CN102123722A - 改进的胆固醇流出的肽介质 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一族非天然存在的多肽，其具有与全长载脂蛋白(例如，Apo AI和Apo E)相似的胆固醇流出活性，并具有与全长载脂蛋白相似的对ABAC1的高选择性。本发明还提供了包含这样的多肽的组合物，鉴别、筛选和合成这样的多肽的方法，以及治疗、预防或诊断与血脂异常、高胆固醇血症和炎症有关的疾病和疾患的方法。

Description

改进的胆固醇流出的肽介质
相关申请的交叉参考
本申请要求2008年6月18日提交的美国临时专利申请No.61/073,708的优先权，该申请以引用的方式并入本文中。
本申请的主题还涉及2007年12月13日提交的PCT申请No.PCT/US07/87477，该申请的公开出于所有目的以引用的方式全文并入本文中。
在联邦政府资助的研究和开发下作出本发明的权利声明。
本发明按照由美国能源部(U.S.Department of Energy)授予的合同No.DE-AC02-05CH11231和由国家老年研究所(National Institutes of Aging)授予的许可(合同)No.R03-AG023153在政府支持下完成。政府享有本发明的某些权利。
导致本发明的研究还受到Artery Therapeutics，Inc.发起的研究协议(LBNL Work for Other Agreement No.LB05-001119)和加利福尼亚州烟草相关的疾病研究(Tobacco Related Disease Research Program of the State of California)授予的准许No.13IT-0025的资助。
背景技术
心血管疾病(CVD)是美国和全世界发病率和死亡率的首要原因。胆固醇在动脉壁内的巨噬细胞中的积累促进泡沫细胞的形成，并且动脉粥样硬化构成了CVD的主要原因(Schmitz，G.and Kaminski，W.E.，“ATPcassette(ABC)transporter in atherosclerosis，”Curr Atheroscler Rep，4(3)：243-51(2002))。巨噬细胞中的胆固醇积累在很大程度上取决于由含载脂蛋白B的脂蛋白粒子(例如VLDL、IDL和LDL)的产生沉积和由ApoA-I和ApoE粒子产生的胆固醇清除之间的平衡。通过他汀类和其他降胆固醇药物降低血浆LDL浓度预防大约1/3的CVD事件，而仍有2/3的事件(例如参见“Randomized trial of cholesterol lowering in 4444 patients with coronary heart disease：the Scandinavian Simvastatin Survival Study(4S)”，Lancet，344(8934)：1383-1389(1994)；和“ Influence of pravastatin and plasma lipid on clinical events in the West of Scotland Coronary Preven
血浆HDL胆固醇水平升高与减少动脉粥样硬化的风险有关(Gordon et al，“High Density Lipopropein As A Protective Factor Against Coronary Heart Disease，”Am.J.Med.，62：707-14(1977))。近年来流行病学研究已将HDL的保护性作用归于其主要载脂蛋白Apo A-I(Walldius，G，et al.，High Apolipoprotein B，Low Apolipoprotein A-I，And Improvement In The Prediction of Fatal Myocardial Infarction(AMORIS study)：A Prospective Study，″Lancet，358(9298)：2026-33(2001)；和Yusuf et al，“Effect of Potentially Modifiable Risk Factors Associated With Myocardial Infarction in 52 Countries(the INTERHEART study)：Case-control Study，”Lancet，364(9438)：937-52(2004))。HDL的有益作用部分是与介导抗动脉粥样硬化的胆固醇逆向转运(RCT)途径中的活性有关。RCT参与胆固醇从外周巨噬细胞转运到肝中以在粪便中排泄固醇(Lewis et al，“New Insights Into The Regulation of HDL Metabolism and Reverse Cholesterol Transport，”Circ.Res.，96：1221-32(2005))。RCT的限速步骤包括通过天然载脂蛋白(例如Apo A-I和Apo E)介导，刺激胆固醇从巨噬细胞中流出。该胆固醇流出过程产生新生HDL并需要ATP-结合盒转运蛋白A1(ABCA1)，否则动脉粥样硬化发展(Calpe-Berdiel et al，″Direct Evidence In Vivo of Impaired Macrophage-Specific Reverse Cholesterol Transport in ATP-Cassette Transporter A1-Deficient Mice，″Biochim.Biophys.Acta.，1738(1-3)：6-9(2005)。ABCA1是丹吉尔(Tangiers)病的缺陷分子，该病的特征在于血浆HDL严重缺乏和早发动脉粥样硬化(Attie et al，“Pivotal Role of ABCA1 in Reverse Cholesterol Transport Influencing HDL Levels and Susceptibility to Atherosclerosis，”J Lipid Res.，42(11)：1717-26(2001))。载脂蛋白A和E还通过阻止降解来稳定细胞ABCA1蛋白，这确保了高水平的细胞胆固醇输出和HDL装配。
在策略的开发中已经对HDL的临床重要性产生关注，以出于治疗目的调控RCT。概念研究的探索性证据表明注射在磷脂复合体中的全长Apo A-I变体，例如proApoA-I、Apo A-I Milano、和Apo A-1 2野生型，增加了RCT(Eriksson et al.，“Stimulation of Fecal Steroid Excretion After Infusion of Recombinant Proapolipoprotein A-I.Potential Reverse Cholesterol Transport in Humans，”Circulation，100(6)：594-8(1999))、并使冠状动脉粥样硬化退化(Nissen et al，″Effect of Recombinant ApoA-I Milano on Coronary Atherosclerosis in Patients with Acute Coronary Syndromes：A Randomized Controlled Trial，″JAMA，290(17)：2292-300(2003)；and Tardif et al，“Effect of rHDL on Atherosclerosis-Safety and Efficacy(ERASE)Investigators，”JAMA，297：1675-82.Epub March 26(2007))。尽管若将有前途的全长ApoA-I蛋白开发成商业产品，则它们作为治疗剂还具有一些缺点。例如，Apo A-I为长度243个氨基酸的蛋白，生产出商业产品所需要的量远不是小事。另外，Apo A-I变体例如Milano和Paris变体，可由于它们的外源性质而激发免疫应答。
因此，本领域需要使用有效的RCT途径以介导胆固醇流出、从而稳定和消退动脉粥样硬化斑块即治疗心血管疾病的另外的组合物和方法。出人意料地，本发明通过提供这样的组合物和方法而满足了这种要求和其他要求。
发明内容
本发明涉及对脂质代谢具有效果的肽。脂质是重要的细胞结构成分，并且为基本的细胞信号传导提供源材料，包括前列腺素、活性氧化物质等。通过信号传导途径，脂质还有助于细胞因子对例如炎性刺激反应的安排。这种脂质作用牵涉在一些疾病状态中，包括但不限于动脉粥样硬化以及神经、炎症和感染疾病表现。所述肽直接或通过介质发挥它们的作用。介质包括但不限于HDL、ABC转运蛋白以及用于氧化和炎症的介质。
在一方面，本发明因此提供一族多肽，所述多肽在重量基础上具有与全长载脂蛋白(例如Apo AI和Apo E)类似、优选超越的胆固醇流出活性；并具有与全长载脂蛋白类似的对于ABAC1的高选择性。更特别地，本发明提供一族非天然存在的多肽，所述多肽起到对ABCA1高亲和性功能配体的作用，并且在每分子基础上以与天然载脂蛋白近似的能力和效力刺激细胞胆固醇流出。本发明的多肽体内刺激胆固醇从巨噬细胞源性泡沫细胞流出，促进粪便固醇排泄的持续增长，并且在高胆固醇血症小鼠中降低动脉粥样硬化的严重性。
同样地，本发明的多肽，即对ABCA1具有有效的和选择性活性的多肽，可治疗性地用于提高ABCA1稳定性和ABCA1脂质流出活性，并且其可单独使用，或可选择地，与其他已知试剂联合使用，以治疗心血管疾病，从而减少动脉粥样硬化。另外，本发明的多肽可单独使用，或可选择地，与其他已知试剂联合使用，以治疗急性冠脉综合征，从而减少斑块脂质含量并稳定易损性斑块。另外，本发明的多肽可单独使用，或可选择地，与其他已知试剂联合使用，以治疗血脂异常、高胆固醇血症和炎症，从而提高血浆HDL浓度和/或促进胆固醇逆向转运。
本发明的肽包含了某些特征，它们共同限定了所述肽的药代动力学和药效学性能。这些特征包括α螺旋结构和氨基酸沿着α螺旋结构的两性亲取向。所述肽沿着亲水性轴包含两个分离的酸性残基集中点。α螺旋结构还通过在脂质-水内相中形成天然氨基酸盐桥而进一步增强。此外所述肽缺乏明显的立体特异性作用，例如包含L和D氨基酸以及反向形式氨基酸的肽同等良好地发挥作用。所述肽包含20个氨基酸残基的核心序列，所述氨基酸残基选择性地与血浆中的HDL结合并且以细胞中的ABCA1转运蛋白为靶。
疏水性促进药效学，例如，沿着α螺旋的轴的疏水性楔角使所述肽定位于ABCA1转运蛋白附近的细胞膜中，从而允许功能性相互作用。因此，所述肽以生理学方式与细胞膜相互作用，因为它们在非特异性细胞膜影响最小的条件下赋予ABCA1特异性脂质流出。
在另一方面，本发明部分基于在长度为20个氨基酸的小肽中，利用在单螺旋中适当位置例如10、12位等的疏水性残基例如L、F、I、W，能够扩展该螺旋的非极性表面区域(即，增加疏水性足迹)，以提供具有20个氨基酸核心序列并具有天然的ABCA1流出刺激活性的小的单螺旋肽，也就是达到可与天然蛋白质、例如具有许多由脯氨酸连接的两亲性α螺旋的ApoAI相匹敌的ABCA1流出活性。此外，在一些实施方案中，本发明提供具有扩大的疏水性足迹的20个氨基酸长度的肽，其中所述肽能够与HDL以免除需要配制磷脂的水平结合起来。
在一个方面，本发明提供分离的多肽，其包含下面的氨基酸序列(并且在某些实施方案中，由所述氨基酸序列构成，或者基本由所述氨基酸序列构成)：X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20其中：X1、X7、X11和X15是独立选自E和D的氨基酸；X4和X18是独立选自E、D和A的氨基酸；X9、X10、X13、X16和X20是独立选自F、L和W的氨基酸；X17是氨基酸L、A、F或W；X3、X5和X19是独立选自R和K的氨基酸；X14是氨基酸R、A或E；和X2、X6、X8和X12是独立选自L、V和A的氨基酸；其中每个字母代表传统的单字母氨基酸密码。
本发明还提供包含下面的氨基酸序列(并且在某些实施方案中，由所述氨基酸序列构成，或者基本由所述氨基酸序列构成)的多肽：X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20(SEQ ID NO：1)其中：X1、X7和X15是独立选自E和D的氨基酸；X4、X11和X18是独立选自E、D、A和G的氨基酸；X2、X6、X9，X10、X12、X13、X16、X17和X20是独立选自F、L、W、I、V和A的氨基酸；X3、X5和X19是独立选R、K和C的氨基酸；X14是氨基酸R、A、E或C；和X8是A、G或V。在本发明这类肽的一些实施方案中，X2、X6、X9、X10、X12、X13、X16、X17和X20独立选自F、L、I和W。在一些实施方案中，X4、X11和X18独立选自A、D和E。在一些实施方案中，X4和X11位是A。在一些实施方案中，X4和X11位独立选自D和E。在一些实施方案中，X9是L、F或W。在一些实施方案中，X2、X6、X12和X1位中的至少三个是L。在一些实施方案中，X14是R；和X17是L或F。在一些实施方案中，X8是A。在一些实施方案中，X2是L或V。在一些实施方案中，X6、X10、X12、X13、X16、X17和X20独立地选自F、L、I和W。在一些实施方案中，X6、X10、X12、X13、X16、X17和X20独立地选自F和L。
在一些实施方案中，本发明的肽包含下面的氨基酸序列(并且在某些实施方案中，由所述氨基酸序列构成，或者基本由所述氨基酸序列构成)：X1X2X3X4X5X6X7AX9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20(SEQID NO：27)，其中：X1、X7、X15和X18独立选自D和E；X2是L、I或V；X4和X11独立选自D、E和A；X3、X5和X19独立选自K和R；X9是W、F或L；X14是R、E或A；并且X6、X10、X12、X13、X16、X17和X20独立选自F、L、I和W。在一些实施方案中，X10、X12、X13、X16、X17和X20独立选自F和L。
在一些实施方案中，本发明提供了包含下面的氨基酸序列(并且在某些实施方案中，由所述氨基酸序列构成，或者基本由所述氨基酸序列构成)的肽：X1LRAX5LX7AX9X10AX12X13RX15X16X17X18RX20(SEQ ID NO：28)，X1、X7、X15和X18独立选自D和E；X5是K或R；X9是W、L或F；并且X10、X12、X13、X16、X17和X20独立选自F和L。
在一些实施方案中，本发明提供了包含下面的氨基酸序列(并且在某些实施方案中，由所述氨基酸序列构成，或者基本由所述氨基酸序列构成)的肽：X1LRX4X5LX7AX9X10X11X12X13RX15X16X17X18RX20(SEQ ID NO：29)，其中X1、X4、X7、X11、X15和X18独立选自E和D；X5是K或R；X9是F、L或W；并且X10、X12、X13、X16、X17和X20独立选自F和L。
在一些实施方案中，本发明的肽包含下面的氨基酸序列(并且在某些实施方案中，由所述氨基酸序列构成，或者基本由所述氨基酸序列构成)：ELR(D/E)(K/R)LEA(W/F/L)(F/L)(D/E)L(F/L)RE(F/L)LER(F/L)(SEQ ID NO：30)。
在一些实施方案中，本文描述的本发明的肽还包含X21，其中X21选自C、K、Y或L。在一些实施方案中，本发明的多肽还包含X21和X22，其中X21选自C、K、Y和L，和X22是S或C。在一些实施方案中，X21是K。在一些实施方案中，X22是S。在一些实施方案中，X21或X22是C。本发明的多肽具有胆固醇流出活性和ABCA1-稳定化活性。
在一些实施方案中，半胱氨酸在两亲性α螺旋的脂-用水界面处被引入本发明的肽，例如，选自SEQ ID NO：2-33的肽，置换带正电荷的氨基酸例如精氨酸或赖氨酸。典型地，包含半胱氨酸置换的本发明的肽在每个肽和/或螺旋段上具有一个半胱氨酸。因此在一些实施方案中，半胱氨酸存在于SEQ ID NO：1的3、5、14或19位，或在SEQ ID NO：27的3、5、14或19位置换。例如，在一些实施方案中，本发明的肽例如SEQ ID NO：2，包含以下置换之一：R3→C，K5→C，R14→C和R19→C。在一些实施方案中，SEQ ID NO：27、28、29或30的肽也可在3、5、14或19位包含半胱氨酸置换。在一些实施方案中，本发明的肽可以在SEQ ID NO：1中包含半胱氨酸或在SEQ ID NO：27、28、39或30的3、5、14或19位处置换的半胱氨酸，和21或22位处的第二个半胱氨酸残基。
在一些实施方案中，本发明的肽包含选自下列的氨基酸序列(并且在某些实施方案中，由所述氨基酸序列构成，或者基本由所述氨基酸序列构成)：
ELREKLEAWFELFREFLERF(SEQ ID NO：2)，
ELRERLEAWFELFREFLERF(SEQ ID NO：3)，
ELRDKLEAWFDLFREFLERF(SEQ ID NO：4)，
DLRDKLDAWFDLFRDFLDRF(SEQ ID NO：5)，
ELRDRLEAWFDLFREFLERF(SEQ ID NO：6)，
DLRDRLDAWFDLFRDFLDRF(SEQ ID NO：7)，
ELREKLEAWLELLRELLERL(SEQ ID NO：8)，
ELRERLEAWLELLRELLERL(SEQ ID NO：9)，
ELRDKLEAWLDLLRELLERL(SEQ ID NO：10)，
DLRDKLDAWLDLLRDLLDRL(SEQ ID NO：11)，
ELRDRLEAWLDLLRELLERL(SEQ ID NO：12)，
DLRDRLDAWLDLLRDLLDRL(SEQ ID NO：13)，
EVREKLEAWFEAFREFAERFKS(SEQ ID NO：14)，
EVREKLEAWFELFREFAERFKS(SEQ ID NO：15)，
EVREKLEAWFELFREFAERFLS(SEQ ID NO：16)，
EVREKLEAWFELFREFLERFKS(SEQ ID NO：17)，
EVREKLEAWFELFREFLERFLS(SEQ ID NO：18)，
EVREKLEAWFELFREFLERFL(SEQ ID NO：19)，
EVREKLEAWFELFREFLERF(SEQ ID NO：20)，
EIREKIEAWIEIIREIIERI(SEQ ID NO：21)，
ELREKLEAWFELFEEFFARFKS(SEQ ID NO：22)，
ELREKLEAWFELFAEFFARFKS(SEQ ID NO：23)，
ELREKLEAWFELFAEFFARFK(SEQ ID NO：24)，
ELREKLEAWFELFAEFFARF(SEQ ID NO：25)，
ELRAKLEAWFEAFAEFFARF(SEQ ID NO：26)，
ELREKLEAWFELFREFLERFKS(SEQ ID NO：31)
ELREKLEALFELFREFLERF(SEQ ID NO.32)，和
ELREKLEAFFELFREFLERF(SEQ ID NO：33)。
在另一个方面，本发明提供具有氨基酸序列SEQ ID NOs：2-26、31、32或33的多肽的多肽变体。在一个实施方案中，所述多肽与选自SEQ ID NOs：2-26、31、32和33的氨基酸序列具有至少75％同一性。在优选的实施方案中，所述多肽与选自SEQ ID NOs：2-26、31、32和33的多肽具有至少75％的同一性，优选80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
本发明还提供具有胆固醇流出活性的多肽，其中所述多肽是具有实施例2中表A、表B或表C显示的序列的多肽。
在一些实施方案中，本发明的肽例如通过脯氨酸残基与另一种具有胆固醇流出活性的两亲性的α螺旋肽连接。在一些实施方案中，本发明的肽与本发明的第二种肽连接。本发明的第二种肽可以是相同的肽，或不同的肽。因此，本发明还提供包含本发明的一种或多种肽的、具有胆固醇流出活性的多肽。
在一些实施方案中，本发明的多肽还包含保护基团。例如，所述多肽可被修饰，使得组成氨基酸和/或末端氨基酸上的R基团被保护基团封闭，即保护。现已发现封闭、特别是氨基和/或羧基末端的封闭明显改善口服递送并显著延长血清半衰期。因此，在一个实施方案中，本发明的多肽还包含与氨基或羧基末端连接的保护基团。在一个实施方案中，多肽还包含与氨基末端连接的第一保护基团和与羧基末端连接的第二保护基团。
合适的保护基团包括但不限于：乙酰基(Ac)、酰胺、3至20个碳的烷基、Fmoc、叔丁氧羰基(Tboc)、9-芴乙酰基、1-芴羧基、9-芴羧基、9-芴酮-1-羧基、苄氧羰基、呫吨基(Xan)、三苯甲基(Trt)、4-甲基三苯甲基(Mtt)、4-甲氧基三苯甲基(Mmt)、4-甲氧基-2，3，6-三甲基-苯磺酰基(Mtr)、均三甲苯-2-磺酰基(Mts)、4，4-二甲氧二苯甲基(Mbh)、甲苯磺酰基(Tos)、2，2，5，7，8-五甲基色满-6-磺酰基(Pmc)、4-甲基苄基(MeBzl)、4-甲氧基苄基(MeOBzl)、苄氧基(BzlO)、苄基(Bzl)、苯甲酰基(Bz)、3-硝基-2-吡啶次磺酰基(Npys)、1-(4，4-二甲基-2，6-二氧亚环己基)乙基(Dde)、2，6-二氯苄基(2，6-DiCl-Bzl)、2-氯苄氧羰基(2-Cl-Z)、2-溴苄氧羰基(2-Br-Z)、苄氧基甲基(Bom)、环己氧基(cHxO)、叔丁氧基甲基(Bum)、叔丁氧基(tBuO)、叔丁基(tBu)和三氟乙酰基(TFA)。
在优选的实施方案中，多肽包含与氨基末端连接的第一保护基团，所述第一保护基团包括但不限于乙酰基、丙酰基和3至20个碳的烷基。在优选的实施方案中，第一保护基团为乙酰基。在另一个优选的实施方案中，多肽包含与羧基末端连接的第二保护基团，所述第二保护基团为酰胺。
本发明的多肽可以全部包含“L”氨基酸、全部包含“D”氨基酸或“L”和“D”氨基酸的混合物。意外地发现全部包含D氨基酸的多肽像L氨基酸多肽一样具有刺激胆固醇流出的高的能力和高的亲和性。
本发明的多肽具有胆固醇流出活性。在一些实施方案中，本发明的多肽具有ABCA1稳定活性。在一个实施方案中，本发明的多肽保护磷脂避免被氧化剂氧化(即所述多肽具有抗氧化活性)。在一个实施方案中，本发明的多肽具有抗炎活性。在优选的实施方案中，本发明的多肽具有一种或这些多种活性。在甚至更优选的实施方案中，本发明的多肽具有各种这些活性。
本发明的肽典型地通过与人血浆中的主要HDL粒子--不同的α-HDL粒子结合/相互作用，并且还将α-HDL粒子改型，以移除apoA-I，从而产生前β-HDL粒子，导致人血浆前β-1HDL形成。
此外，本发明的肽是有力的，并且以2∶1的肽∶apoA-I(血浆中)的摩尔比率、更典型以1∶1的摩尔比率、更加经常以1∶5或1∶10或更低的比率，导致前β-1和ABCA1-介导的胆固醇流出。
本发明的又一个实施方案提供药物组合物，所述药物组合物包含本文中描述的至少一种多肽和药学上可接受的载体或赋形剂。在一些实施方案中，所述药物组合物包含另外的治疗剂(例如他汀类，例如阿伐他汀，洛伐他汀，普伐他汀，辛伐他汀，氟伐他汀或罗伐他汀；胆酸结合剂，例如消胆胺或考来替泊；Nieman-Pick C1样1(Nieman-Pick C1-Like 1)固醇转运蛋白通道抑制剂，例如依泽替米贝；血小板聚集抑制剂，例如阿司匹林、噻氯匹定或氯吡格雷；烟酸/烟酰胺；PPAR激活剂；维生素E；或其组合)以治疗与胆固醇流出(有关的疾病或病症例如心血管疾病)。
本发明的另一个方面提供本文中公开的多肽的肽模拟物。在一个实施方案中，本发明提供的肽模拟物具有基本上如同具有氨基酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：30的多肽那样的三维构象。在另一个实施方案中，本发明提供的肽模拟物具有基本上如同具有选自SEQ ID NOs：2-26、31、32和33的氨基酸序列的多肽那样的三维构象。在一个实施方案中，肽模拟物为反-转型类似物(retro-inverso analog)。在另一个实施方案中，肽模拟物为反-对映类似物(retro-enantio analog)。在又一个实施方案，肽模拟物为反式烯烃(trans-olefin)类似物。如本文中所述，本发明的肽模拟物能包含其他主链修饰。至于本发明的多肽，本发明的肽模拟物还可包含保护基团，并且保护基团优选在氨基和羧基末端处。
