特定の標的ｍＲＮＡに相補的なので、特異的にそのｍＲＮＡに結合する。密接な結合を促進するためにそのようなアンチセンス分子を化学的に修飾することが知られている。結合が生じると、ｍＲＮＡが細胞の翻訳機構によって解読される能力は阻害され、ｍＲＮＡがコードするタンパク質の合成はブロックされる。遺伝子ノックアウトとは異なり、この阻害は、アンチセンス分子の継続的な存在を必要とする可能性がある；したがって、阻害は可逆的であり、部分は、その遺伝子配列についての情報のみに基づいて対象とする遺伝子の特異的な阻害剤を設計することができる。一実施形態では、本発明は、本発明の核酸のコード鎖にアンチセンスな単離核酸分子を提供する。他の実施形態では、本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡのコード鎖にアンチセンスなヌクレオチド配列を有する核酸分子が提供される。
アンチセンス核酸は、全コード鎖またはその部分のみ、たとえばタンパク質コード領域（またはオープンリーディングフレーム）のすべてまたは一部分に相補的とすることができる。アンチセンス核酸分子は、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のコード鎖の非コード領域のすべてまたは一部分にアンチセンスであってもよい。非コード領域（「５’および３’非翻訳領域」）は、コード領域の両側に位置する５’および３’配列であり、アミノ酸に翻訳されない。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、たとえば、５、１０、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０個のヌクレオチド長とすることができる。本発明のアンチセンス核酸は、当技術分野で知られている手順を使用して、化学合成および酵素的ライゲーション反応を使用して構築することができる。たとえば、アンチセンス核酸（たとえばアンチセンスオリゴヌクレオチド）は、自然発生ヌクレオチドを使用して化学的に合成することができる、または分子の生物学的安定性を増加させるためにもしくはアンチセンス核酸およびセンス核酸の間で形成される二重鎖の物理的安定性を増加させるために設計された様々に修飾されたヌクレオチド、たとえばホスホロチオネート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを使用することができる。アンチセンス核酸を生成するために使用することができる修飾ヌクレオチドの例は、５−フルオロウラシル、５−ブロムウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルケウオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルケウオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、ケウオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−予測Ｎ−２−カルボキシプウラシル）（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンを含む。あるいは、アンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス方向でサブクローニングされた（つまり、挿入された核酸から転写されたＲＮＡは、以下のサブセクションでさらに記載される対象とする標的核酸に対してアンチセンス方向となる）生物学的発現ベクターを使用して産生することができる。本発明のアンチセンス核酸分子は、典型的に、患者に投与することができる。あるいは、アンチセンス核酸は、それらが、本発明の選択されたポリペプチドをコードする細胞ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリダイズしまたは結合し、それによって、たとえば転写および／または翻訳を阻害することによって発現を阻害するようにインサイチューで生成することができるかもしれない。
ハイブリダイゼーションは、安定した二重鎖を形成するためのまたはたとえば、二重らせんの主溝中での特異的な相互作用を通してＤＮＡ二重鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合の従来のヌクレオチド相補性によるものとすることができる。本発明のアンチセンス核酸分子の投与の経路の一例は、組織部位での直接的な注射を含む。あるいは、アンチセンス核酸分子は、選択された細胞を標的にするために修飾し、次いで、全身に投与することができる。たとえば、全身投与については、アンチセンス分子は、たとえばアンチセンス核酸分子を、細胞表面受容体または抗原に結合するペプチドまたは抗体に連結させることによって、それらが、選択された細胞表面に発現された受容体または抗原に特異的に結合するように修飾することができる。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するために、アンチセンス核酸分子が強いｐｏｌ ＩＩまたはｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの制御下に配置されるベクター構築物が好ましい。
天然糖（Ｄ−リボースおよびＤ−２−デオキシリボース）ならびにホスホジエステル（ＰＯ）連結を含有するオリゴヌクレオチドは、血清および細胞内ヌクレアーゼによって速やかに分解され、これは有効な治療剤としてのそれらの有用性を制限する。ヌクレアーゼ安定性を改善するための化学的戦略は、糖成分、塩基成分の修飾、および／またはヌクレオチド間ホスホジエステル連結の修飾もしくは置換を含む。現在まで、最も広く研究された類似体はホスホロチオネート（ＰＳ）オリゴデオキシヌクレオチドであり、ホスホジエステルバックボーン中の非架橋酸素原子のうちの１つは硫黄と交換される（Eckstein, F. Ann. Rev. Biochem. 1985,54,367）。本発明の方法での使用に適した、ＦＫＢＰ−Ｌを標的にする例示的なアンチセンスはＲｏｂｓｏｎらによって記載される（Robson et al.,(1999) Radiation Research 152, 451-461; Robson, T., et al., (2000) Int. J. Radiatを参照されたい）。
Ｂ．ｓｉＲＮＡ
ある実施形態では、ＦＫＢＰ−Ｌに対するｓｉＲＮＡは治療剤として使用されてもよい。低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、哺乳動物細胞中での特異的転写後遺伝子発現ノックダウンのための有力なツールである（Elbashir et al., Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 2001, 411: 494-8）。
ｓｉＲＮＡは、ダウンレギュレートする標的遺伝子（つまりＦＫＢＰ−Ｌ）に対応する二本鎖標的特異的領域を典型的に含む。この二本鎖標的特異的領域は、１９〜２５塩基対の範囲の長さを典型的に有する。特定の非限定的な実施形態では、ダウンレギュレートする標的遺伝子（ＦＫＢＰ−Ｌ）に対応する１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５塩基対の二本鎖標的特異的領域を有するｓｉＲＮＡが使用されてもよい。
標的特異的領域は、標的遺伝子（ＦＫＢＰ−Ｌ）の部分に１００％相補的な配列を典型的に有する。しかしながら、１００％の配列同一性が機能的なＲＮＡ阻害にとって必須ではないことは十分に理解されるであろう。標的配列と比較して挿入、欠失、および単一の点突然変異を有するＲＮＡ配列もまたＲＮＡ阻害に有効なことがわかっている。したがって、用語「に対応する」は、ｓｉＲＮＡの標的特異的部分および標的遺伝子（ＦＫＢＰ−Ｌ）の標的領域の間の配列の対応を指すために使用される場合、絶対的に１００％配列同一性を必要とするとは限らないことが適宜解釈されることになる。しかしながら、二本鎖ＲＮＡおよび標的領域の間の配列同一性％は、一般に少なくとも９０％または少なくとも９５％または少なくとも９９％となる。
したがって、本発明の実施形態では、ＦＫＢＰ−Ｌの発現を特異的にダウンレギュレートすることができるｓｉＲＮＡは、配列番号：１、配列番号：２、もしくは配列番号：２９に示されるヌクレオチド配列の１９、２０、２１、２２、２３、２４、もしくは２５個の連続する塩基対を含むもしくはそれからなる二本鎖部分、または配列番号：１、配列番号：２、もしくは配列番号：２９に示されるヌクレオチド配列の部分に少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％もしくは少なくとも９９％同一であるまたは配列番号：１もしくは配列番号：２に示されるヌクレオチド配列の部分と比較して１つもしくは２つの単一のヌクレオチドのミスマッチを含む１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個の連続する塩基の二本鎖部分を含んでもよい。
ｓｉＲＮＡは、ＦＫＢＰ−Ｌ ｍＲＮＡ転写物の任意の適した領域を標的にするように設計することができる。アルゴリズムは、ｓｉＲＮＡの一次配列の特徴に本質的に基づくｓｉＲＮＡ設計に利用可能である（たとえばReynolds A, et al. Nat Biotechnol. 2004 Mar;22(3):326-30. Epub 2004 Feb 1.）。本発明の方法での使用に適した、ＦＫＢＰ−Ｌを標的にする例示的なｓｉＲＮＡは、Jascur et al. 2006, Molecular Cell, 17:237-239によって記載される。
用語「遺伝子発現のダウンレギュレーション」は、標的遺伝子（たとえばＦＫＢＰ−Ｌ）からのタンパク質産物および／またはｍＲＮＡ産物のレベルでの遺伝子発現の測定可能なもしくは観察可能な低下または検出可能な遺伝子発現の完全な消滅を指す。標的遺伝子（たとえばＦＫＢＰ−Ｌ）のダウンレギュレーションが、他の遺伝子に対する明白な影響を伴わないで生じる場合、遺伝子発現のダウンレギュレーションは「特異的」となる。
ｓｉＲＮＡは、ＦＫＢＰ−Ｌに対応する二本鎖標的特異的領域の両側に位置する、一端または両端での一本鎖突出を含んでもよい。特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、２つの３’突出チミジン（ｄＴｄＴ）またはウリジン（ＵＵ）等の３’突出ヌクレオチドを含有していてもよい。３’ＴＴまたはＵＵの突出は、ｄｓＲＮＡの二本鎖部分に含まれる配列のすぐ上流の標的遺伝子の配列がＡＡである場合、ｓｉＲＮＡ中に含まれていてもよい。これは、ｓｉＲＮＡ中のＴＴまたはＵＵ突出が標的遺伝子にハイブリダイズすることを可能にする。３’ＴＴまたはＵＵ突出がｓｉＲＮＡのもう一方の端に含まれていてもよいが、ｓｉＲＮＡの二本鎖部分に含まれる配列の下流の標的配列がＡＡを有することは必須ではない。
ｓｉＲＮＡの二本鎖標的特異的部分は、ホスホジエステル連結のリボヌクレオチドから全体的に構成される２つのアニールされたＲＮＡ鎖から典型的に形成される。しかしながら、ＲＮＡ／ＤＮＡキメラであるｓｉＲＮＡもまた企図される。これらのキメラは、たとえば、上記に論じられるように、ＤＮＡ塩基の３’突出（たとえばｄＴｄＴ）を有する二本鎖ＲＮＡを含むｓｉＲＮＡ、さらに、１つもしくは複数のＲＮＡ塩基もしくはリボヌクレオチドまたはさらに全鎖上のリボヌクレオチドのすべてがＤＮＡ塩基またはデオキシリボヌクレオチドと交換された、ポリヌクレオチドである二本鎖「ＲＮＡ」を含む。他の実施形態では、ｓｉＲＮＡ中の「ＲＮＡ」鎖のバックボーンは、非天然核酸塩基および／または非天然バックボーン連結の包含によって修飾されてもよい（たとえばSoutschek et al. Nature. 2004 Nov 11;432(7014):173-8; Zimmermann TS, et al. Nature 441, 111-4を参照されたい）。例として、２−Ｏメチル修飾はｓｉＲＮＡを安定化するために含まれていてもよい（Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋらによって同章に記載される）。
ｓｉＲＮＡは、当技術分野でそれ自体知られている様式で調製されてもよい。たとえば、ｓｉＲＮＡは、当技術分野でよく知られている化学的または酵素的ポリヌクレオチド合成技術を使用してインビトロで合成されてもよい。一アプローチでは、ｓｉＲＮＡの２本の個々の鎖は別々に合成され、次いで、二本鎖を形成するようアニールされてもよい。
無修飾「外因性」ｓｉＲＮＡは、さらなる試薬を必要としないでインビボでの遺伝子サイレンシングに有効であることが知られている（Filleur S, et al. Cancer Res 63, 3919-22; Duxbury MS, et al. Oncogene 23, 465-73）。他の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、担体もしくはアテロコラーゲン等のデリバリービヒクル（Nozawa H, et al. Cancer Sci. 2006 Oct; 97(10):1115-24；Takeshita F, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Aug 23; 102(34):12177-82. Epub 2005 Aug 9）またはナノ粒子（Schiffelers RM, et al. Nucleic Acids Res. 2004 Nov 1;32(19):e149）またはたとえば、取り込みを促進する水中油型乳剤、ミセル、およびリポソームを含む脂質ベースの担体と共に使用することができる。デリバリービヒクル（たとえばリポソームおよびナノ粒子）は、モノクローナル抗体、糖、糖脂質、またはタンパク質等の特異的なリガンドにビヒクルを結合することによって特定の組織に向けられてもよい。
さらなる実施形態では、共にアニールされた２本の個々のＲＮＡ鎖から形成されるのではなく、「ｓｉＲＮＡ」は、折り返しステムループまたはヘアピン構造を有していてもよく、そこで、ｓｉＲＮＡの標的特異的部分を形成するアニールされた配列は共有結合している。一実施形態では、アニールされた配列は、単一のＲＮＡ鎖で存在してもよい。ｄｓＲＮＡがインビボでの発現またはインビトロ転写によって合成される場合、この構造を有するＲＮＡは典型的である。２本のＲＮＡ鎖を連結させる「ループ」の厳密な性質および配列は、それがＲＮＡｉを媒介するための分子の二本鎖部分の能力を損なうべきでないという以外は、一般に本発明にとって重要ではない。「ループ」構造は、必ずしも核酸から形成される必要がない。
一実施形態では、ｓｉＲＮＡ（またはたとえば内因性酵素「ダイサー」の作用によってｓｉＲＮＡを産生するために加工することができる前駆体構造物）は、適した発現ベクターからの、宿主細胞または生物中での細胞内発現によって合成されてもよい。
ｓｉＲＮＡのインビボ発現のための多くの非ウイルス（たとえばプラスミド）またはウイルス発現ベクター系は当技術分野で知られている。一般に、ｓｉＲＮＡはステムループとして発現され、ステムループは「遊離」ｓｉＲＮＡを産生するよう細胞内で速やかに加工されてもよい（Tuschl, Nature Biotechnology, Vol. 20(5), 446-448, 2002によるレビューを参照されたい。）ｓｉＲＮＡの発現のためのベクター系はＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターに基づくものであることが多く、なぜならこれらは非常に短いＲＮＡ配列の正確な発現に特に適しているからである。たとえば、適したベクター系は、Brummelkamp, T.R. et al., Science, Vol. 296, 550-553, 2002；Lee, N.S. et al., Nature Biotechnology, Vol. 20, 500-505, 2002；Miyagashi, M & Taira, K. Nature Biotechnology, Vol. 20, 497-500, 2002；Paul, C.P. et al., Nature Biotechnology, Vol. 20, 505-508, 2002に記載され、それらの内容は参照によって本明細書に組み込まれる。
ｓｉＲＮＡは、当技術分野で知られている任意の標準の生理学的におよび／または薬学的に許容し得る担体と組み合わせて治療有効量の核酸を含む医薬組成物中に製剤されてもよい。
標的化
標的療法は、抗体または細胞特異的リガンド等の標的系の使用によって、より具体的には特定の組織または細胞に、活性剤、たとえばポリペプチドを送達するために使用されてもよい。これらの標的系は、ペプチド配列にまたは薬品デリバリービヒクル（リポソーム、マイクロスフェア、微粒子、マイクロカプセルなど等）に共有結合させることができる。ポリペプチドはまた、静脈を通過するが、毛細血管床中にとどまるように適切に大きさを合わせられた微粒子または他の薬品デリバリービヒクル中にペプチドを組み込むことによって、成長している腫瘍床（付いている毛細血管床と関連している）に向けることができる。その床中にとどまると、ポリペプチドは、（全身に放出されるのではなく）それらが最も有用な場所で局部的に放出され得る。上記に記載されるように、本発明はさらに本発明のヌクレオチドを使用する遺伝子治療の方法に及ぶ。
他の実施形態では、ＦＫＢＰ−Ｌペプチドは、腫瘍細胞に細胞毒性剤を向けるために使用されてもよい。したがって、一実施形態では、ＦＫＢＰ−Ｌペプチドは、当技術分野で知られている方法を使用して細胞毒性剤に抱合されてもよい。次いで、ＦＫＢＰ−Ｌペプチドは、ＣＤ４４との相互作用によって、ＣＤ４４を発現する細胞に細胞毒性剤を送達してもよい。細胞毒性剤が腫瘍細胞成長を優先的に阻害することができる作用物質である場合、作用物質はＣＤ４４ ＋ｖｅ腫瘍細胞に対して活性である可能性がある。
抗血管新生または血管新生促進活性
本発明のある実施形態は本発明の組成物の血管新生活性の評価を含んでもよい。血管新生活性は、当技術分野で知られているまたは本明細書に記載される任意の手段によって評価されてもよい。たとえば、血管新生活性は、Ｍａｔｒｉｇｅｌアッセイおよび実施例で使用されるアッセイ等の任意の標準のアッセイを使用してアッセイされてもよい。
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照することによってより理解することができる。「Ｎ」の表示は、特定の実施例について実行された個々の実験の数を示す。
実施例１：ＦＫＢＰ−Ｌの一時的形質移入は創傷閉鎖を阻害する（Ｎ＝３）
