JP2011525181A - コレステロール流出の改良型ペプチドメディエータ - Google Patents

Abstract

本発明は、全長アポリポタンパク質(例えば、アポAIおよびアポE)に匹敵するコレステロール流出活性を有し、かつ全長アポリポタンパク質に匹敵するABAC1に対する高い選択性を有する、非天然ポリペプチドのファミリーを提供する。本発明はまた、そのようなポリペプチドを含む組成物、そのようなポリペプチドを同定、スクリーニングおよび合成する方法、ならびに脂質異常症、高コレステロール血症および炎症に関連する疾患および障害を治療、予防または診断する方法も提供する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は2008年6月18日に出願した米国仮特許出願第61/073,708号の恩典を主張し、この出願は参照により本明細書に組み入れられる。

本出願の内容は、2007年12月13日に出願したPCT出願番号PCT/US07/87477にも関連し、この開示はあらゆる目的のために全体として参照により本明細書に組み入れられる。

連邦政府支援の研究開発に基づいてなされた発明の権利に関する言明
本発明は、米国エネルギー省による助成金第DE-AC02-05CH11231号、および米国国立老化研究所による助成金(契約)第R03-AG023153号のもと、政府の支援を受けてなされたものである。政府は、本発明において一定の権利を有する。

本発明に至った研究も、Artery Therapeutics, Inc.と契約が結ばれた委託研究(LBNL Work for Other契約第LB05-001119号)により、およびカリフォルニア州のタバコ関連疾患研究プログラムによる助成金第13IT-0025号により、資金の提供を受けた。

発明の背景
心血管疾患(CVD)は、米国および世界中における罹患および死亡の主な原因である。動脈壁内のマクロファージにおいてコレステロールが蓄積すると、泡沫細胞形成およびアテローム性動脈硬化が促進され、CVDの主要な原因となる(Schmitz, G. and Kaminski, W.E., 「ATP-binding cassette (ABC) transporters in atherosclerosis,」 Curr Atheroscler Rep., 4(3):243-51 (2002)（非特許文献1）)。マクロファージにおけるコレステロール蓄積は、VLDL、IDL、およびLDLなどのアポリポタンパク質B含有リポタンパク質粒子による沈着と、アポA-IおよびアポE粒子によるコレステロール除去との間のバランスに大きく依存する。スタチンおよび他のコレステロール低下薬物療法によって血漿LDL濃度を下げることで、CVD事象の約1/3は妨げられるものの、2/3の事象はそのままである(例えば、「Randomized trial of cholesterol lowering in 4444 patients with coronary heart disease: the Scandinavian Simvastatin Survival Study (4S), Lancet, 344(8934):1383-1389 (1994)（非特許文献2）；および「Influence of pravastatin and plasma lipids on clinical events in the West of Scotland Coronary Prevention Study (WOSCOPS), Circulation, 197(15):1440-5 (1998)（非特許文献3）を参照されたい)。後者は、満たされていない大きな医学的必要性の構成要素となる。

血漿HDLコレステロールのレベルの上昇は、アテローム性動脈硬化のリスクの減少と関連している(Gordon et al., 「High Density Lipoprotein As A Protective Factor Against Coronary Heart Disease,」 Am. J. Med., 62:707-14 (1977)（非特許文献4）)。最近の疫学的研究から、HDLの保護効果がその主要なアポリポタンパク質、アポA-Iによるものだとみなすことができる(Walldius, G, et al., High Apolipoprotein B, Low Apolipoprotein A-I, And Improvement In The Prediction of Fatal Myocardial Infarction (AMORIS study): A Prospective Study,」 Lancet, 358(9298):2026-33 (2001)（非特許文献5）；およびYusuf et al., 「Effect of Potentially Modifiable Risk Factors Associated With Myocardial Infarction in 52 Countries (the INTERHEART study): Case-control Study,」 Lancet, 364(9438):937-52 (2004)（非特許文献6）)。HDLの有益な効果は、抗アテローム生成的なコレステロール逆転送(RCT)経路を媒介する際の活性に一部関連している。RCTは、糞便中にステロールを排出するための、末梢マクロファージから肝臓へのコレステロールの輸送を含む(Lewis et al., 「New Insights Into The Regulation of HDL Metabolism and Reverse Cholesterol Transport,」 Circ. Res., 96:1221-32 (2005)（非特許文献7）)。RCTの律速段階は、アポA-IおよびアポEなどの天然アポリポタンパク質によって媒介されるマクロファージからのコレステロール流出の促進を含む。このコレステロール流出の過程では、新生HDLが生成され、ATP結合カセット輸送体A1(ABCA1)を必要とし、さもなければアテローム性動脈硬化が発生する(Calpe-Berdiel et al., 「Direct Evidence In Vivo of Impaired Macrophage-Specific Reverse Cholesterol Transport in ATP -Binding Cassette Transporter A1-Deficient Mice,」 Biochim. Biophys. Acta., 1738(l-3):6-9 (2005)（非特許文献8）)。ABCA1は、血漿HDLの重篤な欠乏および早期のアテローム性動脈硬化を特徴とするタンジール病における欠損分子である(Attie et al., 「Pivotal Role of ABCAl in Reverse Cholesterol Transport Influencing HDL Levels and Susceptibility to Atherosclerosis,」 J Lipid Res., 42(11):1717-26 (2001)（非特許文献9）)。アポリポタンパク質AおよびEはまた、細胞ABCA1タンパク質をその分解を妨げることによって安定化し、高レベルの細胞コレステロール輸送およびHDL会合を確実にする。

HDLの臨床上の重要性は、治療目的でRCTを操作する戦略を開発することへの関心をかき立てた。概念研究の探索的証拠から、リン脂質複合体中の全長アポA-I変種、例えばプロアポA-I、アポA-Iミラノ、およびアポA-I 2野生型を注射すると、RCTが増加し(Eriksson et al., Stimulation of Fecal Steroid Excretion After Infusion of Recombinant Proapolipoprotein A-I. Potential Reverse Cholesterol Transport in Humans,」 Circulation, 100(6):594-8 (1999)（非特許文献10）)、冠動脈アテローム性動脈硬化が退行することが示された(Nissen et al., 「Effect of Recombinant ApoA-I Milano on Coronary Atherosclerosis in Patients with Acute Coronary Syndromes: A Randomized Controlled Trial,」 JAMA, 290(17):2292-300 (2003)（非特許文献11）；およびTardif et al., 「Effect of rHDL on Atherosclerosis-Safety and Efficacy (ERASE) Investigators,」 JAMA, 297:1675-82. Epub March 26 (2007)（非特許文献12）)。全長アポA-Iタンパク質は有望であるにもかかわらず、市販用製品へと開発しようとする場合には、治療剤としていくつかの欠点がある。例えば、アポA-Iは243アミノ酸長タンパク質であり、市販用製品に必要な量を生産するのは決して簡単ではない。加えて、ミラノ変種およびパリ変種などのアポA-I変種は、それらが外来性の性質であるために、免疫原性反応を誘発する恐れがある。

したがって、アテローム性動脈硬化性プラークを安定化するおよび退行させるための、すなわち心血管疾患を治療するための、コレステロール流出を媒介する強力なRCT経路を用いるさらなる組成物および方法が当技術分野において必要である。驚くべきことに、本発明は、そのような組成物および方法を提供することにより、この必要性および他の必要性を満たす。

Schmitz, G. and Kaminski, W.E., 「ATP-binding cassette (ABC) transporters in atherosclerosis,」 Curr Atheroscler Rep., 4(3):243-51 (2002) 「Randomized trial of cholesterol lowering in 4444 patients with coronary heart disease: the Scandinavian Simvastatin Survival Study (4S), Lancet, 344(8934):1383-1389 (1994) 「Influence of pravastatin and plasma lipids on clinical events in the West of Scotland Coronary Prevention Study (WOSCOPS), Circulation, 197(15):1440-5 (1998) Gordon et al., 「High Density Lipoprotein As A Protective Factor Against Coronary Heart Disease,」 Am. J. Med., 62:707-14 (1977) Walldius, G, et al., High Apolipoprotein B, Low Apolipoprotein A-I, And Improvement In The Prediction of Fatal Myocardial Infarction (AMORIS study): A Prospective Study,」 Lancet, 358(9298):2026-33 (2001) Yusuf et al., 「Effect of Potentially Modifiable Risk Factors Associated With Myocardial Infarction in 52 Countries (the INTERHEART study): Case-control Study,」 Lancet, 364(9438):937-52 (2004) Lewis et al., 「New Insights Into The Regulation of HDL Metabolism and Reverse Cholesterol Transport,」 Circ. Res., 96:1221-32 (2005) Calpe-Berdiel et al., 「Direct Evidence In Vivo of Impaired Macrophage-Specific Reverse Cholesterol Transport in ATP -Binding Cassette Transporter A1-Deficient Mice,」 Biochim. Biophys. Acta., 1738(l-3):6-9 (2005) Attie et al., 「Pivotal Role of ABCAl in Reverse Cholesterol Transport Influencing HDL Levels and Susceptibility to Atherosclerosis,」 J Lipid Res., 42(11):1717-26 (2001) Eriksson et al., Stimulation of Fecal Steroid Excretion After Infusion of Recombinant Proapolipoprotein A-I. Potential Reverse Cholesterol Transport in Humans,」 Circulation, 100(6):594-8 (1999) Nissen et al., 「Effect of Recombinant ApoA-I Milano on Coronary Atherosclerosis in Patients with Acute Coronary Syndromes: A Randomized Controlled Trial,」 JAMA, 290(17):2292-300 (2003) Tardif et al., 「Effect of rHDL on Atherosclerosis-Safety and Efficacy (ERASE) Investigators,」 JAMA, 297:1675-82. Epub March 26 (2007)

本発明は、脂質代謝に影響を及ぼすペプチドに関する。脂質は重要な細胞構造成分であり、プロスタグランジン、反応性酸化種等を含む、基本的な細胞シグナル伝達の原料物質を提供する。脂質は、シグナル伝達経路を介して、例えば炎症性刺激に対するサイトカイン応答の組織化にも寄与する。そのような脂質の影響は、非限定的にアテローム性動脈硬化ならびに神経疾患、炎症性疾患、および感染症の徴候を含むいくつかの疾患状態に関与している。ペプチドは、直接またはメディエータを介してその効果を発揮する。メディエータには、これらに限定されないが、HDL、ABC輸送体、ならびに酸化および炎症のメディエータが含まれる。

1つの局面において、本発明はしたがって、重量ベースで全長アポリポタンパク質(例えばアポAIおよびアポE)に匹敵する、好ましくはそれを上回るコレステロール流出活性を有し；かつ全長アポリポタンパク質に匹敵する、ABCA1に対する高い選択性を有するポリペプチドのファミリーを提供する。より詳細には、本発明は、ABCA1の高親和性機能的リガンドとして作用し、かつ1分子単位当たりで天然アポリポタンパク質に近似した能力および効力で細胞コレステロール流出を促進する非天然ポリペプチドのファミリーを提供する。本発明のポリペプチドは、インビボでマクロファージ泡沫細胞からのコレステロール流出を促進し、糞便へのステロール分泌の持続的増加を促進し、高コレステロール血症マウスにおけるアテローム性動脈硬化の重症度を軽減する。

したがって、本発明のポリペプチド、すなわちABCA1に対する強力かつ選択的な活性を有するポリペプチドを治療に使用して、ABCA1安定化およびABCA1-脂質流出活性を促進することができ、単独で、または代わりに心血管疾患を治療するための他の公知の薬理学的剤と併用して使用して、アテローム性動脈硬化を軽減することができる。加えて、本発明のポリペプチドを単独で、または代わりに急性冠症候群を治療するための他の公知の薬理学的剤と併用して使用して、プラーク脂質含量を減少させること、および不安定プラークを安定化することができる。さらに、本発明のポリペプチドを単独で、または代わりに脂質異常症、高コレステロール血症、および炎症を治療するための他の公知の薬理学的剤と併用して使用して、血漿HDL濃度を上昇させること、および/またはコレステロール逆転送を促進することができる。

本発明のペプチドは、ペプチドの薬物動態特性および薬力学的特性を共に規定するある種の特徴を含む。これらの特徴には、αヘリックス構造、およびαヘリックス構造の軸に沿ったアミノ酸の両親媒性配向が含まれる。ペプチドは、親水性軸に沿って2つの分離した酸性残基中心を含む。αヘリックス構造は、脂質-水界面における天然アミノ酸塩橋の形成によってさらに強化される。ペプチドはまた、実質的な立体特異的効果を欠いており、例えば、Lアミノ酸およびDアミノ酸を含むペプチドならびに反転型は、同等に良好に働く。ペプチドは、血漿中のHDLに選択的に結合し、細胞内のABCA1輸送体を標的化する20アミノ酸残基のコア配列を含む。

疎水性特性によって薬力学が促進され、例えば、αヘリックスの軸に沿った疎水性のくさびの角度が、ABCA1輸送体近傍の細胞膜にペプチドを位置づけ、それによって機能的相互作用が可能になる。したがって、ペプチドは、最小の非特異的な細胞膜効果でABCA1特異的脂質流出を付与するという生理的様式で、細胞膜と相互作用する。

さらなる局面において、本発明は、ヘリックス中の適切な位置、例えば10位、12位等にL、F、I、Wなどの疎水性残基を用いることにより、20アミノ酸長の小ペプチドにおいて単一ヘリックスの非極性表面積を拡大して(すなわち、疎水性区域を増大させて)、20アミノ酸コア配列を有し、かつ天然のABCA1流出促進活性を有する、すなわちプロリンを介して結合している複数の両親媒性αヘリックスを有する例えばアポAIといった天然タンパク質のコレステロール流出活性に匹敵するABCA1流出活性を達成する、小さな単一ヘリックスペプチドを提供することができるという発見に一部基づいている。さらに、いくつかの態様において、本発明は、疎水性区域が拡大された20アミノ酸長のペプチドであって、リン脂質製剤の必要性をなくすレベルでHDLに結合することができるペプチドを提供する。

1つの局面において、本発明は、以下のアミノ酸配列を含む(および特定の態様においては、該アミノ酸配列からなるか、または代わりに本質的に該アミノ酸配列からなる)単離されたポリペプチドを提供する。

式中、X₁、X₇、X₁₁、およびX₁₅は、EおよびDからなる群より独立して選択されるアミノ酸であり；X₄およびX₁₈は、E、D、およびAからなる群より独立して選択されるアミノ酸であり；X₉、X₁₀、X₁₃、X₁₆、およびX₂₀は、F、L、およびWからなる群より独立して選択されるアミノ酸であり；X₁₇はアミノ酸L、A、F、またはWであり；X₃、X₅、およびX₁₉は、RおよびKからなる群より独立して選択されるアミノ酸であり；X₁₄はアミノ酸R、A、またはEであり；かつX₂、X₆、X₈、およびX₁₂は、L、V、およびAからなる群より独立して選択されるアミノ酸であり；各文字は慣習的な1文字アミノ酸コードを表す。

本発明はまた、以下のアミノ酸配列を含む(および特定の態様においては、該アミノ酸配列からなるか、または代わりに本質的に該アミノ酸配列からなる)ポリペプチドを提供する。

式中、X₁、X₇、およびX₁₅は、EおよびDからなる群より独立して選択されるアミノ酸であり；X₄、X₁₁、およびX₁₈は、E、D、A、およびGからなる群より独立して選択されるアミノ酸であり；X₂、X₆、X₉、X₁₀、X₁₂、X₁₃、X₁₆、X₁₇、およびX₂₀は、F、L、W、I、V、およびAからなる群より独立して選択されるアミノ酸であり；X₃、X₅、およびX₁₉は、R、K、およびCからなる群より独立して選択されるアミノ酸であり；X₁₄はアミノ酸R、A、E、またはCであり；かつX₈はA、G、またはVである。本発明のそのようなペプチドのいくつかの態様において、X₂、X₆、X₉、X₁₀、X₁₂、X₁₃、X₁₆、X₁₇、およびX₂₀は、F、L、I、およびWからなる群より独立して選択される。いくつかの態様において、X₄、X₁₁、およびX₁₈は、A、D、およびEからなる群より独立して選択される。いくつかの態様において、X₄位およびX₁₁位はAである。いくつかの態様において、X₄位およびX₁₁位は、DおよびEからなる群より独立して選択される。いくつかの態様において、X₉はL、F、またはWである。いくつかの態様において、X₂位、X₆位、X₁₂位、およびX₁₇位のうちの少なくとも3つはLである。いくつかの態様において、X₁₄はRであり；かつX₁₇はLまたはFである。いくつかの態様において、X₈はAである。いくつかの態様において、X₂はLまたはVである。いくつかの態様において、X₆、X₁₀、X₁₂、X₁₃、X₁₆、X₁₇、およびX₂₀は、F、L、I、およびWからなる群より独立して選択される。いくつかの態様において、X₆、X₁₀、X₁₂、X₁₃、X₁₆、X₁₇、およびX₂₀は、FおよびLからなる群より独立して選択される。

いくつかの態様において、本発明のペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む(および特定の態様においては、該アミノ酸配列からなるか、または代わりに本質的に該アミノ酸配列からなる)。

式中、X₁、X₇、X₁₅、およびX₁₈は、DおよびEからなる群より独立して選択され；X₂はL、I、またはVであり；X₄およびX₁₁は、D、E、およびAからなる群より独立して選択され；X₃、X₅、およびX₁₉は、KおよびRからなる群より独立して選択され；X₉はW、F、またはLであり；X₁₄はR、E、またはAであり；かつX₆、X₁₀、X₁₂、X₁₃、X₁₆、X₁₇、およびX₂₀は、F、L、I、およびWからなる群より独立して選択される。いくつかの態様において、X₁₀、X₁₂、X₁₃、X₁₆、X₁₇、およびX₂₀は、FおよびLからなる群より独立して選択される。

いくつかの態様において、本発明は、以下のアミノ酸配列を含む(および特定の態様においては、該アミノ酸配列からなるか、または代わりに本質的に該アミノ酸配列からなる)ペプチドを提供する。

式中、X₁、X₇、X₁₅、およびX₁₈は、DおよびEからなる群より独立して選択され；X₅はKまたはRであり；X₉はW、L、またはFであり；かつX₁₀、X₁₂、X₁₃、X₁₆、X₁₇、およびX₂₀は、FおよびLからなる群より独立して選択される。

いくつかの態様において、本発明は、以下のアミノ酸配列を含む(および特定の態様においては、該アミノ酸配列からなるか、または代わりに本質的に該アミノ酸配列からなる)ペプチドを提供する。

式中、X₁、X₄、X₇、X₁₁、X₁₅、およびX₁₈は、DおよびEからなる群より独立して選択され；X₅はKまたはRであり；X₉はF、L、またはWであり；かつX₁₀、X₁₂、X₁₃、X₁₆、X₁₇、およびX₂₀は、FおよびLからなる群より独立して選択される。

いくつかの態様において、本発明のペプチドは以下を含む(および特定の態様においては、以下からなるか、または代わりに本質的に以下からなる)。

いくつかの態様において、本明細書に記載する本発明のペプチドはX₂₁をさらに含み、この場合X₂₁は、C、K、Y、またはLからなる群より選択される。いくつかの態様において、本発明のポリペプチドはX₂₁およびX₂₂をさらに含み、この場合X₂₁は、C、K、Y、およびLからなる群より選択され、かつX₂₂はSまたはCである。いくつかの態様において、X₂₁はKである。いくつかの態様において、X₂₂はSである。いくつかの態様において、X₂₁またはX₂₂はCである。本発明のポリペプチドは、コレステロール流出活性およびABCA1安定化活性を有する。

いくつかの態様においては、両親媒性αヘリックスの脂質-水界面において、例えばアルギニンまたはリジンといった正に荷電したアミノ酸の代用として、本発明のペプチド、例えばSEQ ID NO:2〜33からなる群より選択されるペプチドにシステインが導入される。典型的には、システイン置換を含む本発明のペプチドは、ペプチドおよび/またはヘリックスセグメント当たりシステイン1つを有する。したがっていくつかの態様において、システインは、SEQ ID NO:1の3位、5位、14位、もしくは19位に存在するか、またはSEQ ID NO:27、28、39、もしくは30の3位、5位、14位、もしくは19位において置換される。例えば、特定の態様において、例えばSEQ ID NO:2といった本発明のペプチドは、以下の置換のうちの1つを含む：R3→C、K5→C、R14→C、およびR19→C。いくつかの態様においては、SEQ ID NO:27、28、29、または30のペプチドもまた、3位、5位、14位、または19位においてシステイン置換を含んでよい。特定の態様において、本発明のペプチドは、SEQ ID NO:1におけるシステイン、またはSEQ ID NO:27、28、39、もしくは30の3位、5位、14位、もしくは19位において置換されたシステイン、および21位または22位における第2のシステイン残基を含んでよい。

いくつかの態様において、本発明のポリペプチドは、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む(および特定の態様においては、該アミノ酸配列からなるか、または代わりに本質的に該アミノ酸配列からなる)。

別の局面において、本発明は、SEQ ID NO:2〜26、31、32、または33のアミノ酸配列を有するポリペプチドのポリペプチド変種を提供する。1つの態様において、ポリペプチドは、SEQ ID NO:2〜26、31、32、および33からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも75%の同一性を有する。好ましい態様において、ポリペプチドは、SEQ ID NO:2〜26、31、32、および33からなる群より選択されるポリペプチドと、少なくとも75%の同一性、好ましくは80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有する。

本発明はまた、コレステロール流出活性を有するポリペプチドであって、実施例2の表A、表B、または表Cに記載する配列を有するポリペプチドを提供する。

いくつかの態様において、本発明のペプチドは、例えばプロリン残基を介して、コレステロール流出活性を有する別の両親媒性αヘリックスペプチドと結合している。いくつかの態様において、本発明のペプチドは本発明の第2ペプチドに結合している。本発明の第2ペプチドは同じペプチドであってもよいし、または異なるペプチドであってもよい。したがって、本発明はまた、本発明の1つまたは複数のペプチドを含む、コレステロール流出活性を有するポリペプチドを提供する。

1つの態様において、本発明のポリペプチドは保護基をさらに含む。例えば、構成アミノ酸および/または末端アミノ酸上のR基を保護基によってブロックする、すなわち保護するように、ポリペプチドを修飾することができる。特にアミノ末端および/またはカルボキシ末端のブロックは、経口送達を大きく向上させ、血清半減期を有意に延長させ得ることが見出されている。したがって、1つの態様において、本発明のポリペプチドは、アミノ末端またはカルボキシ末端に結合している保護基をさらに含む。1つの態様において、ポリペプチドは、アミノ末端に結合している第1の保護基、およびカルボキシル末端に結合している第2の保護基をさらに含む。

適切な保護基には、これらに限定されないが、アセチル(Ac)、アミド、炭素3〜20個のアルキル基、Fmoc、t-ブトキシカルボニル(Tboc)、9-フルオレンアセチル基、1-フルオレンカルボン酸基、9-フルオレンカルボン酸基、9-フルオレノン-1-カルボン酸基、ベンジルオキシカルボニル、キサンチル(Xan)、トリチル(Trt)、4-メチルトリチル(Mtt)、4-メトキシトリチル(Mmt)、4-メトキシ-2,3,6-トリメチル-ベンゼンスルホニル(Mtr)、メシチレン-2-スルホニル(Mts)、4,4-ジメトキシベンズヒドリル(Mbh)、トシル(Tos)、2,2,5,7,8-ペンタメチルクロマン-6-スルホニル(Pmc)、4-メチルベンジル(MeBzl)、4-メトキシベンジル(MeOBzl)、ベンジルオキシ(BzlO)、ベンジル(Bzl)、ベンゾイル(Bz)、3-ニトロ-2-ピリジンスルフェニル(Npys)、1-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソシクロヘキシリデン)エチル(Dde)、2,6-ジクロロベンジル(2,6-DiCl-Bzl)、2-クロロベンジルオキシカルボニル(2-Cl-Z)、2-ブロモベンジルオキシカルボニル(2-Br-Z)、ベンジルオキシメチル(Bom)、シクロヘキシルオキシ(cHxO)、t-ブトキシメチル(Bum)、t-ブトキシ(tBuO)、t-ブチル(tBu)、およびトリフルオロアセチル(TFA)が含まれる。

好ましい態様において、ポリペプチドはアミノ末端に結合している第1の保護基を含み、第1の保護基には、これらに限定されないが、アセチル、プロピオニル、および炭素3〜20個のアルキルが含まれる。好ましい態様において、第1の保護基はアセチルである。別の好ましい態様において、ポリペプチドはカルボキシル末端に結合している第2の保護基を含み、第2の保護基はアミドである。

本発明のポリペプチドは、すべて「L」アミノ酸、すべて「D」アミノ酸、または「L」アミノ酸と「D」アミノ酸の混合物を含み得る。驚くべきことに、すべてD-アミノ酸を含むポリペプチドが、L-アミノ酸ポリペプチドのように高い能力および高親和性でコレステロール流出を促進することが見出された。

本発明のポリペプチドは、コレステロール流出活性を有する。いくつかの態様において、本発明のポリペプチドはABCA1安定化活性を有する。1つの態様において、本発明のポリペプチドは、酸化剤による酸化からリン脂質を保護する(すなわち、ポリペプチドは抗酸化活性を有する)。1つの態様において、本発明のポリペプチドは、抗炎症活性を有する。好ましい態様において、本発明のポリペプチドはこれらの活性のうちの1つまたは複数を含む。さらにより好ましい態様において、本発明のポリペプチドはこれらの活性をそれぞれ含む。

本発明のペプチドは、典型的には、ヒト血漿中のHDL粒子の大多数である明確なα-HDL粒子と結合/相互作用し、アポA-Iと置き換わるようにα-HDL粒子を再構築し、それによってプレβ HDL粒子を生成することにより、ヒト血漿中でプレβ-1 HDL形成を誘導する。

さらに、本発明のペプチドは強力であり、ペプチド:アポA-I(血漿中)のモル比2:1で、より典型的にはモル比1:1で；さらにより頻繁には1:5もしくは1:10、またはそれよりも低い比率で、プレβ-1およびABCA1媒介性のコレステロール流出を誘導する。

本発明のさらなる態様は、本明細書に記載する少なくとも1つのポリペプチドおよび薬学的に許容される担体または賦形剤を含む、薬学的組成物を提供する。いくつかの態様において、薬学的組成物は、コレステロール流出に関連する疾患または障害(例えば、心血管疾患)を治療するための追加の治療剤(例えば、スタチン、例えばアトルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン、フルバスタチン、もしくはロスバスタチンなど；コレスチラミンもしくはコレスチポールなどの胆汁酸結合剤；エゼチミブなどのニーマンピックC1様1ステロール輸送体チャネル阻害剤；アスピリン、チクロピジン、もしくはクロピドグレルなどの血小板凝集阻害剤、ナイアシン/ニコチンアミド、PPAR活性化剤、ビタミンE、またはこれらの組み合わせ)を含む。

本発明の別の局面は、本明細書に開示するポリペプチドのペプチド模倣体を提供する。1つの態様において、本発明は、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、またはSEQ ID NO:30のアミノ酸配列を有するポリペプチドとして、実質的に三次元高次構造を有するペプチド模倣体を提供する。別の態様において、本発明は、SEQ ID NO:2、26、31、32および33からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドとして、実質的に三次元高次構造を有するペプチド模倣体を提供する。1つの態様において、ペプチド模倣体はレトロ-インベルソ(retro-inverso)類似体である。別の態様において、ペプチド模倣体はレトロ-エナンチオ類似体である。さらに別の態様において、ペプチド模倣体はトランス-オレフィン類似体である。本明細書に開示するように、本発明のペプチド模倣体は他の骨格修飾を含み得る。本発明のポリペプチドと同様に、本発明のペプチド模倣体も、保護基、好ましくはアミノ末端およびカルボキシル末端の両方に保護基をさらに含み得る。

別の局面において、本発明は、1つのaヘリックスセグメントを含み、コレステロール流出活性を有するペプチド、例えばSEQ ID NO:1〜33からなる群より選択されるペプチドと同じABCA1結合部位に結合する両親媒性αヘリックスペプチドを提供する。本発明は、HDLに結合する両親媒性αヘリックスペプチドをさらに提供する。さらに、本発明は、例えば単一の20アミノ酸αヘリックスペプチドエレメント、およびいくつかの態様においては21アミノ酸または22アミノ酸αヘリックスペプチドエレメントを有し、ABCA1特異的コレステロール流出を促進する、単離された両親媒性αヘリックスペプチドをさらに提供する。

さらなる局面において、本発明は、脂質と複合体化した、SEQ ID NO:1〜33からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドなどの本発明のポリペプチドまたはそのペプチド模倣体を含む、組成物を提供する。1つの態様において、脂質はリン脂質である。別の態様において、リン脂質は1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロール-3-ホスファチジルコリン(「POPC」)である。さらに別の態様において、組成物は薬学的に許容される担体をさらに含む。

本発明のさらに別の局面は、本明細書に記載する少なくとも1つのポリペプチドまたはペプチド模倣体を対象に投与することにより、哺乳動物対象(例えば、ヒトもしくはチンパンジーなどの霊長類、またはラットもしくはマウスなどのげっ歯類)におけるコレステロール流出を媒介する方法を提供する。ポリペプチド(またはペプチド模倣体)を投与する代わりに、そのようなポリペプチド(またはペプチド模倣体)をコードする核酸を対象に投与できることを、当業者は理解すると考えられる。本発明はそのような核酸を提供する。本発明のポリペプチドおよびペプチド模倣体を、それらのコレステロール流出活性に基づいて有利に使用して、脂質異常症、高コレステロール血症、および炎症に関連する疾患または状態を治療、改善、または予防することができる。