在另一个方面，本发明提供两亲性α-螺旋肽，其作为包含一个α-螺旋区段并具有胆固醇流出活性的肽，例如选自SEQ ID NO：1-33的肽，结合到相同的ABCA1结合位点。本发明还提供一种结合HDL的两亲性α-螺旋肽。另外，本发明还提供分离的刺激ABCA1-特异性胆固醇流出的两亲性α螺旋肽，例如，其具有单一的20个氨基酸α-螺旋肽元件，并且在一些实施方案中具有21个氨基酸或22个氨基酸的α-螺旋肽元件。
在又一个方面，本发明提供一种组合物，所述组合物包含与脂质复合的本发明的多肽例如具有选自由SEQ ID NO：1-33的氨基酸序列的多肽或其肽模拟物。在一个实施方案中，脂质为磷脂。在另一个实施方案，磷脂为1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(“POPC”)。在又一个实施方案中，组合物还包含药学上可接受的载体。
本发明的又一个方面提供通过将本文中描述的至少一种多肽或肽模拟物施用至对象来介导哺乳动物对象(例如灵长类动物如人或黑猩猩、或啮齿动物如大鼠或小鼠)中的胆固醇流出的方法。本领域技术人员将理解编码这种多肽(或肽模拟物)的核酸可被施用到对象以代替施用所述多肽(或肽模拟物)。本发明提供这样的核酸。基于它们的胆固醇流出活性，本发明的多肽和肽模拟物可有利地用于治疗、改善或预防与血脂异常、高胆固醇血症和炎症有关的疾病或状况。
在另一个方面，本发明提供合成的脂质粒子，例如合成的LDL或HDL粒子，用于递送包含本文描述的多肽、例如具有选自SEQ ID NO：1-33的序列的多肽的治疗或诊断剂。这样的粒子能够用于例如递送用于治疗癌症或治疗感染的治疗剂。
本发明的又一个方面提供了通过将本文中描述的至少一种多肽或肽模拟物施用至对象来治疗或预防哺乳动物中的动脉粥样硬化症状的方法。此外，本领域技术人员将理解编码这种多肽(或肽模拟物)的核酸可被施用到对象以代替施用所述多肽(或肽模拟物)。本发明提供这样的核酸。在该方法的一个实施方案中，哺乳动物是被诊断为具有动脉粥样硬化的一种或多种症状的哺乳动物。在另一个实施方案中，哺乳动物被诊断为存在动脉粥样硬化风险。优选地，哺乳动物是人，但也可以是非人动物。在一个示例性实施方案中，多肽具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：30的氨基酸序列，或选自SEQ ID NOs：2-26、31、32和33的氨基酸序列。
在另一个相关的实施方案中，该方法还包括施用到少一种附加的治疗剂。这种治疗剂的例子包括但不限于抗体、酶抑制剂、抗菌剂、抗病毒剂、类固醇、非类固醇抗炎剂、抗代谢物、细胞因子、或可溶性细胞因子受体。酶抑制剂可以是蛋白酶抑制剂或环氧合酶抑制剂。附加剂可作为药物组合物的一部分加入，或者可伴随施用或在附加剂的生理作用与本发明的多肽或肽模拟物的生理作用重叠的时间期限内施用。更具体地，附加剂可伴随施用或在施用多肽或肽模拟物之前一个星期、几天、24小时、8小时或即刻施用。可选择地，附加剂可在施用多肽或肽模拟物之后一个星期、几天、24小时、8小时或即刻施用。
本发明的又一个方面提供稳定易损性斑块的方法，该方法包括将本文中描述的至少一种多肽或肽模拟物施用至哺乳动物。此外，本领域技术人员将理解编码这种多肽的核酸可被施用到对象以代替施用多肽。这样的核酸由本发明提供。在该方法的一个实施方案中，哺乳动物是被诊断患有一种或多种易损性斑块的哺乳动物。在另一个实施方案中，哺乳动物被诊断为存在患有易损性斑块的风险。哺乳动物优选是人，但也可以是非人动物。在一些实施方案中，多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO.1、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO.29或SEQ ID NO：30。在一些实施方案中，多肽具有选自SEQ ID NOs：2-26、31、32和33的氨基酸序列。
本发明还提供治疗或预防与血脂异常、高胆固醇血症或炎症有关的疾病或状况的试剂盒。在优选的实施方案中，本发明提供治疗或预防动脉粥样硬化的症状的试剂盒，所述试剂盒包含含有本发明的多肽或肽模拟物的容器。所述试剂盒还可包含药学上可接受的载体。另外，所述试剂盒还能包含教导使用多肽或肽模拟物治疗或预防与血脂异常、高胆固醇血症或炎症有关的疾病或状况例如动脉粥样硬化的说明材料。本发明的试剂盒中提供的多肽和肽模拟物可全部包含L氨基酸、全部包含D氨基酸、或L和D氨基酸的混合物。
与上述试剂盒有关的是，说明材料可包括使用药物组合物的文件或记录介质，包括书面的或可听的说明。说明材料包括例如)瓶上的标签、盒中插入的纸、印刷在盒或箱上、在任何这些位置中给出的网址提供的说明书等等。
在另一个方面，本发明提供制备具有胆固醇流出活性和/或ABCA稳定活性的多肽变体的方法，该方法包括：(a)提供具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：30的氨基酸序列或具有选自SEQ ID NOs：2-26、31、32和33的氨基酸序列的多肽；(b)修饰所述多肽的至少一个氨基酸位置以产生多肽变体；(c)筛选所述多肽变异体的胆固醇流出活性和/或ABCA稳定活性；(d)选择胆固醇流出活性为亲本多肽的至少80％的多肽变体和/或选择ABCA稳定活性为为亲本多肽的的至少80％的多肽变体；以及(e)合成所述选择的多肽变体。在一些实施方案中，多肽通过例如置换、缺失或插入一个、两个、三个或更多氨基酸而修饰。例如，在一些实施方案中，22-聚体可被修饰以产生具有胆固醇流出活性的20-聚体。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸被保守氨基酸置换。多肽可包含一种或多种D氨基酸。在该方法的一些实施方案中，修饰或变异的多肽全部包含D氨基酸。另外，为了修饰多肽的一个或多个氨基酸，多肽的主链还可被修饰以制备如本文中所述的肽模拟物。
在又一个方面，本发明提供本发明的至少一种多肽或肽模拟物在制备介导哺乳动物中的胆固醇流出的药物中的应用。在示例性实施方案中，多肽具有选自SEQ ID NO：1-33或者其肽模拟物的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述肽模拟物具有的三维构象基本上与具有选自SEQ ID NO：1-33的氨基酸序列的多肽相同。
在又一个方面，本发明提供本发明的至少一种多肽或肽模拟物在制备治疗哺乳动物中动脉粥样硬化症状的药物中的应用。在示例性实施方案中，多肽具有选自SEQ ID NO：1-33或者其肽模拟物的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述肽模拟物具有的三维构象基本上与具有选自SEQ ID NO：1-33的氨基酸序列的多肽相同。
在又一个方面，本发明提供本发明的至少一种多肽或肽模拟物在制备稳定哺乳动物的易损性斑块的药物中的应用。在示例性实施方案中，多肽具有选自SEQ ID NOS：1-33或者其肽模拟物的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述肽模拟物具有的三维构象基本上与具有选自SEQ ID NO：1-33的氨基酸序列的多肽相同。
本发明的另一个方面提供编码本发明多肽的分离的核酸、包含所述核酸的表达载体和包含所述表达载体的宿主细胞。
本发明的多肽和肽模拟物还可用作研究工具和/或诊断工具。例如，这种肽可用于鉴别具有反向胆固醇缺乏血浆的对象和对反向胆固醇治疗起反应的那些对象。此外，本发明的多肽可用于评价其他化合物(例如包括肽模拟物)的抗动脉粥样硬化潜能。
另外，本发明的多肽或肽模拟物可用于研究动物和动物模型中的脂蛋白-受体相互作用，特别是在本发明的多肽或肽模拟物被标记(例如，放射性标记、荧光标记等)时更是如此。
本发明的多肽或肽模拟物还可用于鉴别阐明脂质代谢途径的合适的动物模型。例如，多肽或肽模拟物可用于鉴别对于胆固醇逆向转运有作用的动物模型以及基因和/或药物相互作用。
通过阅读下面的详细描述、实施例、权利要求和附图，本发明和其优选的实施方案的其他特征、目的和优点将是明显的。
附图说明
图1显示肽N257-11的螺旋轮状图。
图2显示本发明的肽SEQ ID NO：2的螺旋轮状图和螺旋网状图(helical net diagram)。其中图A显示了展示所述肽的两亲性质的旋轮图。图B显示了展示所述肽沿极性表面的长轴下切并展平的螺旋网状图。带阴影的圆圈指示酸性氨基酸，部分带阴影的圆圈指示阳离子残基。两个图中的编号是指一级氨基酸序列。
图3提供了显示SEQ ID NO：2对比全长apoA-I的胆固醇流出活性的数据。其中图A显示胆固醇流出对浓度的依赖性(无脂质的SEQ ID NO：.2肽(正方形)；无脂质的载脂蛋白(apo)A-I(圆圈))。图B显示利用cAMP处理和不处理细胞确定的胆固醇流出对ABCA1表达的依赖性。
图4提供了数据显示，SEQ ID NO：2的将残基KS加到C端的22-聚体类似物刺激ABCA1胆固醇流出。
图5提供了数据证明，亮氨酸(L)或苯丙氨酸(F)能够置换SEQ ID NO：2中的色氨酸(W)而不会不利影响ABCA1胆固醇流出活性的数据。其中图A显示响应所指出的肽的处理，在培养基中出现的细胞[3H]胆固醇的百分比。图B显示胆固醇流出对肽浓度的依赖性。
图6提供了数据显示缬氨酸能够置换胆固醇流出肽的非极性表面上的缬氨酸，而不会不利地影响活性。其中图A显示响应所指出的肽的处理，在培养基中出现的细胞[3H]胆固醇的百分比(8h)。图B显示胆固醇流出对肽浓度的依赖性。
图7提供了数据显示，刺激ABCA1胆固醇流出受到肽中疏水性亮氨酸残基数量的影响。其中图A显示响应所指出的肽的处理，在培养基中出现的细胞[3H]胆固醇的百分比。图B显示胆固醇流出对肽浓度的依赖性。
图8提供数据显示，本发明的肽能够在非极性表面上用亮氨酸残基或亮氨酸和异亮氨酸残基的组合进行改造，而不会不利影响ABCA1胆固醇流出活性。其中图A和B显示响应所指出的肽的处理，在培养基中出现的细胞[3H]胆固醇的百分比。图C显示胆固醇流出对肽浓度的依赖性。
图9提供数据显示，本发明的肽能够在非极性表面上用数量渐增的苯丙氨酸进行改造，而不会不利影响刺激ABCA1胆固醇流出的能力。其中图A显示响应所指出的肽的处理，在培养基中出现的细胞[3H]胆固醇的百分比。图B显示胆固醇流出对肽浓度的依赖性。
图10提供的数据显示，本发明的肽的亮氨酸和苯丙氨酸残基能够代替异亮氨酸而不会不利地影响刺激ABCA1胆固醇流出的能力。其中图A显示响应所指出的肽的处理，在培养基中出现的细胞[3H]胆固醇的百分比。图B显示胆固醇流出对肽浓度的依赖性。
图11提供的数据显示，带正电荷的精氨酸能够置换肽中带正电荷的赖氨酸而不会不利地影响刺激ABCA1胆固醇流出的能力。其中图A显示响应所指出的肽的处理，在培养基中出现的细胞[3H]胆固醇的百分比。图B显示胆固醇流出对肽浓度的依赖性。
图12提供的数据显示，带负电荷的天冬氨酸能够置换带负电荷的谷氨酸而不会不利地影响刺激ABCA1胆固醇流出的能力。其中图A显示响应所指出的肽的处理，在培养基中出现的细胞[3H]胆固醇的百分比。图B显示胆固醇流出对肽浓度的依赖性。
图13提供的数据显示，天冬氨酸和谷氨酸残基在本文描述的肽中是可互换的，而且任一种均可被用于与其它氨基酸置换进行组合。结果表示为利用SEQ ID NO：2肽获得的对照活性的百分数(8h)。
图14提供的数据显示，色氨酸(W)或苯丙氨酸(F)能够置换12位处的亮氨酸(L)而不会不利地影响肽刺激ABCA1胆固醇流出的能力。其中图A和B显示响应所指出的肽的处理，在培养基中出现的细胞[3H]胆固醇的百分比。
图15提供数据显示，本本发明的肽肽肽能够以全部D-氨基酸或反向序列使用而不会不利地影响刺激ABCA1胆固醇流出的能力。图15显示响应所指出的肽的处理，在培养基中出现的细胞[3H]胆固醇的百分比。
图16提供的数据显示，极性表面上的丙氨酸置换有利地增加了本发明的肽刺激ABCA1胆固醇流出的能力。其中图A和B显示响应所指出的肽的处理，在培养基中出现的细胞[3H]胆固醇的百分比。图C显示胆固醇流出对肽浓度的依赖性。
图17提供的数据显示，丙氨酸能够置换精氨酸14(R14)和谷氨酸18(E18)而不会不利地影响刺激ABCA1胆固醇流出的能力其中图A显示响应所指出的肽的处理，在培养基中出现的细胞[3H]胆固醇的百分比。图B显示胆固醇流出对肽浓度的依赖性。
图18提供的数据显示，本发明的肽能够用磷脂配制，以产生通过ABCA1-依赖性和-不依赖性机制支持高水平的细胞胆固醇流出的复合物。其中图A显示表明肽∶POPC复合物的粒度的凝胶照片。图B显示肽∶POPC复合物的胆固醇流出活性。
图19提供的数据显示本发明的肽在用高脂西式膳食喂养的载脂蛋白E-缺乏的小鼠中减少已形成的动脉粥样硬化。其中图A显示对照和肽处理小鼠中动脉粥样硬化的程度，表示为覆盖有病变的主动脉的百分比。图B显示主动脉窦斑块的脂质含量，通过油红O染色确定。
图20提供数据显示，使用氨基酸置换来赋予针对髓过氧物酶(MPO)来源的氧化产物的抗性。其中图A显示用和不用丙烯醛温育的SEQ IDNO：2肽的胆固醇流出活性。图B显示SEQ ID NO：12肽的胆固醇流出活性。
图21提供的数据显示，本发明的肽在人血浆中通过涉及不同HDL亚群的高度特异性的机制，引起前β-1HDL形成。
本发明示例性序列的简要说明
SEQ ID NO：1是：
Figure BPA00001311663500191
SEQ ID NO：27是：
Figure BPA00001311663500192
SEQ ID NO：28是：
Figure BPA00001311663500193
SEQ ID NO：29是：
SEQ ID NO：30是：
ELR(D/E)(K/ZR)LEA(W/F/L)(F/L)(D/E)L(F/L)RE(F/L)LER(F/L)
在一些实施方案中，SEQ ID NOs：27-30的任何肽还包含21位的C、K或L。在一些实施方案中，这样的肽还包含22位，其中22位是S或C。在一些实施方案中，肽还包含21和22位，其中21位是K和22位是S。
本发明和优选的实施方案的详述
I.介绍
本发明特别提供了具有强的胆固醇流出活性和ABCA稳定活性的多肽。本发明的多肽具有类似于天然载脂蛋白例如Apo A-I和Apo E的胆固醇流出活性和ABCA1稳定活性，考虑到这种多肽非天然存在的事实，这是特别出人意料的。在一些情况下，本发明的多肽还具有抗氧化活性和/或抗炎活性。
因此，本发明的多肽是独特的，因为它们尺寸较小并具有自然界中未发现的氨基酸序列，同时具有本质上类似于天然载脂蛋白的活性。因此，本发明的多肽是ABCA1的体外和体内研究的重要的生物工具和多种治疗应用的重要的治疗剂。
这类多肽的优选的实施方案基于SEQ ID NO：1-33的序列及其保守变体。在一些实施方案中，本发明的多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：27、28、29或30。在一些实施方案中，本发明的多肽具有SEQ ID NO：SEQ ID NOs：2-26和31-33的任一种氨基酸序列。本发明提供包含这种多肽的组合物，鉴别、筛选和合成这种多肽的方法，以及通过施用这种多肽来治疗、预防或诊断与血脂异常、高胆固醇血症和炎症有关的疾病和病症例如心脏病、动脉粥样硬化病变、中风、阿尔茨海默氏(Alzheimer′s)病(即，通过改善斑块沉积)和积贮病的方法。本发明还提供治疗、预防或诊断与血脂异常、高胆固醇血症和炎症以及脂贮积病有关的疾病和病症的试剂盒。
II.定义
术语“ABC”或“ATP结合盒”是指负责多种分泌物(allocrites)(例如胆固醇)跨细胞膜的受控流出和流入的多结构域膜蛋白。ABC蛋白包含四个结构域：两个负责多种分泌物结合和转运的跨膜结构域(TMD)和两个负责使ATP水解的能量与TMD构象改变产生偶联的核苷酸结合域(NBD)。该族成员包括，例如ABCA1和ABCA7(例如参见Dean et al，J.Lipid Res.，42：1007-1017(2001))。ABCA1的特征在Denis et al，J Biol Chem.，279(40)：41529-36(2004)中描述。ABCA1在胆固醇流出中发挥作用，在暴露于富胆固醇条件下的细胞中上调，并且是丹吉尔病中的缺陷分子(Brooks-Wilson et al，Nat.Gen.，22：336-344(1999)；Bodzioch et al，Nat.Gen.，22：347-351(1999)；Rust et al，Nat.Gen.，22：352-355(1999))。ABCA1在不存在合适的稳定剂例如载脂蛋白的条件下快速代谢，其半衰期为约1小时(例如参见Wang et al，J.Clin.Invest.，111：99-107(2003))。ABCA1序列在Genbank登录号：AJ012376；NM_173076；NM_015657；NM_005502；NP_005493；O95477中示出。人ABCA7基因的启动子结构和基因组组构在Broccardo et al，Cytogenet Cell Genet.，92(3-4)：264-70(2001)中描述。ABCA7序列在Genbank登录号：NM_033308；NM_019112；NP_150651；NP_061985；AAK00959中示出。已经表征了相关的ATP-结合蛋白家族(例如，参见Higgins et al，J Bioenerg Biomembr.，22(4)：571-92(1990)；Higgins et al，Bioessay，8(4)：111-6(1988)；Higgins et al，Nature，323(6087)：448-50(1986)；Doolittle et al，Nature，323(6087)：451-3(1986)；以及Blight and Holland，MoI Microbiol，4(6)：873-80(1990))。属于该家族的蛋白还含有“A”共有序列的一个或两个拷贝(例如参见Walker et al，EMBO，1(8)：945-51(1982))或“P-环”(例如参见Saraste et al，Trends Biochem Sci.，15(11)：430-46155(1990))。ABCA家族成员在Broccardo et al，Biochimica et Biophysica Acta，1461：395-404(1999)中综述。
术语“两亲性阿尔法螺旋”或“两亲性α螺旋”是指可以是螺旋的二级结构的多肽序列，其中一个表面、即面为极性的并且主要由亲水性氨基酸(例如，Asp、Glu、Lys、Arg、His、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn和Gln)构成，另一个表面为非极性面，其主要由疏水性氨基酸(例如，Leu、Ala、Val、Ile、Pro、Phe、Trp和Met)构成(例如参见Kaiser and Kezdy，Ann.Rev.Biophys.Biophys.Chem.，16：561(1987)和Science，223：249(1984))。
在一些情况下，两亲性α螺旋的极性面可以显示出“带负电荷的氨基酸的排列”或“酸性氨基酸的排列”，即一系列带负电荷的或酸性氨基酸(例如，Asp和/或Glu)在多肽的二级结构内大致均匀地定位(例如，在大致每一个、两个或三个螺旋转角处)。两亲性α螺旋在分子内和分子间的蛋白-蛋白相互作用中均发挥作用，并且推测包含两亲性α螺旋的蛋白和脂蛋白(例如包括载脂蛋白)在脂质(例如HDL)转运和代谢中发挥作用(例如参见Anantharamaiah et al.，Adv.Exp.Med.Biol.，285：131-40(1991))。两亲性α螺旋的结构和功能在例如Segrest et al，Proteins，8(2)：103-17(1990)中综述。鉴别两亲性α螺旋的计算机法在例如Jones et al，J.Lipid Res.，33(2)：141-66(1992)中记述。已经鉴别了多种包含两亲性α螺旋的蛋白，包括例如载脂蛋白和血清淀粉样蛋白。
本发明多肽的“基本上类似的三维构象”的结构是指这样的结构，该结构包含例如长度为24个残基的核心序列并且采用两亲性α螺旋二级结构，所述结构沿着α螺旋结构的轴具有氨基酸的两亲性取向，其中一个表面、即面是极性的并且主要由亲水性残基构成，另一个表面是主要由疏水性残基构成的非极性面。沿着亲水性轴存在两个分开的酸性残基集中点。结构基本上类似于本发明的多肽的三维构象的多肽或肽模拟物也具有刺激ABCA1-介导的胆固醇流出的能力。
术语“载脂蛋白”、或“Apo”、或“可交换的载脂蛋白”是指与脂质结合(即脂质增溶)以形成脂蛋白的几种水溶性蛋白中的任一种，其由乳糜微粒、HDL、LDL和VLDL构成。载脂蛋白通过与特定酶、或脂质转移蛋白、或细胞表面受体、或ATP结合盒转运蛋白(例如ABC转运蛋白)结合并使其激活而在脂质代谢中发挥其生理作用。载脂蛋白和ABCA1之间的相互作用产生胆固醇流出和HDL粒子装配。载脂蛋白包括，例如，Apo A-I、Apo A-II、Apo A-IV、Apo C-I、Apo C-II、Apo C-III、Apo E和血清淀粉样蛋白，例如血清淀粉样蛋白A。
术语“载脂蛋白AI”或Apo A-I是指包含形成N和C末端结构域的243个氨基酸的多肽(例如参见Saito et al，J.Biol.Chem.，278：23227-23232(2003)和Saito et al，Prog.Lipid Res.，43：350-380(2004))。apoA-I的三级结构包含N末端四螺旋束结构域和牢固结合脂质的C末端结构域(例如参见Saito et al，Prog.Lipid Res.，43：350-380(2004)和Mishra et al，Biochemistry，37：10313-10324(1998))。apoA-I的残基44-243含有通过ABCA1介导胆固醇流出的必要结构决定子(例如参见Chroni et al，J.Biol.Chem.，278：6719-6730(2003)和Natarajan et al，J.Biol Chem.，279：24044-24052(2004))。apoA-I的这个区域(aa44-243)由一系列由脯氨酸残基分隔开的10个11-和22-氨基酸的两亲性α螺旋构成，正如由apoA-I基因的外显子4所限定的(例如参见Borhani et al，Proc.Natl.Acad.Sci.，94：12291-6(1997))。apoA-I的各α螺旋区段一部分由带正电荷的残基的相对分布来限定并且被指派为A或Y类别(例如参见Saito et al，J.Biol.Chem.，278：23227-23232(2003))。A类螺旋在脂质-水界面处具有带正电荷的氨基酸，而Y类螺旋显示出除了界面阳离子残基以外，还有朝向极性表面中间的带正电荷的氨基酸。完整的apoA-I分子和蛋白的截断形式(A-I Δl-43)已被结晶(例如参见Ajees et al PNAS，103：2126-2131(2006)；Borhani et al，Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.，55：1578-1583(1999)和Segrest et al，J.Biol Chem.，274：31755-31758(1999))。Apo AI序列在例如Genbank登录号：P02647，J0009、AAB64381、AAB22835、1613168A、1403292A、CAA25519、CAA26097和LPHUA1中示出。
由apoA-I的aa 44-243表示的两亲性α螺旋中的每一个理论上都能够结合磷脂表面。apo A-I的螺旋1(aa 44-65)和10(aa 220-241)作为合成的22-聚体多肽的分离形式具有最高的脂质结合亲和性(例如参见Gillotte et al，J.Biol.Chem.，274：2021-2028(1999))。同样地，螺旋1和10牵涉作为细胞胆固醇流出和新生HDL装配的介导物(Palgunachari et.al，Arteriocler.Thromb.Vase.Biol，16：328-338(1996)；Panagotopulos et.al，J.Biol.Chem.，277：39477-39484(2002)；Chroni et al，J.Biol Chem.，278：6719-6730(2003))。然而，apoA-I的具有高的脂质结合活性的各螺旋，例如螺旋1和10，不能刺激ABCA1依赖性胆固醇流出(例如参见Natarajan et al，J.Biol.Chem.，279：24044-24052(2004))。本质上，需要连续排列并通过脯氨酸残基端对端连接的几个apoA-I两亲性α螺旋的相对长序列段，以介导生产性ABCA1相互作用，即胆固醇流出和HDL装配(参见Beckstead et al，Biochem.44：4591-4599(2005)；Natarajan et al，J.Biol.Chem.，279：24044-24052(2004)；Chroni et al.J.Biol.Chem.，278：6719-6730(2003)和Chroni et al，Biochem.43：2126-2139(2004))。apoA-I螺旋9和10的连接产生具有刺激ABCA1脂质流出的活性的最小元件，但是这种最小螺旋组的活性略弱于全长apoA-I蛋白(参见Natarajan et al，J.Biol.Chem.，279：24044-24052(2004)和Vedhachalam et al J.Biol.Chem.，279：49931-49939(2004))。