実験は、創傷閉鎖に対するＦＫＢＰ−Ｌ（配列番号：１；図１）の効果を決定するために行った。これらの研究で使用されるインビトロ遊走アッセイは、Ashton et al (1999) The J. of Biol. Chem., 1999, 274: 50, 35562-35570によって記載される方法の修飾バージョンである。ヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ１）をスライドガラス上の個々のチャンバー中に平板培養し、９０％コンフルエンスまで増殖させた。
その単層を、配列番号：３１のヌクレオチド配列を有する挿入断片を有するＦＫＢＰ−Ｌ／ｐｃＤＮＡ哺乳動物発現構築物で、リポフェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、英国）の存在下で形質移入した。発現構築物を作製するために、配列番号：３１の核酸断片はＢａｍＨ１を使用して組換えｐＵＣ１８構築物から切り取り、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のＢａｍＨ１制限部位中にライゲーションした。
ＦＫＢＰ−Ｌ挿入断片の発現は、配列番号：２の完全長組換えポリペプチドを生成する。６時間後、形質移入試薬を除去し、単層をピペットチップで傷つけ、ＭＣＤＢ−１３１を再度補充し、７時間インキュベートした。
単層を、１０分間、４％ＰＢＳ緩衝パラホルムアルデヒド溶液で固定した。「創傷」閉鎖の程度を無関係の調査者によって顕微鏡で盲検的に評価し、２０×倍率で目盛り付き接眼レンズグラティキュール（１ｍｍ／１００μｍ目盛）を使用して定量化した（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製ＢＸ５０）。ＦＫＢＰ−Ｌ処理スライド中の閉鎖の程度を０時間の創傷の大きさと比較した。
これらの実験の結果を図３に示す。一時的に形質移入されたＦＫＢＰ−Ｌは配列番号：２に等価なペプチドを産生し、リポフェクチンのみおよび空のベクターコントロールと比較してＨＭＥＣ−１が遊走する能力を有意に阻害した。ＦＫＢＰ−Ｌは、負傷後の７時間で、コントロール（Ｌｉｐｏ−リポフェクチン試薬；ｐｃＤＮＡ−ベクターのみ）と比較してＨＭＥＣ−１遊走を５０％阻害する。このデータは、ＦＫＢＰ−Ｌタンパク質が可能性のある抗遊走性タンパク質であることを示唆する。
実施例２：完全長組換えＦＫＢＰ−Ｌタンパク質は、創傷閉鎖アッセイで内皮細胞遊走を阻害する（Ｎ＝３）
これらの研究で使用されるインビトロ遊走アッセイは、Ａｓｈｔｏｎら（１９９９）によって記載される方法の修飾バージョンである。ＨＭＥＣ−１をスライドガラス上の個々のチャンバー中に平板培養し、９０％コンフルエンスまで一晩成長させた。培地を除去し、単層を傷つけた。単層を新鮮な培地で再度補充し、必要とされる容量の組換え完全長ｈｉｓタグ付きＦＫＢＰ−Ｌタンパク質（配列番号：１）を必要とされる最終濃度とするために追加した。
組換え完全長ＦＫＢＰＬタンパク質を生成するために、ＦＫＢＰＬ ｃＤＮＡ（ポリヌクレオチド配列番号：３１；ポリペプチド変異体変異体Ｔｈｒ１８２、Ｇｌｙ１８６；配列番号：１）を、ｐＲＳＥＴ−Ａベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩ部位中にｐｃＤＮＡ３．１／ＦＫＢＰＬからサブクローニングし、対応するＮ末端ポリヒスチジンタグ付き（ｈｉｓタグ）タンパク質（配列番号：１）を得るようにＢＬ２１（ＤＥ３）中で発現させた。発現は、１５℃で一晩細胞を成長させながら、０．２ｍＭ ＩＰＴＧでＯＤ０．６で誘発させた。細胞を遠心分離によってペレットにし、−２０℃で保存した。タンパク質を標準のＩＭＡＣ精製を使用して精製し、その後、任意の混入しているイー・コリタンパク質を除去するために脱塩した（詳細な説明については実施例３２を参照されたい）。発現された組換えタンパク質は３８ｋＤａの算出分子量を有する；４２２２０Ｄａの算出分子量を有するＨｉｓタグ付きＦＫＢＰ−Ｌは、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって確認されたように４２ｋＤａの分子量を有することがわかった。
単層を、組換えＦＫＢＰ−Ｌタンパク質に対する暴露後の７時間インキュベートし、次いで、４％ＰＢＳ緩衝パラホルムアルデヒド中で固定した。「創傷」閉鎖の程度を無関係の調査者によって顕微鏡で盲検的に評価し、２０×倍率で目盛り付き接眼レンズグラティキュール（１ｍｍ／１００μｍ目盛）を使用して定量化した（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製ＢＸ５０）。ＦＫＢＰ−Ｌ処理スライド中の閉鎖の程度を時間が一致する偽処理コントロールと比較し、時間が一致するコントロールと比較した創傷閉鎖の阻害％を算出した。
これらの実験の結果を図４に示す。ＦＫＢＰ−Ｌ組換えタンパク質での処理が遊走の有意な阻害をもたらし、７５０ｎｇｍｌ−１の最適濃度で、時間が一致するコントロールと比較して、単層の裸出されたエリア中へのＨＭＥＣ−１遊走の６０％の阻害を誘発したことを理解することができる。この実験からの所見は、一時的に形質移入されたＦＫＢＰ−Ｌで観察された結果（図３）を支持する。
結果はまた、ＦＫＢＰ−Ｌが、細胞間で（発現構築物を使用する先の図３でのように）または細胞外で（つまり組織培養培地に対する組換えタンパク質の追加によって）発現された場合、内皮細胞遊走を阻害することができることを示唆する。これは、ＦＫＢＰ−Ｌが２つの異なるメカニズムによって内皮細胞遊走を阻害していることまたはＦＫＢＰ−Ｌが細胞から分泌されることを暗示した。本明細書に示されるように、ＦＫＢＰ−Ｌは実際に分泌される。
実施例３：ＦＫＢＰ−Ｌタンパク質はＨＭＥＣ−１細胞（Ｎ＝１）から分泌される
ヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ１）を３５ｍｍプラスチック培養皿上に平板培養し、１００％コンフルエンスまで成長させた。単層を、リポフェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、英国）の存在下で赤血球凝集素（ＨＡ）タグ付きＦＫＢＰ−Ｌ／ｐｃＤＮＡ哺乳動物発現構築物で形質移入した。この結果、ＨＡタグを有する配列番号：２が発現する。
ＨＡタグ付きＦＫＢＰＬプラスミドを生成するために、ＦＫＢＰＬ ｃＤＮＡ（ポリヌクレオチド配列番号：３１；ポリペプチド変異体変異体Ｔｈｒ１８２、Ｇｌｙ１８６；配列番号：２）をＢａｍＨ１での消化によってｐＵＣ１８から切り取り、平滑末端化し、ｐＣＭＶ−ＨＡ哺乳動物発現ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、英国）の平滑末端化Ｓａｌ１部位中に定方向でクローニングした。これは、Ｎ末端ＨＡタグを有する配列番号：２の発現をもたらし、４４ｋＤａタンパク質を産生する。
６時間後、形質移入試薬を除去し、単層をピペットチップで傷つけ（コントロールは傷つけなかった）、ＭＣＤＢ−１３１を再度補充し、さらに７時間インキュベートした。培地を分析のために収集し、次いで、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、１００μｌの２ＸＬａｅｍｍｌｉバッファー（Ｓｉｇｍａ社）中に採取し、１０分間１００℃まで加熱した。細胞可溶化物および培養液の両方をニトロセルロース膜上にスロットブロットし、ＨＡタグ付きＦＫＢＰ−Ｌタンパク質を検出するためにモノクローナル抗ＨＡ抗体（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）（１：１０００希釈）でプローブし、次いで、ウサギＩｇ ＨＲＰ連結二次抗体（１：７５００希釈）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）でプローブした。抗体結合は、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（登録商標）Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ検出試薬（Ｐｉｅｒｃｅ社）を使用して検出した。
結果を図５に示す。図５は、正常なＨＭＥＣ−１単層または創傷単層中へのＨＡタグ付きＦＫＢＰ−Ｌ ｃＤＮＡ構築物の形質移入が、形質移入の２４時間後にＨＡタグ付きＦＫＢＰ−Ｌタンパク質の、培地中への分泌をもたらすことを示すスロット／ウェスタンブロットである。ウェスタンブロットはＨＡ抗体でプローブした。
これらのデータは、正常な成長条件下でＦＫＢＰ−Ｌタンパク質が活発に分泌されることを示し、ＦＫＢＰ−Ｌが、受容体活性化を介したその抗血管新生効果を媒介している可能性があるという仮説を支持する。データはまた、なぜ組換えタンパク質またはｃＤＮＡ構築物を使用する過剰発現が、インビトロおよびインビボで観察された抗血管新生効果を共に発揮することができるかに関する説明を提供する。
実施例４：時間の関数として測定された創傷閉鎖アッセイに対する完全長組換えタンパク質ＦＫＢＰ−Ｌの効果（Ｎ＝３）
以下の研究は、時間の関数として測定された創傷閉鎖アッセイに対する完全長Ｈｉｓタグ付き組換えＦＫＢＰ−Ｌタンパク質の効果を決定するために実行した。さらに、これらの研究で使用されるインビトロ遊走アッセイは、Ａｓｈｔｏｎら（１９９９）によって記載される方法の修飾バージョンである。ＨＭＥＣ−１をスライドガラス上の個々のチャンバー中に平板培養し、９０％コンフルエンスまで一晩成長させた。培地を除去し、単層を傷つけた。単層を新鮮な培地で再度補充し、必要とされる容量の完全長ｈｉｓタグ付き組換えＦＫＢＰ−Ｌ（つまり配列番号：１）を必要とされる最終濃度７５０ｎｇｍｌ−１とするために追加した。
スライドを、創傷の完全閉鎖まで固定した時点で取り出し、次いで、４％ＰＢＳ緩衝パラホルムアルデヒド中で固定した。「創傷」閉鎖の程度を無関係の調査者によって顕微鏡で盲検的に評価し、２０×倍率で目盛り付き接眼レンズグラティキュール（１ｍｍ／１００μｍ目盛）を使用して定量化した（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製ＢＸ５０）。ＦＫＢＰ−Ｌ処理スライド中の閉鎖の程度を時間が一致する偽処理コントロールと比較し、時間が一致するコントロールと比較した創傷閉鎖の阻害％を算出した。
これらの実験の結果を図６に示す。創傷閉鎖が、コントロールと比較して、ＦＫＢＰ−Ｌ処理（７５０ｎｇｍｌ−１）ＨＭＥＣ−１細胞中で全体として有意に阻害されたことを理解することができる。５０％の創傷閉鎖は７時間でコントロールで観察されたが、ＦＫＢＰ−Ｌ処理単層中の５０％の創傷閉鎖は最初の負傷後の１６時間まで観察されず、９時間の有意な遅延をもたらした。全創傷閉鎖は、３４時間まで開いたままであったＦＫＢＰ−Ｌ処理単層とは対照的に、コントロール実験で１６時間で観察された。これらの結果は、ＦＫＢＰ−Ｌの単一投与の効果がこのインビトロモデルでの創傷閉鎖を遅らせる極めて有効な方法となる可能性があることを示す。
実施例５：合成基底膜Ｍａｔｒｉｇｅｌ上での内皮細胞間接触の形成に対する完全長組換えタンパク質ＦＫＢＰ−Ｌの効果（Ｎ＝３）
本実験では、内皮細胞間接触の形成に対する完全長Ｈｉｓタグ付き組換えＦＫＢＰ−Ｌタンパク質（配列番号：１）の効果を評価した。サンプルは三連で実行した。
これらの研究で使用されるインビトロ細管形成アッセイは、Ａｓｈｔｏｎら（１９９９）によって記載される方法の修飾バージョンである。手短に言えば、アッセイは、ＢＤ ＢｉｏＣｏａｔ（登録商標）Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）Ｍａｔｒｉｘ Ｔｈｉｎ Ｌａｙｅｒ ２４−ｗｅｌｌ Ｍｕｌｔｉｗｅｌｌ Ｐｌａｔｅｓ（ＢＤ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｌａｂｗａｒｅ、Ｏｘｆｏｒｄ、英国）を使用して行った。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）は５００μｌ ＭＣＤＢ−１３１血清なし培地で再水和し、３０分間３７℃でインキュベートした。過剰培地を除去し、ＨＭＥＣ−１を１×１０５の密度で接種し、平板を１時間、５％ＣＯ２／９５％空気下で３７℃でインキュベートした。
増加性の濃度の組換えＦＫＢＰ−Ｌタンパク質（配列番号：１）を、各個々のウェルに三連で添加し（２５０〜１０００ｎｇｍｌ−１）、平板をさらに１８時間インキュベートした。近傍のＨＭＥＣ−１細胞の間の細管形成の程度を、指定エリア中の異なるＨＭＥＣ−１細胞の間の細胞間接触の数を数えることによって５つの視野で各ウェルで評価した。無関係の調査者が各ウェルを評価し、ＦＫＢＰ−Ｌ処理ウェルを偽処理コントロールと比較した。
結果を図７に示す。組換えＦＫＢＰ−Ｌタンパク質は、ＨＭＥＣ−１が、用量依存的な様式でＭａｔｒｉｇｅｌ上で細胞間接触または細管を形成する能力を阻害したことがわかった。この効果についての最適濃度は７５０ｎｇｍｌ−１であり、効能は８０％であり、ＥＣ５０効力は３１４ｎｇｍｌ−１であった。これらの結果は、これらの用量で、ＦＫＢＰ−Ｌが抗血管新生であり、ＨＭＥＣ−１細胞による管形成を予防することを示す。
実施例６：マウススポンジアッセイを使用したインビボでの血管新生に対する完全長組換えＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドの効果（Ｎ＝１；１グループ当たり２匹のマウス）
本実験は、２つの別のインビトロモデル、マウススポンジアッセイおよび大動脈輪モデルを使用して血管新生に対するＦＫＢＰ−Ｌの効果を測定した。
これらの実験では、ポリエーテルスポンジをＣ５７ブラックマウスに皮下に移植し、１０ｎｇウシ線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）または１０ｎｇ ｂＦＧＦ＋ ５μｇ完全長Ｈｉｓタグ付き組換えＦＫＢＰ−Ｌポリペプチド（配列番号：１）を１日おきに注射した。処理の１４日後、スポンジを採取し、薄切し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。
結果を図８および９に示す。図８Ａで、濃い灰色の細胞として見え、矢印によって示される赤血球は、ｂＦＧＦ処理スポンジの微小血管内に見ることができる。さらに、大量の細胞の内部成長（明るい灰色として見える）があることを理解することができる。赤血球および細胞の内部成長の両方は、ＦＫＢＰ−Ｌで同様に処理したスポンジでそれほど明白ではない（図８Ｂ）。４０×倍率で盲検的な様式で数えた１グループ当たり２匹のマウスからのスポンジ中の血管数を図９に示す。ＦＫＢＰ−Ｌ処理スポンジは、ｂＦＧＦ単独で処理したものよりも有意に少ない血管を有した（ｐ＝０．０００８）。
結果は、完全長組換えＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドがインビボで血管新生を阻害することができること、およびこのポリペプチドが臨床設定で可能性のある治療価値を有する可能性があることを示す。
実施例７：形成された血管の平均長、最大長、および数に対する効果を調査する血管新生のエクスビボ大動脈輪外植片モデルに対する完全長組換えＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドの効果（Ｎ＝３）
オスウィスターラットを安楽死させ、胸大動脈を取り出し、１ｃｍ厚の環に無菌的に薄切した。環は、あらゆる細菌を除去するために無菌培地中で１０回洗浄し、２４ウェルプレート上のＭａｔｒｉｇｅｌ中に埋め込んだ。ウェルを、２ｍｌの培地および増加性の濃度の完全長Ｈｉｓタグ付き組換えＦＫＢＰ−Ｌタンパク質（配列番号１）で補充した。平板を８日間インキュベートし、インキュベーション後、Ｍａｔｒｉｇｅｌおよび環を４％ＰＢＳ緩衝パラホルムアルデヒド中で固定し、ＰＢＳ中に保存した。血管発達の程度を無関係の調査者によって顕微鏡で盲検的に評価し、２０×倍率で目盛り付き接眼レンズグラティキュール（１ｍｍ／１００μｍ目盛）を使用して定量化した（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製ＢＸ５０）。各視野の血管長、最大血管長、および血管の数の程度を測定し、時間が一致する偽コントロールと比較し、阻害パーセント（％）を算出した。
これらの実験の結果を図１０に示す。ＦＫＢＰ−Ｌは、このエキソビボモデルで血管新生の強力な用量依存的な阻害剤であることがわかった。形成された平均血管長および最大血管長は１０００ｎｇｍｌ−１で有意に阻害され、時間が一致するコントロールとそれぞれ比較して６３％および７０％の阻害を示した。大動脈の外植片から形成された血管の数は、５００ｎｇｍｌ−１でのＦＫＢＬ−Ｌタンパク質での処理後に６５％最適に阻害された。
実施例８：ＭＴＴアッセイを使用するＨＭＥＣ−１の生存率または増殖に対する完全長組換えＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドの効果（Ｎ＝３）
これらの実験は、完全長ＦＫＢＰ−Ｌタンパク質の抗血管新生効果がポリペプチドの毒性によるものかどうかを評価した。ＭＴＴアッセイは細胞生存率／増殖を測定するために使用した。簡潔に言えば、ＨＭＥＣ−１細胞を９６ウェルプレート中に接種し（２．５×１０３）、５時間付着させた。細胞を、増加性の濃度の組換えＨｉｓタグ付きＦＫＢＰ−Ｌタンパク質（配列番号：１）で処理し、２４時間（図１１Ａ）および４８時間（図１１Ｂ）インキュベートした。インキュベーション後、細胞を、４時間、３−（−４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）２，５ジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ）の５ｍｇｍｌ−１溶液にさらした。細胞を吸引し、２００μｌのＤＭＳＯを追加して、塩を還元し、かつ色変化を誘発した。ウェルを５５０ｎｍで比色測定で分析し、結果を未処理コントロール細胞と比較した。実験を３回繰り返した。
結果を図１１Ａおよび１１Ｂに示す。ＦＫＢＰ−Ｌは、測定した時点のうちのいずれかで時間が一致するコントロールと比較してＨＭＥＣ−１細胞の増殖に対して有意な効果を有していなかったことがわかり、先のアッセイで観察された抗血管新生効果は、細胞成長の阻害またはＦＫＢＰ−Ｌ媒介性の毒性によって引き起こされたものではなかったことを示唆した。
実施例９：７５０ｍｇｍｌ−１完全長組換えＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドに対する暴露の際の遊走性内皮細胞の細胞骨格の形態の変化（Ｎ＝２）