別の局面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチド、例えばSEQ ID NO:1〜33からなる群より選択される配列を有するポリペプチドを含む治療剤または診断剤を送達するための、例えば合成LDLまたはHDL粒子といった合成脂質粒子を提供する。そのような粒子を用いて、例えば癌の治療のため、または感染症の治療のための治療剤を送達することができる。

本発明のさらに別の局面は、本明細書に記載する少なくとも1つのポリペプチドまたはペプチド模倣体を対象に投与することにより、哺乳動物におけるアテローム性動脈硬化の症状を治療または予防する方法を提供する。この場合も同様に、ポリペプチド(またはペプチド模倣体)を投与する代わりに、そのようなポリペプチド(またはペプチド模倣体)をコードする核酸を対象に投与できることを、当業者は理解すると考えられる。そのような核酸は本発明によって提供される。本方法の1つの態様において、哺乳動物は、アテローム性動脈硬化の1つまたは複数の症状を有すると診断された哺乳動物である。別の態様において、哺乳動物は、アテローム性動脈硬化のリスクがあると診断される。好ましくは、哺乳動物はヒトであるが、非ヒト動物であり得る。1つの例示的な態様において、ポリペプチドは、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、もしくはSEQ ID NO:30のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:2〜26、31、32および33からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。

別の関連態様において、本方法は、少なくとも1つの追加の治療剤を投与する段階をさらに含む。そのような治療剤の例には、これらに限定されないが、抗体、酵素阻害剤、抗菌剤、抗ウイルス剤、ステロイド、非ステロイド性抗炎症剤、代謝拮抗剤、サイトカイン、または可溶性サイトカイン受容体が含まれる。酵素阻害剤は、プロテアーゼ阻害剤またはシクロオキシゲナーゼ阻害剤であってよい。追加の剤は薬学的組成物の一部として添加してもよいし、同時に、または追加の剤の生理的効果が本発明のポリペプチドもしくはペプチド模倣体の生理的効果と重複する時間内に投与してもよい。より具体的には、追加の剤は、ポリペプチドもしくはペプチド模倣体の投与と同時に、またはポリペプチドもしくはペプチド模倣体の投与の1週間前、数日前、24時間前、8時間前、または直前に投与してもよい。または、追加の剤は、ポリペプチドまたはペプチド模倣体の投与の1週間後、数日後、24時間後、8時間後、または直後に投与してもよい。

本発明のさらに別の態様は、本明細書に記載する少なくとも1つのポリペプチドまたはペプチド模倣体を哺乳動物に投与する段階を含む、不安定プラークを安定化する方法を提供する。この場合も同様に、ポリペプチドを投与する代わりに、そのようなポリペプチドをコードする核酸を対象に投与できることを、当業者は理解すると考えられる。そのような核酸は本発明によって提供される。本方法の1つの態様において、哺乳動物は、1つまたは複数の不安定プラークを有すると診断された哺乳動物である。別の態様において、哺乳動物は、不安定プラークを有するリスクがあると診断される。好ましくは、哺乳動物はヒトであるが、非ヒト動物でもあり得る。いくつかの態様において、ポリペプチドは、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、またはSEQ ID NO:30のアミノ酸配列を有する。いくつかの態様において、ペプチドは、SEQ ID NO:2〜26、31、32、および33からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。

本発明はまた、脂質異常症、高コレステロール血症、または炎症に関連する疾患または状態を治療または予防するためのキットを提供する。好ましい態様において、本発明は、本発明のポリペプチドまたはペプチド模倣体を含む容器を含む、アテローム性動脈硬化の症状を治療または予防するためのキットを提供する。キットは、薬学的に許容される担体をさらに含み得る。加えて、キットは、アテローム性動脈硬化などの、脂質異常症、高コレステロール血症、または炎症に関連する疾患または状態を治療または予防するためのポリペプチドまたはペプチド模倣体の使用を教示する使用説明資料をさらに含み得る。本発明のキット中に提供されるポリペプチドおよびペプチド模倣体は、すべてLアミノ酸、すべてDアミノ酸、またはLアミノ酸とDアミノ酸の混合物を含み得る。

上記のキットに関連して、使用説明資料は、薬学的組成物の使用に関する書面によるかまたは可聴式の使用説明を含む、書類または記録媒体を含み得る。使用説明資料には、例えば、ボトル上のラベル、箱に装入された紙面、箱またはカートン上の印刷物、これらの箇所のいずれかに示されるアドレスのウェブサイトにより提供される使用説明などが含まれる。

別の局面において、本発明は、コレステロール流出活性および/またはABCA安定化活性を有する変種ポリペプチドを作製する方法であって、(a) SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29もしくはSEQ ID NO:30のアミノ酸配列を有するか、またはSEQ ID NO:2〜26、31、32、および33からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する親ポリペプチドを提供する段階；(b) 該ポリペプチドの少なくとも1つのアミノ酸位を改変して、ポリペプチド変種を生成する段階；(c) コレステロール流出活性および/またはABCA安定化活性について該ポリペプチド変種をスクリーニングする段階；(d) 親ポリペプチドのコレステロール流出活性の少なくとも80%を有する該ポリペプチド変種を選択する、および/または親ポリペプチドのABCA安定化活性の少なくとも80%を有する該ポリペプチド変種を選択する段階；ならびに(e) 選択されたポリペプチド変種を合成する段階を含む方法を提供する。いくつかの態様において、ポリペプチドを、例えば、1つ、2つ、3つ、またはそれ以上のアミノ酸の置換、欠失、または挿入によって改変する。例えば、いくつかの態様において、コレステロール流出活性を有する20merを作製するために、22merを改変することができる。1つの態様では、アミノ酸の1つまたは複数を保存的アミノ酸で置換する。ポリペプチドは、1つまたは複数のDアミノ酸を含み得る。本方法のいくつかの態様において、改変または変種ポリペプチドはすべてDアミノ酸を含む。ポリペプチドの1つまたは複数のアミノ酸の改変に加えて、本明細書に記載するようにポリペプチドの骨格を修飾して、ペプチド模倣体を作製することもできる。

さらに別の局面において、本発明は、哺乳動物におけるコレステロール流出を媒介するための薬剤の調製における、本発明の少なくとも1つのポリペプチドまたはペプチド模倣体の使用を提供する。例示的な態様において、ポリペプチドは、SEQ ID NO:1〜33または代わりにそのペプチド模倣体からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。1つの態様において、ペプチド模倣体は、SEQ ID NO:1〜33からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドとして、実質的な三次元高次構造を有する。

さらなる局面において、本発明は、哺乳動物におけるアテローム性動脈硬化の症状を治療するための薬剤の調製における、本発明の少なくとも1つのポリペプチドまたはペプチド模倣体の使用を提供する。例示的な態様において、ポリペプチドは、SEQ ID NO:1〜33または代わりにそのペプチド模倣体からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。1つの態様において、ペプチド模倣体は、SEQ ID NO:1〜33からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドとして、実質的な三次元高次構造を有する。

なおさらなる局面において、本発明は、哺乳動物における不安定プラークを安定化するための薬剤の調製における、本発明の少なくとも1つのポリペプチドまたはペプチド模倣体の使用を提供する。例示的な態様において、ポリペプチドは、SEQ ID NO:1〜33または代わりにそのペプチド模倣体からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。1つの態様において、ペプチド模倣体は、SEQ ID NO:1〜33からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドとして、実質的な三次元高次構造を有する。

本発明の別の局面は、本発明のポリペプチドをコードする単離された核酸、該核酸を含む発現ベクター、および該発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。

本発明のポリペプチドおよびペプチド模倣体は、研究手段および/または診断手段としても有用である。例えば、そのようなペプチドを使用して、逆コレステロール欠損血漿(reverse cholesterol deficient plasma)を有する対象、および逆コレステロール治療(reverse cholesterol treatment)に対して応答する対象を同定することができる。同様に、本発明のポリペプチドを使用して、他の化合物(例えばペプチド模倣体を含む)の抗アテローム性動脈硬化の潜在能力を評価することもできる。

加えて、特に本発明のポリペプチドまたはペプチド模倣体を標識した場合には(例えば、放射性標識、蛍光標識等)、動物および動物モデルにおけるリポタンパク質-受容体相互作用を調べるために、本発明のポリペプチドまたはペプチド模倣体を使用することができる。

本発明のポリペプチドまたはペプチド模倣体を使用して、脂質代謝経路を解明するのに適した動物モデルを同定することもできる。例えば、ポリペプチドまたはペプチド模倣体を使用して、コレステロール逆転送に影響を及ぼす動物モデルならびに遺伝子および/または薬物相互作用を同定することができる。

本発明の他の特徴、目的、および利点、ならびにその好ましい態様は、以下の詳細な説明、実施例、特許請求の範囲、および図面を読むことにより明らかになると考えられる。

ペプチドN257-11のヘリックスホイールを示す。 本発明のペプチド、SEQ ID NO:2のヘリックスホイール図およびヘリックスネット図を示す。パネルAは、このペプチドの両親媒性を示すヘリックスホイール図を示す。パネルBは、極性表面の長軸下方に切断して、平板化したペプチドを示すヘリックスネット図を示す。影付きの丸は酸性アミノ酸を示し、部分的に影付きの丸はカチオン残基を示す。両パネル中の数字は、アミノ酸の一次配列を示す。 SEQ ID NO:2と全長アポA-Iのコレステロール流出活性を示すデータを提供する。パネルAは、濃度に対するコレステロール流出の依存性を示す(脂質を含まないSEQ ID NO:2ペプチド(四角)；脂質を含まないアポリポタンパク質(アポ)A-I(丸))。パネルBは、cAMPで処理したおよびcAMPなしで処理した細胞を用いて決定した、ABCA1発現に対するコレステロール流出の依存性を示す。 C末端に残基KSが付加されたSEQ ID NO:2の22mer 類似体がABCA1コレステロール流出を促進することを示すデータを提供する。 ABCA1コレステロール流出活性に悪影響を及ぼすことなく、SEQ ID NO:2中のトリプトファン(W)に対してロイシン(L)またはフェニルアラニン(F)を置換することができることを実証するデータを提供する。パネルAは、表示のペプチドによる処理に応答して培地中に出現した細胞[³H]コレステロールの割合を示す。パネルBは、ペプチドの濃度に対するコレステロール流出の依存性を示す。 活性に悪影響を及ぼすことなく、コレステロール流出ペプチドの非極性表面上のロイシンに対してバリンを置換することができることを示すデータを提供する。パネルAは、表示のペプチドによる処理に応答して培地中に出現した細胞[³H]コレステロールの割合(8時間)を示す。パネルBは、ペプチドの濃度に対するコレステロール流出の依存性を示す。 ABCA1コレステロール流出の促進が、ペプチド中の疎水性ロイシン残基の数に影響を受けることを示すデータを提供する。パネルAは、表示のペプチドによる処理に応答して培地中に出現した細胞[³H]コレステロールの割合を示す。パネルBは、ペプチドの濃度に対するコレステロール流出の依存性を示す。 ABCA1コレステロール流出活性に悪影響を及ぼすことなく、非極性表面上のロイシン残基またはロイシン残基とイソロイシン残基の組み合わせを用いて、本発明のペプチドを改変することができることを示すデータを提供する。パネルAおよびBは、表示のペプチドによる処理に応答して培地中に出現した細胞[³H]コレステロールの割合を示す。パネルCは、ペプチドの濃度に対するコレステロール流出の依存性を示す。 ABCA1コレステロール流出を促進する能力に悪影響を及ぼすことなく、非極性表面上のフェニルアラニン残基の数を増加させて、本発明のペプチドを改変することができることを示すデータを提供する。パネルAは、表示のペプチドによる処理に応答して培地中に出現した細胞[³H]コレステロールの割合を示す。パネルBは、ペプチドの濃度に対するコレステロール流出の依存性を示す。 ABCA1コレステロール流出を促進する能力に悪影響を及ぼすことなく、本発明のペプチドのロイシンおよびフェニルアラニン残基をイソロイシンで置換することができることを示すデータを提供する。パネルAは、表示のペプチドによる処理に応答して培地中に出現した細胞[³H]コレステロールの割合を示す。パネルBは、ペプチドの濃度に対するコレステロール流出の依存性を示す。 ABCA1コレステロール流出を促進する能力に悪影響を及ぼすことなく、ペプチド中の正に荷電したリジンに対して正に荷電したアルギニンを置換することができることを示すデータを提供する。パネルAは、表示のペプチドによる処理に応答して培地中に出現した細胞[³H]コレステロールの割合を示す。パネルBは、ペプチドの濃度に対するコレステロール流出の依存性を示す。 ABCA1コレステロール流出を促進する能力に悪影響を及ぼすことなく、負に荷電したグルタミン酸に対して負に荷電したアスパラギン酸を置換することができることを示すデータを提供する。パネルAは、表示のペプチドによる処理に応答して培地中に出現した細胞[³H]コレステロールの割合を示す。パネルBは、ペプチドの濃度に対するコレステロール流出の依存性を示す。 本明細書に記載のペプチドにおいてアスパラギン酸残基とグルタミン酸残基に互換性があること、およびいずれも他のアミノ酸置換と組み合わせて用いることができることを示すデータを提供する。結果は、SEQ ID NO:2ペプチドを用いて得られた対照活性に対する割合(8時間)として表す。 ABCA1コレステロール流出を促進するペプチドの能力に悪影響を及ぼすことなく、12位のロイシン(L)に対してトリプトファン(W)またはフェニルアラニン(F)を置換することができることを示すデータを提供する。パネルAおよびBは、表示のペプチドによる処理に応答して培地中に出現した細胞[³H]コレステロールの割合を示す。 ABCA1コレステロール流出を促進する能力に悪影響を及ぼすことなく、すべてDアミノ酸である、または逆配列を有する本発明のペプチドを用いることができることを示すデータを提供する。図15は、表示のペプチドによる処理に応答して培地中に出現した細胞[³H]コレステロールの割合を示す。 極性表面上のアラニン置換により、ABCA1コレステロール流出を促進する本発明のペプチドの能力が有利に増加することを示すデータを提供する。パネルAおよびBは、表示のペプチドによる処理に応答して培地中に出現した細胞[³H]コレステロールの割合を示す。パネルCは、ペプチドの濃度に対するコレステロール流出の依存性を示す。 ABCA1コレステロール流出を促進する能力に悪影響を及ぼすことなく、アルギニン14(R14)およびグルタミン酸18(E18)に対してアラニンを置換することができることを示すデータを提供する。パネルAは、表示のペプチドによる処理に応答して培地中に出現した細胞[³H]コレステロールの割合を示す。パネルBは、ペプチドの濃度に対するコレステロール流出の依存性を示す。 本発明のペプチドをリン脂質と共に製剤化して、ABCA1依存的および非依存的機構を介して高レベルの細胞コレステロール流出を支持する複合体を生成することができることを示すデータを提供する。パネルAは、ペプチド:POPC複合体の粒子サイズを実証するゲル写真を示す。パネルBは、ペプチド:POPC複合体のコレステロール流出活性を示す。 本発明のペプチドが、高脂肪の西洋式食餌を与えたアポリポタンパク質E欠損マウスにおいて確立されたアテローム性動脈硬化を軽減したことを示すデータを提供する。パネルAは、病変によって覆われた大動脈の割合として表示した、対照およびペプチドで処理したマウスにおけるアテローム性動脈硬化の程度を示す。パネルBは、オイルレッドO染色により決定した、大動脈洞プラークの脂質含量を示す。 ミエロペルオキシダーゼ(MPO)由来の酸化生成物に対する抵抗性を付与するためのアミノ酸置換の使用を示すデータを提供する。パネルAは、アクロレインと共におよびアクロレインなしでインキュベートしたSEQ ID NO:2ペプチドのコレステロール流出活性を示す。パネルBは、SEQ ID NO:12ペプチドのコレステロール流出活性を示す。 本発明のペプチドが、明確なHDL亜集団が関与する高度に特異的な機構を介して、ヒト血漿中のプレβ-1 HDL形成を誘導したことを示すデータを提供する。

本発明の例示的な配列の簡単な説明
SEQ ID NO:1は、

である。

SEQ ID NO:27は、

である。

SEQ ID NO:28は、

である。

SEQ ID NO:29は、

である。

SEQ ID NO:30は、

である。

いくつかの態様においては、SEQ ID NO. 27〜30のペプチドのいかなるものも、C、K、またはLである21位をさらに含む。いくつかの態様において、そのようなペプチドは22位をさらに含み、この場合22位はSまたはCである。いくつかの態様において、ペプチドは21位および22位を含み、この場合21位はKであり、かつ22位はSである。

発明の詳細な説明および好ましい態様
I. 序論
本発明は、とりわけ、強力なコレステロール流出活性およびABCA安定化活性を有するポリペプチドを提供する。本発明のポリペプチドは、アポA-IおよびアポEなどの天然アポリポタンパク質に匹敵するコレステロール流出活性およびABCA1安定化活性を有するが、このことは、そのようなポリペプチドが天然ではないという事実を考慮すると極めて驚くべきことである。場合によっては、本発明のポリペプチドは、抗酸化活性および/または抗炎症活性も有する。

したがって、本発明のポリペプチドは、天然アポリポタンパク質と本質的に同様の活性を有しながら、サイズが小さく、天然で見出されないアミノ酸配列を有するという点で独特である。したがって、本発明のポリペプチドは、ABCA1のインビトロおよびインビボ研究の重要な生物学的手段であり、また多くの治療適用のための重要な治療剤である。

そのようなポリペプチドの好ましい態様は、SEQ ID NO:1〜33ならびにそれらの保存的変種の配列に基づく。いくつかの態様において、本発明のポリペプチドは、アミノ酸配列 SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、またはSEQ ID NO:30を有する。いくつかの態様において、本発明のポリペプチドは、SEQ ID NO: SEQ ID NO:2〜26および31〜33のいずれか1つのアミノ酸配列を有する。本発明は、そのようなポリペプチドを含む組成物、そのようなポリペプチドを同定、スクリーニング、および合成する方法、ならびにそのようなポリペプチドを投与することにより、例えば心疾患、アテローム性動脈硬化病変、卒中、アルツハイマー病(すなわち、プラーク沈着の改善による)、および貯蔵障害などの、脂質異常症、高コレステロール血症、および炎症に関連する疾患および障害を治療、予防、または診断する方法を提供する。本発明は、脂質異常症、高コレステロール血症、および炎症、ならびに脂質貯蔵障害に関連する疾患および障害を治療、予防、または診断するためのキットをさらに提供する。

II. 定義
「ABC」または「ATP結合カセット」という用語は、細胞膜を介した輸送物質(allocrite)(例えば、コレステロール)の制御された流出および流入を担う多ドメイン膜タンパク質を指す。ABCタンパク質は、輸送物質の結合および輸送を担う2つの膜貫通ドメイン(TMD)、およびATP加水分解のエネルギーをTMDの高次構造変化と共役させることに関与している2つのヌクレオチド結合ドメイン(NBD)の4つのドメインを含む。ファミリーメンバーには、例えばABCA1およびABCA7(例えば、Dean et al., J. Lipid Res., 42:1007-1017 (2001)を参照されたい)が含まれる。ABCA1は、Denis et al., J Biol Chem., 279(40):41529-36 (2004)において特徴づけられている。ABCA1はコレステロール流出において役割を果たし、コレステロール濃縮条件に曝露された細胞において上方制御され、タンジール病における欠損分子である(Brooks-Wilson et al., Nat. Gen., 22:336-344 (1999)；Bodzioch et al., Nat. Gen., 22:347-351 (1999)；Rust et al., Nat. Gen., 22:352-355 (1999))。ABCA1は速やかに代謝回転し、アポリポタンパク質などの適切な安定剤の非存在下では半減期は約1時間である(例えば、Wang et al., J. Clin. Invest., 111:99-107 (2003)を参照されたい)。ABCA1配列は、Genbankアクセッション番号：AJ012376；NM_173076；NM_015657；NM_005502；NP_005493；O95477に示されている。ヒトABCA7遺伝子のプロモーター構造およびゲノム構成は、Broccardo et al., Cytogenet Cell Genet., 92(3-4):264-70 (2001)に記載されている。ABCA7配列は、Genbankアクセッション番号：NM_033308；NM_019112；NP_150651；NP_061985；AAK00959に示されている。関連するATP結合タンパク質のファミリーが特徴づけられている(例えば、Higgins et al., J Bioenerg Biomembr., 22(4):571-92 (1990)；Higgins et al., Bioessay, 8(4):111-6 (1988)；Higgins et al., Nature, 323(6087):448-50 (1986)；Doolittle et al., Nature, 323(6087):451-3 (1986)；およびBlight and Holland, Mol Microbiol., 4(6):873-80 (1990)を参照されたい)。このファミリーに属するタンパク質は、「A」コンセンサス配列(例えば、Walker et al., EMBO, 1(8):945-51 (1982)を参照されたい)または「Pループ」(例えば、Saraste et al., Trends Biochem Sci., 15(11):430-4 6155 (1990)を参照されたい)の1つまたは複数のコピーも含む。ABCAファミリーメンバーは、Broccardo et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1461 :395-404 (1999)に概説されている。

「両親媒性アルファヘリックス」または「両親媒性αヘリックス」という用語は、一方の表面、すなわち面に極性があって、主に親水性アミノ酸(例えば、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、およびGln)から構成され、もう一方の表面が主に疎水性アミノ酸(例えば、Leu、Ala、Val、Ile、Pro、Phe、Trp、およびMet)を含む非極性面であるらせん状の二次構造を取り得るポリペプチド配列を指す(例えば、Kaiser and Kezdy, Ann. Rev. Biophys. Biophys. Chem., 16:561 (1987)、およびScience, 223:249 (1984)を参照されたい)。

両親媒性αヘリックスの極性面は、場合によって、「負に荷電したアミノ酸の整列」または「酸性アミノ酸の整列」、すなわちポリペプチド二次構造内にほぼ均等に(例えば、ヘリックスターン約1つ、2つ、または3つごとに)位置している一連の負に荷電したアミノ酸または酸性アミノ酸(例えば、Aspおよび/またはGlu)を示す。両親媒性αヘリックスは、分子内および分子間のタンパク質間相互作用の両方において役割を果たし、両親媒性αヘリックスを含むタンパク質およびリポタンパク質(例えば、アポリポタンパク質を含む)は、脂質(例えば、HDL)輸送および代謝において役割を果たすと仮定されている(例えば、Anantharamaiah et al., Adv. Exp. Med. Biol., 285:131-40 (1991)を参照されたい)。両親媒性αヘリックスの構造および機能は、例えば、Segrest et al., Proteins, 8(2):103-17 (1990)に概説されている。両親媒性αヘリックスを同定するコンピュータによる方法は、例えば、Jones et al., J. Lipid Res., 33(2):141-66 (1992)によって記載されている。例えばアポリポタンパク質および血清アミロイドタンパク質を含む、両親媒性αヘリックスを含む複数のタンパク質が同定されている。

本発明のポリペプチドの「三次元高次構造と実質的に類似している」構造とは、一方の表面、すなわち面に極性があって主に親水性残基から構成され、もう一方の表面が主に疎水性残基を含む非極性面である、αヘリックス構造の軸に沿ったアミノ酸の両親媒性配向を有する両親媒性αヘリックス二次構造をとる、例えば24残基長のコア配列を含む構造を指す。2つの分離した酸性残基中心が、親水性軸に沿って存在する。本発明のポリペプチドの三次元高次構造と実質的に類似している構造を有するポリペプチドまたはペプチド模倣体はまた、ABCA1媒介性コレステロール流出を促進する能力を有する。

「アポリポタンパク質」または「アポ」または「交換可能なアポリポタンパク質」という用語は、脂質と組み合わさって(すなわち、脂質を可溶化して)リポタンパク質を形成し、カイロミクロン、HDL、LDL、およびVLDLの構成成分であるいくつかの水溶性タンパク質のいずれか1つを指す。アポリポタンパク質は、特定の酵素または脂質輸送タンパク質または細胞表面受容体またはATP結合カセット輸送体(例えば、ABC輸送体)に結合してそれを活性化することによって、脂質代謝にその生理的効果を及ぼす。アポリポタンパク質とABCA1との間の相互作用によって、コレステロール流出およびHDL粒子会合が生じる。アポリポタンパク質には、例えば、アポA-I、アポA-II、アポA-IV、アポC-I、アポC-II、アポC-III、アポE、および血清アミロイドAなどの血清アミロイドタンパク質が含まれる。

「アポリポタンパク質AI」またはアポA-Iという用語は、N末端およびC末端ドメインを形成する243アミノ酸を含むポリペプチドを指す(例えば、Saito et al., J. Biol. Chem., 278:23227-23232 (2003)、およびSaito et al., Prog. Lipid Res., 43:350-380 (2004)を参照されたい)。アポA-Iの三次構造は、N末端の4ヘリックス束ドメイン、および脂質と強力に結合するC末端ドメインを含む(例えば、Saito et al., Prog. Lipid Res., 43:350-380 (2004)、およびMishra et al., Biochemistry, 37:10313-10324 (1998)を参照されたい)。アポA-Iの残基44〜243は、ABCA1を介したコレステロール流出の媒介に必要な構造決定基を含む(例えば、Chroni et al., J. Biol. Chem., 278:6719-6730 (2003)、およびNatarajan et al., J. Biol. Chem., 279:24044-24052 (2004)を参照されたい)。アポA-Iのこの領域(aa44〜243)は、アポA-I遺伝子のエクソン4によって規定される、プロリン残基によって分離された11アミノ酸および22アミノ酸の一連の10個の両親媒性αヘリックスから構成される(例えば、Borhani et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 94:12291-6 (1997)を参照されたい)。アポA-Iの個々のαヘリックスセグメントは、正に荷電した残基の相対分布によって一部規定され、クラスAまたはYと命名される(例えば、Saito et al., J. Biol. Chem., 278:23227-23232 (2003)を参照されたい)。クラスAヘリックスは、脂質-水界面に正に荷電したアミノ酸を有するのに対し、クラスYヘリックスは、界面の陽イオン性残基に加えて、極性表面の中央に向かって正に荷電したアミノ酸を提示する。切断型のタンパク質(A-I Δ1-43)と共に、無傷のアポA-I分子も結晶化されている(例えば、Ajees et al. PNAS, 103:2126-2131 (2006)；Borhani et al., Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr., 55:1578-1583 (1999)、およびSegrest et al., J. Biol Chem., 274:31755-31758 (1999)を参照されたい)。アポAI配列は、例えばGenbankアクセッション番号：P02647、J0009；AAB64381；AAB22835；1613168A；1403292A；CAA25519；CAA26097；およびLPHUAlに示されている。

アポA-Iのaa 44〜243によって示される両親媒性αヘリックスはそれぞれ、理論上、リン脂質表面に結合することができる。アポA-Iのヘリックス1(aa 44〜65)および10(aa 220〜241)は、合成22mer ポリペプチドとして単離された形態で、最も高い脂質結合親和性を有する(例えば、Gillotte et al., J. Biol. Chem., 274:2021-2028 (1999)を参照されたい)。したがって、ヘリックス1および10は、細胞コレステロール流出および新生HDL会合のメディエータとして関係づけられている(Palgunachari et. al., Arteriocler. Thromb. Vasc. Biol., 16:328-338 (1996)；Panagotopulos et. al., J. Biol. Chem., 277:39477-39484 (2002)；Chroni et al., J. Biol. Chem., 278:6719-6730 (2003))。しかし、ヘリックス1および10などの、高い脂質結合活性を有するアポA-Iの個々のヘリックスは、ABCA1依存性コレステロール流出を促進することができない(例えば、Natarajan et al., J. Biol. Chem., 279:24044-24052 (2004)を参照されたい)。実際に、順番に配置して、プロリン残基で末端と末端を結合した、いくつかのアポA-I両親媒性αヘリックスの比較的長いひと続きが、生産的なABCA1相互作用、すなわちコレステロール流出およびHDL会合を媒介するのに必要である(例えば、Beckstead et al., Biochem. 44:4591-4599 (2005)；Natarajan et al., J. Biol. Chem., 279:24044-24052 (2004)；Chroni et al. J. Biol. Chem., 278:6719-6730 (2003)、およびChroni et al., Biochem. 43:2126-2139 (2004)を参照されたい)。アポA-Iヘリックス9と10を結合すると、ABCA1脂質流出を促進する活性を有する最小のエレメントが生じるが、この最小ヘリックスセットの活性は、全長アポA-Iタンパク質よりもいくらか弱い(例えば、Natarajan et al., J. Biol. Chem., 279:24044-24052 (2004)、およびVedhachalam et al. J. Biol. Chem., 279:49931-49939 (2004)を参照されたい)。