术语“载脂蛋白E”或“Apo E”是指在动脉壁和脑中的脂质稳态中发挥重要作用的血浆蛋白(例如参见Wahrle et al，J.Biol.Chem.，279：40987-40993(2004))。Apo E由动脉粥样硬化病变内的巨噬细胞源性泡沫细胞合成和分泌，在动脉粥样硬化病变中其通过逆转巨噬细胞源性泡沫细胞的表型来发挥作用，以维持细胞胆固醇稳态(例如参见Basu et al，Proc.Natl Acad.Sci USA，78：7545-7549(1981)；Basu et al，Science，219：871-873(1983)；Rosenfeld et al，Arterioscler.Thromb.，13：1382-1389(1993)；O′Brien et al，Am.J.Pathol，144：538-548(1994))。这些作用与apoE通过ABCA1刺激细胞胆固醇流出的能力和其在胆固醇逆向转运中的作用有关(Hara et al，J.Biol.Chem.，266：3080-3086(1991)；Smith et al，J.Biol.Chem.，271：30647-30655(1996)；Oram et al，J.Lipid Res.，37：2473-2491(1996)；Zhang et al，J.Biol.Chem.，271：28641-28646(1996)；Remaley et al，Biochem.Biophys.Res.Comm.，280：818-823(2001)和Mahley，Science，240：622-630(1988))。ApoE可与apo A-I竞争结合ABCA1表达细胞，并且其可与ABCA1形成分子复合体(Krimbou et al，J.Lipid Res.，45：839-848(2004))。脑中的Apo E/ABCA1相互作用缺陷将急剧减少细胞外Apo E水平并且干扰细胞间脂质转运，这有助于神经疾病的形成(例如参见Hirsch-Reinshagen et al，J.Biol Chem.，279：41197-41207(2004)；Wahrle et al，J.Biol.Chem.，279：40987-40993(2004)和Koldamavo et al，J.Biol.Chem.，280：43224-43235(2005))。
所述apo E蛋白由N末端四螺旋束结构域和C末端螺旋构成，这类似于apoA-I(Saito et al，Prog.Lipid Res.，43：350-380(2004)；Saito et al，J.Biol Chem.，278：23227-23232(2003)；Ajees et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，103：2128-2131(2006))。apoE的C末端结构域由两个被脯氨酸残基分隔的长的螺旋区段构成(例如参见Hatters et al，Trends Biochem.Sci，416，待发表，www.sciencedirect.com(2006)；Weisgraber，Adv.Prot.Chem.，45：249-302(1994)；Saito et al，J.Biol Chem.，278：23227-23232(2003))。第一区段由形成A类α螺旋的51个氨基酸(残基216-266)和G类α螺旋的第二个33个氨基酸(aa 267-299)构成(Segrest et al.，J.Lipid Res.，33：141-165)。需要这两个包含apoE CT结构域的约79个氨基酸(残基222-299)的螺旋区段来有效介导ABCA1脂质流出和HDL装配(Vedhachalam et.al，J.Biol.Chem.，279(48)：49931-49939(2004))。因此，与Apo A-I的情况一样，性质依靠串联连接的多个螺旋区段的相对长段序列以引起ABCA1相互作用和ABCA1-细胞胆固醇流出(Vedhachalam et.al，同前)。Apo E序列在Genbank登录号：NM_000041、P02649、AAH03557、AAB59397和AAB59518中示出。
术语“胆固醇流出”和“胆固醇流出活性”是指胆固醇从任何细胞类型中流出。例如，动脉壁中的巨噬细胞源性泡沫细胞释放(即输出)胆固醇至合适的接纳体，例如载脂蛋白和/或HDL。介导胆固醇流出的化合物增强了所述释放，即增强了胆固醇从细胞中移动出来并进入细胞外介质或区室中。胆固醇流出通常伴随磷脂从细胞中流出或在胆固醇流出之前磷脂从细胞中流出(即在磷脂从细胞中流出之后)。在合适的脂质接纳体例如载脂蛋白或肽存在的条件下，胆固醇和磷脂的协同释放产生HDL。因此，胆固醇和磷脂流出的过程是彼此关联和同义的。增强胆固醇从细胞中释放的化合物与不存在所述化合物的条件下胆固醇流出的水平相比，使细胞外出现的胆固醇和/或磷脂的量增加至少25％、50％、75％、100％、或至少2倍、4倍、8倍、10倍或更多。
术语“ABCA稳定活性”或“ABCA1稳定化”是指通过抑制其降解来增加和/或延长ABCA蛋白的半衰期。具有ABCA1稳定活性的化合物将显著延迟蛋白降解。与不存在所述化合物的条件下检测的ABCA1蛋白相比，这使细胞ABCA1蛋白水平增加至少25％、50％、75％、100％、或至少2倍、4倍、8倍、10倍或更高。
术语“抗炎活性”是指炎症的预防或减轻。炎症被认为在动脉粥样硬化发展中发挥作用，并且其与血脂异常、高胆固醇血症和/或脂蛋白脂质氧化有关。炎症反应可以是局部的，例如在动脉壁或脑或其他血管外组织中，和全身的。局部和全身炎症都可与炎症介质例如氧化脂的质和/或细胞因子的产生有关。通常，炎症反应与血液单核细胞-巨噬细胞征集到血管外区室中有关。单核细胞-巨噬细胞的征集与巨噬细胞在血管外组织中的激活、分化和持留有关。具有抗炎活性的化合物与不存在所述化合物的情况相比，将减轻炎症反应，这通过炎症介质(例如粘附分子、细胞因子和/或氧化脂质)的减少和/或斑块和组织中巨噬细胞和/或的巨噬细胞激活的减少来测定。
术语“抗氧化活性”是指预防或减轻由活性氧类别(ROS)、包括例如过氧化氢(H2O2)、次氯酸根离子(-OCl)、羟基(-OH)和超氧阴离子(O2-))引起的氧化。许多天然存在的物质(例如蛋白质和小分子)具有抗氧化活性。例如，载脂蛋白可以抑制脂质过氧化，因此保护磷脂表面避免受到亲脂性以及水溶性自由基引发剂的影响(例如参见Biochemistry，41：2089-2096(2002))。另外，α-生育酚(维生素E)是抗氧化剂。而且，促进氧化剂例如氧固醇和氧化磷脂以及抗氧化剂(维生素E)通过ABC转运蛋白或任何其他方式进出细胞的蛋白和肽可被认为具有抗氧化活性，从而除去动脉壁的炎症介质和/或实现组织中有利的氧化还原平衡的恢复。具有抗氧化活性的化合物的抗氧化活性比不存在所述化合物条件下的抗氧化活性高至少25％、50％、75％、100％、或至少2倍、4倍、8倍、10倍或更高。
如本文所使用的，“斑块稳定化”是指稳定易损性斑块免于受到从富脂质的斑块中除去胆固醇、包括但不限于从泡沫细胞巨噬细胞中除去胆固醇而引起破裂或侵蚀的风险。斑块含有凝血酶原物质，即在暴露于血浆时非常强有力地聚集血小板从而存在局部血栓和血管堵塞的风险的物质，例如组织因子。斑块的破裂和这种物质的暴露通过将斑块与血管分离的纤维帽而得到阻止。脂质的除去以两种主要方式赋予斑块稳定性。首先，在解剖学上，通过缩小动脉中的粥样斑块(gruel)除去脂质经降低血液动力学应激(与心跳和血压变化有关的扩张-收缩)的风险而赋予斑块稳定性。其次，如文献所述，胆固醇的积聚刺激蛋白酶、包括对纤维帽具有裂解作用的基质金属蛋白酶(MMP)的合成和分泌；以及产生组织因子，其是强有力的阻塞因子。
如本文所使用的，“胆固醇逆向转运(RCT)”是指下列过程：从巨噬细胞源性泡沫细胞除去胆固醇和从动脉壁除去富脂质的斑块，随后通过血浆转移至肝中进行摄取、处理并以中性固醇(胆固醇)或酸性固醇(羟基化胆固醇/胆汁)的形式在粪便中排泄。对于RCT益处本身而言，需要胆固醇从巨噬细胞源性泡沫细胞流出，即使胆固醇可移动至其他不太易损的相邻细胞。然而，通过在HDL样粒子中转运至肝以进行排泄来进一步处理这种胆固醇是治疗的有利的方面。这种完全RCT通过动脉中胆固醇成分的实际净去除来提供动脉树的总体复原。RCT和斑块稳定作用直接由所述肽赋予，或所述肽与血浆和细胞中的磷脂天然形成的复合体赋予，或者可选择地，作为肽与内源性HDL粒子结合的apoA-I/HDL，从而改变它们的性能并使它们更有效地促进RCT。
本发明情形中的术语“前-β形式”是指前-β-HDL粒子的形式。前-β-HDL是包含ApoA-I分子、典型地包含2-3个ApoA-I分子和少量磷脂的贫脂质粒子。前-β-HDL粒子充当细胞胆固醇流出的初始受体和/或介导ABCA1胆固醇流出。
与“血脂异常”有关的疾病或病症是任何这样的疾病或病症，其中由于组织(即血液)脂质和脂蛋白浓度的改变和/或胆固醇流出的异常介导或异常ABCA稳定性，导致脂质代谢失调。这类疾病包括，例如，心脏病、动脉粥样硬化病变、中风、阿尔茨海默氏病和贮积病。
术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及作用方式与天然存在的氨基酸类似的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由基因密码编码的那些以及后来修饰的那些氨基酸，例如羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸盐和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即α碳与氢、羧基、氨基和R基结合，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这种类似物具有修饰的R基(例如正亮氨酸)或修饰的多肽主链，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指结构与氨基酸的一般化学结构不同、但作用方式与天然存在的氨基酸类似的化学化合物。氨基酸和保守氨基酸置换的更详细的描述在下面题为“多肽”的章节中提供。
本文中氨基酸可通过它们通常已知的IUPAC-IUB生物化学命名委员会(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)推荐的三字母符号或单字母符号来指示。同样地，核苷酸可通过它们通常接受的单字母密码来指示。
本文中可交换使用的术语“多肽”、“肽”和“蛋白”是指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于这样的氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相对应的天然存在的氨基酸的人造化学模拟物，以及也适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。氨基酸聚合物可完全包含L氨基酸、完全包含D氨基酸、或包含L和D氨基酸的混合物。本申请中使用的术语“肽或肽模拟物”仅仅强调预见包含天然存在的氨基酸和修饰的氨基酸的肽。
术语“分离的”、“纯化的”或“生物纯的”是指材料实质上或基本上没有通常在天然状态下发现的与其伴随的成分。纯度和同质性通常使用分析化学技术例如聚丙烯酰胺凝胶电泳法或高效液相色谱法来测定。制剂中存在的主要种类的蛋白基本上是纯化的。术语“纯化的”表示核酸或蛋白在电泳凝胶中产生基本上一个条带。特别地，其是指核酸或蛋白的纯度为至少85％，更优选纯度为至少95％，最优选纯度为至少99％。
在两个或多个多肽序列(或两种或多种核酸)的情况中，术语“同一”或百分比“同一性”是指两种或多种序列或亚序列当在比较窗或指定区域内进行最大对应性比较和比对时，在特定区域(例如氨基酸序列SEQ ID NO.2-26、31、32或33)或者长度为21或22个氨基酸的那些序列的前20个氨基酸中相同或具有特定百分比的氨基酸残基或核苷酸相同，例如60％的同一性、优选65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性，这是应用以下的序列比较算法或通过人工比和目测来测量的。然后这种序列被称为是“基本上同一的”。该定义还指测试序列的互补序列(compliment)。
对于序列比较，通常一个序列用作比较测试序列的参照序列。当使用序列比较算法时，测试序列和参照序列输入计算机，如果需要，要指定亚序列坐标，并指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，或者可以指定可选择的参数。然后基于程序参数，序列比较算法计算测试序列相对于参照序列的序列同一性百分比。对于核酸和蛋白的序列比较，使用下面讨论的BLAST和BLAST 2.0算法和默认参数。
术语“核酸”和“聚核苷酸”在本文中可互换使用，是指脱氧核糖核酸或核糖核酸以及其单链或双链形式的聚合物。所述术语包括含有已知的核苷酸类似物或修饰的主链残基或键的核酸，它们是合成的、天然存在的和非天然存在的，具有与参照核酸类似的结合性能，并且按照类似于参照核苷酸的方式代谢。这些类似物的例子包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、膦酸甲酯、手性膦酸甲酯、2-O-甲基核糖核苷酸、多肽-核酸(PNA)。除非另有说明，否则特定的核酸序列还包括其“保守修饰的变体”(例如简并密码子置换)和互补序列，以及明确指出的序列。具体而言，简并密码子置换可通过产生其中一个或多个选择的(或全部)密码子的3位被混合的碱基和/或脱氧肌苷残基置换的序列而完成(Batzer et al.，Nucleic Acid Res.19：5081(1991)；Ohtsuka et al，J.Biol.Chem.，260：2605-2608(1985)；Rossolini et al，MoI Cell Probes，8：91-98(1994))。术语核酸可与基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和聚核苷酸互换使用。
“表达载体”是使用一系列允许特定核酸在宿主细胞中转录的特定核酸元件重组或合成产生的核酸构建体。表达载体可以是质粒、病毒或核酸片段的一部分。通常，表达载体包含可与启动子操作性连接的待转录的核酸。
“宿主细胞”是指含有表达载体并支持表达载体的复制或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞例如大肠杆菌(E.coli)或真核细胞例如酵母、昆虫细胞、两栖动物细胞或哺乳动物细胞例如CHO、HeLa等，例如培养细胞、移植体和体内细胞。
“标记”或“可检测的标记”是可通过分光、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段来检测的组合物。例如，有用的标记包括放射同位素(例如3H、35S、32P、51Cr或125I)、荧光染料、电子致密试剂、酶(例如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、和ELISA中通常使用的其他酶)、生物素、洋地黄毒甙、或可得到它们的抗血清或单克隆抗体的半抗原和蛋白(例如，SEQ ID NO：1、2或3编码的多肽可通过例如将放射标记引入多肽中而变得可测定，并用于检测与所述多肽特异性反应的抗体)。
如本文所使用的，“改善”是指缓和、减轻或减少症状的程度或者减少疾病症候发作的发生次数。
术语“预防”是本领域已知的，并且当在涉及病况、例如疾病例如高胆固醇血症或动脉粥样硬化的复发或发作而使用时，是本领域非常了解的，其包括在对象中施用组合物，相对于没有接受该组合物的对象，该组合物减少医学病况的症状的频率或者延迟其发作。
如本文所使用的，“治疗”是指延缓、停止或反转病症或疾病的进展。在优选的实施方案中，“治疗”是指反转进展至消除病症或疾病的点。
如本文所使用的，“抑制”是指与对照样品中存在的量相比，所述量减少。在优选的实施方案中，抑制是指量的减少大于50％，甚至更优选大于75％或甚至100％。
受到本文中公开的方法治疗的“对象”、“患者”或“哺乳动物”可以是指人或非人动物。
III.多肽
本发明提供一族非天然存在的多肽，其利用有效的胆固醇逆向转运(RCT)途径来介导胆固醇流出。除了是ABCA1依赖性胆固醇流出的有效和选择性介导物以外，本发明的多肽还具有ABCA稳定活性、抗氧化活性和抗炎活性、这些活性的任意组合，优选具有所有这些活性。
本发明的肽基于对胆固醇流出具有作用的核心氨基酸序列SEQ ID NO：1的意外发现。本发明的多肽为非天然存在的多肽，即SEQ ID NOs.2-26和31-33，它们刺激ABCA1依赖性胆固醇流出，其摩尔效价(molar potency)类似于载脂蛋白(例如Apo A-I、Apo E等)。有趣的是，本发明的多肽家族成员尺寸小，对应于获得完整的载脂蛋白的全部生物活性和效价的单个螺旋区段和自然界中发现的、需要通过ABCA1发挥胆固醇流出活性的多个α螺旋区段的长段序列。
关于两亲性α螺旋肽，通常螺旋的一侧集中疏水性氨基酸并且另一侧集中极性或亲水性氨基酸。这种排列在载脂蛋白和球状蛋白的α螺旋中是共同的，其中所述螺旋的一面朝向疏水性核心取向，一面朝向水暴露表面取向。不同氨基酸序列具有形成α螺旋结构的不同倾向。甲硫氨酸、丙氨酸、亮氨酸、谷氨酸盐和赖氨酸都具有特别高的螺旋形成倾向，而脯氨酸、甘氨酸、酪氨酸和丝氨酸具有相对差的螺旋形成倾向。
在一个实施方案中，本发明提供包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的分离多肽(和包含这样的肽的组合物)。在一些实施方案中，本发明提供包含以下氨基酸序列的分离多肽X1X2X3X4X5X6X7AX9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20(SEQ ID NO：27)，其中：X1、X7、X15和X18独立选自D和E；X2是L、I或V；X4和X11独立选自D、E和A；X3、X5和X19独立选自K和R；X9是W、F或L；X14是R、E或A；和X6、X10、X12、X13、X16、X17和X20独立选自F、L、I和W。
在一个实施方案中，分离多肽包含选自SEQ ID NOs：1-33的氨基酸序列(和，在某些实施方案中，由所述序列组成，或者基本由所述序列组成)。
在一些实施方案中，本发明的肽包含具有SEQ ID NO：2显示的氨基酸序列的肽或其具有一个或多个以下置换的变体：L或F置换9位的W；V置换非极性表面上的L，例如V置换2位的L；L或I置换非极性表面上10、13、16和/或20位的F残基；F或I置换2、6、12和/或17位的L残基；R置换K，例如5位的K；天冬氨酸置换SEQ ID NO：2中的一个或多个谷氨酸残基；W置换12位的L；极性表面上的A置换，例如A置换14位的R、4位的E、11位的E和/或18位的E。在一些实施方案中，SEQ ID NO：2或这样的变体还可以包含被加到C端的残基KS。因此，在一些实施方案中，SEQ ID NO：2的变体在极性表面上具有残基；但是在非极性表面上没有。在一些实施方案中，通过在位于脂-水界面处或附近的12、17和位包含高度疏水的L或F，能够增加非极性表面，以最大化疏水性表面。
本领域技术人员容易理解上述多肽没有全部囊括本发明的多肽家族。实际上，使用本文中提供的教导，可以按照常规、例如通过保守或半保守置换(例如D被E替代)、延伸、缺失等产生其他合适的多肽(例如，保守变体)。另外，使用本文中提供的分析法，可以按照常规筛选其他合适的多肽的所需生物活性。
因此，在另一个实施方案中，本发明提供SEQ ID NOS：2-26和31-33的多肽的多肽变体。在一个示例性实施方案中，所述多肽与选自SEQ ID NO.2-26、31、32和33的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的同一性。本领域技术人员将意识到，非同一的氨基酸残基可以是天然的或非天然存在的。术语“百分比同一的”是指两个氨基酸序列(或两个核苷酸序列，其也由本发明提供)之间的序列同一性。可比较出于比较目的进行比对的各序列中的位置来分别测定同一性。在比较序列中的等同位置被相同的氨基酸或碱基占据时，则在该位置处的分子是同一的；在等同位点被相同或类似的氨基酸残基(例如空间特性和电子特性类似)占据时，则分子可被称为在该位置处是同源的(类似的)。以同源性即类似性或同一性的百分比表示是指比较序列共享的位置处的类似或同一氨基酸的数目的函数。可以使用各种比对算法和/或程序，包括(例如)FASTA、BLAST和ENTREZ。FASTA和BLAST可作为GCG序列分析包(University of Wisconsin，Madison，Wis.)的一部分而获得，并且可以在例如默认设置的条件下使用。ENTREZ可通过马萨诸塞州Bethesda的国立卫生研究院，国立医学图书馆，国立生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information，National Library of Medicine，National Institutes of Health，Bethesda，MD)获得。在一个实施方案中，两个序列的百分比同一性可使用GCG程序采用空位权重为1(例如每个氨基酸空位被加权就像其为两个序列之间的单个氨基酸或核苷酸错配)来确定。
在可与上述实施方案重叠的另一个实施方案中，SEQ ID NOS：2-26和31-33的多肽被保守(或半保守)氨基酸残基置换。术语“保守氨基酸置换”是指来自一个这样的组中的氨基酸被来自相同组中的不同氨基酸(在概念上地或以其他方式)置换。一种限定个体氨基酸之间的共同性能的有用方式是分析同源有机体的相应蛋白之间氨基酸变化的归一化频率(例如参见Schulz，G.E.and R.H.Schirmer，Principles of Protein Structure，Springer-Verlag)。根据这种分析，可以限定氨基酸组，其中组内的氨基酸优选彼此交换，因此在它们对整个蛋白结构的影响方面彼此大多类似(例如参见Schulz，G.E.and R.H.Schirmer，Principles of Protein Structure，Springer-Verlag)。按照这种方式限定的一组氨基酸组的一个例子包括：(i)带电荷的组，其由Glu和Asp、Lys、Arg和His构成；(ii)带正电荷的组，其由Lys、Arg和His构成；(iii)带负电荷的组，其由Glu和Asp构成；(iv)芳族组，其由Phe、Tyr和Trp构成；(v)氮环组，其由His和Trp构成；(vi)大的脂肪族非极性组，其由Val、Leu和Ile构成；(vii)轻微极性组，其由Met和Cys构成；(viii)小残基组，其由Ser、Thr、Asp、Asn、Gly、Ala、Glu、Gln和Pro构成；(ix)脂肪族组，其由Val、Leu、Ile、Met和Cys构成；以及(x)小的羟基组，其由Ser和Thr构成。
在同样可与上述实施方案重叠的另一个示例性实施方案中，“保守氨基酸置换”是指氨基酸置换分子量类似或疏水性类似的另一种氨基酸。“分子量类似”和“疏水性类似”是指数值在相应数值的25％、更优选20％、15％、10％或小于10％以内。氨基酸的分子量和疏水性的数据列于表1中。疏水性等级列于表2中；保守置换包括将标记“＝”的氨基酸交换为另一种氨基酸(例如Tyr＝Trp)以及将一种氨基酸交换为在通过大于号和小于号表示的等级次序中与其相邻的另一种氨基酸。
表1：
Figure BPA00001311663500351
*给出的分子量是中性自由氨基酸的分子量；残基重量可通过减去一个当量的水(18g/mol)来获得。