免疫組織化学的分析は、チューブリンおよびビメンチンを染色することによって、ＦＫＢＰ−Ｌでの処理に際しての細胞骨格の形態を評価するために実行した。ＨＭＥＣ−１を４つのウェルチャンバースライドに接種し、コンフルエントな単層が形成されるまで一晩インキュベートした。先に記載されるように、培地を各ウェルから除去し、単層を傷つけた。細胞に、７５０ｎｇｍｌ−１組換えＨｉｓタグ付きＦＫＢＰ−Ｌタンパク質（つまり配列番号：１）を含有する培地を再度補充した。細胞を５時間インキュベートし、チャンバーをスライドから取り出し、細胞をＰＢＳで４回洗浄し、その後、２０分間、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘで処理した４％ＰＢＳ緩衝パラホルムアルデヒド中での固定を続けた。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘを含有する２％ＢＳＡ中で２０分間ブロックした。ブロックした細胞をＰＢＳ中で洗浄し、以下のモノクローナル一次抗体のうちの１つと９０分間インキュベートした：（Ａ）抗αチューブリン（１：５００）；および（Ｂ）抗ビメンチン（１：２００）。細胞をＰＢＳ中で洗浄し、その後、室温でのＦＩＴＣ抱合抗マウス二次（１：３０）との１時間のインキュベーションを続けた。細胞をヨウ化プロピジウムを含有するＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄで封入し、脱水を予防するために密封した。スライドをアルミ箔でカバーし、蛍光共焦点顕微鏡を使用する分析のために４℃で保存した。
結果を、図１２（細胞の抗チューブリン染色）および図１３（細胞の抗ビメンチン染色）に示す。コントロール遊走性ＨＭＥＣ−１では、微小管（抗αチューブリンを使用して染色）（図１２：コントロール）は、創傷の方向に走り、したがって方向性の遊走のプロセスを助ける規則的な直線状構造を有する。染色の濃い領域を核の前方に観察することができ、この微小管形成中心（ＭＴＯＣ）は、固定時に方向性の遊走が生じているといった良い指標となる。対照的に、ＦＫＢＰ−Ｌ処理細胞（図１２：ＦＫＢＰ−Ｌ）では、微小管は創傷中への配列をほとんど有していないように見える。微小管はわずかに曲がりくねっているまたは小さい束のように見え、左から右に配列しており、ＭＴＯＣは細胞の側に位置するように見え、活性の方向性の遊走を示さないことを理解することができる。
図１３は、抗ビメンチンを使用して染色したＨＭＥＣ−１の中間径フィラメントを示す。コントロール（未処理）細胞は、なおまた、組織化され、細長く、創傷の方向に向いているように見え、なおまた、細胞が活発に遊走していることを示唆する（図１３：コントロール）。対照的に、ＦＫＢＰ−Ｌ処理非遊走性ＨＭＥＣ−１の中間径フィラメントは、極めて無秩序であり、さらに凝集しており、それらが創傷中で活発に遊走しているといった徴候を示していないように見える（図１３：ＦＫＢＰ−Ｌ）。
この共焦点調査の結果は、遊走のＦＫＢＰ−Ｌ媒介性の阻害のメカニズムが細胞骨格を対象とする可能性があることを示唆する。
実施例１０：ＰＣ３、ＨＴ２９、およびＭＤＡ腫瘍細胞遊走に対する完全長組換えＦＫＢＰ−Ｌの効果（Ｎ＝３）
これらの実験では、腫瘍細胞遊走に対する組換えＦＫＢＰ−Ｌの効果を評価した。これらの研究で使用されるインビトロ遊走アッセイは、Ａｓｈｔｏｎら（１９９９）によって記載される方法の修飾バージョンである。前掲を参照されたい。ＰＣ３、ＭＤＡ２３１、およびＨＴ２９腫瘍細胞をスライドガラス上の個々のチャンバー中に平板培養し、９０％コンフルエンスまで一晩成長させた。培地を除去し、単層を傷つけた。単層を新鮮な培地で再度補充し、必要とされる容量のＨｉｓタグ付き組換えＦＫＢＰ−Ｌタンパク質（配列番号：１）を示される最終濃度とするために追加した。単層を２４時間インキュベートし、次いで、４％ＰＢＳ緩衝パラホルムアルデヒド中で固定した。
「創傷」閉鎖の程度を無関係の調査者によって顕微鏡で盲検的に評価し、２０×倍率で目盛り付き接眼レンズグラティキュール（１ｍｍ／１００μｍ目盛）を使用して定量化した（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製ＢＸ５０）。ＦＫＢＰ−Ｌ処理スライド中の閉鎖の程度を時間が一致する偽処理コントロールと比較し、時間が一致するコントロールと比較した創傷閉鎖の阻害パーセントを算出した。
結果を図１４、パネルＡ、Ｂ、およびＣに示す。組換えＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドが用量依存的な様式で腫瘍細胞遊走を阻害することがわかった。これらの発見は、ＦＫＢＰ−Ｌが腫瘍細胞の浸潤および転移を低下させるための治療薬として有用である可能性があることを示す。
実施例１１：インビボでのＤＵ１４５ヒト前立腺腫瘍細胞成長に対するＦＫＢＰ−Ｌ ｃＤＮＡ構築物の直接的な注射の効果（Ｎ＝１、処理グループ当たり４〜７匹のマウス）
実験は、インビボでのＤＵ１４５ヒト前立腺腫瘍細胞成長に対する、ＦＫＢＰ−Ｌ ｃＤＮＡ構築物の直接的な腫瘍内注射の効果を決定するために行った。
細胞培養
Ｄｕ１４５（前立腺癌）細胞をＣａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＵＫから得、１０％ウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩ １６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中で培養した。細胞株はすべて単層として成長させ、５％ＣＯ２下で３７℃でインキュベートした。
ＤＮＡプラスミド構築
ＦＫＢＰ−Ｌ／ｐｃＤＮＡ３．１プラスミドは、ｐＵＣ１８からのＢａｍＨ１を使用したＦＫＢＰＬ ｃＤＮＡ（ポリヌクレオチド配列番号：３１）の切り取りおよび次いで、実施例１に記載される、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のＢａｍＨＩ制限部位中へのＦＫＢＰ−Ｌの方向性のライゲーションによって構築した。エンドスタチンプラスミド（ポジティブ抗血管新生コントロールとしての使用のため）ｈＥｎｄｏ ＸＶ／ｐｃＤＮＡ３．１は、ｈＥｎｄｏ ＸＶ挿入断片を放出するようにＨｐａ１（Ｐｒｏｍｅｇａ社）およびＥｃｏＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）でｐＢＬＡＳＴ ｈＥＮＤＯ ＸＶプラスミド（ＩｎＶｉｖｏＧｅｎ社）を消化することによって構築した。ｈＥｎｄｏ ＸＶ挿入断片を、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のＥＣｏＲＶ制限部位中に定方向でライゲーションした。
前立腺癌異種移植片モデル
１９匹（１９）オス免疫低下（重篤な複合免疫不全）マウスを使用した（Ｈａｒｌａｎ社）。マウスを順応させ、壁ありの飼育施設中で５匹以下のグループでケージ中に入れた。先に記載されるように、Ｄｕ１４５（前立腺癌）細胞を培養した。サブコンフルエントな細胞を採取し、細胞濃度をＰＢＳ中で５×１０７細胞／ｍｌに合わせた。各マウスの背部を剪毛した。麻酔薬を投与した後、マウスにそれぞれ、２６ゲージ針での後部背部中への５×１０６ Ｄｕ１４５腫瘍細胞（１００μｌ）の皮内注射を両側に受けさせた。腫瘍が１００〜１２５ｍｍ３の容量に達するまで腫瘍を成長させた。マウスを４つの処理レジメンに無作為に分けた：（ａ）未処理（４匹のマウス）；（ｂ）空のベクター（ｐｃＤＮＡ３．１）（４匹のマウス）；（ｃ）ｈＥｎｄｏ ＸＶ／ｐｃＤＮＡ３．１（４匹のマウス）；および（ｄ）ＦＫＢＰ−Ｌ／ｐｃＤＮＡ３．１（７匹のマウス）。マウスに、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）：プラスミド複合体の腫瘍内注射を毎週２回、３日毎、または４日毎に受けさせた。簡潔に言えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００：プラスミド複合体を、動物当たりの各注射に関して以下のように作製した：２５μｌのプラスミド（１μｇ／μｌ）を２５μｌのオプティメム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に追加し、１０μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を４０μｌのオプティメムに追加した。２つの溶液を５分間室温でインキュベートした。２つの溶液を組み合わせ、腫瘍内注射の前にさらに２０分間室温でインキュベートした。腫瘍を各処理の前に測定した。腫瘍容量を次のように算出した：４／３πｒ３（式中、ｒ＝１／２ＧＭＰおよび
Figure 2009539367
結果を図１５に示す。ＦＫＢＰ−Ｌおよびエンドスタチン処理の腫瘍の両方は、壊死中心の徴候を示した、つまり、それらはドーナツ形に見えた。これは抗血管新生で見られた効果の典型である。コントロールは、約３５日までにそれらの容量を４倍にする時間に達した。しかしながら、ＦＫＢＰ−Ｌ処理腫瘍の成長は最初の処理後の３カ月（１００日）にわたって阻害され、腫瘍はそれらの最初の容量のわずか１０％であった。
したがって、ＦＫＢＰ−Ｌ発現構築物の腫瘍内注射がＤＵ１４５ヒト腫瘍異種移植片の成長を阻害すること、および肺癌の治療のために少なくともいくつかの国々（たとえば中国）で現在承認されているエンドスタチンで見られる効果に、上回らないにしても匹敵することがわかった。なおまた、これは、臨床設定でのＦＫＢＰ−Ｌ遺伝子治療の可能性のある治療価値を示す。
実施例１２：血管新生／遊走と関連するＦＫＢＰ−ＬアンチセンスオリゴヌクレオチドによってＬ１３２細胞中で調節された遺伝子
ｃＤＮＡマイクロアレイ分析
ＦＫＢＰ−Ｌアンチセンス（ＦＫＢＰ−Ｌアンチセンス：５’ＡＴＧ ＧＣＣ ＡＧＧ ＣＴＣ ＣＣＧ ＣＴＣ、３’）（配列番号：４０）またはコントロールとしてのリポフェクチンのみへの暴露の８時間後に、全ＲＮＡをＬ１３２細胞から単離した。ポリＡ＋ｍＲＮＡを、メーカーの指示に従って、Ｑｉａｇｅｎ社製Ｏｌｉｇｏｔｅｘキット（Ｑｉａｇｅｎ社、英国）を使用して全ＲＮＡサンプルから抽出した。これらのｍＲＮＡサンプル（サンプル当たり８００ｎｇ）をＩｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ社、米国に送り、そこでＵｎｉＧＥＭ ２．０マイクロアレイ分析を行った。
Ｉｎｃｙｔｅ社のＬｉｆｅａｒｒａｙチップは、同時に１０，０００個までの遺伝子の照合を可能にし、２つの異なるサンプル中の遺伝子発現レベルの比較をもたらす。簡潔に言えば、標準の逆転写反応を、両方のｍＲＮＡサンプルをシアニン色素標識ｃＤＮＡに変換するために実行した。８時間後の、ＦＫＢＰ−Ｌアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理したＬ１３２細胞からのｍＲＮＡをシアニン３（緑）標識プローブを生成するために使用し、８時間後のリポフェクチンのみで処理したＬ１３２細胞からのｍＲＮＡをシアニン５（赤色）標識プローブを産生するために使用した。２つの蛍光プローブサンプルを、特異的な場所で固形支持物上に固定された多数のｃＤＮＡプローブを含有する単一のマイクロアレイチップに同時にかけ、そこでそれらは、整列されたｃＤＮＡ分子と競合的に反応する。インキュベーション後、あらゆるハイブリダイズしていないサンプルの除去を確実にするためにマイクロアレイを一連の溶液中ですすいだ。次いで、マイクロアレイを、蛍光シグナル検出のためのスキャナーを使用して得た画像として取り込んだ。このスキャナーは、アレイ上の蛍光色素の励起による各スポットの強度についてのデータを生成した。チップの各エレメントを、Ｃｙ３（緑）、次いでＣｙ５（赤色）蛍光標識についてスキャンして、両方の色素チャンネルについての電子画像を作り出した。最終的なアレイ画像をＩｎｃｙｔｅ社製ＧＥＭＴｏｏｌｓソフトウェアパッケージを使用して分析した。
アップレギュレートされた遺伝子は血管新生の増加と関連する（表１）。ＲｈｏＡ、ＲｈｏＣ、ＲＯＣＫ Ｉ、およびＲＯＣＫ ＩＩ発現の上昇は、より進行した段階への腫瘍進行と関連することが知られており、ＲｈｏおよびＲＯＣＫシグナル伝達はいくつかの腫瘍細胞の形態学的変化および転移性の活動の一因となることが示唆された。これは、ＦＫＢＰ−Ｌの過剰発現が血管新生を阻害するならびにアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用するＦＫＢＰ−Ｌ抑制がＲｈｏおよびＲＯＣＫの活性化によって血管新生を促進することができるかもしれないといった仮説と一致している。データは、アンチセンスまたは標的ｓｉＲＮＡでのＦＫＢＰＬのノックダウンが血管新生を促進することができ、また慢性の創傷の癒合を促進するために使用することができることを暗示する。
表１ 遺伝子は、ＦＫＢＰ−Ｌアンチセンスオリゴヌクレオチドへの暴露の後に差動的に（differentially）発現した。
Figure 2009539367
実施例１３：細胞遊走の阻害は、ＨＭＥＣ−１および腫瘍細胞株ＤＵ１４５、ＰＣ３、ＨＴ２９、ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−２３１中のＣＤ４４に対して依存性である。
ＣＤ７４ ｍＲＮＡ発現を検出するためのＲＴ−ＰＣＲ
Ｄｕ１４５、ＨＭＥＣ−１、ＨＴ２９、ＰＣ３、ＭＣＦ−７、およびＭＤＡ−２３１細胞をＴ２５組織培養フラスコ中に接種し、それらが７０％の培養密度を達するまで成長させた。ＲＮＡは、メーカーの指示に従って、ＲＮＡｑｕｅｏｕｓキット（Ａｍｂｉｏｎ社、カタログ＃ＡＭ１９１２）を使用して細胞から単離した。ＲＮＡは、混入しているＤＮＡを除去するために、メーカーの指示に従って、Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡ−ｆｒｅｅ（商標）（Ａｍｂｉｏｎ社、カタログ＃１９０６）で処理した。ｃＤＮＡは、ＩｍＰｒｏｍ ＩＩ（商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、カタログＡ３８００）を使用してＲＮＡサンプルから調製した。簡潔に言えば、０．５μｇのＲＮＡおよび０．５μｇのオリゴｄＴプライマーをヌクレアーゼなしの水で５μｌまでにし、５分間氷上でインキュベートする前に５分間７０℃でインキュベートした。次いで、以下の試薬を追加した：ヌクレアーゼなしの水（５．３μｌ）、５×ＩｍＰｒｏｍ ＩＩ（商標）反応バッファー（４μｌ）、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２（３．２μｌ）１０ｍＭ ｄＮＴＰ混合物（１μｌ）ＩｍＰｒｏｍ ＩＩ（商標）逆転写酵素（１μｌ）、および組換えＲＮａｓｉｎリボヌクレアーゼ阻害剤（０．５μｌ）。逆転写反応を５分間２５℃、１時間４２℃、および最後に１５分間７０℃でインキュベートした。
各ＰＣＲ反応については：ｃＤＮＡ（２μｌ）、１０×ＰＣＲバッファー（５μｌ）、１０ｍＭ ｄＮＴＰミックス（２μｌ）、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２（２μｌ）、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ）（０．２５μｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社 カタログ＃１８０３８−０１８）、ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｒａｄｅ ｗａｔｅｒ（３４．７５μｌ）、ならびに２μｌの適切なフォワードプライマーおよびリバースプライマー（１０μＭ）（表２を参照されたい）を組み合わせた。サンプルを以下の温度プログラムを使用して増幅した：１分間９４℃を１サイクル、４５秒間９４℃、３０秒間５５℃、および９０秒間７２℃を４０（ＣＤ７４）または２５（ＧＡＰＤＨ）サイクル；その後１０分間７２℃を１サイクル続けた。
表２：ＣＤ７４およびＧＡＰＤＨのプライマー配列
Figure 2009539367
ＭＩＦおよびＣＤ４４を検出するためのウェスタンブロット
マウス内皮細胞株２Ｈ〜１１を含むすべての細胞株（ＭＩＦ試験のみのため）を、ウェスタンブロット分析を使用してそれらのＣＤ４４およびＭＩＦステータスについて評価した。細胞をｌａｅｍｍｌｉバッファー（Ｓｉｇｍａ社）中に採取し、１０分間９０℃まで加熱した。サンプルをＸｃｅｌｌ ＳｕｒｅＬｏｃｋ Ｍｉｎｉ−ｃｅｌｌシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にかけ、ニトロセルロース膜に移し、１％乳状液中で室温で１時間ブロックし、希釈１：５００のモノクローナル抗ＣＤ４４Ｈ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、カタログ＃ＢＢＡ１０）または希釈１：５００の抗ＭＩＦ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、カタログ＃ＡＦ−２８９−ＰＢ）および１：５０００希釈の抗−β−アクチン抗体（Ｓｉｇｍａ社、カタログ＃Ａ４７００）でプローブした。次いで、ブロットを、ＣＤ４４またはβ−アクチンについてプローブする場合は１：３５００希釈のマウスＩｇ ＨＲＰ連結二次抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、英国、カタログＮＡ９３１Ｖ）でまたはＭＩＦについてプローブする場合はヤギＩｇ ＨＲＰ連結二次抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、カタログ＃ｓｃ−２０２０）でプローブした。抗体結合は、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ社、カタログ＃３４０８０）を使用して検出した。
結果を図１６に示す。創傷閉鎖のＦＫＢＰ−Ｌ媒介性の阻害について先に評価されたすべての細胞株中でＣＤ７４およびＭＩＦが発現されたことがわかった。しかしながら、ＣＤ４４はＰＣ３、ＭＤＡ−２３１、ＨＴ２９、およびＨＭＥＣ−１中に存在したが、Ｄｕ１４５およびＭＣｆ−７中に存在しなかった。ＦＫＢＰ−ＬがＤＵ１４５およびＭＣＦ−７中で創傷閉鎖を阻害することができないことはＣＤ４４の不在と相互に関連した（下記の実施例１４に示す）。データは、ＦＫＢＰ−ＬがＣＤ４４に結合し、ＣＤ７４／ＭＩＦ結合に干渉し、これらの受容体からの血管新生シグナル伝達応答の阻害をもたらすといった仮説を支持する。
実施例１４：ＰＣ３（ＣＤ４４ ＋ｖｅ）、ＭＤＡ（ＣＤ４４ ＋ｖｅ）、ＨＴ２９（ＣＤ４４ ＋ｖｅ）、ＭＣＦ−７（ＣＤ４４ −ｖｅ）、およびＤＵ１４５（ＣＤ４４ −ｖｅ）腫瘍細胞遊走に対する完全長組換えＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドの効果（Ｎ＝３）