「アポリポタンパク質E」または「アポE」という用語は、動脈壁および脳における脂質ホメオスタシスにおいて重要な役割を果たす血漿タンパク質を指す(例えば、Wahrle et al., J. Biol. Chem., 279:40987-40993 (2004))を参照されたい)。アポEは、アテローム性動脈硬化病変内のマクロファージ泡沫細胞によって合成および分泌され、そこで、マクロファージ泡沫細胞表現型を逆転させることによって、細胞のコレステロールホメオスタシスを維持するように機能する(例えば、Basu et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 78:7545-7549 (1981)；Basu et al., Science, 219:871-873 (1983)；Rosenfeld et al., Arterioscler. Thromb., 13:1382-1389 (1993)；O'Brien et al., Am. J. Pathol., 144:538-548 (1994)を参照されたい)。これらの効果は、ABCA1を介して細胞コレステロール流出を促進するアポEの能力、およびコレステロール逆転送におけるその役割と関連している(Hara et al., J. Biol. Chem., 266:3080-3086 (1991)；Smith et al., J. Biol. Chem., 271:30647-30655 (1996)；Oram et al., J. Lipid Res., 37:2473-2491 (1996)；Zhang et al., J. Biol. Chem., 271:28641-28646 (1996)；Remaley et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 280:818-823 (2001)、およびMahley, Science, 240:622-630 (1988))。アポEは、ABCA1発現細胞に対する結合においてアポA-Iと競合することができ、アポEはABCA1と分子複合体を形成し得る(Krimbou et al., J. Lipid Res., 45:839-848 (2004))。脳におけるアポE/ABCA1相互作用の欠損は、細胞外アポEレベルを劇的に減少させ、細胞間脂質輸送を妨げ、その結果、神経障害の発生に寄与する(例えば、Hirsch-Reinshagen et al., J. Biol Chem., 279:41197-41207 (2004)；Wahrle et al., J. Biol. Chem., 279:40987-40993 (2004)、およびKoldamavo et al., J. Biol. Chem., 280:43224-43235 (2005)を参照されたい)。

アポEタンパク質は、N末端の4ヘリックス束ドメインおよびC末端ヘリックスから構成され、アポA-Iと類似している(Saito et al., Prog. Lipid Res., 43:350-380 (2004)；Saito et al., J. Biol. Chem., 278:23227-23232 (2003)；Ajees et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:2128-2131 (2006))。アポEのC末端ドメインは、プロリン残基によって分離された2つの長いヘリックスセグメントから構成されている(例えば、Hatters et al., Trends Biochem. Sci., 416, in press, www.sciencedirect.com(2006)；Weisgraber, Adv. Prot. Chem., 45:249-302 (1994)；Saito et al., J. Biol. Chem., 278:23227-23232 (2003)を参照されたい)。第1のセグメントは、クラスA αヘリックスを形成する51アミノ酸(残基216〜266)からなり、第2のセグメントは、クラスG αヘリックスである33アミノ酸(aa 267-299)からなる(Segrest et al., J. Lipid Res., 33:141-165)。アポE CTドメインの約79アミノ酸(残基222〜299)を含む両ヘリックスセグメントが、ABCA1脂質流出およびHDL会合を効率的に媒介するために必要である(Vedhachalam et. al., J. Biol. Chem., 279(48):49931-49939 (2004))。したがって、アポA-Iの場合と同様に、ABCA1相互作用およびABCA1細胞コレステロール流出を誘発するための性質は、順番に結合している複数のヘリックスセグメントの比較的長いひと続きに依存する(Vedhachalam et. al.、前記)。アポE配列は、Genbankアクセッション番号：NM_000041；P02649；AAH03557；AAB59397；およびAAB59518に示されている。

「コレステロール流出」および「コレステロール流出活性」という用語は、任意の細胞型からのコレステロールの流出を指す。例えば、動脈壁のマクロファージ泡沫細胞は、アポリポタンパク質および/またはHDLなどの適切なアクセプターにコレステロールを放出(すなわち、搬出)する。コレステロール流出を媒介する化合物は、細胞から細胞外培地または区画へのコレステロールの放出、すなわち移動を強化する。コレステロール流出は、多くの場合、細胞からのリン脂質の流出を伴うか、またはリン脂質の流出に先行される、すなわちリン脂質の流出に続いて起こる。コレステロールとリン脂質の両方が協調して放出されると、適切な脂質アクセプター、例えばアポリポタンパク質またはペプチドの存在下でHDLが生じる。したがって、コレステロール流出およびリン脂質流出の過程は関連しており、互いに同義である。細胞からのコレステロールの放出を強化する化合物は、細胞外に出現するコレステロールおよび/またはリン脂質の量を、該化合物の非存在下におけるコレステロール流出のレベルと比較して、少なくとも25%、50%、75%、100%、または少なくとも2倍、4倍、8倍、10倍、もしくはそれ以上増加させる。

「ABCA安定化活性」または「ABCA1安定化」という用語は、その分解を妨げることによる、ABCAタンパク質の半減期の向上および/または延長を指す。ABCA1安定化活性を有する化合物は、タンパク質分解を有意に遅延させることになる。このことは、該化合物の非存在下で検出されるABCA1タンパク質と比較して、少なくとも25%、50%、75%、100%、または少なくとも2倍、4倍、8倍、10倍、もしくはそれ以上の細胞のABCA1タンパク質レベルの増加をもたらす。

「抗炎症活性」という用語は、炎症の予防または軽減を指す。炎症は、アテローム性動脈硬化の発生において役割を果たし、脂質異常症、高コレステロール血症、および/またはリポタンパク質脂質酸化に関連していると認識されると考えられる。炎症反応は、動脈壁または脳もしくは他の血管外組織内のように局所的、および全身的であり得る。局所的な炎症および全身的な炎症はいずれも、酸化脂質および/またはサイトカインなどの炎症性メディエータの生成と関連し得る。一般に、炎症反応は、血中単球マクロファージの血管外区画への動員を伴う。単球マクロファージの動員は、マクロファージの活性化、分化、および血管外組織での維持を伴う。抗炎症活性を有する化合物は、該化合物の非存在下の場合と比較して、炎症性メディエータ(例えば、接着分子、サイトカイン、および/または酸化脂質)の減少によって測定されるように、炎症反応を減少させ、かつ/またはプラークおよび組織内のマクロファージおよび/またはマクロファージ活性化を減少させる。

「抗酸化活性」という用語は、例えば過酸化水素(H₂O₂)；次亜塩素酸イオン(-OCl)；ヒドロキシルラジカル(-OH)；およびスーパーオキシドアニオン(O_2-)を含む反応性酸素種(ROS)によって起こる酸化の予防または軽減を指す。いくつかの天然物質(例えば、タンパク質および小分子)は、抗酸化活性を有する。例えば、アポリポタンパク質は脂質の過酸化を阻害し、それによって親油性および水溶性フリーラジカル開始剤からリン脂質表面を保護することができる(例えば、Biochemistry, 41:2089-2096 (2002)を参照されたい)。加えて、α-トコフェロール(ビタミンE)は抗酸化剤である。さらに、ABC輸送体または任意の他の手段による細胞内外の、オキシステロールおよび酸化されたリン脂質などの酸化体ならびに抗酸化剤(ビタミンE)の移動を促進するタンパク質およびペプチドは、抗酸化活性を有して、動脈壁から炎症性メディエータを取り除き、および/または組織における好ましい酸化還元バランスの回復に作用するとみなされ得る。抗酸化活性を有する化合物は、該化合物の非存在下における抗酸化活性よりも、少なくとも25%、50%、75%、100%、または少なくとも2倍、4倍、8倍、10倍、もしくはそれ以上高い抗酸化活性を有する。

本明細書で使用する「プラーク安定化」とは、非限定的に泡沫細胞マクロファージからのコレステロールの除去を含む、脂質の豊富なプラークからコレステロールを除去することによる、不安定プラークの破裂または侵食のリスクからの安定化を指す。プラークは、血栓形成物質、すなわち血漿に曝露された場合に、局所的血栓症および血管閉塞のリスクを伴って、血小板凝集において非常に強力な物質、例えば組織因子などを含む。プラークの破裂およびそのような物質の曝露は、血管からプラークを分離している線維性被膜が防いでいる。脂質除去は、2つの主要な方法でプラーク安定性を付与する。第一に、解剖学的に、血管内の粥腫の縮小による脂質除去は、血行動態ストレス(心拍および血圧変化に伴う伸縮)のリスクを減少させることによってプラーク安定性を付与する。第二に、文献に記載されているように、コレステロール蓄積は、線維性被膜に溶解作用を及ぼすマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)を含むプロテアーゼの合成および分泌、ならびに組織因子、強力な凝固因子の産生を促進している。

本明細書で使用する「コレステロール逆転送(RCT)」とは、動脈壁のマクロファージ泡沫細胞および脂質の豊富なプラークからコレステロールを除去し、続いて血漿を介して肝臓に運んで、これを取り込み、処理し、糞便中の中性ステロール(コレステロール)または酸性ステロール(ヒドロキシル化コレステロール/胆汁)として排出する過程を指す。コレステロールはより脆弱な他の隣接細胞に移行し得るものの、マクロファージ泡沫細胞からのコレステロールの流出は、それ自体がRCT利点の要件である。しかし、排出のためにHDL様粒子によって肝臓へ輸送することにより、そのようなコレステロールをさらに廃棄することが、処理の有益な局面である。そのような完全なRCTは、動脈内のコレステロール含量の正味除去によって、動脈樹の全般的な若返りを提供する。RCTおよびプラーク安定化効果は、ペプチド、もしくはペプチドが血漿および細胞中のリン脂質と自然に形成する複合体によって直接付与されるか、または代わりにペプチドが内因性HDL粒子に結合し、それによって自身の特性を変更し、RCTを促進するのにより効率的となったアポA-I/HDLによって付与される。

本発明との関連における「プレβ形成」という用語は、プレβ-HDL粒子の形成を指す。プレβ-HDLとは、アポA-I分子、典型的には2〜3個のアポA-I分子、および少量のリン脂質を含む、脂質の乏しい粒子である。プレβ-HDL粒子は、細胞のコレステロール流出の初期アクセプターとして作用する、および/またはABCA1コレステロール流出を媒介する。

「脂質異常症」に関連する疾患または障害とは、組織(すなわち、血液)脂質およびリポタンパク質濃度の変化ならびに/またはコレステロール流出の異常な媒介もしくは異常なABCA安定化に起因する、脂質代謝が脱制御される任意の疾患または障害である。そのような疾患には、例えば、心疾患、アテローム性動脈硬化病変、卒中、アルツハイマー病、および貯蔵障害が含まれる。

「アミノ酸」という用語は、天然および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様の様式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。天然アミノ酸とは遺伝暗号によってコードされるアミノ酸であり、また例えばヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタミン酸、およびO-ホスホセリンといった、後に修飾されるアミノ酸である。アミノ酸類似体とは、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムといった、天然アミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち水素、カルボキシル基、アミノ基、およびR基に結合しているα炭素を有する化合物を指す。そのような類似体は、修飾されたR基(例えば、ノルロイシン)または修飾されたポリペプチド骨格を有するが、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。アミノ酸模倣体とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然アミノ酸と同様の様式で機能する化合物を指す。アミノ酸および保存的アミノ酸置換のより詳細な説明は、以下の「ポリペプチド」という表題の項に提供する。

アミノ酸は、本明細書において、IUPAC-IUB生化学命名委員会の推奨する一般に知られている3文字記号または1文字記号で参照することができる。ヌクレオチドも同様に、一般に是認されている1文字コードで参照することができる。

「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は本明細書で互換的に用いられ、アミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、天然アミノ酸ポリマーおよび非天然アミノ酸ポリマーばかりでなく、1つまたは複数のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工的な化学模倣体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。アミノ酸ポリマーは、全体にL-アミノ酸を含んでもよく、全体にD-アミノ酸を含んでもよく、またはLアミノ酸とDアミノ酸の混合物を含んでもよい。本明細書における「ペプチドまたはペプチド模倣体」という用語の使用は、天然アミノ酸および改変アミノ酸を含むペプチドを意図することを単に強調するにすぎない。

「単離された」、「精製された」、または「生物学的に純粋な」という用語は、その天然状態において見出される、通常それに付随する成分を実質的にまたは本質的に含まない物質を指す。純度および均一性は典型的に、ポリアクリルアミド電気泳動または高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学技法により決定される。調製物中に存在する主な種であるタンパク質は、実質的に精製されている。「精製された」という用語は、核酸またはタンパク質が、電気泳動ゲルで本質的に1本のバンドを生じることを表す。特に、これは、核酸またはタンパク質が少なくとも85%純粋、より好ましくは少なくとも95%純粋、最も好ましくは少なくとも99%純粋であることを意味する。

2つまたはそれ以上のポリペプチド配列(または2つもしくはそれ以上の核酸)との関連における「同一の」またはパーセント「同一性」という用語は、以下の配列比較アルゴリズムの1つを用いるかまたは手動のアライメントおよび目視検査により測定して、比較領域または指定領域にわたって最大限の一致を得るために比較およびアライメントした場合に、特定の領域(SEQ ID NO:2〜26、31、32または33のアミノ酸配列など）または長さが21アミノ酸または22アミノ酸であるそれらの配列の最初の20アミノ酸にわたって同一であるか、または特定の割合のアミノ酸残基もしくはヌクレオチドが同一である、例えば60%同一性、好ましくは65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一性である、2つまたはそれ以上の配列またはサブ配列を指す。よってそのような配列は「実質的に同一である」と称される。この定義はまた、試験配列の相補体を指す。

配列比較では、典型的に1つの配列が、試験配列を比較する参照配列となる。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じて部分サブ配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。初期設定プログラムパラメータを使用することもできるし、または別のパラメータを指定することもできる。次に、配列比較アルゴリズムにより、プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性が計算される。核酸およびタンパク質の配列比較には、BLASTおよびBLAST 2.0アルゴリズム、ならびに以下に考察する初期設定パラメータが用いられる。

「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は本明細書で互換的に用いられ、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、および一本鎖または二本鎖形態のそれらのポリマーを指す。この用語は、合成、天然、および非天然であり、参照核酸と類似の結合特性を有し、かつ参照ヌクレオチドと同様の様式で代謝される、公知のヌクレオチド類似体または修飾骨格残基もしくは結合を含む核酸を包含する。そのような類似体の例には、非限定的に、ホスホロチオエート、ホスホロアミダート、メチルホスホン酸、キラル-メチルホスホン酸、2-O-メチルリボヌクレオチド、ポリペプチド核酸(PNA)が含まれる。特記しない限り、特定の核酸配列は、明確に示した配列ばかりでなく、その保存的に改変された変種(例えば、縮重コドン置換物)および相補的配列も包含する。具体的には、縮重コドン置換物は、1つまたは複数の選択された(またはすべての)コドンの3番目の位置を混合塩基および/またはデオキシイノシン残基で置換した配列を作製することによって得てもよい(Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991)；Ohtsuka et al., J. Biol. Chem., 260:2605-2608 (1985)；Rossolini et al., Mol. Cell. Probes, 8:91-98 (1994))。核酸という用語は、遺伝子、cDNA、mRNA、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換的に用いられる。

「発現ベクター」とは、宿主細胞において特定の核酸の転写を可能にする一連の特定の核酸エレメントを伴う、組換えまたは合成により作製された核酸構築物である。発現ベクターは、プラスミド、ウイルス、または核酸断片の一部であってよい。典型的に、発現ベクターは、プロモーターに機能的に連結された転写されるべき核酸を含む。

「宿主細胞」とは、発現ベクターを含み、該発現ベクターの複製または発現を支持する細胞を意味する。宿主細胞は、大腸菌(E. coli)などの原核細胞、または酵母、昆虫、両生類、もしくはCHO、HeLa等のような哺乳動物細胞などの真核細胞であってよく、例えば培養細胞、移植片、およびインビボ細胞であってよい。

「標識」または「検出可能な標識」とは、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、または化学的手段により検出可能な組成物である。例えば、有用な標識には、放射性同位体(例えば、³H、³⁵S、³²P、⁵¹Cr、もしくは¹²⁵I)、蛍光色素、電子密度試薬、酵素(例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、もしくはELISAで一般的に使用される他のもの)、ビオチン、ジゴキシゲニン、または抗血清もしくはモノクローナル抗体が入手可能なハプテンおよびタンパク質が含まれる(例えば、SEQ ID NO: 1、2、または3によってコードされるポリペプチドを、例えば該ポリペプチドに放射標識を組み入れることによって検出可能にし、これを用いて、該ポリペプチドと特異的に反応する抗体を検出することができる)。

本明細書で使用する「改善する」とは、症状の程度を緩和する、軽減する、もしくは低下させるか、または疾患徴候のエピソードの発現回数を減らすことを意味する。

「予防すること」という用語は当技術分野で認識されており、高コレステロール血症またはアテローム性動脈硬化などの疾患の再発または発症といった状態に関連して使用する場合、当技術分野において十分に理解されており、組成物の投与を受けていない対象と比較して、対象における医学的状態の症状の、出現率を減少させるか、または発症を遅延させる組成物の投与を含む。

本明細書で使用する「治療すること」とは、障害または疾患の進行を遅延させる、停止させる、または逆転させることを意味する。好ましい態様において、「治療すること」とは、障害または疾患が消滅する程度まで進行を逆転させることを意味する。

本明細書で使用する「阻害する」とは、対照試料で生じる量と比較して、量が減少することを意味する。好ましい態様において、阻害するとは、量が50%より多く、さらにより好ましくは75%より多く、またはさらには100%減少することを意味する。

本明細書に開示する方法によって治療する「対象」、「患者」、または「哺乳動物」は、ヒトまたは非ヒト動物のいずれかを意味し得る。

III. ポリペプチド
本発明は、強力なコレステロール逆転送(RCT)経路を用いてコレステロール流出を媒介する、非天然ポリペプチドのファミリーを提供する。本発明のポリペプチドは、ABCA1依存性コレステロール流出の強力かつ選択的なメディエータであることに加えて、ABCA安定化活性、抗酸化活性、および抗炎症活性、これらの活性の任意の組み合わせ、ならびに好ましくはこれらの活性のすべてもまた有する。

本発明のペプチドは、コレステロール流出に影響を及ぼすコアアミノ酸配列であるSEQ ID NO:1の驚くべき発見に基づく。本発明のポリペプチドは、アポリポタンパク質(例えば、アポA-I、アポE等)と同様のモル強度でABCA1依存性コレステロール流出を促進する非天然ポリペプチド、例えばSEQ ID NO:2〜26および31〜33である。興味深いことに、本発明のポリペプチドファミリーメンバーはサイズが小さく、無傷のアポリポタンパク質、およびABCA1を介してコレステロール流出活性を発揮するために必要な天然で見出される複数のαヘリックスセグメントの長いひと続きの完全な生物活性および効力を獲得する単一のヘリックスセグメントに相当する。

両親媒性αヘリックスペプチドに関しては、疎水性アミノ酸がヘリックスの片側に集中しており、通常は反対側に極性または親水性アミノ酸が集中している。この配置はアポリポタンパク質および球状タンパク質のアルファヘリックスで共通しており、ヘリックスの片面が疎水性コア方向に配向し、もう一方の面が水に曝露されている表面方向に配向している。アミノ酸配列が異なれば、αヘリックス構造を形成する傾向も異なる。メチオニン、アラニン、ロイシン、グルタミン酸、およびリジンはいずれもヘリックスを形成する傾向が特に高く、一方、プロリン、グリシン、チロシン、およびセリンはヘリックスを形成する傾向が比較的低い。

1つの態様において、本発明は、SEQ ID NO:1のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド(およびそのようなペプチドを含む組成物)を提供する。いくつかの態様において、本発明は、以下のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供する。

式中、X₁、X₇、X₁₅、およびX₁₈は、DおよびEからなる群より独立して選択され；X₂はL、I、またはVであり；X₄およびX₁₁は、D、E、およびAからなる群より独立して選択され；X₃、X₅、およびX₁₉は、KおよびRからなる群より独立して選択され；X₉はW、F、またはLであり；X₁₄はR、E、またはAであり；かつX₆、X₁₀、X₁₂、X₁₃、X₁₆、X₁₇、およびX₂₀は、F、L、I、およびWからなる群より独立して選択される。

1つの態様において、単離されたポリペプチドは、SEQ ID NO. 1〜33からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む(および特定の態様においては、該アミノ酸配列からなるか、または代わりに本質的に該アミノ酸配列からなる)。

いくつかの態様において、本発明のペプチドは、SEQ ID NO:2、または以下の置換の1つもしくは複数を有するその変種に記載されるアミノ酸配列を有するペプチドを含む：9位のWに対して置換されたLまたはF；非極性表面上のLに対するV置換、例えば2位のLに対するV置換；10位、13位、16位、および/または20位の非極性表面上のF残基に対するLまたはI置換；2位、6位、12位、および/または17位のL残基に対するFまたはI置換；例えば5位のKに対するR置換；SEQ ID NO:2中の1つまたは複数のグルタミン酸残基に対するアスパラギン酸置換；12位のLに対するW置換；極性表面上のA置換、例えば14位のR、4位のE、11位のE、および/または18位のEに対するA置換。いくつかの態様において、SEQ ID NO:2またはその変種は、C末端に付加された残基KSをさらに含んでよい。したがっていくつかの態様において、SEQ ID NO:2の変種は、非極性表面上ではなく、極性表面上にA残基を有する。いくつかの態様においては、脂質-水界面に、またはその近傍に位置する12位、17位、および21位に高度に疎水性のLまたはFを含めることにより非極性表面を増大させて、疎水性表面を最大にすることができる。

前述のポリペプチドが本発明のポリペプチドのファミリーを完全に含まないことが、当業者によって容易に理解されると考えられる。実際に、本明細書に提供する教示を使用して、他の適切なポリペプチド(例えば、保存的変種)を、例えば保存的または半保存的置換(例えば、DのEによる置換)、伸長、欠失等によって日常的に生成することができる。加えて、本明細書に提供するアッセイ法を使用して、他の適切なポリペプチドを、所望の生物活性について日常的にスクリーニングすることができる。

したがって、別の態様において、本発明は、SEQ ID NO:2〜26および31〜33のポリペプチドのポリペプチド変種を提供する。1つの例示的な態様において、ポリペプチドは、SEQ ID NO:2〜26、31、32および33からなる群より選択されるポリペプチドのポリペプチドと少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも98%の同一性を有する。当業者によって理解される通り、同一でないアミノ酸残基は、天然であっても非天然であってもよい。「同一率」という用語は、2つのアミノ酸配列間(または、同様に本発明によって提供される2つのヌクレオチド配列間)の配列同一性を指す。同一性は、比較のためにアライメントされ得る各配列中の位置を比較することによって決定することが可能である。比較する配列内の対応する位置が同じアミノ酸または塩基によって占有されている場合、それらの分子はその位置で同一であり；対応する部位が同じまたは類似のアミノ酸残基(例えば、立体的および/または電気的性質が類似している)によって占有されている場合、それらの分子はその位置で相同である(類似している)と称され得る。相同性、すなわち類似性、または同一性の割合としての表示は、比較する配列によって共有される位置での類似のまたは同一なアミノ酸の数の関数を指す。例えばFASTA、BLAST、およびENTREZを含む、様々なアライメントアルゴリズムおよび/またはプログラムを用いることができる。FASTAおよびBLASTは、GCG配列解析パッケージ(ウィスコンシン大学、ウィスコンシン州、マディソン)の一部として利用可能であり、例えば初期設定で用いることができる。ENTREZは、米国国立衛生研究所、米国国立医学図書館、国立バイオテクノロジー情報センター、メリーランド州、ベテスダを通じて利用可能である。1つの態様において、2つの配列の同一性パーセントは、例えば、2つの配列間の単一のアミノ酸またはヌクレオチドミスマッチであるように、各アミノ酸ギャップに荷重するといったギャップ荷重1を用いて、GCGプログラムによって決定することが可能である。

上記の態様と重複し得る別の態様では、SEQ ID NO:2〜26および31〜33のポリペプチドを、保存的(または半保存的)アミノ酸残基で置換する。「保存的アミノ酸置換」という用語は、1つのそのような群由来のアミノ酸を、同じ群由来の異なるアミノ酸により置換すること(概念的に、またはそれ以外で)を指す。個々のアミノ酸間の共通した特徴を規定する機能的な方法は、相同生物の対応するタンパク質間のアミノ酸変化の正規化された頻度を解析することである(例えば、Schulz, G. E. and R. H. Schirmer, Principles of Protein Structure, Springer-Verlagを参照されたい)。このような解析に従って、群内のアミノ酸が互いに優先的に交換され、よって全体的なタンパク質構造に及ぼす影響が互いに最も似ているアミノ酸の群を規定することができる(例えば、Schulz, G. E. and R. H. Schirmer, Principles of Protein Structure, Springer-Verlagを参照されたい)。この様式で規定される一連のアミノ酸群の一例には、(i) GluおよびAsp、Lys、Arg、およびHisからなる荷電した群；(ii) Lys、Arg、およびHisからなる正に荷電した群；(iii) GluおよびAspからなる負に荷電した群；(iv） Phe、Tyr、およびTrpからなる芳香族群；(v) HisおよびTrpからなる窒素環群；(vi） Val、Leu、および Ileからなる大型の脂肪族非極性群；(vii） MetおよびCysからなるわずかに極性のある群；(viii) Ser、Thr、Asp、Asn、Gly、Ala、Glu、Gln、およびProからなる小型の残基群；(ix） Val、Leu、Ile、Met、およびCysからなる脂肪族群；ならびに(x) SerおよびThrからなる小型のヒドロキシル群が含まれる。

同様に上記の態様と重複し得る別の例示的な態様において、「保存的アミノ酸置換」とは、分子量が類似しているかまたは疎水性が類似している別のアミノ酸に対するアミノ酸の置換を指し得る。「類似の分子量」および「類似の疎水性」とは、各値の25%、より好ましくは20%、15%、10%、または10%未満以内である値を意味する。アミノ酸の分子量および疎水性に関するデータを表1に示す。疎水性順位を表2に示し、保存的置換は、「＝」と示される1つのアミノ酸をもう一方のアミノ酸に交換すること(例えば、Tyr＝Trp)、ならびに1つのアミノ酸を、大なり記号および小なり記号によって示される場合の順位の順番においてそれに隣接している別のアミノ酸に交換することを含む。

（表１）

^†表示の分子量は、中性の遊離アミノ酸のものであり；残基重量は、水1等量(18 g/mol)を差し引くことによって得ることができる。
^‡表示の疎水性は、「小断片アプローチ」によるコンピュータlog(P)判定による「調整」値である(「Development of Hydrophobicity Parameters to Analyze Proteins Which Bear Post- or Cotranslational Modifications」 Black, S.D. and Mould, D.R., Anal. Biochem., 193:72-82 (1991)を参照されたい)。生log(P)値を、表示の調整値に調整するために使用した式は以下の通りである：調整パラメータ＝(生パラメータ＋2.061)/4.484。

（表２）

アスパラギン酸およびグルタミン酸は酸性であり、生理的pHにおいて負電荷を提供し；ヒスチジン、アルギニン、およびリジンは塩基性であり、生理的pHにおいて正電荷を提供する。

2つのポリペプチドが互いの保存的変種であることの別の指標は、2つのポリペプチドが、同じ機能、好ましい態様では同じまたはよく似たレベルの活性で同じ機能を実行することである。したがって、いくつかの態様において、本発明のポリペプチドの保存的変種は、SEQ ID NO:1、27、28、29または30のポリペプチドに見出される活性の、またはより詳細にはSEQ ID NO:2〜26および31〜33からなる群より選択されるのポリペプチドに見出される活性に対して、少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の活性を含む。再度繰り返すが、いくつかの態様において、本発明のポリペプチドは複数の活性を有する。例えば、本発明のポリペプチドは、コレステロール流出媒介活性、ABCA安定化活性、抗炎症活性、および抗酸化活性、これらの活性の任意の組み合わせ、または理想的にはこれらの活性のすべてを含み得る。保存的変種は、同じ活性を1つまたは複数、理想的には同じ活性をすべて有し得る。当業者は本明細書に記載するスクリーニングアッセイ法を容易に用いて、2つまたはそれ以上のポリペプチドが同様の活性を有するかどうかを決定することができる。加えて、当業者は、2つまたはそれ以上のポリペプチドが同様の生物学的特性または生物活性を有するかどうかを決定するために使用できる他のスクリーニングアッセイ法を知っていると考えられる。

一方、好ましい態様では、本発明のポリペプチドは天然アミノ酸または天然アミノ酸のD型を使用するが、本発明のポリペプチドに非天然アミノ酸(例えば、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム、ノルロイシン、ε-アミノカプロン酸、4-アミノブタン酸、テトラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸、8-アミノカプリル酸、4-アミノ酪酸、Lys(N(ε)-トリフルオロアセチル)、α-アミノイソ酪酸等)による置換を用いることもできる。他のアミノ酸置換と同様に、非天然アミノ酸は典型的に、置換に際して、非天然アミノ酸が置換する残基の空間特性およびイオンまたは非イオン特性を保持するように置換される。

当業者は、ポリペプチドの活性に影響を及ぼすことなく、本発明のポリペプチドのC末端および/またはN末端にアミノ酸残基を付加できることを理解する。したがって、本明細書に記載するヘリックス配列を含む本発明のポリペプチド(例えば、SEQ ID NO:1〜33のポリペプチド)は、20、21、または22アミノ酸長を超える態様、例えば23、24、25、26、27、30、35、または40アミノ酸長であるペプチドを含む。当業者はまた、本発明のポリペプチドを、1つの態様において本発明のポリペプチドを、例えばプロリンまたは他のリンカー残基を介して、コレステロール流出を促進し得る別の両親媒性αヘリックスペプチドに連結して、例えば40、50、60、70、80、90、または100アミノ酸長といった、二ヘリックス（bi-helix）または多量体ポリペプチドが形成されることを理解する。したがって、SEQ ID NO. 1〜33のいずれの配列も、アミノ酸付加を有してよく、または結合させることができる。例えば、本発明のポリペプチドの1つの分子、例えばSEQ ID NO: 2〜26または31〜33を、プロリン残基を介して該ポリペプチドの別の分子に結合させて、少なくとも41アミノ酸長であるポリペプチドを提供することができる。同様に、2つの20mer、2つの21mer、2つの22mer、20merと22mer、21merと20mer、または21merと22merを、例えばプロリンを用いて結合させて、それによって41〜45残基長であるポリペプチドを得ることができる。そのような二ヘリックスまたは多量体ペプチドは、該二ヘリックスまたは多量体ペプチドに含まれる本発明の単一ヘリックスペプチドの活性と同等であるか、または好ましくはその活性を上回る活性を有する。さらに、そのような二ヘリックスまたは多量体ポリペプチドは、天然の全長アポリポタンパク質(例えば、アポAIおよびアポE)のコレステロール流出活性、またはアポリポタンパク質のコレステロール流出媒介ドメインのコレステロール流出活性を上回るコレステロール流出活性を有し得る。当業者は、本明細書に記載する方法論を用いて、C末端および/またはN末端に付加的なアミノ酸を容易に付加して、得られたポリペプチドを所望の活性についてスクリーニングすることができる。

いくつかの態様においては、ヘリックスの極性/非極性界面においてチオール保有アミノ酸(例えば、Cys)を代用または挿入することにより、本明細書に記載のヘリックスペプチドを改変してもよい。

特に好ましい態様において、本発明のポリペプチドは、本明細書に記載する通り1つまたは複数のD-アミノ酸を含む。特定の態様では、すべてのアミノ酸(例えば、すべての鏡像異性アミノ酸)がD-アミノ酸である。すべてD-アミノ酸を含むポリペプチドが、L-アミノ酸ポリペプチドのように、高い能力および高親和性でコレステロール流出を促進することが見出された。D-アミノ酸は、化学合成においてD型誘導体化アミノ酸残基を使用することにより、ポリペプチド内の1つまたは複数の位置に容易に取り込まれる。固相ポリペプチド合成用のD型残基は、いくつかの供給元から市販されている(例えば、Advanced Chem Tech、ケンタッキー州、ルイビル；Nova Biochem、カリフォルニア州、サンディエゴ；Sigma、ミズーリ州、セントルイス；Bachem California Inc.、カリフォルニア州、トランス等を参照されたい)。D型アミノ酸は、必要に応じてポリペプチド内の任意の位置に取り込ませることが可能である。したがって、例えば、1つの態様において、ポリペプチドは単一のD-アミノ酸を含んでよく、他の態様では、ポリペプチドは少なくとも2つ、一般的には少なくとも3つ、より一般的には少なくとも4つ、最も一般的には少なくとも5つ、好ましくは少なくとも6つ、より好ましくは少なくとも7つ、かつ最も好ましくは少なくとも8つのDアミノ酸を含む。1つの態様では、本質的に1つおきの(鏡像異性)アミノ酸がD型アミノ酸である。特定の態様では、鏡像異性アミノ酸の少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%がD型アミノ酸である。1つの特に好ましい態様では、本質的にすべての鏡像異性アミノ酸がD型アミノ酸である。

さらに別の態様では、本発明のポリペプチドのペプチド模倣体を提供する。「ペプチド模倣体」には、リン酸化、キャッピング、脂肪酸修飾、ならびに非天然の骨格構造および/または側鎖構造の含有を含む、アミノ酸鎖の任意の修飾型が含まれるが、これらに限定されない。ペプチド模倣体が、アミノ酸鎖と非ペプチド小分子との構造連続体を含むことは、当業者に容易に明白であると考えられる。ペプチド模倣体は一般に、認識可能なポリペプチド様ポリマー単位構造を保持する。したがって、ペプチド模倣体は典型的に、天然ポリペプチドが結合する任意の標的分子に結合する機能を保持する。適切なペプチド模倣体の例は、米国特許出願公開第2006/0069030号に開示されており、その教示はあらゆる目的のために参照により組み入れられる。他のペプチド模倣体およびペプチド模倣体を作製する方法は、当業者に公知であると考えられる。

好ましい態様において、本発明のペプチド模倣体は、2つのカテゴリー：(i) 代用物；および(ii)類似体のうちの1つに分類される。ポリペプチドのアミド結合用に、多くの代用物が開発されてきた。頻繁に利用されるアミド結合用の代用物には、以下の群が含まれるがこれらに限定されない：(i) トランス-オレフィン、(ii) フルオロアルケン、(iii) メチレンアミノ、(iv) ホスホンアミド、および(v) スルホンアミド。そのような代用物の例は、米国特許出願公開第2006/0069030号に開示されている。さらに、ポリペプチドの骨格のより実質的な修飾に基づくペプチド模倣体も使用することができる。このカテゴリーに分類されるペプチド模倣体には、(i) レトロ-インベルソ類似体、および(ii) N-アルキルグリシン類似体(いわゆるペプトイド)が含まれる。同様に、そのような類似体の例も、米国特許出願公開第2006/0069030号に開示されている。

本発明の1つの態様において、ペプチドまたはペプチド模倣体はレトロ-インベルソ類似体である。レトロ-インベルソ類似体は、L-アミノ酸に基づくポリペプチドの合成と同様の様式で、当技術分野で公知の方法に従って作製することが可能である。より具体的には、そのようなレトロ-インベルソ類似体の調製に適した方法の例は、Sisto et al.に発行された米国特許第4,522,752号に記載されている。HPLCまたは当業者に公知の任意の他の適切なクロマトグラフィー法によって、最終生成物またはその中間体を精製することができる。

別の態様において、ペプチドまたはペプチド模倣体はレトロ-エナンチオ類似体である。レトロ-エナンチオ類似体は、標準的な固相または液相ポリペプチド合成技法を用いて、市販のD-アミノ酸(またはその類似体)から合成することが可能である。

さらに別の態様において、ペプチド模倣体はトランス-オレフィン類似体または誘導体である。ポリペプチドのそのようなトランス-オレフィン類似体は、Shue et al., Tetrahedron Lett., 28:3225 (1987)の方法に従って、容易に合成することが可能である。加えて、当技術分野で公知の他の方法も使用することができる。トランス-オレフィン誘導体の合成に使用する試薬の性質に応じて、Sjue et al.,の手順または利用できる他の手順において変動が必要になる場合もあることが理解されると考えられる。

上記の方法によって合成した偽ジペプチドを他の偽ジペプチドに結合させて、アミド官能性の代わりにいくつかのオレフィン官能性を有する偽ペプチドを作製することも可能である。例えば、標準的な技法により、特定のジペプチド配列に相当する偽ジペプチドを作製し、次いで共に結合させて、残基間に交互にオレフィン結合を有するポリペプチドの類似体を得ることができる。

ペプチド模倣体誘導体のさらに別のクラスには、ホスホン酸誘導体が含まれる。そのようなホスホン酸誘導体の合成には、公知の合成図式を適応させることが可能である(例えば、Loots et al. in 「Peptides: Chemistry and Biology,」(Escom Science Publishers, Leiden, p. 118, 1988)；Petrillo et al. in 「Peptides: Structure and Function (Proceedings of the 9th American Peptide Symposium)」(Pierce Chemical Co. Rockland, Ill., 1985)を参照されたい)。

他の態様において、修飾は糖質または脂質部分の導入であってよい。このような修飾により、ポリペプチドを適切な薬学的組成物として有利に調製できるように、種々の媒体中でのポリペプチドの溶解度を変化させることができる。修飾させる脂質基には、これらに限定されないが、ファルネシル基およびミリストイル基が含まれる。修飾させる糖質基には、これらに限定されないが、任意の天然および/または合成糖の単糖またはオリゴ糖ならびに糖アルコールが含まれ、これには例えば、グルコース、ガラクトース、ラムノース、マンノース、アラビノース、およびその他の糖、ならびにそれらのそれぞれの糖アルコールが含まれる。

特定の態様において、本発明のペプチド模倣体は、翻訳後修飾と類似した修飾をさらに含んでよい。このような修飾には、これらに限定されないが、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、およびアシル化が含まれる。結果として、修飾されたペプチド模倣体は、ポリエチレングリコール、脂質、多糖または単糖、およびリン酸などの非アミノ酸エレメントを含んでよい。このような非アミノ酸エレメントがペプチド模倣体の機能性にもたらす効果は、本明細書に開示するアッセイ法を用いて試験することが可能である。

したがって、好ましい態様において、本発明のペプチド模倣体は、SEQ ID NO:1〜33のポリペプチドと実質的に類似している三次元構造を有する。特定の態様において、ペプチド模倣体は、天然ポリペプチドに対するレトロ-インベルソポリペプチドのように、アミノからカルボキシ方向にアミド結合以外の少なくとも1つの骨格結合を含むか、またはアミド結合以外の少なくとも1つの骨格結合を含む。

例えばレトロインベルソペプチド模倣体を含む、本発明のポリペプチドおよびペプチド模倣体は、構成アミノ酸および/または末端アミノ酸上のR基を保護基によってブロックする、すなわち保護するように、修飾することが可能である。特にアミノ末端および/またはカルボキシ末端のブロックは、経口送達を大きく向上させ、血清半減期を有意に延長させることが見出されている。本明細書で使用する「保護基」とは、望ましくない化学変換から潜在的な反応性官能基を保護する一時的な置換基を指す。そのような保護基の例には、一般的に、カルボン酸のエステル、アルコールのシリルエーテル、ならびにアルデヒドおよびケトンそれぞれのアセタールおよびケタールが含まれる。保護基化学の分野は概説されている(Greene, T. W.; Wuts, P. G. M. Protective Groups in Organic Synthesis, 2^nd ed.; Wiley: New York, 1991)。

多くの保護基がこの目的に適している。そのような基には、アセチル、CH₃-(CH₂)_n-CO-、アミド、Fmoc、t-ブトキシカルボニル(t-BOC)、9-フルオレンアセチル基、1-フルオレンカルボン酸基、9-フルオレンカルボン酸基、9-フルオレノン-1-カルボン酸基、ベンジルオキシカルボニル、キサンチル(Xan)、トリチル(Trt)、4-メチルトリチル(Mtt)、4-メトキシトリチル(Mmt)、4-メトキシ-2,3,6-トリメチル-ベンゼンスルホニル(Mtr)、メシチレン-2-スルホニル(Mts)、4,4-ジメトキシベンズヒドリル(Mbh)、トシル(Tos)、2,2,5,7,8-ペンタメチルクロマン-6-スルホニル(Pmc)、4-メチルベンジル(MeBzl)、4-メトキシベンジル(MeOBzl)、ベンジルオキシ(BzlO)、ベンジル(Bzl)、ベンゾイル(Bz)、3-ニトロ-2-ピリジンスルフェニル(Npys)、1-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソシクロヘキシリデン)エチル(Dde)、2,6-ジクロロベンジル(2,6-DiCl-Bzl)、2-クロロベンジルオキシカルボニル(2-Cl-Z)、2-ブロモベンジルオキシカルボニル(2-Br-Z)、ベンジルオキシメチル(Bom)、シクロヘキシルオキシ(cHxO)、t-ブトキシメチル(Bum)、t-ブトキシ(tBuO)、t-ブチル(tBu)、およびトリフルオロアセチル(TFA)が含まれるが、これらに限定されない。変数「n」は、0〜12の整数であり、典型的には0〜6、例えば0〜4などである。その他の適切な保護基は、米国特許第6,933,279号に開示されており、その教示は参照により組み入れられる。

1つの態様において、好ましい保護基には、これらに限定されないが、アセチル基、アミド基、およびアルキル基が含まれ、アセチル基およびアルキル基がN末端の保護に特に好ましく、アミド基がカルボキシル末端の保護に特に好ましい。1つの好ましい態様では、アミノ末端の保護にアセチル基が用いられ、カルボキシル末端の保護にアミド基が用いられる。この態様において、アセチル化は、無水酢酸を用いて、ポリペプチドが樹脂上に存在する合成中に達成することが可能である。アミド保護は、合成に適切な樹脂を選択することによって達成することが可能である。例えば、リンクアミド樹脂を使用することができる。合成の完了後に、AspおよびGluなどの酸性の二官能性アミノ酸、およびLysなどの塩基性アミノ酸、ならびにTyrのヒドロキシル上の半永久的保護基をすべて同時に除去する。酸処理を用いてそのような樹脂から遊離されたポリペプチドは、N末端がアセチルとして保護され、C末端がNH₂として保護され、同時に他の保護基がすべて除去された状態で得られる。

A. 化学合成
ポリペプチドは、例えば固相合成を含む当技術分野で周知の方法を用いて化学合成することが可能である(例えば、Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)、およびAbelson et al., Methods in Enzymology, Volume 289: Solid-Phase Peptide Synthesis (1st ed. 1997)を参照されたい)。ポリペプチド合成は、手動技法を使用するか、または自動化により行うことが可能である。自動化された合成は、例えばApplied Biosystems 431Aペプチド合成機(Perkin Elmer)を使用して達成することが可能である。あるいは、ポリペプチドの種々の断片を別々に化学合成し、次いで化学的方法を用いてそれらを結合させて、全長ポリペプチドを生成することもできる。ポリペプチドの配列および質量は、GC質量分析により確認することが可能である。一旦合成されると、例えば上記のようにN末端アセチル基およびC末端アミド基によって、ポリペプチドを修飾することができる。合成されたポリペプチドは、HPLCにより、少なくとも約80%、好ましくは90%、かつより好ましくは95%の純度までさらに単離することが可能である。

B. 組換え発現
本明細書に記載するポリペプチドは、特にポリペプチドが「D」アミノ酸残基を含まない場合には、組換えにより発現させることも可能である。本態様は、組換え遺伝学の分野における日常的な技法に依存する。一般に、本明細書に記載する組換えDNA技術における命名法および実験手順は、当技術分野で周知であり、広く使用されているものである。クローニング、DNAおよびRNAの単離、増幅、ならびに精製には、標準的な技法を使用する。一般に、DNAリガーゼ、DNAポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼ等を含む酵素反応は、製造業者の仕様書に従って実施する。本発明における一般的な使用方法を開示している基本的な教科書には、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3d ed. 2001)；Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990)；およびCurrent Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994)が含まれる。

例えば、発現させようとするポリペプチドをコードする核酸配列をクローニングするためには、生理的試料中のコードmRNAの存在を検出するため、核酸を配列決定するため、または他の目的のためのプローブとして使用する核酸を作製するためには、ポリメラーゼ連鎖反応またはその他のインビトロ増幅法もまた有用な場合がある。PCR反応によって増幅された核酸をアガロースゲルから精製し、適切なベクターにクローニングすることができる。

当技術分野で公知の技法、例えば、mRNAの逆転写および増幅、全RNAまたはポリA+ RNAの単離、ノーザンブロッティング、ドットブロッティング、インサイチューハイブリダイゼーション、RNase保護、DNAマイクロチップアレイの探索等により、本発明の配列の遺伝子発現を解析することもできる。

本発明のポリペプチドをコードする核酸配列などの核酸配列の高レベル発現を得るには、典型的に、本発明のポリペプチド配列をコードする核酸配列を発現ベクターにサブクローニングし、次いでこれを適切な宿主細胞にトランスフェクションする。発現ベクターは典型的に、転写を指示するための強力なプロモーターまたはプロモーター/エンハンサー、転写/翻訳ターミネーター、およびタンパク質をコードする核酸に関しては、翻訳開始用のリボソーム結合部位を含む。プロモーターは、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列またはそのサブ配列に機能的に連結させる。適切な細菌プロモーターは当技術分野で周知であり、例えば、Sambrook et al.およびAusubel et al.に記載されている。発現ベクターに典型的に含まれるエレメントには、大腸菌(E.coli)で機能するレプリコン、組換えプラスミドを有する細菌を選択できるようにする抗生物質耐性をコードする遺伝子、および真核生物配列の挿入を可能にするプラスミドの非必須領域における独特の制限部位も含まれる。選択される抗生物質耐性遺伝子の種類は重要ではなく、当技術分野で公知の多くの耐性遺伝子がいずれも適している。

遺伝情報を細胞内に輸送するために使用する特定の発現ベクターの種類は、特に重要ではない。真核細胞または原核細胞における発現に用いられる従来のベクターのいずれも使用してもよい。標準的な細菌発現ベクターには、pBR322ベースのプラスミド、pSKF、pET23Dなどのプラスミド、ならびにGSTおよびLacZなどの融合発現システムが含まれる。簡便な単離方法を提供するために、例えばHisタグといったエピトープタグを組換えポリペプチドに付加することもできる。場合によっては、酵素切断配列(例えば、第Xa因子切断部位を形成するMet-(His)g-Ile-Glu-GLy-Arg)を組換えポリペプチドに付加する。ポリペプチドを発現させるための細菌発現システムは、例えば大腸菌、バチルス属(Bacillus)種、およびサルモネラ属(Salmonella)において利用可能である(Palva et al., Gene 22:229-235(1983)；Mosbach et al., Nature 302:543-545 (1983))。このような発現システム用のキットは市販されている。哺乳動物細胞、酵母、および昆虫細胞用の真核生物発現システムは当技術分野で周知であり、同様に市販されている。

標準的なトランスフェクション法を用いて、本発明のポリペプチドを大量に発現する細胞株を作製し、次に標準的な技法を用いてこのポリペプチドを精製する(例えば、Colley et al., J. Biol. Chem., 264:17619-17622 (1989)；Guide to Protein Purification, in Methods in Enzymology, vol.182 (Deutscher, ed., 1990)を参照されたい)。細胞の形質転換は、標準的な技法に従って行う(例えば、Morrison, J. Bact., 132:349-351(1977)；Clark-CurtissおよびCurtiss, Methods in Enzymology, 101:347-362 (Wu et al., eds, 1983)を参照されたい)。例えば、外来ヌクレオチド配列を宿主細胞に導入するための周知の手順のいずれも使用してもよい。これには、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム、マイクロインジェクション、プラズマベクター(plasma vector)、ウイルスベクター、およびクローニングされたゲノムDNA、cDNA、合成DNA、または他の外来遺伝物質を宿主細胞に導入するための他の周知の任意の方法の使用が含まれる(例えば、Sambrook et al.、前記を参照されたい)。唯一必要なのは、使用する特定の遺伝子工学手順が、本発明のポリペプチドを発現し得る宿主細胞に少なくとも1つの遺伝子を良好に導入できるという点である。

発現ベクターを細胞に導入した後、本発明のポリペプチドの発現に好ましい条件下で、トランスフェクションした細胞を培養する。以下に明記する標準的な技法を用いて、培養物から本発明のポリペプチドを回収する。

C. ポリペプチドの精製
例えば、封入体からの抽出および精製、サイズの差によるろ過、溶解度分画(すなわち、硫酸アンモニウムのような物質による選択的沈殿)；カラムクロマトグラフィー、免疫精製法、およびその他を含む、当技術分野で公知の標準的な技法により、ポリペプチドを実質的に純粋になるまで精製する(例えば、Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (1982)；米国特許第4,673,641号；Ausubel et al.、前記；およびSambrook et al.、前記を参照されたい)。

ポリペプチドを精製する場合、いくつかの手順を使用することができる。例えば、確立された分子接着特性を有するポリペプチドを、組換えポリペプチドに可逆的に融合させることができる。適切なリガンドを用いて、組換えポリペプチドを精製カラムに選択的に吸着させ、その後カラムから比較的純粋な形態で遊離させることができる。次に、酵素の働きにより融合ポリペプチドを取り外す。最終的に、免疫親和性カラムを使用して、ポリペプチドを精製することができる。

IV. 所望の活性を有するポリペプチドを同定する方法
本発明のポリペプチドまたはペプチド模倣体を、当業者に周知の方法を用いてコレステロール流出を媒介する能力および/またはABCA(例えば、ABCA1)を安定化する能力について、容易にスクリーニングすることができる。

いくつかの異なるスクリーニングプロトコールを使用して、コレステロール流出を媒介するおよび/またはABCA(例えば、ABCA1)を安定化する本発明のポリペプチドまたはペプチド模倣体を同定することができる。1つの態様において、スクリーニング法は、例えばヒト細胞を含む哺乳動物細胞において、コレステロール流出を媒介するおよび/またはABCA(例えば、ABCA1)を安定化する複数の試験ポリペプチドを同定するために、これらのポリペプチドをスクリーニングする段階を含む。

コレステロール流出を媒介する能力および/またはABCAを安定化する能力に関するスクリーニングに加えて、候補試験ポリペプチドを、例えば抗酸化活性および抗炎症活性を含む他の活性についてスクリーニングすることもできる。いくつかの異なるスクリーニングプロトコールを使用して、抗酸化活性および/または抗炎症活性を有する本発明のポリペプチドまたはペプチド模倣体を同定することができる。

本明細書に開示するものに加えて、多くの他のスクリーニングアッセイ法を用いて、本発明のポリペプチドまたはペプチド模倣体を所望の生物活性についてスクリーニングできることは、当業者に容易に明白であると考えられる。

A. コレステロール流出活性に関するスクリーニング
適切なコレステロール流出アッセイ法は、例えば、Bielicki, J. K and Oda, M. N., Biochemistry, 41:2089-2096 (2002)；Jia et al., Biochem. Biophys. Res. Common., 297:206-213 (2002)に記載されている。いくつかの態様では、コレステロール流出を媒介することが知られているポリペプチド(例えば、アポA-Iのヘリックス9/10)を用いて、細胞ベースのアッセイ法で、コレステロール流出のさらなるメディエータをスクリーニングする。例えば、ABCA1タンパク質発現を上方制御するcAMP類似体を用いてコレステロール流出を増強することができる細胞株(例えば、J774マクロファージ)を都合よく使用して、コレステロール流出を媒介する本発明のポリペプチドの能力を評価することができる。細胞によるコレステロール取り込みに適した条件下で、細胞を標識コレステロール(例えば、[³H]コレステロール)と共にインキュベートする。したがって、細胞コレステロール流出の開始前に、すなわち細胞を試験ポリペプチドと接触させる前に、cAMPまたはcAMP類似体(例えば、CPT-cAMP)を、適切な時間、細胞と共にインキュベートする。培地中に出現する標識コレステロールの測定値を用いて、試験ポリペプチドのコレステロール流出媒介活性を決定する。

B. ABCA安定化活性に関するスクリーニング
当技術分野で公知の複数のアッセイ法を用いて、本発明のポリペプチドのABCA安定化活性を測定することができる。例えば、結合アッセイ法を用いて、試験ポリペプチドがABCA(例えば、ABCA1)に結合する能力を試験することができる。ABCA安定化活性を有するポリペプチドは、コレステロール流出のメディエータである可能性も高いことが見出されている。したがって、好ましい態様において、本発明のポリペプチドまたはペプチド模倣体は、コレステロール流出を媒介しかつABCAを安定化する能力を有する。1つのスクリーニング態様において、結合アッセイ法は競合アッセイ法であってよい。他のアッセイ法には、例えば、試験ポリペプチドとの接触後のABCA(例えば、ABCAタンパク質または核酸)の直接測定が含まれる。

1. 結合アッセイ法
結合アッセイ法は通常、ABCAを1つまたは複数の試験ポリペプチドと接触させる段階、およびABCAと試験ポリペプチドが結合複合体を形成するのに十分な時間を与える段階を含む。いくつかの確立された分析技法のいずれかを用いて、形成された任意の結合複合体を検出することができる。タンパク質結合アッセイ法には、これらに限定されないが、免疫組織化学的結合アッセイ法、フローサイトメトリー、またはその他のアッセイ法が含まれる。いくつかの態様では、競合アッセイ法を用いて、試験ポリペプチドがABCA安定化活性を有するかどうかを決定する。競合アッセイ法は当技術分野で周知である。典型的には、競合化合物、すなわちABCAと結合することが知られている化合物を、(例えば、ABCAに結合し得る本発明の試験ポリペプチドの漸増量の存在下で)ABCAに対する結合の差が測定できるように標識する。ABCAに対する試験化合物の結合を有意に妨げない限り、アッセイに使用する標識または検出可能な基の種類は、本発明の重要な局面ではない。本明細書に記載するように、検出可能な基(または代わりに、検出可能な部分もしくは標識)は、検出可能な物理的または化学的性質を有する任意の物質であってよい。そのような検出可能な標識は、免疫測定法の分野で十分に開発されており、一般的に、そのような方法で有用な大部分のいかなる標識も本発明に適用することができる。したがって、標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、または化学的手段により検出可能な任意の組成物である。本発明で有用な標識には、これらに限定されないが、磁気ビーズ(例えば、DYNABEADS（商標）)、蛍光色素(例えば、フルオレセインイソチオシアネート、Texas red、ローダミン等)、放射標識(例えば、³H、¹²⁵I、³⁵S、¹⁴C、または³²P)、酵素(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびELISAで一般的に用いられるその他のもの)、ならびにコロイド金または着色ガラスまたはプラスチックビーズ(例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス等)などの比色標識が含まれる。

いくつかの態様では、ABCA発現およびABCA非発現細胞を用いて、試験ポリペプチドおよび競合化合物(例えば、全長アポA-I AまたはアポA-I 9/10ポリペプチド)のABCAに対する相対的なABCA結合親和性を測定することにより、試験ポリペプチドのABCA(例えば、ABCA1)安定化活性を測定する。いくつかの態様では、例えばRemaley et al., J. Lipid Res., 44:828-836 (2003)に記載されているように、全長アポA-I AのABCAに対する結合親和性を、本発明の標識ポリペプチドの結合親和性と比較する。ABCAを発現する細胞を競合化合物の存在下および非存在下でインキュベートし、次いで一連の濃度の個々の標識試験ポリペプチド(例えば、本発明の放射標識ポリペプチド)に曝露する。典型的に、試験ポリペプチドの濃度は、約0.1μg/ml〜約200μg/ml、約0.5μg/ml〜約100μg/ml、約1μg/ml〜約40μg/ml、または約5μg/ml〜約20μg/mlの範囲である。

2. ABCAの直接測定
いくつかの態様では、細胞ベースのアッセイ法を用いて、ABCA(例えば、ABCAタンパク質または核酸)の直接測定によってABCAの安定化を測定する。細胞ベースのアッセイは、ABCAをトランスフェクションした細胞(例えば、HeLa細胞)を含む、ABCAが発現される任意の細胞(例えば、J774マクロファージ)で行うことが可能である。任意の細胞型を用いることができる。例えば、J774マクロファージを用いて、本発明のポリペプチドの存在下および非存在下における、相対的なABCA1タンパク質レベルを評価することができる。最初に、ABCA(例えば、ABCA1)発現を上方制御するようにABCAを誘導する化合物(例えば、cAMP、または8-ブロモ-cAMPなどのcAMP類似体)と細胞を接触させ、次にcAMP刺激の非存在下において、本発明のポリペプチドの存在下および非存在下で合成ABCA1タンパク質レベルに曝露して、ABCA1タンパク質が安定化されたかまたは分解されたかどうかを評価する。ABCA1タンパク質の相対レベルは、例えば、細胞膜の免疫ブロット解析(Oram et al., J. Biol. Chem., 278:52379-52385 (2003))、またはABCA mRNAに対する核酸プローブのハイブリダイゼーションを含む、当技術分野で公知の任意の手段を用いて評価することが可能である。

C. 抗酸化活性に関するスクリーニング
本発明のポリペプチドまたはペプチド模倣体は、当技術分野で公知の方法を用いて、抗酸化活性についてスクリーニングすることが可能である。例えば、米国特許出願公開第2003/0087819号は、例えばミセル基質アッセイ法を含む、ポリペプチドの抗酸化活性を決定するために使用できる複数のアッセイ法を記載している。リン脂質(例えば、1-パルミトイル-2-リノレオイルホスファチジルコリン)を含むミセル基質を用いて、特定の酵素(例えば、大豆リポキシゲナーゼおよび/またはキサンチン/キサンチンオキシダーゼ)によって触媒される脂質の過酸化の速度を測定する。本発明の組換えポリペプチドをリン脂質ミセルに添加した後、酵素で脂質の過酸化を開始する。共役ジエン(脂質の過酸化の産物)の増加を、25℃で紫外線吸収分光法(234 nm)によりモニターする。共役ジエンのモル吸光係数(ε＝29,500 Lcm^-1 mol^-1)を用いて、リン脂質ヒドロペルオキシドの質量を計算する。酸化曲線の直線部分の勾配から、リポキシゲナーゼによる脂質の過酸化の初速を計算し、形成されたリン脂質過酸化物nmole/分として結果を表すことができる。ポリペプチドの非存在下で得られた脂質過酸化物の蓄積の最大レベル(すなわち、酸化曲線におけるプラトー)に基づいて、本発明のポリペプチドの効力に関する定量的情報(例えば、脂質の過酸化に対して50%保護をもたらすポリペプチドの濃度)を導出することが可能である。その他の方法は、LDL、VLDL、およびLp(A)としてのアポBリポタンパク質の酸化を防ぐポリペプチド能力についてのスクリーニングに関する。

抗酸化活性に関するスクリーニングのための他のアッセイ法は、PCT公報 国際公開公報第02/15923号に開示されており、その教示は参照により本明細書に組み入れられる。

D. 抗炎症活性に関するスクリーニング
本発明のポリペプチドまたはペプチド模倣体は、当技術分野で公知の任意の手段を用いて、抗炎症活性についてスクリーニングすることが可能である。例えば、炎症事象に感受性のある酵素(例えば、レシチン：コレステロールアセチルトランスフェラーゼ(LCAT)またはパラオキソナーゼ(PON))の活性を評価するアッセイ法を用いて、本発明のポリペプチドの抗炎症活性を評価することができる。適切なアッセイ法は、例えば、外因性プロテオリポソーム基質を使用するLCAT活性の定量を記載しているChen et al.., J. Lipid Res., 23:680-691 (1982)、およびPON活性の定量を記載しているForte et al., J. Lipid Res., 43:477-485 (2002)に記載されている。その他のスクリーニングは、種々の刺激(例えば、接着分子、TNF-α、LPS、またはそれらの組み合わせ)後の標的細胞のmRNA発現および/またはタンパク質産生を阻害するポリペプチド能力をモニターする段階を含み得る。

E. プレβ形成
本発明のペプチドはまた、ヒト血漿中でプレβ-1 HDL形成を誘導する能力についてスクリーニングすることもできる。そのような解析の一例では、試験するペプチドをヒト血漿に添加する。ペプチドを含むまたは含まない血漿をインキュベートし、次いで、例えば一次元目のアガロースゲル電気泳動およびそれに続く二次元目の未変性勾配ゲル電気泳動によって評価して、ヒト血漿試料中に存在するHDL粒子の集団を評価する。関心対象のペプチドは典型的に、ペプチド:アポAI(血漿中)のモル比約1:1またはそれ未満で、強力な活性を示す。

F. さらなる試験
コレステロール流出を媒介するかまたはABCAと相互作用すると最初に同定されたポリペプチドを、それらのコレステロール流出を媒介する能力および/またはABCAを安定化する能力を確認するためにさらに試験することができる。そのような方法の基本的形式は、最初のスクリーニングで同定されたリード化合物を、モデルとなる動物に投与する段階を含む。確認研究に使用される動物モデルは一般に、任意の種類の哺乳動物である。適切な動物の具体例には、これらに限定されないが、霊長類(例えば、チンパンジー、サル等)およびげっ歯類(例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ等)が含まれる。好ましい態様では、アポE-/-マウス、アポA-II -/-マウス、またはアポC-III -/-マウスを使用する。さらなる動物モデルは、例えば、Marschang et al., Sem. Cell Dev. Biol., 14:25-35 (2003)に記載されている。

G. ハイスループットスクリーニング
1つの態様では、ハイスループットスクリーニング(HTS)法を用いて、コレステロール流出を媒介するおよび/またはABCAを安定化する本発明のポリペプチドまたはペプチド模倣体を同定する。HTS法は、多数の潜在的な治療化合物(すなわち、コレステロール流出を媒介するか、またはABCAを安定化するポリペプチドまたはペプチド模倣体)を含むコンビナトリアルポリペプチドライブラリーを提供する段階を含む。次に、そのような「ライブラリー」を、本明細書に記載するように1つまたは複数のアッセイ法でスクリーニングして、所望の特有の活性を示すライブラリーメンバー(すなわち、特定のポリペプチドまたはペプチド模倣体)を同定する。このようにして同定された化合物は、従来の「リード化合物」となり得るか、またはそれ自体を潜在的な治療剤または実際の治療剤として使用することが可能である。

コンビナトリアルポリペプチドライブラリーは、いくつかの「化学的構成」要素、すなわちアミノ酸を組み合わせることによって、化学合成または生物学的合成により作製された多様なポリペプチドの収集物である。より詳細には、線形コンビナトリアルポリペプチドライブラリーは、所与の化合物長(すなわち、ポリペプチド化合物中のアミノ酸の数)に対して、可能なすべての方法で一連の化学的構成要素(アミノ酸)を組み合わせることによって形成される。化学的構成要素のそのような組み合わせ混合によって、何百万の化合物を合成することができる。好ましい態様では、ハイスループット様式で、SEQ ID NO:2〜26および31〜33のポリペプチドの保存的変種を作製し、所望の生物活性(例えば、コレステロール流出活性)についてスクリーニングする。

コンビナトリアルライブラリーを調製するための装置は当業者に公知であり、いくつかの異なる供給元から市販されている(例えば、ECIS(商標)、Applied BioPhysics Inc.、ニューヨーク州、トロイ、MPS、390 MPS、Advanced Chem Tech、ケンタッキー州、ルイビル、Symphony、Rainin、マサチューセッツ州、ウォバーン、433A Applied Biosystems、カリフォルニア州、フォスターシティー、9050 Plus、 Millipore、マサチューセッツ州、ベッドフォードを参照されたい)。

V. 使用方法
本発明の非天然ポリペプチドは、強力なコレステロール逆転送(RCT)経路を使用して、コレステロール流出を媒介する。本発明のポリペプチドは、ABCA1依存性コレステロール流出の強力かつ選択的なメディエータであることに加えて、ABCA安定化活性、抗酸化活性、および抗炎症活性、これらの活性の任意の組み合わせ、ならびに好ましくはこれらの活性のすべてもまた有する。

それらの生物活性、特にコレステロール流出を媒介するそれらの能力を考慮して、本発明のポリペプチド(またはそのペプチド模倣体)を用いて、哺乳動物におけるコレステロールレベルの上昇を治療すること、またはコレステロールレベルの上昇を来たすリスクのある哺乳動物を予防的に治療することができる。加えて、哺乳動物における脂質パラメータを改善するために、ポリペプチドまたはペプチド模倣体を使用することもできる。「脂質パラメータ」の改善には、例えば、リポタンパク質の血管接着性の低下、アテローム性動脈硬化性プラーク量の減少(たとえ、血漿LDLおよび/またはHDLの濃度が有意に変化し得なくとも)、HDLまたはLDL粒子の酸化能の低下、アテローム性動脈硬化の退行(例えば、頸動脈の血管造影または超音波により測定される)、ならびに心臓事象の減少のうちの1つまたは複数が含まれる。したがって、本発明のポリペプチドまたはペプチド模倣体を用いて、本明細書に開示する疾患および状態のような、脂質異常症、高コレステロール血症、および炎症に関連する疾患および状態、または脂質パラメータを変化させることによって治療可能な疾患および状態を、治療または予防する(すなわち、予防的に治療する)ことができる。

本明細書に具体的に開示する疾患および状態に加えて、当業者は、本発明のポリペプチドまたはペプチド模倣体を用いて治療または予防できる、脂質異常症、高コレステロール血症、および炎症に関連する他の疾患および状態について知っていると考えられる。

A. アテローム性動脈硬化の症状の治療または予防
1つの態様において、本発明は、アテローム性動脈硬化の1つまたは複数の症状を治療、改善、および/または予防する方法を提供する。本方法は、好ましくは、生物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトに本発明の1つまたは複数のポリペプチド(またはそのようなポリペプチドの摸倣体)を投与する段階を含む。ポリペプチドは、本明細書に記載するように、これらに限定されないが、注射、坐剤、経鼻スプレー、持続放出型のインプラント、経皮パッチ、経口等を含むいくつかの標準的な方法のいずれかに従って投与することができる。1つの特に好ましい態様では、ポリペプチドを経口投与する(例えば、シロップ剤、カプセル剤、錠剤等として)。

本発明の方法は、アテローム性動脈硬化の1つまたは複数の症状(例えば、高血圧、血管の狭小化、プラークの形成および破裂、心臓発作、狭心症、または卒中、高レベルの血漿コレステロール、高レベルの低密度リポタンパク質、高レベルの超低密度リポタンパク質、または炎症性タンパク質等)を有するヒトまたは非ヒト動物の治療に限定されず、予防的な意味でも非常に有用である。したがってアテローム性動脈硬化の1つまたは複数の症状の発症、すなわち発生を予防するために、本発明のポリペプチド(またはその摸倣体)を、ヒトまたは非ヒト動物などの生物に投与することができる。予防的治療に適した候補対象には、例えば、アテローム性動脈硬化の1つまたは複数のリスク因子(例えば、家族歴、アテローム性動脈硬化と相関する遺伝子マーカー、高血圧、肥満、アルコールの大量摂取、喫煙、高血中コレステロール、高血中トリグリセリド、血中LDL、VLDL、IDLの上昇、もしくは低HDL、糖尿病、または糖尿病、高血中脂質、心臓発作、狭心症、もしくは卒中の家族歴等)を有する対象が含まれる。

治療により、血管手術の必要性を補足するかまたは取り除くことができ、抗アテローム性動脈硬化治療を全身的なものにしかつ持続可能にする。したがって、ペプチドは、手術前に循環を最適化するために介入の前に、脈管構造もしくはその近傍に局所投与するために手術中に、または手術介入による機械的外傷によって起こった炎症およびアテローム性動脈硬化を軽減するために手術後に、施与することができる。

B. 急性炎症反応に関連するアテローム性動脈硬化の症状の治療または予防
本発明のアテローム性動脈硬化抑制ポリペプチドは、いくつかの他の状況においても有用である。特に、心血管系合併症(例えば、アテローム性動脈硬化、卒中等)は、急性期炎症反応の開始を伴うか、またはこれに付随する場合が多いことが見出されている。そのような急性期炎症反応は、再発性炎症性疾患(例えば、ハンセン病、結核、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ等)、ウイルス感染(例えば、インフルエンザ、HIV等)、細菌感染、真菌感染、臓器移植、創傷または他の外傷、埋め込み人工器官、バイオフィルム等に関連している場合が多い。

それらの抗酸化活性を考慮して、急性期炎症反応中またはその後の酸化されたリン脂質の形成を軽減または予防するために、本明細書に記載するポリペプチドを使用し、それによってそのような状態に関連する心血管系合併症を緩和または排除することができる。

したがって、特定の態様において、本発明は、急性期炎症反応のリスクがあるかもしくはこれを招いている、および/またはアテローム性動脈硬化のリスクがあるかもしくはその症状を招いている対象に、本発明のポリペプチドの1つまたは複数を投与することを意図する。

本発明のペプチドは脂質に変化をもたらし、よって脂質および脂質代謝が役割を果たす疾患状態の治療に有用であり得る。したがって、例えば、冠動脈疾患を有するかまたはそのリスクがある人に、流感の季節に本発明のポリペプチドを予防的に投与することができる。再発性炎症状態、例えば関節リウマチ、種々の自己免疫疾患等を被ったヒト(または他の動物)を本発明のポリペプチドで治療して、アテローム性動脈硬化または卒中の発生を緩和または予防することができる。同様に、外傷、例えば急性損傷、組織移植等を受けたヒト(または他の動物)を本発明のポリペプチドで治療して、アテローム性動脈硬化または卒中の発生を緩和または予防することができる。

場合によっては、そのような方法は、急性炎症反応の発生またはリスクの診断を伴う。急性炎症反応は典型的に、代謝および肝臓における遺伝子調節の変化を伴う。それは、免疫系、心血管系、および中枢神経系に加え、身体の主要な系のすべてを含む動的なホメオスタシス過程である。通常は、急性期反応は数日続くだけであるが、慢性炎症または再発性炎症の場合には、急性期反応のいくつかの局面の異常な継続が、疾患を伴う根本的な組織損傷の一因となる場合があり、さらなる合併症、例えば心血管疾患またはアミロイドーシスなどのタンパク質沈着疾患をも引き起こす場合がある。

急性期反応の重要な局面は、肝臓の生合成プロファイルの急激な変化である。正常な状況下では、肝臓は、特有の範囲の定常状態濃度の血漿タンパク質を合成する。これらのタンパク質の多くは重要な機能を有し、これらの急性期反応物(APR)または急性期タンパク質(APP)のより高い血漿レベルが、炎症刺激後の急性期反応の間に必要とされる。大部分のAPRは肝細胞によって合成されるが、単球、内皮細胞、線維芽細胞、および脂肪細胞を含む他の細胞型によって産生されるものもある。大部分のAPRは、正常レベルの50%〜数倍誘導される。対照的に、主要なAPRは、正常レベルの1000倍にまで増加し得る。この群には、血清アミロイドA(SAA)、およびヒトのC反応性タンパク質(CRP)またはマウスのその相同体、血清アミロイドP成分(SAP)が含まれる。いわゆる負のAPRは急性期反応中に血漿濃度が減少して、誘導APRを合成する肝臓の能力を増加させる。

特定の態様では、急性期炎症反応またはそのリスクを、1つまたは複数のAPPを測定することによって評価する。そのようなマーカーの測定は当業者に周知であり、そのような測定を提供する営利会社が存在する(例えば、AGPはCardiotech Services、ケンタッキー州、ルイビルによって測定される)。人が急性期炎症反応を起こしているか、または急性期炎症反応を起こすリスクがあることが決定されたならば、急性期炎症反応中またはその後の酸化されたリン脂質の形成を軽減または予防するために、本発明のポリペプチドを投与し、それによってそのような状態に関連する心血管系合併症を緩和または排除することができる。

C. 冠動脈石灰化および骨粗鬆症に関連する症状または状態の治療または予防
酸化された脂質が、冠動脈石灰化および骨粗鬆症の原因となり得ることも見出されている。酸化された脂質が石灰沈着性大動脈狭窄の病因に関与し得るとも考えられている。

したがって、別の態様では、本発明のポリペプチドを用いて、リウマチ性多発性筋痛、結節性多発動脈炎、強皮症、特発性肺線維症、慢性閉塞性肺疾患、アルツハイマー病、AIDS、冠動脈石灰化、石灰沈着性大動脈狭窄、骨粗鬆症等の疾患の症状を治療、抑制、または予防する。そのような方法では、酸化されたリン脂質の形成を軽減または予防するために、本発明のポリペプチドまたはペプチド模倣体をヒトまたは非ヒト動物に投与し、それによってリウマチ性多発性筋痛、結節性多発動脈炎、強皮症、特発性肺線維症、慢性閉塞性肺疾患、アルツハイマー病、AIDS、冠動脈石灰化、石灰沈着性大動脈狭窄、骨粗鬆症等の疾患の症状を抑制または予防することができる。

典型的に、上記の方法はいずれも、本発明の単一のポリペプチドの投与、または代わりに本発明の2つまたはそれ以上の異なるポリペプチドの投与を含む。そのようなポリペプチドは、単独で、または本明細書に開示するような他の治療剤と併用して投与することが可能である。ポリペプチドは、単量体として、または二量体、オリゴマー、もしくは多量体型で提供することが可能である。特定の態様では、多量体型は会合している単量体(例えば、イオン結合しているかまたは疎水的に結合している)を含んでよく、一方で他の態様では、他の多量体型は共有結合した単量体(直接結合しているか、またはリンカーを介して結合している)を含む。

加えて、前述の方法はいずれもヒトに関して記載しているが、そのような方法は、他の動物にも、すなわち獣医学使用にも有用であることは、当業者に容易に明白であると考えられる。したがって、好ましい生物には、これらに限定されないが、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ウマ、ネコ、ブタ、有蹄動物、ウサギ目動物等が含まれる。

D. 不安定プラークの安定化
本明細書に説明した通り、心疾患、特に冠動脈疾患は、米国および他の先進工業国における死亡、障害、および医療費の主たる原因である。最近まで、大部分の心疾患は、主に、冠動脈において硬性プラークが徐々に増加した結果であると考えられていた。硬性プラークのこのアテローム性動脈硬化性の疾患過程は、罹患した冠動脈の重大な狭小化(狭窄)を引き起こし、胸痛として一般に知られる狭心症症候群を生じる。狭小化が進行すると血流が減少し、血塊(血栓)の形成を誘発する。血塊は心筋への酸素に富んだ血液の流れを断ち(虚血)、心臓発作を引き起こす場合がある。または、血塊がはがれて、脳などの別の器官の血管に詰まり、脳血栓症を引き起こす場合がある。

しかし、過去10年内に、アテローム性動脈硬化、冠動脈疾患、および心臓発作のパラダイムをある程度変える証拠が出てきた。硬性プラークの蓄積は、狭心症および冠動脈における重度の虚血をもたらす恐れがあるが、新たな臨床データから、それ自体非閉塞性である場合の多い不安定プラークの破裂が心臓発作の大多数を引き起こすことが示唆される。その割合は、60〜80パーセントもの高さであると推定される。

多くの場合、不安定プラークは血管腔を侵害せず、むしろ、膿瘍とほぼ同様に、動脈壁内に深く根付いている。不安定プラークの大部分は、薄い線維性被膜によって収容された脂質プール、平滑筋(内皮)細胞、およびコレステロールを満たしたマクロファージ/泡沫細胞の高密度浸潤物を含む。脂質プールは、低密度リポタンパク質(LDL)、マクロファージ、および炎症過程を伴う病的過程の結果として形成されると考えられている。マクロファージはLDLを酸化し、泡沫細胞が生じる。

マクロファージ、泡沫細胞、および関連する内皮細胞は、腫瘍壊死因子、組織因子、およびマトリックスプロテイナーゼなどの種々の物質を放出し、その結果として、全般的な細胞の壊死およびアポトーシス、凝固促進、ならびに線維性被膜の脆弱化が起こる。炎症過程は、血圧の上昇によって生じるような十分な機械的ストレスが破裂を引き起こし得る程度にまで、線維性被膜を脆弱化し得る。次に、脂質コアおよび不安定プラークの他の内容物が血流中に流出し、それによって凝固カスケードが始動する。カスケードは、心臓発作および/または卒中を引き起こす可能性のある血塊を生じる。この過程は、放出されて凝固を増強するコラーゲンおよびプラーク成分(例えば、コラーゲンおよび組織因子)の放出により悪化する。

本発明のポリペプチドは、コレステロール逆転送を介してプラーク脂質含量を減少させることによって、不安定プラークを安定化できることが見出された。したがって、別の態様において、本発明は、本発明のポリペプチド(またはそのようなポリペプチドのペプチド模倣体)の1つまたは複数を哺乳動物(およびより好ましくは、ヒト)に投与することにより、哺乳動物の血管内の不安定プラークを安定化する方法を提供する。「不安定」プラークとは一般に、適切なコラーゲンおよび平滑筋細胞の支持を欠いた、線維性被膜の薄い、脂質の豊富なプラークと定義される。再度繰り返すが、本発明のポリペプチドは、プラーク脂質含量を減少させ、それによってそのような「不安定」プラークを安定化することができる。

1つの態様において、哺乳動物は、1つまたは複数の不安定プラークを有すると診断された哺乳動物である。本態様では、温度検出戦略、標識戦略、画像化戦略(例えば、磁気共鳴、超音波、赤外線、蛍光、可視光、電波、X線等を利用する装置)、周囲の健常な血管組織から不安定プラークを識別するための一般的戦略等を含む、不安定プラークを検出(例えば、診断および位置特定)するためのいくつかの異なる診断アッセイ法が開発されている(例えば、米国特許第6,245,026号、同第6,475,159号、同第6,475,210号、および同第7,118,567号を参照されたい)。1つの戦略は、血管内の温度の測定を含む。例えば、不安定プラーク組織温度は一般に、健常な血管組織と比較して高い。この温度の相違の測定により、不安定プラークの検出が可能になる。別の検出戦略は、マーカーによる不安定プラークの標識を含む。マーカーは、成分に特異的な、および/または不安定プラークに特有の(C反応性タンパク質など)物質であってよい。例えば、マーカーは、不安定プラークに対して、健常組織を上回る親和性を有し得る。したがって、マーカーの検出により、不安定プラークの検出が可能となり得る。あるいは、マーカーは必ずしも不安定プラークに対して親和性を有する必要はなくてよいが、不安定プラークと会合しながら単純に特性を変更する。特性の変化を検出することができ、よって不安定プラークの検出が可能となる。

別の態様において、哺乳動物は、1つまたは複数の不安定プラークを有するリスクがある。本態様では、当業者が哺乳動物が1つまたは複数の不安定プラークを有するリスクがあると考えるに至る、臨床症状が発現している、および/または臨床事象が起こっている。

不安定プラークを安定化する上記の方法に関連して、ポリペプチドは、本明細書に記載するように、これらに限定されないが、注射、注入、坐剤、経鼻スプレー、持続放出型のインプラント、経皮パッチ、経口等を含むいくつかの標準的な方法のいずれかに従って投与することが可能である。1つの特に好ましい態様では、ポリペプチドを経口投与する(例えば、シロップ剤、カプセル剤、錠剤等として)。加えて、本発明のポリペプチド(またはペプチド模倣体)を単独で、または脂質異常症、高コレステロール血症、および炎症を治療するための他の公知の薬学的物質と併用して使用して、血漿HDL濃度を上昇させること、および/またはコレステロール逆転送を促進することができる。

VI. 併用療法
いくつかの態様において、本発明のポリペプチドまたはペプチド模倣体を、アテローム性動脈硬化を含む心血管疾患などの、脂質異常症、高コレステロール血症、および炎症に関連する疾患および障害を治療または予防するための1つまたは複数の追加の治療剤と併用して投与する。例えば、1つの態様では、本発明のポリペプチドを、例えば、スタチン(例えば、アトルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン、フルバスタチン、またはロスバスタチン)；ニーマンピックC1様1ステロール輸送体チャネル阻害剤(例えば、エゼチミブ)；胆汁酸結合剤(例えば、コレスチラミンまたはコレスチポール)；血小板凝集阻害剤(例えば、アスピリン、チクロピジン、またはクロピドグレル)；ナイアシン/ニコチンアミド；PPAR活性化剤；ビタミンE；外科的介入(例えば、血管形成術、ステント、ステント、または動脈内膜切除術)；ならびに生活習慣の変化(例えば、低脂肪食、減量、および運動)を含む、アテローム性動脈硬化の標準的な治療のいずれかと併用して投与する。

より詳細には、本発明のポリペプチドまたはペプチド模倣体は、以下のうちの1つまたは複数と、別個の単位としてまたは固定した組み合わせとして併用することが可能である：インターロイキン-6、インターロイキン-8、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、および腫瘍壊死因子-αなどの望まれない炎症性分子もしくはサイトカインに結合する抗体；酵素阻害剤、例えばプロテアーゼ阻害剤アプロチニンもしくはシクロオキシゲナーゼ阻害剤など；抗生物質、例えばアモキシシリン、リファンピシン、エリスロマイシンなど；抗ウイルス剤、例えばアシクロビルなど；ステロイド系抗炎症剤、例えばグルココルチコチドなど；非ステロイド系抗炎症剤、例えばアスピリン、イブプロフェン、もしくはアセトアミノフェンなど；または非炎症性サイトカイン、例えばインターロイキン-4もしくはインターロイキン-10など。インターフェロン-β、腫瘍壊死因子、抗血管新生薬、エリスロポエチン、トロンボポエチン、インターロイキン、成熟因子、走化性タンパク質などの他のサイトカインおよび増殖因子、ならびに同様の生理的活性を保持するそれらの変種および誘導体も、追加の治療剤として使用することができる。

本発明のポリペプチドまたはペプチド模倣体は、例えば糖尿病患者における脂質障害を治療するために通常用いられる薬物と併用することが可能である。そのような薬物には、HMG-CoA還元酵素阻害剤、ニコチン酸、エゼチミド(ezetimide)、胆汁酸捕捉剤、フィブリン酸誘導体、MTP阻害剤、ACAT阻害剤、およびCETP阻害剤が含まれる。HMG-CoA還元酵素阻害剤の例には、ロバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチン、およびアトルバスタチンが含まれるが、これらに限定されない。胆汁酸捕捉剤の例には、コレスチラミン、コレスチポール、およびコレセベラムが含まれる。フィブリン酸誘導体の例には、ゲムフィブロジルおよびフェノフィブラートが含まれる。

本発明のポリペプチドまたはペプチド模倣体は、例えば、利尿薬、β遮断薬、カテプシンS阻害剤、メチルドパ、α2アドレナリンアゴニスト、グアナドレル、レセルピン、βアドレナリン受容体アンタゴニスト、α1アドレナリン受容体アンタゴニスト、ヒドララジン、ミノキシジル、カルシウムチャネルアンタゴニスト、ACE阻害剤、およびアンジオテンシンII受容体アンタゴニストなどの抗高血圧薬と併用することもできる。β遮断薬の例には、アセブトロール、ビソプロロール、エスモロール、プロパノロール、アテノロール、ラベタロール、カルベジロール、およびメトプロロールが含まれる。ACE阻害剤の例には、カプトプリル、エナラプリル、リシノプリル、ベナゼプリル、フォシノプリル、ラミプリル、キナプリル、ペリンドプリル、トランドラプリル、およびモエキシプリルが含まれる。

本発明のポリペプチドまたはペプチド模倣体は、カルシウムチャネルアンタゴニスト、βアドレナリン受容体アンタゴニストおよびアゴニスト、アルドステロンアンタゴニスト、ACE阻害剤、アンジオテンシンII受容体アンタゴニスト、ニトロ血管拡張薬、ならびに強心配糖体などの心血管薬と併用して使用することも可能である。本発明のポリペプチドまたはペプチド模倣体は、H1受容体アンタゴニスト、H2受容体を介したアゴニストおよびアンタゴニスト、COX-2阻害剤、NSAID、サリチル酸、アセトアミノフェン、プロピオン酸誘導体、エノール酸、ジアリール置換フアノン(fuanone)、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、ならびにブラジキニンアゴニストおよびアンタゴニストなどの抗炎症薬と併用して使用することも可能である。

本発明のポリペプチドまたはペプチド模倣体との併用した使用に適している他の治療剤は、2005年6月30日に公開された米国特許出願公開第2005/0142180号に開示されており、その教示は参照により本明細書に組み入れられる。

ポリペプチド(またはそのペプチド模倣体)と追加の治療剤は、同時にまたは連続して投与することが可能である。例えば、ポリペプチドを最初に投与し、続いて追加の治療剤を投与することができる。または、追加の治療剤を最初に投与し、続いて本発明のポリペプチドを投与することができる。場合によっては、本発明のポリペプチドと追加の治療剤を同じ製剤として投与する。他の場合には、ポリペプチドと追加の治療剤を異なる製剤として投与する。ポリペプチドと追加の治療剤を異なる製剤として投与する場合、それらの投与は同時であってもよいし、または連続的であってもよい。

VII. 薬学的製剤
本発明の方法を実行するために、1つまたは複数の本発明のポリペプチドまたはそのペプチド模倣体を、脂質異常症、高コレステロール血症、および炎症に関連する疾患または障害を有するか、または有するリスクがあると診断された個体(例えば、アテローム性動脈硬化の1つもしくは複数の症状を有するか、またはアテローム性動脈硬化のリスクがあると診断された個体)に投与する。ポリペプチドまたはそのペプチド模倣体は、その「天然」型で、または必要に応じて、例えば、塩、エステル、アミド、プロドラッグ、誘導体が薬理学的に適している、すなわち本発明の方法において有効であるという条件において、塩、エステル、アミド、プロドラッグ、誘導体等の形態で投与することが可能である。

本明細書に記載する方法の1つの態様において、投与経路は、経口、腹腔内、経皮、皮下、静脈内注射または筋肉注射によって、吸入によって、局所的な病巣内注入；リポソームによる送達；局所的、くも膜下腔内、歯肉ポケット、直腸、気管支内、経鼻、経粘膜、腸管、眼もしくは耳を介した送達、または当業者が容易に理解し得るような当技術分野で公知の任意の他の方法であってよい。本発明の組成物の他の態様は、非経口、経肺、経鼻、および経口を含む種々の投与経路のための粒子形態保護コーティング、プロテアーゼ阻害剤、または浸透増強剤を組み入れる。薬学的組成物は、投与の方法/様式に応じて、種々の単位剤形で投与することが可能である。適切な単位剤形には、散剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、ロゼンジ剤、坐剤、パッチ、経鼻スプレー、注射剤、埋め込み型徐放製剤等が含まれるが、これらに限定されない。

したがって、別の局面において、本発明は、本発明のポリペプチドまたはペプチド模倣体の薬学的有効量ならびに許容される担体および/または賦形剤を含む、薬学的組成物を提供する。薬学的に許容される担体には、生理的に適合し、かつ好ましくはポリペプチドまたはペプチド模倣体の活性を妨げないか、またはさもなくば阻害しない任意の溶媒、分散媒、またはコーティングが含まれる。好ましくは、担体は、静脈内投与、筋肉内投与、経口投与、腹腔内投与、経皮投与、局所投与、または皮下投与に適している。薬学的に許容される担体は、例えば組成物を安定化するか、または活性剤の吸収を増加もしくは低下させるように作用する1つまた複数の生理学的に許容される化合物を含み得る。生理的に許容される化合物には、例えば、グルコース、スクロース、もしくはデキストランなどの糖質、アスコルビン酸もしくはグルタチオンなどの抗酸化剤、キレート剤、低分子量タンパク質、活性剤のクリアランスもしくは加水分解を減少させる組成物、または賦形剤もしくは他の安定化剤および/もしくは緩衝剤が含まれ得る。

他の生理的に許容される化合物には、湿潤剤、乳化剤、分散剤、または特に微生物の増殖もしくは作用を防ぐために有用な保存剤が含まれるが、これらに限定されない。種々の保存剤が周知であり、これには、例えばフェノールおよびアスコルビン酸が含まれる。生理的に許容される化合物を含む薬学的に許容される担体の選択が、例えば、ポリペプチドまたはペプチド模倣体の投与経路、およびポリペプチドまたはペプチド模倣体の特定の生理化学的特性に依存することを、当業者は理解すると考えられる。

好ましい態様において、薬学的に許容される担体は生理的食塩水である。薬学的に許容される他の担体およびそれらの製剤は周知であり、一般的には、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Philadelphia, PA. Lippincott Williams and Wilkins, 2005に記載されている。薬学的に許容される種々の賦形剤は当技術分野で周知であり、例えば、Handbook of Pharmaceutical Excipients (5^th ed., Ed. Rowe et al., Pharmaceutical Press, Washington, D.C.)に記載されている。再度繰り返すが、薬学的組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、カプセル剤、錠剤、または他の適切な形態として製剤化することが可能である。活性成分は、作用標的部位に到達する前に環境によって不活化されないようにする物質でコーティングしてもよい。

特定の好ましい態様において、本発明のポリペプチドまたはペプチド摸倣体は、当業者に周知の標準的方法に従って、経口的に(例えば、錠剤により)または注射剤として投与することが可能である。他の好ましい態様において、ポリペプチドまたはペプチド模倣体は、従来の経皮的薬物送達システム、すなわち皮膚に貼る薬物送達装置となる層状構造内にポリペプチドまたはペプチド模倣体を典型的に含めた経皮「パッチ」を用いて、皮膚を通して送達することも可能である。そのような構造において、薬物組成物は典型的に、上部裏打ち層の下部にある、層または「貯蔵所」に含まれる。この場合の「貯蔵所」という用語は、皮膚表面への送達に最終的に利用できる一定量の「有効成分」を指すことが理解されよう。したがって、例えば、「貯蔵所」は、パッチの裏打ち層上の粘着剤内に、または当業者に公知の多種多様なマトリックス製剤のいずれかの内部に、有効成分を含んでもよい。パッチは単一の貯蔵所を含んでもよいし、または複数の貯蔵所を含んでもよい。

1つの態様において、貯蔵所は、薬物送達中に該システムを皮膚に貼るのに役立つ、薬学的に許容される接触粘着性物質のポリマーマトリックスを含む。適切な皮膚接触粘着性物質の例には、ポリエチレン、ポリシロキサン、ポリイソブチレン、ポリアクリル酸、ポリウレタン等が含まれるが、これらに限定されない。または、薬物を含有する貯蔵所と皮膚に接触する粘着剤は分離した別々の層として存在し、粘着剤は、この場合上記のようなポリマーマトリックスであってもよいし、または液体もしくはヒドロゲル貯蔵所であってもよいし、または何らかの他の形態をとってもよい貯蔵所の下部に存在する。これらの層の裏打ち層は、装置の上部表面として役立ち、好ましくは「パッチ」の主要な構造エレメントとして機能し、装置にその柔軟性の多くを提供する。裏打ち層に選択される物質は、好ましくは、活性薬剤および存在する任意の他の物質に対して実質的に非透過性である。

局所的な薬物送達のための他の好ましい製剤には、軟膏剤およびクリーム剤が含まれるが、これらに限定されない。軟膏剤は、典型的にワセリンまたは他の石油誘導体に基づく半固形の調製物である。選択した活性物質を含むクリーム剤は、典型的に粘稠な液体または半固形の乳濁液であり、多くの場合に水中油型または油中水型である。クリーム基剤は典型的に水洗性であり、油相、乳化剤、および水相を含む。油相は「内部」相と称される場合もあり、一般にワセリンおよびセチルアルコールまたはステアリルアルコールなどの脂肪族アルコールから構成され；水相は、必ずしもそうではないが通常は油相の容積を上回り、一般に湿潤剤を含む。クリーム製剤中の乳化剤は一般に、非イオン性、陰イオン性、陽イオン性、または両親媒性の界面活性剤である。使用する特定の軟膏またはクリーム基剤は、当業者によって理解されるように、最適な薬物送達を提供するものである。他の担体またはビヒクルと同様に、軟膏基剤も不活性で、安定で、非刺激性で、かつ非感作性であるべきである。

いくつかの態様では、埋め込み装置(例えば、溶出ステントを含む動脈および静脈ステント、ならびにカテーテル)を用いて、本発明のポリペプチドおよびペプチド模倣体を含む製剤を送達する。例えば、本発明のポリペプチドおよびペプチド模倣体を含む水溶液を、ステントおよびカテーテルを通して直接投与する。いくつかの態様では、ステントおよびカテーテルを、本明細書に記載するポリペプチドおよびペプチド模倣体を含む組成物でコーティングしてもよい。いくつかの態様において、ポリペプチドおよびペプチド模倣体は、持続放出製剤中に存在し、ステントから溶出される。適切なステントは、例えば、米国特許第6,827,735号；同第6,827,735号；同第6,827,732号；同第6,824,561号；同第6,821,549号；同第6,821,296号；同第6,821,291号；同第6,818,247号；同第6,818,016号；同第6,818,014号；同第6,818,013号；同第6,814,749号；同第6,811,566号；同第6,805,709号；同第6,805,707号；同第6,805,705号；同第6,805,704号；同第6,802,859号；同第6,802,857号；同第6,802,856号；および同第49 6,802,849号に記載されている。適切なカテーテルは、例えば、米国特許第6,829,497号；同第6,827,798号；同第6,827,730号；同第6,827,703号；同第6,824,554号；同第6,824,553号；同第6,824,551号；同第6,824,532号；および同第6,819,951号に記載されている。

典型的なポリペプチド製剤とは異なり、L型またはD型アミノ酸を含む本発明のポリペプチドは、胃酸等によるタンパク質分解に対して保護することなく、経口でも投与することが可能である。それにもかかわらず、特定の態様において、ポリペプチド送達は、保護的な賦形剤を用いることによって強化され得る。これは典型的に、酸加水分解および酵素加水分解に対する耐性を付与する組成物とポリペプチドを複合体化することによって、またはリポソームなどの適切な耐性のある担体中にポリペプチドを内包することによってのいずれかで達成される。経口送達のためにポリペプチドを保護する手段は、当技術分野で周知である(例えば、治療剤を経口送達するための脂質組成物について記載している米国特許第5,391,377号を参照されたい)。

血清半減期の延長は、徐放性ポリペプチド「内包」システムを用いることによって維持することが可能である。そのような徐放システムは当業者に周知である。1つの好ましい態様では、タンパク質およびポリペプチドのProLease生分解性ミクロスフェア送達システムを使用するが(Tracy, Biotechnol. Prog., 14:108 (1998)；Jonson et al., Nature Med., 2:795 (1996)；Herbert et al., Pharmaceut. Res., 15:357 (1998))、これは、他の剤と共にまたは他の剤なしで乾燥製剤として配合することができるポリマーマトリックス中にポリペプチドを含む生分解性ポリマーミクロスフェアから構成される乾燥粉末の使用を含む。

ProLeaseミクロスフェア製造工程は、タンパク質の完全性を維持しながら高いポリペプチド封入効率を達成できるように設計された。この工程は、(i) 薬物溶液を、安定化させる賦形剤と共に噴霧凍結乾燥させることによって、原料ポリペプチドから凍結乾燥タンパク質粒子を調製すること；(ii) 薬物-ポリマー懸濁液を調製し、続いて超音波処理またはホモジナイズ処理により薬物粒径を小さくすること；(iii) 液体窒素中に噴霧することによって、凍結薬物-ポリマーミクロスフェアを製造すること；(iv) エタノールでポリマー溶媒を抽出すること；および(v) ろ過および真空乾燥によって、最終的な乾燥粉末生成物を製造することからなる。得られた粉末は、多孔質ポリマー粒子内に均一かつ強固に分散された固形のポリペプチドを含む。この工程で最も一般的に使用されるポリマーであるポリ(ラクチド-コ-グリコリド)(PLG)は、生体適合性でありかつ生分解性である。

封入は、低温(例えば、-40℃)で達成することが可能である。封入の間は、ポリペプチドを水の非存在下で固体状態で維持し、それにより水によって誘発されるポリペプチドの立体構造の可動性を最小限に抑え、反応物として水を含むポリペプチド分解反応を妨げ、さらにポリペプチドが変性を受け得る有機相-水相界面を回避する。好ましい工程では、その中で大部分のポリペプチドが不溶性である溶媒を使用し、したがって高い封入効率(例えば、95%超)が得られる。

別の態様では、溶液の1つまたは複数の成分を、例えば、希釈用に準備した(例えば、予め測定した容積の)保存容器中に、または一定の容積の水を添加できるように準備した可溶性カプセル中に、「濃縮物」として提供することができる。

本発明の特定の態様において、薬学的組成物は徐放性製剤である。本発明のポリペプチドまたはペプチド模倣体を、周辺環境への共重合体の放出速度を制御する、生物学的に適合性のあるポリマーまたはマトリックスと混合することができる。制御放出性または徐放性の組成物には、親油性デポー(例えば、脂肪酸、ワックス、油)としての製剤が含まれる。ポリマー(例えば、ポロキサマーまたはポロキサミン)でコーティングした粒子状組成物も、本発明によって意図される。本発明の組成物の他の態様は、非経口、経肺、経鼻、および経口を含む種々の投与経路のための粒子形態、保護コーティング、プロテアーゼ阻害剤、または浸透増強剤を組み入れる。許容される担体には、カルボキシメチルセルロース(CMC)および修飾されたCMCが含まれる。

本発明の薬学的組成物は、好ましくは送達時に無菌でかつ非発熱性であり、好ましくは製造および貯蔵の状況下で安定である。これらの薬学的組成物は、従来の周知の滅菌技法によって滅菌することが可能である。

治療適用においては、本発明の組成物を、脂質異常症、高コレステロール血症、および炎症に関連する疾患または障害を有するか、または有するリスクがあると診断された個体に(好ましい態様においては、アテローム性動脈硬化の1つもしくは複数の症状を有するか、またはアテローム性動脈硬化のリスクがあると診断された個体に)、疾患、状態、および/またはその合併症を、治癒させるかまたは少なくとも部分的に予防するかもしくは停止させるために十分な量で投与する。これを達成するのに適した量を、「治療有効用量」と定義する。この使用に有効な量は、疾患の重篤度および患者の健康の全般的状態に依存する。患者に必要とされかつ許容される投与量および頻度に応じて、組成物の単回または複数回投与を行うことができる。いずれの場合にも、組成物は、個体または患者を効果的に治療する(1つまたは複数の症状を改善する)ために十分な量の、本発明の製剤の活性剤、すなわちポリペプチドまたはペプチド模倣体を提供する。

ポリペプチドまたはペプチド模倣体の濃度は大きく異なる可能性があり、選択される特定の投与様式および患者の必要性に従って、主に液量、粘度、体重、ポリペプチドの循環血漿レベル、ポリペプチドの毒性、疾患(例えば、アテローム性動脈硬化)の進行、ポリペプチドに特異的に結合する抗体の産生等に基づいて選択する。典型的に、ポリペプチドまたはペプチド模倣体の用量当量は、約0.1〜約50 mg/kg体重、好ましくは約1〜約25 mg/kg体重、最も好ましくは約1〜約20 mg/kg体重である。そのような投与量は、特定の対象または対象群における治療計画を最適化するように変更できることが理解されると考えられる。

投与に際しては、患者の体重および健康全般に適用して、ポリペプチドのLD50および種々の濃度のポリペプチドの副作用によって決定された速度で、本発明のポリペプチドを投与することができる。投与は、単回用量または分割用量、例えば一定期間(例えば、2日、3日、4日、5日、6日、もしくは1〜3週間、またはそれ以上)に定期的に(例えば、毎日)投与する用量によって、達成することが可能である。

本明細書に示すように、本発明のポリペプチドまたはペプチド模倣体は、いくつかの異なる方法で修飾することが可能である。例えば、構成アミノ酸および/または末端アミノ酸上のR基を保護基によってブロックする、すなわち保護するように、ポリペプチドを修飾することが可能である。特にアミノ末端および/またはカルボキシ末端のブロックにより、経口送達を大きく向上させることができ、血清半減期を延長させることが見出されている。加えて、インビボでの送達および/または生物活性を向上させるために、合成有機化学分野の当業者に公知であり、例えば、March (1992) Advanced Organic Chemistry; Reactions, Mechanisms and Structure, 4th Ed. N.Y. Wiley-Interscienceによって記載されている標準的な手順を用いて、本発明のポリペプチドまたはペプチド模倣体の塩、エステル、アミド、プロドラッグ、および他の誘導体を調製することができる。

例えば酸付加塩は、典型的に適切な酸との反応を伴う従来の方法論を用いて遊離塩基から調製される。一般に、塩基形態の薬物をメタノールまたはエタノールなどの極性有機溶媒に溶解し、それに酸を付加する。生じた塩は沈澱するか、またはより極性の小さい溶媒を添加して溶液から取り出してもよい。酸付加塩の調製に適した酸には、有機酸、例えば酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、サリチル酸等、ならびに無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の両方が含まれる。酸付加塩は、適切な塩基で処理することによって遊離塩基に再変換することができる。本明細書に記載するポリペプチドの特に好ましい酸付加塩は、塩酸または臭化水素酸を用いて調製できるようなハロゲン化塩である。反対に、本発明のポリペプチドまたはペプチド模倣体の塩基性塩調製物は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、トリメチルアミン等の薬学的に許容される塩基を用いて、同様の様式で調製する。特に好ましい塩基性塩には、アルカリ金属塩、例えばナトリウム塩、および銅塩が含まれる。

エステルの調製は典型的に、本発明のポリペプチドまたはペプチド模倣体内に存在し得るヒドロキシル基および/またはカルボキシル基の官能化を伴う。エステルは、典型的に、遊離アルコール基のアシル置換誘導体、すなわち、式中Rがアルキル、かつ好ましくは低級アルキルである、式RCOOHのカルボン酸から誘導される部分である。エステルは、必要に応じて、従来の水素化分解または加水分解手順を用いることによって、遊離酸に再変換することが可能である。

アミドおよびプロドラッグも、当業者に公知であるか、または関連文献に記載されている技法を用いて調製することができる。例えば、アミドは、適切なアミン反応物を用いてエステルから調製してもよく、またはアンモニアもしくは低級アルキルアミンとの反応によって無水物もしくは酸塩化物から調製してもよい。プロドラッグは典型的に、個体の代謝システムによって修飾されるまで治療的に不活性である化合物を生じる部分を共有結合することにより調製される。

前述の製剤化および投与方法は明らかに説明を意図するものであって、決して限定するものではない。本明細書に提供する教示を用いて、他の適切な製剤化および投与様式を容易に考案できることが理解されると考えられる。

VIII.脂質ベースの製剤
別の局面では、本発明のポリペプチドおよびペプチド模倣体を1つまたは複数の脂質と併用して投与することが好ましい。脂質は、ポリペプチドまたはペプチド模倣体を保護する、および/もしくはその輸送/取り込みを強化するための賦形剤として製剤化することもでき、または別々に投与することも可能である。

脂質は、リポソーム、ナノカプセル、微粒子、ミクロスフェア、脂質粒子、脂質小胞等に製剤化することが可能である。そのような脂質製剤を用いて、本発明のポリペプチドおよびペプチド模倣体を封入することができ、かつ/または脂質製剤をそのようなポリペプチドおよびペプチド模倣体と単純に複合体化/混合することができる。当業者は、本発明のポリペプチドまたはペプチド模倣体を封入するか、またはそれらと複合体化するためにそのような脂質製剤を使用する方法を知っていると考えられる。例えば、リポソームの形成および使用は、当業者に一般に公知である。近年、血清安定性および循環半減期が改善されたリポソームが開発された(米国特許第5,741,516号を参照されたい)。さらに、潜在的な薬物担体としてのリポソームおよびリポソーム様調製物の種々の方法が概説されている(米国特許第5,567,434号；同第5,552,157号；同第5,565,213号；同第5,738,868号、および同第5,795,587号を参照されたい)。

1つの態様では、本発明のポリペプチドまたはペプチド模倣体を、その教示が参照により本明細書に組み入れられる、2005年6月30日に公開された米国特許出願公開第2005/0142180号に開示されている様式と同様の様式で、リン脂質(例えば、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロール-ホスファチジルコリン(「POPC」))などの脂質と複合体化する。本発明のポリペプチドおよびペプチド模倣体を、例えばPOPCと、約1:0.5〜約1:5(ポリペプチド:POPC)の比率で複合体化した場合に、約5〜約20 nmのサイズを有する明白な脂質-ポリペプチド粒子が形成され、細胞からコレステロールを流出させる能力(capacity)、すなわち能力(ability)が有意に向上することが、驚くべきことに見出された。

したがって、本発明は、細胞からコレステロールを流出させる能力が増加したポリペプチド-脂質複合体(または代わりに、ペプチド模倣体-脂質複合体)を提供する。典型的には、投与前に脂質をポリペプチドと混合する。本発明のポリペプチドと脂質を適切な比率で水溶液中に混合することができ、これらに限定されないが、凍結乾燥、界面活性剤による可溶化とそれに続く透析、微少溶液操作、超音波処理、およびホモジナイズ処理を含む、当技術分野で公知の方法により複合体化することができる。複合体化効率は、例えば、圧力、超音波周波数、または界面活性剤濃度を変化させることにより、最適化することが可能である。ポリペプチド-脂質複合体を調製するために一般的に使用される界面活性剤の例は、コール酸ナトリウムである。

特定の態様において、ポリペプチド-脂質(例えば、リン脂質)複合体は、適切な薬学的希釈剤または薬学的担体と共に溶液中に存在し得る。他の態様では、ポリペプチド-脂質複合体の凍結乾燥(freeze-dried)または凍結乾燥(lyophilized)調製物を、投与前に、適切な薬学的希釈剤で水和させるか、または再構成することができる。別の態様において、ポリペプチド-脂質複合体は凍結調製物であってよく、これは、均一な溶液が得られるまで融解してから、それを必要とする対象に投与する。

脂質は、当業者に公知である任意の適切な脂質であり得る。1つの態様では、非リン含有脂質を使用することができ、これには、ステアリルアミン、ドデシルアミン、アセチルパルミテート、(1,3)-D-マンノシル-(1,3)ジグリセリド、アミノフェニルグリコシド、3-コレステリル-6'-(グリコシルチオ)ヘキシルエーテル糖脂質、N-(2,3-ジ(9-(Z)-オクタデセニルオキシ))-プロパ-1-イル-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロライド、および脂肪酸アミドが含まれる。

別の態様では、リン脂質またはリン脂質の混合物を使用する。適切なリン脂質には、これらに限定されないが、低分子アルキル鎖リン脂質、ホスファチジルコリン、卵ホスファチジルコリン、大豆ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、大豆ホスファチジルグリセロール、卵ホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジラウリルホスファチジルコリン、1-ミリストイル-2-パルミトイルホスファチジルコリン、1-パルミトイル-2-ミリストイルホスファチジルコリン、1-パルミトイル-2-ステアロイルホスファチジルコリン、1-ステアロイル-2-パルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、1-パルミトイル-2-オレオイルホスファチジルコリン、1-オレオイル-2-パルミチルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジラウロイルホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ジホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ジミリストイルホスファチジン酸、ジパルミトイルホスファチジン酸、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、脳ホスファチジルセリン、スフィンゴミエリン、スフィンゴ脂質、脳スフィンゴミエリン、ジパルミトイルスフィンゴミエリン、ジステアロイルスフィンゴミエリン、ガラクトセレブロシド、ガングリオシド、セレブロシド、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ケファリン、カルジオリピン、ジセチルホスファート、ジステアロイル-ホスファチジルエタノールアミン、ならびにコレステロールおよびその誘導体が含まれる。同様に、リン脂質は、前述のリン脂質のいずれかの誘導体もしくは類似体、またはやはり前述のリン脂質のいずれかの2つもしくは複数の混合物であってもよい。そのようなリン脂質は、商業的供給元、天然の供給源から、または当業者に公知の合成もしくは半合成手段によって得ることが可能である。

好ましい態様において、ポリペプチド-脂質複合体はポリペプチド-リン脂質複合体である。より好ましい態様において、脂質は、1-パルミトイル-2-オレオイルホスファチジルコリン(「POPC」)または(「1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリン」)である。

本発明のポリペプチドおよび脂質、好ましくはリン脂質を含む複合体は、複合体がコレステロール流出を媒介し、ひいてはそれと関連する疾患または症状を治療するのに効果的であるという条件で、任意の量の脂質および任意の量のポリペプチドを含み得ることが、当業者によって容易に理解されると考えられる。前述した通り、本発明のポリペプチドを、例えばPOPCと約1:0.5〜約1:5(ポリペプチド：POPC)の比率で複合体化した場合に、約5〜約20 nmのサイズを有する明白な脂質-ポリペプチド粒子が形成され、細胞からコレステロールを流出させる能力(capacity)、すなわち能力(ability)が有意に向上することが、驚くべきことに見出された。しかし、本発明のポリペプチド-脂質複合体は、約100:1、約10:1、約5:1、約3:1、約2:1、約1:1、約1:2、約1:3、約1:5、約1:10、および約1:100(ポリペプチド重量/脂質重量)など、リン脂質対ポリペプチドの他の比率の複合体を含み得る。

本発明のポリペプチド-脂質複合体は、当業者に公知の任意の方法により作製することができる。場合によっては、投与の前に脂質とポリペプチドを混合することが望ましい。脂質は、溶液中に存在してもよいし、またはホモジナイズ処理、超音波処理、もしくは押し出しなどの標準的な技法を使用して形成されたリポソームもしくは乳濁液の形態であってもよい。超音波処理は一般に、氷浴中で、Bransonチップソニファイアーなどのチップソニファイアーを用いて行う。典型的には、懸濁液を数回の超音波処理サイクルに供す。押し出しは、Lipex Biomembrane Extruder(商標)(Lipex Biomembrane Extruder, Inc. カナダ、バンクーバー)などの生体膜押し出し機により行うことができる。押し出しフィルターにおける規定の孔径により、特定のサイズの単層リポソーム小胞を生成することができる。リポソームは、Norton Company、マサチューセッツ州、ウースターから市販されているCeraflow Microfilter(商標)などの非対称セラミックフィルター、またはポリカーボネートフィルターまたは当業者に公知の他の種類のポリマー材料(すなわち、プラスチック)を通す押し出しによって形成することも可能である。

前述の通り、本発明のポリペプチド-脂質複合体は、小胞、リポソーム、またはプロテオリポソームを含むがこれらに限定されない、種々の形態で調製することが可能である。当業者に周知の種々の方法を使用して、ポリペプチド-脂質複合体を調製することができる。リポソームまたはプロテオリポソームを調製するために利用可能ないくつかの技法を用いることができる。例えば、本発明のポリペプチド(例えば、3NOS:1〜30のポリペプチド、例えばSEQ ID NO:1〜26または31〜33のポリペプチド)を、適切な脂質と共に同時に超音波処理して(浴またはプローブ超音波処理器を使用)、ポリペプチド-脂質複合体を形成することができる。特定の態様では、ポリペプチドを予め形成された脂質小胞と混合し、結果としてポリペプチド-脂質複合体を自発的に形成させることができる。別の態様では、界面活性剤透析法によって、ポリペプチド-脂質複合体を作製することもできる。この方法では、ポリペプチド、脂質、およびコール酸ナトリウムなどの界面活性剤の混合物を透析して界面活性剤を除去し、再構成してポリペプチド-脂質複合体を作製することができる(例えば、Jonas et al., Methods Enzymol., 128:553-82 (1986)を参照されたい)。

他の態様では、米国特許第6,287,590号および同第6,455,088号に記載されているような同時凍結乾燥によって、ポリペプチド-脂質複合体を作製することができ、いずれの教示も全体として参照により本明細書に組み入れられる。他の方法は、例えば、米国特許第6,004,925号、同第6,037,323号、および同第6,046,166号によって開示されており、いずれの教示も全体として参照により本明細書に組み入れられる。ポリペプチド-脂質複合体を調製する他の方法は、当業者に明らかである。

1つの好ましい態様において、ポリペプチド-脂質複合体はホモジナイズ処理によって作製することができる。

さらなる局面において、本発明は、本発明のポリペプチドを含む合成脂質粒子を提供する。そのような粒子は、治療剤または診断剤を送達するために用いることができる。いくつかの態様において、本発明のポリペプチドは合成LDL粒子の成分である。他の態様において、本発明のポリペプチドは合成HDL粒子の成分である。いくつかの態様において、粒子は直径約500 nm未満であるか、または直径約200 nm未満である。他の態様において、粒子は直径約80 nm未満である。いくつかの態様において、粒子は直径約25 nm未満である。そのような粒子を作製する方法は、当技術分野で公知である(例えば、米国特許出願公開第20040229794号および同第20070167351号、ならびにそれらに記載されている参考文献を参照されたい)。

いくつかの態様において、合成脂質粒子は、感染症を治療するための抗生物質または薬物を含む。そのような剤は、抗生剤または抗微生物剤(例えば、抗菌剤、抗真菌剤、および抗ウイルス剤)を含み得る。

さらなる態様において、本発明のペプチドを含む合成脂質粒子は、癌の治療もしくは診断のための剤、または神経系障害の治療のための剤を含む。例えば、本明細書に記載のペプチドを含む合成粒子を、腫瘍の治療もしくは診断のために、または血液細胞癌の治療もしくは診断のために投与することができる。腫瘍には癌腫および肉腫が含まれる。治療することができる例示的な癌には、腎臓、乳房、肺、膀胱、結腸、卵巣、前立腺、膵臓、胃、脳、頭頸部、皮膚の癌、子宮癌、精巣癌、神経膠腫、食道癌、および肝癌が含まれる。血液細胞癌には、B急性リンパ芽球性白血病、非ホジキンリンパ腫(例えば、バーキット、小細胞型、および大細胞型リンパ腫)およびホジキンリンパ腫、白血病(AML、ALL、およびCMLを含む)、多発性骨髄腫、マントル細胞リンパ腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ならびにフィラデルフィア陽性癌が含まれる。

いくつかの態様において、本発明の合成脂質粒子は、中枢神経系の疾患を治療するために用いられる。いくつかの態様において、中枢神経系の疾患は、脳卒中、癲癇、頭部外傷、ウイルス感染症(例えば、HIV関連認知機能障害、ピコルナウイルス、トガウイルス、ヘルペスウイルス パラミクソウイルス、およびアレナウイルスによる髄膜炎)、細菌感染症(例えば、クリプトコッカス髄膜炎および劇症型細菌性髄膜炎などの髄膜炎、神経結核症、トキソプラズマ症、ならびに神経梅毒)、真菌、リケッチア、原虫、または蠕虫感染症、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、および脳の遺伝性代謝疾患からなる群より選択される。

そのような合成粒子は、患者に全身投与または局所投与することができる。

いくつかの態様においては、粒子中に取り込む本発明のペプチドを標的化成分、例えば細胞表面受容体に結合するペプチドに結合させて、該粒子を関心対象の細胞に指向する。

当業者によって認識されるように、本発明の別の局面では、本明細書に記載するペプチドを、脂質を含み得ない粒子の製剤化において用いることもでき、これもまた上記した通りに診断剤または治療剤の送達に用いることができる。脂質ベースでなくてよい粒子の例は、例えば米国特許出願公開第20070128290号および第20050238725号、ならびにそれらに記載されている参考文献に記載されている。例えば、本発明のペプチドは、治療的にまたは診断的に活性のある剤を含む粒子に吸収されるか、またはその表面と会合している水溶性成分として使用してよい。そのような粒子は一般に、直径約1000 nmもしくは500 nm未満であるか、または直径約200 nm未満である。他の態様において、粒子は直径約80 nm未満である。いくつかの態様において、粒子は直径約25 nm未満である。

IX. 核酸および遺伝子治療
別の態様において、本発明は、本明細書に開示するポリペプチドをコードする単離された核酸、該核酸を含む発現ベクター、および該発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。より詳細には、本発明は、1分子単位当たりで全長アポリポタンパク質と同様のコレステロール流出活性を有し、かつ全長アポリポタンパク質と同様の様式でABCA1に対する高い選択性を有する本発明のポリペプチドをコードする単離された核酸を提供し、このポリペプチドには、SEQ ID NO:1〜33を含むアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。

特定の態様では、本発明のポリペプチドをコードする核酸を、インビトロおよびインビボにおける細胞のトランスフェクションに使用する。これらの核酸を、後述するように、標的の細胞および生物にトランスフェクションするためのいくつかの周知のベクターのいずれにも挿入することができる。核酸は、ベクターと標的細胞の相互作用により、エクスビボまたはインビボで細胞にトランスフェクションされる。核酸は次いで、プロモーターの制御下で、本発明のポリペプチドを発現し、それによって脂質異常症、高コレステロール血症、および炎症に関連する疾患の影響を緩和する。

そのような遺伝子治療手順は、後天性および遺伝性の遺伝子欠損、癌、ならびに他の疾患を、いくつかの状況下で正すために使用されている。ヒトにおいて人工遺伝子を発現させる能力により、他の治療法による治療に応答しない多くの疾患を含む、多くの重要なヒト疾患の予防および/または治癒が促進される(遺伝子治療手順の総説に関しては、Anderson, Science, 256:808-813 (1992)；Nabel et al., TIBTECH, 11:211-217 (1993)；Mitani et al., TIBTECH, 11:162-166 (1993)；Mulligan, Science, 926-932 (1993)；Dillon, TIBTECH, 11:167-175 (1993)；Miller, Nature, 357:455-460 (1992)；Van Brunt, Biotechnology, 6(10):l149-1154 (1998)；Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience, 8:35-36 (1995)；Kremer et al., British Medical Bulletin, 51(1):31-44 (1995)；Haddada et al., in Current Topics in Microbiology and Immunology (DoerflerおよびBohm eds., 1995)；およびYu et al., Gene Therapy, 1:13-26 (1994)を参照されたい)。

核酸の送達には、ウイルスベクターを使用することができる。適切なベクターには、例えば、Lilley et al., Curr. Gene Ther., 1(4):339-58 (2001)に記載されているような単純ヘルペスウイルスベクター、例えばPolo et al., Dev. Biol. (Basel), 104:181-5(2000)に記載されているようなアルファウイルスDNAおよび粒子レプリコン、例えばMazda, Curr. Gene Ther., 2(3):379-92 (2002)に記載されているようなエプスタイン・バーウイルス(EBV)ベースのプラスミドベクター、例えばOtomo et al., J. Gene Med., 3(4):345-52 (2001)に記載されているようなEBVレプリコンベクターシステム、例えばGao et al., PNAS USA., 99(18):11854 (2002)に記載されているようなアカゲザル由来のアデノウイルス随伴ウイルス、例えばNicklin et al., Curr. Gene Ther., 2(3):273-93 (2002)に記載されているようなアデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスベクターが含まれる。他の適切なアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターシステムは、当技術分野で周知の技法を用いて容易に構築することができる(例えば、米国特許第5,173,414号および同第5,139,941号；PCT公報 国際公開公報第92/01070号および同第93/03769号；Lebkowski et al., Mol. Cell. Biol., 8:3988-3996 (1988)；Vincent et al. (1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Carter, Current Opinion in Biotechnology 3:533-539 (1992)；Muzyczka, Current Topics in Microbiol, and Immunol, 158:97-129 (1992)；Kotin, Human Gene Therapy, 5:793-801 (1994)；Shelling et al., Gene Therapy, 1:165-169 (1994)；およびZhou et al., J. Exp. Med., 179:1867-1875 (1994)を参照されたい)。さらなる適切なベクターには、例えばKim et al., Cancer Gene Ther., 9(9):725-36 (2002)に記載されているE1B遺伝子減弱型複製アデノウイルス、および例えばPascual et al., J. Immunol., 160(9):4465-72 (1998)に記載されている非複製アデノウイルスベクターが含まれる。例示的なベクターは、Okayama et al., Mol. Cell. Biol., 3:280 (1983)によって開示されている通りに構築することができる。

Michael et al., J. Biol. Chem., 268:6866-6869 (1993)、およびWagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:6099-6103 (1992)に記載されているアデノウイルスキメラベクターなどの分子結合体ベクターも、本発明の方法に従って遺伝子送達に使用することができる。

1つの例証的態様では、レトロウイルスが遺伝子送達システムの簡便かつ効率的な基盤を提供する。本発明のポリペプチドをコードする選択されたヌクレオチド配列を、当技術分野で公知の技法を用いてベクターに挿入し、レトロウイルス粒子にパッケージングする。その後組換えウイルスを単離し、対象に送達することができる。適切なベクターには、例えばScherr et al., Curr. Gene Ther., 2(1):45-55 (2002)に記載されているような、レンチウイルスベクターが含まれる。さらなる例証的なレトロウイルスシステムが記載されている(例えば、米国特許第5,219,740号；Miller et al., BioTechniques, 7:980-990 (1989)；Miller, Human Gene Therapy, 1:5-14 (1990)；Scarpa et al., Virology, 180:849-852 (1991)；Burns et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90:8033-8037 (1993)；およびBoris-Lawrie et al., Curr. Opin. Genet. Develop., 3:102-109 (1993))。

他の公知のウイルスベースの送達システムは、例えば、Fisher-Hoch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:317-321 (1989)；Flexner et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 569:86-103 (1989)；Flexner et al., Vaccine, 8:17-21 (1990)；米国特許第第4,603,112号、同第4,769,330号、および同第5,017,487号；国際公開公報第89/01973号；米国特許第4,777,127号；GB 2,200,651；EP 0,345,242；国際公開公報第91/02805号；Berkner, Biotechniques, 6:616-627 (1988)；Rosenfeld et al., Science, 252:431-434 (1991)；Kolls et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:215-219 (1994)；Kass-Eisler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:11498-11502 (1993)；Guzman et al., Circulation, 88:2838-2848 (1993)；Guzman et al., Cir. Res., 73:1202-1207 (1993)；およびLotze et al., Cancer Gene Ther., 9(8):692-9 (2002)に記載されている。

X. 研究手段としてのおよび診断方法における使用
本発明のポリペプチドおよびペプチド模倣体は、研究手段としても有用である。例えば、特にポリペプチドまたはそのペプチド模倣体を、検出可能な部分、例えば放射性標識、蛍光標識等で標識した場合には、動物および動物モデルにおけるリポタンパク質-受容体相互作用を調べるために、本発明のポリペプチドまたはペプチド模倣体を使用することができる。加えて、本発明のポリペプチドを使用して、脂質代謝経路を解明するのに適した動物モデルを同定することもできる。例えば、ポリペプチドを使用して、脂質の過酸化がアテローム性動脈硬化の進行に寄与する動物モデルを同定することができる。さらに、本発明のポリペプチドを使用して、他の化合物(例えばポリペプチド変種および他のペプチド模倣体を含む)の抗アテローム性動脈硬化能を評価することもできる。

場合によっては、本発明のポリペプチドまたはペプチド模倣体を使用して、ABCAを発現する細胞および組織に対して治療剤を標的化する。

他の態様では、本発明のポリペプチドまたはペプチド模倣体を、異常なコレステロール流出、またはABCAと関連した疾患および障害を診断する方法において使用することができる。例えば、コレステロール逆転送欠損を診断するための、およびペプチド治療に対して応答すると予測される個体を同定するためのアッセイにおいて、該ペプチドを使用することができる。そのような診断アッセイ法には、インビトロアッセイ法が含まれる。例えば、本発明のポリペプチド、例えばNO:1〜33のいずれか1つを対象由来の血漿と混合し、細胞に曝露するアッセイ法においてコレステロール流出を評価して、対象が治療に対して応答するかどうかを示すことができる(例えば、ペプチドの非存在下における血漿媒介性流出と比較して、ペプチドの存在下における流出が大きく増加することにより、対象が応答性であることが示唆される)。同様に、本発明のポリペプチド、例えばSEQ ID NO:1〜33のいずれか1つを対象由来の血漿と混合して、該ペプチドの存在下におけるHDLサブクラス分布の変化を検出すること、および/または血漿の抗酸化特性の変化を検出することができる。

いくつかの態様では、ポリペプチドまたはペプチド模倣体をインビボ画像化法に使用する。ポリペプチドまたはペプチド模倣体を検出可能な部分に結合させ、対象(例えば、ヒトなどの哺乳動物)に投与する。検出可能な部分を検出することで、例えばアテローム性動脈硬化病変またはアミロイド斑を含む、関心対象の細胞、組織、または器官の画像化が可能になる。

「画像化」という用語は、本明細書に記載するような、または当業者に公知の、検出可能な部分の画像をインビボ、エクスビボ、またはインビトロで作製するための手順または様式を指す。画像化様式の例には、磁気共鳴、核磁気共鳴、放射性シンチグラフィー、陽電子放出断層撮影、コンピュータ断層撮影、近赤外蛍光、X線、超音波、紫外線、または可視光が含まれるが、これらに限定されない(例えば、Dahnhert, Radiology Review Manual (4th ed. 1999)；Brant et al., Fundamentals of Diagnostic Radiobiology (2nd ed. 1999)；Weissleder et al., Primer of Diagnostic Imaging (2nd ed. 1997)；Buddinger et al., Medical Magnetic Resonance A Primer, Society of Magnetic Resonance, Inc. (1988)；およびWeissleder et al., Nature Biotech., 17:375-378 (1999)を参照されたい)。

本明細書で使用する「検出可能な部分」という語句は、本明細書に記載する、または当業者に公知の手順または様式によって、インビボ、エクスビボ、またはインビトロで画像化および/または標識できる部分または標識を指す。本明細書で使用する場合、検出可能な部分を、本発明のポリペプチドまたはペプチド模倣体に直接または間接的に連結することができる。リンカーは、ポリペプチドまたはペプチド模倣体を1つの検出可能な部分に連結するのに役立ち得る。あるいは、リンカーは、2つ以上の検出可能な部分にポリペプチドを連結させてもよい。同様に、検出可能な部分を2つ以上のリンカーに連結させてもよい。1つのポリペプチドに複数の検出可能な部分を結合させて使用することにより、検出可能な部分の検出能を増加させることができ(例えば、その放射線不透過性、エコー輝度、または緩和能の増加による)、または代わりにポリペプチドを2つ以上の画像化様式で検出することが可能になる。

本発明のポリペプチドまたはペプチド模倣体への検出可能な部分の連結は、通常、検出可能な部分、リンカー、および/またはポリペプチド上に位置する1つまたは複数の官能基との相互作用を含む、共有結合手段または非共有結合手段によって達成してもよい。この目的に使用することができる化学反応性官能基の例には、アミノ基、ヒロドキシル基、スルフヒドリル基、カルボキシル基、およびカルボニル基、ならびに糖質基、隣接ジオール、チオエーテル、2-アミノアルコール、2-アミノチオール、グアニジニル基、イミダゾリル基、およびフェノール基が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様では、例えば、生分解性であるかもしくは化学的感受性である、または酵素切断部位を組み入れたスペーサーアームを含む、不安定な連結を使用する。リンカーの種類は、本発明の重要な局面ではない。適切な期間にわたって、すなわちポリペプチドが所望の標的に到達し、検出されるのに十分な期間にわたって、ポリペプチドまたはペプチド模倣体および検出可能な部分と共に結合する限り、当技術分野で公知の任意のリンカーを使用することができる。

本発明の方法で使用する検出可能な部分は、本明細書に記載する、または当業者に公知の画像化手順において、直接または間接的に検出可能な任意の部分であってよい。例えば、以下の検出可能な部分を使用することができる：検出可能な放射線を放射するか、または放射するようにされ得る部分(例えば、放射性崩壊、蛍光励起、スピン共鳴励起等による）、局所的な電磁場に影響を及ぼす部分(例えば、常磁性、超常磁性、フェリ磁性、または強磁性種）、放射エネルギーを吸収または散乱する部分(例えば、発色団、粒子(気体または液体含有小胞を含む)、重元素およびその化合物等)、および検出可能な物質を生成する部分(例えば、気体微小気泡発生剤)。

画像化様式によって検出可能な非常に広範囲の物質が当技術分野で公知であり、検出可能な部分は、使用する画像化様式に従って選択される。したがって、例えば、超音波画像化には、通常、エコー源性物質またはエコー源性物質を発生し得る物質が選択され；X線画像化については、検出可能な部分は一般に重原子(例えば、原子量38またはそれ以上のもの)であるか、または重原子を含み；MR画像化については、検出可能な部分は、核スピンがゼロでない同位体(¹⁹Fなど)、または不対電子スピンを有し、よって常磁性、超常磁性、フェリ磁性、または強磁性特性を有する物質であり；光画像化については、検出可能な部分は光散乱体(例えば、着色または非着色粒子)、光吸収体、または発光体であり；磁気測定画像化については、検出可能な部分は検出可能な磁気特性を有し；電気インピーダンス画像化については、検出可能な部分は電気インピーダンスに影響を及ぼし；またシンチグラフィー、SPECT、PET等については、検出可能な部分は放射性核種である。

画像診断の文献で周知である適切な検出可能な部分の例には、例えば、磁性酸化鉄粒子、気体含有小胞、キレート化された常磁性金属(Gd、Dy、Mn、Fe等)(例えば、米国特許第5,228,446号；同第4,647,447号；同第4,863,715号；同第4,770,183号；および同第5,387,080号；PCT公報 国際公開公報第97/25073号、同第96/09840号、同第85/02772号、同第92/17212号、同第97/29783号、同第91/15243号、同第93/05818号、同第96/23524号、同第95/26205号、および同第96/17628号；EP-A-554213；ならびにGB 9624918.0を参照されたい)；PCT公報 国際公開公報第91/14460号、同第89/00557号、同第92/17215号、同第96/40287号、および同第96/22914号；ならびに米国特許第4,647,447号、同第5,367,080号、および同第5,364,613号に記載されているような金属放射性核種、常磁性金属イオン、蛍光金属イオン、重金属イオン、およびクラスターイオン；例えば¹²³I、¹³¹I、および¹⁸Fなどの非金属原子部分、ならびにIなどの重原子；Matsuoka, Topics in Applied Chemistry: Infrared absorbing dyes (1990)；Waring et al., Topics in Applied Chemistry: The Chemistry and Application of Dyes (1990)；「Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals」 Haugland, Molecular Probes Inc, 1996、DE-A-4445065、DE-A-4326466、JP-A-3/228046、Narayanan et al., J. Org. Chem., 60:2391-2395 (1995)、Lipowska et al., Heterocyclic Comm., 1:427-430 (1995)、Fabian et al., Chem. Rev., 92:1197 (1992)；PCT公報 国際公開公報第96/23525号：Strekowska et al.,. J. Org. Chem., 57:4578-4580 (1992)；およびPCT公報 国際公開公報第96/17628号に記載されているような有機の発色団またはフルオロフォア部分；Waring and Hallas, The Chemistry and Application of Dyes, Topics in Applied Chemistry (1990)；Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (6th ed. 1996)に記載されているような可視色素が含まれる。

リガンドに結合している検出可能な部分を検出するのに適している画像化様式の例には、これらに限定されないが、磁気共鳴、核磁気共鳴、放射性シンチグラフィー、陽電子放出断層撮影、コンピュータ断層撮影、近赤外蛍光、X線、超音波、紫外線、または可視光が含まれ、これらにおいて、検出可能な部分の画像により、特定の細胞外プロテアーゼの活性が示される(例えば、Dahnhert, Radiology Review Manual (4th ed. 1999)；Brant et al., Fundamentals of Diagnostic Radiobiology, (2nd ed. 1999)；Weissleder et al., Primer of Diagnostic Imaging, (2nd ed. 1997)；Buddinger et al., Medical Magnetic Resonance A Primer, Society of Magnetic Resonance, Inc.(1988)；およびWeissleder et al., Nature Biotech., 17:375-378 (1999)を参照されたい)。

特定の状況では、投与後にリンカーが生分解することが望ましい場合がある。適切な生分解性リンカーを選択することにより、ポリペプチドおよび/または検出可能な部分の生体内分布および生体排出を変更することが可能である。ポリペプチドおよび/または検出可能な部分が生物活性を有するか、または画像化手順の終了後に残存していると望ましくない影響を及ぼし得る場合には、ポリペプチドおよび/または検出可能な部分の適切な生体排出または代謝分解を確実にする生分解性を、リンカーに対して設計することが望ましい場合がある。したがって、リンカーは生分解性機能を含んでよく、この機能のために、分解時に、ポリペプチドからの検出可能な部分の放出または高分子構造の断片化に起因して、生体内分布パターンが変化した分解産物が生じる。例として、キレート化された金属イオン部分を有するリンカーについては、分解時に、検出可能な部分を含む排出可能なキレート化合物を放出する生分解性機能をリンカーに組み入れることが可能である。したがって、必要に応じて、好ましくは(a) 分枝部位で、(b) リガンドもしくは検出可能な部分の結合部位もしくはその近傍で、または(c) 生分解により、生理的に許容されるか、もしくは迅速に排出可能な断片が生じるような部位で、生分解性機能をリンカー構造内に組み入れることができる。

XI. キット
別の局面において、本発明は、脂質異常症、高コレステロール血症、および炎症に関連する疾患または障害、すなわち状態を治療する、すなわち改善する、または予防するためのキットを提供する。好ましい態様において、本発明は、アテローム性動脈硬化の1つもしくは複数の症状を治療する、すなわち改善するための、またはアテローム性動脈硬化のリスクがある対象(例えば、ヒトまたは動物)を予防的に治療するためのキットを提供する。キットは、好ましくは、本発明のポリペプチド(またはペプチド模倣体)の1つまたは複数を含む容器を含む。ポリペプチドまたはペプチド模倣体は、単位剤形(例えば、錠剤、カプセル剤、パッチ、坐剤等)として提供することが可能であり、かつ/または1つもしくは複数の薬学的に許容される賦形剤と任意に混合することが可能である。

キットは任意に、脂質異常症、高コレステロール血症、ならびに炎症に関連する疾患または状態(心疾患および/またはアテローム性動脈硬化など)の治療において用いられる1つまたは複数の他の剤をさらに含み得る。そのような剤には、「併用療法」の項との関連で上記したものが含まれるが、これに限定されない。例えば、いくつかの態様において、キットは、β遮断薬、血管拡張薬、アスピリン、スタチン、ace阻害剤、またはace受容体阻害剤(ARB)等を含み得る。

加えて、キットは標識物質および/または使用説明資料を任意に含んでよく、使用説明資料は、本方法の実施または本発明の「治療剤」もしくは「予防剤」の使用に関する説明(すなわち、プロトコール)を提供する。好ましい使用説明資料は、例えば、アテローム性動脈硬化の1つもしくは複数の症状を緩和するため、および/またはアテローム性動脈硬化のリスクがある個体においてそのような症状の1つもしくは複数の発症もしくは増加を予防するための、本発明の1つまたは複数のポリペプチドまたはペプチド模倣体の使用について記載している。使用説明資料は、好ましい投与量/治療計画、対応する適応症等も任意に教示し得る。

使用説明資料は典型的に、書面による資料または印刷資料を含むが、そのようなものに限定されない。そのような使用説明を保存し、それらをエンドユーザーに伝達することができる任意の媒体が、本発明によって意図される。このような媒体には、これらに限定されないが、電子記録媒体(例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ等)、光学媒体(例えば、CD ROM)等が含まれる。そのような媒体は、そのような使用説明資料を提供するインターネットサイトへのアドレスを含み得る。

具体例を挙げて、本発明をより詳細に説明する。以下の実施例は例示目的で提供するものであり、本発明をいかようにも限定するものではない。当業者は、本質的に同じ結果をもたらすために変更または修正できる、重要でない種々のパラメータを容易に認識すると考えられる。

XII. 実施例
実施例1
22mer ペプチドのコレステロール流出活性
ABCA1コレステロール流出を促進する効率を増大させるために行った組成の変更を反映する群として、ペプチドを列記する。配列は、合成ロット番号に対応する番号によって識別する。

N257-11は、生物活性を伴って改変に成功した22mer ぺプチドに相当する。ペプチドN257-11のアミノ酸配列は、

(図1、ペプチドのヘリックスホイールを示す)である。N257-11は概して高い能力でABCA1コレステロール流出を促進したが、活性には高濃度が必要であり、よって該ペプチドは弱い流出効率を示した。

ペプチド系列#：N257-11
ABCA1コレステロール流出活性を有する22mer ペプチド

8時間流出データ(J774マクロファージ±ABCA1を上方制御するためのcAMP)

実施例2
20mer、21mer、および22mer ペプチドのコレステロール流出活性
親N257-11ペプチドのコレステロール流出効率を増大させるために、アミノ酸置換を用いて、N356系列を含むペプチドを設計した。非極性表面を140度に拡大するように、1置換(R10→F、N356-1ペプチド)を意図し；これにより、親ペプチド内の推定上の塩橋の1つが破壊された。この変更によって、コレステロール流出を促進する上でN257-11よりも強力なペプチドが生成されたが、濃度依存曲線から、天然タンパク質の特徴ではない閾値型反応が示された。

N965系列のペプチドは、N257系列およびN356系列の複合設計に基づいたものであり、塩橋配置、広範な非極性表面、および極性表面上の酸性残基の重要なトポグラフィー局面を維持するように改変した。その後の改変(N1154系列)により、生物活性のあるペプチドを人工的に改変するためには、全フェニルアラニン残基を置換するための全ロイシン残基の使用を含め、アミノ酸の比較的少ない選択を用いることができるという驚くべき知見が導き出された。

表A. ペプチド系列#：N356
N257-11の設計に基づいた22mer、21mer、および20mer ペプチド
コレステロール流出の効率を増大させるために置換を設計。

下線の残基は、リスト中の最初の配列(すなわちN257-11)に対してなされた変更を表す。

結果
N356ペプチド系列：コレステロール流出データ(J774マクロファージ+ABCA1を上方制御するcAMP)
コレステロール流出率(%)/8時間

濃度依存性(コレステロール流出効率)
コレステロール流出率(%)/4時間

表B. ペプチド系列#：N965
N257-11およびN365の設計に基づいた22mer、21mer、および20mer ペプチド

下線の残基は、リスト中の最初の配列(すなわちN965-1)に対してなされた変更を表す。

結果
N965ペプチド系列：コレステロール流出データ(J774マクロファージ+ABCA1を上方制御するcAMP)
コレステロール流出率(%)/8時間

濃度依存性(コレステロール流出効率)
コレステロール流出率(%)/4時間

表C. ペプチド系列#：N1154
N965-8に基づいた20mer ペプチド

下線の残基は、ATI-185に対してなされた変更を表す。

結果
N1154ペプチド1〜5：コレステロール流出データ(J774マクロファージ+ABCA1を上方制御するcAMP)
コレステロール流出率(%)/8時間

濃度依存性(コレステロール流出効率)
コレステロール流出率(%)/4時間

N1154ペプチド6〜11：コレステロール流出データ(J774マクロファージ+ABCA1を上方制御するcAMP)
コレステロール流出率(%)/8時間

濃度依存性(コレステロール流出効率)
コレステロール流出率(%)/4時間

実施例3
強力なABCA1コレステロール流出ペプチドSEQ ID NO:2(20mer)の一次アミノ酸配列および投影αヘリックス構造(図2)。パネルAは、このペプチドの両親媒性を示すヘリックスホイール図を示す。パネルBは、極性表面の長軸下方に切断して、平板化したペプチドを示すヘリックスネット図を示す。影付きの丸は酸性アミノ酸を示し、部分的に影付きの丸はカチオン残基を示す。両パネル中の数字は、アミノ酸の一次配列を示す。

実施例4
本実施例は、SEQ ID NO:2と全長アポA-Iのコレステロール流出活性を示す。[³H]コレステロールで標識したJ774マクロファージを用いて、本発明のペプチドのコレステロール流出活性を評価した。24ウェル培養プレートにプレーティングしたJ774細胞を、1% FBS中の1μCi/mlの[³H]コレステロールで標識した(48時間)。ABCA1発現を上方制御するために、いくつかのウェルにはcAMP類似体を添加した(0.3 mM、12〜18時間)。cAMPで処理した後、細胞をリンスし、次いで無血清培地中でペプチドに曝露した。結果を図3に示す。パネルAは、濃度に対するコレステロール流出の依存性を示すデータを提供する(脂質を含まないSEQ ID NO:2ペプチド(四角)および脂質を含まないアポリポタンパク質(アポ)A-I(丸))；cAMPで処理した細胞を使用した。8時間の時点で培地中に出現した細胞[³H]コレステロールの割合を、無血清培地のみに対するバックグラウンド流出を減算して示す。値は平均値±SDである；アポA-I、n=8；SEQ ID NO:2ペプチド、n=3。ミカエリス-メンテン式および4時間の流出データを用いて、濃度依存曲線から、コレステロール流出促進の効率を反映するKm値を計算した(Prism 4ソフトウェア)。SEQ ID NO:2ペプチドは、質量ベースで、アポA-Iと比較して〜5倍効率的にコレステロール流出を促進した(それぞれ、Km=0.7±0.3対アポA-I Km=3.4±0.6μg/ml)。モルベースでは、このペプチドの流出効率はアポA-Iとほぼ同等であった(Km=0.26±0.11対アポA-I Km=0.12±0.02)。

図3のパネルBは、脂質を含まないSEQ ID NO:2ペプチドが、アポA-Iと同様に、ABCA1依存的様式でコレステロール流出を促進したことを示す。[³H]コレステロールで標識し、cAMPで処理した(影付きのバー)およびcAMPなしで処理した(白いバー)J774細胞を、SEQ ID NO:2ペプチドまたはアポA-I；いずれも30μg/mlの濃度に曝露した。培地へのコレステロール流出の割合(8時間)を示す。値は、2回の実験の代表例である。

実施例5
本実施例は、C末端に残基KSが付加されたSEQ ID NO:2の22mer 類似体が、20merのSEQ ID NO:2ペプチドと同様に、ABCA1コレステロール流出を促進することを実証する。

実施例4に記載した通りに、[³H]コレステロールで標識し、cAMP(0.3 mM)で処理したJ774細胞をリンスし、無血清培地中で脂質を含まないペプチドに曝露した。結果を図4に示す。SEQ ID NO:2ペプチド(白いバー)またはSEQ ID NO:31ペプチド(影付きのバー)に応答して、培地中に出現した細胞[³H]コレステロールの割合(8時間)を示す。値は1回の実験による。各濃度につき二つ組のウェルを使用した。二つ組は12パーセント以下しか異ならなかった。

実施例6
本実施例は、ABCA1コレステロール流出活性に悪影響を及ぼすことなく、20mer ペプチド(SEQ ID NO:2)中のトリプトファン(W)に対してロイシン(L)またはフェニルアラニン(F)を置換することができることを実証する。

実施例4に記載した通りに、J774細胞を[³H]コレステロールで標識し、ペプチドに曝露した。パネルA(図5)は、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:32、およびSEQ ID NO:33ペプチドに応答して、培地中に出現した細胞[³H]コレステロールの割合(8時間)を示す。ペプチドは、30μg/ml無血清培地の脂質を含まない形態で使用した。値は1回の実験によるものであり、各ペプチド/条件につき三つ組のウェルを使用した。平均値±SDを示す。ペプチドは、cAMPなし(白いバー)の場合の低レベルと比較して、ABCA1応答に関して誘導した(すなわち、+cAMP、影付きのバー)細胞から比較的高レベルのコレステロール流出を促進した。パネルBは、SEQ ID NO:32およびSEQ ID NO:33ペプチドの濃度に対するコレステロール流出の依存性を示す。cAMPで処理した細胞を使用した。値は、各条件につき二つ組のウェルを用いた1回の実験による。

実施例7
本実施例は、活性に悪影響を及ぼすことなく、コレステロール流出ペプチドの非極性表面上のロイシンに対してバリンを置換することができることを示す。実施例4に記載した通りに、J774細胞を[³H]コレステロールで標識した。解析の結果を図6に示す。パネルAは、それぞれ一次配列の2位においてロイシン(L)の代わりにバリン(V)を含むSEQ ID NO:2ペプチド(20mer)およびSEQ ID NO:31ペプチド(22mer)に応答して、培地中に出現した細胞[³H]コレステロールの割合(8時間)を示す。ペプチドは、30μg/ml無血清培地の脂質を含まない形態で使用した。値は1回の実験によるものであり、各ペプチド/条件につき三つ組のウェルを使用した。平均値±SDを示す。ペプチドは、cAMPなし(白いバー)の場合の低レベルと比較して、ABCA1応答に関して誘導した(すなわち、+cAMP、影付きのバー)細胞から比較的高レベルのコレステロール流出を促進した。パネルBは、ペプチド(説明文に表示)の濃度に対するコレステロール流出の依存性を示すデータを提供する。cAMPで処理した細胞を使用した。値は、各条件につき二つ組のウェルを用いた1回の実験による。

実施例8
本実施例は、ABCA1コレステロール流出の促進が、ペプチド中の疎水性ロイシン残基の数に影響を受けることを示す。

実施例4に記載した通りに、J774細胞を[3H]コレステロールで標識した。SEQ ID NO:31ペプチド中の重要な12位および17位のロイシン(L)に対してアラニン(A)を置換することにより、実験を行った。結果を図7に示す。パネルAは、ペプチドに応答して培地中に出現した細胞[³H]コレステロールの割合(8時間)を示すデータを提供する。対照ペプチドは、2位においてLの代わりにVを含むSEQ ID NO:31に相当する(四角)。このペプチドは全部で3つのロイシン(L)残基を含む。3つおよび4つのL残基を有するペプチドは、同様のコレステロール流出活性を有した(図6、すなわちL2>Vを伴うおよび伴わないSEQ ID NO:2)。対照的に、3つ未満のL残基を有するペプチドは、コレステロール流出をあまり促進しなかった。パネルBは、ペプチドの濃度に対するコレステロール流出の依存性を示すデータを提供する。示される通り、疎水性L残基の数は、本発明のペプチドのコレステロール流出効率に寄与した。cAMPで処理した細胞を使用した。

実施例9
本実施例は、ABCA1コレステロール流出活性に悪影響を及ぼすことなく、非極性表面上のロイシン残基またはロイシン残基とイソロイシン残基との組み合わせを用いて、本発明のペプチドを改変することができることを実証する。

実施例4に記載した通りに、J774細胞を[³H]コレステロールで標識した。SEQ ID NO:2ペプチドの非極性表面上の疎水性フェニルアラニン(F)残基に対してイソロイシン(I)またはロイシン(L)のいずれかを置換することにより、実験を行った。F>L置換により、(W9を除いて)すべてL残基である非極性表面を示すペプチドが生じる。結果を図8に示す。パネルAは、SEQ ID NO:2ペプチドとF>L置換を伴うSEQ ID NO:2に応答して、培地中に出現した細胞[³H]コレステロールの割合(8時間)を示す。パネルBは、F>I置換を伴うSEQ ID NO:2ペプチドを用いたことを除いて、パネルAと同様の実験を示す。パネルAおよびBにおけるペプチドは、30μg/ml無血清培地の脂質を含まない形態で使用した。パネルCは、ペプチドの濃度に対するコレステロール流出の依存性を示し、これにより、ABCA1コレステロール流出の促進が芳香族(フェニルアラニン)残基に依存しないことが示される。cAMPで処理した細胞を使用した。