**给出的疏水性是通过“小碎片法(Small Fragment Approach)”从计算的log(P)测定值而得的“换算”值(参见“Development of Hydrophobicity Parameters to Analyze Proteins Which Bear Post-or Cotranslational Modifications”Black，S.D.and Mould，D.R.，Anal.Biochem.，193：72-82(1991))。用于将原始log(P)值换算为给出的换算值的等式如下所示：换算参数＝(原始参数+2.061)/4.484。
表2：
生理L-α氨基酸的疏水性参数的趋势
Phe＞Leu＝Ile＞Tyr＝Trp＞Val＞Met＞Pro＞Cys＞Ala＞Gly＞
Thr＞Ser＞Lys＞Gln＞Asn＞His＞Glu＞Asp＞Arg
天冬氨酸和谷氨酸是酸性的，在生理pH下提供负电荷；组氨酸、精氨酸和赖氨酸是碱性的，在生理pH下提供正电荷。
两种多肽彼此是保守变体的另一种指示为所述两种多肽具有相同的功能，在优选的实施方案中，所述相同功能的活性水平相同或非常类似。因此，在一些实施方案中，本发明的多肽的保守变体的活性为SEQ ID NO：1、27、28、29或30的多肽中发现的、或更特别地在选自SEQ ID NOs：2-26和31-33的多肽中发现的活性的至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。此外，在一些实施方案中，本发明的多肽具有一种以上的活性。例如，本发明的多肽可具有胆固醇流出介导活性、ABCA稳定活性、抗炎活性和抗氧化活性，这些活性的任意组合，或理想地，所有这些活性。保守变异体可具有一种或多种相同的活性，并且理想地具有所有相同的活性。本领域技术人员可容易地使用本文中描述的筛选分析法来确定两个或多个多肽是否具有类似的活性。另外，本领域技术人员已知可用于确定两个或多个多肽是否具有类似的生物性能或活性的其他筛选分析法。
尽管在优选的实施方案中，本发明的多肽利用天然存在的氨基酸、或天然存在的氨基酸的D型，但是本发明的多肽中可使用非天然存在的氨基酸(例如甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍、正亮氨酸、ε-氨基己酸、4-氨基丁酸、四氢异喹啉-3-羧酸、8-氨基辛酸、4-氨基丁酸、Lys(N(ε)-三氟乙酰基)、α-氨基异丁酸等)进行置换。至于其他氨基酸置换，非天然存在的氨基酸通常被置换，使得在置换后，它们保持它们所置换的残基的空间以及离子或非离子特性。
技术人员了解，氨基酸残基可以被加到本发明多肽的C端和/或N端，而不影响这样的多肽的活性。因此，包含本文描述的螺旋序列的本发明多肽(例如，SEQ ID NO：1-33的多肽)包括长度超过20、21或22个氨基酸的实施方案，例如长度23、24、25、26、27、30、35或40氨基酸的肽。技术人员还了解本发明的多肽，在一个实施方案中，本发明的多肽例如通过脯氨酸或其它的接头残基与另一个能够刺激胆固醇流出的两亲性α螺旋肽连接，形成双螺旋或多聚体多肽，例如40、50、60、70、80、90或100个氨基酸长度的多肽。因此，SEQ ID NOs：1-33的任何序列能够添加氨基酸或能够连接。例如，本发明的多肽的一个分子，例如SEQ ID NO：2-26或31-33，可以与另一个多肽通过脯氨酸残基相连，以提供至少41个氨基酸长度的多肽。同样的，两个20-聚体、两个21-聚体、两个22-聚体、一个20-聚体和一个22-聚体、一个21-聚体和20-聚体或一个21-聚体和22-聚体能够例如利用脯氨酸相连，从而产生41-45个残基长度的多肽。这样的双螺旋或多聚体肽具有等于或优选超过被所述双螺旋或多聚体肽包含的本发明的单螺旋肽的活性。此外，这样的双螺旋或多聚体多肽能够具有超过天然全长载脂蛋白(例如Apo AI和Apo E)、或载脂蛋白的胆固醇流出介导域的胆固醇流出活性。利用本文描述的方法，技术人员能够容易地向C端和/或N端任一端增添附加的氨基酸，然后筛选所产生的多肽的所需活性。
在一些实施方案中，本文描述的螺旋肽可通过在螺旋的极性/非极性界面处置换或插入带硫羟基的氨基酸(例如Cys)来修饰。
在特别优选的实施方案中，本发明的多肽包含一个或多个本文描述的D-氨基酸。在某些实施方案中，每个氨基酸(例如，每个对映体氨基酸)都是D-氨基酸。已经发现，全部包含D-氨基酸的多肽以如同L-氨基酸多肽的高能力和高亲合力刺激胆固醇流出。在化学合成中，D-氨基酸容易简单地通过利用D形式来源的氨基酸残基，掺入到多肽中的一个或多个位置。用于固相多肽合成的D-形式残基是可一从许多供应商买到的(参见，例如，Advanced Chem Tech，Louisville，KY；Nova Biochem，San Diego，CA；Sigma，St Louis，MO；Bachem California Inc.，Torrance，CA，等)。D-形式氨基酸能够依照要求掺入多肽中的任何位置。因此，例如，在一个实施方案中，多肽能够包含单个D-氨基酸，而在其它实施方案中，多肽包含至少两个、通常至少三个、更通常至少四个、最通常至少五个、优选至少六个、更优选至少七个和最优选至少八个D氨基酸。在一个实施方案中，基本上每隔一个(对映体)氨基酸是D-形式氨基酸。在某些实施方案中，至少80％、优选至少90％、更优选至少95％的对映体氨基酸是D-形式氨基酸。在一个特别优选的实施方案中，基本上每个对映体氨基酸都是D形式氨基酸。
在又一个实施方案中，提供本发明的多肽的肽模拟物。“肽模拟物”包括氨基酸链的任何修饰形式，包括但不限于磷酸化、加帽、脂肪酸修饰和包含不饱和主链和/或侧链结构。本领域技术人员容易理解，肽模拟物包含氨基酸链和非肽类小分子之间的结构连续体。肽模拟物通常保持可识别的多肽样聚合物单元结构。因此，肽模拟物通常保持与结合天然多肽的任何靶分子结合的功能。合适的肽模拟物的例子在美国专利申请公布No.2006/0069030中有所描述公开，其教导出于所有目的以引用的方式并入。其他肽模拟物及其制备方法是本领域技术人员已知的。
在优选的实施方案中，本发明的肽模拟物属于两种类别之一：(i)替代物和(ii)类似物。已开发许多替代物用于多肽的酰胺键。经常研究的用于酰胺键的替代物包括但不限于下列基团：(i)反式烯烃；(ii)氟代烯烃；(iii)亚甲基氨基；(iv)磷酰胺；以及(v)磺酰胺。这种替代物的例子在美国专利申请公布No.2006/0069030中公开。另外，可以使用基于对多肽的主链进行更显著修饰的肽模拟物。该类的肽模拟物包括：(i)反-转型类似物；以及(ii)N-烷基甘氨酸类似物(所谓的拟肽)。此外，这种类似物的例子在美国专利申请公布No.2006/0069030中公开。
在本发明的一个实施方案中，肽或肽模拟物为反-转型类似物。反-转型类似物可根据本领域已知的方法按照与合成L氨基酸基多肽类似的方式制备。更具体地，适于制备这种反-转型类似物的方法的例子在授予Sisto等的美国专利No.4,522,752中描述。最终产物或其中间体可通过HPLC或本领域技术人员已知的任何其他合适的色谱法来纯化。
在另一个实施方案中，肽或肽模拟物是反-对映(retro-enatio)类似物。反-对映类似物可以使用标准的固相或液相多肽合成技术从市售的D氨基酸(或其类似物)来合成。
在又一个实施方案中，肽模拟物为反式烯烃类似物或衍生物。这种多肽的反式烯烃类似物可根据Shue et al，Tetrahedron Lett，28：3225(1987)的方法容易地合成。另外，还可以使用本领域已知的其他方法。要理解，取决于反式烯烃衍生物的合成中使用的试剂的性质，可能需要Sjue等程序的修正版本或其他可得的程序。
还可以使通过上述方法合成的假二肽与其他假二肽偶联，从而使假肽具有一些代替酰胺官能度的烯烃官能度。例如，可以制备对应于某些二肽序列的假二肽，然后通过标准技术连接在一起，从而产生在残基间具有交替的烯烃键的多肽的类似物。
又一类肽模拟物衍生物包括膦酸酯衍生物。这种膦酸酯衍生物的合成可以从已知的合成路线改编(例如参见Loots et al.“Peptides：Chemistry and Biology，”(Escom Science Publishers，Leiden，p.118，1988)；Petrillo et al.“Peptides：Structure and Function(Proceedings of the 9th American Peptide Symposium)，”(Pierce Chemical Co.Rockland，111.，1985)。
在其他实施方案中，可以对糖或脂质部分引进修饰。这种修饰可改变多肽在多种介质中的溶解度，使得它们可有利地制成合适的药物组合物。修饰脂质基团包括但不限于法呢基和肉豆蔻酰基。修饰糖基团包括但不限于任何天然存在的和/或合成的糖和糖醇例如包括葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、甘露糖、阿拉伯糖和其他糖以及它们各自的醇的单糖或低聚糖。
在某些实施方案中，本发明的肽模拟物还可包含类似于翻译后修饰的修饰。这种修饰包括但不限于：乙酰化、羧化、糖基化、磷酸化、脂质化和酰化。结果，修饰的肽模拟物可含有非氨基酸元件，例如聚乙二醇、脂质、多糖或单糖、和磷酸酯。可使用本文中公开的分析法来测试这种非氨基酸元件对于肽模拟物的功能性。
因此，在优选的实施方案中，本发明的肽模拟物具有基本上类似于SEQ ID NO：1-33的多肽的三维构象。在特定的实施方案中，肽模拟物包含至少一个不是氨基至羧基方向上的酰胺键的主链键，例如相对于天然存在的多肽的反-转型多肽，或至少一个不是酰胺键的主链键。
本发明的多肽和肽模拟物，包括例如反-转型肽模拟物，可被修饰以使得组成氨基酸和/或末端氨基酸上的R基团被保护基团封闭，即保护。现已发现，封闭、特别是氨基和/或羧基末端的封闭明显改善口服递送并显著延长血清半衰期。如本文所使用的，“保护基团”是指保护潜在活性官能团避免进行不期望的化学转化的临时取代基。这种保护基团的例子通常相应包括羧酸的酯、醇的甲硅烷基醚、以及醛和酮的缩醛和缩酮。保护基团化学的领域已有综述(Greene，T.W.；Wuts，P.G.M.Protective Groups in Organic Synthesis，2nd ed.；Wiley.New York，1991)。
许多保护基团适用于该目的。这些基团包括但不限于：乙酰基、CH3-(CH2)n-CO-、酰胺、Fmoc、叔丁氧羰基(t-BOC)、9-芴乙酰基、1-芴羧基、9-芴羧基、9-芴酮-1-羧基、苄氧羰基、呫吨基(Xan)、三苯甲基(Trt)、4-甲基三苯甲基(Mtt)、4-甲氧基三苯甲基(Mmt)、4-甲氧基-2，3，6-三甲基-苯磺酰基(Mtr)、均三甲苯-2-磺酰基(Mts)、4，4-二甲氧基二苯甲基(Mbh)、甲苯磺酰基(Tos)、2，2，5，7，8-五甲基色满-6-磺酰基(Pmc)、4-甲基苄基(MeBzl)、4-甲氧基苄基(MeOBzl)、苄氧基(BzlO)、苄基(Bzl)、苯甲酰基(Bz)、3-硝基-2-吡啶次磺酰基(Npys)、1-(4，4-二甲基-2，6-二氧亚环己基)乙基(Dde)、2，6-二氯苄基(2，6-DiCl-Bzl)、2-氯苄氧羰基(2-Cl-Z)、2-溴苄氧羰基(2-Br-Z)、苄氧基甲基(Bom)、环己氧基(cHxO)、叔丁氧基甲基(Bum)、叔丁氧基(tBuO)、叔丁基(tBu)和三氟乙酰基(TFA)。变量“n”为0至12的整数，通常为0至6，例如0至4。其他合适的保护基团在美国专利6,933,279中公开，其教导以引用的方式并入。
在一个实施方案中，优选的保护基团包括但不限于乙酰基、酰胺和烷基基团，乙酰基和烷基基团对于N-末端保护是特别优选的，酰胺基团对于羧基末端保护是特别优选的。在一个优选的实施方案中，乙酰基被用于保护氨基末端，酰胺基团被用于保护羧基末端。在该实施方案中，在合成期间当多肽在树脂上时可使用乙酸酐完成乙酰化。酰胺保护可通过选择用于合成的合适的树脂来完成。例如，可使用rink酰胺树脂。在完成合成后，在酸性双官能氨基酸例如Asp和Glu以及碱性氨基酸例如Lys上的半永久性保护基团以及Tyr的羟基被全部同时除去。使用酸处理从这种树脂中释放的多肽显现出N-末端被保护为乙酰基，C-末端被保护为NH2，同时除去所有其他保护基团。
A.化学合成
多肽可利用本领域中熟知的方法来化学合成，例如固相合成法(例如参见Merrifield，J.Am.Chem.Soc，85：2149-2154(1963)和Abelson et al，Methods in Enzymology，Volume 289：Solid-Phase Peptide Synthesis(1st ed.1997))。多肽合成可利用人工技术或自动化来进行。自动化合成可利用例如Applied Biosystems 431A肽合成仪(Perkin Elmer)来完成。可选择地，可分别化学合成多肽的各种片段，然后使用化学方法结合以制得全长多肽。多肽的序列和质量可通过GC质谱法来证实。一旦合成，可例如通过上述N-末端乙酰基和C-末端酰胺基团来修饰多肽。合成的多肽可通过HPLC法进一步分离至纯度为至少约80％、优选90％、更优选95％。
B.重组表达
本文中所述的多肽还可被重组表达，特别在所述多肽不含“D”氨基酸残基时更是如此。该实施方案依靠重组遗传学领域中的常规技术。通常，本文中描述的重组DNA技术中的命名法和实验室方法是本领域熟知的和通常使用的。标准技术用于克隆、DNA和RNA分离、扩增和纯化。通常根据制造商的说明书来进行包括DNA连接酶、DNA聚合酶、限制性内切核酸酶等的酶促反应。公开本发明中使用的通常方法的基本教材包括：Sambrook et al，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(3d ed.2001)；Kriegler，Gene Transfer and Expression：A Laboratory Manual(1990)；和Current Protocol in Molecular Biology(Ausubel et al，eds.，1994))。
聚合酶链反应或其他体外扩增方法还可用于，例如，克隆编码待表达的多肽的核酸序列，从而使核酸用作下列目的的探针：检测生理样品中编码mRNA的存在、核酸测序、或其他目的。通过PCR反应扩增的核酸可从琼脂糖凝胶中纯化并克隆到合适的载体中。
本发明的序列的基因表达还可通过本领域中已知的技术来分析，例如mRNA的逆转录和扩增、总RNA或聚A+RNA的分离、RNA印迹、斑点印迹、原位杂交、RNA酶保护、探测DNA微芯片阵列等。
为了获得高水平的核酸序列例如编码本发明的多肽的核酸序列的表达，通常将编码本发明的多肽序列的核酸序列亚克隆到表达载体中，随后所述表达载体被转染到合适的宿主细胞中。表达载体通常含有：指导转录的强启动子或启动子/增强子、转录/翻译终止子、和对于编码蛋白的核酸而言引发翻译的核糖体结合位点。启动子与编码本发明的多肽的核酸序列或其亚序列操作性连接。合适的细菌启动子是本领域中熟知的，并且描述在例如Sambrook等和Ausubel等的文献中。表达载体中通常包含的元件还包括：在大肠杆菌中发挥作用的复制子、编码抗生素抗性以允许选择包藏重组质粒的细菌的基因、和在质粒的非必需区域中允许插入真核生物序列的独特的限制位点。选出的特定的抗生素抗性基因不是关键的，本领域中已知的多种抗性基因中的任一种都是合适的。
用于将遗传信息转运到细胞中的特定表达载体并不是特别关键的。可以使用用于在真核或原核细胞中表达的常规载体的任一种。标准细菌表达载体包括质粒例如pBR322基质粒、pSKF，、pET23D，和融合表达体系例如GST和LacZ。表位标签，例如His标签，也可添加到重组多肽以提供便捷的分离方法。在某些情况下，酶切序列(例如Met-(His)g-Ile-Glu-GLy-Arg，其形成Xa因子切割位点)被加到重组多肽。用于表达多肽的细菌表达体系可用的有例如大肠杆菌、芽孢杆菌(Bacillus sp.)和沙门氏菌(Salmonella)(Palva et al，Gene 22：229-235(1983)；Mosbach et al，Nature 302：543-545(1983))。用于这种表达体系的试剂盒是市售的。用于哺乳动物细胞、酵母和昆虫细胞的真核生物表达体系是本领域中熟知的，并且也是市售的。
标准转染方法用于制备表达大量本发明的多肽的细胞系，然后使用标准技术进行纯化(例如参见Colley et al.，J.Biol Chem.，264：17619-17622(1989)；Guide to Protein Purification，Methods in Enzymology，vol.182(Deutscher，ed.，1990))。根据标准技术进行细胞转化(例如参见Morrison，J.Bact.，132：349-351(1977)；Clark-Curtiss & Curtiss，Methods in Enzymology，101：347-362(Wu et al，eds，1983)。例如，可以使用将外源核苷酸序列引入宿主细胞的公知方法中的任一种。这些包括使用磷酸钙转染、凝聚胺、原生质体融合、电穿孔、脂质体、显微注射、血浆载体、病毒载体、以及其他熟知的用于将克隆的基因组DNA、cDNA、合成DNA或其他外源基因材料引入宿主细胞的方法中的任一种(例如参见Sambrook et al，同前)。仅仅必须的是使用的特定基因工程方法能够成功地将至少一种基因引入能够表达本发明的多肽的宿主细胞中。
在将表达载体引入细胞后，将转染的细胞在有利于进行本发明的多肽表达的条件下培养。使用下列确定的标准技术来将发明的多肽从培养物中回收。
C.多肽的纯化
多肽通过本领域中已知的标准技术纯化至基本上纯的，所述技术包括例如从包含体中提取和纯化、尺寸差别过滤法、溶解度分级(即使用诸如硫酸铵之类的物质进行选择性析出)、柱色谱法、免疫纯化法、和其他方法(例如参见Scopes，Protein Purification：Principles and Practice(1982)；美国专利No.4,673,641；Ausubel et al，同前；以及Sambrook et al，同前)。
在纯化多肽时可使用很多方法。例如，具有确定的分子粘附性能的多肽可与重组多肽可逆融合。使用合适的配体，重组多肽可选择性吸附到纯化柱上，然后以相对纯的形式从柱上释放。然后通过酶活性除去融合的多肽。最后，可使用免疫亲和柱来纯化多肽。
IV.鉴别具有所需活性的多肽的方法
使用本领域技术人员熟知的方法，可容易地筛选本发明的多肽或肽模拟物介导胆固醇流出和/或稳定ABCA(例如ABCA1)的能力。
可利用许多不同的筛选规程来鉴别本发明的介导胆固醇流出和/或稳定ABCA(例如ABCA1)的多肽或肽模拟物。在一个实施方案中，所述筛选方法包括筛选多种被测多肽以鉴别在例如在哺乳动物细胞、包括人细胞中介导胆固醇流出和/或稳定ABCA(例如ABCA1)的那些多肽。
除了筛选它们介导胆固醇流出和/或稳定ABCA的能力以外，还可筛选候选被测多肽的其他活性，包括例如抗氧化活性和抗炎活性。可使用许多不同的筛选规程来鉴别本发明的具有抗氧化活性和/或抗炎活性的多肽或肽模拟物。
本领域技术人员容易明白的是，除了本文中描述的那些方法以外，还可以使用多种其他筛选分析法来筛选本发明的多肽或肽模拟物的期望生物活性。
A.胆固醇流出活性的筛选
合适的胆固醇流出分析法在例如Bielicki，J.K and Oda，M.N.，Biochemistry，41：2089-2096(2002)；Jia et al，Biochem.Biophys.Res.Common.，297：206-213(2002)中描述。在一些实施方案中，已知介导胆固醇流出的多肽(例如Apo A-I的螺旋9/10)被用于在基于细胞的分析法中筛选使胆固醇流出的另外介导物。例如，可使用上调ABCA1蛋白表达的cAMP类似物增强胆固醇流出的细胞系(例如J714巨噬细胞)可便捷地用于评价本发明的多肽介导胆固醇流出的能力。在适于胆固醇被细胞摄取的条件下，将标记的胆固醇(例如[3H]胆固醇)和细胞温育。因此，在引起细胞胆固醇流出之前，即在使细胞与被测多肽接触之前，将细胞和cAMP或cAMP类似物(例如CPT-cAMP)温育合适的时间。介质中出现的标记的胆固醇的测量结果被用于确定被测多肽的介导胆固醇流出的活性。
B.ABCA稳定活性的筛选
可以使用本领域已知的多种分析法来测量本发明的多肽的ABCA稳定活性。例如，可以使用结合分析法来检测所述被测多肽与ABCA(例如，ABCA1)结合的能力。现已发现，具有ABCA稳定活性的多肽还可能是胆固醇流出的介导物。同样地，在优选的实施方案中，本发明的多肽或肽模拟物具有介导胆固醇流出和稳定ABCA的能力。在一个筛选实施方案中，所述结合分析法可以是竞争分析法。其他分析法包括，例如在与所述被测多肽接触后直接测定ABCA(例如，ABCA蛋白或核酸)。
1.结合分析法
结合分析法通常包括将ABCA与一种或多种被测多肽接触并且允许足够的时间以使ABCA和被测多肽形成结合复合体。可以使用多种建立的分析技术中的任一种来检测任何形成的结合复合体。蛋白结合分析法包括但不限于免疫组化结合分析、流式细胞术或其他分析定法。在一些实施方案中，使用竞争分析法来确定被测多肽是否具有ABCA稳定活性。竞争分析法是本领域熟知的。通常，竞争化合物、即已知结合ABCA的化合物被标记，使得可以测定与ABCA结合的差异(例如，在存在渐增量的本发明可结合ABCA的被测多肽的条件下)。分析法中使用的特定标记或可检测的基团不是本发明的关键方面，只要其不显著干涉被测化合物与ABCA的结合即可。如本文中所述，可检测的基团(或可选择地，可检测的部分或标记)可以是具有可检测的物理或化学性能的任何材料。这样的可检测标记已在免疫分析领域充分建立，通常可用于这类方法的大多数任意标记均可应用于本发明。因此，标记是可通过分光、光化学、生物化法、免疫化学、电学、光学或化学手段来检测的任意组合物。本发明中可使用的标记包括但不限于磁珠(例如DYNABEADSTM)、荧光染料(例如异硫氰酸荧光素、德克萨斯红、若丹明等)、放射标记(例如3H、125I、35S、14C或32P)、酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和ELISA中通常使用的其他酶)、和显色标记例如胶体金或者有色玻璃或塑料珠(例如聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等)。
在一些实施方案中，通过测定被测多肽和竞争化合物(例如全长Apo A-I A或Apo A-I 9/10多肽)对于ABCA的相对ABCA结合亲和性，ABCA表达或不表达细胞被用于测量被测多肽的ABCA(例如ABCA1)稳定活性。在一些实施方案中，按照例如Remaley et al.，J.Lipid Res.，44：828-836(2003)中的描述，全长Apo A-I A与ABCA的结合亲和性与本发明的标记多肽的结合亲和性进行比较。ABCA表达细胞在存在和不存在竞争化合物的条件下温育，然后暴露于一系列浓度的各标记被测多肽(例如，本发明的放射标记的多肽)。通常，被测多肽的浓度为约0.1μg/ml至约200μg/ml、约0.5μg/ml至约100μg/ml、约1μg/ml至约40μg/ml、或约5μg/ml至约20μg/ml。
2.ABCA的直接测量
在一些实施方案中，通过使用基于细胞的分析法直接测定ABCA(例如ABCA蛋白或核酸)，来测定ABCA的稳定性。基于细胞的分析法可在任意ABCA表达细胞(例如J774巨噬细胞)中进行，包括被ABCA转染的细胞(例如HeLa细胞)。可使用任何细胞类型。例如，J774巨噬细胞可用于评价在存在和不存在本发明的多肽的条件下的相对ABCA1蛋白水平。细胞首先与化合物接触，该化合物将诱导ABCA(例如cAMP或cAMP类似物，例如8-溴-cAMP)上调ABCA(例如ABCA1)表达，然后在存在和不存在本发明的多肽以及不存在cAMP刺激物的条件下暴露于合成的ABCA1蛋白水平，从而评价ABCA1蛋白是稳定的还是降解的。使用本领域中已知的任何方法可以评价ABCA1蛋白的相对水平，包括例如细胞膜的免疫印迹分析(Oram et al，J.Biol.Chem.，278：52379-52385(2003))或核酸探针与ABCA mRNA的杂交。
C.抗氧化活性的筛选