これらの研究で使用されるインビトロ遊走アッセイは、Ａｓｈｔｏｎら（１９９９）によって記載される方法の修飾バージョンである。前掲を参照されたい。ＰＣ３（前立腺腫瘍細胞株；ＣＤ４４陽性；ＣＤ４４ ＋ｖｅ）、ＭＤＡ２３１（乳房腫瘍細胞株；ＣＤ４４ ＋ｖｅ）、ＨＴ２９（結腸直腸腫瘍細胞株；ＣＤ４４ ＋ｖｅ）、ＭＣＦ−７（乳房腫瘍細胞株；ＣＤ４４陰性；ＣＤ４４ −ｖｅ）、およびＤＵ１４５（前立腺腫瘍細胞株；ＣＤ４４ −ｖｅ）をスライドガラス上の個々のチャンバー中に平板培養し、９０％のコンフルエンスまで一晩成長させた。培地を除去し、単層を傷つけた。単層を新鮮な培地で再度補充し、必要とされる容量の組換えＨｉｓタグ付きＦＫＢＰ−Ｌタンパク質（配列番号：１）を必要とされる最終濃度とするために追加した。単層を２４時間インキュベートし、次いで、４％ＰＢＳ緩衝パラホルムアルデヒド中で固定した。
「創傷」閉鎖の程度を無関係の調査者によって顕微鏡で盲検的に評価し、２０×倍率で目盛り付き接眼レンズグラティキュール（１ｍｍ／１００μｍ目盛）を使用して定量化した（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製ＢＸ５０）。ＦＫＢＰ−Ｌ処理スライド中の閉鎖の程度を時間が一致する偽処理コントロールと比較し、時間が一致するコントロールと比較した創傷閉鎖の阻害％を算出した。
細胞株はまた、ウェスタンブロット分析を使用してそれらのＣＤ４４ステータスについて評価した（図１６）。細胞をｌａｅｍｍｌｉバッファー（Ｓｉｇｍａ社）中に採取し、１０分間９０℃まで加熱した。サンプルをＸｃｅｌｌ ＳｕｒｅＬｏｃｋ Ｍｉｎｉ−ｃｅｌｌシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にかけ、ニトロセルロース膜に移し、１％乳状液中で室温で１時間ブロックし、希釈１：５００のモノクローナル抗ＣＤ４４Ｈ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、カタログ＃ＢＢＡ１０）および１：５０００希釈の抗−β−アクチン抗体（Ｓｉｇｍａ社、カタログ＃Ａ４７００）でプローブし、次いで、ＣＤ４４またはβ−アクチンについてプローブする場合は１：３５００希釈のマウスＩｇ ＨＲＰ連結二次抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、英国、カタログＮＡ９３１Ｖ）で、またはＭＩＦについてプローブする場合はヤギＩｇ ＨＲＰ連結二次抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、カタログ＃ｓｃ−２０２０）でプローブした。抗体結合は、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ社、カタログ＃３４０８０）を使用して検出した。
創傷閉鎖アッセイの結果を図１７Ａ〜１７Ｅに示す。組換えＦＫＢＰ−Ｌは、ＣＤ４４ −ｖｅ腫瘍細胞株中ではなく、ＣＤ４４ ＋ｖｅ腫瘍細胞株中で腫瘍細胞遊走を阻害することができることを理解することができる。データは、ＦＫＢＰ−Ｌが、ＣＤ４４ ＋ｖｅ腫瘍細胞株のサブセット中で腫瘍転移を阻害することができるかもしれないことを示唆する。
実施例１５：ｓｉＲＮＡ標的アプローチを介したＰＣ３細胞中のＣＤ４４のノックダウンはＰＣ３遊走のＦＫＢＰ−Ｌ媒介性の阻害を阻害する（Ｎ＝２）
ＰＣ３細胞をｓｉコントロール非標的ｓｉＲＮＡ（ＳＣＲ ｓｉＲＮＡ）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社、カタログ＃Ｄ−００１２１０−０１−０５）またはＣＤ４４標的ｓｉＲＮＡ（ＣＤ４４ｓｉＲＮＡ）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社、カタログ＃００９９９９）で７２時間形質移入した。簡潔に言えば、１．２×１０６ ＰＣ３細胞を２枚のＰ９０皿に接種し、２４時間３７℃でインキュベートした。形質移入するために、１５０μｌのｓｉコントロール非標的ｓｉＲＮＡまたはＣＤ４４標的ｓｉＲＮＡ（２μＭ）を４５０μｌの血清なし培地に追加した（チューブ１）。１８μｌのＤｈａｒｍａｆｅｃｔ２形質移入試薬（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社、カタログ＃Ｔ−２００２−０３）を５８２μｌの血清なし培地に二連で追加した（チューブ２）。すべてのチューブを５分間室温でインキュベートした。チューブ１および２の内容物を混合し、室温でさらに２０分間インキュベートした。このインキュベーション期間の間に、ＰＣ３細胞の２枚のＰ９０皿を洗浄し、４．８ｍｌの完全培地を各皿に追加した。次いで、適切なｓｉＲＮＡ形質移入ミックスを滴下し、皿を３７℃で７２時間インキュベートした。次いで、形質移入細胞をチャンバースライド中に接種し（１．２５×１０５細胞／チャンバー）、３７℃でさらに２４時間インキュベートした。単層を傷つけ、完全長組換えＨｉｓタグ付きＦＫＢＰ−Ｌ（配列番号：１）（１５００ｎｇ／ｍｌ）または完全培地を単層に追加した。単層をさらなる２４時間後に固定し、創傷閉鎖の程度を目盛り付きグラティキュールを使用して盲検的に評価した。未処理単層と比較した、ＦＫＢＰ−Ｌ処理単層中の創傷閉鎖の阻害パーセントを算出した。ＦＫＢＰ−Ｌは、ＳＣＲ ｓｉＲＮＡ処理細胞の遊走を２１．７％阻害したが、ＣＤ４４ ｓｉＲＮＡ処理細胞に対する効果を有していなかった。
ウェスタンブロット分析をＰＣ３細胞中のＣＤ４４のノックダウンを確認するために実行した。ｓｉコントロール非標的ｓｉＲＮＡ（５０ｎＭ）またはＣＤ４４標的ｓｉＲＮＡ（５０ｎＭ）での形質移入の１４４時間後、細胞をｌａｅｍｍｌｉバッファー（Ｓｉｇｍａ社）中に採取し、１０分間９０℃まで加熱した。サンプルをＸｃｅｌｌ ＳｕｒｅＬｏｃｋ Ｍｉｎｉ−ｃｅｌｌシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にかけ、ニトロセルロース膜に移し、１％乳状液中で室温で１時間ブロックし、希釈１：５００のモノクローナル抗ＣＤ４４Ｈ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、カタログ＃ＢＢＡ１０）および１：５０００希釈の抗−β−アクチン抗体（Ｓｉｇｍａ社、カタログ＃Ａ４７００）でプローブした。次いで、ブロットを、１：３５００希釈のマウスＩｇ ＨＲＰ連結二次抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、英国、カタログＮＡ９３１Ｖ）でプローブした。抗体結合は、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ社、カタログ＃３４０８０）を使用して検出した。
結果を図１８に示す。ＦＫＢＰ−Ｌは、コントロールｓｉＲＮＡの存在下で、ＣＤ４４ ＋ｖｅ細胞株、ＰＣ３の遊走を阻害することができることがわかった。ＣＤ４４ ｓｉＲＮＡでＣＤ４４をノックダウンすることにより（ＣＤ４４ ｓｉＲＮＡレーンを参照されたい）、遊走のＦＫＢＰ−Ｌ媒介性の阻害がＣＤ４４の存在に依存性であることがわかった。これらのデータはまた、遊走のＦＫＢＰ−Ｌ媒介性の阻害を促進するための、ＨＭＥＣ−１、ＰＣ３、ＭＤＡ−２３１、およびＨＴ２９等の細胞株中の内因性ＣＤ４４の必要性と相互に関連する。遊走のそのようなＦＫＢＰ−Ｌ媒介性の阻害は、ＣＤ４４を欠く細胞株、つまりＭＣＦ−７およびＤＵ１４５中で検出されない。
実施例１６：ＦＫＢＰ−Ｌは、創傷ＨＭＥＣ−１単層中の内因性ＣＤ４４と相互作用する
４枚のＰ９０組織培養皿にＨＭＥＣ−１細胞を接種し、その結果、それらは２４時間後に９０％コンフルエントとなった。ＨＭＥＣ−１細胞の４枚のＰ９０皿をＦＫＢＰ−Ｌ／ｐｃＤＮＡ３．１ ＤＮＡ構築物で形質移入した。簡潔に言えばリポフェクチン：ＦＫＢＰ−Ｌ／ｐｃＤＮＡ３．１プラスミド複合体を各ｐ９０皿について以下のように作り上げた：４μｇのプラスミドを４００μｌの最終容量までオプティメム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に添加し、４０μｌのリポフェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を３６０μｌのオプティメムに追加した。２つの溶液を４５分間室温でインキュベートした。２つの溶液を組み合わせ、さらに１５分間室温でインキュベートした。このインキュベーション期間の間に、Ｐ９０皿をＰＢＳで２回洗浄し、３．２ｍｌのオプティメムを各皿に追加した。リポフェクチン／プラスミド複合体を皿に静かに追加し、６時間３７℃でインキュベートした。次いで、形質移入培地を細胞から除去し、完全培地と交換した。細胞を３７℃でさらに１８時間インキュベートした。ＨＭＥＣ−１単層を傷つけ（Ｐ９０皿当たり３つの創傷）、７時間３７℃でインキュベートした。次いで細胞を氷冷ＰＢＳ中で２回洗浄し、細胞溶解バッファー（ＰＢＳ、１％イゲパール、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、１０ｍＭモリブデン酸ナトリウム、ＥＤＴＡフリーのタブレット１つ）中で採取した；Ｐ９０皿当たり３００μｌ。細胞可溶化物を３０分間回転させながら４℃でインキュベートした。細胞可溶化物は、細胞片を除去するために４℃で２０分間１３０００ｒｐｍで遠心分離した。次いで、上清を、回転させながら４℃で１時間、予洗したアガロースＧビーズと共にインキュベートすることによって予めきれいにした。予めきれいにした細胞可溶化物を３つに分割し、１／３をアガロースＧ−ＣＤ４４抗体抱合体に追加し、１／３をアガロースＧ−ＦＫＢＰ−Ｌ抗体抱合体に追加し、１／３を予洗したビーズに追加した（ネガティブコントロール）。抗体−アガロースＧ／細胞可溶化物の混合物を回転させながら４℃で一晩インキュベートした。次いで、ビーズを、氷冷細胞溶解バッファーで３回および氷冷ＰＢＳで３回洗浄した。次いで、ビーズを６０μｌのｌａｅｍｍｌｉバッファー中で元に戻した。
免疫沈降サンプルのウェスタンブロット分析を、ＦＫＢＰ−ＬおよびＣＤ４４の間の相互作用を確認するために実行した。サンプルを１０分間９０℃まで加熱した。サンプルをＸｃｅｌｌ ＳｕｒｅＬｏｃｋ Ｍｉｎｉ−ｃｅｌｌシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にかけ、ニトロセルロース膜に移し、１％乳状液中で室温で１時間ブロックし、希釈１：５００のモノクローナル抗ＣＤ４４Ｈ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、カタログ＃ＢＢＡ１０）および希釈１：１０００の抗ＦＫＢＰ−Ｌ抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ社）でプローブし、次いで、１：３５００のマウス（ＣＤ４４）またはウサギ（ＦＫＢＰ−Ｌ）Ｉｇ ＨＲＰ連結二次抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、英国、カタログＮＡ９３１Ｖ）でプローブした。抗体結合は、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ社、カタログ＃３４０８０）を使用して検出した。
結果を図１９に示す。したがって、外因的に過剰発現させたＦＫＢＰ−Ｌは創傷単層中の内因性ＣＤ４４と相互作用することが免疫沈降を使用してわかった。内因性ＦＫＢＰ−ＬおよびＣＤ４４の間の相互作用は創傷中でのみ検出することができるかもしれず、非創傷単層中では検出することができないかもしれない（データ示さず）。これは、ＣＤ４４との相互作用が検出され得る前に決定的なレベルのＦＫＢＰ−Ｌが発現される必要があることを示唆する。さらに、この相互作用は、遊走の刺激を受けた内皮細胞中、つまり創傷単層中でのみ生じる。
実施例１７：ＦＫＢＰ−ＬのＮ末端ドメインはＦＫＢＰ−Ｌの抗血管新生特性にとって重要である（Ｎ＝３）
切断型ＦＫＢＰ−Ｌ突然変異体構築物の調製
５つのＦＫＢＰ−Ｌ切断型突然変異体プラスミド構築物（Δ３４ＦＫＢＰ−Ｌ／ｐｃＤＮＡ３．１、Δ４０ＦＫＢＰ−Ｌ／ｐｃＤＮＡ３．１、Δ４８ＦＫＢＰ−Ｌ／ｐｃＤＮＡ３．１、Δ５８ＦＫＢＰ−Ｌ／ｐｃＤＮＡ３．１、Δ８６ＦＫＢＰ−Ｌ／ｐｃＤＮＡ３．１、Δ１５１ＦＫＢＰ−Ｌ／ｐｃＤＮＡ３．１、およびΔ２００ＦＫＢＰ−Ｌ／ｐｃＤＮＡ３．１）を構築するために；停止コドンを、部位特異的突然変異誘発（Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅキット、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）によってアミノ酸位置３４、４０、４８、５８、８６、１５１、または２００に導入した。
各部位特異的突然変異誘発反応については：ｐｃＤＮＡ３．１／ＦＫＢＰ−Ｌ／ＤＩＲｌ（１０ｎｇ）、１０×反応バッファー（５μｌ）、１０ｍＭ ｄＮＴＰ（２μｌ）、Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ／μｌ）（１μｌ）ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｒａｄｅ ｗａｔｅｒ（３７μｌ）、ＱｕｉｋＳｏｌｕｔｉｏｎ（３μｌ）、ならびに１μｌの適切なフォワードプライマーおよびリバースプライマー（１２５ｎｇ／μｌ）を組み合わせた。サンプルを以下の温度プログラムを使用して増幅した：１分間９５℃を１サイクル、５０秒間９５℃、５０秒間６０℃、および１６分間６８℃を１８サイクル；その後７分間６８℃を１サイクル続けた。
表３−ＦＫＢＰ−Ｌ切断型ＦＫＢＰ−Ｌ突然変異体構築物を調製するために使用されるプライマー
Figure 2009539367
制限エンドヌクレアーゼＤｐｎ Ｉ（１０ Ｕ／μｌ）（１μｌ）を、親の（突然変異なしの）ＤＮＡを消化するために各増幅反応物に直接追加し、１時間３７℃でインキュベートした。消化した増幅反応物をＸＬ−１０−ＧＯＬＤウルトラコンピテント細胞中に形質転換し、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ寒天平板上に平板培養した。１つのコロニーを選び取り、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有する２００ｍｌのＬＢブロス中で成長させた。各切断型ＦＫＢＰ−Ｌ突然変異体ＤＮＡ構築物をＱｉａｇｅｎ社製Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔを使用して精製した。突然変異構築物中の配列変化を自動ＤＮＡ配列決定法（Ｆｕｓｉｏｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ社）によって確認した（たとえば図２０Ａおよび２０Ｂを参照されたい）。
７つのＦＫＢＰ−Ｌ切断型突然変異体構築物を、図１に示されるポリペプチド（配列番号：３〜９）を発現するために形質移入した。
インビトロ遊走アッセイ
これらの研究で使用されるインビトロ遊走アッセイは、Ａｓｈｔｏｎら（１９９９）によって記載される方法の修飾バージョンである。ＨＭＥＣ−１をスライドガラス上の個々のチャンバー中に平板培養し、９０％コンフルエンスまで成長させた。単層を、リポフェクチンの存在下で、１μｇの野生型ＦＫＢＰ−Ｌ／ｐｃＤＮＡ（ポリペプチド配列番号１を発現する）、Δ３４ＦＫＢＰ−Ｌ／ｐｃＤＮＡ３．１、Δ４０ＦＫＢＰ−Ｌ／ｐｃＤＮＡ３．１、Δ４８ＦＫＢＰ−Ｌ／ｐｃＤＮＡ３．１、Δ５８ＦＫＢＰ−Ｌ／ｐｃＤＮＡ３．１、Δ８６ＦＫＢＰ−Ｌ／ｐｃＤＮＡ３．１、Δ１５１ＦＫＢＰ−Ｌ／ｐｃＤＮＡ３．１、または、Δ２００ＦＫＢＰ−Ｌ／ｐｃＤＮＡ３．１構築物（図１に示されるポリペプチドを発現する）で形質移入した。６時間後、形質移入試薬を除去し、単層をピペットチップで傷つけ、ＭＣＤＢ−１３１を再度補充し、７時間インキュベートした。
単層を、１０分間、４％ＰＢＳ緩衝パラホルムアルデヒド溶液で固定した。「創傷」閉鎖の程度を無関係の調査者によって顕微鏡で盲検的に評価し、２０×倍率で目盛り付き接眼レンズグラティキュール（１ｍｍ／１００μｍ目盛）を使用して定量化した（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製ＢＸ５０）。
結果を図２０Ｃに示す。完全長野生型ＦＫＢＰ−Ｌおよび切断型突然変異体Δ４８、Δ５８、Δ８６、Δ１５１、Δ２００は創傷閉鎖を阻害したことがわかった。ＷＴ−ＦＫＢＰ−ＬおよびΔ５８は、それぞれ３６．２．６％および４８．８％創傷閉鎖を阻害した。Δ３４およびΔ４０は創傷閉鎖を有意に阻害せず、活性ドメインがこれらの突然変異体中で欠失していたことならびに活性抗血管新生ドメインが完全長ＦＫＢＰ−Ｌのアミノ酸３４および５７の間に存在することを示唆する。
実施例１８：創傷切屑アッセイを使用した、ＦＫＢＰ−Ｌの活性ドメインをわたる候補ペプチドの評価：組換えＦＫＢＰ−Ｌとの比較（Ｎ＝３）
これらの研究で使用されるインビトロ遊走アッセイは、Ａｓｈｔｏｎら（１９９９）によって記載される方法の修飾バージョンである。前掲を参照されたい。ＨＭＥＣ−１をスライドガラス上の個々のチャンバー中に平板培養し、９０％コンフルエンスまで一晩成長させた。培地を除去し、単層を傷つけた。単層を新鮮な培地で再度補充し、必要とされる容量の以下のペプチドを１０−１４〜１０−６Ｍの用量範囲を達成するために追加した。
Figure 2009539367
単層を７時間インキュベートし、次いで、４％ＰＢＳ緩衝パラホルムアルデヒド中で固定した。「創傷」閉鎖の程度を無関係の調査者によって顕微鏡で盲検的に評価し、２０×倍率で目盛り付き接眼レンズグラティキュール（１ｍｍ／１００μｍ目盛）を使用して定量化した（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製ＢＸ５０）。ＦＫＢＰ−Ｌ処理スライド中の閉鎖の程度を時間が一致する偽処理コントロールと比較し、時間が一致するコントロールと比較した創傷閉鎖の阻害％を算出した。
これらの実験の結果を図２１に示す。より低用量の範囲（１０−１４〜１０−９Ｍ）では、ＦＫＢＰ−Ｌ ２４ｍｅｒおよび１〜５７ｍｅｒは創傷閉鎖の強力な阻害剤となった。最大の阻害は１０−１０〜１０−９Ｍの間で観察され、ＥＣ５０は各ペプチドについて非常に類似していた。これらのペプチドの両方は、モル／モルベースで、完全長組換えタンパク質と比較して効力の増加を示した。結論として、２４ｍｅｒおよび１〜５７ｍｅｒは内皮細胞遊走の強力な阻害剤となる。