実施例10
本実施例は、ABCA1コレステロール流出を促進する能力に悪影響を及ぼすことなく、非極性表面上のフェニルアラニン残基の数を増加させて、本発明のペプチドを改変することができることを実証する。

実施例4に記載した通りに、J774細胞を[³H]コレステロールで標識した。SEQ ID NO:2ペプチドの非極性表面上のロイシン(L)に対して疎水性フェニルアラニン(F)残基を置換することにより、実験を行った。2位、6位、12位、および17位におけるL>F置換により、(W9を除いて)すべてF残基である非極性表面を示すペプチドが生じる。結果を図9に示す。パネルAは、SEQ ID NO:2ペプチドとL>F置換を伴うSEQ ID NO:2に応答して、培地中に出現した細胞[³H]コレステロールの割合(8時間)を示す。ペプチドは、30μg/ml無血清培地の脂質を含まない形態で使用した。パネルBは、L>F置換を伴うおよび伴わないSEQ ID NO:2ペプチドの濃度に対するコレステロール流出の依存性を示す。cAMPで処理した細胞を使用した。

実施例11
本実施例は、ABCA1コレステロール流出を促進する能力に悪影響を及ぼすことなく、本発明のペプチドのロイシンおよびフェニルアラニン残基をイソロイシンで置換することができることを実証する。

実施例4に記載した通りに、J774細胞を[³H]コレステロールで標識した。SEQ ID NO:2ペプチドの非極性表面上の全ロイシン(L)残基(2位、6位、12位、17位)または全(L)残基およびフェニルアラニン(F)残基(10、13、16、20)に対して疎水性イソロイシン(I)を置換することにより、実験を行った。後者のLおよびF>I置換により、(W9を除いて)すべてI残基の非極性表面を示すペプチドが生じる。結果を図10に示す。パネルAは、SEQ ID NO:2ペプチドとL>IおよびLおよびF>I置換を有するSEQ ID NO:2に応答して、培地中に出現した細胞[³H]コレステロールの割合(8時間)を示す。ペプチドは、30μg/ml無血清培地の脂質を含まない形態で使用した。パネルBは、説明文に表示した通りの、イソロイシン置換を伴うおよび伴わないSEQ ID NO:2ペプチドの濃度に対するコレステロール流出の依存性を示す。cAMPで処理した細胞を使用した。

実施例12
本実施例は、ABCA1コレステロール流出を促進する能力に悪影響を及ぼすことなく、ペプチド中の正に荷電したリジンに対して正に荷電したアルギニンを置換することができることを実証する。

実施例4に記載した通りに、J774細胞を[³H]コレステロールで標識した。SEQ ID NO:2ペプチドの極性表面上の5位のリジン(K)に対してアルギニン(R)を置換することにより、実験を行った。結果を図11に示す。パネルAは、SEQ ID NO:2ペプチドとK5>R置換を有するSEQ ID NO:2に応答して、培地中に出現した細胞[³H]コレステロールの割合(8時間)を示す。ペプチドは、30μg/ml無血清培地の脂質を含まない形態で使用した。パネルBは、K5>R置換を伴うおよび伴わないSEQ ID NO:2ペプチドの濃度に対するコレステロール流出の依存性を示す。cAMPで処理した細胞を使用した。

実施例13
本実施例は、ABCA1コレステロール流出を促進する能力に悪影響を及ぼすことなく、本発明のペプチド中の負に荷電したグルタミン酸に対して負に荷電したアスパラギン酸を置換することができることを実証する。

実施例4に記載した通りに、J774細胞を[³H]コレステロールで標識した。SEQ ID NO:2ペプチドの極性表面上の4位、11位、または4位、11位、加えて1位、7位、15位、18位のいずれかのグルタミン酸(E)に対してアスパラギン酸(D)を置換することにより、実験を行った。後者により、全酸性残基がEであるSEQ ID NO:2とは対照的に、全酸性残基がDであるペプチドが生じる。結果を図12に示す。パネルAは、SEQ ID NO:2ペプチドとE>D置換を有するSEQ ID NO:2に応答して、培地中に出現した細胞[³H]コレステロールの割合(8時間)を示す。ペプチドは、30μg/ml無血清培地の脂質を含まない形態で使用した。パネルBは、E>D置換を有するSEQ ID NO:2ペプチドの濃度に対するコレステロール流出の依存性を示す。cAMPで処理した細胞を使用した。

実施例14
本実施例は、ペプチドにおいてアスパラギン酸残基とグルタミン酸残基に互換性があり、いずれも他のアミノ酸アミノ酸置換と組み合わせて用いることができることを実証する。

実施例4に記載した通りに、J774細胞を[³H]コレステロールで標識した。SEQ ID NO:2ペプチド、またはK5>Rおよび全ロイシン残基(すなわち、F10、13、16、20>L)などの様々な他の置換を有するSEQ ID NO:2ペプチドの極性表面上の4位、11位、または4位、11位、加えて1位、7位、15位、18位のグルタミン酸(E)に対してアスパラギン酸(D)を置換することにより、実験を行った。結果を図13に示す。ペプチドは、30μg/ml無血清培地の脂質を含まない形態で使用した。cAMPで処理した細胞によるデータを示す。結果は、SEQ ID NO:2ペプチドを用いて得られた対照活性に対する割合(8時間)として表す。

実施例15
本実施例は、ABCA1コレステロール流出を促進する能力に悪影響を及ぼすことなく、12位のロイシン(L)に対してトリプトファン(W)またはフェニルアラニン(F)を置換することができることを実証する。

実施例4に記載した通りに、J774細胞を[³H]コレステロールで標識した。SEQ ID NO:2ペプチド中のW9とL12の位置を交換するか(W9<->L12交換)、またはSEQ ID NO:2ペプチド中の12位のロイシン(L)に対してフェニルアラニン(F)を置換するか(L12>F)、または対応するL12>Fペプチドを採用し、残基F12とW9を交換することにより(すなわちW9<->F12交換)、実験を行った。実施例7に記載するようなL2>V置換を含むSEQ ID NO:2ペプチドに対しても、SEQ ID NO:2ペプチド中に示されるアミノ酸置換を行った。結果を図14に示す。パネルAは、SEQ ID NO:2ペプチドと表示のアミノ酸置換を伴うSEQ ID NO:2ペプチドに応答して、培地中に出現した細胞[³H]コレステロールの割合(8時間)を示す。パネルBは、SEQ ID NO:2ベースのペプチドをすべてE4、11>DおよびK5>R置換を用いて構築したことを除いて、パネルAに関して行った実験と同様の実験を示す。ペプチド(パネルAおよびB)は、30μg/ml無血清培地の脂質を含まない形態で使用した。cAMPで処理した細胞によるデータを示す。結果は、SEQ ID NO:2ペプチドを用いて得られた対照活性に対する割合として表す。

実施例16
本実施例は、ABCA1コレステロール流出を促進する能力に悪影響を及ぼすことなく、すべてDアミノ酸である、または逆配列を有する本発明のペプチドを用いることができることを実証する。

実施例4に記載した通りに、J774細胞を[³H]コレステロールで標識した。すべてDアミノ酸から構成されるSEQ ID NO:2ペプチドを用いて、または一次アミノ酸配列を逆転させることにより、実験を行った。結果を図15に示す。図15は、対照SEQ ID NO:2ペプチド(Lアミノ酸)とDアミノ酸から構成されるSEQ ID NO:2および逆配列ペプチド模倣体(Lアミノ酸)に応答して、培地中に出現した細胞[³H]コレステロールの割合(8時間)を示す。ペプチドは、30μg/ml無血清培地の脂質を含まない形態で使用した。

実施例17
本実施例は、極性表面上のアラニン置換により、ABCA1コレステロール流出を促進する本発明のペプチドの能力が有利に増加することを実証する。

実施例4に記載した通りに、J774細胞を[³H]コレステロールで標識した。E4およびE11の位置をA8と交換するか(E<->A交換)、または4位および11位のグルタミン酸(E)に対してアラニン(A)を置換することにより、実験を行った。結果を図16に示す。パネルAは、SEQ ID NO:2ペプチドとE<>A交換を伴うSEQ ID NO:2に応答して、培地中に出現した細胞[³H]コレステロールの割合(8時間)を示す。いずれの交換(E4<>A8およびE11<>A8)においても、SEQ ID NO:2ペプチドの流出活性は減少し、これにより8位のAが活性にとって重要であることが示される。パネルBは、E>A置換を伴うSEQ ID NO:2ペプチドを使用したことを除いて、パネルAと同様の実験の結果を示す。ペプチド(パネルAおよびB)は、30μg/ml無血清培地の脂質を含まない形態で使用した。パネルCは、SEQ ID NO:2ペプチド、および極性表面上のE>A置換の数が増加したSEQ ID NO:2ペプチドの濃度に対するコレステロール流出の依存性を示す。アラニン置換(パネルBおよびC)により、ABCA1コレステロール流出を効率的に促進するSEQ ID NO:2ペプチドの能力が大きく増加した。これは、ペプチドの非極性表面にアラニン置換が行われた場合(図7)の結果不良(流出活性の減少)とは対照的である。

実施例18
本実施例は、ABCA1コレステロール流出を促進する能力に悪影響を及ぼすことなく、アルギニン14(R14)およびグルタミン酸18(E18)に対してアラニンを置換することができることを実証する。

実施例4に記載した通りに、J774細胞を[³H]コレステロールで標識した。それぞれ推定上の塩橋対を表す14位および18位のアルギニンおよびグルタミン酸に対してアラニン(A)を置換することにより、実験を行った。保存的なL17>F置換を伴うSEQ ID NO:2ペプチドに対して置換を行った。結果を図17に示す。パネルAは、ペプチドに応答して培地中に出現した細胞[³H]コレステロールの割合(8時間)を示す。ペプチドは、30μg/ml無血清培地の脂質を含まない形態で使用した。パネルBは、(表示の通りの)アラニン置換を伴うSEQ ID NO:2ペプチドの濃度に対するコレステロール流出の依存性を示す。このペプチドは、親のSEQ ID NO:2ペプチド(図3および4)と同様の高い効率でコレステロールを促進した(すなわち、3μg/mlで最大流出)。

実施例19
本実施例は、本発明のペプチド、例えばSEQ ID NO:2および本明細書に記載のSEQ ID NO:2の置換を含むペプチドをリン脂質と共に製剤化して、ABCA1依存的および非依存的機構を介して高レベルの細胞コレステロール流出を支持する複合体を生成することができることを実証する。

改良コール酸透析手順を用いて、SEQ ID NO:12に相当する20mer ペプチド(実施例13に記載)を1-パルミトイル-2-オレオイル-ホスファチジルコリン(POPC)と共に製剤化した。コレステロール流出を評価する実験の結果を図18に示す。パネルAは、非変性勾配(4〜20%)ゲル電気泳動により決定した、ペプチド:POPC複合体の粒子サイズを実証するゲル写真を示す。レーン1はペプチド:POPC複合体に対応し、かつレーン2は脂質を含まないペプチドに対応する。パネルBは、[³H]コレステロールで標識し、cAMPで処理した(影付きのバー)およびcAMPなしで処理した(白いバー)J774細胞を用いて判断した、ペプチド:POPC複合体のコレステロール流出活性を示す。比較の目的で、脂質を含まないSEQ ID NO:12に応答したコレステロール流出を示す。脂質を含まないペプチドおよびペプチド:POPC複合体の濃度は、50μg/ml(ペプチドの質量に基づく)であった。値は平均値±SDであり、n=3であった。

実施例20
本実施例は、本実施例においてSEQ ID NO:12によって例証される本発明のペプチドが、高脂肪の西洋式食餌を与えたアポリポタンパク質E欠損マウスにおいて確立されたアテローム性動脈硬化を軽減したことを実証する。

7週齢の雄のアポリポタンパク質E欠損(アポE-/-)マウスに、全部で26週間にわたり高脂肪の西洋式食餌を与えた。高脂肪食での最後の6週間の間、マウスに、生理食塩水(対照)またはPOPCと共に製剤化したSEQ ID NO:12ペプチドのいずれかを1日おきに腹腔内(ip)注射した。ペプチド:POPCの用量は、ペプチドの質量に基づいて30 mg/kg BWであった。結果を図19に示す。パネルAは、病変によって覆われた大動脈の割合として表示した、対照およびペプチドで処理したマウスにおけるアテローム性動脈硬化の程度を示すデータを提供する。パネルBは、オイルレッドO染色により決定した、大動脈洞プラークの脂質含量を示す。いずれのパネルにおいても、値は平均値±SEMであり、n=マウス7匹/群である。

実施例21
本実施例は、ミエロぺルオキシダーゼ(MPO)由来の酸化生成物に対する抵抗性を付与するためのアミノ酸置換の使用を実証する。

SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:12に相当するペプチドを、アクロレインに対して37℃で18時間曝露した(アクロレイン:ペプチドモル比=25:1)。対照ペプチドは、アクロレインの非存在下で同様にインキュベートした。対照ペプチドおよびアクロレインで処理したペプチドを次に透析し、コレステロール流出実験に使用した。本実験の結果を図20に示す。パネルAは、アクロレインと共におよびアクロレインなしでインキュベートしたSEQ ID NO:2ペプチドのコレステロール流出活性を示す。アクロレインにより、SEQ ID NO:2ペプチドの活性は大きく減少した。パネルBはSEQ ID NO:12ペプチドのコレステロール流出活性を示すが、アクロレインの穏やかな影響が示される。いずれのパネルにおいても、ABCA1を上方制御するcAMPで処理したJ774マクロファージを用いた。コレステロール流出アッセイは、2μg/ml無血清培地のペプチドを用いて行った。

実施例22
本発明のペプチドは、明確なHDL亜集団が関与する高度に特異的な機構を介して、ヒト血漿中のプレβ-1 HDL形成を誘導する。

SEQ ID NO:2に相当するペプチドを、最終濃度30μg/mlでヒト血漿に添加した(すなわち、ペプチド:アポA-Iモル比〜1:5)。続いて、ペプチドを含むおよび含まない血漿を37℃で5分間インキュベートした。インキュベーション後、血漿試料を、一次元目のアガロースゲル電気泳動およびそれに続く二次元目の未変性勾配ゲル電気泳動に供した。得られたゲル上のタンパク質をニトロセルロースに転写し、アポA-I抗体を用いてウェスタンブロット解析により解析した。結果を図21に示す。ビヒクルのみ(白いバー)、すべてDアミノ酸から構成されるSEQ ID NO:2ペプチド(中程度の影付き)、およびすべてLアミノ酸から構成されるSEQ ID NO:2ペプチド(濃い影付き)で処理した血漿中のHDL亜集団の分布を示す。ペプチド処理により、プレβ-1 HDLの優先的な増加が生じた。α-HDL亜集団の減少から、ペプチドが明確なHDL種と特異的に相互作用して、プレβ-1アポA-I粒子が生成されることが示される。

上記の説明は例証を意図したものであって、限定を意図したものではないことが理解されるべきである。上記の説明を読むことにより、多くの態様が当業者に明らかになると考えられる。したがって、本発明の範囲は、上記の説明を参照して決定されるべきではなく、添付の特許請求の範囲、およびそのような特許請求の範囲が適用される均等物の全範囲を参照して決定されるべきである。特許出願および出版物を含む、すべての論文および参考文献の開示は、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み入れられる。

Claims (77)

1. 以下のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド：
   

   

   式中、
   X₁、X₇、およびX₁₅は、EおよびDからなる群より独立して選択されるアミノ酸であり；
   X₄、X₁₁、およびX₁₈は、E、D、A、およびGからなる群より独立して選択されるアミノ酸であり；
   X₂、X₆、X₉、X₁₀、X₁₂、X₁₃、X₁₆、X₁₇、およびX₂₀は、F、L、W、I、V、およびAからなる群より独立して選択されるアミノ酸であり；
   X₃、X₅、およびX₁₉は、R、K、およびCからなる群より独立して選択されるアミノ酸であり；
   X₁₄はアミノ酸R、A、E、またはCであり；かつ
   X₈はA、G、またはVである。
2. X₁₀、X₁₂、X₁₆、およびX₁₇が、F、L、I、およびWからなる群より独立して選択される、請求項1記載の単離されたポリペプチド。
3. X₁₀、X₁₂、X₁₆、およびX₁₇が、FおよびLより独立して選択される、請求項2記載の単離されたポリペプチド。
4. X₉がL、F、またはWである、前記請求項のいずれか一項記載の単離されたポリペプチド。
5. X₂位、X₆位、X₁₂位、およびX₁₇位のうちの少なくとも3つがLである、前記請求項のいずれか一項記載の単離されたペプチド。
6. X₄位、X₈位、およびX₁₁位の1つまたは複数がAである、前記請求項のいずれか一項記載の単離されたポリペプチド。
7. X₈がAである、請求項6記載の単離されたポリペプチド。
8. X₄、X₁₁、およびX₁₈が、DおよびEからなる群より独立して選択される、請求項1記載の単離されたポリペプチド。
9. X₃、X₅、X₁₄、およびX₁₉からなる群より選択される1つの位置にCが存在する、請求項1記載の単離されたポリペプチド。
10. 以下を含む、請求項1記載の単離されたポリペプチド：
    

    

    式中、
    X₁、X₇、X₁₅、およびX₁₈は、DおよびEからなる群より独立して選択され；
    X₂はL、I、またはVであり；
    X₄およびX₁₁は、D、E、およびAからなる群より独立して選択され；
    X₃、X₅、およびX₁₉は、KおよびRからなる群より独立して選択され；
    X₉はW、F、またはLであり；
    X₁₄はR、E、またはAであり；かつ
    X₆、X₁₀、X₁₂、X₁₃、X₁₆、X₁₇、およびX₂₀は、F、L、I、およびWからなる群より独立して選択される。
11. X₁₀、X₁₂、X₁₃、X₁₆、X₁₇、およびX₂₀が、LおよびFからなる群より独立して選択される、請求項10記載の単離されたポリペプチド。
12. 以下を含む、請求項10記載の単離されたポリペプチド：
    X₁LRAX₅LX₇AX₉X₁₀AX₁₂X₁₃RX₁₅X₁₆X₁₇X₁₈RX₂₀(SEQ ID NO:28)
    式中、
    X₁、X₇、X₁₅、およびX₁₈は、DおよびEからなる群より独立して選択され；
    X₅はKまたはRであり；
    X₉はF、L、またはWであり；かつ
    X₁₀、X₁₂、X₁₃、X₁₆、X₁₇、およびX₂₀は、FおよびLからなる群より独立して選択される。
13. 以下を含む、請求項10記載の単離されたポリペプチド：
    

    

    式中、
    X₁、X₄、X₇、X₁₁、X₁₅、およびX₁₈は、DおよびEからなる群より独立して選択され；
    X₅はKまたはRであり；
    X₉はF、L、またはWであり；かつ
    X₁₀、X₁₂、X₁₃、X₁₆、X₁₇、およびX₂₀は、FおよびLからなる群より独立して選択される。
14. 

    含む、請求項13記載の単離されたポリペプチド。
15. C、K、Y、またはLからなる群より選択されるX₂₁をさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載の単離されたポリペプチド。
16. SまたはCであるX₂₂をさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載の単離されたポリペプチド。
17. X₂₁がKである、請求項15記載の単離されたペプチド。
18. X₂₂がSである、請求項17記載の単離されたペプチド。
19. X₂₁またはX₂₂がCである、請求項16記載の単離されたペプチド。
20. 保護基をさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載の単離されたポリペプチド。
21. 前記保護基が、アセチル(Ac)、アミド、炭素3〜20個のアルキル基、Fmoc、t-ブトキシカルボニル(Tboc)、9-フルオレンアセチル基、1-フルオレンカルボン酸基、9-フルオレンカルボン酸基、9-フルオレノン-1-カルボン酸基、ベンジルオキシカルボニル、キサンチル(Xan)、トリチル(Trt)、4-メチルトリチル(Mtt)、4-メトキシトリチル(Mmt)、4-メトキシ-2,3,6-トリメチル-ベンゼンスルホニル(Mtr)、メシチレン-2-スルホニル(Mts)、4,4-ジメトキシベンズヒドリル(Mbh)、トシル(Tos)、2,2,5,7,8-ペンタメチルクロマン-6-スルホニル(Pmc)、4-メチルベンジル(MeBzl)、4-メトキシベンジル(MeOBzl)、ベンジルオキシ(BzlO)、ベンジル(Bzl)、ベンゾイル(Bz)、3-ニトロ-2-ピリジンスルフェニル(Npys)、1-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソシクロヘキシリデン)エチル(Dde)、2,6-ジクロロベンジル(2,6-DiCl-Bzl)、2-クロロベンジルオキシカルボニル(2-Cl-Z)、2-ブロモベンジルオキシカルボニル(2-Br-Z)、ベンジルオキシメチル(Bom)、シクロヘキシルオキシ(cHxO)、t-ブトキシメチル(Bum)、t-ブトキシ(tBuO)、t-ブチル(tBu)、およびトリフルオロアセチル(TFA)からなる群より選択される保護基である、請求項20記載の単離されたポリペプチド。
22. 前記保護基がアミノ末端またはカルボキシ末端に結合している、請求項20または21記載の単離されたポリペプチド。
23. アミノ末端に結合している第1保護基、およびカルボキシル末端に結合している第2保護基を含む、請求項20、21、または22記載の単離されたポリペプチド。
24. 前記第1保護基が、アセチル、プロピオニル、および炭素3〜20個のアルキルからなる群より選択される保護基である、請求項23記載の単離されたポリペプチド。
25. 前記第1保護基がアセチルである、請求項24記載の単離されたポリペプチド。
26. 前記第2保護基がアミドである、請求項23、24または25記載の単離されたポリペプチド。
27. 鏡像異性アミノ酸がすべて「D」アミノ酸である、前記請求項のいずれか一項記載の単離されたポリペプチド。
28. 鏡像異性アミノ酸が「L」アミノ酸と「D」アミノ酸との混合物である、請求項1〜26のいずれか一項記載の単離されたポリペプチド。
29. 請求項1記載の配列を有する第2ペプチドに結合している、前記請求項のいずれか一項記載の単離されたポリペプチド。
30. 前記第2ペプチドが第1ペプチドと同じ配列を有する、請求項29記載の単離されたポリペプチド。
31. コレステロール流出活性を有する、前記請求項のいずれか一項記載の単離されたポリペプチド。
32. ヒト血漿中でプレβ形成を誘導した、前記請求項のいずれか一項記載の単離されたポリペプチド。
33. ABCA1安定化活性を有する、前記請求項のいずれか一項記載の単離されたポリペプチド。
34. 酸化剤による酸化からリン脂質を保護する、前記請求項のいずれか一項記載の単離されたポリペプチド。
35. 薬学的に許容される担体と混合される、前記請求項のいずれか一項記載の単離されたポリペプチド。
36. 請求項1〜34のいずれか一項記載のポリペプチドと実質的に類似している三次元高次構造を有する、ペプチド模倣体。
37. レトロ-インベルソ(retro-inverso)類似体である、請求項36記載のペプチド模倣体。
38. レトロ-エナンチオ類似体である、請求項36記載のペプチド模倣体。
39. 請求項1〜34のいずれか一項記載のポリペプチドまたは請求項36〜38のいずれか一項記載のペプチド模倣体、および薬学的に許容される担体
    を含む、組成物。
40. 心血管疾患を治療するための治療剤をさらに含む、請求項39記載の組成物。
41. 前記治療剤が、スタチン、胆汁酸結合剤、血小板凝集阻害剤、ニコチンアミド、PPAR活性化剤、ビタミンE、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項40記載の組成物。
42. 脂質と複合体化された請求項1〜34のいずれか一項記載のポリペプチドまたは請求項36〜38のいずれか一項記載のペプチド模倣体を含む、組成物。
43. 前記脂質がリン脂質である、請求項42記載の組成物。
44. 前記リン脂質が1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロール-3-ホスファチジルコリン(「POPC」)である、請求項43記載の組成物。
45. 薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項42〜44のいずれか一項記載の組成物。
46. 請求項1〜34のいずれか一項記載のポリペプチドを哺乳動物に投与し、それによってコレステロール流出が媒介される段階
    を含む、哺乳動物におけるコレステロール流出を媒介する方法。
47. 前記ポリペプチドがABCAを安定化する、請求項46記載の方法。
48. 前記ABCAがABCA1である、請求項47記載の方法。
49. 前記ポリペプチドが抗酸化活性を有する、請求項46記載の方法。
50. 前記ポリペプチドが抗炎症活性を有する、請求項46記載の方法。
51. 前記哺乳動物がヒトである、請求項46記載の方法。
52. 前記哺乳動物が非ヒト哺乳動物である、請求項46記載の方法。
53. 請求項1〜34のいずれか一項記載のポリペプチドの治療的有効量を哺乳動物に投与する段階
    を含む、哺乳動物におけるアテローム性動脈硬化の症状を治療するための方法。
54. 前記哺乳動物が、アテローム性動脈硬化の1つまたは複数の症状を有すると診断された哺乳動物である、請求項53記載の方法。
55. 前記哺乳動物が、アテローム性動脈硬化のリスクがあると診断された哺乳動物である、請求項53記載の方法。
56. 前記哺乳動物がヒトである、請求項53記載の方法。
57. 前記哺乳動物が非ヒト哺乳動物である、請求項53記載の方法。
58. 請求項1〜34のいずれか一項記載のポリペプチドを哺乳動物に投与する段階
    を含む、哺乳動物の管腔壁内の不安定プラークを安定化するための方法。
59. 前記哺乳動物が、1つまたは複数の不安定プラークを有すると診断された哺乳動物である、請求項58記載の方法。
60. 前記哺乳動物が、1つまたは複数の不安定プラークを有するリスクがあると診断された哺乳動物である、請求項58記載の方法。
61. 両親媒性αヘリックスを含むポリペプチド変種を作製する方法であって、
    該変種がコレステロール流出活性および/またはABCA安定化活性を有し、
    該方法が、
    (a) SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する段階；
    (b)ポリペプチド変種を生成するために、該ポリペプチドの少なくとも1つのアミノ酸位を置換する段階；
    (d) コレステロール流出活性および/またはABCA安定化活性について該ポリペプチド変種をスクリーニングする段階；
    (e) SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を有する該ポリペプチドのコレステロール流出活性の少なくとも80%を有する該ポリペプチド変種を選択する、および/またはSEQ ID NO:2のアミノ酸配列を有する該ポリペプチドのABCA安定化活性の少なくとも80%を有する該ポリペプチド変種を選択する段階；ならびに
    (f) 選択された該ポリペプチド変種を合成する段階
    を含む、
    方法。
62. 前記ポリペプチド変種がDアミノ酸を少なくとも1つ含む、請求項61記載の方法。
63. 前記ポリペプチド変種のカルボキシ末端がDアミノ酸を含み、かつ該ポリペプチド変種のアミノ末端がDアミノ酸を含む、請求項61記載の方法。
64. 前記ポリペプチド変種がすべてDアミノ酸を含む、請求項61記載の方法。
65. 請求項1〜34のいずれか一項記載のポリペプチドまたは請求項36〜38のいずれか一項記載のペプチド模倣体を含む容器を含む、アテローム性動脈硬化の症状を治療するためのキット。
66. 薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項65記載のキット。
67. 単位剤形中で、前記ポリペプチドが薬学的に許容される担体と混合されている、請求項65記載のキット。
68. 薬剤として使用するための、請求項1〜34のいずれか一項記載の単離されたポリペプチドまたは請求項36〜38のいずれか一項記載のペプチド模倣体。
69. 脂質異常症に関連する障害の治療において使用するための、請求項1〜34のいずれか一項記載の単離されたポリペプチドまたは請求項36〜38のいずれか一項記載のペプチド模倣体。
70. コレステロール流出障害の治療において使用するための、請求項1〜34のいずれか一項記載の単離されたポリペプチドまたは請求項36〜38のいずれか一項記載のペプチド模倣体。
71. 高コレステロール血症の治療において使用するための、請求項1〜34のいずれか一項記載の単離されたポリペプチドまたは請求項36〜38のいずれか一項記載のペプチド模倣体。
72. 炎症の治療において使用するための、請求項1〜34のいずれか一項記載の単離されたポリペプチドまたは請求項36〜38のいずれか一項記載のペプチド模倣体。
73. アテローム性動脈硬化の治療においてまたはアテローム性動脈硬化の症状を予防するための治療において使用するための、請求項1〜34のいずれか一項記載の単離されたポリペプチドまたは請求項36〜38のいずれか一項記載のペプチド模倣体。
74. プラークの安定化に関する治療において使用するための、請求項1〜34のいずれか一項記載の単離されたポリペプチドまたは請求項36〜38のいずれか一項記載のペプチド模倣体。
75. インビトロでABCAに結合させるための、請求項1〜34のいずれか一項記載の単離されたポリペプチドまたは請求項36〜38のいずれか一項記載のペプチド模倣体の使用。
76. 検出可能な部分に直接または間接的に結合している、請求項1〜34のいずれか一項記載の単離されたポリペプチドまたは請求項36〜38のいずれか一項記載のペプチド模倣体
    を含む、検出可能な親和性リガンド。
77. 標識が、蛍光色素、金属、発色団色素、化学発光化合物、生物発光タンパク質、酵素、放射性同位体、磁性酸化鉄粒子、気体含有小胞、および量子ドットからなる群より選択される、請求項76記載の検出可能な親和性リガンド。

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