可使用本领域中已知的方法来筛选本发明的多肽或肽模拟物的抗氧化活性。例如，美国专利公布No.2003/0087819记述了许多可用于确定多肽的抗氧化活性的分析法，包括例如胶束底物分析法。包含磷脂(例如1-棕榈酰-2-亚油酰磷脂酰胆碱)的胶束底物被用于测定被特定酶(例如大豆脂肪氧化酶和/或黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶)催化的脂质过氧化速率。在将本发明的重组多肽加入磷脂胶束后，酶引发脂质过氧化。在25℃下通过紫外光吸收分光光度法(234nm)来监测共轭二烯(脂质过氧化的产物)的增加。使用共轭二烯的摩尔吸收系数(ε＝29,500Lcm-1mol-1)来计算磷脂过氧化物的质量。从氧化曲线的线性部分的斜率计算脂肪氧化酶介导的脂质过氧化的初始速率，结果可以表示为每分钟形成的磷脂过氧化物的纳摩尔数。基于在不存在多肽的条件下获得的脂质过氧化物积蓄的最高水平(即氧化曲线关联的平台)，可以得到有关本发明的多肽的效价的定量信息(例如导致保护50％避免受到脂质过氧化的多肽的浓度)。其他方法涉及筛选多肽阻止ApoB脂蛋白氧化为LDL、VLDL和Lp(A)的能力。
筛选抗氧化活性的其他分析法在PCT公布No.WO 02/15923中公开，该教导以引用的方式并入本文。
D.抗炎活性的筛选
可使用本领域中已知的任何方法来筛选本发明的多肽或肽模拟物的抗炎活性。例如，可以使用评价对炎症事件敏感的酶(例如卵磷脂：胆固醇乙酰转移酶(LCAT)或对氧磷酶(PON))的活性的分析法来评价本发明的多肽的抗炎活性。合适的分析法记载于例如Chen et al.，J.Lipid Res.，23：680-691(1982)中，其描述了使用外源性脂蛋白体底物进行LCAT活性的定量，和Forte et al.，J.Lipid Res.，43：477-485(2002)，其描述了PON活性的定量。其他筛选可包括监测多肽抑制mRNA表达的能力和/或靶细胞在各种刺激(例如粘附分子、TNF-α、LPS、或其组合)后的蛋白生产。
E.前-β形成
还可筛选本发明的肽在人血浆中诱导前β-1HDL形成的能力。在这样的分析的一个实施例中，待测肽被加到人血浆中。温育有和没有肽的血浆，然后例如通过第一尺寸的琼脂糖凝胶电泳继之以第二种尺寸的天然梯度凝胶电泳进行评价，来评价人血浆样品中存在的HDL粒子群。目的肽在例如肽∶Apo AI(血浆中)为大约1∶1或更低的摩尔比率下，典型地展现有力的活性。
F.进一步的测试
可以进一步测试初始被鉴别为介导胆固醇流出或与ABCA相互作用的多肽，从而证实它们介导胆固醇流出和/或稳定ABCA的能力。这种方法的基本形式包括将在初始筛选过程中鉴别的先导化合物施用到用作模型的动物。在证实研究中利用的动物模型通常为任何类型的哺乳动物。合适动物的特定例子包括但不限于灵长类动物(例如黑猩猩、猴等)和啮齿动物(例如小鼠、大鼠、豚鼠、兔等)。在优选的实施方案中，使用Apo E-/-小鼠、Apo A-II-/-小鼠或Apo C-III-/-小鼠。另外的动物模型在例如Marschang et al，Sem.Cell Dev.Biol，14：25-35(2003)中描述。
G.高通量筛选
在一个实施方案中，高通量筛选(HTS)法用于鉴别本发明的介导胆固醇流出和/或稳定ABCA的多肽或肽模拟物。HTS法包括提供含有许许多多潜在治疗化合物(即介导胆固醇流出或稳定ABCA的多肽或肽模拟物)的组合多肽文库。然后按照本文中描述，以一种或多种分析法筛选这种“文库”，从而鉴别显示出所需特性活性的那些文库成员(即特定的多肽或肽模拟物)。因此，鉴别的化合物可充当常规“先导化合物”或它们本身可用作潜在的或实用的治疗剂。
组合多肽文库是通过化学合成或生物合成组合许多化学“结构单元”、即氨基酸而产生的多样的多肽的集合。更特别地，对于给定的化合物长度(即多肽化合物中氨基酸的数目)，通过以每种可能的方式组合一组化学结构单元(氨基酸)而形成线性组合多肽文库。通过化学结构单元的这种组合式混合可合成数百万种多肽化合物。在优选的实施方案中，以高通量方式产生并筛选SEQ ID NO：2-26和31-33的多肽的保守变体的所需生物活性(例如胆固醇流出活性)。
制备组合文库的装置是本领域技术人员已知的，并且可从许多不同来源购得(例如参见ECIS TM，Applied BioPhysics Inc.，Troy，NY，MPS，390MPS，Advanced Chem Tech，Louisville KY，Symphony，Rainin，Woburn，MA，433 A Applied Biosystems，Foster City，CA，9050 Plus，Millipore，Bedford，MA)。
V.使用方法
本发明的非天然存在的多肽使用强效的胆固醇逆向转运(RCT)途径来介导胆固醇流出。除了是强效和选择性的ABCA1依赖性胆固醇流出的介导物以外，本发明的多肽还具有ABCA稳定活性、抗氧化活性和抗炎活性，这些活性的任意组合，并优选所有这些活性。
考虑到它们的生物活性、特别是它们介导胆固醇流出的能力，本发明的多肽(或其肽模拟物)可用于治疗哺乳动物中胆固醇水平升高或者预防性治疗存在发展胆固醇水平升高风险的哺乳动物。另外，所述多肽或肽模拟物还可用于改善哺乳动物中的脂质参数。“脂质参数”的改善包括例如下列情况中的一种或多种：脂蛋白粘附血管的倾向性降低、动脉粥样硬化斑块的量减少(即使血浆LDL和/或HDL浓度可不显著改变)、HDL或LDL粒子的氧化潜能降低、动脉粥样硬化消退(例如这通过颈动脉血管造影术或超声法来测定)和心脏事件的减少。因此，本发明的多肽或肽模拟物可用于治疗或预防(即预防性治疗)与血脂异常、高胆固醇血症和炎症有关的疾病和状况、或可通过改变脂质参数治疗的疾病和状况，例如本文中公开的那些疾病和状况。
除了本文中具体公开的疾病和状况以外，本领域技术人员将知道使用本发明的多肽或肽模拟物可治疗或预防的与血脂异常、高胆固醇血症和炎症有关的其他疾病和状况。
A.动脉粥样硬化症的治疗或预防
在一个实施方案中，本发明提供治疗、改善和/或预防一种或多种动脉粥样硬化症状的方法。方法优选包括将一种或多种本发明的多肽(或这种多肽的肽模拟物)施加至有机体、优选哺乳动物、更优选人。如本文中所述，多肽可根据许多标准方法中的任一种来施用，所述方法包括但不限于注射、栓剂、鼻腔喷雾、限时释放移植剂、经皮贴剂、口服等。在一个特别优选的实施方案中，口服施用多肽(例如作为糖浆、胶囊、片剂等)。
本发明的方法不限于治疗患有一种或多种动脉粥样硬化症状(例如高血压、血管缩窄、斑块形成和破裂、心脏病发作、心绞痛、或中风、高水平的血浆胆固醇、高水平的低密度脂蛋白、高水平的极低密度脂蛋白、或炎症蛋白等)的人或非人动物，而在预防方面也非常有用。因此，本发明的多肽(或其肽模拟物)可施用到有机体、例如人或非人动物上，以预防一种或多种动脉粥样硬化症状的发作，即发展。用于预防性治疗的合适的候选对象包括，例如具有一种或多种动脉粥样硬化的风险因素(例如家族史，与动脉粥样硬化相关联的遗传标志，高血压，肥胖症，严重酗酒，吸烟，高血胆固醇，高血甘油三酯，血LDL、VLDL、IDL或低HDL升高、糖尿病或糖尿病家族史、高血脂、心脏病发作、心绞痛或中风等)的那些对象。
治疗可补充或避免血管外科手术的需要，使抗动脉粥样硬化治疗具有系统性和可持续性。因此，所述肽可在干预前给予以在外科手术前优化循环、在外科手术中在脉管系统或其附近局部施用、或在外科手术后给予以减轻由外科手术干预的机械性创伤引起的炎症和动脉粥样硬化。
B.与急性炎症反应有关的动脉粥样硬化症状的治疗或预防
本发明的抑制动脉粥样硬化的多肽还可用于许多其他方面。特别地，现已发现心血管并发症(例如动脉粥样硬化、中风等)通常伴随或紧跟急性期炎症反应。这种急性期炎症反应通常与复发性炎症疾病(例如麻风病、肺结核、全身性红斑狼疮、类风湿性关节炎等)、病毒感染(例如流感、HIV等)、细菌感染、真菌感染、器官移植、伤口或其他创伤、移植的假体、生物膜等有关。
考虑到它们的抗氧化活性，本文中所述的多肽可用于在急性期炎症反应期间或之后减少或预防氧化磷脂的形成，从而减轻或消除与这种状况有关的心血管并发症。
因此，在某些实施方案中，本发明预见将一种或多种本发明的多肽施用到存在急性期炎症反应风险或遭受急性期炎症反应的对象和/或存在动脉粥样硬化症状风险或遭受动脉粥样硬化症状的对象。
本发明的肽对脂质具有作用，从而可用于治疗其中脂质和脂质代谢发挥作用的疾病状态。因此，例如，在流感季节患有冠状动脉疾病或存在冠状动脉疾病风险的人可预防性施用本发明的多肽。经受复发性炎症状况例如类风湿性关节炎、各种自体免疫疾病等的人(或其他动物)可使用本发明的多肽治疗，以减轻或预防动脉粥样硬化或中风的发展。类似地，经受创伤例如急性损伤、组织移植等的人(或其他动物)可使用本发明的多肽治疗，以减轻或预防动脉粥样硬化或中风的发展。
在某些情况下，这些方法需要诊断急性炎症反应的发生或风险。急性炎症反应通常涉及肝中的代谢和基因调节的改变。这是一个在免疫系统、心血管系统和中枢神经系统以外，还涉及机体的所有主要系统的动态体内平衡过程。正常地，急性期反应仅持续几天，然而在慢性或复发性炎症的情况下，急性期反应的一些方面的异常延续可能促进伴随疾病的潜在组织损害，并且还可导致进一步的并发症，例如心血管疾病或蛋白沉积疾病，例如淀粉样变性。
急性期反应的一个重要方面是肝的生物合成情况根本改变。在正常的情况下，肝合成稳定态浓度的特定范围的血浆蛋白。这些蛋白许多具有重要的功能，并且在炎症刺激后的急性期反应期间需要较高血浆水平的这些急性期反应物(APR)或急性期蛋白(APP)。尽管大部分APR由肝细胞合成，但是一些APR由其他细胞类型生产，包括单核细胞、内皮细胞、成纤维细胞和脂肪细胞。大部分APR被诱导到高出正常水平50％至几倍。相反，主要APR可增加至高出正常水平1000倍。该组包括血清淀粉样A(SAA)、和人的C-反应性蛋白(CRP)或其小鼠同源物、血清淀粉样P成分(SAP)。所谓的负性APR的血浆浓度在急性期反应期间降低，从而允许肝合成诱导的APR的能力增强。
因此，在某些实施方案中，通过测定一种或多种APP来评价急性期炎症反应或风险。这种标志的测定是本领域技术人员熟知的，并且存在提供这种测定的商业公司(例如Cardiotech Services，Louisville，KY.测定AGP)。一旦确定人正经历急性期炎症反应或存在经历急性期炎症反应的风险，本发明的多肽可在急性期炎症反应期间或之后施用以减少或预防氧化磷脂的形成，从而减轻或消除与这种状况有关的心血管并发症。
C.与冠状动脉钙化和骨质疏松症有关的症状或状况的治疗或预防
还已经发现，氧化脂质可能是冠状动脉钙化和骨质疏松症的病因。还认为氧化脂质可能涉及钙化性主动脉狭窄的发病机理。
因此，在另一个实施方案中，本发明的多肽用于治疗、抑制或预防疾病例如风湿性多肌痛、结节性多动脉炎、硬皮病、特发性肺纤维化、慢性阻塞性肺病、阿尔茨海默氏病、AIDS、冠状动脉钙化、钙化性主动脉狭窄、骨质疏松症等的症状。在这样的方法中，本发明的多肽或肽模拟物可施用到人或非人动物以减少或预防氧化磷脂的形成，从而抑制或预防疾病例如风湿性多肌痛、结节性多动脉炎、硬皮病、特发性肺纤维化、慢性阻塞性肺病、阿尔茨海默氏病、AIDS、冠状动脉钙化、钙化性主动脉狭窄、骨质疏松症等的症状。
通常，所有上述方法包括施用本发明的单一多肽，或可选择地，施用本发明的两种或多种不同的多肽。这样的多肽可单独施用或与其他治疗剂、例如本文中描述的那些联合施用。多肽可以提供为单体或二聚物、低聚物或聚合物的形式。在某些实施方案中，多聚物形式可包含缔合的单体(例如离子性或疏水性连接)；而在其他实施方案中，其他多聚物形式包含共价连接的单体(直接连接或通过接头连接)。
另外，尽管本文中描述的所有上述方法都是针对人而言的，但是本领域技术人员容易明白这种方法还可用于其他动物，即用于兽医应用。因此，优选的有机体包括但不限于人、非人灵长类动物、犬类动物、马类动物、猫科动物、猪类动物、有蹄类动物、兔类动物等。
D.易损性斑块的稳定
如本文中所解释的，心脏病、特别是冠状动脉疾病是美国和其他工业化国家中死亡、残疾和医疗保健花费的主要原因。直到近年来，大部分心脏病被认为主要是冠状动脉中的硬斑块的渐进性增加而引起的。这种硬斑块的动脉粥样硬化疾病过程导致受到影响的冠状动脉的严重缩小(狭窄)，并且产生通常称为胸疼的心绞痛综合征。渐进性缩窄减慢了血液流动，引起形成血液凝块(血栓)。凝块可阻塞富氧血液流向心肌(局部缺血)，引起心脏病发作。或者，凝块可中断另一器官例如脑的血管并存在于其中，导致血栓性中风。
然而在过去十年中，已出现在一定程度上改变动脉粥样硬化、冠状动脉疾病和心脏病发作模式的证据。尽管硬斑块的累积可产生心绞痛和在冠状动脉中的严重局部缺血，但是新的临床数据表明本身通常是非阻塞性的易损性斑块，破裂会引起绝大部分心脏病发作。估计比率高达60-80％。
在许多情况下，易损性斑块不侵占血管腔；而是更像脓肿那样根植于动脉壁内。大部分易损性斑块包括脂质池、平滑肌(内皮)细胞和填充胆固醇的、由薄的纤维帽包含的巨噬细胞/泡沫细胞的致密浸润物。脂质池被认为是由于涉及低密度脂蛋白(LDL)、巨噬细胞和炎症过程的病理过程而形成。巨噬细胞氧化LDL，从而产生泡沫细胞。
巨噬细胞、泡沫细胞和相关的内皮细胞释放多种物质，例如肿瘤坏死因子、组织因子和基质蛋白酶，这导致广泛性细胞坏死和凋亡、促凝聚和纤维帽的弱化。炎症过程可将纤维帽弱化到足够的机械应力、例如通过增加血压而产生的应力可导致破裂的程度。然后易损性斑块的脂质核心和其他成分可溢出到血流中，从而引发凝血级联。所述级联产生潜在地引起心脏病发作和/或中风的血液凝块。由于胶原蛋白和斑块成分(例如，胶原蛋白和组织因子)的释放，因它们释放而增加凝血，该过程恶化。
已经发现本发明的多肽可通过胆固醇逆向转运减少斑块脂质含量来稳定易损性斑块。因此，在另一个实施方案，本发明提供通过向哺乳动物(更优选为人)施用一种或多种本发明的多肽(或这种多肽的肽模拟物)来稳定哺乳动物的血管中的易损性斑块的方法。“易损性”斑块通常被定义为具有薄纤维帽的富脂质斑块，这样的薄纤维帽缺乏合适的胶原蛋白和平滑肌细胞支持。此外，本发明的多肽可以减少斑块脂质含量，从而稳定这种“易损性”斑块。
在一个实施方案中，哺乳动物是被诊断为患有一种或多种易损性斑块的哺乳动物。在该实施方案中，已建立了多种不同的诊断分析法用于检测(例如诊断和定位)易损性斑块，包括温度检测法、标记法、成像法(例如利用磁共振、超声、红外、荧光、可见光、无线电波、X射线等的装置)、辨别易损性斑块与周围健康血管组织的通用方法等(例如参见美国专利No.6,245,026、6,475,159、6,475,210和7,118,567)。一种方法包括测定血管内的温度。例如，与健康的血管组织相比，易损性斑块组织的温度通常较高。这种温度差异的测定允许检测易损性斑块。另一种检测方法包括使用标志物标记易损性斑块。标志物可以是对易损性斑块的成分和/或特性具有特异性的物质(例如C-反应性蛋白)。例如，与对健康组织的亲和性相比，标志物对于易损性斑块可具有更高的亲和性。因此标志物的检测可允许检测易损性斑块。或者，标志物对于易损性斑块可不必须具有亲和性，而是仅仅在与易损性斑块缔合时改变性质。性能的改变可以检测，并且因此允许检测易损性斑块。
在另一个实施方案中，哺乳动物存在患有一种或多种易损性斑块的风险。在该实施方案中，临床症状已得到发展和/或临床事件已发生从而导致本领域技术人员相信哺乳动物存在患有一种或多种易损性斑块的风险。
与稳定易损性斑块的上述方法相关的是，如本文中所述，多肽可根据许多标准方法中的任一种来施用，所述方法包括但不限于注射、输液、栓剂、鼻腔喷雾、限时释放移植剂、透皮贴剂、口服等。在一个特别优选的实施方案中，口服施用多肽(例如作为糖浆、胶囊、片剂等)。另外，本发明的多肽(或肽模拟物)可单独使用或与其他已知治疗血脂异常、高胆固醇血症和炎症的药剂联合使用以提高血浆HDL浓度和/或促进胆固醇逆向转运。
VI.联合治疗
在一些实施方案中，本发明的多肽或肽模拟物联合一种或多种附加治疗剂施用以治疗或预防与血脂异常、高胆固醇血症和炎症有关的疾病和病症，例如心血管疾病，包括动脉粥样硬化。例如，在一个实施方案中，本发明的多肽结合用于动脉粥样硬化的标准治疗中的任一种施用，所述标准治疗包括例如他汀类(例如阿伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀、氟伐他汀或罗伐他汀)；Nieman-Pick C1样1固醇转运蛋白通道抑制剂(例如依泽替米贝)；胆汁酸结合剂(例如消胆胺或考来替泊)；血小板聚集抑制剂(例如阿司匹林、噻氯匹定或氯吡格雷)；烟酸/烟酰胺；PPAR激活剂；维生素E；外科手术干预(例如血管成形术、支架法、或动脉内膜切除术)、和生活方式改变(例如，低脂膳食、减肥和运动)。
更特别地，本发明的多肽或肽模拟物可以作为分开的单元或固定的组合与一种或多种下列物质联合使用：抗体，其与不想要的炎症分子或细胞因子例如白介素6、白介素8、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子α结合；酶抑制剂，例如蛋白酶抑制剂抑肽酶或环氧合酶抑制剂；抗生素，例如阿莫西林、利福平、红霉素；抗病毒剂，例如阿昔洛韦；类固醇抗炎剂，例如糖皮质激素；非类固醇抗炎剂，例如阿司匹林、布洛芬或乙酰氨基酚；或非炎症性细胞因子，例如白介素4或白介素10。其他细胞因子和生长因子例如干扰素-β、肿瘤坏死因子、抗血管生成因子、促红细胞生成素、血小板生成素、白介素、成熟因子、趋化蛋白、和它们保持类似生理活性的变异体和衍生物，也可用作附加治疗剂。
本发明的多肽或肽模拟物还可与通常用于治疗例如糖尿病患者的脂质病症的药物联合使用。这样的药物包括但不限于：HMG-CoA还原酶抑制剂、烟酸、依折麦布(ezetimide)、胆汁酸螯合剂、纤维酸衍生物、MTP抑制剂、ACAT抑制剂和CETP抑制剂。HMG-CoA还原酶抑制剂的例子包括：洛伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀、罗伐他汀、氟伐他汀和阿伐他汀。胆汁酸螯合剂的例子包括：消胆胺、考来替泊和考来维仑。纤维酸衍生物的例子包括：吉非罗齐和非诺贝特。
本发明的多肽或肽模拟物还可与抗高血压药物联合使用，所述抗高血压药物为例如利尿剂、β-阻断剂、组织蛋白酶S抑制剂、甲基多吧、α2-肾上腺素能受体激动剂、胍那决尔、利血平、β-肾上腺素能受体拮抗剂、α1-肾上腺素能受体拮抗剂、肼苯哒嗪、米诺地尔、钙通道拮抗剂、ACE抑制剂和血管紧张素II受体拮抗剂。β-阻断剂的例子包括醋丁洛尔、比索洛尔、艾司洛尔、普奈洛尔、阿替洛尔、拉贝洛尔、卡维地洛和美托洛尔。ACE抑制剂的例子包括卡托普利、依拉普利、赖诺普利、贝那普利、福辛普利、雷米普利、喹那普利、培哚普利、群多普利和莫西普利。
本发明的多肽或肽模拟物还可与心血管药物联合使用，所述心血管药物为例如钙通道拮抗剂、β-肾上腺素能受体拮抗剂和激动剂、醛固酮拮抗剂、ACE抑制剂、血管紧张素II受体拮抗剂、硝基血管扩张剂和强心甙。本发明的多肽或肽模拟物还可与抗炎药物联合使用，所述抗炎药物为例如H1-受体拮抗剂、H2-受体介导的激动剂和拮抗剂、COX-2抑制剂、NSAID、水杨酸盐、乙酰氨基酚、丙酸衍生物、烯醇酸、二芳基取代的呋喃酮、环氧合酶抑制剂、和缓激肽激动剂和拮抗剂。
其他适于与本发明的多肽或肽模拟物联合使用的治疗剂公开在2005年6月30日公布的美国专利申请公布No.2005/0142180中，其教导以引用的方式并入本文。
所述肽(或其肽模拟物)和附加治疗剂可同时或相继施用。例如，可首先施用多肽，接着施用附加治疗剂。或者，可首先施用附加治疗剂，接着施用本发明的多肽。在一些情况下，本发明的多肽和附加治疗剂在同一制剂中施用。在其他情况下，多肽和附加治疗剂在不同的制剂中施用。当多肽和附加治疗剂在不同的制剂中施用时，它们的施用可以同时或相继进行。
VII.药物制剂
为了实施本发明的方法，将本发明的一种或多种多肽或其肽模拟物施用到被诊断为患有与血脂异常、高胆固醇血症和炎症有关的疾病或病症或存在所述疾病或病症风险的个体(例如，被诊断患有一种或多种动脉粥样硬化症状或存在动脉粥样硬化风险的个体)。所述多肽或其肽模拟物可以用它们的“天然”形式施用，或如果需要以例如盐、酯、酰胺、前药、衍生物等形式施用，前提条件是所述盐、酯、酰胺、前药或衍生物是药理学上合适的，即在本发明的方法中是有效的。
在本文所述的方法的一个实施方案中，给药途径可以是口服、腹膜内、透皮、皮下、静脉内或肌肉内注射、吸入、局部、病灶内、输液；脂质体介导的递送；局部、鞘内、龈袋、直肠、支气管内、鼻腔、经粘膜、肠道、眼睛或耳递送，或本领域技术人员容易想到的本领域已知的其他任何方法。本发明组合物的其他实施方案针对各种给药途径、包括胃肠外、肺、鼻和口，结合了微粒形式的保护性涂层、蛋白酶抑制剂或渗透增强剂。取决于给药方法/方式，药物组合物可以各种单位剂型施用。合适的单位剂型包括但不限于粉末、片剂、丸剂、胶囊、菱形片、栓剂、贴剂、鼻喷雾剂、注射剂、可植入的缓释制剂等。
同样地，在另一个方面，本发明提供药物组合物，其包含药学上有效量的本发明的多肽或肽模拟物和可接受的载体和/或赋形剂。药学上可接受的载体包括生理相容的、并且优选不干扰或不以其他方式抑制多肽或肽模拟物活性的任何溶剂、分散介质或涂料。优选地，所述载体适于静脉内、肌肉内、口服、腹膜内、透皮、局部或皮下施用。药学上可接受的载体可含有一种或多种生理学上可接受的化合物，该化合物起到例如稳定组合物或者增加或降低活性剂的吸收的作用。生理学上可接受的化合物可包括，例如，碳水化合物例如葡萄糖、蔗糖或右旋糖酐，抗氧化剂例如抗坏血酸或谷胱甘肽，螯合剂、低分子量蛋白质、减少活性剂的清除或水解的组合物、或赋形剂、或其他稳定剂和/或缓冲剂。
其他生理学上可接受的化合物包括但不限于润湿剂、乳化剂、分散剂或特别可用于预防微生物的生长或作用的防腐剂。各种防腐剂是熟知的，包括例如苯酚和抗坏血酸。本领域技术人员将意识到，药学上可接受的载体、包括生理学上可接受的化合物的选择，取决于例如多肽或肽模拟物的给药途径和多肽或肽模拟物的特定理化特性。
在优选的实施方案中，药学上可接受的载体为生理盐水。其他药学上可接受的载体和它们的制剂是熟知的，并且通常在例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy，21st Edition，Philadelphia，PA.Lippincott Williams & Wilkins，2005中描述。各种药学上可接受的赋形剂是本领域熟知的，并且可在例如Handbook of Pharmaceutical Excipients(4th ed.，Ed.Rowe et al，Pharmaceutical Press，Washington，D.C.)中找到。此外，所述药物组合物可配制为溶液、微乳液、脂质体、胶囊、片剂或其他合适的形式。活性成分可在材料中包被以保护其避免在到达靶作用位点之前因环境而失活。
在某些优选的实施方案中，本发明的多肽或肽模拟物可根据本领域技术人员熟知的标准方法口服施用(例如，通过片剂)或作为注射剂施用。在其他优选的实施方案中，多肽或肽模拟物还可使用常规的透皮药物递送系统、即透皮“贴剂”通过皮肤递送，其中多肽或肽模拟物通常包含在固定在皮肤上的起到药物递送装置的层状结构内。在这种结构中，药物组合物通常包含在上背衬层下面的层中或“贮库”中。将理解在本文中术语“贮库”是指最终可递送到皮肤表面的一定量的“活性成分”。因此，例如“贮库”可包含在贴剂的背衬层上的粘合剂中的活性成分、或者在本领域技术人员已知的多种各样基质制剂的任一种中的活性成分。贴剂可包含单个贮库，或者其可包含多个贮库。
在一个实施方案中，贮库包含药学上可接受的接触粘合剂材料的聚合物基质，所述粘合剂材料起到在药物递送过程中将系统固定到皮肤上的作用。合适的皮肤接触粘合剂材料的例子包括但不限于聚乙烯、聚硅氧烷、聚异丁烯、聚丙烯酸酯、聚氨酯等。可选择地，含药贮库和皮肤接触粘合剂以分离而独立的层存在，在这种情况下贮库下面的粘合剂可以是如上所述的聚合物基质，或者其可以是液体或水凝胶贮库，或者可以呈某些其他形式。这些层状结构中充当装置的上表面的背衬层优选用作“贴剂”的主要结构元件，并将其柔性大量赋予装置。所选的用于背衬层的材料优选对于活性剂和存在的任何其他材料是基本上不渗透的。
局部药物递送的其他优选制剂包括但不限于软膏和乳膏。软膏是通常基于矿脂或其它石油衍生物的半固体制剂。含有所选活性剂的乳膏通常为粘性液体或半固体乳剂，其常是水包油或油包水的。乳膏基质通常是可以水洗的，并含有油相、乳化剂和水相。油相，有时又称“内”相，通常由矿脂和脂肪醇例如鲸蜡醇或硬脂醇构成；尽管不是必要的，但是水相体积通常超过油相体积，并且通常含有保湿剂。乳膏制剂中的乳化剂通常是非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂或两性表面活性剂。正如本领域技术人员所理解的一样，所使用的特定软膏基质或乳膏基质将是提供最佳药物递送的基质。如同其它载体或介质一样，软膏基质应是惰性、稳定、无刺激性和不致敏的。