実施例１９：管形成アッセイで合成基底膜Ｍａｔｒｉｇｅｌを使用した、内皮細胞間接触の形成についての、ＦＫＢＰ−Ｌの活性ドメインをわたる候補ペプチドの評価：組換えＦＫＢＰ−Ｌとの比較（Ｎ＝３）
方法：
これらの研究で使用されるインビトロ細管形成アッセイは、Ａｓｈｔｏｎら（１９９９）によって記載される方法の修飾バージョンである。手短に言えば、アッセイは、ＢＤ ＢｉｏＣｏａｔ（登録商標）Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）Ｍａｔｒｉｘ Ｔｈｉｎ Ｌａｙｅｒ ２４−ｗｅｌｌ Ｍｕｌｔｉｗｅｌｌ Ｐｌａｔｅｓ（ＢＤ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｌａｂｗａｒｅ、Ｏｘｆｏｒｄ、英国）を使用して行った。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）は５００μｌ ＭＣＤＢ−１３１血清なし培地で再水和し、３０分間３７℃でインキュベートした。過剰培地を除去し、ＨＭＥＣ−１を１×１０５の密度で接種し、平板を１時間、５％ＣＯ２／９５％空気下で３７℃でインキュベートした。１０−１４〜１０−６Ｍの増加性の濃度のＦＫＢＰ−Ｌ ２４ｍｅｒ（配列番号：１０）および１〜５７ｍｅｒ（配列番号：６）を使用した。
平板をさらに１８時間インキュベートした。近傍のＨＭＥＣ−１細胞の間の細管形成の程度を、指定エリア中の異なるＨＭＥＣ−１細胞の間の細胞間接触の数を数えることによって５つの視野の各ウェルで評価した。無関係の調査者が各ウェルを評価し、ＦＫＢＰ−Ｌ処理ウェルを偽処理コントロールと比較した。
結果を図２２に示す。ＦＫＢＰ−Ｌ ２４ｍｅｒおよび１〜５７ｍｅｒは、ＨＭＥＣ−１が、用量依存的な様式でＭａｔｒｉｇｅｌ上で細胞間接触または細管を形成する能力を阻害した。１〜５７ｍｅｒはこのアッセイでより有効であり、２４ｍｅｒの３０ｐＭと比較してＥＣ５０＝０．７ ｐＭであった。結論として、データは、ＦＫＢＰ−Ｌ ２４ｍｅｒおよびＦＫＢＰ−Ｌ １〜５７ｍｅｒが内皮の管形成の強力な阻害剤であることを示唆する。
実施例２０：ラット大動脈輪アッセイを使用する、血管新生の出芽に対する、ＦＫＢＰ−Ｌの活性ドメインをわたる候補ペプチドの効果。形成された血管の平均長、最大長、および数に対する効果（ｎ＝３）；完全長組換えタンパク質との比較
オスウィスターラットを安楽死させ、胸大動脈を取り出し、１ｃｍ厚の環に無菌的に薄切した。環は、あらゆる細菌を除去するために無菌培地中で１０回洗浄し、２４ウェルプレート上のＭａｔｒｉｇｅｌ中に埋め込んだ。ウェルに、２ｍｌの培地ならびに増加性の濃度のＦＫＢＰ−Ｌ ２４ｍｅｒ（配列番号：１０）およびＦＫＢＰ−Ｌ １〜５７ｍｅｒ（配列番号：６）および組換えＦＫＢＰ−Ｌ（配列番号：１）を補充した。
平板を無関係の調査者によって盲検的に評価し、２０×倍率で目盛り付き接眼レンズグラティキュール（１ｍｍ／１００μｍ目盛）を使用して定量化した（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製ＢＸ５０）。各視野の血管長、最大血管長、および血管の数の程度を測定し、時間が一致する偽コントロールと比較し、阻害％を算出した。
これらの実験の結果を図２３〜２４に示す。ＦＫＢＰ−Ｌ ２４ｍｅｒおよびＦＫＢＰ−Ｌ １〜５７ｍｅｒの両方は、３つのすべてのパラメーター、つまり血管長、最大血管長、および血管の数の程度によって評価した場合、このアッセイで活性であることがわかった（それぞれ図２３Ａおよび２３Ｂ）。しかしながら、このアッセイでは、２４ｍｅｒは、血管の数の点からとりわけ最も強力であり、１〜５７ｍｅｒの０．５３ｎＭおよび完全長組換えＦＫＢＰ−Ｌの１．５６ｎＭと比較してＩＣ５０：０．２ｐＭであった（図２４Ａおよび２４Ｂ）。２４ｍｅｒはまたいくつかの二相性の活性を示す。これらのデータは、２４ｍｅｒが、最初の血管の出芽の阻害、したがって血管の数の減少に最も強力である可能性があることを示唆する。要約すると、ＦＫＢＰ−Ｌ ２４ｍｅｒ、１〜５７ｍｅｒ、および組換えＦＫＢＰ−Ｌは血管新生の強力な阻害剤となる。
実施例２１：修飾Ｂｏｙｄｅｎチャンバーシステムでの細胞浸潤に対するＦＫＢＰ−Ｌ ２４ｍｅｒの効果（Ｎ＝３）。
このアッセイは、細胞が遊走し、浸潤する能力を測定する。微小血管内皮細胞は、遊走し、血管新生刺激後に細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に浸潤する必要がある。さらに、腫瘍細胞は、別の部位に広がり／転移するために遊走し、ＥＣＭに浸潤する必要がある。ＨＭＥＣ−１（微小血管内皮細胞；ＣＤ４４ ＋ｖｅ）ならびに２つの腫瘍細胞株ＭＤＡ−２３１（乳房；ＣＤ４４ ＋ｖｅ）およびＰＣ３（前立腺；ＣＤ４４ ＋ｖｅ）の両方をＦＫＢＰ−Ｌ ２４ｍｅｒの存在下でのそれらの浸潤性の可能性について評価した。
１２ウェルプレートポリカーボネート挿入物を２つのグループに分け、半分は被覆しないままとし、半分は１００μｇ／ｃｍ２Ｍａｔｒｉｇｅｌで被覆した。被覆挿入物を無菌組織培養フード中で室温で一晩乾燥させた。必要とされる細胞株；ＨＭＥＣ−１、ＰＣ３、またはＭＤＡ２３１をトリプシン処理し、新鮮な培地中で再懸濁し、細胞数を算出した。５００μｌの全容量中の５×１０５細胞を挿入物（上部のチャンバー）に追加し、１．５ｍｌの完全培地を浸潤のための刺激物として平板の下部のチャンバーに追加した。ＦＫＢＰ−Ｌ ２４ｍｅｒを実験ウェル中で必要とされる濃度で平板の上部および下部の両方に追加した。平板を２４時間（ＰＣ３もしくはＭＤＡ２３１）または４８時間（ＨＭＥＣ−１）インキュベートした。
挿入物をそれらの１２ウェルプレートから注意深く取り出した。Ｍａｔｒｉｇｅｌ被覆なしの挿入物をカルノワ固定液に直接入れた。Ｍａｔｒｉｇｅｌで被覆した挿入物は、浸潤していない細胞を除去するために綿棒で挿入物の上面を３回拭いた。次いで、挿入物をカルノワ中に置き、１０分間放置した。
挿入物をカルノワ溶液から取り出し、２０分間風乾した。乾燥した挿入物を、蒸留水中で洗浄する前に３０分間Ｈｏｅｓｃｈｔ（５０ｎｇ．ｍｌ−１）中で染色した。
ポリカーボネート挿入物をホルダーから切り取り、顕微鏡のスライド上の封入剤に置いた。カバーガラスをかけ、マニキュア液で密封した。スライドを分析するまで４℃で保存した。
各挿入物からの１０枚の画像を取り込み、画像当たりの蛍光細胞の数をＬｕｃｉａ画像ソフトウェアによって分析した。Ｍａｔｒｉｇｅｌ被覆挿入物上で可視の細胞と比較した非被覆挿入物上で可視の細胞の比を浸潤％として表現した。次いで、コントロールでの浸潤パーセント（％）を２４ｍｅｒ処理細胞と比較した。
結果を図２５に示す。ＦＫＢＰ−Ｌ ２４ｍｅｒ（配列番号：１０）はＨＭＥＣ−１、ＰＣ３、およびＭＤＡ−２３１細胞浸潤の強力な阻害剤であることを理解することができる。ＨＭＥＣ−１遊走の阻害を支持するためのさらなるデータを提供するのみならず、データは、ＦＫＢＰ−Ｌ ２４ｍｅｒがまたＭａｔｒｉｇｅｌを通しての浸潤；血管新生プロセスの重要な工程を阻害することができることを示す。データはまた、臨床設定でＣＤ４４ ＋ｖｅ腫瘍の転移を阻害することができるかもしれないということを示す。
実施例２２：細胞接着に対するＦＫＢＰ−Ｌ ２４ｍｅｒの効果（Ｎ＝３）
このアッセイは、細胞が接着する能力を測定する。これは血管新生および転移の重要な特徴である。内皮への白血球の動員および付着の重要な伝達物質は、炎症の間にアップレギュレートされるＥ−セレクチン、ＶＣＡＭ−１、およびＩＣＡＭ−１を含み、内皮への白血球付着を開始し、最終的に疾患進行または組織損傷の一因となる。
９６ウェルプレートを、一晩凝固させた薄層のＭａｔｒｉｇｅｌで予め被覆した。平板ウェルを、９５％空気／５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃で１時間０．５％ＢＳＡでブロックした。ヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ−１）をトリプシン処理し、新鮮な培地中で再懸濁し、ウェル当たり２００００個の細胞の密度で接種した。平板を１０分間４℃で置き、細胞をウェルの底に沈殿させた。ＦＫＢＰ−Ｌ ２４ｍｅｒを補充した必要とされる量の培地を各ウェルに追加し、平板を３７℃で１時間インキュベートした。過剰培地および付着していない細胞を除去し、ウェルを無菌ＰＢＳで３回洗浄した。ウェルに新鮮な培地を補充し、ＭＴＴを追加した（５ｍｇｍｌ−１）。平板を３７℃でさらに４時間インキュベートした。ＤＭＳＯを各ウェルに添加し、ＭＴＴをホルマザンに対して可溶化し、平板を５４０ｎｍで読み取り、コントロールウェルの相対的吸光度をＦＢＫＰ−Ｌ ２４ｍｅｒ補充ウェルと比較した。
結果を図２６に示す。ＦＫＢＰ−Ｌ ２４ｍｅｒはＨＭＥＣ−１付着の強力な阻害剤であることを理解することができる。ＨＭＥＣ−１遊走および浸潤の阻害を支持するためのさらなるデータを提供するのみならず、このアッセイはまた、ＦＫＢＰ−Ｌ ２４ｍｅｒが、血管新生プロセスおよび別の疾患状態での重要な工程である付着を阻害することができることを示す。
実施例２３：ＭＤＡ−２３１およびＰＣ３腫瘍細胞遊走に対するＦＫＢＰ−Ｌ ２４ｍｅｒの効果（Ｎ＝３）
これらの研究で使用されるインビトロ遊走アッセイは、Ａｓｈｔｏｎら（１９９９）によって記載される方法の修飾バージョンである。前掲を参照されたい。ＭＤＡ２３１（乳房腫瘍細胞株；ＣＤ４４ ＋ｖｅ）およびＰＣ３（前立腺腫瘍細胞株；ＣＤ４４ ＋ｖｅ）細胞をスライドガラス上の個々のチャンバー中に平板培養し、９０％コンフルエンスまで一晩成長させた。培地を除去し、単層を傷つけた。単層を新鮮な培地で再度補充し、必要とされる容量のＦＫＢＰ−Ｌ ２４ｍｅｒ（配列番号：１０）を必要とされる最終濃度（１０−１４〜１０−７Ｍ）とするために追加した。単層を２４時間インキュベートし、次いで、４％ＰＢＳ緩衝パラホルムアルデヒド中で固定した。
「創傷」閉鎖の程度を無関係の調査者によって顕微鏡で盲検的に評価し、２０×倍率で目盛り付き接眼レンズグラティキュール（１ｍｍ／１００μｍ目盛）を使用して定量化した（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製ＢＸ５０）。ＦＫＢＰ−Ｌ処理スライド中の閉鎖の程度を時間が一致する偽処理コントロールと比較し、時間が一致するコントロールと比較した創傷閉鎖の阻害％を算出した。
結果を、図２７Ａ（ＭＤＡ−２３細胞）および２７Ｂ（ＰＣ３細胞）に示す。ＦＫＢＰ−Ｌ ２４ｍｅｒがＭＤＡ−２３１およびＰＣ３腫瘍細胞の遊走を阻害することができることがわかった。これらはＣＤ４４ ＋ｖｅ腫瘍細胞株であり、なおまたＦＫＢＰ−Ｌが、完全長組換えタンパク質で観察されたもの（図１７）に類似して、ＣＤ４４を介して作用する可能性があることを示す。データは、ＦＫＢＰ−Ｌ ２４ｍｅｒが、ＣＤ４４ ＋ｖｅ腫瘍細胞株のサブセット中で腫瘍転移を阻害することができるかもしれないことを示唆する。
実施例２４：ＦＫＢＰ−Ｌ ２４ｍｅｒは血管新生抑制性阻害剤である（Ｎ＝３）
ＦＫＢＰ−Ｌ ２４ｍｅｒが内皮細胞出芽に対して永久的または静的な効果を発揮するかどうかを決定するために、ラット大動脈輪アッセイを使用した。オスウィスターラットを安楽死させ、無菌的に胸大動脈を取り出し、１ｃｍ厚の環に薄切した。環は、あらゆる細菌を除去するために無菌培地中で１０回洗浄し、２４ウェルプレート上のＭａｔｒｉｇｅｌ中に埋め込んだ。ウェルを２ｍｌの培地で補充し、平板を１５日間に至るまでインキュベートした。毎日、Ｍａｔｒｉｇｅｌ環を撮影し、それらのインキュベーターに戻した。さらに２つの実験を実行した：（Ａ）血管が７日間成長した後の、培地へのＦＫＢＰ−Ｌ ２４ｍｅｒの追加；および（Ｂ）最初の埋め込む段階での培地へのＦＫＢＰ−Ｌ ２４ｍｅｒの追加、続く７日後の除去、さらに７日間、新鮮な培地と交換。血管発達の程度を２０×倍率で目盛り付き接眼レンズグラティキュール（１ｍｍ／１００μｍ目盛）を使用して定量化し（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製ＢＸ５０）、Ｌｕｃｉａ画像ソフトウェアを使用して電子的手段によって測定した。血管長を測定し、時間が一致する偽コントロールと比較し、阻害パーセント（％）を算出した。
結果を図２８Ａおよび２８Ｂに示す。コントロール条件では、血管発達は３日目および１４日目の間に観察され、１４日目で最大値の１４００μｍに達した。対応する実験では、血管を７日間発達させ（およそ８００μｍ）、培地を除去し、１０−９ＭのＦＫＢＰ−Ｌ ２４ｍｅｒを含有する培地で再度補充した。２４ｍｅｒの追加は、時間が一致するコントロールと比較した場合、血管発達の完全な阻害を引き起こした（図２８Ａ）。
逆の実験（図２８Ｂ）では、大動脈輪をＦＫＢＰ−Ｌ ２４ｍｅｒで補充した培地に最初にさらし、７日間インキュベートした。ＦＫＢＰ−Ｌ ２４ｍｅｒはほとんど完全に血管発達を阻害した。ＦＫＢＰ−Ｌ ２４ｍｅｒ補充培地を環から取り出し、新鮮な培地を追加すると、血管の不断の成長をもたらした。
これらの実験は、ＦＫＢＰ−Ｌ ２４ｍｅｒが、血管新生抑制性の様式でおよび血管が成熟しているまたは新たに埋め込まれる場合に血管発達を阻害することを示唆する。
実施例２５：ＦＫＢＰＬ ２４ｍｅｒ（配列番号：１０）はスポンジアッセイを使用して、インビボで血管新生を阻害する；完全長組換えＦＫＢＰＬ（Ｎ＝１、グループ当たり３匹のマウス）との比較
本実験は、マウススポンジアッセイを使用して、ＦＫＢＰ−Ｌ ２４ｍｅｒが血管新生を阻害する能力を評価した。ポリエーテルスポンジを０日目にＣ５７ブラックマウス中に皮下移植し、（ａ）１０ｎｇ ｂＦＧＦコントロール（３匹のマウス）、（ｂ）１０ｎｇウシ線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）＋５μｇ完全長ｈｉｓタグ付き組換えＦＫＢＰＬ（インビトロでの３．２×１０−６Ｍに当量）（３匹のマウス）、（ｃ）１０ｎｇ ｂＦＧＦ＋０．３５μｇ ＦＫＢＰＬ ２４ｍｅｒ（５μｇ完全長組換えＦＫＢＰＬのモル当量）（３匹のマウス）、 または（ｄ）０．１１ｎｇ ＦＫＢＰＬ ２４ｍｅｒ（インビトロでの１０−９Ｍに当量）（３匹のマウス）を１日おきに注射した。
すべてのマウスを２１日目に犠牲死させた。スポンジを除去し、固定し、パラフィン包埋した。５ミクロンの切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。血管を、切片当たり１０視野中で×４０倍率を使用して３人の無関係の査定者によって盲検的に数えた。次いで、スポンジ／マウス当たりの平均数を各査定者についてプロットした。
結果を図２９に示す。ｂＦＧＦ単独の注射がスポンジ中への有意な数の血管成長をもたらしたことを理解することができる（血管の平均数／×４０視野＝１０）。血管数の５０％の低下は、ｂＦＧＦおよび５μｇ組換え完全長ＦＫＢＰＬの両方で処理したそれらのスポンジ中で観察された。血管数の８０％の低下は、ｂＦＧＦおよび０．３５μｇ ＦＫＢＰＬ ２４ｍｅｒの両方で処理したスポンジ中で観察された。最も低い用量のＦＫＢＰＬ ２４ｍｅｒでも、ｂＦＧＦ単独で処理したスポンジと比較して血管数を７０％低下させた。これらの結果は、ＦＫＢＰＬ ２４ｍｅｒがインビボでの血管新生を阻害することができることを示し、臨床設定で可能性のある治療価値を示唆する。データはまた、ＦＫＢＰＬ ２４ｍｅｒが、血管新生の阻害で完全長ＦＫＢＰＬタンパク質よりも強力である可能性があることを示す。
実施例２６：創傷切屑アッセイを使用する、マウス内皮細胞株中でのＦＫＢＰＬ ２４ｍｅｒペプチド（配列番号：１０）の評価
本実験は、ＦＫＢＰ−Ｌ ２４ｍｅｒが１０−１４Ｍ〜１０−７Ｍにわたる用量範囲にわたって内皮細胞遊走を阻害する能力を評価した。これらの研究で使用されるインビトロ遊走アッセイは、Ａｓｈｔｏｎら（１９９９）によって記載される方法の改変バージョンである。前掲を参照されたい。このアッセイで、マウス内皮細胞２Ｈ〜１１はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから得、１０％ＦＣＳを含有するＤ−ＭＥＭ中で成長させた。それらをスライドガラス上の個々のチャンバー中に平板培養し、９０％コンフルエンスまで一晩増殖させた。培地を除去し、単層を傷つけた。単層を新鮮な培地で再度補充し、必要とされる容量のＦＫＢＰＬ ２４ｍｅｒペプチドを１０−１４〜１０−７Ｍの用量範囲を達成するために追加した。単層を７時間インキュベートし、次いで、４％ＰＢＳ緩衝パラホルムアルデヒド中で固定した。
「創傷」閉鎖の程度を無関係の調査者によって顕微鏡で盲検的に評価し、２０×倍率で目盛り付き接眼レンズグラティキュール（１ｍｍ／１００μｍ目盛）を使用して定量化した（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製ＢＸ５０）。ＦＫＢＰ−Ｌ ２４ｍｅｒ処理スライド中の閉鎖の程度を時間が一致する偽処理コントロールと比較し、時間が一致するコントロールと比較した創傷閉鎖の阻害％を算出した。
これらの実験の結果を図３０に示す。ＦＫＢＰＬ ２４ｍｅｒがマウス内皮細胞中で創傷閉鎖を阻害したことを理解することができる。最大の阻害は１０−９〜１０−１１Ｍの間で観察された。データは、ＦＫＢＰＬ ２４ｍｅｒがマウス内皮細胞の遊走を阻害し、そのため、細胞遊走、血管新生、および転移の阻害剤となる可能性があることを実証する。データは、本明細書に記載されるマウスで実行されたインビボ実験を支持するものである（たとえば図８、９、１５、２９、および３１）。
実施例２７：ＦＫＢＰ−Ｌ ２４ｍｅｒペプチド（ＱＩＲＱＱＰＲＤＰＰＴＥＴＬＥＬＥＶＳＰＤＰＡＳ）は、毎日のＩＰ注射後にインビボでのＤＵ１４５腫瘍成長の強力な阻害剤となる（Ｎ＝１、処理グループ当たり６匹のマウス）
細胞培養
Ｄｕ１４５（前立腺癌）細胞をＣａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＵＫから得、１０％ウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩ １６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中で培養した。細胞株はすべて単層として増殖させ、５％ＣＯ２下で３７℃でインキュベートした。
前立腺癌異種移植片モデル
２４匹オス免疫低下（重篤な複合免疫不全）マウスを使用した（Ｈａｒｌａｎ社）。マウスは順応させ、５匹以下のグループでアイソレーター中に入れた。先に記載されるように、Ｄｕ１４５（前立腺癌）細胞を培養した。サブコンフルエントな細胞を採取し、細胞濃度をＰＢＳ中で５×１０７細胞／ｍｌに合わせた。各マウスの背部を剪毛した。麻酔薬を投与した後、マウスにそれぞれ、２６ゲージ針での後部背部中への５×１０６ Ｄｕ１４５腫瘍細胞（１００μｌ）の皮内注射を両側に受けさせた。腫瘍が１５０〜１７５ｍｍ３の容量に達するまで腫瘍を成長させた。マウスを４つの処理グループに無作為に分けた：（ａ）コントロール：ＰＢＳのみ（８匹のマウス）；（ｂ）２４ｍｅｒＦＫＢＰＬペプチド：０．３ｍｇ／ｋｇ／日（６匹のマウス）；（ｃ）２４ｍｅｒＦＫＢＰＬペプチド：３×１０−３ｍｇ／ｋｇ／日（６匹のマウス）；および（ｄ）２４ｍｅｒＦＫＢＰＬペプチド：３×１０−４ｍｇ／ｋｇ／日（５匹のマウス）。
マウスは、上記の処理の毎日のＩＰ注射（１００μｌ）を受けた。各マウスの体重および腫瘍容量を２日毎に記録した。腫瘍容量を次のように算出した：長さ×幅×高さ×０．５２３６。最初の処理の２１日後に以下の動物を犠牲死させた：０．３ｍｇ／ｋｇ／日 ２４ｍｅｒＦＫＢＰＬ（２匹のマウス）、３×１０−３ｍｇ／ｋｇ／日（２匹のマウス）、３×１０−４ｍｇ／ｋｇ／日（１匹のマウス）、およびＰＢＳ（２匹のマウス）。腫瘍を切り取り、後日の組織病理学的分析のためにホルマリン生理食塩水中で保存した。
結果を図３１に示す。０．３ｍｇ／ｋｇ／日または３×１０−３ｍｇ／ｋｇ／日の用量での２４ｍｅｒＦＫＢＰＬペプチドでのｉ．ｐ．注射による処理は、ビヒクルのみで処理した腫瘍と比較して、ＳＣＩＤマウス中でのＤＵ１４５腫瘍の成長を有意に遅らせたことを理解することができる（図３１Ａ）。最も有効用量の２４ｍｅｒＦＫＢＰＬペプチドで処理した多くの腫瘍は壊死中心部の徴候を示した、つまり、それらはドーナツ形に見えた。これは抗血管新生で見られた効果の典型である。
総合的なデータセットを（図３１Ａ）に示す。２匹のＰＢＳコントロール処理動物が図３１Ａに示されるデータから除外されたことに注意されたい。１匹目のコントロール動物は、その腫瘍が他の動物によって食べられたので除外した；もう一匹のコントロール動物は、その腫瘍の移植が誤って尾に近すぎたので、これは成長を制限することで知られているので、除外した。
カプラン−マイヤ生存曲線を、腫瘍が、犠牲の判断基準としての３×それらの処理容量に達する時間を使用して引いた（図３１Ｂ〜Ｄ）。０．３ｍｇ／ｋｇ／日（図３１Ｂ）および０．００３ｍｇ／ｋｇ／日（図３１Ｄ）の両方でのＦＫＢＰＬ ２４ｍｅｒ処理動物の腫瘍が、コントロールよりも有意に後で、３×それらの処理容量に達したことを明白に理解することができる。０．３ｍｇ／ｋｇ／日処理グループからの２つの腫瘍以外のすべて（６つのうち）および０．００３ｍｇ／ｋｇ／日処理グループからの１つ（６つのうち）は実験の期間内にそれらの容量の３倍に達しなかった。しかしながら、３×処理容量に達したそれらの腫瘍は肉眼的検査後に明白に壊死していた。したがって、これらの腫瘍はまた応答していたが、それらの大きさがより大きくなったのは、生存可能な腫瘍細胞ではなく大量の壊死によって引き起こされたものであった。最も低用量の０．０００３ｍｇ／ｋｇ／日で処理した動物中の腫瘍はコントロールと有意差はなかった。
動物のどれも２４ｍｅｒでの毎日の処理の後に減量せず、２４ｍｅｒは耐容性がよく、ひどく有毒ではないことを示唆する（図３１Ｅ）。
実施例２８：ＭＴＴアッセイを使用するＨＭＥＣ−１の生存率または増殖に対するＦＫＢＰ−Ｌの活性ドメインをわたる候補ペプチドの効果（Ｎ＝３）
ＭＴＴアッセイは細胞生存率および／または増殖を測定するために使用した。簡潔に言えば、ＨＭＥＣ−１細胞を９６ウェルプレート中に接種し（２．５×１０３）、５時間付着させた。細胞を、ＦＫＢＰ−Ｌ ２４ｍｅｒ（配列番号：１０）（１０−５〜１０−１０Ｍ）、１〜５７ｍｅｒ（配列番号：６）（１０−９Ｍおよび１０−１０Ｍ）、または培地（コントロール）で処理した。
インキュベーション後、細胞を、４時間、３−（−４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）２，５ジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ）の５ｍｇｍｌ−１溶液にさらした。細胞を吸引し、２００μｌのＤＭＳＯを追加して、塩を還元し、かつ色変化を誘発した。ウェルを５５０ｎｍで比色測定で分析し、結果を未処理コントロール細胞と比較した。
結果を図３２および３３に示す。図３２は、ＦＫＢＰ−Ｌ ２４ｍｅｒでの細胞の処理のための用量範囲を示し、図３３Ａおよび３３Ｂは、それぞれ２４時間および４８時間後のＦＫＢＰ−Ｌ ２４ｍｅｒおよびＦＫＢＰ−Ｌ １〜５７（５７ｍｅｒ）の効果を示す。ペプチドのどちらも、測定した時点のうちのいずれかでの時間が一致するコントロールと比較して、ＨＭＥＣ−１細胞の増殖に対していかなる有意な効果をも有さず、先のアッセイで観察された抗血管新生効果は、細胞成長の阻害またはペプチド媒介性の毒性によって引き起こされたものではなかったことを示唆したことを理解することができる。
実施例２９：創傷切屑アッセイを使用して、細胞遊走の阻害の点から各ペプチドの重要性を評価するための切断型２４ｍｅｒベースのペプチドの分析
これらの研究で使用されるインビトロ遊走アッセイは、Ａｓｈｔｏｎら（１９９９）によって記載される方法の改変バージョンである。前掲を参照されたい。ＨＭＥＣ−１をスライドガラス上の個々のチャンバー中に平板培養し、９０％コンフルエンスまで一晩増殖させた。培地を除去し、単層を傷つけた。単層を新鮮な培地で再度補充し、必要とされる容量の各ペプチド（つまりペプチド１〜１７、配列番号：１２〜２８；下記の表４）を必要とされる最終濃度（１０−１４〜１０−６Ｍ）まで添加した。
ペプチド１を作製するために、蛍光体Ａｌｅｘａ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を、２４ｍｅｒ配列のＣ末端に配置された、側鎖スルフヒドリル官能性のシステイン残基に付けた。−ＰＥＧ−スペーサーは、このＣ末端システイン残基を２４ｍｅｒ配列のＣ末端に連結させるために使用した。これは、２４ｍｅｒ配列およびＣ末端Ａｌｅｘａ標識システインの間に−ＰＥＧスペーサーを得るために、ポリエチレングリコールスペーサーである市販で入手可能な構成要素Ｆｍｏｃ−８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸（ＮｅｏＭＰＳ社）を組み込むことによるペプチドの合成の間に行った。ＰＥＧスペーサー／蛍光体は以下の構造を有する：−ＮＨ−（ＣＨ２）２Ｏ−（ＣＨ２）２Ｏ−（ＣＨ２）−ＣＯ−Ｃｙｓ−（Ａｌｅｘａ４８８）。別のペプチドもまた、下記のペプチド２〜１７を生成するために市販で入手可能な構成要素を組み込むことによって作製した。
表４
ＦＫＢＰ−Ｌペプチド
Figure 2009539367
単層を２４時間インキュベートし、次いで、４％ＰＢＳ緩衝パラホルムアルデヒド中で固定した。「創傷」閉鎖の程度を無関係の調査者によって顕微鏡で盲検的に評価し、２０×倍率で目盛り付き接眼レンズグラティキュール（１ｍｍ／１００μｍ目盛）を使用して定量化した（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製ＢＸ５０）。ＦＫＢＰ−Ｌ処理スライド中の閉鎖の程度を時間が一致する偽処理コントロールと比較し、時間が一致するコントロールと比較した創傷閉鎖の阻害％を算出した。
ペプチド１〜１２についての結果を、図３４Ａ〜Ｌにそれぞれおよび表５に示す。
表５
Figure 2009539367
ペプチド１２は、ＦＫＢＰ−Ｌ ２４ｍｅｒとほぼ同じ活性を示した。これらのデータは、いくつかのＦＫＢＰ−Ｌ由来のペプチドが二相性の用量反応を示すことを示唆する。データはまた、サブ領域−ＱＱＰＲＤＰＰＴＥＴＬＥＬＥＶＳＰＤ−（配列番号：１１）が強力な抗血管新生ドメインとなる可能性があることを示唆する。データは、１８個以上の連続したアミノ酸（たとえばペプチド５、配列番号：１６；ペプチド１２、配列番号：２３および配列番号：１１）を含む配列番号：１０の断片が抗血管新生剤として活性である可能性があることをさらに示す。このドメインを含むさらなるペプチドを図１に示す。
実施例３０：精製組換えＦＫＢＰ−Ｌの分析
組換えＦＫＢＰ−Ｌタンパク質発現
ｐＲＳＥＴ−ＡベクターのＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩ部位中にクローニングしたＦＫＢＰ−Ｌ（変異体Ｔｈｒ１８１、Ｇｌｙ１８６）をＢＬ２１（ＤＥ３）中で発現させて、対応するＮ末端ポリヒスチジンタグ付きタンパク質（配列番号：１）を得た。発現は、１５℃で一晩細胞を成長させながら、０．２ｍＭ ＩＰＴＧでＯＤ０．６で誘発させた。細胞を遠心分離によってペレットにし、−２０℃で保存した。
組換えＦＫＢＰ−Ｌ精製
タンパク質の精製は、カラム上でのリフォールディング工程と共に変性条件下で行った。細胞を、冷却しながら３×２分間氷上で超音波処理することによって、溶解バッファー（１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４ ｐＨ８．０、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、８Ｍ尿素、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ β−メルカプトエタノール）中で溶解した。細胞片および不溶性物質を、４℃、２０分間、３１，１００ｒｃｆでの遠心分離によって除去した。上清は、０．４５μｍフィルターを通してシリンジ濾過した。
５ｍｌ ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラムを結合バッファー（８Ｍ尿素、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー ｐＨ８．０、５ｍＭ β−メルカプトエタノール）中で平衡化し、細胞可溶化物をカラム上に装填した。カラムを１０カラム容量の洗浄バッファー（８Ｍ尿素、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー ｐＨ８．０、２０ｍＭイミダゾール、５ｍＭ β−メルカプトエタノール）で洗浄し、次いで、結合バッファー中で再平衡化した。
結合したタンパク質は、３０ｍｌ ０〜１００％直線勾配のリフォールディングバッファー（５ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー ｐＨ７．４、１ｍＭ β−メルカプトエタノール）中で、その後１００％リフォールディングバッファーでの５分間で徐々にリフォールディングした。
結合したタンパク質を、３０ｍｌ ０〜１００％直線勾配の溶出バッファー（５００ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー ｐＨ７．４、１ｍＭ β−メルカプトエタノール）中で溶出した。画分をＳＤＳ ＰＡＧＥによって分析し、適宜プールした。イミダゾール、ＮａＣｌ、およびβ−メルカプトエタノールの濃度を低下させるために、タンパク質は、１５０ｍＭ ＮａＣｌを有する２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー ｐＨ ７．４に対して透析した（図３５Ａ）または２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾール中でＨｉＬｏａｄ ２６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ ２６／６０プレップカラムを通して移動させた（図３５Ｃおよび図３６）。組換えＦＫＢＰ−Ｌサンプルを、ＳＤＳ ＰＡＧＥ（図３５Ａおよび３５Ｂ）ならびに未変性ＰＡＧＥ（図３５Ｃ、挿入図）によって比較した。
分析用ＨＰＬＣおよび質量分析
１００ｍＭ ＤＴＴありおよびなしの組換えＦＫＢＰ−Ｌの５０μｇサンプルを、３０分間にわたってアセトニトリルの０〜７３％勾配で分析用Ｊｕｐｉｔｅｒ ５ｕ ｃ５カラム上で移動させた。ピークを収集し、エレクトロスプレー質量分析によって分析した。
ゲル浸透分析
以下の分子量標準物質を、バッファー（２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾール）中でＳｕｐｅｒｏｓｅ１２ １０／３００ ＧＬカラム上を移動させた：ブルーデキストラン、アルコールデヒドロゲナーゼ、ウシ血清アルブミン、オバルブミン、炭酸脱水酵素、およびシトクロムｃ。ピークの溶出容量を完全長組換えＦＫＢＰ−ＬについてのＫａｖを算出するために使用した。このＫａｖから検量線により分子量を算出することができた。Ｋａｖは、
Ｋａｖ＝（Ｖｅ−Ｖｏ）／（Ｖｔ−Ｖｏ）
として算出した。式中、Ｖｅは溶出容量であり、Ｖｏは空隙容量（ブルーデキストランについての溶出容量）であり、Ｖｔは全カラム容量である。Ｋａｖをログ分子量に対してプロットして、直線を得、これから方程式を求め、所与のＶｅについての分子量を見積もるために使用した。
分析については、１００ｍＭ ＤＴＴありおよびなしの組換えＦＫＢＰ−Ｌの１４０μｇサンプルを同じ条件下で移動させ、見積もった分子量は上記に記載されるＶｅから見積もった。そのうえ、カラムは、バッファー＋１ｍＭ ＤＴＴ中で平衡化させ、ＤＴＴで前処理したＦＫＢＰ−Ｌのさらなるサンプルをこれらの条件下で移動させた（図３６）。
グルタルアルデヒドを使用するタンパク質架橋
１％最終濃度のグルタルアルデヒドを、３０秒間、５００μｌバッファー（２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、約５ｍＭイミダゾール）中で２５μｇ組換えＦＫＢＰ−Ｌ（透析済み）に追加した。その反応を、ＮａＢＨ４を追加することによって止め、タンパク質をＮａデオキシコレートおよびＴＣＡで沈殿させ、還元条件下でＳＤＳ ＰＡＧＥによって分析した（図３７）。
これらの実験は、ここで発現され、精製され、透析された組換えＦＫＢＰ−Ｌタンパク質が還元条件（図３５Ａ）下でのＳＤＳ ＰＡＧＥ分析に際して単一バンドの純度を示したことを示す。非還元条件（図３５Ｂレーン３および図３５Ｃ）ならびに還元条件（図３５Ｂレーン４および図３５Ｃ）下でのＦＫＢＰ−ＬのＳＤＳ ＰＡＧＥ分析ならびに未変性ＰＡＧＥ分析（それぞれ図３５Ｂならびに図３５Ｃ）は、ＦＫＢＰ−Ｌが、タンパク質内のシステイン残基の間の分子間ジスルフィド結合形成の形成を通して、より高い分子量の多量体種を形成することを示す。
エレクトロスプレー質量分析が後に続く組換えＦＫＢＰ−Ｌの分析用ＨＰＬＣ分析により、還元ＦＫＢＰ−Ｌについて４２，２５７（４２，２２０と予測された）の質量を得、タンパク質の同一性を確認した。
ゲル浸透分析は、組換えＦＫＢＰ−Ｌの四次構造についての情報を獲得しようと試みるために使用した（図３６）。記載される条件下で、還元ＦＫＢＰ−Ｌは、平均溶出容量１２ｍｌで溶出する。一連の分子量標準物質でのカラムの校正から、１２ｍｌの溶出容量は９９ＫＤａの質量に対応する。同様に、ＤＴＴ存在下でのグルタルアルデヒド架橋の組換えＦＫＢＰ−Ｌは、一貫して、９７ｋＤａにＳＤＳ ＰＡＧＥ分析移動の際にバンドを示した（図３７）。これらの結果は、ＦＫＢＰ−Ｌが、非共有結合を通してホモ二量体および／またはホモ三量体種を形成する可能性があることを示す。これは、ＦＫＢＰ−Ｌアミノ酸配列内のテトラトリコペプチド反復の存在の予測と一致しており、これは、別のタンパク質中で三量体形成を誘発することで知られている。
実施例３１：ＦＫＢＰ−Ｌ抗体の生成
ｐＲＳＥＴ−ＡベクターのＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩ部位中にクローニングしたＦＫＢＰ−Ｌ（変異体Ｔｈｒ１８１、Ｇｌｙ１８６）をＢＬ２１（ＤＥ３）中で発現させて、対応するＮ末端ポリヒスチジンタグ付きタンパク質（配列番号：１）を得た。配列を確証したクローンをＢＬ２１（ＤＥ３）イー・コリ細胞中に形質転換し、対数期まで培養し、標的タンパク質発現をイソプロピル−ｂ−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ、１ｍＭ）の追加によって誘発し、３７℃でさらに４時間インキュベートした。細胞ペレットを再懸濁し、８Ｍ尿素、３００ｍＭ ＮａＣｌ、および１０ｍＭイミダゾールを含有する５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ８．０中に溶解させた。粗変性可溶化物を、Ｎｉ２＋イオンでチャージしたＩＭＡＣカラム、ＨｉＴｒａｐ １ｍｌカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）にかける前に、遠心分離（１０，０００ｇ、４℃で６０分間）によって清澄した。非特異的に結合した物質を、８Ｍ尿素、３００ｍＭ ＮａＣｌ、および２０ｍＭイミダゾールを含有する５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ ８．０を使用してカラムから洗い落とし、その後、２００カラム容量に対して８から０Ｍへの尿素の還元によるカラム上でのリフォールディングを続けた。リフォールディングしたカラム結合物質を、さらなる２０カラム容量の５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ、および２０ｍＭイミダゾールで洗浄し、次いで、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ、および２５０ｍＭイミダゾールで溶出した。タンパク質画分をＰＢＳ中に収集し、脱塩した。
ウサギを組換えタンパク質で免疫化し（標準の英国内務省ガイドラインに従って）、４回の追加免疫が完了するまで、追加免疫を３週間毎に与えた。血清を収集し、ウェスタンブロット分析によって組換えＦＫＰＰ−Ｌ（抗原として生成された）に対して評価した。約３９ｋＤａのＦＫＢＰＬバンドが検出された。
したがって、本発明の実施形態は、ＦＫＢＰ−Ｌを含む方法および組成物を提供する。ある実施形態では、ＦＫＢＰ−Ｌおよびそのペプチド断片は、そのような療法が陽性の予後の結果を有することが期待される癌および／または他の状態の治療での使用のための抗血管新生剤および／または抗転移性剤として臨床的有用性を有するポリペプチドである。ポリペプチドは、指定された腫瘍に対して可能性のある二次的または一次的治療効果を示す、選択された癌細胞に対して実証可能な成長阻害効果を有する。
本明細書に言及された文書はすべて、参照によって本明細書に組み込まれる。本発明の記載される実施形態に対する多種多様の改変および変更は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく当業者にとって明白であろう。本発明は、特定の好ましい実施形態に関連して記載されるが、請求される本発明は、そのような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないということを理解されたい。実際に、当業者にとって明白な、本発明を実行する、記載された形態の多種多様の改変は、本発明によって包含されることが意図される。