在一些实施方案中，植入装置(例如动脉和静脉内支架包括洗脱支架，和导管)用于递送包含本发明的多肽和肽模拟物的制剂。例如，包含本发明的多肽和肽模拟物的水溶液通过支架和导管直接施用。在一些实施方案中，支架和导管可以涂覆有包含本文中描述的多肽和肽模拟物的制剂。在一些实施方案中，多肽和肽模拟物在从支架洗脱的限时释放制剂中。合适的支架在例如美国专利No.6,827,735、6,827,735、6,827,732、6,824,561、6,821,549、6,821,296、6,821,291、6,818,247、6,818,016、6,818,014、6,818,013、6,814,749、6,811,566、6,805,709、6,805,707、6,805,705、6,805,704、6,802,859、6,802,857、6,802,856和496,802,849中描述。合适的导管在例如美国专利No.6,829,497、6,827,798、6,827,730、6,827,703、6,824,554、6,824,553、6,824,551、6,824,532和6,819,951中描述。
与通常的多肽制剂不同，本发明的包含L型或D型氨基酸的多肽甚至可以口服施用，而无须加以保护以避免胃酸的蛋白酶解等。然而，在某些实施方案中，通过使用保护性赋形剂可以增强多肽递送。这通常是将多肽与组合物复合以使其耐酸和酶的水解、或者通过将多肽包装在合适的抗性载体例如脂质体中来实现的。用于口服递送的保护多肽的方法是本领域所熟知的(例如参见美国专利No.5,391,377，其描述了用于治疗剂的口服递送的脂质组合物)。
延长的血清半衰期可以用缓释多肽“包装”系统来维持。这种缓释系统是本领域技术人员熟知的。在一个优选的实施方案中，使用用于蛋白和多肽的ProLease可生物降解的微球递送系统(Tracy，Biotechnol.Prog.，14：108(1998)；Johnson et al，Nature Med.，2：795(1996)；Herbert et al，Pharmaceut.Res.，15：357(1998))，其包括使用由可生物降解的聚合物微球构成的干粉，该微球在聚合物基质内含有多肽，可以将含或不含其他试剂的干粉制成干制剂。
对ProLease微球制造工艺进行设计，以在维持蛋白完整性的同时达到高效率的多肽包封。该工艺由以下步骤组成：(i)通过喷洒冻干的药物溶液与稳定性赋形剂，由本体多肽制备冻干的蛋白粒子；(ii)制备药物-聚合物混悬液，随后通过超声处理或均化处理以减小药物粒度；(iii)通过在液氮中雾化，产生冻结的药物-聚合物微球；(iv)用乙醇萃取聚合物溶剂；以及(v)过滤和真空干燥以产生最终的干粉产品。所得干粉含有固体形式的多肽，它均匀稳定地分散在多孔聚合物粒子内。该工艺最常用的聚合物聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLG))，其既是生物相容性的又是可生物降解的。
包封可以在低温(例如-40℃)下完成。在包封期间，在不存在水的条件下，多肽保持固态，因此使水诱导的多肽构象活动性最小化，防止了包括水作为反应物的多肽降解反应，并且避免了多肽可能发生变性的有机-水界面。优选的方法采用大多数多肽不溶解的溶剂，因此获得高包封效率(例如大于95％)。
在另一个实施方案，溶液的一种或多种成分可作为“浓缩物”在例如准备用于稀释的储存容器(例如预定体积)或准备用于添加一定体积水的可溶胶囊中提供。
在本发明的某些实施方案中，药物组合物为缓释制剂。本发明的多肽或肽模拟物可与控制共聚物释放到直接环境中的速率的生物相容性聚合物或基质混合。控释或缓释组合物包括亲脂性药库(depot)(例如脂肪酸、蜡、油)形式的制剂。本发明还预见了涂覆聚合物(例如泊洛沙姆或泊洛沙胺)的微粒组合物。本发明组合物的其他实施方案针对各种给药途径、包括胃肠外、肺、鼻和口，引入微粒形式、保护性涂层、蛋白酶抑制剂或渗透增强剂。可接受的载体包括羧甲基纤维素(CMC)和改性CMC。
本发明的药物组合物在递送时优选是无菌的和非热原性的，并且在制备和储存的条件下优选是稳定的。这些药物组合物可通过常规熟知的灭菌技术来灭菌。
在治疗应用中，本发明的组合物施用到被诊断为患有与血脂异常、高胆固醇血症和炎症有关的疾病或病症或存在所述疾病或病症风险的个体(在优选的实施方案中，施用到被诊断为患有一种或多种动脉粥样硬化症状或存在动脉粥样硬化风险的个体)的量足以治愈、或至少部分预防或遏制疾病、状况和/或其并发症。足以达到该目的的量被定义为“治疗有效剂量”。对该用途有效的量取决于疾病的严重程度和患者健康的大体状态。单次或多次施用组合物可根据患者需要和耐受的剂量和频率而施用。在任何情况下，组合物都应该提供足够量的本发明制剂的活性剂、即多肽或肽模拟物，以有效地治疗(改善一种或多种症状)个体或患者。
多肽或肽模拟物的浓度可发生较大改变，并将根据选择的特定给药模式和患者需要，主要基于流体体积、粘度、体重、多肽的循环血浆水平、多肽毒性、疾病(例如动脉粥样硬化)进展、与多肽特异性结合的抗体的产生等而选择。通常，多肽或肽模拟物的剂量当量为约0.1至约50mg/kg体重，优选为约1至约25mg/kg，最优选为优选为约1至约20mg/kg。将理解这种剂量在具体对象或对象组中可改变，以优化治疗方案。
对于施用，本发明的多肽可以通过用于患者的质量和整体健康情况时多肽的LD50和不同浓度下多肽的副作用来确定的速率施用。施用可通过单次或分剂量来完成，例如在规则的基础(例如每日)上施用一段时间(例如2、3、4、5、6天、或1-3周、或更久)。
如本文中所解释的，本发明的多肽或肽模拟物可以用多种不同的方式修饰。例如，多肽可被修饰，使得组成氨基酸和/或末端氨基酸上的R基团被保护基团封闭、即保护。已发现，封闭、特别是氨基和/或羧基末端的封闭可明显改善口服递送并显著延长血清半衰期。另外，为了增强体内递送和/或生物活性，可使用合成有机化学领域的技术人员已知的标准程序来制备本发明的多肽或肽模拟物的盐、酯、酰胺、前药和其他衍生物，所述方法在例如March(1992)，Advanced Organic Chemistry；Reactions，Mechanisms and Structure，4th Ed.N.Y.Wiley-Interscience中描述。
例如，用常规方法由游离碱制备酸加成盐，这通常包括与合适的酸反应。一般来说，将药物的碱形式溶于极性有机溶剂例如甲醇或乙醇中，并向其中加入酸。所得盐或者加以沉淀或者可以通过加入极性较小的溶剂而从溶液中析出。用于制备酸加成盐的合适酸包括：有机酸，例如乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等；以及无机酸，例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。酸加成盐可以通过用合适的碱处理再转变成游离碱。本文中描述的多肽的特别优选的酸加成盐为卤化物盐，例如可以用盐酸或氢溴酸制备。相反地，以类似方式用药学上可接受的碱例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙、三甲胺等制备本发明的多肽或肽模拟物的碱式盐制剂。特别优选的碱式盐包括碱金属盐，例如钠盐和铜盐。
酯的制备通常包括可存在于本发明的多肽或肽模拟物内的羟基和/或羧基的官能化。酯通常是游离醇基的酰基取代的衍生物，即由式RCOOH羧酸衍生的部分，其中R为烷基、优选为低级烷基。如有需要，可以用常规氢解或水解程序将酯再转变成游离酸。
还可以用本领域技术人员已知的技术或有关文献资料所述技术来制备酰胺和前药。例如，酰胺可以用合适的胺反应物由酯制备，或者它们可以由酸酐或酰氯与氨或低级烷基胺反应来制备。前药通常通过共价连接一个部分来制备，该部分导致直到被个体代谢系统修饰之前，化合物是治疗上无活性的。
上述制剂和给药方法明确旨在是示意性的，其并不以任何方式限定。将理解使用本文中提供的教导，可以容易地设计其他合适的制剂和给药用方式。
VIII.脂质基制剂S
在另一个方面，本发明的多肽和肽模拟物优选结合一种或多种脂质施用。脂质可配制为赋形剂以保护和/或增强多肽或肽模拟物的转运/摄取，或者它们可单独施用。
脂质可配制为脂质体、纳米囊泡、微粒、微球、脂质粒、脂质囊泡等。这种脂质制剂可用于将本发明的多肽和肽模拟物包封和/或它们可仅与这种多肽和肽模拟物复合/混合。本领域技术人员已知如何使用这类脂质制剂来包封或复合本发明的多肽或肽模拟物。例如，脂质体的形成和应用通常是本领域技术人员已知的。近年来，开发了具有改善的血清稳定性和循环半衰期的脂质体(参见美国专利No.5,741,516)。另外，作为潜在药物载体的脂质体和脂质体样制剂的方法已有综述(参见美国专利No.5,567,434、5,552,157、5,565,213、5,738,868和5,795,587)。
在一个实施方案中，本发明的多肽或肽模拟物以与2005年6月30日公布的美国申请公布No.2005/0142180中公开的类似的方式与脂质例如磷脂(例如1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-磷脂酰胆碱(“POPC”))复合，该专利的教导以引用的方式并入本文。意外地发现，在本发明的多肽和肽模拟物以约1∶0.5至约1∶5(多肽∶POPC)的比例与例如POPC复合时，形成尺寸为约5至约20nm的不同的脂质-多肽粒子，从而导致显著增强的能力，即使胆固醇从细胞流出的能力。
因此，本发明提供多肽-脂质复合体(或者，肽模拟物-脂质复合体)，其具有增强的使胆固醇从细胞中流出的能力。通常，脂质在施用前与多肽混合。本发明的多肽和脂质可以在水溶液中以合适的比例混合，并且可以通过本领域已知的方法复合，所述方法包括但不限于冻干、去污剂增溶随后加以透析、微流化、超声和匀化。例如通过改变压力、超声频率或去污剂浓度，可以优化复合效率。通常用于制备多肽-脂质复合体的去污剂的例子为胆酸钠。
在某些实施方案中，多肽-脂质(例如磷脂)复合体可以和合适的药用稀释剂或载体一起在溶液中。在其他实施方案中，在施用前可以使用合适的药用稀释剂水合或复溶多肽-脂质复合体的冷冻干燥或冻干制剂。在另一个实施方案中，多肽-脂质复合体可以为冻干制剂，其在施用至需要的对象之前解冻到得到均匀溶液为止。
脂质可以是本领域技术人员已知的任何合适的脂质。在一个实施方案中，可以使用不含磷的脂质，包括十八胺、十二烷胺、乙酰基棕榈酸酯、(1，3)-D-甘露糖基-(1，3)甘油二酯、氨基苯糖苷、3-胆固醇基-6′-(糖基硫代)己醚糖脂、N-(2，3-二(9-(Z)-十八碳烯基氧基))-丙-1-基-N，N，N-三甲基氯化铵和脂肪酸酰胺。
在另一个实施方案中，使用磷脂或磷脂的混合物。合适的磷脂包括但不限于小烷基链磷脂、磷脂酰胆碱、卵磷脂酰胆碱、大豆磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、大豆磷脂酰甘油、卵磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱、1-肉豆蔻酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱、1-棕榈酰-2-肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、1-棕榈酰-2-硬脂酰磷脂酰胆碱、1-硬脂酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰胆碱、1-油酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰乙醇胺、二月桂酰磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、二磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘油、磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酸、二棕榈酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸、脑磷脂酰丝氨酸、鞘磷脂、鞘脂、脑鞘磷脂、二棕榈酰鞘磷脂、二硬脂酰鞘磷脂、半乳糖脑苷脂、神经节苷脂、脑苷脂、磷脂酰甘油、磷脂酸、溶血卵磷脂、溶血磷脂酰乙醇胺、脑磷脂、心磷脂、二磷酸十六酯、二硬脂酰-磷脂酰乙醇胺、和胆固醇、及其衍生物。类似地，磷脂可以是任意上述磷脂的衍生物或类似物，或还可以是两种或多种任意上述磷脂的混合物。这样的磷脂可从商业源、天然源、或通过本领域技术人员已知的合成或半合成方法来获得。
在优选的实施方案中，多肽-脂质复合体为多肽-磷脂复合体。在更优选的实施方案中，脂质为1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰胆碱(“POPC”)或(“1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱”)。
本领域技术人员将容易明白，包含本发明的多肽和脂质、优选磷脂的复合体可包含任意量的脂质和任意量的多肽，只要所述复合体有效地介导胆固醇流出并进而治疗与其有关的疾病或症状。如前所述，意外地发现在本发明的多肽以约1∶0.5至约1∶5(多肽∶POPC)的比例与例如POPC复合时，形成尺寸为约5至约20nm的不同的脂质-多肽粒子，从而导致显著增强的能力，即，使胆固醇从细胞流出的能力。然而，本发明的多肽-脂质复合体可包含磷脂与多肽的其他比例的复合体，例如约100∶1、约10∶1、约5∶1、约3∶1、约2∶1、约1∶1、约1∶2、约1∶3、约1∶5、约1∶10和约1∶100(多肽重量/脂质重量)。
本发明的多肽-脂质复合体可通过普通技术人员已知的任何方法来制备。在一些情况下，需要在施用之前将脂质和多肽混合。脂质可在溶液中，或者是使用标准技术例如均化法、超声法或挤出法形成的脂质体或乳液形式。超声通常使用翻转式超声波破碎仪(tip sonifier)，例如Branson翻转式超声波破碎仪，在冰浴中进行。通常，悬液经历数个超声周期。挤出可通过生物膜挤出机、例如Lipex生物膜挤出机TM.(Lipex Biomembrane Extruder，Inc.Vancouver，Canada)来进行。挤出过滤器中限定的孔径可产生特定尺寸的单层脂质体囊泡。脂质体还可通过挤压过不对称陶瓷过滤器、例如Ceraflow Microfilter.TM.(其可购自Norton Company，Worcester，MA)、或通过聚碳酸酯过滤器或本领域技术人员已知的其他类型的聚合物材料(即塑料)而形成。
如前所述，本发明的多肽-脂质复合体可制成各种形式，包括但不限于囊泡、脂质体或脂蛋白体。可以使用本领域技术人员熟知的多种方法来制备多肽-脂质复合体。可以使用用于制备脂质体或脂蛋白体的多种可得的技术。例如，本发明的多肽(例如NO：1-30的多肽，例如SEQ ID NOS：1-26或31-33的多肽)可与合适的脂质共超声(使用浴式或探针式超声仪)，从而形成多肽-脂质复合体。在某些实施方案中，多肽可与预先形成的脂质囊泡结合，导致自发形成多肽脂质复合体。在另一个实施方案，多肽-脂质复合体还可通过去污剂透析法来制备。在该方法中，多肽、脂质和去污剂例如胆酸钠的混合物可被透析以除去去污剂并复原制得多肽-脂质复合体(例如参见Jonas et al，Methods EnzymoL，128：553-82(1986))。
在其他实施方案中，多肽-脂质复合体可通过美国专利No.6,287,590和6,455,088中所述的共冻干法来制备，所述专利的教导以引用的方式全文并入。其他方法在例如美国专利No.6,004,925、6,037,323和6,046,166中公开，所述专利的教导以引用的方式全文并入本文。制备多肽-脂质复合体的其他方法对于本领域技术人员而言是明显的。
在一个优选的实施方案中，多肽-脂质复合体可以通过均化法来制备。
在另一方面，本发明提供包含本发明多肽的合成脂质粒子。这样的粒子能用于递送治疗或诊断剂。在一些实施方案中，本发明的多肽是合成的LDL粒子的成分。在其它实施方案中，本发明的多肽是合成的HDL粒子的成分。在一些实施方案中，粒子的直径小于约500nm或直径小于约200nm。在其它实施方案中，粒子直径小于约80nm。在一些实施方案中，粒子直径小于约25nm。制造这样的粒子的方法在本领域中是已知的(参见，例如美国专利申请公布Nos.20040229794和20070167351以及在其中描述的参考文献)。
在一些实施方案中，合成的脂质粒子包含抗生素或治疗感染的药物。这样的药剂能够包括抗生素或抗微生物剂(例如，抗菌剂，抗真菌剂和抗病毒剂)。
在其他实施方案中，包含本发明的肽的合成脂质粒子包含用于治疗或诊断癌症的药剂或者用于治疗神经系统疾患的药剂。例如，能够施用包含本文描述的肽的合成粒子，用于治疗或诊断肿瘤或者治疗或诊断血细胞癌。肿瘤包括癌和肉瘤。能够治疗的示例性的癌包括肾、乳房、肺、膀胱、结肠、卵巢、前列腺、胰腺、胃、大脑、头和颈、皮肤的癌，子宫癌，睾丸癌，神经胶质瘤，食管癌和肝癌。血细胞癌包括B-急性淋巴母细胞性淋巴瘤、非霍奇金氏(Hodgkin′s)淋巴瘤(例如，Burkitt淋巴瘤，小细胞淋巴瘤和大细胞淋巴瘤)和霍奇金氏淋巴瘤、白血病(包括AML，ALL和CML)、套细胞淋巴瘤、瓦氏(Waldenstrom′s)巨球蛋白血症和Ph染色体阳性癌。
在一些实施方案中，本发明的合成脂质粒子用来治疗中枢神经系统疾病。在一些实施方案中，中枢神经系统疾病选自中风、癫痫症、头部外伤、病毒感染(例如，HIV-相关的认知功能障碍、由小核糖核酸病毒、披膜病毒、疱疹病毒、副粘液病毒和areanavirus引起的脑膜炎)、细菌感染(例如，脑膜炎诸如隐球菌脑膜炎和暴发性细菌性脑膜炎，神经结核病，弓形虫病和神经梅毒)、真菌感染、立克次体感染或蠕虫感染、阿尔茨海默病、帕金森病、多发性硬化和脑的遗传性代谢病。
这样的合成粒子能够全身地或局部地施用于患者。
在一些实施方案中，并入粒子的本发明的肽与寻靶部分例如与细胞表面受体结合的肽连接，以将粒子引向目的细胞。
正如本领域技术人员所领会的，在本发明的另一个方面，本文描述的肽还可用于配制可能不包含脂质的粒子，该粒子也可以用于递送上面描述的诊断或治疗剂。可能不是基于脂质的粒子的实例描述在例如美国专利申请公布Nos.20070128290和20050238725以及在其中记述的参考文献中。例如，本发明的肽可用作吸附于或缔合在包含治疗或诊断活性剂的粒子表面上的水溶性成分。这样的粒子通常直径小于约1000nm或500nm，或者直径小于约200nm。在其它的实施方案中，粒子直径小于约80nm。在一些实施方案中，粒子直径小于约25nm。
IX.核酸和基因治疗
在另一个实施方案中，本发明提供编码本文中公开的多肽的分离的核酸、包含所述核酸的表达载体、和包含所述表达载体的宿主细胞。更具体地，本发明提供编码本发明的多肽的分离的核酸，所述多肽在每一分子的基础上具有类似于全长载脂蛋白的胆固醇流出活性，并且按照与全长载脂蛋白类似的方式具有对ABAC1的高选择性，所述多肽包括但不限于具有包含SEQ ID NO：1-33的氨基酸序列的多肽。
在某些实施方案中，编码本发明的多肽的核酸用于细胞的体外和体内转染。这些核酸可插入多种熟知的载体中的任一种中，以如下所述转染靶细胞和有机体。通过载体和靶细胞的相互作用，核酸离体(exvivo)或体内转染到细胞中。然后核酸在启动子的控制下表达本发明的多肽，从而减轻与血脂异常、高胆固醇血症和炎症有关的的疾病的影响。
这种基因治疗方法已在许多情形下用于校正获得性和遗传性基因缺陷、癌症和其他疾病。在人中表达人工基因的能力促进了预防和/或治愈许多重要的人类疾病，包括许多不易通过其他疗法治疗的疾病(基因治疗方法的综述参见Anderson，Science，256：808-813(1992)；Nabel et al.，TIBTECH，11：211-217(1993)；Mitani et al，TIBTECH，11：162-166(1993)；Mulligan，Science，926-932(1993)；；Dillon，TIBTECH，11：167-175(1993)；Miller，Nature，357：455-460(1992)；Van Brunt，Biotechnology，6(10)：1 149-1154(1998)；Vigne，Restorative Neurology and Neuroscience，8：35-36(1995)；Kremer et al，British Medical Bulletin，51(1)：31-44(1995)；Haddada et al，in Current Topics in Microbiology and Immunology(Doerfler & Bδhm eds.，1995)；和Yu et al，Gene Therapy，1：13-26(1994))。
对于核酸的递送，可以使用病毒载体。合适的载体包括，例如，单纯疱疹病毒载体，在Lilley et al，Curr.Gene Ther.，1(4)：339-58(2001)中所述；α病毒DNA和粒子复制子，例如在Polo et al，Dev.Biol.(Basel)，104：181-5(2000)中所述；Epstein-Barr病毒(EBV)-基的质粒载体，例如在Mazda，Curr.Gene Ther.，2(3)：379-92(2002)中所述；EBV复制子载体体系，例如在Otomo et al，J.Gene Med.，3(4)：345-52(2001)中所述；来自恒河猴的腺病毒相关病毒，例如在Gao et al.，PNAS USA.，99(18)：11854(2002)中所述；腺病毒和腺病毒相关病毒载体，例如在Nicklin et al，Curr.Gene Ther.，2(3)：273-93(2002)中所述。其他合适的腺病毒相关病毒(AAV)载体体系可使用本领域熟知的技术容易地构建(例如参见美国专利No.5,173,414和5,139,941；PCT公开No.WO 92/01070和WO 93/03769；Lebkowski et al，MoI Cell.Biol，8：3988-3996(1988)；Vincent et al.(1990)Vaccines 90(Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Carter，Current Opinion in Biotechnology 3：533-539(1992)；Muzyczka，Current Topics in Microbiol，and Immunol，158：97-129(1992)；Kotin，Human Gene Therapy，5：793-801(1994)；Shelling et al，Gene Therapy，1：165-169(1994)；和Zhou et al.，J.Exp.Med.，179：1867-1875(1994))。其他合适的载体包括E1B基因-弱化的复制腺病毒，例如在Kim et al，Cancer Gene Ther.，9(9)：725-36(2002)中描述；和非复制腺病毒载体，例如在Pascual et al，J.Immunol，160(9)：4465-72(1998)中描述。示例性载体可按Okayama et al，Mol Cell.Biol，3：280(1983)所述进行构建。
分子接合载体，例如Michael et al，J.Biol.Chem.，268：6866-6869(1993)和Wagner et al，Proc.Natl Acad.ScL USA，89：6099-6103(1992)中所述的腺病毒嵌合载体，也可用于根据本发明方法的基因递送。
在一个示意性实施方案中，逆转录病毒为基因递送系统提供便捷和有效的平台。使用本领域已知的技术，将选择的编码本发明多肽的核苷酸序列插入载体中并包装到逆转录病毒粒子中。然后可分离重组病毒并递送至对象。合适的载体包括慢病毒载体，例如在Scherr et al，Curr.Gene Ther.，2(1)：45-55(2002)中所述。另外的示意性逆转录系统也已描述(例如美国专利No.5,219,740；Miller et al，BioTechniques，7：980-990(1989)；Miller，Human Gene Therapy，1：5-14(1990)；Scarpa et al，Virology，180：849-852(1991)；Burns et al，Proc.Natl Acad.ScL USA，90：8033-8037(1993)；和Boris-Lawrie et al，Curr.Opin.Genet.Develop.，3：102-109(1993)。
其他已知的病毒基递送系统在(例如)下列文献中描述：Fisher-Hochet al，Proc.Natl Acad.Sci.USA，86：317-321(1989)；Flexner et al，Ann.NY.Acad.ScL，569：86-103(1989)；Flexner et al，Vaccine，8：17-21(1990)；美国专利No.4,603,112、4,769,330和5,017,487；WO 89/01973；美国专利No.4,777,127；GB 2,200,651；EP 0,345,242；WO 91/02805；Berkner，Biotechniques，6：616-627(1988)；RosenMd et al，Science，252：431-434(1991)；Kolls et al，Proc.Natl.Acad.ScL USA，91：215-219(1994)；Kass-Eisler et al，Proc.Natl Acad.ScL USA，90：11498-11502(1993)；Guzman et al，Circulation，88：2838-2848(1993)；Guzman et al，Cir.Res.，73：1202-1207(1993)；和Lotze et al，Cancer Gene Ther.，9(8)：692-9(2002)。
X.作为研究工具和在诊断方法中的应用
本发明的多肽和肽模拟物还可用作研究工具。例如，本发明的多肽或肽模拟物可用于研究动物和动物模型中的脂蛋白-受体相互作用，特别是多肽或其肽模拟物用可检测的部分进行标记例如放射性标记、荧光标记等时更是如此。另外，本发明的多肽还可用于鉴别阐明脂质代谢途径的合适动物模型。例如，多肽可用于鉴别其中脂质过氧化促进动脉粥样硬化进展的动物模型。而且，本发明的多肽可用于评价其他化合物(例如包括多肽变体和其他肽模拟物)的抗动脉粥样硬化潜能。
在一些情况下，本发明的多肽或肽模拟物用于使治疗剂靶定表达ABCA的细胞和组织。
在其他实施方案中，本发明的多肽或肽模拟物可用于与异常胆固醇流出或ABCA有关的疾病和病症的诊断方法。例如，所述肽可用于分析法，以诊断胆固醇逆向转运缺乏和鉴别预计是肽治疗的有反应者的个体。这种诊断分析法包括体外分析法。例如，在可评价胆固醇流出的分析法中，本发明的多肽例如SEQ ID NO：1-33的任一种与对象的血浆混合，并暴露于细胞以指示对象是否对治疗产生反应(例如，与不存在所述肽的条件下血浆介导的流出相比，在所述肽存在的条件下流出的大幅增加表明对象应是有反应的)。类似地，本发明的多肽例如SEQ ID NO：1-33的任一种与对象的血浆混合，在所述肽存在的条件下检测HDL亚类分布的变化和/或检测血浆的抗氧化性质的变化。
在一些实施方案中，多肽或肽模拟物用于体内成像法。多肽或肽模拟物与可检测的部分接合并施用到对象(例如哺乳动物，例如人)。可检测的部分的检定允许目标细胞、组织或器官包括例如动脉粥样硬化灶或淀粉样斑块进行成像。
术语“成像”是指如本文中所述或本领域技术人员所知，在体内、离体、或体外产生可检测的部分的图像的方法或模式。成像模式的例子包括但不限于磁共振法、核磁共振法、放射性闪烁照相法、正电子发射断层照相法、计算断层照相法、近红外荧光法、X射线法、超声法、紫外线法、或可见光法(例如参见，Dahnhert，Radiology Review Manual(4th ed.1999)；Brant et al，Fundamentals of Diagnostic Radiobiology(2nd ed.1999)；Weissleder et al，Primer of Diagnostic Imaging(2nd ed.1997)；Buddinger et al，Medical Magnetic Resonance A Primer，Society of Magnetic Resonance，Inc.(1988)；和Weissleder et al，Nature Biotech.，17：375-378(1999))。
如本文所使用的，术语“可检测的部分”是指通过本文中所述或本领域技术人员已知的方法或模式，在体内、离体或体外可被成像和/或检测的部分或标记。如本文所使用的，可检测的部分可直接或间接与本发明的多肽或肽模拟物连接。接头可起到将多肽或肽模拟物与一种可检测的部分连接的作用。可选择地，接头可将多肽与一种以上的可检测的部分连接。同样，可检测的部分可与一种以上的接头连接。使用多个可检测的部分与一种多肽连接，能够增加可检测的部分的可检测性(例如增加其射线不透性、回声性或弛豫率)，或可选择地，其能够使多肽在一种以上的成像模式中被检测到。
可检测的部分与本发明的多肽或肽模拟物的连接可通过共价方式或非共价方式达成，这通常涉及可检测的部分、接头和/或多肽上的一种或多种官能团的相互作用。可用于该目的的化学活性官能团的例子包括但不限于氨基、羟基、巯基、羧基、和羰基、以及碳水化合物基团、邻位二醇(vicinal dials)、硫醚、2-氨基醇、2-氨基硫醇、胍基、咪唑基和酚基。在一些实施方案中，使用不稳定的键，例如该键含有生物降解性或化学性的间隔臂，或者合并有酶切位点。具体的接头不是本发明的关键方面。可以使用本领域已知的任何接头，只要其将多肽或肽模拟物和可检测的部分结合在一起足够的时间即可，即所述时间足以找到多肽的所需目标和被检测到。
本发明的方法中使用的可检测的部分可以是能够在本文中所述或本领域技术人员已知的成像法中直接或间接检测的任何部分。例如，可以使用下列可检测的部分：发射或可引起发射可检测的射线(例如通过放射性衰变、荧光激发、自旋共振激发等)的部分、影响局部电磁场的部分(例如顺磁性、超顺磁性、亚铁磁或铁磁物质)、吸收或散射放射能的部分(例如发色团、粒子(包括含有气体或液体的囊泡)、重元素及其化合物等)、和产生可检测的物质的部分(例如小气泡产生剂)。
可通过成像模式检测的多种多样材料是本领域已知的，并且根据使用的成像模式来选择可检测的部分。因此，例如，对于超声成像，通常将选择回声性材料或能够产生回声性材料的材料；对于X射线成像，可检测的部分通常是或含有重原子(例如原子量为38或更高)；对于MR成像，可检测的部分是非零核自旋同位素(例如19F)或具有未成对的电子自旋并因此具有顺磁性、超顺磁性、亚铁磁性或铁磁性的材料；对于光成像，可检测的部分是光散射体(例如有色或无色粒子)、吸光体或发光体；对于测磁成像，可检测的部分具有可检测的磁性；对于电阻抗成像，可检测的部分将影响电阻抗；对于闪烁照相法、SPECT、PET等，可检测的部分是放射性核素。
由诊断成像文献熟知的合适的可检测部分的例子包括，例如，磁性氧化铁粒子、含气体的囊泡、螯合的顺磁性金属(例如Gd、Dy、Mn、Fe等)(例如参见美国专利No.5,228,446、4,647,447、4,863,715、4,770,183和5,387,080；PCT公布No.WO 97/25073、WO 96/09840、WO 85/02772、WO 92/17212、WO 97/29783、WO 91/15243、WO 93/05818、WO 96/23524、WO 95/26205和WO 96/17628；EP-A-554213；和GB 9624918.0)；金属放射性核素、顺磁性金属离子、荧光金属离子、重金属离子、和离子簇，如PCT公布No.WO 91/14460、WO 89/00557、WO 92/17215、WO 96/40287和WO 96/22914以及美国专利No.4,647,447、5,367,080和5,364,613中所述；非金属原子部分，例如123I、131I和18F，和重原子，例如I；有机发色团或荧光团部分，在Matsuoka，Topics in Applied Chemistry：Infrared absorbing dyes(1990)；Waring et al，Topics in Applied Chemistry：The Chemistry and Application of Dyes(1990)；“Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals”Haugland，Molecular Probes Inc，1996，DE-A-4445065，DE-A-4326466，JP-A-3/228046，Narayanan et al，J.Org.Chem.，60：2391-2395(1995)，Lipowska et al，Heterocyclic Comm.，1：427-430(1995)，Fabian et al，Chem.Rev.，92：1197(1992)；PCT公布No.W096/23525：Strekowska et al.，.J.Org.Chem.，57：4578-4580(1992)和PCT公布No.WO 96/17628中描述；染色渗透液，在Waring and Hallas，The Chemistry and Application of Dyes，Topics in Applied Chemistry(1990)；Haugland，Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals(6th ed.1996)中描述。
适于检测与配体连接的可检测部分的成像模式的例子包括但不限于磁共振法、核磁共振法、放射性闪烁照相法、正电子发射断层照相术、计算断层照相法、近红外荧光法、X射线法、超声法、紫外线法、或可见光法，其中可检测的部分的图像是特定细胞外蛋白酶的活性的指示(例如，参见Dahnhert，Radiology Review Manual(4th ed.1999)；Brant et al.，Fundamentals of Diagnostic Radiobiology，(2nd ed.1999)；Weissleder et al，Primer of Diagnostic Imaging，(2nd ed.1997)；Buddinger et al.，Medical Magnetic Resonance A Primer，Society of Magnetic Resonance，Inc.(1988)；and Weissleder et al，Nature Biotech.，17：375-378(1999))。
在某些情况下，可期望接头在施用后生物降解。通过选择合适的可生物降解性接头，可以改变多肽和/或可检测部分的生物分布和生物消除形式。如果在成像过程结束后仍然保留的多肽和/或可检测的部分是生物活性的或能够产生不期望的作用，可期望对接头设计可生物降解性，以确保多肽和/或可检测部分的合适的生物消除或代谢分解。因此，接头可具有可生物降解功能，该功能在分解时产生生物分布形式改变的分解产物，这种改变源自可检测的部分从多肽或大分子结构的碎片中的释放。例如，对于携带螯合的金属离子部分的接头而言，可使接头引入可生物降解功能，该功能在分解时释放含有可检测的部分的可排泄的螯合化合物。因此，如果需要，可生物降解功能可引入接头结构中，优选引入下列位点：(a)支化位点，(b)配体或可检测部分的连接位点或附近，或(c)使得生物降解产生生理学可容忍或快速排泄的碎片。
XI.药剂盒
在另一个方面，本发明提供用于治疗、即改善或预防疾病或病症、即与血脂异常、高胆固醇血症和炎症有关的状况的药剂盒。在优选的实施方案中，本发明提供治疗、即改善一种或多种动脉粥样硬化症状或预防性治疗存在动脉粥样硬化风险的对象(例如，人或动物)的药剂盒。药剂盒优选包含含有一种或多种本发明的多肽(或肽模拟物)的容器。所述多肽或肽模拟物可以提供成单位剂量制剂(例如，片剂、囊片、贴剂、栓剂等)和/或可以任选地与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合。
药剂盒还可以任选地包含一种或多种用于治疗与血脂异常、高胆固醇血症和炎症有关的疾病或状况(例如心脏病和/或动脉粥样硬化)的其他药剂。这样的药剂包括但不限于上述与“联合治疗”章节有关的那些。例如，在某些实施方案中，药剂盒可以包含β受体阻滞剂、血管扩张剂、阿司匹林、他汀类、ACE抑制剂或ACE受体抑制剂(ARB)等。
另外，药剂盒可以任选地包括标签和/或说明材料，其提供了实践本发明的“治疗”或“预防”方法或应用的指导(即，规程)。优选的说明材料描述了使用本发明的一种或多种多肽或肽模拟物来例如减轻一种或多种动脉粥样硬化症状和/或预防存在动脉粥样硬化风险的个体中的一种或多种这些症状的发作或增加。说明材料还可以任选地教导优选的剂量/治疗方案、禁忌症等。
尽管说明材料通常包含书面的或印刷的材料，但是它们并不限于此。本发明预见到能够存储这种说明书并将它们传达到终端用户的任何介质。这类介质包括但不限于：电子存储介质(例如，磁盘、磁带、盒式磁带、芯片等)、光学介质(例如，CD ROM)等。这类介质可包括提供这种指导材料的因特网站点地址。
本发明将通过具体实施例来更详细地描述。下列实施例是出于举例说明性目的而提供的，其并不意在以任何方式限制本发明。本领域技术人员将容易地认识到多个非关键的参数，所述参数可以改变或修改以产生基本上相同的结果。
XII.实施例
实施例1
22-聚体肽的胆固醇流出活性
所述肽以组列出，所述组反映了为增加刺激ABCA1胆固醇流出效率而制备的组合物中的变化。通过与合成批号相应的编号来鉴别序列。
N257-11对应于被成功改造的、具有生物活性的22-聚体肽。肽N257-11的氨基酸序列是ELREKLEAWREAFEEFFARFKS(图1，其显示所述肽的螺旋轮图)。N257-11以一般高的能力刺激ABCA1胆固醇流出，但是活性需要高浓度，因此所述肽显示出弱的流出效率。
肽系列号：N257-11。
具有ABCA1胆固醇流出活性的22-聚体肽
ELREKLEAWREAFEEFFARFKS
8小时流出数据(J774巨噬细胞±cAMP以上调ABCA1)
％胆固醇流出
(8小时)
无cAMP  0.91±0.1  肽刺激ABCA1-胆固醇流出
+c AMP  6.99±1.4  Km大约10-20μg/ml
实施例2
20-聚体、21-聚体和22-聚体肽的胆固醇流出活性
包含N356系列的肽被设计带有氨基酸取代以增加亲本N257-11肽的胆固醇流出效率。一个取代(R10→F，N356-1肽)意图是将非极性表面扩大到140度；这破坏了亲本肽中被认定的盐桥之一。所述变化产生了比N257-11更有力地刺激胆固醇流出的肽，但是浓度依赖性曲线显示出天然蛋白质非特征性的阈值类型响应。
N965系列中的肽基于N257和N356系列的复合设计，并被改造以保持盐桥构造，盐桥构造是宽的非极性表面，并保持所述极性表面上酸性残基的关键拓扑形态。后续改造(N1154系列)产生了意外的发现，即可用于人工工程是生物学活性肽的氨基酸选择相对少，包括使用全部的亮氨酸残基替换全部的苯丙氨酸残基。
表A：肽系列号：N356
22-、21-和20-聚体肽基于N257-11进行设计
取代目的是增加胆固醇流出效率。
ELREKLEAWREAFEEFFARFKS亲本N257-11序列(上面列出)
序列                      系列号    氨基酸数目
ELREKLEAWFEAFEEFFARFKS    N356-1    22-聚体
ELREKLEAWRELFEEFFARFKS    N356-2    22-聚体
ELREKLEAWFELFEEFFARFKS    N356-3    22-聚体
ELREKLEAWFELFAEFFARFKS    N356-4    22-聚体
ELREKLEAWFELFAEFFARFK     N356-5    21-聚体
ELREKLEAWFELFAEFFARF      N356-6    20-聚体
ELRAKLEAWFEAFAEFFARF      N356-7    20-聚体
下划线的残基表示对列出的第一个序列(也就是N257-11)所做的改变。
结果
N356肽系列：胆固醇流出数据(J774巨噬细胞±cAMP，上调ABCA1)
％胆固醇流出/8小时
Figure BPA00001311663500801
浓度依赖性(胆固醇流出效率)
％胆固醇流出/4小时
Figure BPA00001311663500802
表B.肽系列号：N965，
设计基于N257-11 & N365的22-、21-和20-聚体肽
序列                      系列号    氨基酸数目
EVREKLEAWFEAFREFAERFKS    N965-1    22-聚体
EVREKLEAWFELFREFAERFKS    N965-2    22-聚体
EVREKLEAWFELFREFAERFLS    N965-3    22-聚体
EVREKLEAWFELFREFLERFKS    N965-4    22-聚体
EVREKLEAWFELFREFLERFLS    N965-5    22-聚体
EVREKLEAWFELFREFLERFL     N965-6    21-聚体
EVREKLEAWFELFREFLERF      N965-7    20-聚体
ELREKLEAWFELFREFLERF      N965-8    20-聚体
ELREKLEAWRELFEEFFARFLS    N965-9    22-聚体
下划线的残基表示对列出的第一个序列(也就是N965-1)所做的改变。
结果
N965肽系列：胆固醇流出数据(J774巨噬细胞±cAMP，上调ABCA1)
％胆固醇流出/8小时
Figure BPA00001311663500811
浓度依赖性(胆固醇流出效率)
％胆固醇流出/4小时
Figure BPA00001311663500812
表C.肽系列号：N1154
基于N965-8的20-聚体肽
ELREKLEAWFELFREFLERF亲本N965-8(ATI-185)
序列                    系列号     氨基酸数目
ELRERLEAWFELFREFLERF    N1154-1    20-聚体
ELRDKLEAWFDLFREFLERF    N1154-2    20-聚体
DLRDKLDAWFDLFRDFLDRF    N1154-3    20-聚体
ELRDRLEAWFDLFREFLERF    N1154-4    20-聚体
DLRDRLDAWFDLFRDFLDRF    N1154-5    20-聚体
ELREKLEAWLELLRELLERL    N1154-6    20-聚体
ELRERLEAWLELLRELLERL    N1154-7    20-聚体
ELRDKLEAWLDLLRELLERL    N1154-8    20-聚体
DLRDKLDAWLDLLRDLLDRL    N1154-9    20-聚体
ELRDRLEAWLDLLRELLERL    N1154-10   20-聚体
DLRDRLDAWLDLLRDLLDRL    N1154-11   20-聚体
下划线的残基表示对ATI-185所做的改变。
结果
N1154肽1-5：胆固醇流出数据(J774巨噬细胞±cAMP，上调ABCA1)
％胆固醇流出/8小时
Figure BPA00001311663500821
浓度依赖性(胆固醇流出效率)
％胆固醇流出/4小时
Figure BPA00001311663500822
N1154肽6-11：胆固醇流出数据(J774巨噬细胞±cAMP，上调ABCA1)
％胆固醇流出/8小时
Figure BPA00001311663500831
浓度依赖性(胆固醇流出效率)
％胆固醇流出/4小时
Figure BPA00001311663500832
实施例3
有效的ABCA1胆固醇流出肽SEQ ID：2(20-聚体)的一级氨基酸序列和凸出的α-螺旋结构(图2)。图A显示了螺旋轮图，示出了肽的两亲性性质。图B显示了展示所述肽沿极性表面的长轴下切并展平的螺旋网图。带阴影的圆圈指示酸性氨基酸，部分带阴影的圆圈指示阳离子残基。两个图中的编号是指一级氨基酸序列。
实施例4
这个实施例显示SEQ ID NO：2对比全长apoA-I的胆固醇流出活性。带有[3H]胆固醇标记的J774巨噬细胞用于评价本发明肽的胆固醇流出活性。在24孔板上铺板的J774细胞用在1％FBS中的1μCi/ml[3H]胆固醇标记(48h)。一些孔添加cAMP类似物(0.3mM)(12-18h)，以上调ABCA1表达。CAMP处理之后，清洗细胞，然后在不含血清的培养基中暴露于肽。结果示于图3。图A提供数据显示胆固醇流出对浓度(不含脂质的SEQ ID NO：2肽(正方形)和不含脂质的载脂蛋白(apo)A-I(圆圈))的依赖性；使用cAMP-处理过的细胞。显示出以8h处培养基中出现的细胞[3H]胆固醇的百分比，减去了只向不含血清的培养基的背景流出。数值是平均值±SD；apoA-I，n＝8；SEQ ID NO：2肽，n＝3。利用米-曼氏方程(Michaelis-Menton equation)和4h流出数据，从浓度依赖性曲线计算反映刺激胆固醇流出的Km值(Prism 4软件)。在质量基础上，SEQ ID NO：2肽刺激胆固醇流出比起apoA-I更有效～5-倍(分别是Km＝0.7±0.3对比apoA-I Km＝3.4±0.6μg/m)。在摩尔基础上，所述肽的流出效率几乎等于apoA-I(Km＝0.26±0.11对比apoA-I Km＝0.12±0.02)。
图3的图B显示，不含脂质的SEQ ID NO：2肽以ABCA1依赖性方式刺激胆固醇流出，与apoA-I类似。标记有[3H]胆固醇并用(阴影柱)和不用(空心柱)cAMP处理的J774细胞暴露于SEQ ID NO：2肽或apoA-I；两者的浓度都是30μg/ml。显示向培养基的胆固醇流出百分比(8h)。数值代表两个实验。
实施例5
本实施例证明SEQ ID NO：2的将残基KS加到C端的22-聚体类似物刺激ABCA1胆固醇流出。与20-聚体SEQ ID NO：2肽类似。
SEQ ID NO：2ELREKLEAWFELFREFLERF
SEQ ID NO：31ELREKLEAWFELFREFLERFKS
带有[3H]胆固醇标记并用cAMP(0.3mM)处理的J774细胞被清洗，并在不含血清的培养基中暴露于不含脂质的肽，如实施例4所述。结果示于图4。显示了在培养基中响应SEQ ID NO：2肽(空心柱)或SEQ ID NO：31肽(阴影柱)出现的细胞[3H]胆固醇的百分比(8h)。数值来自于单个实验。每个浓度采用双份重复的孔。双份重复的孔的差异不超过12％。
实施例6
本实施例证明，亮氨酸(L)或苯丙氨酸(F)能够取代20-聚体肽(SEQID NO：2)中的色氨酸(W)，且不会不利影响ABCA1胆固醇流出活性。
SEQ ID NO：32ELREKLEALFELFREFLERF
SEQ ID NO：33ELREKLEAFFELFREFLERF
J774细胞用[3H]胆固醇标记并暴露于实施例4所述的肽。图A(图5)显示培养基中响应SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：.33肽出现的细胞[3H]胆固醇的百分比。肽以不含脂质形式、30μg/ml无血清培养基浓度使用。数值来自于单个实验，利用每个肽三个重复孔/条件。显示平均值±SD。肽从进行了ABCA1响应诱导(即+cAMP，阴影柱)的细胞刺激了比较高水平的胆固醇流出，相比之下，从没有cAMP(空心柱)诱导的细胞刺激的水平低。图B显示胆固醇流出对SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33肽的浓度依赖性；使用cAMP处理过的细胞。数值来自于每个条件双份重复孔的单次试验。
实施例7
本实施例显示，缬氨酸能够取代胆固醇流出肽的非极性表面上的亮氨酸，而不会不利地影响活性。J774细胞如实施例4所述用[3H]胆固醇标记。分析结果显示在图6中。图A显示响应SEQ ID NO：2(20-聚体)和SEQ ID NO：31(22-聚体)肽而出现在培养基中的细胞[3H]胆固醇的百分比，所述肽每个都在一级序列中的2位处用缬氨酸(V)代替了亮氨酸(L)。肽以不含脂质形式使用，浓度为30μg/ml不含血清的培养基。数值来自于单个实验，利用每个肽三个重复孔/条件。显示平均值±SD。肽从进行了ABCA1响应诱导(即+cAMP，阴影柱)的细胞刺激了比较高水平的胆固醇流出，相比之下，从没有cAMP(空心柱)诱导的细胞刺激的水平低。图B提供数据显示了胆固醇流出对肽浓度的依赖性(通过图例指示)；使用cAMP处理的细胞。数值来自于每个条件双份重复孔的单次试验。
实施例8
本实施例显示，刺激ABCA1胆固醇流出受到所述肽中疏水性亮氨酸数量的影响。
J774细胞如实施例4所述用[3H]胆固醇标记。实验通过将SEQ IDNO：31肽中的重要位置12和17位处用丙氨酸(A)取代亮氨酸(L)来进行。结果显示在图7中。图A提供数据显示了响应肽出现在培养基中的细胞[3H]胆固醇的百分比(8h)；对照肽对应于包含V取代2位的L的SEQ ID NO：31(正方形)；该肽包含总共3个亮氨酸(L)残基。带有3和4个L残基的肽具有同样的胆固醇流出活性(图6，即有和没有L2的SEQ ID NO：2＞V)。相反，带有少于三个L残基的肽刺激胆固醇流出差。图B提供数据显示了胆固醇流出对肽浓度的依赖性。如所指出的，疏水性L残基的数量赋予了本发明的肽胆固醇流出效率；使用cAMP处理的细胞。
实施例9
本实施例证明，本发明的肽能够用亮氨酸残基或亮氨酸和异亮氨酸残基的组合对非极性表面进行改造，而不会不利地影响ABCA1胆固醇流出活性。
J774细胞如实施例4所述用[3H]胆固醇标记。通过用异亮氨酸(I)或亮氨酸(L)取代SEQ ID NO：2肽的非极性表面上的疏水性苯丙氨酸(F)残基来进行实验。F＞L取代产生了呈现出全部为L残基(除了W9)的非极性表面的肽。结果显示在图8中。图A显示响应SEQ ID NO：2肽而出现在培养基中的细胞胆固醇的百分比(8h)，与带有F＞L取代的SEQ ID NO：2对比。图B显示了类似于图A的实验，除了使用的是带有F＞I的SEQ ID NO：2肽之外。图A和B中的肽以不含脂质的形式使用，浓度为30μg/ml不含血清的培养基。图C显示胆固醇流出对肽浓度的依赖性，指示刺激ABCA1胆固醇流出不依赖于芳香族(苯丙氨酸)残基；使用cAMP处理的细胞。
实施例10
本实施例证明，本发明的肽能够用数量逐渐增加的苯丙氨酸对非极性表面进行改造，而不会不利地影响刺激ABCA1胆固醇流出的能力。
J774细胞如实施例4所述用[3H]胆固醇标记。通过用疏水性苯丙氨酸(F)残基取代SEQ ID NO：2肽的非极性表面上的亮氨酸(L)来进行实验。2、6、12和17位处L＞F取代产生了呈现全部为F残基(除了W9)的非极性表面。结果显示在图9中。图A显示响应SEQ ID NO：2肽而出现在培养基中的细胞[3H]胆固醇的百分比(8h)，与带有L＞F取代的SEQ ID NO：2对比。肽以不含脂质形式使用，浓度为30μg/ml不含血清的培养基。图B显示胆固醇流出对有和没有L＞F取代的SEQ ID NO：2肽浓度的依赖性；使用cAMP处理过的细胞。
实施例11
本实施例证明，发明肽的亮氨酸和苯丙氨酸残基能够用异亮氨酸代替，而不会不利地影响刺激ABCA1胆固醇流出的能力。
J774细胞如实施例4所述用[3H]胆固醇标记。通过用疏水性异亮氨酸(I)取代SEQ ID NO：2肽的非极性表面上的全部亮氨酸(L)残基(2、6、1217位)或全部的(L)和苯丙氨酸(F)残基(10、13、16、20位)来进行实验。后一项L&F＞I取代产生了呈现出全部为I残基(除了W9)的非极性表面的肽。结果显示在图10中。图A显示响应SEQ ID NO：2肽而出现在培养基中的细胞胆固醇的百分比(8h)，与带有L＞I和L&F＞I取代的SEQ ID NO：2对比。肽以不含脂质形式使用，浓度为30μg/ml不含血清的培养基。图B显示胆固醇流出对有和没有异亮氨酸取代的SEQ ID NO：2肽浓度的依赖性，如图例指示；使用cAMP处理过的细胞。
实施例12
本实施例证明，带正电荷的精氨酸能够取代肽中带正电荷的赖氨酸，而不会不利地影响刺激ABCA1胆固醇流出的能力。
J774细胞如实施例4所述用[3H]胆固醇标记。通过用精氨酸(R)取代SEQ ID NO：2肽的极性表面上5位的赖氨酸(K)来进行实验。结果显示在图11中。图A显示响应SEQ ID NO：2肽而出现在培养基中的细胞[3H]胆固醇的百分比(8h)，与带有K5＞R取代的SEQ ID NO：2对比。肽以不含脂质形式使用，浓度为30μg/ml不含血清的培养基。图B显示胆固醇流出对有和没有K5＞R取代的SEQ ID NO：2肽浓度的依赖性；使用cAMP处理过的细胞。
实施例13
本实施例证明，带负电荷的天冬氨酸能够取代目前的肽中带负电荷的谷氨酸，而不会不利地影响刺激ABCA1胆固醇流出的能力。
J774细胞如实施例4所述用[3H]胆固醇标记。通过用天冬氨酸(D)取代SEQ ID NO：2肽的极性表面上4、11位或4、11加上1、7、15、18位处的谷氨酸(E)来进行实验。后者产生了全部的酸性残基是D的肽；对比之下，SEQ ID NO：2中全部的酸性残基是E。结果显示在图12中。图A显示响应SEQ ID NO：2肽而出现在培养基中的细胞[3H]胆固醇的百分比(8h)，与带有E＞D取代的SEQ ID NO：2对比。肽以不含脂质形式使用，浓度为30μg/ml不含血清的培养基。图B显示胆固醇流出对具有E＞D取代的SEQ ID NO：2肽浓度的依赖性，如图例指示；使用cAMP处理过的细胞。
实施例14
本实施例证明，天冬氨酸和谷氨酸残基在肽中是可互换的，其任一种可与其它的氨基酸取代组合使用。
J774细胞如实施例4所述用[3H]胆固醇标记。通过用天冬氨酸(D)取代SEQ ID NO：2肽或具有各种其它取代的SEQ ID NO：2肽的极性表面上4、11位或4、11加上1、7、15、18位处的谷氨酸(E)来进行实验，所述各种其它取代诸如K5＞R和全部为亮氨酸残基(即F10、13、16、20)L)。结果显示在图13中。肽以不含脂质形式使用，浓度为30μg/ml不含血清的培养基。显示了来自cAMP处理的细胞的数据。结果表示为利用SEQ ID NO：2肽获得的对照活性的百分比(8h)。
实施例15
本实施例证明，色氨酸(W)或苯丙氨酸(F)能够取代12位亮氨酸(L)，而不会不利地影响肽刺激ABCA1胆固醇流出的能力。
J774细胞如实施例4所述用[3H]胆固醇标记。通过交换SEQ ID NO：2肽中W9和L12(
Figure BPA00001311663500891
对换)的位置，或通过用苯丙氨酸(F)取代SEQ ID NO：2肽中12位的亮氨酸(L)(L12＞F)，或通过获取相应的L12＞F肽并将残基F12与W9交换(即
Figure BPA00001311663500892
对换)，来进行试验。SEQ ID NO：肽中指出的氨基酸取代也被改造成包含L2＞V取代的SEQ ID NO：2肽，如实施例7所述。结果显示在图14中。图A显示响应SEQ ID NO：2肽而出现在培养基中的细胞胆固醇的百分比(8h)，与带有指出的氨基酸取代的SEQ ID NO：2肽对比。图B显示了类似于图A所执行的实验，除了构造的所有基于SEQ ID NO：2的肽都带有E4、11＞D和K5＞R取代之外。肽(图A和B)以不含脂质的形式使用，浓度为30μg/ml不含血清的培养基。显示了来自cAMP处理的细胞的数据。结果表示为利用SEQ ID NO：2肽获得的对照活性的百分比。
实施例16
本实施例证明，本发明的肽能够以全部D-氨基酸或反向序列使用，而不会不利地影响刺激ABCA1胆固醇流出的能力。
J774细胞如实施例4所述用[3H]胆固醇标记。利用由全部D氨基酸或通过反转一级氨基酸序列构成的SEQ ID NO：2进行试验。结果显示在图15中。图15显示响应对照SEQ ID NO：2肽(L-氨基酸)在培养基中出现的细胞[3H]胆固醇的百分比，与D氨基酸和反向序列肽模拟物(L-氨基酸)组成的SEQ ID NO：2对比。肽以不含脂质形式使用，浓度为30μg/ml不含血清的培养基。
实施例17
本实施例证明，极性表面上的丙氨酸取代有利地增加了本发明的肽刺激ABCA1胆固醇流出的能力。
J774细胞如实施例4所述用[3H]胆固醇标记。通过交换E4和E11与A8的位置(
Figure BPA00001311663500901
对换)，或通过用丙氨酸(A)取代4和11位谷氨酸(E)，来进行试验。结果显示在图16中。图A显示响应SEQ ID NO：2肽而出现在培养基中的细胞[3H]胆固醇的百分比(8h)，与带有E＜＞A交换的SEQ ID NO：2对比。这两种交换(E4＜＞A8和E11＜＞A8)减少了SEQ ID NO：2肽的流出活性，表明8位的A对于活性具有重要性。图B显示了类似于图A的实验的结果，除了使用带有E＞A取代的SEQ ID NO：2肽之外。肽(图A和B)以不含脂质的形式使用，浓度为30μg/ml不含血清的培养基。图C显示胆固醇流出对SEQ ID NO：2肽和在极性表面上带有渐增数量的E＞A取代的SEQ ID NO：2肽浓度的依赖性。丙氨酸取代(图B和C)大幅增加了SEQ ID NO：2肽有效刺激ABCA1胆固醇流出的能力。这与丙氨酸取代被落实到肽的非极性表面中时的差结果(流出活性降低)(图7)形成对比。
实施例18
本实施例证明了丙氨酸能够取代精氨酸14(R14)和谷氨酸18(E18)，而不会不利地影响刺激ABCA1胆固醇流出的能力。
J774细胞如实施例4所述用[3H]胆固醇标记。通过用丙氨酸(A)分别地取代14和18位代表推定的盐桥对的精氨酸和谷氨酸来进行实验。取代被落实到带有保守的L17＞F取代的SEQ ID NO：2肽中。结果显示在图17中。图A显示响应肽在培养基中出现的细胞[3H]胆固醇的百分比(8h)。肽以不含脂质形式使用，浓度为30μg/ml不含血清的培养基。图B显示胆固醇流出对具有丙氨酸取代(如所指出)的SEQ ID NO：2肽浓度的依赖性。所述肽以高效率刺激胆固醇(即最大流出3μg/ml)，类似于亲本SEQ ID NO：2肽(图3和4)。
实施例19
本实施例证明，本发明的肽，例如，SEQ ID NO：2和包含本文描述的SEQ ID NO：2的取代的肽，能够与磷脂一起配制，以产生通过ABCA1依赖性和不依赖性机制支持高水平的细胞胆固醇流出的复合物。
ELRDRLEAWLDLLRELLERL(SEQ ID NO：12)
ELREKLEAWFELFREFLERF(SEQ ID NO：2)
对应于SEQ ID NO：12(实施例13中描述)的20-聚体肽利用修饰的胆盐透析方法，与1-棕榈酰-2-油酰-磷脂酰胆碱(POPC)一起配制。评价胆固醇流出的实验结果显示在图18中。图A显示通过非变性坡度(4-20％)凝胶电泳，表现肽∶POPC复合物的粒度的凝胶照片。1道对应于肽∶POPC复合物，2道对应不含脂质对应的肽。图B显示肽∶POPC复合物的胆固醇[3H]流出活性，利用标记有胆固醇并用(阴影柱)和不用cAMP(空心柱)处理的J774巨噬细胞判定。出于比较的目的，显示了响应不含脂质的SEQ ID NO：12肽的胆固醇流出。不含脂质的肽和肽∶POPC复合物的浓度是50μg/ml(根据肽质量)。数值是平均值±SD，n＝3。
实施例20
本实施例证明，本发明的肽，以本实施例中的SEQ ID NO：12为例，在以高脂西式饮食饲养的载脂蛋白E-缺乏的小鼠中，减少了形成的动脉粥样硬化。
雄性七周龄的载脂蛋白E缺乏(apoE-/-)小鼠用高脂西式饮食总共喂养26周。高脂饮食最后6周期间，小鼠每隔一天接受腹内的(ip)注射盐水(对照)或用POPC配制的SEQ ID NO：12肽。根据肽质量，肽∶POPC的剂量是30mg/kg BW。结果显示在图19中。图A提供数据显示对照和肽处理小鼠中动脉粥样硬化的程度，表示为覆盖有病变的主动脉的百分比。图B显示主动脉窦斑块的脂质含量，通过油红O染色确定。数值是平均值±SEM，两个图中每组n＝7只小鼠。
实施例21
本实施例证明利用氨基酸取代赋予对髓过氧物酶(MPO)来源的氧化产物的抵抗力。
对应于SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：12的肽在37℃下暴露于丙烯醛(丙烯醛∶肽摩尔比＝25∶1)18h。对照肽在没有丙烯醛的情况下同样温育。然后将对照和丙烯醛处理的肽进行渗析并用于胆固醇流出实验。本实验的结果显示在图20中。图A显示用和不用丙烯醛温育的SEQ ID NO：2肽的胆固醇流出活性。丙烯醛大幅降低SEQ ID NO：2肽的活性。图B显示SEQ ID NO：肽的胆固醇流出活性，表明丙烯醛的适中作用。。两个图中使用了用cAMP处理的J774巨噬细胞，其上调ABCA1。胆固醇流出分析法利用2μg/ml不含血清的培养基进行。
实施例22
本发明的肽通过牵涉不同HDL亚群的高度特异性的机制，诱导人血浆中前β-1HDL形成。
向人血浆添加对应于SEQ ID NO：2的肽，终浓度为30μg/ml(即肽∶apoA-I摩尔比～1∶5)。有和没有肽的血浆随后在37℃下温育5分钟。温育之后，将血浆样品进行一维琼脂糖凝胶电泳，继之以二维天然梯度凝胶电泳。所产生的凝胶上的蛋白质被转移到硝化纤维上，并利用apoA-I抗体通过Western印迹分析进行分析。结果显示在图21中。显示了只用介质(空心柱)、用全部D-氨基酸组成的SEQ ID NO：2肽(中等阴影)、和用全部L-氨基酸组成的SEQ ID NO：2肽(深色阴影)处理的血浆中HDL亚群的分布。肽处理优先产生前β-1HDL的增加。A-HDL亚群的减少表明肽与不同的HDL种类特异性相互作用，产生前β-1apoA-I粒子。
将理解上述说明是示意性的而不是限制性的。在阅读上述说明书时，许多实施方案对于本领域技术人员而言是明显的。因此，本发明的范围不应该参照上述说明书而确定，相反应该参照所附权利要求书以及这些权利要求所赋予的等效形式的全部范围而确定。为了所有目的，所有文章和参考文献，包括专利申请和专利公开，都以引用的方式并入本文。

Claims (77)

1.分离的多肽，其包含下面的氨基酸序列：
X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20(SEQ ID NO：1)
其中：
X1、X7和X15是独立选自E和D的氨基酸；
X4、X11和X18是独立选自E、D、A和G的氨基酸；
X2、X6、X9、X10、X12、X13、X16、X17和X20是独立选自F、L、W、I、V和A的氨基酸；
X3、X5和X19是独立选R、K和C的氨基酸；
X14是氨基酸R、A、E或C；并且
X8是A、G或V。
2.权利要求1的分离的多肽，其中X10、X12、X16和X17独立选自F、L、I和W。
3.权利要求2的分离的多肽，其中X10、X12、X16和X17独立选自F和L。
4.前述权利要求任一项的分离的多肽，其中X9是L、F或W。
5.前述权利要求任一项的分离的多肽，其中X2、X6、X12和X17位的至少三个是L。
6.前述权利要求任一项的分离的多肽，其中X4、X8和X11位的一个或多个是A。
7.权利要求6的分离的多肽，其中X8是A。
8.权利要求1的分离的多肽，其中X4、X11和X18独立选自D和E。
9.权利要求1的分离的多肽，其中C存在于选自X3、X5、X14和X19的一个位置。
10.权利要求1的分离的多肽，其中所述分离的多肽包含：
X1X2X3X4X5X6X7AX9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20(SEQ ID NO：27)
其中：
X1、X7、X15和X18独立选自D和E；
X2是L、I或V；
X4和X11独立选自D、E和A；
X3、X5和X19独立选自K和R；
X9是W、F或L；
X14是R、E或A；并且
X6、X10、X12、X13、X16、X17和X20独立选自F、L、I和W。
11.权利要求10的分离的多肽，其中X10、X12、X13、X16、X17和X20独立选自L和F。
12.权利要求10的分离的多肽，其中所述分离的多肽包含：
X1LRAX5LX7AX9X10AX12X13RX15X16X17X18RX20(SEQ ID NO：28)，
其中
X1、X7、X15和X18独立选自D和E；
X5是K或R；
X9是F、L或W；并且
X10、X12、X13、X16、X17和X20独立选自F和L。
13.权利要求10的分离的多肽，其中所述分离的多肽包含：
X1LRX4X5LX7AX9X10X11X12X13RX15X16X17X18RX20(SEQ ID NO：29)，
其中
X1、X4、X7、X11、X15和X18独立选自D和E；
X5是K或R；
X9是F、L或W；并且
X10、X12、X13、X16、X17和X20独立选自F和L。
14.权利要求13的分离的多肽，其中所述多肽包含：
ELR(D/E)(K/R)LEA(W/F/L)(F/L)(D/E)L(F/L)RE(F/L)LER(F/L)(SEQ ID NO：30)。
15.前述权利要求任一项的分离的多肽，其还包含X21，其中X21选自C、K、Y或L。
16.前述权利要求任一项的分离的多肽，其还包含X22，其中X22是S或C。
17.权利要求15的分离的多肽，其中X21是K。
18.权利要求17的分离的多肽，其中X22是S。
19.权利要求16的分离的多肽，其中X21或X22是C。
20.前述权利要求任一项的分离的多肽，其中所述多肽还包含保护基团。
21.权利要求20的分离的多肽，其中保护基团是选自下列的保护基团：乙酰基(Ac)、酰胺、3至20个碳的烷基、Fmoc、叔丁氧羰基(Tboc)、9-芴乙酰基、1-芴羧基、9-芴羧基、9-芴酮-1-羧基、苄氧羰基、呫吨基(Xan)、三苯甲基(Trt)、4-甲基三苯甲基(Mtt)、4-甲氧基三苯甲基(Mmt)、4-甲氧基-2，3，6-三甲基-苯磺酰基(Mtr)、均三甲苯-2-磺酰基(Mts)、4，4-二甲氧二苯甲基(Mbh)、甲苯磺酰基(Tos)、2，2，5，7，8-五甲基色满-6-磺酰基(Pmc)、4-甲基苄基(MeBzl)、4-甲氧基苄基(MeOBzl)、苄氧基(BzlO)、苄基(Bzl)、苯甲酰基(Bz)、3-硝基-2-吡啶次磺酰基(Npys)、1-(4，4-二甲基-2，6-二氧亚环己基)乙基(Dde)、2，6-二氯苄基(2，6-DiCl-Bzl)、2-氯苄氧羰基(2-Cl-Z)、2-溴苄氧羰基(2-Br-Z)、苄氧基甲基(Bom)、环己氧基(cHxO)、叔丁氧基甲基(Bum)、叔丁氧基(tBuO)、叔丁基(tBu)和三氟乙酰基(TFA)。
22.权利要求20或21的分离的多肽，其中保护基团与氨基或羧基末端连接。
23.权利要求20、21或22的分离的多肽，其中所述多肽包含与氨基末端连接的第一保护基团和与羧基末端连接的第二保护基团。
24.权利要求23的分离的多肽，其中所述第一保护基团是选自乙酰基、丙酰基和3至20个碳烷基的保护基团。
25.权利要求24的分离的多肽，其中所述第一保护基团是乙酰基。
26.权利要求23、24或25的分离的多肽，其中所述第二保护基团是酰胺。
27.前述权利要求任一项的分离的多肽，其中全部对映体氨基酸是“D”氨基酸。
28.权利要求1至26任一项的分离的多肽，其中对映体氨基酸是“L”氨基酸和“D”氨基酸的混合物。
29.前述权利要求任一项的分离的多肽，其中所述肽与具有权利要求1所显示的序列的第二肽连接。
30.权利要求29的分离的多肽，其中第二肽具有与第一肽相同的序列。
31.前述权利要求任一项的分离的多肽，其中所述多肽具有胆固醇流出活性。
32.前述权利要求任一项的分离的多肽，其中所述多肽诱导人血浆中的前-β形成。
33.前述权利要求任一项的分离的多肽，其中所述多肽具有ABCA1稳定活性。
34.前述权利要求任一项的分离的多肽，其中所述多肽保护磷脂免遭氧化剂的氧化。
35.前述权利要求任一项的分离的多肽，其中所述多肽与药学上可接受的载体混合。
36.与权利要求1至34任一项的多肽具有基本上相似的三维构造的肽模拟物。
37.权利要求36的肽模拟物，其中所述肽模拟物是反-转型类似物。
38.权利要求36的肽模拟物，其中所述肽模拟物是反-对映型类似物。
39.组合物，其包含权利要求1至34任一项的多肽或权利要求36至38任一项的肽模拟物以及药学上可接受的载体。
40.权利要求39的组合物，其还包含治疗心血管疾病的治疗剂。
41.权利要求40的组合物，其中所述治疗剂选自他汀类、胆酸结合剂、血小板聚集抑制剂、烟酰胺、PPAR激活剂、维生素E和其组合。
42.组合物，其包含与脂质复合的权利要求1至34任一项的多肽或权利要求36至38任一项的肽模拟物。
43.权利要求42的组合物，其中所述脂质是磷脂。
44.权利要求42的组合物，其中所述脂质是1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-磷脂酰胆碱(″POPC″)。
45.权利要求42至44任一项的组合物，其还包含药学上可接受的载体。
46.在哺乳动物中介导胆固醇流出的方法，所述方法包含给所述哺乳动物施用权利要求1至34任一项的多肽，从而介导胆固醇流出。
47.权利要求46的方法，其中所述多肽稳定ABCA。
48.权利要求47的方法，其中所述ABCA是ABCA1。
49.权利要求46的方法，其中所述多肽具有抗氧化剂活性。
50.权利要求46的方法，其中所述多肽具有抗炎活性。
51.权利要求46的方法，其中所述哺乳动物是人类。
52.权利要求46的方法，其中所述哺乳动物是非人类哺乳动物。
53.治疗哺乳动物的动脉粥样硬化症状的方法，所述方法包含给哺乳动物施用治疗有效量的权利要求1至34任一项的多肽。
54.权利要求53的方法，其中所述哺乳动物是被诊断为患有一种或多种动脉粥样硬化症状的哺乳动物。
55.权利要求53的方法，其中所述哺乳动物是被诊断为具有动脉粥样硬化风险的哺乳动物。
56.权利要求53的方法，其中所述哺乳动物是人类。
57.权利要求53的方法，其中所述哺乳动物是非人类哺乳动物。
58.稳定哺乳动物管腔壁中易损性斑块的方法，所述方法包含给所述哺乳动物施用权利要求1至34任一项的多肽。
59.权利要求58的方法，其中所述哺乳动物是被诊断为具有一个或多个易损性斑块的哺乳动物。
60.权利要求58的方法，其中所述哺乳动物是被诊断为处于具有一个或多个易损性斑块风险下的哺乳动物。
61.制备包含两亲性α-螺旋的多肽变体的方法，其中所述变体具有胆固醇流出活性和/或ABCA稳定活性，所述方法包括：
(a)提供具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽；
(b)取代所述多肽的至少一个氨基酸位置以产生多肽变体；
(d)筛选所述多肽变异体的胆固醇流出活性和/或ABCA稳定活性；
(e)选择胆固醇流出活性为具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽的至少80％的所述多肽变体和/或选择ABCA稳定活性为具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽的至少80％的所述多肽变体；以及
(f)合成所选择的多肽变体。
62.权利要求61的方法，其中所述多肽变体包含至少一个D氨基酸。
63.权利要求61的方法，其中所述多肽变体的羧基末端包含D氨基酸和所述多肽变体的氨基末端包含D氨基酸。
64.权利要求61的方法，其中所述多肽变体全部包含D氨基酸。
65.治疗动脉粥样硬化症状的药剂盒，所述药剂盒包含容器，所述容器包含权利要求1至34任一项的多肽或权利要求36至38任一项的肽模拟物。
66.权利要求65的药剂盒，其还包含药学上可接受的载体。
67.权利要求65的药剂盒，其中所述多肽在单位剂量制剂中与药学上可接受的载体组合。
68.权利要求1至34任一项的分离的多肽或权利要求36至38任一项的肽模拟物，其用作药剂。
69.权利要求1至34任一项的分离的多肽或权利要求36至38任一项的肽模拟物，其用于治疗与血脂异常有关的疾患。
70.权利要求1至34任一项的分离的多肽或权利要求36至38任一项的肽模拟物，其用于治疗胆固醇流出疾患。
71.权利要求1至34任一项的分离的多肽或权利要求36至38任一项的肽模拟物，其用于治疗高胆固醇血症。
72.权利要求1至34任一项的分离的多肽或权利要求36至38任一项的肽模拟物，其用于治疗炎症。
73.权利要求1至34任一项的分离的多肽或权利要求36至38任一项的肽模拟物，其用于治疗动脉粥样硬化或用于预防动脉粥样硬化症状的治疗。
74.权利要求1至34任一项的分离的多肽或权利要求36至38任一项的肽模拟物，其用于稳定斑块的治疗。
75.权利要求1至34任一项的分离的多肽或权利要求36至38任一项的肽模拟物在体外结合ABCA中的应用。
76.包含权利要求1至34任一项的分离的多肽或权利要求36至38任一项的肽模拟物的可检测的亲和配体，其直接或间接与可检测的部分连接。
77.权利要求76的可检测的亲和配体，其中所述标记选自荧光染料、金属、发色染料、化学发光化合物、生物发光蛋白、酶、放射性同位素、磁铁氧化物粒子、含气囊泡和量子点。
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