Claims (33)

  1. 血管新生によって媒介されるまたはそれと関連する障害の治療用薬剤の製造における、（ｉ）単離ＦＫＢＰ−ＬポリペプチドもしくはＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドの生物活性断片またはＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドの生物活性誘導体もしくはその断片を含む活性化合物あるいは（ｉｉ）そのようなＦＫＢＰ−Ｌポリペプチド、断片または誘導体をコードするポリヌクレオチドの使用。
  2. 血管新生の阻害剤として使用するための薬剤の製造における、請求項１に記載の（ｉ）単離ＦＫＢＰ−ＬポリペプチドもしくはＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドの生物活性断片またはＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドの生物活性誘導体もしくはその断片を含む活性化合物あるいは（ｉｉ）そのようなＦＫＢＰ−Ｌポリペプチド、断片または誘導体をコードするポリヌクレオチドの使用。
  3. 癌の治療用薬剤の製造における、（ｉ）単離ＦＫＢＰ−ＬポリペプチドもしくはＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドの生物活性断片またはＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドの生物活性誘導体もしくはその断片を含む活性化合物あるいは（ｉｉ）そのようなＦＫＢＰ−Ｌポリペプチド、断片または誘導体をコードするポリヌクレオチドの使用。
  4. 腫瘍細胞の遊走および／または転移の阻害剤として使用するための薬剤の製造における、（ｉ）単離ＦＫＢＰ−ＬポリペプチドもしくはＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドの生物活性断片またはＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドの生物活性誘導体もしくはその断片を含む活性化合物あるいは（ｉｉ）そのようなＦＫＢＰ−Ｌポリペプチド、断片または誘導体をコードするポリヌクレオチドの使用。
  5. 腫瘍細胞の成長および／または増殖の阻害剤として使用するための薬剤の製造における、（ｉ）単離ＦＫＢＰ−ＬポリペプチドもしくはＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドの生物活性断片またはＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドの生物活性誘導体もしくはその断片を含む活性化合物あるいは（ｉｉ）そのようなＦＫＢＰ−Ｌポリペプチド、断片または誘導体をコードするポリヌクレオチドの使用。
  6. ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチド、ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドの生物活性断片またはＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドの生物活性誘導体もしくはその断片が、少なくとも１つのさらなる化学療法剤もしくは化学的予防剤または放射線療法と組み合わせて提供される、請求項３から５のいずれか一項に記載の使用。
  7. 少なくとも１つのさらなる化学療法剤または化学的予防剤が、少なくとも１つの抗血管新生薬、エンドスタチン、アンジオスタチン、ＶＥＧＦ阻害剤、細胞毒性剤、アルカロイド、代謝拮抗薬、癌成長阻害剤、遺伝子治療の治療薬、癌ワクチン、インターフェロン、アルデスロイキン、モノクローナル抗体、化学療法薬、放射線療法、ホルモン療法または別の支持療法を含む、請求項６に記載の使用。
  8. 血管新生関連の炎症の治療用薬剤の製造における、請求項１に記載の（ｉ）単離ＦＫＢＰ−ＬポリペプチドもしくはＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドの生物活性断片またはＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドの生物活性誘導体もしくはその断片を含む活性化合物あるいは（ｉｉ）そのようなＦＫＢＰ−Ｌポリペプチド、断片または誘導体をコードするポリヌクレオチドの使用。
  9. 血管新生によって媒介される眼障害の治療用薬剤の製造における、請求項１に記載の（ｉ）単離ＦＫＢＰ−ＬポリペプチドもしくはＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドの生物活性断片またはＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドの生物活性誘導体もしくはその断片を含む活性化合物あるいは（ｉｉ）そのようなＦＫＢＰ−Ｌポリペプチド、断片または誘導体をコードするポリヌクレオチドの使用。
  10. ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドが配列番号：１０に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の使用。
  11. ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドが配列番号：１、配列番号：２または配列番号：２９に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の使用。
  12. ＦＫＢＰ−Ｌの生物活性断片が配列番号：３〜７、１０〜２８のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の使用。
  13. ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドの生物活性誘導体が配列番号：１〜２８のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列、または配列番号：１０の少なくとも１８個の連続したアミノ酸からなる配列、またはそれと少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の使用。
  14. 前記ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチド、断片または誘導体をコードするポリヌクレオチドが配列番号：３０〜３９もしくは配列番号：３０〜３９の少なくとも５４個の連続したヌクレオチドのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の使用。
  15. 血管新生によって媒介されるまたはそれと関連する障害の治療用薬剤の製造における、ＦＫＢＰ−Ｌの発現を特異的にダウンレギュレートすることができるアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡの使用。
  16. 血管新生のプロモーターとして使用するための薬剤の製造における、請求項１５に記載の、ＦＫＢＰ−Ｌの発現を特異的にダウンレギュレートすることができるアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡの使用。
  17. 創傷治癒の治療用薬剤の製造における、請求項１５に記載のＦＫＢＰ−Ｌの発現を特異的にダウンレギュレートすることができるアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡの使用。
  18. 配列番号：１０に示されるアミノ酸配列もしくはその断片または配列番号：１０と少なくとも９０％同一である配列もしくはその断片を含む、単離ポリペプチド。
  19. ポリペプチドが配列番号：１〜２８の少なくとも１つに示されるアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載のポリペプチド。
  20. ＦＫＢＰ−Ｌの生物活性断片を含み、前記ポリペプチドが配列番号：１、配列番号：２または配列番号：２９に示されるアミノ酸配列の連続する２００個以下のアミノ酸を含む、請求項１８または１９に記載のポリペプチド。
  21. ＦＫＢＰ−Ｌの生物活性断片を含む単離ポリペプチドであって、前記断片がＦＫＢＰ−Ｌからの任意の他の連続したアミノ酸配列の非存在下、配列番号：３〜７、１０〜２８の少なくとも１つに示されるアミノ酸配列からなる、単離ポリペプチド。
  22. 配列番号：３〜７または１０〜２８の少なくとも１つに示されるアミノ酸配列からなる、請求項２１に記載の単離ポリペプチド。
  23. 請求項１８から２２のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする、単離核酸分子。
  24. 配列番号：１０のペプチドまたはその断片をコードする、配列番号：３１に示されるヌクレオチド配列、または配列番号：３１の少なくともヌクレオチド１００〜１７２を含む、配列番号：３１の断片を含む、請求項２３に記載の単離核酸分子。
  25. 請求項２３または２４に記載の核酸を含む、ベクター。
  26. 発現ベクターである、請求項２５に記載のベクター。
  27. 請求項２５または２６に記載のベクターで形質移入された、宿主細胞。
  28. 請求項１８から２７のいずれか一項に記載のポリペプチドを産生する方法であって、前記ポリペプチドの発現を可能にする条件下、請求項２６に記載のベクターで形質転換された宿主細胞を培養すること、および発現されたポリペプチドを回収することを含む、方法。
  29. 薬学的に許容し得る担体と混合された、請求項２から２２のいずれか一項に記載の単離ポリペプチドを含む、組成物。
  30. 薬剤として使用するための、単離ＦＫＢＰ−ＬポリペプチドもしくはＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドの生物活性断片、またはそのようなＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドもしくは断片の生物活性誘導体。
  31. 前記ＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドまたは断片が請求項１８から２２のいずれか一項に定義されるとおりである、請求項３０に記載の使用のための単離ＦＫＢＰ−ＬポリペプチドまたはＦＫＢＰ−Ｌポリペプチドの生物活性断片。
  32. ＦＫＢＰ−Ｌの機能的等価物を含む化合物であって、機能的等価物がＣＤ４４に結合して、および／またはＣＤ７４もしくは他の受容体リガンド複合体と競合して、細胞遊走および血管新生を阻害することができる分子である、化合物。
  33. ＦＫＢＰ−Ｌの機能的等価物を含む化合物であって、機能的等価物がＣＤ４４に結合し、および／またはＭＩＦ活性化ＣＤ７４への結合を予防することができる分子である、化合物。
JP2009513764A 2006-06-09 2007-06-08 Ｆｋｂｐ−ｌおよびその使用 Expired - Fee Related JP5474535B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB0611405.2A GB0611405D0 (en) 2006-06-09 2006-06-09 FKBP-L: A novel inhibitor of angiogenesis
GB0611405.2 2006-06-09
PCT/GB2007/002107 WO2007141533A2 (en) 2006-06-09 2007-06-08 Fkbp-l and uses thereof

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2009539367A true JP2009539367A (ja) 2009-11-19
JP2009539367A5 JP2009539367A5 (ja) 2010-07-29
JP5474535B2 JP5474535B2 (ja) 2014-04-16

Family

ID=36745574

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2009513764A Expired - Fee Related JP5474535B2 (ja) 2006-06-09 2007-06-08 Ｆｋｂｐ−ｌおよびその使用

Country Status (18)

Country Link
US (3) US9381228B2 (ja)
EP (1) EP2040728B1 (ja)
JP (1) JP5474535B2 (ja)
CN (1) CN101489575B (ja)
AU (1) AU2007255196B2 (ja)
CA (1) CA2657947C (ja)
CY (1) CY1116970T1 (ja)
DK (1) DK2040728T3 (ja)
ES (1) ES2548332T3 (ja)
GB (1) GB0611405D0 (ja)
HU (1) HUE028099T2 (ja)
IL (1) IL195580A (ja)
NZ (2) NZ573425A (ja)
PL (1) PL2040728T3 (ja)
PT (1) PT2040728E (ja)
SI (1) SI2040728T1 (ja)
WO (1) WO2007141533A2 (ja)
ZA (1) ZA200810323B (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2022521529A (ja) * 2019-02-22 2022-04-08 博瑞生物医薬（蘇州）股▲分▼有限公司 Ｃｄ４４標的化マルチアームコンジュゲート

Families Citing this family (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7192713B1 (en) 1999-05-18 2007-03-20 President And Fellows Of Harvard College Stabilized compounds having secondary structure motifs
PT2332968T (pt) 2003-11-05 2016-08-17 Harvard College Péptidos alfa-helicoidais adequados para a activação ou inibição da morte celular
US7507842B2 (en) 2005-08-12 2009-03-24 Radiorx, Inc. Cyclic nitro compounds, pharmaceutical compositions thereof and uses thereof
JP5649825B2 (ja) 2007-01-31 2015-01-07 デイナ ファーバー キャンサー インスティチュート，インコーポレイテッド 安定化させたｐ５３ペプチドおよびその使用法
KR101525754B1 (ko) 2007-03-28 2015-06-09 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 스티칭된 폴리펩티드
GB0724393D0 (en) * 2007-12-14 2008-01-23 Univ Ulster Use of FKBPL gene to identify a cause of infertility
WO2010011313A2 (en) 2008-07-23 2010-01-28 President And Fellows Of Harvard College Ligation of stapled polypeptides
WO2010034032A2 (en) 2008-09-22 2010-03-25 Aileron Therapeutic, Inc. Methods for preparing purified polypeptide compositions
JP2012515172A (ja) 2009-01-14 2012-07-05 エルロン・セラピューティクス・インコーポレイテッド ペプチド模倣大環状分子
GB0908589D0 (en) * 2009-05-19 2009-06-24 Univ Belfast Assay method
JP2012532929A (ja) * 2009-07-13 2012-12-20 プレジデント アンド フェロウズ オブ ハーバード カレッジ 二機能性のステープリングされたポリペプチドおよびそれらの使用
US20130072439A1 (en) 2009-09-22 2013-03-21 Huw M. Nash Peptidomimetic macrocycles
CN108570097A (zh) 2010-08-13 2018-09-25 爱勒让治疗公司 拟肽大环化合物
WO2012040459A2 (en) 2010-09-22 2012-03-29 President And Fellows Of Harvard College Beta-catenin targeting peptides and uses thereof
US9487562B2 (en) 2011-06-17 2016-11-08 President And Fellows Of Harvard College Stabilized polypeptides as regulators of RAB GTPase function
WO2013052803A2 (en) * 2011-10-07 2013-04-11 Radiorx, Inc. Methods and compositions comprising a nitrite-reductase promoter for treatment of medical disorders and preservation of blood products
MX358886B (es) 2011-10-18 2018-08-31 Aileron Therapeutics Inc Macrociclos peptidomimeticos.
US8987414B2 (en) 2012-02-15 2015-03-24 Aileron Therapeutics, Inc. Triazole-crosslinked and thioether-crosslinked peptidomimetic macrocycles
SG11201404648PA (en) 2012-02-15 2014-09-26 Aileron Therapeutics Inc Peptidomimetic macrocycles
WO2014052647A2 (en) 2012-09-26 2014-04-03 President And Fellows Of Harvard College Proline-locked stapled peptides and uses thereof
EP2914256B1 (en) 2012-11-01 2019-07-31 Aileron Therapeutics, Inc. Disubstituted amino acids and methods of preparation and use thereof
CN110105434A (zh) 2013-03-13 2019-08-09 哈佛大学的校长及成员们 钉合且缝合的多肽及其用途
WO2014201370A1 (en) 2013-06-14 2014-12-18 President And Fellows Of Harvard College Stabilized polypeptide insulin receptor modulators
JP6759109B2 (ja) 2014-05-21 2020-09-23 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ Ｒａｓ抑制性ペプチドおよびその使用
CN112972378A (zh) 2014-09-24 2021-06-18 艾瑞朗医疗公司 拟肽大环化合物及其制剂
JP2017533889A (ja) 2014-09-24 2017-11-16 エルロン・セラピューティクス・インコーポレイテッドＡｉｌｅｒｏｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． ペプチド模倣大環状分子およびその使用
EP3294318A4 (en) 2015-03-20 2019-04-03 Aileron Therapeutics, Inc. PEPTIDOMIMETIC MACROCYCLES AND USES THEREOF
US10059741B2 (en) 2015-07-01 2018-08-28 Aileron Therapeutics, Inc. Peptidomimetic macrocycles
US10023613B2 (en) 2015-09-10 2018-07-17 Aileron Therapeutics, Inc. Peptidomimetic macrocycles as modulators of MCL-1
US10342778B1 (en) 2015-10-20 2019-07-09 Epicentrx, Inc. Treatment of brain metastases using organonitro compound combination therapy
US9987270B1 (en) 2015-10-29 2018-06-05 Epicentrix, Inc. Treatment of gliomas using organonitro compound combination therapy
KR20190040931A (ko) 2016-01-11 2019-04-19 에피센트알엑스, 인코포레이티드 2-브로모-1-(3,3-디니트로아제티딘-1-일)에타논의 정맥내 투여를 위한 조성물 및 방법
US20190381127A1 (en) 2016-02-02 2019-12-19 Splash Pharmaceuticals, Inc. Combination therapy with a6, chemotherapeutic agents, radiation therapy, or a combination thereof for the treatment of cancer
CN109475598A (zh) * 2016-06-22 2019-03-15 阿尔麦克探索有限公司 眼部疾病的治疗
EP3526195A4 (en) 2016-10-14 2020-05-20 EpicentRx, Inc. SULFOXYALKYL ORGANONITRO AND RELATED COMPOUNDS AND PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS FOR USE IN MEDICINE
US11376308B2 (en) 2016-10-19 2022-07-05 Royal College Of Surgeons In Ireland Use of FKBP-L polypeptides and nucleic acids for the treatment of obesity
CN108362870A (zh) * 2017-01-27 2018-08-03 武汉三鹰生物技术有限公司 一种用于人fkbpl蛋白的酶联免疫检测及制备方法
US11744859B2 (en) 2017-07-07 2023-09-05 Epicentrx, Inc. Compositions and methods for parenteral administration of therapeutic agents
WO2019164593A2 (en) 2018-01-08 2019-08-29 Epicentrx, Inc. Methods and compositions utilizing rrx-001 combination therapy for radioprotection
CN113702632A (zh) * 2021-09-02 2021-11-26 深圳市光与生物科技有限公司 一种快速检测子痫前期的免疫层析检测卡及其制备方法与应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003504024A (ja) * 1999-07-06 2003-02-04 インサイト・ゲノミックス・インコーポレイテッド ヒト免疫応答分子

Family Cites Families (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3194732A (en) 1960-10-03 1965-07-13 Neuhauser Irene Assisting healing of skin-denuded areas on the body with dried non-fibrous egg-shellmembrane products and compositions therefor
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4263428A (en) 1978-03-24 1981-04-21 The Regents Of The University Of California Bis-anthracycline nucleic acid function inhibitors and improved method for administering the same
AU7757581A (en) 1980-11-19 1982-05-27 United Energy Technologies Inc. Enhanced surface tubing
IE52535B1 (en) 1981-02-16 1987-12-09 Ici Plc Continuous release pharmaceutical compositions
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
DE3374837D1 (en) 1982-02-17 1988-01-21 Ciba Geigy Ag Lipids in the aqueous phase
DE3218121A1 (de) 1982-05-14 1983-11-17 Leskovar, Peter, Dr.-Ing., 8000 München Arzneimittel zur tumorbehandlung
WO1984004642A1 (en) 1983-05-09 1984-11-22 Gen Electric Co Plc Cathode ray tube display device
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
EP0143949B1 (en) 1983-11-01 1988-10-12 TERUMO KABUSHIKI KAISHA trading as TERUMO CORPORATION Pharmaceutical composition containing urokinase
JP3065628B2 (ja) * 1988-12-19 2000-07-17 三井化学株式会社 ヒト免疫グロブリン遺伝子関連ｄｎａ断片及び該ｄｎａ断片を用いる診断方法
US5766883A (en) 1989-04-29 1998-06-16 Delta Biotechnology Limited Polypeptides
FR2650598B1 (fr) 1989-08-03 1994-06-03 Rhone Poulenc Sante Derives de l'albumine a fonction therapeutique
US5073627A (en) 1989-08-22 1991-12-17 Immunex Corporation Fusion proteins comprising GM-CSF and IL-3
AU648140B2 (en) 1991-02-01 1994-04-14 Virtual Drug Development, Inc. Reverse antimicrobial peptides and antimicrobial compositions
IL99120A0 (en) 1991-08-07 1992-07-15 Yeda Res & Dev Multimers of the soluble forms of tnf receptors,their preparation and pharmaceutical compositions containing them
FR2686899B1 (fr) 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
JP3589665B2 (ja) 1992-10-23 2004-11-17 イミュネックス・コーポレーション 可溶性オリゴマー蛋白質の調製法
US5681811A (en) 1993-05-10 1997-10-28 Protein Delivery, Inc. Conjugation-stabilized therapeutic agent compositions, delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same
US5359030A (en) 1993-05-10 1994-10-25 Protein Delivery, Inc. Conjugation-stabilized polypeptide compositions, therapeutic delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same
JP3570516B2 (ja) 1993-06-29 2004-09-29 カイロン コーポレイション 増加した生物学的活性を有する短縮型ケラチノサイト増殖因子（ｋｇｆ）
ES2293137T3 (es) 1995-10-11 2008-03-16 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Combinacion de pdgf, kgf,igf e igfbp para curacion de heridas.
JP2002514079A (ja) 1997-05-01 2002-05-14 アムジエン・インコーポレーテツド キメラｏｐｇポリペプチド
US6583168B1 (en) 1997-11-25 2003-06-24 Applera Corporation Sulfonated diarylrhodamine dyes
US6180095B1 (en) 1997-12-17 2001-01-30 Enzon, Inc. Polymeric prodrugs of amino- and hydroxyl-containing bioactive agents
JP2002517998A (ja) * 1998-06-18 2002-06-25 キュラジェン コーポレイション ｐ２７（ＫＩＰ１）のＦＫＢＰ−１２との相互作用
CN1281465A (zh) * 1998-10-09 2001-01-24 上海第二医科大学 人fk506结合蛋白(fkbp)
JP4821031B2 (ja) 1999-04-13 2011-11-24 株式会社林原生物化学研究所 シアニン色素
MXPA02000128A (es) 1999-06-22 2002-06-21 Res Dev Foundation Material mejorado de heridas para mejorar curacion de heridas.
US6413507B1 (en) 1999-12-23 2002-07-02 Shearwater Corporation Hydrolytically degradable carbamate derivatives of poly (ethylene glycol)
US20030125246A9 (en) * 2000-01-31 2003-07-03 Rosen Craig A. Nucleic acids, proteins, and antibodies
NZ526708A (en) * 2000-11-28 2005-07-29 Wyeth Corp Expression analysis of FKBP nucleic acids and polypeptides useful in the diagnosis and treatment of prostate cancer
WO2002068579A2 (en) 2001-01-10 2002-09-06 Pe Corporation (Ny) Kits, such as nucleic acid arrays, comprising a majority of human exons or transcripts, for detecting expression and other uses thereof
US7235358B2 (en) * 2001-06-08 2007-06-26 Expression Diagnostics, Inc. Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection
ES2333108T3 (es) * 2001-06-22 2010-02-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Utilizacion de chaperonas fkbp como herramienta de expresion.
US6856185B2 (en) 2001-10-23 2005-02-15 Arris International, Inc. Simple RMS to DC converter
US20040053388A1 (en) * 2002-01-03 2004-03-18 Eckert Jorg H. Detection of protein conformation using a split ubiquitin reporter system
US20040047835A1 (en) * 2002-09-06 2004-03-11 Cell Therapeutics, Inc. Combinatorial drug therapy using polymer drug conjugates
AU2006259583A1 (en) * 2005-06-13 2006-12-28 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for treating and diagnosing cancer

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003504024A (ja) * 1999-07-06 2003-02-04 インサイト・ゲノミックス・インコーポレイテッド ヒト免疫応答分子

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JPN6012057635; ＣＡＮＣＥＲ　ＲＥＳＥＡＲＣＨ Ｖｏｌ．６３，　Ｎｏ．８, 2003, ｐ．１８６５-１８７０ *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2022521529A (ja) * 2019-02-22 2022-04-08 博瑞生物医薬（蘇州）股▲分▼有限公司 Ｃｄ４４標的化マルチアームコンジュゲート
JP7353378B2 (ja) 2019-02-22 2023-09-29 博瑞生物医薬（蘇州）股▲分▼有限公司 Ｃｄ４４標的化マルチアームコンジュゲート

Also Published As

Publication number Publication date
EP2040728B1 (en) 2015-09-02
CN101489575A (zh) 2009-07-22
US20090192085A1 (en) 2009-07-30
IL195580A0 (en) 2011-08-01
US9381228B2 (en) 2016-07-05
HUE028099T2 (en) 2016-11-28
NZ573425A (en) 2012-07-27
CN101489575B (zh) 2013-08-28
US20160340401A1 (en) 2016-11-24
AU2007255196B2 (en) 2013-10-03
NZ600690A (en) 2014-03-28
PT2040728E (pt) 2015-10-29
PL2040728T3 (pl) 2016-02-29
AU2007255196A1 (en) 2007-12-13
ZA200810323B (en) 2013-05-29
SI2040728T1 (sl) 2015-12-31
US20160340402A1 (en) 2016-11-24
DK2040728T3 (en) 2015-10-26
WO2007141533A3 (en) 2008-07-31
IL195580A (en) 2013-07-31
CY1116970T1 (el) 2017-04-05
US10577406B2 (en) 2020-03-03
CA2657947A1 (en) 2007-12-13
GB0611405D0 (en) 2006-07-19
CA2657947C (en) 2017-11-21
EP2040728A2 (en) 2009-04-01
ES2548332T3 (es) 2015-10-15
JP5474535B2 (ja) 2014-04-16
WO2007141533A2 (en) 2007-12-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5474535B2 (ja) Ｆｋｂｐ−ｌおよびその使用
JP6243133B2 (ja) 乳癌を治療または予防するためのアクチビンＡｃｔＲＩＩａアンタゴニストおよび使用
JP5965322B2 (ja) 抗転移療法におけるａｘｌシグナル伝達の阻害
JP2019194270A (ja) Ｔｇｆ−ベータ受容体ｉｉ型変異体およびその使用
US20160375145A1 (en) Etoposide and doxorubicin conjugates for drug delivery
US9254309B2 (en) Use of multivalent synthetic ligands of surface nucleolin for treating cancer or inflammation
EP2413968B1 (en) Semaphorin 3c (sema3c) inhibitor therapeutics, methods, and uses
KR20180064534A (ko) 조건부 활성 폴리펩티드
US20180312539A1 (en) Methods for preparing high throughput peptidomimetics, orally bioavailable drugs and compositions containing same
JP4955654B2 (ja) 癌の治療のためのｐ２１タンパク質を含んで成るコンジュゲート
US10106797B2 (en) Methods for suppressing adipocyte differentiation
US20030144236A1 (en) Novel specific inhibitor of the cyclin kinase inhibitor p21 (wafl/cip1)
US20210379147A1 (en) Method and system for treating cancer utilizing tinagl1
CA3109702A1 (en) Peptides and compositions for targeted treatment and imaging
KR102207221B1 (ko) 도펠-타겟팅 분자를 이용한 병리학적 신생혈관 생성을 억제하는 방법
KR20090042105A (ko) Ｓｉｒｔ１활성조절용 조성물
JP2024511620A (ja) がんの治療のためのｈｅｒ２／４－１ｂｂ二重特異性融合タンパク質
CN116134138A (zh) 靶向细胞内诱瘤蛋白的抗体、或其单链可变片段与癌细胞穿透肽的融合蛋白、及其用途
AU2016202059A1 (en) Activin-actriia antagonists and uses for treating or preventing breast cancer
WO2008150987A1 (en) Novel basement membrane associated fibulin fragments that function as tumor suppressors with anti-angiogenic activity

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20100607

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20100607

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20110603

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20121106

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20130205

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20130213

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20130306

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20130313

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20130327

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20130730

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20131008

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20140107

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20140205

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 5474535

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees