JP2003525565A - アポリポタンパク質ａ−１アゴニストを供給するための遺伝子治療法および異常脂肪血障害を治療するためのその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、天然型のアポリポタンパク質Ａ−１（ＡｐｏＡ−１）、すなわち、成熟ＡｐｏＡ−１、プレプロＡｐｏＡ−１およびプロＡｐｏＡ−１の改変型、例えば、ＡｐｏＡ−１アゴニスト（ＡｐｏＡ−１の活性を模擬するペプチド）を含むように改変された天然ＡｐｏＡ−１、ＡｐｏＡ−１スーパーアゴニスト（天然ＡｐｏＡ−１の活性を上回るペプチド）、および１以上のＡｐｏＡ−１アゴニストのヌクレオチドにより置換された１以上の両親媒性ヘリックスを有する改変された天然ＡｐｏＡ−１、をコードするヌクレオチド配列を、異常リポタンパク質血症と関連した障害、例えば、心血管性の障害、アテローム硬化症、再狭窄、高脂血症、および敗血症性ショックなどの他の障害を治療するために供給するための遺伝子的アプローチに関する。

Description

【発明の詳細な説明】

１．序 本発明は、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、高脂血症および敗
血症性ショックなどのその他疾患をはじめとする異リポタンパク血症が関与する
疾患の治療のための、天然型のアポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ＡｐｏＡ−Ｉ）の改
変型、すなわち成熟型ＡｐｏＡ−Ｉ；プレプロＡｐｏＡ−ＩおよびプロＡｐｏＡ
−Ｉ；ＡｐｏＡ−Ｉペプチド；天然型ＡｐｏＡ−Ｉの活性を模倣するかまたはそ
れを超えるＡｐｏＡ−Ｉアゴニストおよびスーパーアゴニスト、ペプチド；およ
び天然型ＡｐｏＡ−Ｉ遺伝子をコードするヌクレオチド配列を供給する遺伝子治
療のアプローチに関する。 ２．発明の背景 循環コレステロールは、、血液中で脂質を輸送する脂質・タンパク質複合組成
物粒子である血漿リポタンパク質によって運ばれる。低密度リポタンパク質（Ｌ
ＤＬ）および高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）は、主要なコレステロール担体で
ある。ＬＤＬは、生体中において肝臓（ここで、コレステロールが食物源から合
成されるかまたは取り出される）から肝外組織へコレステロールを送達する役割
を担っていると考えられる。「逆コレステロール輸送」という用語は、肝外組織
から、コレステロールが異化および除去される肝臓へ、コレステロールを輸送す
ることを意味する。血漿ＨＤＬ粒子は、組織コレステロールのスカベンジャーと
して作用し、逆輸送過程における主要な役割を果たすと考えられる。 血清コレステロールの増加を冠状動脈性心疾患に関連づける証拠は、決定的な
ものである。例えば、アテローム性動脈硬化症は、動脈壁中へのコレステロール
の蓄積によって特性付けられる進行の遅い疾患である。アテローム性動脈硬化病
巣に沈着する脂質は主として血漿ＬＤＬに由来するという考え方を支持する有力
な証拠がある。従って、ＬＤＬは「悪玉」コレステロールとして一般に知られる
ようになった。これとは対照的に、ＨＤＬ血清レベルは、冠状動脈性心疾患と逆
相関関係にある。実際に、ＨＤＬの高血清レベルは、ネガティブな（ｎｅｇａｔ
ｉｖｅ）危険因子と見なされる。血漿ＨＤＬのレベルが高いと冠状動脈疾患が防
止されるだけでなく、実際にアテローム性動脈硬化斑の退縮を誘発しうるという
仮説が立てられている（例えば、Ｂａｄｉｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｃ
ｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ８６（Ｓｕｐｐｌ．ＩＩＩ）：８６−９４を参照された
い）。このため、ＨＤＬは、「善玉」コレステロールとして一般に知られている
。 ２．１．コレステロール輸送 脂肪輸送系は、２つの経路：すなわち、腸から吸収されるコレステロールおよ
びトリグリセリドのための外因性経路と、肝臓および他の非肝臓組織から血流中
に入るコレステロールおよびトリグリセリドのための内因性経路と、に分割する
ことができる。 外因性経路では、食物脂肪は、キロミクロンと呼ばれるリポタ
ンパク質粒子中にパッケージ化される。このキロミクロンは、血流中に入ってそ
れらのトリグリセリドを脂肪組織（貯蔵するため）および筋肉（酸化させてエネ
ルギーを供給するため）に送達する。キロミクロンの残りの部分（コレステリル
エステルが含まれる）は、肝細胞上にのみ見出される特異的受容体によって循環
系から除去される。次に、このコレステロールは、細胞代謝のためにまたは血漿
リポタンパク質として肝外組織へ再循環させるために再び利用可能となる。 内因性経路では、肝臓は、大きな超低密度リポタンパク質粒子（ＶＬＤＬ）を
血流中に分泌する。ＶＬＤＬのコアは、ほとんど、肝臓で合成されたトリグリセ
リドから成り、そのほかに、より小量のコレステリルエステル（肝臓で合成され
るかまたはキロミクロンから再循環される）を含む。ＶＬＤＬの表面上には、２
種の主要タンパク質、すなわち、アポタンパク質Ｂ−１００およびアポタンパク
質Ｅがディスプレイされる。ＶＬＤＬが脂肪組織のまたは筋肉の毛細管に達する
と、そのトリグリセリドが抽出されて、新しい種類の粒子が生成する。この粒子
は、サイズが減少してコレステリルエステルが富化されるが、中間密度リポタン
パク質（ＩＤＬ）と呼ばれるその２種のアポタンパク質は保持される。 ヒトでは、ＩＤＬ粒子の約半分は循環系から迅速に除去される（それらが形成
されてから２〜６時間以内）。なぜなら、それらのコレステロールを抽出して新
しいＶＬＤＬおよび胆汁酸を形成する肝細胞にＩＤＬ粒子が強く結合するからで
ある。肝臓に吸収されないＩＤＬ粒子は、循環系中に、より長く残存する。やが
て、アポタンパク質Ｅは、循環粒子から解離し、その結果、該粒子は、それらの
唯一のタンパク質としてアポタンパク質Ｂ−１００を有するＬＤＬに変化する。 主として、肝臓は、コレステロールの大部分を吸収して分解し、コレステロー
ル代謝の最終産物である胆汁酸を生成する。コレステロール含有粒子の吸収は、
肝細胞上に高濃度で存在するＬＤＬ受容体によって媒介される。ＬＤＬ受容体は
、アポタンパク質Ｅとアポタンパク質Ｂ−１００の両方に結合し、ＩＤＬとＬＤ
Ｌの両方に結合してそれらを循環系から除去する役割を担っている。しかしなが
ら、ＬＤＬ受容体に対する親和力は、アポタンパク質Ｅの方がアポタンパク質Ｂ
−１００よりも大きい。その結果、ＬＤＬ粒子は、ＩＤＬ粒子よりもはるかに長
い循環寿命を有する。すなわち、ＬＤＬ粒子は、平均で２日半にわたり循環した
後、肝臓および他の組織に結合する。ＬＤＬ（「悪玉」コレステロール）の血清
レベルが高いことは、冠状動脈性心疾患と明確に関連づけられる。例えば、アテ
ローム性動脈硬化症では、循環ＬＤＬに由来するコレステロールが動脈の壁に蓄
積することにより、血液の流れを妨害する嵩高いプラークが形成され、結果とし
て、血餅を生じて動脈が遮断され、心臓発作または拍動を引き起こす。 最終的には、ＬＤＬから放出される細胞内コレステロールの量によって、細胞
コレステロール代謝が制御される。ＶＬＤＬおよびＬＤＬに由来する細胞コレス
テロールの蓄積は、３つのプロセスを制御する。第１に、こうした蓄積が起こる
と、コレステロールの生合成経路における中心的な酵素であるＨＭＧＣｏＡレダ
クターゼの合成を停止させることによって、その細胞がもつコレステロール合成
能力が減退させられる。第２に、ＬＤＬ由来のコレステロールが流入すると、コ
レステロールを貯蔵小滴中に沈着するコレステリルエステルに変換する細胞酵素
であるＡＣＡＴを活性化させることによって、コレステロールの貯蔵が促進され
る。第３に、細胞内にコレステロールが蓄積すると、新しいＬＤＬ受容体の細胞
合成を妨害するフィードバック機構が作動する。従って、代謝の要求に合わせて
負荷をかけすぎることなく十分なコレステロールを取り込めるように、細胞はＬ
ＤＬ受容体のそれらの補体を調節する。（レビューに関しては、Ｂｒｏｗｎ ＆
Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ
Ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，８ｔｈ Ｅｄ．，Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇ
ｉｌｍａｎ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９９０，Ｃｈ．３６，ｐ
ｐ．８７４−８９６を参照されたい）。 ２．２．逆コレステロール輸送 要するに、末梢（非肝）細胞は、ＶＬＤＬおよびＬＤＬに由来するプレフォー
ム型ステロールの局所合成と吸収とを組み合わせて、それらのコレステロールを
獲得する。これとは対照的に、逆コレステロール輸送（ＲＣＴ）は、肝外組織へ
再循環させるために、あるいは胆汁として腸中に分泌するために、末梢細胞コレ
ステロールを肝臓に戻すことのできる経路である。ＲＣＴ経路は、ほとんどの肝
外組織からコレステロールを除去する唯一の手段であり、生体中のほとんどの細
胞の構造および機能を維持するうえで極めて重要である。 ＲＣＴは、主に３つのステップ：すなわち、末梢細胞の種々のプールからコレ
ステロールを最初に除去するステップであるコレステロール流出ステップと、 （ｂ）レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）の作用
によりコレステロールをエステル化し、流出したコレステロールが再び細胞中に
流入するのを防止するステップと、（ｃ）肝細胞中へのＨＤＬコレステリルエス
テルの吸収／送達を行うステップと、から成る。ＲＣＴ経路は、ＨＤＬによって
媒介される。ＨＤＬは、高密度であることによって特性付けられるリポタンパク
質粒子に対する一般的な用語である。ＨＤＬ複合体の主な脂質成分は、種々のリ
ン脂質、コレステロール（エステル）、およびトリグリセリドである。最も目立
つアポリポタンパク質成分は、ＨＤＬの機能特性を決定するＡ−ＩおよびＡ−Ｉ
Ｉである。更に、少量のアポリポタンパク質Ｃ−Ｉ、Ｃ−ＩＩ、Ｃ−ＩＩＩ、Ｄ
、Ｅ、Ｊなども観測されている。代謝ＲＣＴカスケード中のリモデリング状態に
もよるが、ＨＤＬは、上記の成分の種々の混合物として多種多様な異なるサイズ
で存在することができる。 ＲＣＴ経路に関与する中心的な酵素は、ＬＣＡＴである。ＬＣＡＴは、主に肝
臓で産生され、ＨＤＬ画分と会合して血漿中を循環する。コレステリルエステル
運搬タンパク質（ＣＥＴＰ）、別の脂質運搬タンパク質、およびリン脂質運搬タ
ンパク質（ＰＬＴＰ）は、循環ＨＤＬ集団の更なるリモデリングに寄与する。Ｃ
ＥＴＰは、ＬＡＣＴによって形成されたコレステリルエステルを、他のリポタン
パク質、特に、ＡｐｏＢ含有リポタンパク質、例えば、ＶＬＤＬに移動すること
ができる。ＨＤＬトリグリセリドは、細胞外肝臓トリグリセリドリパーゼにより
異化可能であり、リポタンパク質コレステロールは、いくつかの機構を介して肝
臓により除去される。 各ＨＤＬ粒子には、ＡｐｏＡ−Ｉの少なくとも１つのコピー（通常、２つ〜４
つのコピー）が含まれる。ＡｐｏＡ−Ｉは、急速に開裂して２４３個のアミノ酸
残基を有する成熟ポリペプチドを発生させるプロタンパク質として分泌されるプ
レプロアポリポタンパク質として肝臓および小腸により合成される。ＡｐｏＡ−
Ｉは、主に、プロリンであることの多いリンカー部分で区切られた異なる２２ア
ミノ酸リピート６〜８個から成り、いくつかの場合、数個の残基から構成された
ストレッチから成る。ＡｐｏＡ−Ｉは、脂質との３つのタイプの安定な複合体：
すなわち、プレβ１ＨＤＬと呼ばれる、脂質の少ない小さな複合体と、プレβ２
ＨＤＬと呼ばれる、極性脂質（リン脂質およびコレステロール）のみを含有する
平たい円盤状粒子と、球状ＨＤＬまたは成熟ＨＤＬ（ＨＤＬ３およびＨＤＬ２）
と呼ばれる、極性および非極性脂質の両方を含有する球状粒子と、を形成する。
循環集団中の大部分のＨＤＬは、ＡｐｏＡ−ＩとＡｐｏＡ−ＩＩ（第２の主要な
ＨＤＬタンパク質）の両方を含んでおり、本明細書中ではＨＤＬのＡＩ／ＡＩＩ
−ＨＤＬ画分と記す．しかしながら、ＡｐｏＡ−Ｉだけを含むＨＤＬの画分（本
明細書中ではＡＩ−ＨＤＬ画分と記す）は、ＲＣＴにより効果的であると思われ
る。ＡＩ−ＨＤＬ画分は抗アテローム性であるという仮説は、特定の疫学的研究
によって支持される。（Ｐａｒｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ａｒｔｅｒｉｏ
ｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．１２：７０１−７０７；Ｄｅｃｏｓｓｉｎ ｅｔ
ａｌ．，１９９７，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２７：２９９−３０
７）。 細胞の表面からのコレステロールの運搬に対する機構については分かっていな
いが、脂質の少ない複合体であるプレβ１ＨＤＬは、ＲＣＴに関与する末梢組織
から運搬されるコレステロールに対する好ましい受容体であると考えられる。細
胞表面からプレ−β−１ＨＤＬへ新たに転移されたコレステロールは、迅速に円
盤状プレーβ−２ＨＤＬに現れる。ＰＬＴＰは、プレβ２円盤の形成速度を増大
させる可能性があるが、ＲＣＴにおけるＰＬＴＰの役割を示唆するデータは不足
している。ＬＣＡＴは優先的に円盤および球形ＨＤＬと反応し、レシチンまたは
他のリン脂質の２−アシル基を脂肪アルコール、特にコレステロールの遊離のヒ
ドロキシル残基に転移して、コレステリルエステル（ＨＤＬ中に保持）およびリ
ソレシチンを生じる。ＬＡＣＴ反応には、アクチベーターとしてＡｐｏＡ−Ｉが
必要である。すなわち、ＡｐｏＡ−Ｉは、ＬＣＡＴに対する天然の補因子である
。コレステロールを、ＨＤＬ中に隔離されるそのエステルに変換すると、細胞中
へのコレステロールの再流入が防止され、結果として、コレステリルエステルが
除去されることになる。ＡＩ−ＨＤＬ画分（すなわち、ＡｐｏＡ−Ｉは含まれる
がＡｐｏＡ−ＩＩは含まれない画分）中の成熟ＨＤＬ粒子に含まれるコレステリ
ルエステルは、ＡｐｏＡ−ＩとＡｐｏＡ−ＩＩの両方を含有するＨＤＬ（ＡＩ／
ＡＩＩ−ＨＤＬ画分）に由来するコレステリルエステルよりも効果的に、肝臓に
よって除去および処理されて胆汁に変換される。この原因の一部分として、ＡＩ
−ＨＤＬがより効果的に肝細胞膜に結合することが考えられる。ＨＤＬ受容体が
存在するという仮説が立てられ、更に、最近、スカベンジャー受容体ＳＲ−ＢＩ
がＨＤＬ受容体として同定された（Ａｃｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２７１：５１８−５２０）。ＳＲ−ＢＩは、ステロイド産生組織（
例えば、副腎）中および肝臓中で最も多く発現される（Ｌａｎｄｓｈｕｌｚ ｅ
ｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８：９８４−９９５；
Ｒｉｇｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：
３３５４５−３３５４９）。 ＣＥＴＰは、ＲＣＴで主要な役割を果たすとは思われないが、その代わりに、
ＶＬＤＬおよびＬＤＬ由来の脂質の代謝に関与する。しかしながら、ＣＥＴＰ活
性の変化またはそのアクセプターであるＶＬＤＬおよびＬＤＬは、ＨＤＬ集団を
「リモデリング」するという役割を果たす。例えば、ＣＥＴＰの不在下において
、ＨＤＬは、排除されない増大粒子になる。（ＲＣＴおよびＨＤＬに関するレビ
ューについては、Ｆｉｅｌｄｉｎｇ ＆ Ｆｉｅｌｄｉｎｇ，１９９５，Ｊ．Ｌ
ｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３６：２１１−２２８；Ｂａｒｒａｎｓ ｅｔ ａｌ．，１
９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１３００：７３−８５；
Ｈｉｒａｎｏ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏ
ｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１７（６）：１０５３−１０５９を参照されたい）
。 ２．３．血清コレステロールを低下させるための現在の治療 血清コレステロールおよびトリグリセリドを低減させるために、現在、多数の
治療法が利用可能である（例えば、前述のブラウン＆ Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎの文
献を参照されたい）。しかしながら、いずれの方法にも、効力、副作用、および
患者集団の適性に関して、それぞれに特有な欠点および制限がある。 胆汁酸結合樹脂は、腸から肝臓への胆汁酸のリサイクルを阻害する薬剤のクラ
スであり、具体的には、コレスチラミン（Ｑｕｅｓｔｒａｎ Ｌｉｇｈｔ（登録
商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）および塩酸コレスチポー
ル（Ｃｏｌｅｓｔｉｄ（登録商標）、Ｔｈｅ Ｕｐｊｏｈｎ Ｃｏｍｐａｎｙ）
が挙げられる。経口投与した場合、これらの正に帯電した樹脂は、腸中において
負に帯電した胆汁酸に結合する。樹脂が腸から吸収されることはありえないので
、樹脂は、胆汁酸を伴って排泄される。しかしながら、このような樹脂を使用し
た場合、せいぜい、血清コレステロールレベルが約２０％低下するにすぎず、し
かも、胃腸の副作用、例えば、便秘症および特定のビタミン欠乏症を併発する。
更に、樹脂が他の薬剤に結合するため、樹脂摂取の少なくとも１時間前または４
〜６時間後、他の経口薬を服用しなければならない。従って、心臓病患者の薬剤
療法が複雑になる。 スタチンは、コレステロール減少剤であり、コレステロール生合成経路に関与
する中心的な酵素であるＨＭＧＣｏＡレダクターゼを阻害することによってコレ
ステロール合成をブロックする。スタチン、例えば、ロバスタチン（Ｍｅｖａｃ
ｏｒ（登録商標）， Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．）およびプラバスタチ
ン（Ｐｒａｖａｃｈｏｌ（登録商標）， Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕ
ｉｂｂ Ｃｏ．）は、胆汁酸結合樹脂と併用される。スタチンは、血清コレステ
ロールレベルおよびＬＤＬ血清レベルを著しく減少させ、アテローム性冠状動脈
硬化症の進行を遅らせる。しかしながら、血清ＨＤＬコレステロールレベルは、
わずかに増加する。ＬＤＬ減少作用の機構には、ＶＬＤＬ濃度の低下とＬＤＬ受
容体の細胞発現の誘発の両方が関与し、結果として、ＬＤＬ産生の低下および／
またはＬＤＬ異化の増大が起こるものと考えられる。肝臓および腎臓の機能不全
などの副作用は、これらの薬剤の使用と関連づけられる（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ
Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ Ｃｏ
．，Ｉｎｃ．，Ｍｏｎｔｖａｌｅ，Ｎ．Ｊ．，１９９７）。最近、ＦＤＡは、稀
ではあるが急を要する家族性高コレステロール血症患者を治療するために、アト
ルバスタチン（Ｐａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓにより開発されたＨＭＧＣｏＡレダクタ
ーゼ阻害剤）（Ｗａｒｎｅｒ Ｌａｍｂｅｒｔ）を承認した（１９９５，Ｓｃｒ
ｉｐ ２０（１９）：１０）。 ナイアシンすなわちニコチン酸は、栄養補給食品および抗高脂質血症薬として
使用される水溶性ビタミンＢ複合体である。ナイアシンは、ＶＬＤＬの産生を減
少させ、かつ効果的にＬＤＬを低減させる。ナイアシンは、胆汁酸結合樹脂と併
用される。ナイアシンは、適切な用量で使用した場合、ＨＤＬを増大させること
ができるが、このような高用量で使用した場合、重度の副作用によりその有用性
は制限される。 フィブレートは、高コレステロール血症とも関連づけることのできる種々の形
態の高脂質血症（すなわち、血清トリグリセリドの増大）を治療するために使用
される脂質減少薬剤のクラスである。フィブレートは、ＶＬＤＬ画分を減少させ
、ＨＤＬを中程度に増大させると思われるが、これらの薬剤が血清コレステロー
ルに及ぼす作用は様々である。米国において、フィブレートは、抗高脂血症薬と
して使用することが認められているが、高コレステロール血症薬としては認可さ
れていない。例えば、クロフィブレート（Ａｔｒｏｍｉｄ−Ｓ（登録商標），
Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）は、ＶＬＤＬ画分を減
少させることによって血清トリグリセリドを低減させる働き（その機構は分かっ
ていない）をする抗高脂血症薬である。特定の患者の小集団で血清コレステロー
ルを減少させることは可能であるが、薬剤に対する生化学的反応は様々であり、
必ずしも、好ましい結果がどの患者に現れるかを予測できるわけではない。Ａｔ
ｒｏｍｉｄ−Ｓ（登録商標）が冠状動脈性心疾患の予防に有効であることは実証
されていない。化学的および薬理学的関連薬剤であるジェムフィブロジル（Ｌｏ
ｐｉｄ（登録商標）， Ｐａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓ）は、脂質調節薬であり、血清
トリグリセリドおよびＶＬＤＬコレステロールを中程度に減少させ、ＨＤＬコレ
ステロール、すなわち、ＨＤＬ２およびＨＤＬ３サブ画分ならびにＡｐｏＡ−Ｉ
およびＡ−ＩＩの両方（すなわち、ＡＩ／ＡＩＩ−ＨＤＬ画分）を増大させる。
しかしながら、特に患者集団が異なると、脂質応答は様々に変化する。更に、既
存の冠状動脈性心疾患の病歴または徴候のない４０〜５５歳の男性患者で冠状動
脈性心疾患の防止が観測されたが、これらの知見がどの程度まで他の患者集団（
例えば、女性、より老年および若年の男性）に適用できるかは明確でない。実際
のところ、冠状動脈性心疾患であることが立証された患者では、効力はまったく
観測されなかった。毒性などの重度の副作用、例えば、悪性疾患、（特に、胃腸
癌）、胆嚢疾患、および冠状動脈以外の原因による死亡率の増加は、フィブレー
トの使用と関連付けられる。これらの薬剤は、高ＬＤＬまたは低ＨＤＬが唯一の
脂質異常である患者には必要でない（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅ
ｆｅｒｅｎｃｅ，１９９７，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ Ｃｏ．，Ｉ
ｎｃ．Ｍｏｎｔｖａｌｅ，Ｎ．Ｊ．）。 閉経後の女性の中程度の高コレステロール血症に対して、経口エストロゲン代
償療法を適用することも考えられる。しかしながら、ＨＤＬを増加させるとそれ
に伴ってトリグリセリドも増加する可能性がある。エストロゲン療法は、もちろ
ん、特定の患者集団（閉経後の女性）に限定され、しかも、悪性新生物、胆嚢疾
患、血栓閉塞疾患、肝細胞腺種、高血圧症、ブドウ糖不耐症、および高カルシウ
ム血症の誘発などの重度の副作用を伴う。 従って、血清コレステロールを低減しＨＤＬ血清レベルを増加させて、冠状動
脈性心疾患の予防および／または既存の疾患、特にアテローム性動脈硬化症の治
療を行うのに有効であるより安全な薬剤の開発が必要である。 ２．４．目標物としてのＡｐｏＡ−Ｉ コレステロールを安全に低減させるための現用の薬剤の中には、ＨＤＬレベル
を増大させ、ＲＣＴを刺激するものはまったくなく、ほとんどは、コレステロー
ル輸送経路に作用して、コレステロールの食物摂取、再循環、および合成、なら
びにＶＬＤＬ集団を調節するものと考えられる。 コレステロールの流出および除去を刺激する薬剤を探索することが望ましく、
ＲＣＴにおいていくつかの有望な目標物、すなわち、ＬＡＣＴ、ＨＤＬ、その種
々の成分（ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＩ、およびリン脂質）、ＰＬＴＰ、なら
びにＣＥＴＰが存在するが、どの目標物が、所望のリポタンパク質プロフィルお
よび予防効果を得るのに最も有効であるかは分かっていない。ＲＣＴにおいて、
いずれかの成分１つが変化させると、最終的に、循環リポタンパク質集団の組成
およびＲＣＴの効率が影響を受ける。 ｉｎ ｖｉｖｏで得られたデータに基づくいくつかの系統の証拠から、ＨＤＬ
およびその主要タンパク質成分であるＡｐｏＡ−Ｉが、アテローム性動脈硬化症
を予防し、場合によりプラークを退縮させることが示唆される。従って、これら
の魅力的な目標物は治療に役立てることができると考えられる。第１に、ヒトに
おいて、血清ＡｐｏＡ−Ｉ（ＨＤＬ）濃度とアテローム形成との間には、逆相関
関係がある（Ｇｏｒｄｏｎ ＆ Ｒｉｆｋｉｎｄ，１９８９，Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．
Ｍｅｄ．３２１：１３１１−１３１６；Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９
，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ７９：８−１５）。実際に、ヒトにおいて、ＨＤＬ
の特定の小集団が、アテローム性動脈硬化症の危険率の低減と関連付けられた（
Ｍｉｌｌｅｒ，１９８７，Ａｍｅｒ．Ｈｅａｒｔ １１．３：Ｓ８９−５９７；
Ｃｈｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３２：３８３−
３９４）。 第２に、動物実験から、ＡｐｏＡ−Ｉ（ＨＤＬ）の予防的役割が支持される。
コレステロールを摂取したウサギをＡｐｏＡ−ＩまたはＨＤＬで処置したところ
、プラークの発生および進行が軽減した。（Ｋｏｉｚｕｍｉ ｅｔ ａｌ．，１
９８８，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．２９：１４０５−１４１５；Ｂａｄｉｍｏｎ
ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．６０：４５５−４６１；Ｂ
ａｄｉｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８５：
１２３４−１２４１）。しかしながら、その効力は、ＨＤＬの供給源に依存して
変化した（Ｂｅｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ
ｓ，Ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅｓａｎｄ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｆａｔｔｙ Ａｃ
ｉｄｓ ４７：１４９−１５２；Ｍｅｚｄｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ａ
ｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ １１３：２３７−２４６）。 第３に、トランスジェニック動物を関与させた実験から、ＡｐｏＡ−Ｉの役割
の直接の証拠が得られた。マウスに転移させたＡｐｏＡ−Ｉのためのヒト遺伝子
の発現は、食事性アテローム動脈硬化症について大動脈の損傷の発症に対して防
御する素因を遺伝的に与えた（Ｒｕｂｉｎら、１９９１，Ｎａｔｕｒｅ ３５３
：２６５−２６７）。このＡｐｏＡ−ＩトランスジーンはＡｐｏＥ欠失マウスお
よびＡｐｏ（ａ）トランスジェニックマウスにおいてアテローム動脈硬化症を抑
制することもまた示された（Ｐａｓｚｔｙら、１９９４，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖ
ｅｓｔ．９４：８９９−９０３；Ｐｌｕｍｐら、１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：９６０７−９６１１；Ｌｉｕら、１９９４
，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３５：２２６３−２２６６）。同様の結果が、ヒト
ＡｐｏＡ−Ｉを発現するトランスジェニックラビット（Ｄｕｖｅｒｇｅｒ，１９
９６，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９４：７１３−７１７；Ｄｕｖｅｒｇｅｒら、
１９９６，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１
６：１４２４−１４２９； Ｅｍｍａｎｕｅｌら，１９９７，Ａｒｔｈｅｒｉｏ
ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ １０３５：１４４）およびアテローム動脈硬化症を防御す
るヒトＡｐｏＡ−Ｉレベルが上昇し、そしてバルーン血管形成術後の再狭窄が阻
害されたトランスジェニックラット（Ｂｕｒｋｅｙら、１９９２，Ｃｉｒｃｕｌ
ａｔｉｏｎ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｉ，８６：Ｉ−４７２，Ａｂｓｔｒａｃｔ
Ｎｏ．１８７６；Ｂｕｒｋｅｙら、１９９５，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３６
：１４６３−１４７３）において、観察された。 ＡＩ−ＨＤＬはＡＩ／ＡＩＩ−ＨＤＬ画分よりもＲＣＴにおいてより効果的で
あるようである。ヒトＡｐｏＡ−ＩまたはＡｐｏＡ−ＩおよびＡｐｏＡ−ＩＩ（
ＡＩ／ＡＩＩ）で形質転換したマウスによる研究から、ＨＤＬのタンパク質組成
がその役割に顕著に影響する、すなわちＡＩ−ＨＤＬの方がＡＩ／ＡＩＩ−ＨＤ
Ｌよりも抗アテローム誘発性であることが示された（Ｓｃｈｕｌｔｚら、１９９
３，Ｎａｔｕｒｅ ３６５：７６２−７６４）。ヒトＬＣＡＴ遺伝子を発現する
トランスジェニックマウスに関連した類似の研究で、ＬＣＡＴ活性の適度の上昇
がリポタンパク質コレステロールレベルを顕著に変化させること、およびＬＣＡ
ＴがＡｐｏＡ−Ｉを含有するＨＤＬに対して顕著な優先性を有することが証明さ
れている（Ｆｒａｎｃｏｎｅら、１９９５，Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃ．Ｉｎｖｅｓｔ．
９６：１４４０−１４４８；Ｂｅｒａｒｄら、１９９７，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ
ｉｃｉｎｅ ３（７）：７４４−７４９）。これらのデータはＬＣＡＴの活性化
およびＲＣＴの刺激におけるＡｐｏＡ−Ｉの顕著な役割を支持するものであるが
、その他の研究からさらに複雑なシナリオが証明されている。すなわち、細胞コ
レステロールの流出をモジュレートするＨＤＬの主要成分はリン脂質である（Ｆ
ｏｕｒｎｉｅｒら、１９９６，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３７：１７０４−１７
１１）。 アテローム動脈硬化症に対する防御におけるＨＤＬ、すなわちＡｐｏＡ−Ｉお
よびこれに結合するリン脂質の両方の潜在的な役割の面から、組み換え産生され
たＡｐｏＡ−Ｉを利用するヒトの臨床試験がＵＣＢ Ｂｅｌｇｉｕｍによって開
始され、終了され、そして再開された模様であり（Ｐｈａｒｍａｐｒｏｊｅｃｔ
ｓ，Ｏｃｔ．２７，１９９５；ＩＭＳ Ｒ＆Ｄ Ｆｏｃｕｓ，Ｊｕｎｅ ３０，
１９９７；Ｄｒｕｇ Ｓｔａｔｕｓ Ｕｐｄａｔｅ，１９９７，Ａｔｈｅｒｏｓ
ｃｌｅｒｏｓｉｓ ２（６）：２６１−２６５；Ｃｏｎｇｒｅｓｓ，”疾病予防
におけるＨＤＬの役割（Ｔｈｅ Ｒｏｌｅ ｏｆ ＨＤＬ ｉｎ Ｄｉｓｅａｓ
ｅ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）”，Ｎｏｖ．７−９，１９９６，Ｆｏｒｔ Ｗｏｒ
ｔｈにおけるＭ．Ｅｒｉｋｓｓｏｎ；Ｌａｃｋｏ ＆ Ｍｉｌｌｅｒ，１９９７
，Ｊ．Ｌｉｐ．Ｒｅｓ．３８：１２６７−１２７３；およびＷＯ９４／１３８１
９も参照されたい）、そしてＢｉｏ−Ｔｅｃｈによって開始され終了された（Ｐ
ｈａｒｍａｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ａｐｒｉｌ ７，１９８９）。敗血症性ショック
を治療するために、ＡｐｏＡ−Ｉを使用する試験も試みられた（Ｏｐａｌ，”敗
血症の治療戦略としての再調製ＨＤＬ（Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ ＨＤＬ
ａｓ ａ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ Ｓｅｐｓｉｓ），
”ＩＢＣ’ｓ７ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏ
ｎ Ｓｅｐｓｉｓ，Ａｐｒｉｌ ２８−３０，１９９７，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ
，Ｄ．Ｃ．；Ｇｏｕｎｉら、１９９３，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．９４：１３９
−１４６；Ｌｅｖｉｎｅ，ＷＯ９６／０４９１６）。しかし、ＡｐｏＡ−Ｉの製
造および使用に関しては、薬剤としての理想から遠ざけるような多くの落し穴が
ある。例えば、ＡｐｏＡ−Ｉは大きなタンパク質であるので製造するのは困難で
費用がかかり、保存中の安定性、活性な製品の送達およびｉｎ ｖｉｖｏでの半
減期に関して、多くの製造上および再現性の問題を克服しなければならない。 これらの欠点の見地から、ＡｐｏＡ−Ｉを模倣するペプチドを調製する試みが
行なわれてきた。ＡｐｏＡ−Ｉのキィとなる活性はこのタンパク質の独特の二次
構造特性の多数の反復の存在、すなわちクラスＡの両親媒性αヘリックスによっ
てもたらされたもの（Ｓｅｇｒｅｓｔ，１９７４，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３８：
２４７−２５３）なので、ＡｐｏＡ−Ｉの活性を模倣するペプチドの設計のため
の大部分の努力はクラスＡ型の両親媒性αヘリックスを形成するペプチドの設計
に焦点が当てられた。 クラスＡ型の両親媒性αヘリックスは陽性荷電アミノ酸残基が疎水性−親水性
界面に集まり、そして陰性荷電アミノ酸残基が親水性面の中心に集まっている点
において独特である。さらに、クラスＡαヘリックスペプチドは疎水性角が１８
０°未満である（Ｓｅｇｒｅｓｔら、１９９０，ＰＲＯＴＥＩＮＳ：Ｓｔｒｕｃ
ｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ８：１０３−１１７
）。ＡｐｏＡ−Ｉ模倣体の設計のための初期の新規な戦略は天然に生起するアポ
リポタンパク質の一次構造ではなく、むしろペプチド類似体の配列中にこれらの
独特のクラスＡヘリックスの特徴およびＡｐｏＡ−Ｉドメインのいくつかの特性
を取り込むことに基づいていた（例えば、Ｄａｖｉｄｓｏｎら、１９９６，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１３６０５−１３６１０；
Ｒｏｇｅｒｓら、１９９７，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６：２８８−３００
；Ｌｉｎｓら、１９９３，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ Ｂｉｏ
ｍｅｍｂｒａｎｅｓ １１５１：１３７−１４２；Ｊｉ ａｎｄ Ｊｏｎａｓ，
１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１１２９０−１１２９７；Ｃｏｌ
ｌｅｔら、１９９７，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，
３８：６３４−６４４；Ｓｐａｒｒｏｗ ａｎｄ Ｇｏｔｔｏ，１９８０，Ａｎ
ｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３４８：１８７−２１１；Ｓｐａｒｒｏｗ ａ
ｎｄ Ｇｏｔｔｏ，１９８２，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１
３：８７−１０７；Ｓｏｒｃｉ−Ｔｈｏｍａｓら、１９９３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２６８：２１４０３−２１４０９；Ｗａｎｇら、１９９６，Ｂｉｏｃｈ
ｉｍ．Ｂｉｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １７４−１８４；Ｍｉｎｎｉｃｈら、１９９２
，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１６５５３−１６５６０；Ｈｏｌｖｏｅｔ
ら、１９９５，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：１３３３４−１３３４２；Ｓ
ｏｒｃｉ−Ｔｈｏｍａｓら、１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１１
）：７２７８−７２８４；およびＦｒａｎｋら、１９９７，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ ３６：１７９８−１８０６、を参照されたい）。 研究の１つにおいて、Ｆｕｋｕｓｈｉｍａらは等しい親水性および疎水性面を
有する両親媒性αヘリックス（「ＥＬＫペプチド」）を形成させるために、周期
的に配列され、完全にＧｌｕ、ＬｙｓおよびＬｅｕ残基で構成される２２残基ペ
プチドを合成した（Ｆｕｋｕｓｈｉｍａら、１９７９，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ
．Ｓｏｃ．１０１（１３）：３７０３−３７０４；Ｆｕｋｕｓｈｉｍａら、１９
８０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：１０６５１−１０６５７；Ｆｕｋｕｓ
ｈｉｍａら，１９７９，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０１（１３）：３
７０３−３７０４）。このＥＬＫペプチドはＡｐｏＡ−Ｉの１９８−２１９断片
と４１％の配列相同性を共有している。定量用限外ろ過、ゲルパーミエーション
クロマトグラフィーおよび円二色性による研究から、このＥＬＫペプチドはリン
脂質と効果的に結合してＡｐｏＡ−Ｉのいくつかの物理的および化学的特性を模
倣することが示された（Ｋａｉｓｅｒら、１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：１１３７−１１４０；Ｋａｉｓｅｒら、１９８４
，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２３：２４９−２５５；Ｆｕｋｕｓｈｉｍａら、１９８０
，上記；Ｎａｋａｇａｗａら、１９８５，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０７
：７０８７−７０９２）。Ｙｏｋｏｙａｍａらはこうした研究から、ＬＣＡＴ活
性化のための決定的な因子は単純に十分大きな両親媒性構造の存在にあると結論
した（Ｙｏｋｏｙａｍａら、１９８０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５（１５
）：７３３３−７３３９）。この２２残基ペプチドの二量体がモノマーよりも密
接にＡｐｏＡ−Ｉを模倣することが後にわかった。これらの結果を基礎として、
ヘリックスブレーカー（ＧｌｙまたはＰｒｏのいずれか）で中間で区切られた４
４残基体がＡｐｏＡ−Ｉの最小の機能性ドメインに相当することが示唆された（
Ｎａｋａｇａｗａら、１９８５，上記）。 別の研究には「ＬＡＰペプチド」と称されるモデル両親媒性ペプチドが関与し
た（Ｐｏｗｎａｌｌら、１９８０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ７７（６）：３１５４−３１５８；Ｓｐａｒｒｏｗら、１９８１，Ｉｎ：
Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｆｕｎｃｔｉｏ
ｎ，Ｒｏｃｈ ａｎｄ Ｇｒｏｓｓ，Ｅｄｓ．，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ
．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，２５３−２５６）。天然のアポリポタンパク質の
断片との脂質の結合の研究に基づいて、いくつかのＬＡＰペプチドを設計し、Ｌ
ＡＰ−１６、ＬＡＰ−２０およびＬＡＰ−２４と命名した（それぞれ１６、２０
および２４アミノ酸残基を含有する）。これらのモデル両親媒性ペプチドはアポ
リポタンパク質と配列相同性を共有せず、アポリポタンパク質と結合するクラス
Ａ型両親媒性ヘリックスドメインとは異なる様相で組織された親水性面を有する
ように設計された。これらの研究から、著者らはモデル両親媒性ペプチドに脂質
結合特性を与えるためには最少で２０残基の長さが必要であると結論した。 配列中の別の位置にプロリン残基を１つ有するＬＡＰ２０の変異体の研究で、
脂質の結合とＬＣＡＴ活性化との間には直接の関係があるが、ペプチドのヘリッ
クス化能力のみではＬＣＡＴ活性が導かれないことが示された（Ｐｏｎｓｉｎら
、１９８６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１（２０）：９２０２−９２０５）
。さらに、このペプチドの中央部に近いヘリックスブレーカー（Ｐｒｏ）の存在
はリン脂質表面との親和性およびＬＣＡＴを活性化する能力を減退させた。ＬＡ
Ｐペプチドのあるものはリン脂質と結合することが示された（Ｓｐａｒｒｏｗら
、上記）が、脂質の存在下でどの程度のＬＡＰペプチドがヘリックス状にあるか
についての論争が存在している（Ｂｕｃｈｋｏら、１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２７１（６）：３０３９−３０４５；Ｚｈｏｎｇら、１９９４，Ｐｅｐ
ｔｉｄｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７（２）：９９−１０６）。 ＳｅｇｒｅｓｔらはＡｐｏＡ−Ｉのヘリックスと何ら配列相同性を共有しない
１８から２４アミノ酸残基で構成されるペプチドを合成した（Ｋａｎｎｅｌｉｓ
ら、１９８０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５（３）：１１４６４−１１４７
２；Ｓｅｇｒｅｓｔら、１９８３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：２２９０
−２２９５）。その配列はクラスＡ交換性アポリポタンパク質の両親媒性ヘリッ
クスドメインに疎水性モーメント（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら、１９８２，Ｎａｔｕ
ｒｅ ２９９：３７１−３７４）および電荷分布（Ｓｅｇｒｅｓｔら、１９９０
，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ８：１０３−１１７；米国特許第４，６４３，９８８号）
の点で模倣するように特別に設計された。１８残基ペプチドの１つ、「１８Ａ」
ペプチドはモデルクラスＡαヘリックスとなるように設計された（Ｓｅｇｒｅｓ
ｔら、１９９０，上記）。これらのペプチドおよび「１８Ｒ」ペプチドのような
逆荷電分布を有する別のペプチドによる研究で、活性のために電荷分布が重要で
あることが矛盾なく示された。逆電荷分布を有するペプチドは１８ＡクラスＡ模
倣体に比較して減少した脂質親和性および脂質の存在下でのより低いヘリックス
含有量を示した（Ｋａｎｎｅｌｉｓら、１９８０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
５５：１１４６４−１１４７２；Ａｎａｎｔｈａｒａｍａｉａｈら、１９８５，
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：１０２４８−１０２５５；Ｃｈｕｎｇら、１
９８５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：１０２５６−１０２６２；Ｅｐａｎ
ｄら、１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：９３８９−９３９６；Ａｎ
ａｎｔｈａｒａｍａｉａｈら、１９９１，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．
２８５：１３１−１４０）。 ある程度成功したものとして提案されたアポリポタンパク質と配列相同性を共
有しないその他の合成ペプチドとして、１８Ａペプチドの二量体および三量体（
Ａｎａｎｔｈａｒａｍａｉａｈら、１９８６，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｂｉｏ
ｌｏｇｉｃａｌ Ｆｌｕｉｄｓ ３４：６３−６６）、ＧＡＬＡおよびＥＡＬＡ
ペプチド（Ｓｕｂｂａｒａｏら、１９８８，ＰＲＯＴＥＩＮＳ：Ｓｔｒｕｃｔｕ
ｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３：１８７−１９８）お
よびＩＤペプチド（Ｌａｂｅｕｒら、１９９７，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓ
ｉｓ，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １
７：５８０−５８８）、そして１８ＡＭ４ペプチド（Ｂｒａｓｓｅｕｒら、１９
９３，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１７０：１−７）が含ま
れる。 ヒトＡｐｏＡ−Ｉ配列に基づく２２個のアミノ酸残基を含む「コンセンサス」
または「共通」ペプチドもまた設計された（Ｖｅｎｋａｔａｃｈａｌａｐａｔｈ
ｉら，１９９１，Ｍｏｌ．Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂｉｏ． Ｉｎ
ｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ Ｂ：５８５−５９６）。この配列はＡｐｏＡ−Ｉヘリッ
クスの各位置で最も優勢な残基を同定して構築された。上記のペプチドのように
、このペプチドによって形成されるヘリックスは親水性−疎水性界面に集まった
陽性荷電アミノ酸、親水性面の中心に集まった陰性荷電アミノ酸を有し、疎水性
角は１８０°未満である。このペプチドの二量体はＬＣＡＴを活性化する効果が
いくらかはあるが、モノマーは脂質結合特性が弱い（Ｖｅｎｋａｔａｃｈａｌａ
ｐａｔｈｉら、１９９１，上記）。 主として上記のペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ研究に基づいて、ＡｐｏＡ−Ｉの
機能を模倣するペプチドを設計するための一連の「基準」が生まれた。顕著なこ
とは、脂質親和性およびＬＣＡＴ活性化のためには、親水性−疎水性界面に集ま
った陽性荷電アミノ酸および極性面の中心に集まった陰性荷電アミノ酸を有する
両親媒性αヘリックスが必要なことである（Ｖｅｎｋａｔａｃｈａｌａｐａｔｈ
ｉら、１９９１，上記）。Ａｎａｎｔｈａｒａｍａｉａｈらはαヘリックスの疎
水性面内に位置する共通２２残基ペプチドの１３番位置の陰性荷電Ｇｌｕ残基が
ＬＣＡＴ活性化に重要な役割を持つことをも示した（Ａｎａｎｔｈａｒａｍａｉ
ａｈら、１９９１，上記）。さらに、Ｂａｓｓｅｕｒは最適の脂質−アポリポタ
ンパク質複合体の安定性のためには１８０°未満の疎水性角（ｐｈｏ角）が必要
であり、そして脂質二重層の端部のまわりにペプチドを有する平円盤状粒子の形
成の説明がつくことを示した（Ｂｒａｓｓｅｕｒ，１９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．６６（２４）：１６１２０−１６１２７）。ＲｏｓｓｅｎｅｕらもＬＣ
ＡＴの活性化のために１８０°未満の疎水性角が必要であることを主張した（Ｗ
Ｏ９３／２５５８１）。 しかし、今日までのこうした「基準」にもかかわらず、ＡｐｏＡ−Ｉと同様に
活性なペプチドを設計または製造したものはいない。最良のものでも本明細書に
記載したＬＣＡＴ活性化アッセイによって測定してＡｐｏＡ−Ｉの活性の４０％
未満である。文献中に記載されたペプチド「模倣体」のいずれも薬剤として有用
であると証明されていない。 前記の観点から、ＡｐｏＡ−Ｉの活性を模倣し、製造するのが比較的簡単でし
かも安価である、安定なＡｐｏＡ−Ｉアゴニストの開発の必要がある。しかし、
効果的なＡｐｏＡ−Ｉ模倣体を設計するための「基準」は解明されておらず、ま
たＡｐｏＡ−Ｉの機能を有する有機分子を設計するための原理も未知である。 ３．発明の概要 本発明は心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、高脂血症、および敗
血症ショックのような他の疾患を含む異常リポタンパク質血症に関連する疾患の
治療に、ＡｐｏＡ−Ｉの活性を模倣するペプチドであるＡｐｏＡ−Ｉアゴニスト
を含むよう改変した天然ＡｐｏＡ−Ｉ；天然ＡｐｏＡ−Ｉの活性を超えるペプチ
ドであるＡｐｏＡ−Ｉ超アゴニスト；および１以上のＡｐｏＡ−Ｉアゴニストの
ヌクレオチド配列で置換された１以上の両親媒性ヘリックスを有する改変型天然
ＡｐｏＡ−Ｉを含む天然型アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ＡｐｏＡ−Ｉ）の改変型
：成熟ＡｐｏＡ−Ｉ、プレプロＡｐｏＡ−ＩおよびプロＡｐｏＡ−Ｉをコードす
るヌクレオチド配列を供給する遺伝学的アプローチに関する。 特に、本発明は改変した天然型ＡｐｏＡ−Ｉタンパク質、および天然ＡｐｏＡ
−Ｉの活性に近いか、またはそれを超える、例えばプレβ様またはＨＤＬ様複合
体を形成させ、コレステロールの流出を促進し、脂質へ結合させ、ＬＣＡＴ活性
を増強、さらにＨＤＬの血清レベルを増加させる両親媒性α−ヘリックスを形成
できるＡｐｏＡ−Ｉアゴニストとして作用する（脂質の存在下）ペプチドをコー
ドするヌクレオチド配列を供給する遺伝学的アプローチに関する。 本発明はまた１以上のＡｐｏＡ−Ｉアゴニストのヌクレオチド配列で置換され
た１以上の両親媒性ヘリックスを有する改変型天然ＡｐｏＡ−Ｉをコードするヌ
クレオチド配列に関する。 本発明は改変型ＡｐｏＡ−ＩまたはＡｐｏＡ−Ｉアゴニストまたはスーパーア
ゴニストとして作用するペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡベ
クターまたはカセットに関する。本発明はさらに天然ＡｐｏＡ−Ｉ遺伝子の改変
型をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡベクターまたはカセットに関する
。ＤＮＡベクターまたはカセットは高レベルのＡｐｏＡ−Ｉ発現をもたらす強い
調節エレメントの制御下で天然ＡｐｏＡ−Ｉの改変型またはＡｐｏＡ−Ｉアゴニ
ストをコードすると考えられる。生産効率を上げるためにＤＮＡ発現ベクターま
たはカセットが多くの単位のペプチドをコードするよう設計することができ、例
えばカセットはいくつかのＡｐｏＡ−Ｉペプチドを縦列にコードするヌクレオチ
ド配列を含んでおり、リボソーム結合部位内で分離されるため、いくつかのペプ
チドが同じカセットによりコードされ得る。ベクターまたはカセットはまたＡｐ
ｏＡ−Ｉペプチドをモノポリマー（反復ペプチド単位）またはヘテロポリマー（
異なるペプチド単位）として発現できる。本発明のペプチドが天然ＡｐｏＡ−Ｉ
タンパク質と同様に処理されるように、本発明のカセットはさらにプレプロペプ
チドまたはプロペプチドＡｐｏＡ−Ｉ配列をもコードする。 本発明はさらに、改変した天然型ＡｐｏＡ−Ｉ；成熟ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ
−Ｉの活性に似たプレプロ型またはプロ型ペプチド、または天然ＡｐｏＡ−Ｉ遺
伝子産物を発現する遺伝子操作された宿主細胞に関する。宿主細胞はｉｎ ｖｉ
ｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおいて遺伝子操作すればよい。本発明はまた本発
明のＡｐｏＡ−Ｉペプチドを発現するよう操作されたトランスジェニック動物に
関する。 本発明はまた、単量体またはヘテロマー型のＡｐｏＡ−ＩまたはＡｐｏＡ−Ｉ
アゴニストペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む操作型ウイルスベクターまた
はリポソームを投与することを含む遺伝子治療のためのｉｎ ｖｉｖｏ送達適用
に関する。本発明は天然ＡｐｏＡ−Ｉ遺伝子の改変型、単量体またはヘテロマー
型のＡｐｏＡ−Ｉアゴニストを発現させるために患者または適合宿主由来の操作
細胞を提供するｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子治療アプローチに関する。ｅｘ ｖｉｖｏ
遺伝子治療アプローチでは単量体またはヘテロマー型のＡｐｏＡ−Ｉアゴニスト
およびさらにＡｐｏＡ−Ｉ前駆配列を含む本発明のＡｐｏＡ−Ｉ遺伝子を発現す
るよう遺伝子操作された「細胞嚢」の送達もまた包含されよう。好ましい実施形
態では、ヒト肝細胞がＡｐｏＡ−Ｉアゴニストを発現するよう操作され得る。 本発明は一部、らせん構造およびＡｐｏＡ−Ｉの両親媒性らせん領域の両親媒
性特性を模倣するペプチドについての出願者の構想および発見に基づいている。
驚くべきことに本発明のペプチドはＡｐｏＡ−Ｉ活性を有する、すなわちＨＤＬ
様複合体を形成させ、コレステロールの流出を促進させる。これらは文献に記載
されたＡｐｏＡ−Ｉ誘導ペプチドは前記で詳しく報告されている。実際、本発明
のいくつかの実施形態では、天然ＡｐｏＡ−Ｉの活性の１００％に近く、一方本
明細書に記載のスーパーアゴニストはＡｐｏＡ−Ｉの特異活性を超えている。 本発明は本発明の核酸によりコードされるＡｐｏＡ−Ｉペプチドおよびアゴニ
ストのｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ活性ならびに効力を記載する実施
例により示される。例示された実施形態の構成および活性に基づき、出願者らは
本発明の範囲内でもある変更または変異形態を設計するのに使用できる一連の「
ルール」を考案した。 本発明は、かかる処方の製造方法および異常リポタンパク質血症に関連する疾
患（例えば心血管疾患、アテローム性動脈硬化症）、再狭窄、高脂血症、高トリ
グリセリド血症および／または内毒素血症（例えば敗血症ショック）を治療する
ために使用し、かつ、有効成分として、天然ＡｐｏＡ−Ｉの改変型、すなわち成
熟ＡｐｏＡ−Ｉ、プレプロ型ＡｐｏＡ−Ｉまたはプロ型ＡｐｏＡ−Ｉ、もしくは
ＡｐｏＡ−Ｉアゴニスト（ペプチドまたはペプチド−脂質複合体のいずれか）を
コードする細胞系およびベクターを含む医薬製剤に関する。 ３．１．略語 本明細書で使用される遺伝学的にコードされたアミノ酸についての略語は次の
通りである： ３．２．定義 本明細書中で用いられる、下記の語句は下記の意味を有する。 「親水性（ｈｙｄｒｏｐｈｏｐｈｉｌｉｃ）アミノ酸」とは、脂質が存在する
ときに、水相又はリン脂質の極性頭部と結合する傾向のある側鎖を有するアミノ
酸をいう。遺伝学的にコードされた親水性アミノ酸としては、Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇ
ｌｕ（Ｅ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌ
ｎ（Ｑ）、Ｓｅｒ（Ｓ）及びＴｈｒ（Ｔ）を含む。 「酸性アミノ酸」とは、側鎖がｐＫ値が７未満であるアミノ酸をいう。酸性ア
ミノ酸は、水素イオンの喪失により生理学的ｐＨでマイナス荷電した側鎖を典型
的に有する。遺伝学的にコードされた酸性アミノ酸としては、Ｇｌｕ（Ｅ）及び
Ａｓｐ（Ｄ）を含む。 「塩基性アミノ酸」とは、側鎖がｐＫ値が７を超えるアミノ酸をいう。塩基性
アミノ酸は、ヒドロニウムイオンとの結合のため、生理学的ｐＨで、プラス荷電
した側鎖を典型的に有する。遺伝学的にコードされた塩基性アミノ酸としては、
Ａｒｇ（Ｒ）及びＬｙｓ（Ｋ）を含む。 「極性アミノ酸」とは、生理学的ｐＨで荷電しないが、２つの原子に共通に共
有されている電子対が、そのうちの一方の原子によってより近くに保持されてい
る、少なくとも１つの結合を有する側鎖を有するアミノ酸をいう。遺伝学的にコ
ードされている極性アミノ酸としては、Ａｓｎ（Ｎ）及びＧｌｎ（Ｑ）を含む。 「疎水性アミノ酸」とは、脂質が存在するときに、リン脂質のアシル鎖と結合
する傾向のある側鎖を有するアミノ酸をいう。遺伝学的にコードされる疎水性ア
ミノ酸としては、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、
Ｖａｌ（Ｖ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ａｌａ（Ａ）及び
Ｐｒｏ（Ｐ）を含む。 「芳香族アミノ酸」とは、少なくとも１つの芳香環又はヘテロ芳香環を有する
側鎖を有する疎水性アミノ酸をいう。芳香環又はヘテロ芳香環は、１個以上の置
換基を含むことができる。遺伝学的にコードされた芳香族アミノ酸としては、Ｐ
ｈｅ（Ｆ）、Ｔｙｒ（Ｙ）及びＴｒｐ（Ｗ）を含む。 「非極性アミノ酸」とは、生理学的ｐＨで荷電せず、２つの原子に共通の共有
されている電子対が、一般に２つの原子でそれぞれに同等に保持されている（す
なわち、側鎖が非極性である）側鎖を有する疎水性アミノ酸をいう。 「脂肪族アミノ酸」とは、脂肪族炭化水素側鎖を有する疎水性アミノ酸をいう
。遺伝学的にコードされた脂肪族アミノ酸としては、Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ
）、Ｌｅｕ（Ｌ）及びＩｌｅ（Ｉ）を含む。 ５．発明の詳細な説明 本発明は、高コレステロール血症と関連する疾患の治療のための、天然のＡｐ
ｏＡ−Ｉ遺伝子の改変型をコードするヌクレオチド配列、ＡｐｏＡ−Ｉの機能及
び活性を模倣するか、又は天然のＡｐｏＡ−Ｉの機能及び活性を上回るＡｐｏＡ
−Ｉアゴニストをコードするヌクレオチド配列を提供する遺伝子治療アプローチ
に関する。 本発明のヌクレオチド配列は、（脂質の存在下で）両親媒性ヘリックスを形成
し、脂質と結合し、プレβ様複合体又はＨＤＬ様複合体を形成し、ＬＣＡＴを活
性化し、血清ＨＤＬ濃度を増加させ、コレステロール流出を促進するペプチドを
コードする。 コードされたペプチドの生物学的機能は、それらのヘリックス構造か、又は脂
質の存在下でのヘリックス構造への変換と相互に関連があると思われる。 少なくとも３つのタイプのＤＮＡベクター又はカセットが、本発明に従って設
計、構築でき、天然のヒトＡｐｏＡ−Ｉ遺伝子のヌクレオチド配列；ＡｐｏＡ−
Ｉの天然又はプロフォームの改変型；プレプロフォーム及びプロフォーム中のＡ
ｐｏＡ−Ｉアゴニストをコードするヌクレオチド配列；及びＡｐｏＡ−Ｉアゴニ
スト及びスーパーアゴニストをコードするヌクレオチド配列を含ませることがで
きる。ＤＮＡベクター又はカセットはまた、製造効率を高めるため、ホモポリマ
ー（反復ペプチドユニット）又はヘテロポリマー（異なるペプチドユニット）と
してＡｐｏＡ−Ｉペプチドを発現することもできる。 本発明はさらに、本発明のＡｐｏＡ−Ｉペプチドアゴニストを発現する遺伝操
作された宿主細胞に関する。宿主細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏ
で操作され得る。本発明はさらに、宿主中でＡｐｏＡ−Ｉペプチドアゴニストを
発現させるｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏ遺伝子治療アプローチに関する
。本発明はまた、天然ＡｐｏＡ−Ｉ又はそのプロフォームの改変型及び本発明の
ＡｐｏＡ−Ｉペプチドアゴニストを発現するように操作されたトランスジェニッ
ク動物に関する。 本発明のＡｐｏＡ−Ｉアゴニストをコードするヌクレオチド配列は、裸の（ｎ
ａｋｅｄ）ＲＮＡ又はＤＮＡ配列として、ウイルスベクターなどのベクター中に
、又はトランスフェクションされた細胞によって提供され得る。本発明は、医薬
製剤及び該製剤の異常リポタンパク質血症（ｄｙｓｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｅｍ
ｉａ）、高脂血症、高コレステロール血症、冠状動脈性心臓病、アテローム性動
脈硬化症、及び内毒素血症／敗血症性ショックなどの他の症状の治療における使
用を含む。 本発明は、本発明のＡｐｏＡ−Ｉアゴニストは、血漿のＨＤＬ成分と関連して
おり、ＨＤＬ及びプレβ顆粒（ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）の濃度を増加させることが
できるという本出願人らの知見にある程度基づいている。本発明のＡｐｏＡ−Ｉ
アゴニストは、肝外組織からのコレステロール流出を増加させる。アゴニストは
また、ＬＣＡＴを活性化するのに非常に有効であり、そしてこのようにしてＲＣ
Ｔを促進する。動物モデル中のｉｎ ｖｉｖｏでの本発明のＡｐｏＡ−Ｉアゴニ
ストの使用は、血清ＨＤＬ濃度の増加をもたらす。 本発明を、以下のサブセクションにおいてさらに詳細に述べる。サブセクショ
ンでは次のことについて記載する：ＡｐｏＡ−Ｉの天然型、ＡｐｏＡ−Ｉのプレ
プリフォーム、天然ＡｐｏＡ−Ｉ又はＡｐｏＡ−Ｉのプロフォームの改変型及び
ＡｐｏＡ−Ｉペプチドアゴニストをコードするヌクレオチド配列、これらのヌク
レオチド配列を発現するように設計され得るベクター及び細胞系列；これらのヌ
クレオチド配列を提供するｉｎ ｖｉｖｏ及びｅｘ ｖｉｖｏでの遺伝子治療ア
プローチ；並びにバルク及び単回用量製剤の調製方法、及び使用方法。 ５．１．ＡｐｏＡ−Ｉ及びＡｐｏＡ−Ｉアゴニストをコードするヌクレオチド配
列 本発明のヌクレオチド配列は、脂質の存在下で両親媒性α−ヘリックスの領域
を形成でき、かつＡｐｏＡ−Ｉ活性を模倣するＡｐｏＡ−Ｉペプチド又はＡｐｏ
Ａ−Ｉアゴニストをコードする。ＡｐｏＡ−Ｉアゴニスト及びＡｐｏＡ−Ｉペプ
チドをコードするヌクレオチド配列を、本明細書中に記載する。 本発明はまた、発現された遺伝子産物のＡｐｏＡ−Ｉ様活性を増強又は増加さ
せるうに、すなわち（脂質の存在下で）両親媒性ヘリックスを形成し、脂質と結
合し、プレβ様複合体又はＨＤＬ様複合体を形成し、ＬＣＡＴを活性化し、血清
ＨＤＬ濃度を増加させ、コレステロール流出を促進するように改変された、全長
のＡｐｏＡ−Ｉ遺伝子をコードするヌクレオチド配列（配列番号＿（図１））を
も包含する。本発明はまた、天然ＡｐｏＡ−Ｉの改変型をコードするヌクレオチ
ド配列、すなわち、少なくとも２個のＡｐｏＡ−Ｉアゴニストによって置換され
た１又は２以上の両親媒性ヘリックスを有する改変されたＡｐｏＡ−Ｉをコード
するヌクレオチド配列をも包含する。 本発明はまた、本発明の１又は２以上のＡｐｏＡ−Ｉアゴニストをコードする
ように改変されているＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＡ−ＩＩＩ、ＡｐｏＡ−ＩＶ、Ａ
ｐｏＢ、ＡｐｏＣ−Ｉ、ＡｐｏＣ−ＩＩ、ＡｐｏＣ−ＩＩＩ、ＡｐｏＤ及びＡｐ
ｏＥの改変型をコードするヌクレオチド配列に関する（例えば、参照によってそ
の全体が本明細書中に組み入れられる、Ｌｕｓｉｓ，１９８８，Ｊ ｏｆ Ｌｉ
ｐｉｄＲｅｓ．２９：３９７−４２８を参照されたい）。 本発明のヌクレオチド配列はまた、構造Ｉで示されるコアペプチド（例えば、
配列番号＿（図２））、構造ＩＩで示されるコアペプチド（例えば、配列番号＿
（図３））又は構造ＩＩＩで示されるコアペプチド（例えば、配列番号＿（図４
））をコードするヌクレオチド配列をも包含する。 本発明はまた、 （ａ）任意の前記ＡｐｏＡ−Ｉコード配列及び／又はそれらの相補体（ｃｏｍ
ｐｌｅｍｅｎｔｓ）（すなわち、アンチセンス）を含むＤＮＡベクター； （ｂ）コード配列の発現を指令する調節エレメントと作動可能に連結されてい
る任意の前記ＡｐｏＡ−Ｉコード配列を含むＤＮＡ発現ベクター； （ｃ）幾つかの同一コード配列が同一カセットから発現できるか、又は異なる
ＡｐｏＡ−Ｉアゴニストを発現する幾つかの異なるコード配列が、同一カセット
から発現できるように、内部リボソーム結合部位によって分離された縦に一列に
並んだＡｐｏＡ−ＩアゴニストをコードするＤＮＡ発現ベクター又はカセット； （ｄ）その宿主細胞中でのコード配列の発現を指令する調節エレメントに作動
可能に連結された任意の前記ＡｐｏＡ−Ｉコード配列を含む遺伝子操作された宿
主細胞をも包含する。 本明細書中で用いられる、調節エレメントは、これらに限定されないが、誘導
性及び非誘導性プロモーター、エンハンサー、オペレーター及び発現を駆動及び
調節する当業者に公知の他のエレメントを含む。そのような調節エレメントは、
これらに限定されないが、サイトメガロウイルスｈＣＭＶ前初期遺伝子、ＳＶ４
０アデノウイルスの初期又は後期プロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ系
、ＴＲＣ系、ファージＡの主なオペレーター及びプロモーター領域、ｆｄコート
タンパク質の調節領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼのプロモーター、酸性
ホスファターゼのプロモーター、及び酵母α接合因子のプロモーターを含む。 ５．１．１． 天然ＡｐｏＡ−Ｉ遺伝子 ＡｐｏＡ−Ｉ遺伝子は、ＨＤＬの主タンパク質成分をコードし、コレステロー
ル流出及び血清ＨＤＬ濃度の調節と関連している。本発明のＡｐｏＡ−Ｉ遺伝子
をコードする核酸は、本明細書中では、異常脂質血症（ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉ
ａ）と関連する障害の治療のための遺伝子治療アプローチでの使用に記載されて
いる。本明細書中で用いられる本発明のＡｐｏＡ−Ｉ遺伝子は、これらに限定さ
れないが、 （ａ）ヒトＡｐｏＡ−ＩをコードするｃＤＮＡを含む核酸分子、全長のヒトＡ
ｐｏＡ−Ｉ ｃＤＮＡは、少なくとも１つの２２個のアミノ酸反復をコードする
ヌクレオチド配列が、本発明のＡｐｏＡ−Ｉアゴニストをコードするヌクレオチ
ド配列によって置換されている、８４２個のヌクレオチドを含む（配列番号＿（
図１））（参照によってその全体が本明細書中に組み入れられる、Ｓｈｏｕｌｄ
ｅｒｓら，１９８３，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １１：
２８２７−２８３７を参照されたい）を含む； （ｂ）１８５個及び５８８個のヌクレオチドからなる少なくとも２つのイント
ロンを含むヒトＡｐｏＡ−Ｉのゲノム配列を含む核酸分子（参照によってその全
体が本明細書中に組み入れられる、Ｓｈｏｕｌｄｅｒら，１９８３，Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １１：２８２７−２８３７を参照された
い）； （ｃ）天然ヒトＡｐｏＡ−Ｉ中に見られる１〜８個の異なる２２個のアミノ酸
反復をコードするＤＮＡ配列を含む核酸分子、そしてそれは、１以上の反復の間
で見られるリンカー又はスペーサー部分をコードするＤＮＡ配列をさらに含むこ
とができる； （ｄ）少なくとも１つの両親媒性ヘリックスが、少なくとも１つのＡｐｏＡ−
Ｉアゴニストの配列によって置換されている、改変ＡｐｏＡ−ＩをコードするＤ
ＮＡ配列を含む核酸分子； （ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）の全部又は部分、及び追加的に、
ＡｐｏＡ−Ｉのアミノ末端の最初の１８個のアミノ酸を含むプレプロペプチドセ
グメント又はリーダーペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む核酸分子。ヒトＡ
ｐｏＡ−Ｉのリーダーペプチド、５’ＭＫＡＡＶＬＴＬＡＶＬＦＬＴＧＳＱＡ３
’（配列番号＿）は、宿主細胞からのＡｐｏＡ−Ｉ分泌後に開裂される； （ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）または（ｅ）の全部又は部分、及び追
加的に、成熟ＡｐｏＡ−Ｉをもたらす特異的プロテアーゼによって開裂される、
６個のアミノ酸配列、５’ＲＨＦＷＱＱ３’、を含むプロペプチドセグメントを
コードするＤＮＡ配列を含む核酸分子；及び／又は （ｇ）ＡｐｏＡ−Ｉペプチドと機能的に等価な遺伝子産物をコードするＤＮＡ
配列を含む核酸分子を含む。 本明細書中で用いられる、用語「ＡｐｏＡ−Ｉペプチドと機能的に等価」とは
、（脂質の存在下での）両親媒性ヘリックスの形成、脂質への結合、プレβ様複
合体又はＨＤＬ様複合体の形成、ＬＣＡＴの活性化、血清ＨＤＬ濃度の増加及び
コレステロール流出の促進を含む、ＡｐｏＡ−Ｉペプチドの生物学的活性の１つ
を示す遺伝子産物をいう。この態様によれば、本発明はまた、１又は２以上の本
発明のＡｐｏＡ−Ｉアゴニストをコードするように改質された、ＡｐｏＡ−ＩＩ
、ＡｐｏＡ−ＩＩＩ、ＡｐｏＡ−ＩＶ、ＡｐｏＢ、ＡｐｏＣ−Ｉ、ＡｐｏＣ−Ｉ
Ｉ、ＡｐｏＣ−ＩＩＩ、ＡｐｏＤ及びＡｐｏＥの改変型をコードするヌクレオチ
ド配列をも含む。 本発明はまた、上記天然ＡｐｏＡ−ＩをコードするＤＮＡ配列にハイブリダイ
ズし、それ故その相補体である核酸分子、好ましくはＤＮＡ分子をも含む。その
ようなハイブリダイゼーション条件は、上記のように、高度にストリンジェント
であってもよいし、又はそれほど高度にストリンジェントでなくてもよい。核酸
分子がデオキシオリゴヌクレオチド（「オリゴ類」）の例では、例えば、６ｘＳ
ＳＣ／０．０５％ピロリン酸ナトリウム中、３７℃で（１４塩基オリゴの場合）
、４８℃で（１７塩基オリゴの場合）、５５℃で（２０塩基オリゴの場合）、及
び６０℃で（２３塩基オリゴの場合）洗浄する、という高度にストリンジェント
な条件に言及できる。これらの核酸分子は、例えば、ＡｐｏＡ−Ｉ遺伝子調節に
おいて、ＡｐｏＡ−Ｉ核酸配列の増幅反応のアンチセンスプライマーにとって及
び／又はＡｐｏＡ−Ｉ核酸配列の増幅反応のアンチセンスプライマーとして有用
な、ＡｐｏＡ−Ｉアゴニストアンチセンス分子として作用し得る。ＡｐｏＡ−Ｉ
遺伝子調節に関して、そのような技術を使用し、例えば高コレステロール血症疾
患を調節できる。さらに、そのような配列は、リボザイム及び／又は三重らせん
配列の一部として使用でき、ＡｐｏＡ−Ｉアンタゴニスト特性を示し得るＡｐｏ
Ａ−Ｉの突然変異型の遺伝子調節に有用でもある。さらにまた、そのような分子
は、例えば、高コレステロール血症疾患を引き起こす原因である特定の突然変異
ＡｐｏＡ−Ｉ対立遺伝子の存在がそれによって検出できる、診断方法の構成成分
として使用できる。 本明細書中に記載されたそれらのヒト配列に加えて、別のＡｐｏＡ−Ｉ遺伝子
配列を、過度な実験を行うこと無しに、当業界で周知の分子生物学的技術によっ
て同定でき、容易に単離できる。 ５．１．２． ＡｐｏＡ−Ｉペプチド及びＡｐｏＡ−Ｉアゴニスト ヌクレオチド配列は、それらの主たる特徴として１５〜２３個のアミノ酸残基
からなる「コア」ペプチドを有するＡｐｏＡ−Ｉペプチド又はアゴニストをコー
ドし得る。このコアペプチドのアミノ酸配列は、本出願人らが見出したペプチド
ファミリーが、ＡｐｏＡ−Ｉの構造及び両親媒性ヘリックス特性を模倣し、そし
て天然ＡｐｏＡ−Ｉの特異的活性に近づくか、又はある実施態様においては、そ
れを上回りさえする特異的活性を示すペプチドファミリーのアミノ酸配列に基づ
いている。 ＡｐｏＡ−Ｉペプチド及びアゴニストをコードする本発明のヌクレオチド配列
は、多量体の形態でそれら自身で発現され得るか、又は天然ＡｐｏＡ−Ｉ又はＡ
ｐｏＡ−Ｉのプロフォームをコードするヌクレオチド配列とのキメラとして発現
され得る。 本発明のＡｐｏＡ−Ｉアゴニストは、活性にとって重要であると考えられてい
たＶｅｎｋａｔａｃｈａｌａｐａｔｈｉら（１９９１，Ｍｏｌ．Ｃｏｎｆｏｒｍ
ａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ Ｂ：５８５−５９
６）の２２−ｍｅｒ共通配列からなる一次配列（ＰＶＬＤＥＦＲＥＫＬＮＥＥＬ
ＥＡＬＫＱＫＬＫ；配列番号７５；以下「セグレストの（Ｓｅｇｒｅｓｔ’ｓ）
共通２２−ｍｅｒ」又は「共通２２−ｍｅｒ」という）中のあるアミノ酸残基の
改変が、天然ＡｐｏＡ−Ｉの活性に近づくか、ある実施態様においてはそれを超
えさえする活性を示す合成ペプチドをもたらすという本出願人らの驚くべき知見
にある程度基づいている。特に、本出願人らは、Ｓｅｇｒｅｓｔの共通２２−ｍ
ｅｒペプチド中の３つの荷電アミノ酸残基（Ｇｌｕ−５、Ｌｙｓ−９及びＧｌｕ
−１３）を、疎水性ロイシン残基で置換することによって、当業界で前例のない
程度までＡｐｏＡ−Ｉの構造及び機能特性を模倣したペプチドを提供できること
を見出した。 いかなる特定の理論にも拘束されるものではないが、本発明のＡｐｏＡ−Ｉア
ゴニストにより形成されるヘリックスは、文献に記載されているＡｐｏＡ−Ｉ疑
似ペプチドによって形成されるα−ヘリックスよりも、天然のＡｐｏＡ−Ｉの両
親媒性ヘリックス領域（これは脂質との結合、コレステロールの流出およびＬＣ
ＡＴ活性化を生じるのに重要である）の構造的および機能的特性に近いものであ
り、そのため、これらの他のペプチドよりも有意に高いＡｐｏＡ−Ｉ様活性を示
すペプチドを生じると思われる。事実、本発明のＡｐｏＡ−Ｉアゴニストの多く
はＡｐｏＡ−Ｉの活性に近く、幾つかの実施形態ではそれを上回っているのに対
して、現在までの文献に記載されている最良のペプチドＡｐｏＡ−Ｉ疑似体であ
るペプチド１８ＡＭ４（ＥＷＬＥＡＦＹＫＫＶＬＥＫＬＫＥＬＦ；配列番号２４
６）（Ｃｏｒｉｎｊｎら，１９９３，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔ
ａ １１７０：８−１６；Ｌａｂｅｕｒら，Ｏｃｔ．１９９４，Ａｒｔｅｒｉｏ
ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ： Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｏ．１８６および１８７）およびＮ−アセチル化Ｃ−ア
ミド化ペプチド１８ＡＭ４（配列番号２３９）（Ｂｒａｓｓｅｕｒ，１９９３，
Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１７０：１−７）は、本明細書
中に記載のＬＣＡＴ活性化アッセイにより測定した場合に、それぞれＡｐｏＡ−
Ｉの活性の４％未満および１１％未満しか示さない。 本発明の具体的実施態様では、ヌクレオチド配列は、下記構造式を有する本発
明のＡｐｏＡ−Ｉアゴニストを含むコアペプチド（又はその類似体）をコードす
る： （Ｉ）Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｘ_５−Ｘ_６−Ｘ_７−Ｘ_８−Ｘ_９−Ｘ_１０−Ｘ_１
１−Ｘ_１２−Ｘ_１３−Ｘ_１４−Ｘ_１５−Ｘ_１６−Ｘ_１７−Ｘ_１８−Ｘ_１９−Ｘ_２
０−Ｘ_２１−Ｘ_２２ ［式中、 Ｘ_１は、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ａｌａ（Ａ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ａｓｐ
（Ｄ）又はＡｓｎ（Ｎ）であり； Ｘ_２は、脂肪族アミノ酸であり； Ｘ_３は、Ｌｅｕ（Ｌ）又はＰｈｅ（Ｆ）であり； Ｘ_４は、酸性アミノ酸であり； Ｘ_５は、Ｌｅｕ（Ｌ）又はＰｈｅ（Ｆ）であり； Ｘ_６は、Ｌｅｕ（Ｌ）又はＰｈｅ（Ｆ）であり； Ｘ_７は、親水性アミノ酸であり； Ｘ_８は、酸性又は塩基性アミノ酸であり； Ｘ_９は、Ｌｅｕ（Ｌ）又はＧｌｙ（Ｇ）であり； Ｘ_１０は、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｔｒｐ（Ｗ）又はＧｌｙ（Ｇ）であり； Ｘ_１１は、親水性アミノ酸であり； Ｘ_１２は、親水性アミノ酸であり； Ｘ_１３は、Ｇｌｙ（Ｇ）又は脂肪族アミノ酸であり； Ｘ_１４は、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｔｒｐ（Ｗ）又はＧｌｙ（Ｇ）であり； Ｘ_１５は、疎水性アミノ酸であり； Ｘ_１６は、疎水性アミノ酸であり； Ｘ_１７は、疎水性アミノ酸であり； Ｘ_１８は、塩基性アミノ酸、Ｇｌｎ（Ｑ）又はＡｓｎ（Ｎ）であり； Ｘ_１９は、塩基性アミノ酸、Ｇｌｎ（Ｑ）又はＡｓｎ（Ｎ）であり； Ｘ_２０は、塩基性アミノ酸であり； Ｘ_２１は、脂肪族アミノ酸であり；そして Ｘ_２２は、塩基性アミノ酸である。］ 構造（Ｉ）のコアペプチド中の、アミノ酸残基の間の記号「−」は、一般にバ
ックボーンの構成的連結機能を示す。すなわち、記号「−」は、通常、ペプチド
結合又はアミド結合を示す。 本発明は、構造（Ｉ）のペプチドと機能的に等価なペプチドをコードするヌク
レオチド配列を包含する。より詳細な説明としては、参照によってその全体が本
明細書中に組み入れられる、米国特許出願第 号、２５頁、６行〜５８頁
、２１行を参照されたい。 本発明のさらなる具体的実施態様では、ヌクレオチド配列は、下記構造式を有
する本発明のＡｐｏＡ−Ｉアゴニストを含むコアペプチド（又はその類似体）を
コードする： （ＩＩ）Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｘ_５−Ｘ_６−Ｘ_７−Ｘ_８−Ｘ_９−Ｘ_１０−Ｘ
_１１−Ｘ_１２−Ｘ_１３−Ｘ_１４−Ｘ_１５−Ｘ_１６−Ｘ_１７−Ｘ_１８−Ｘ_１９−Ｘ
_２０−Ｘ_２１−Ｘ_２２ ［式中、 Ｘ_１は、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ａｌａ（Ａ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ａｓｎ
（Ｎ）又はＡｓｐ（Ｄ）であり； Ｘ_２は、脂肪族アミノ酸であり； Ｘ_３は、Ｌｅｕ（Ｌ）又はＰｈｅ（Ｆ）であり； Ｘ_４は、Ｇｌｕ（Ｅ）であり； Ｘ_５は、脂肪族アミノ酸であり； Ｘ_６は、Ｌｅｕ（Ｌ）又はＰｈｅ（Ｆ）であり； Ｘ_７は、Ｇｌｕ（Ｅ）又はＬｅｕ（Ｌ）であり； Ｘ_８は、Ａｓｎ（Ｎ）又はＧｌｎ（Ｑ）であり； Ｘ_９は、Ｌｅｕ（Ｌ）であり； Ｘ_１０は、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｔｒｐ（Ｗ）又はＧｌｙ（Ｇ）であり； Ｘ_１１は、酸性アミノ酸であり； Ｘ_１２は、Ａｒｇ（Ｒ）であり； Ｘ_１３は、Ｌｅｕ（Ｌ）又はＧｌｙ（Ｇ）であり； Ｘ_１４は、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｐｈｅ（Ｆ）又はＧｌｙ（Ｇ）であり； Ｘ_１５は、Ａｓｐ（Ｄ）であり； Ｘ_１６は、Ａｌａ（Ａ）であり； Ｘ_１７は、Ｌｅｕ（Ｌ）であり； Ｘ_１８は、Ａｓｎ（Ｎ）又はＧｌｎ（Ｑ）であり； Ｘ_１９は、塩基性アミノ酸であり； Ｘ_２０は、塩基性アミノ酸であり； Ｘ_２１は、Ｌｅｕ（Ｌ）であり；そして Ｘ_２２は、塩基性アミノ酸である。］ 各「−」は、独立して、ペプチド結合又はアミド結合を示す。 本発明は、構造（ＩＩ）で示されるペプチドと機能的に等価なペプチドをコー
ドするヌクレオチド配列を含む。より詳細な説明としては、参照によってその全
体が本明細書中に組み入れられる、米国特許出願第 号、２５頁、６行〜
５８頁、２１行を参照されたい。 本発明のまたさらなる具体的実施態様では、ヌクレオチド配列は、下記構造式
を有する本発明のＡｐｏＡ−Ｉアゴニストを含むコアペプチド（又はその類似体
）をコードする： （ＩＩＩ）Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｘ_５−Ｘ_６−Ｘ_７−Ｘ_８−Ｘ_９−Ｘ_１０−
Ｘ_１１−Ｘ_１２−Ｘ_１３−Ｘ_１４−Ｘ_１５−Ｘ_１６−Ｘ_１７−Ｘ_１８ ［式中、 Ｘ_１は、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ａｌａ（Ａ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ａｓｎ（Ｎ）又はＧｌ
ｎ（Ｑ）であり； Ｘ_２は、脂肪族アミノ酸であり； Ｘ_３は、Ｌｅｕ（Ｌ）であり； Ｘ_４は、酸性アミノ酸であり； Ｘ_５は、Ｌｅｕ（Ｌ）又はＰｈｅ（Ｆ）であり； Ｘ_６は、Ｌｅｕ（Ｌ）又はＰｈｅ（Ｆ）であり； Ｘ_７は、塩基性アミノ酸であり； Ｘ_８は、酸性アミノ酸であり； Ｘ_９は、Ｌｅｕ（Ｌ）又はＴｒｐ（Ｗ）であり； Ｘ_１０は、Ｌｅｕ（Ｌ）又はＴｒｐ（Ｗ）であり； Ｘ_１１は、酸性アミノ酸又はＡｓｎ（Ｎ）であり； Ｘ_１２は、酸性アミノ酸であり； Ｘ_１３は、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｔｒｐ（Ｗ）又はＰｈｅ（Ｆ）であり； Ｘ_１４は、塩基性アミノ酸又はＬｅｕ（Ｌ）であり； Ｘ_１５は、Ｇｌｎ（Ｑ）又はＡｓｎ（Ｎ）であり； Ｘ_１６は、塩基性アミノ酸であり； Ｘ_１７は、Ｌｅｕ（Ｌ）であり；そして Ｘ_１８は、塩基性アミノ酸である。 各「−」は、独立してペプチド結合又はアミド結合を示す。 本発明は、構造（ＩＩＩ）で示されるペプチドと機能的に等価なペプチドをコ
ードするヌクレオチド配列を包含する。より詳細な説明としては、参照によって
その全体が本明細書中に組み入れられる、米国特許出願第 号、２４頁の
３１行〜５８頁、３行を参照されたい。 構造（Ｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）で示されるコアペプチドは、指定クラス
のアミノ酸に関しては、ある程度規定される。種々の指定クラスの定義は、構造
（Ｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）で示される成熟型又は改変型の実施態様の説明
と関連して、下記に示す。 構造（Ｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）中の他の全ての文字は、前述したように
、当業界で共通に使用されている１文字アミノ酸略号を示す。ペプチドのヌクレ
オチド配列を、下記のように推論することができる： 表Ｉ いかなる特定の学説によって縛られることも意図していないが、本発明のヌク
レオチド配列は、文献記載のペプチドによって形成されたα−ヘリックスよりも
、脂質結合、コレステロール流出及びＬＣＡＴ活性化を行うのに重要な天然Ａｐ
ｏＡ−Ｉのヘリックス領域の構造及び両親媒性特性をよりいっそう模倣する、脂
質の存在下で両親媒性α−ヘリックスを形成するペプチドをコードし、それによ
って、これら他のペプチドよりも有意に高いＡｐｏＡ−Ｉ様活性を示すペプチド
をもたらすと考えられる。確かに、構造（Ｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）で示さ
れるコアペプチドの多くは、ＡｐｏＡ−Ｉ活性に近づき、そしてある実施態様で
はそれを超えさえもするが、現在までのところ、文献記載の最良のペプチドＡｐ
ｏＡ−Ｉ疑似体は、下記に記載するＬＣＡＴ活性化アッセイによる測定で、４０
％未満のＡｐｏＡ−Ｉ活性しか有しない。 いかなる特定の学説によって縛られることも意図していないが、構造（Ｉ）、
（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）で示されるコアペプチドによって形成される両親媒性ヘ
リックスのある構造的及び／又は物理的特性が活性にとって重要である。これら
の特性としては、両親媒性の程度、全体としての疎水性度、平均疎水性度、疎水
性及び親水性角、疎水性モーメント、平均疎水性モーメント、正味電荷並びに双
極子モーメントを含む。 構造（Ｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）で示されるコアペプチドの好ましい物理
的及び構造的特性の概要を、下記の表ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶに示す： 本発明のコアペプチドによって形成される両親媒性のαヘリックスの特性はク
ラスＡ両親媒性αヘリックス、特にＳｅｇｒｅｓｔの１８Ａおよびコンセンサス
２２量体ペプチドのクラスＡαヘリックスとは著しく異なる。これらの相異は典
型的なコアペプチド２１０（配列番号２１０）とともに示している。 ペプチド２１０（配列番号２１０）およびＳｅｇｒｅｓｔの１８Ａペプチド（
配列番号２４４）およびコンセンサス２２量体（配列番号７５）の物理的および
構造的特性の比較は下記の表Ｖに示している： これらの特性の相異によって活性の顕著な相異が生ずる。本明細書に記載のア
ッセイ法で、Ｓｅｇｒｅｓｔの１８Ａペプチド（配列番号２４４）およびコンセ
ンサス２２量体ペプチド（配列番号７５）が天然のＡｐｏＡ−Ｉの５％および１
０％のＬＣＡＴ活性化しかそれぞれ示さないのに対し、同じアッセイ法でペプチ
ド２１０（配列番号２１０）は天然のＡｐｏＡ−Ｉの４６％の活性化を示した。 構造（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）のコアペプチド中の一定のアミノ酸残
基はペプチドの活性を著しく損なうことなく、多くの場合にはむしろ増強するよ
うに他のアミノ酸残基と置換することができる。また、構造（Ｉ）、（ＩＩ）お
よび（ＩＩＩ）のコアペプチドを変異させた形のもので、その構造中の少なくと
も１個の定められたアミノ酸残基を別のアミノ酸で置き換えたものも本発明に包
含される。本発明のコアペプチドの活性に影響を及ぼす非常に重要な特徴の１つ
は、脂質の存在下での上述の両親媒性およびその他の特性を示すαヘリックスの
形成能であると考えられ、本発明の好ましい実施形態においては、アミノ酸の置
換は保存的、すなわち置換によって新たに入るアミノ酸残基がもとのアミノ酸残
基と類似の物理的および化学的特性を有するものであることであると考えられる
。 保存的な置換を行うアミノ酸を定めるために、主としてアミノ酸の側鎖の物理
化学的特性によってアミノ酸を２つの主要なカテゴリー、つまり親水性および疎
水性に都合良く分けることができる。これら２つの主要なカテゴリーはさらに、
アミノ酸側鎖の特性をより明確に定義するサブカテゴリーに分類することができ
る。例えば、親水性のアミノ酸のクラスはさらに酸性、塩基性および極性アミノ
酸に分けることができる。疎水性のアミノ酸のクラスはさらに無極性および芳香
族アミノ酸に分けることが出来る。構造（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）を定
義するアミノ酸の各カテゴリーの定義は下記のとおりである： 「親水性アミノ酸」とは、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ（１９８４，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３： ５９５−６２３）のコンセンサス疎水性スケール（ｃ
ｏｎｓｅｎｓｕｓ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ ｓｃａｌｅ）に従ってゼロ
未満の疎水性を示すアミノ酸をいう。遺伝的にコードされる親水性アミノ酸とし
ては、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｇｌｕ（Ｅ
）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ａｓｐ（Ｄ）、Ｌｙｓ（Ｋ）及びＡｒｇ（Ｒ
）が挙げられる。 「酸性アミノ酸」とは、側鎖ｐＫ値が７未満の親水性アミノ酸をいう。酸性ア
ミノ酸は、典型的には、水素イオンの欠失により、生理学的ｐＨにおいて負電荷
をもつ側鎖を有する。遺伝的にコードされる酸性アミノ酸としては、Ｇｌｕ（Ｅ
）及びＡｓｐ（Ｄ）が挙げられる。 「塩基性アミノ酸」とは、側鎖ｐＫ値が７よりも大きい親水性アミノ酸をいう
。塩基性アミノ酸は、典型的には、ヒドロニウムイオンとの結合により、生理学
的ｐＨにおいて正電荷をもつ側鎖を有する。遺伝的にコードされる塩基性アミノ
酸としては、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ａｒｇ（Ｒ）及びＬｙｓ（Ｋ）が挙げられる。 「極性アミノ酸」とは、生理学的ｐＨにおいて電荷をもたない側鎖を有する親
水性アミノ酸であって、２つの原子が共有する電子対がそのうちの１つにより近
づいている結合を少なくとも１つ有するものをいう。遺伝的にコードされる極性
アミノ酸としては、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｓｅｒ（Ｓ）
及びＴｈｒ（Ｔ）が挙げられる。 「疎水性アミノ酸」とは、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ（１９８４，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３： ５９５−６２３）のコンセンサス疎水性スケールに従
ってゼロより大きい疎水性を示すアミノ酸をいう。遺伝的にコードされる疎水性
アミノ酸としては、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）
、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ａｌａ（Ａ）、Ｇｌｙ（Ｇ）及びＴｙｒ（Ｙ）
が挙げられる。 「芳香族アミノ酸」とは、少なくとも１つの芳香環又はヘテロ芳香環をもつ側
鎖を有する疎水性アミノ酸をいう。該芳香環又はヘテロ芳香環は、１以上の置換
基を含有していてもよく、このような置換基としては、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＮ
、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＮＯ_２、−ＮＯ、−ＮＨ_２、−ＮＨＲ、−Ｎ
ＲＲ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２、−Ｃ
（Ｏ）ＮＨＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲＲ（ここで、各々のＲは、独立に、（Ｃ_１−Ｃ_６
）アルキル、置換（Ｃ_１−Ｃ_６）アルキル、（Ｃ_１−Ｃ_６）アルケニル、置換（
Ｃ_１−Ｃ_６）アルケニル、（Ｃ_１−Ｃ_６）アルキニル、置換（Ｃ_１−Ｃ_６）アル
キニル、（Ｃ_５−Ｃ_２０）アリール、置換（Ｃ_５−Ｃ_２０）アリール、（Ｃ_６−
Ｃ_２６）アルカリール、置換（Ｃ_６−Ｃ_２６）アルカリール、鎖員数５〜２０の
ヘテロアリール、または置換された鎖員数５〜２０のヘテロアリールである）な
どが挙げられる。遺伝的にコードされる芳香族アミノ酸としては、Ｐｈｅ（Ｆ）
、Ｔｙｒ（Ｙ）及びＴｒｐ（Ｗ）が挙げられる。 「非極性（ｎｏｎｐｏｌａｒ）アミノ酸」とは、生理学的ｐＨにおいて電荷を
もたない側鎖を有する疎水性アミノ酸であって、２つの原子が共有する電子対が
これらの各原子により概して等しく保持される結合を有する（すなわち、側鎖が
極性でない）ものをいう。遺伝的にコードされる非極性（ａｐｏｌａｒ）アミノ
酸としては、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｇｌ
ｙ（Ｇ）及びＡｌａ（Ａ）が挙げられる。 「脂肪族アミノ酸」とは、脂肪族炭化水素側鎖を有する疎水性アミノ酸をいう
。遺伝的にコードされる脂肪族アミノ酸としては、Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）
、Ｌｅｕ（Ｌ）及びＩｌｅ（Ｉ）が挙げられる。 アミノ酸残基Ｃｙｓ（Ｃ）は、他のＣｙｓ（Ｃ）又は他のスルファニル含有ア
ミノ酸とジスルフィド結合を形成する点で、通常のアミノ酸とは異なる。Ｃｙｓ
（Ｃ）残基（及び−ＳＨ含有側鎖を有する他のアミノ酸）の、ペプチド中におい
て還元された遊離−ＳＨ型又は酸化されたジスルフィド結合型で存在する能力に
よって、Ｃｙｓ（Ｃ）がペプチドに全体として親水性を与えるか疎水性を与える
かが決まる。Ｃｙｓ（Ｃ）がＥｉｓｅｎｂｅｒｇ（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ，１９８
４、上掲）のコンセンサススケールに従って０．２９の疎水性を示す場合には、
本発明の目的に照らし、上記の一般的な分類とは異なって、Ｃｙｓ（Ｃ）は極性
親水性アミノ酸とされるものと理解すべきである。 当業者には明らかなように、上述のカテゴリーは相互に排他的なものではない
。従って、２以上の物理・化学的特性を示す側鎖を有するアミノ酸は、複数のカ
テゴリーに含まれる可能性がある。例えば、極性の置換基でさらに置換された芳
香族部分をもつ側鎖を有するアミノ酸、例えばＴｙｒ（Ｙ）は、芳香族疎水性の
特性及び極性若しくは親水性の特性の両方を示すことができ、従って、芳香族及
び極性の両方のカテゴリーに含まれ得る。あらゆるアミノ酸の適切な分類は、特
に本明細書の詳細な開示に照らせば、当業者には明らかであろう。 「ヘリックス破壊」アミノ酸と称されるある種のアミノ酸残基は、そのヘリッ
クスの内部に含まれると、α−ヘリックスの構造を破壊する性質を有する。ヘリ
ックス破壊特性を示すアミノ酸残基は当技術分野で周知であり（例えば、Ｃｈｏ
ｕａｎｄ Ｆａｓｍａｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７： ２５１−
２７６を参照されたい）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｄ−Ｐｒｏ（ｐ）およびＧｌｙ（Ｇ）
が挙げられる。これらのアミノ酸は上述のカテゴリーに便宜的に含まれるが、こ
れらの残基（Ｇｌｙ（Ｇ）は例外である）は、ヘリックス内部のアミノ酸残基の
置換には用いるべきでなく、ペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端の１〜３個のア
ミノ酸残基を置換するためだけに用いるべきである。 ＡｐｏＡ−Ｉの天然の構造には、一斉に脂質に結合するように働くと考えられ
る８個のヘリックス単位が含まれる（Ｎａｋａｇａｗａら，１９８５，Ｊ．Ａｍ
．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０７：７０８７−７０９２；Ａｎａｎｔｈａｒａｍａｉ
ａｈら，１９８５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：１０２４８−１０２６２
；Ｖａｎｌｏｏら，１９９１，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３２：１２５３−１２
６４；Ｍｅｎｄｅｚら，１９９４，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１６９
８−１７０５； Ｐａｌｇｕｎａｒｉら，１９９６，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ
．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１６：３２８−３３８； Ｄｅｍｏｏｒ
ら，１９９６，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３９：７４−８４）。従って、
本明細書に記載のコアペプチドの二量体、三量体、四量体およびそれ以上の高次
の重合体（「多量体」）より構成されるＡｐｏＡ−Ｉアゴニストも本発明に含ま
れる。このような多量体は、縦列反復配列、分枝網状構造体、またはこれらの組
み合わせの形態であってよい。コアペプチドは、互いに直接結合してもよく、１
つ以上のリンカーで隔てられていてもよい。 多量体を含んでなるコアペプチドは、構造（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）
のペプチド、構造（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）の類似体、構造（Ｉ）、（
ＩＩ）および（ＩＩＩ）の突然変異体、構造（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）
の末端切断体もしくは内部欠失体、構造（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）の伸
長体および／またはこれらの組み合わせであってよい。コアペプチドは、頭−尾
型（即ち、Ｎ末端をＣ末端へ）、頭−頭型（即ち、Ｎ末端をＮ末端へ）、尾−尾
型（即ち、Ｃ末端をＣ末端へ）、またはこれらの組み合わせの型で結合すること
ができる。 本発明の一つの実施形態では、多量体は、２、３、４および約１０個までのコ
アペプチドの縦列反復配列である。好ましくは、多量体は、２〜８個のコアペプ
チドの縦列反復配列である。従って、一実施形態では、本発明のＡｐｏＡ−Ｉア
ゴニストは、以下の構造式： （ＩＶ） ＨＨ−［−ＬＬ_ｍ−ＨＨ−］_ｎ−ＬＬ_ｍ−ＨＨ ［式中、 各ｍは独立に０〜１の整数であり、好ましくは１であり、 ｎは０〜１０の整数であり、好ましくは０〜８であり、 各「ＨＨ」は独立に構造（Ｉ）のコアペプチドもしくはペプチド類似体、また
は本明細書に記載のこれらの突然変異体、末端切断体、内部欠失体もしくは伸長
体を表し、 各「ＬＬ」は独立にリンカー（例えばＰｒｏ（Ｐ）、Ｇｌｙ（Ｇ）およびＣｙ
ｓ−Ｃｙｓ）を表す］を有する多量体を含んでなる。 本発明の好適な実施形態では、縦列反復配列は、１個のプロリン残基によって
内部で区切られている。このため、コアペプチドがそのＮもしくはＣ末端にてプ
ロリンで終結している場合（例えば、構造（Ｉ）のＸ_１がＰｒｏ（Ｐ）の場合）
。コアペプチドがＮもしくはＣ末端プロリンを含まない場合には、ＬＬは好まし
くはＰｒｏ（Ｐ）である。 本発明のある実施形態では、一定の条件下で１個以上のヘリックスセグメント
（ＨＨ）を放出し得る開裂可能なリンカーを使用するのが望ましい。適切な開裂
可能なリンカーとしては、プロテアーゼによって認識されるアミノ酸配列を有す
るペプチド、エンドヌクレアーゼによって開裂されるオリゴヌクレオチドが挙げ
られる。好ましくは、開裂条件は、多量体ＡｐｏＡ−Ｉアゴニストを構成するヘ
リックスセグメントおよび／または非開裂リンカーを変性または分解しないよう
な比較的穏和なものである。 選択的に開裂し得るペプチドリンカーおよびオリゴヌクレオチドリンカー、並
びにリンカーを開裂する手段は周知であり、当業者には直ちに明らかであろう。
好適な実施形態では、使用するリンカーは内在性の循環酵素に対する基質である
ペプチドであり、これにより多量体ＡｐｏＡ−Ｉアゴニストのｉｎ ｖｉｖｏに
おける選択的開裂が可能になる。リンカーの開裂に適した内在性の酵素としては
、例えば、プロアポリポタンパク質Ａ−Ｉプロペプチダーゼが挙げられる。適切
な酵素、並びにこのような酵素の基質として働くペプチドセグメントは、当該技
術分野で周知である（例えば、Ｅｄｅｌｓｔｅｉｎら，１９８３，Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．２５８：１１４３０−１１４３３； Ｚａｎｉｓ，１９８３，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２５７４−２５７８を参照
）。 上述したように、本発明のコアペプチドの重要な特徴は、逆平行の状態で配置
された場合に分子間水素結合または塩橋を形成する能力である。従って、本発明
の好適な実施形態では、構造（ＩＩ）のヘリックスセグメント（ＨＨ）が逆平行
の状態に並んで、かつ脂質の存在下にて分子間水素結合もしくは塩橋を形成する
よう、十分な長さと柔軟性を有するリンカーを使用する。十分な長さと柔軟性を
有するリンカーとしては、限定するものではないが、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｇｌｙ（Ｇ
）、Ｃｙｓ−Ｃｙｓが挙げられる。 あるいは、天然のアポリポタンパク質は、逆平行ヘリックスセグメント間の協
同的結合を許容するため、一次配列において天然のアポリポタンパク質（例えば
、ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＡ−ＩＶ、ＡｐｏＣ−Ｉ、ＡｐｏＣ−
ＩＩ、ＡｐｏＣ−ＩＩＩ、ＡｐｏＤ、ＡｐｏＥおよびＡｐｏＪ）の隣接ヘリック
スを結合するペプチドセグメントに相当するペプチドリンカーは、コアペプチド
を結合するのに簡便に使用することができる。これらの配列は当該技術分野で周
知である（例えば、Ｒｏｓｓｅｎｅｕら，“Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ
Ｐｒｉｍａｒｙ ａｎｄ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ｓｔｒｕｃｔｕ
ｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ”，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ
ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｃｈ．６，１
５９−１８３，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９９２を参照）。 逆平行ヘリックスセグメントの縦列反復配列間に分子間水素結合または塩橋を
形成し得る他のリンカーとしては、ペプチドの逆ターン（例えば、β−ターンお
よびγ−ターン）が挙げられる。通常、逆ターンは、１本のポリペプチド鎖に逆
平行β−シートまたは逆平行α−ヘリックス構造の領域が含まれるよう、ポリペ
プチド鎖の方向を逆転させるペプチドのセグメントである。β−ターンは通常４
個のアミノ酸残基から構成され、γ−ターンは、通常３個のアミノ酸残基から構
成される。 多くのペプチドのβ−ターンのコンホメーションおよび配列は、当該技術分野
で十分に記載されており、例としては、限定するものではないが、タイプＩ、タ
イプＩ’、タイプＩＩ、タイプＩＩ’、タイプＩＩＩ、タイプＩＩＩ’、タイプ
ＩＶ、タイプＶ、タイプＶ’、タイプＶＩａ、タイプＶＩｂ、タイプＶＩＩおよ
びタイプＶＩＩＩが挙げられる（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，１９８１，Ａｄｖ．Ｐ
ｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ．３４：１６７−３３９； Ｒｏｓｅら，１９８５，Ａ
ｄｖ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ．３７：１−１０９； Ｗｉｌｍｏｔら，１９
８８，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０３：２２１−２３２； Ｓｉｂａｎｄａら，
１９８９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０６：７５９−７７７； Ｔｒａｍｏｎｔ
ａｎｏら，１９８９，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．Ｇａｎ
ｅｔ．６：３８２−３９４を参照）。 β−ターン等の短鎖ペプチドターンの特異的なコンホメーションは、主として
、ターン中における一定のアミノ酸残基の位置に依存する（通常は、Ｇｌｙ、Ａ
ｓｎまたはＰｒｏ）。一般に、タイプＩのβ−ターンでは、ターンの位置１〜４
はいずれのアミノ酸残基でも可能である（但し、Ｐｒｏが位置３に存在すること
はない）。タイプＩおよびタイプＩＩのターンとも、Ｇｌｙは位置４を優先的に
占め、Ｐｒｏは位置２を優先的に占める。Ａｓｐ、Ａｓｎ、ＳｅｒおよびＣｙｓ
残基は位置１に存在することが多く、その側鎖は残基３のＮＨに水素結合するこ
とが多い。 タイプＩＩのターンでは、ＧｌｙおよびＡｓｎは位置３に存在することが最も
多い。これは、ＧｌｙおよびＡｓｎであれば、必要なバックボーンの角度が最も
容易に得られるためである。理想的には、タイプＩ’のターンはＧｌｙを位置２
および３に有し、タイプＩＩ’のターンはＧｌｙを位置２に有する。タイプＩＩ
Ｉのターンは一般にほとんどのアミノ酸残基を有することができるが、タイプＩ
ＩＩ’のターンは通常位置２および３にＧｌｙが必要である。タイプＶＩａおよ
びＶＩｂのターンは、通常ｃｉｓペプチド結合と内部残基としてのＰｒｏを有す
る。タンパク質およびペプチド中に含まれるβ−ターンの個々のタイプおよび配
列の概説については、Ｗｉｌｍｏｔら，１９８８，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０
３：２２１−２３２を参照されたい。 多くのペプチドのγ−ターンのコンホメーションおよび配列も、当該技術分野
で十分に記載されている（例えば、Ｒｏｓｅら，１９８５，Ａｄｖ．Ｐｒｏｔｅ
ｉｎ Ｃｈｅｍ．３７：１−１０９； Ｗｉｌｍｅｒ−Ｗｈｉｔｅら，１９８７
，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１２：１８９−１９２； Ｗｉｌｍ
ｏｔら，１９８９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０３：２２１−２３２； Ｓｉｂ
ａｎｄａら，１９８９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０６：７５９−７７７； Ｔ
ｒａｍｏｎｔａｎｏら，１９８９，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃ
ｔ．Ｇｅｎｅｔ．６：３８２−３９４を参照）。これら全てのタイプのβ−ター
ンおよびγ−ターン構造並びにその対応配列、並びに後から発見されるペプチド
のβ−ターンおよびγ−ターン構造並びに配列は、特に本発明の範囲内とする。 構造（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）は、２２の明記したアミノ酸残基位
置を含むが、本発明のコアペプチドは２２未満のアミノ酸残基を含むことができ
ると理解する。実際、構造（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）のコアペプチドに
より形成された両親媒性ヘリックスの全体的特徴および特性を実質的に保持する
１８またはさらには１５という少ないアミノ酸残基を含む、構造（Ｉ）、（ＩＩ
）および（ＩＩＩ）のトランケートされた形態または内部欠失形態は、本発明の
範囲内であると考える。 構造（Ｉ）のペプチドのトランケート形態は、構造（Ｉ）、（ＩＩ）および（
ＩＩＩ）のＮおよび／またはＣ末端から１つ以上のアミノ酸を欠失することによ
り得られる。構造（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）の内部欠失形態は、構造（
Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）のペプチド内の内部位置から１つ以上のアミノ
酸を欠失することにより得られる。欠失する内部アミノ酸残基は、連続した残基
であってもそうでなくてもよい。 当業者は、構造（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）のコアペプチドからの内部
アミノ酸残基の欠失により、ヘリックスの親水性−疎水性界面の平面が欠失ポイ
ントで１００°回転することを認識する。かかる回転は生じたヘリックスの両親
媒性特性を有意に変化し得るので、本発明の好ましい実施形態において、アミノ
酸残基は、親水性−疎水性界面の平面を、ヘリックスの全体の長い軸に沿って揃
えて保持するように欠失する。 これは、便利には、１つの完全なヘリックスターンがなくなるように、十分な
数の連続または非連続アミノ酸残基を欠失することにより達成される。理想的な
α−ヘリックスは、１ターンあたり３．６残基を含む。従って、好ましい実施形
態において、３〜４個の連続または非連続アミノ酸残基の群を欠失する。３アミ
ノ酸または４アミノ酸を欠失するかは、最初に欠失する残基のヘリックス内にお
ける位置に依存する。両親媒性ヘリックス内の任意の特定の出発点から１つの完
全なヘリックスターンを構成する、連続または非連続アミノ酸残基の適当な数の
決定は、当業者の能力範囲内である。 ヘリックスの安定化には構造（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）のコアペプチ
ドのＣ末端における塩基性クラスターが重要であると推測され、脂質結合および
ＬＣＡＴ活性化の奏効には疎水性クラスターが重要であることから、本発明の好
ましい実施形態において、塩基性および疎水性クラスターを含む残基は欠失させ
ない。従って、好ましい実施形態において、残基１９、２０および２２（塩基性
クラスター）および残基３、６、９および１０（疎水性クラスター）は欠失させ
ない。 構造（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）のコアペプチドはまた、実質的にペプ
チドの構造および／または機能的特性を妨害せずある実施形態においてはむしろ
増強する、追加のアミノ酸残基を用いて、一端または両端あるいは内部において
伸長できる。実際、２３、２５、２６、２９またはさらにそれ以上という多くの
アミノ酸残基を含む伸長コアペプチドは、本発明の範囲内であると考える。好ま
しくは、かかる伸長ペプチドは、実質的に実効両親媒性および構造（Ｉ）、（Ｉ
Ｉ）および（ＩＩＩ）のペプチドの他の特性を保持する。もちろん、アミノ酸の
内部付加により、内部欠失で上記したのと同じように、疎水性−親水性界面の平
面が挿入点において回転することが認識される。従って、内部欠失と関連して上
記で議論した考察を同様に内部付加にも適用する。 １つの実施形態において、コアペプチドは、少なくとも１つのヘリックスター
ンによりＮおよび／またはＣ末端において伸長される。好ましくは、該伸長によ
り、脂質の存在下でヘリックス二次構造、例えば前記した末端キャップアミノ酸
およびセグメントは安定化する。 特に好ましい実施形態において、構造（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）のコ
アペプチドは、単一の塩基性アミノ酸残基、好ましくはＬｙｓ（Ｋ）によりＣ末
端が伸長する。 ５．１．３ 好ましい実施形態 本発明のヌクレオチド配列によりコードされるＡｐｏＡ−Ｉアゴニストは、さ
らに、好ましい実施形態により定義できる。 １つの好ましい実施形態において、本発明のヌクレオチド配列は、２２アミノ
酸残基を含む構造（Ｉ）のコアペプチドからなるＡｐｏＡ−Ｉアゴニストをコー
ドし、ここで： Ｘ_１はＰｒｏ（Ｐ）、Ｇｌｙ（Ｇ）またはＡｌａ（Ａ）であり； Ｘ_２はＶａｌ（Ｖ）またはＬｅｕ（Ｌ）であり； Ｘ_３はＬｅｕ（Ｌ）であり； Ｘ_４はＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）であり； Ｘ_５はＬｅｕ（Ｌ）またはＰｈｅ（Ｆ）であり； Ｘ_６はＬｅｕ（Ｌ）またはＰｈｅ（Ｆ）であり； Ｘ_７はＬｙｓ（Ｋ）またはＡｒｇ（Ｒ）であり； Ｘ_８はＧｌｕ（Ｅ）であり； Ｘ_９はＬｅｕ（Ｌ）であり； Ｘ_１０はＬｅｕ（Ｌ）またはＴｒｐ（Ｗ）であり； Ｘ_１１はＡｓｎ（Ｎ）またはＧｌｎ（Ｑ）であり； Ｘ_１２はＧｌｕ（Ｅ）であり； Ｘ_１３はＬｅｕ（Ｌ）であり； Ｘ_１４はＬｅｕ（Ｌ）またはＴｒｐ（Ｗ）であり； Ｘ_１５はＧｌｕ（Ｅ）であり； Ｘ_１６はＡｌａ（Ａ）またはＴｒｐ（Ｗ）であり； Ｘ_１７はＬｅｕ（Ｌ）であり； Ｘ_１８またはＸ_１９の一方はＧｌｎ（Ｑ）であり、他方はＬｙｓ（Ｋ）であり；
Ｘ_２０はＬｙｓ（Ｋ）であり； Ｘ_２１はＬｅｕ（Ｌ）であり；および Ｘ_２２はＬｙｓ（Ｋ）である。 さらに別の好ましい実施形態において、本発明のヌクレオチド配列は、２２ア
ミノ酸残基を含む構造（Ｉ）のコアペプチドからなるＡｐｏＡ−Ｉアゴニストを
コードし、ここで： Ｘ_１はＰｒｏ（Ｐ）、Ｇｌｙ（Ｇ）またはＡｌａ（Ａ）であり； Ｘ_２はＶａｌ（Ｖ）であり； Ｘ_３はＬｅｕ（Ｌ）であり； Ｘ_４はＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）であり； Ｘ_５はＬｅｕ（Ｌ）またはＰｈｅ（Ｆ）であり； Ｘ_６はＰｈｅ（Ｆ）であり； Ｘ_７はＡｒｇ（Ｒ）であり； Ｘ_８はＧｌｕ（Ｅ）であり； Ｘ_９はＬｅｕ（Ｌ）であり； Ｘ_１０はＬｅｕ（Ｌ）またはＴｒｐ（Ｗ）であり； Ｘ_１１はＡｓｎ（Ｎ）であり； Ｘ_１２はＧｌｕ（Ｅ）であり； Ｘ_１３はＧｌｙ（Ｇ）であり； Ｘ_１４はＬｅｕ（Ｌ）であり； Ｘ_１５はＧｌｕ（Ｅ）であり； Ｘ_１６はＡｌａ（Ａ）またはＴｒｐ（Ｗ）であり； Ｘ_１７はＬｅｕ（Ｌ）であり； Ｘ_１８はＬｙｓ（Ｋ）であり； Ｘ_１９はＧｌｎ（Ｑ）であり； Ｘ_２０はＬｙｓ（Ｋ）であり； Ｘ_２１はＬｅｕ（Ｌ）であり；および Ｘ_２２はＬｙｓ（Ｋ）である。 本発明のこの態様による特に好ましいヌクレオチド配列は： からなる群から選択されたコアペプチドをコードするものである。 さらに別の好ましい実施形態において、ヌクレオチド配列は、構造（Ｉ）（こ
こで、Ｘ_９はＧｌｙ（Ｇ）であり、各Ｘ_１０、Ｘ_１３、Ｘ_１４、Ｘ_１６およびＸ
_１７はＧｌｙ（Ｇ）以外である）の２２−アミノ酸残基ペプチドであるＡｐｏＡ
−Ｉアゴニストをコードする。本発明のこの態様による特に好ましいＡｐｏＡ−
Ｉアゴニス である。 さらに別の好ましい実施形態において、ヌクレオチド配列は、構造（Ｉ）（こ
こで、Ｘ_１０はＧｌｙ（Ｇ）であり、各Ｘ_９、Ｘ_１３、Ｘ_１４、Ｘ_１６およびＸ
_１７はＧｌｙ（Ｇ）以外である）の２２−アミノ酸残基ペプチドであるＡｐｏＡ
−Ｉをコードする。本発明のこの態様による特に好ましいＡｐｏＡ−Ｉアゴニス
トは、ペプ さらに別の好ましい実施形態において、ヌクレオチド配列は、構造（Ｉ）（こ
こで、Ｘ_１４はＧｌｙ（Ｇ）であり、各Ｘ_９、Ｘ_１０、Ｘ_１３、Ｘ_１６およびＸ
_１７はＧｌｙ（Ｇ）以外である）の２２−アミノ酸残基ペプチドであるＡｐｏＡ
−Ｉアゴニストをコードする。本発明のこの態様による特に好ましいＡｐｏＡ−
Ｉアゴニス ６）である。 さらに別の好ましい実施形態において、ヌクレオチド配列は、構造（Ｉ）（こ
こで、Ｘ_１６はＧｌｙ（Ｇ）であり、各Ｘ_９、Ｘ_１０、Ｘ_１３、Ｘ_１４およびＸ
_１７はＧｌｙ（Ｇ）以外である）の２２−アミノ酸残基ペプチドであるＡｐｏＡ
−Ｉアゴニストである。本発明のこの態様による特に好ましいＡｐｏＡ−Ｉアゴ
ニストは、 さらに別の好ましい実施形態において、ヌクレオチド配列は、構造（Ｉ）（こ
こで、Ｘ_１７はＧｌｙ（Ｇ）であり、各Ｘ_９、Ｘ_１０、Ｘ_１３、Ｘ_１４およびＸ
_１６はＧｌｙ（Ｇ）以外である）の２２−アミノ酸残基ペプチドであるＡｐｏＡ
−Ｉアゴニストである。本発明のこの態様による特に好ましいＡｐｏＡ−Ｉアゴ
ニストは、 さらに別の好ましい実施形態において、ヌクレオチド配列は、構造（Ｉ）（こ
こで、各Ｘ_９、Ｘ_１０、Ｘ_１３、Ｘ_１４、Ｘ_１６およびＸ_１７はＧｌｙ（Ｇ）以
外である）の２２−アミノ酸残基ペプチドであるＡｐｏＡ−Ｉアゴニストである
。 アゴニストは、構造（Ｉ）の２２−アミノ酸残基ペプチドであり、ここで： Ｘ_１はＰｒｏ（Ｐ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ａｌａ（Ａ）であり； Ｘ_２はＶａｌ（Ｖ）またはＬｅｕ（Ｌ）であり； Ｘ_３はＬｅｕ（Ｌ）であり； Ｘ_４はＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）であり； Ｘ_５はＬｅｕ（Ｌ）またはＰｈｅ（Ｆ）であり； Ｘ_６はＬｅｕ（Ｌ）またはＰｈｅ（Ｆ）であり； Ｘ_７はＡｒｇ（Ｒ）またはＬｙｓ（Ｋ）であり； Ｘ_８はＧｌｕ（Ｅ）であり； Ｘ_９はＬｅｕ（Ｌ）であり； Ｘ_１０はＬｅｕ（Ｌ）またはＴｒｐ（Ｗ）であり； Ｘ_１１はＡｓｎ（Ｎ）またはＧｌｎ（Ｑ）であり； Ｘ_１２はＧｌｕ（Ｅ）であり； Ｘ_１３はＬｅｕ（Ｌ）であり； Ｘ_１４はＬｅｕ（Ｌ）またはＴｒｐ（Ｗ）であり； Ｘ_１５はＧｌｕ（Ｅ）であり； Ｘ_１６はＡｌａ（Ａ）、Ｌｅｕ（Ｌ）またはＴｒｐ（Ｗ）であり； Ｘ_１７はＬｅｕ（Ｌ）であり； Ｘ_１８またはＸ_１９の一方はＧｌｎ（Ｑ）であり、他方はＬｙｓ（Ｋ）であり；
Ｘ_２０はＬｙｓ（Ｋ）であり； Ｘ_２１はＬｅｕ（Ｌ）であり；および Ｘ_２２はＬｙｓ（Ｋ）である。 本発明のこの態様による特に好ましい実施形態において、Ｘ_２はＶａｌ（Ｖ）
であり；Ｘ_４はＡｓｐ（Ｄ）であり；Ｘ_５はＬｅｕ（Ｌ）であり；Ｘ_６はＰｈｅ
（Ｆ）であり；Ｘ_７はＡｒｇ（Ｒ）であり；Ｘ_１０はＬｅｕ（Ｌ）であり；Ｘ_１
１はＡｓｎ（Ｎ）であり；Ｘ_１３はＬｅｕ（Ｌ）であり；Ｘ_１４はＬｅｕ（Ｌ）
であり；Ｘ_１６はＡｌａ（Ａ）であり；Ｘ_１７はＬｅｕ（Ｌ）であり；Ｘ_１８は
Ｌｙｓ（Ｋ）であり；Ｘ_１９はＧｌｎ（Ｑ）であり；Ｘ_２０はＬｙｓ（Ｋ）であ
り、および／またはＸ_２２はＬｙｓ（Ｋ）である。 さらに別の好ましい実施形態において、ヌクレオチド配列は、構造（Ｉ）のペ
プチドの変化または変異形であるＡｐｏＡ−Ｉアゴニストをコードし、ここで：
Ｘ_１はＶａｌ（Ｖ）またはＬｅｕ（Ｌ）以外であり； Ｘ_５はＬｙｓ（Ｋ）、Ｇｌｕ（Ｅ）またはＴｒｐ（Ｗ）以外であり； Ｘ_６はＴｒｐ（Ｗ）以外であり； Ｘ_７はＴｒｐ（Ｗ）またはＬｅｕ（Ｌ）以外であり； Ｘ_８はＴｒｐ（Ｗ）以外であり； Ｘ_９はＬｙｓ（Ｋ）またはＴｒｐ（Ｗ）以外であり； Ｘ_１１はＴｒｐ（Ｗ）以外であり； Ｘ_１２はＴｒｐ（Ｗ）またはＬｅｕ（Ｌ）以外であり； Ｘ_１３はＧｌｕ（Ｅ）またはＴｒｐ（Ｗ）以外であり； Ｘ_１５はＴｒｐ（Ｗ）以外であり；および／または Ｘ_２１はＬｙｓ（Ｋ）以外である。 さらに別の好ましい実施形態において、本発明のヌクレオチド配列は、以下に
示されるペプチド群から選択したＡｐｏＡ−Ｉアゴニストをコードする： 好ましい実施形態において、ヌクレオチド配列は、構造（ＩＩ）の２２アミノ
酸残基ペプチドであるＡｐｏＡ−Ｉアゴニストをコードし、ここで： Ｘ_１はＰｒｏ（Ｐ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ａｌａ（Ａ）またはＡｓｎ（Ｎ）であり；
Ｘ_２はＡｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）またはＬｅｕ（Ｌ）であり； Ｘ_５はＬｅｕ（Ｌ）であり； Ｘ_６はＰｈｅ（Ｆ）であり； Ｘ_１１はＧｌｕ（Ｅ）であり； Ｘ_１９はＬｙｓ（Ｋ）であり； Ｘ_２０はＬｙｓ（Ｋ）であり；および／または Ｘ_２２はＬｙｓ（Ｋ）であり、各Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_７、Ｘ_８、Ｘ_９、Ｘ_１０、Ｘ_１
２、Ｘ_１３、Ｘ_１４、Ｘ_１５、Ｘ_１６、Ｘ_１７、Ｘ_１８およびＸ_２１は、構造（
ＩＩ）で以前に定義した通りである。 本発明のこの態様による特に好ましいＡｐｏＡ−Ｉアゴニストは、Ｘ_２がＶａ
ｌ（Ｖ）であり；および／またはＸ_１８がＧｌｎ（Ｑ）であるものである。 さらに別の好ましい実施形態において、ＡｐｏＡ−Ｉアゴニストは、構造（Ｉ
Ｉ）の２２アミノ酸残基ペプチドであり、ここでＸ_１０、Ｘ_１３またはＸ_１４の
うちうの１つはＧｌｙ（Ｇ）であり、Ｘ_１０、Ｘ_１３およびＸ_１４のうちのその
他のものはＧｌｙ（Ｇ）以外である。Ｘ_１４がＧｌｙ（Ｇ）である場合、Ｘ_７は
好ましくはＧｌｕ（Ｅ）である。 本発明のこの態様による特に好ましいヌクレオチド配列は、 からなる群から選択したペプチドであるＡｐｏＡ−Ｉアゴニストをコードする。 さらに別の好ましい実施形態において、ＡｐｏＡ−Ｉアゴニストは、構造（Ｉ
Ｉ）の２２−アミノ酸残基ペプチドであり、ここで各Ｘ_１０、Ｘ_１３およびＸ_１
４はＧｌｙ（Ｇ）以外である。 さらに別の好ましい実施形態において、ヌクレオチド配列は、構造（ＩＩ）の
ペプチドの変化または変異形であるＡｐｏＡ−Ｉアゴニストをコードし、ここで
： Ｘ_４はＡｓｐ（Ｄ）以外であり； Ｘ_５はＰｈｅ（Ｆ）以外であり； Ｘ_６はＴｒｐ（Ｗ）以外であり； Ｘ_７はＬｅｕ（Ｌ）またはＡｓｐ（Ｄ）以外であり； Ｘ_９はＧｌｙ（Ｇ）またはＴｒｐ（Ｗ）以外であり； Ｘ_１２はＬｙｓ（Ｋ）以外であり； Ｘ_１３はＴｒｐ（Ｗ）以外であり； Ｘ_１４はＴｒｐ（Ｗ）以外であり； Ｘ_１５はＧｌｕ（Ｅ）以外であり； Ｘ_１６はＴｒｐ（Ｗ）またはＬｅｕ（Ｌ）以外であり；および／または Ｘ_１７はＴｒｐ（Ｗ）以外である。 さらに別の好ましい実施形態において、ＡｐｏＡ−Ｉアゴニストは、構造（Ｉ
Ｉ）の２２アミノ酸残基ペプチドであり、ここで、Ｘ_７はＬｅｕ（Ｌ）であり、
Ｘ_１０はＴｒｐ（Ｗ）であり、Ｘ_１はＧｌｙ（Ｇ）以外であり、および／または
Ｘ_１４はＧｌｙ（Ｇ）以外である。本発明のこの態様による特に好ましいペプチ
ドは、 る。 さらに別の好ましい実施形態において、ヌクレオチド配列は、以下に示される
ペプチド群から選択したＡｐｏＡ−Ｉアゴニストをコードする： １つの好ましい実施形態において、ＡｐｏＡ−Ｉアゴニストは、構造（ＩＩＩ
）の１８アミノ酸残基ペプチドである。 別の好ましい実施形態において、ヌクレオチド配列は、構造（ＩＩＩ）の１８
アミノ酸残基ペプチドであるＡｐｏＡ−Ｉアゴニストをコードし、ここで： Ｘ_２はＡｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）またはＬｅｕ（Ｌ）であり； Ｘ_４はＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）であり； Ｘ_７はＡｒｇ（Ｒ）またはＬｙｓ（Ｋ）であり； Ｘ_８はＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）であり； Ｘ_１１はＧｌｕ（Ｅ）またはＡｓｎ（Ｎ）であり； Ｘ_１２はＧｌｕ（Ｅ）であり； Ｘ_１４はＡｒｇ（Ｒ）、Ｌｙｓ（Ｋ）またはＬｅｕ（Ｌ）であり； Ｘ_１６はＡｒｇ（Ｒ）またはＬｙｓ（Ｋ）であり；および／または Ｘ_１８はＡｒｇ（Ｒ）またはＬｙｓ（Ｋ）であり； Ｘ_１、Ｘ_３、Ｘ_５、Ｘ_６、Ｘ_９、Ｘ_１０、Ｘ_１３、Ｘ_１５およびＸ_１７は、構造
（ＩＩＩ）で以前に定義した通りである。 別の好ましい実施形態において、ＡｐｏＡ−Ｉアゴニストは、構造（ＩＩＩ）
の１８アミノ酸残基ペプチドであり、ここで、Ｘ_１１はＡｓｎ（Ｎ）であり、Ｘ
_１４はＬｅｕ（Ｌ）であり、Ｘ_１１がＡｓｎ（Ｎ）以外である場合、Ｘ_１４はＬ
ｅｕ（Ｌ）以外である。本発明のこの態様による例示的な特に好ましい実施形態
は、 さらに別の好ましい実施形態において、ＡｐｏＡ−Ｉアゴニストは、構造（Ｉ
ＩＩ）のペプチドの変化または変異形であり、ここで、 Ｘ_１は、Ａｓｐ（Ｄ）以外であり； Ｘ_９は、Ｇｌｙ（Ｇ）以外であり； Ｘ_１０は、Ｇｌｙ（Ｇ）以外であり； Ｘ_１２は、Ｌｅｕ（Ｌ）以外であり；および Ｘ_１３は、Ｇｌｙ（Ｇ）以外である。 さらに別の好ましい実施形態において、ヌクレオチド配列は、以下に示される
ペプチド群から選択したＡｐｏＡ−Ｉアゴニストをコードする： さらに別の好ましい実施形態において、本発明のヌクレオチド配列は、構造Ｉ
Ｖの多量体形であるＡｐｏＡ−Ｉアゴニストをコードし、ここで、各ＨＨは、独
立して、構造（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）のペプチド、または本明細書に
記載の構造（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の好ましい任意のペプチドである
。 最後の好ましい実施形態 において、ＡｐｏＡ−Ｉアゴニストは、遺伝子に
コードされていないアミノ酸から構成されるか、または天然のヒトＡｐｏＡ−Ｉ
と比較した場合、３８％未満のＬＣＡＴ活性化活性を示す表ＶＩＩＩに記載され
たペプチドではない。 ５．１．４．構造および機能の分析 本発明のコアペプチドまたはペプチド類似体の構造および機能、並びにこのよ
うなコアペプチドから構成されるＡｐｏＡ−Ｉアゴニスト（上述のような多量体
形態を含む）の構造および機能は、活性なアゴニストまたはＡｐｏＡ−Ｉ模倣体
を選別するためにアッセイすることができる。例えば、コアペプチドまたはペプ
チド類似体は、脂質の存在下でα−ヘリックスを形成する能力、脂質に結合する
能力、脂質と複合体を形成する能力、ＬＣＡＴを活性化する能力、コレステロー
ルの流出を促進する能力などについてアッセイすることができる。 ペプチドの構造および／または機能を分析する方法およびアッセイは、当該技
術分野で周知である。好適な方法を後述の実施例に示す。例えば、後述の第７節
に記載する円二色性（ＣＤ）アッセイおよび核磁気共鳴（ＮＭＲ）アッセイを使
用して、ペプチドまたはペプチド類似体の構造（特に、脂質の存在下でのらせん
度）を分析することができる。脂質に結合する能力は、後述の第７節に記載する
蛍光分光法アッセイを使用して判定できる。ＬＣＡＴを活性化するペプチドおよ
び／またはペプチド類似体の能力は、後述の第８節に記載するＬＣＡＴ活性化を
用いて容易に判定できる。後述の第９、１０および１１節に記載するｉｎ ｖｉ
ｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏアッセイを使用して、半減期、分布、コレステロー
ルの流出およびＲＣＴに対する作用を評価することができる。 通常、下記の表ＶＩに列挙した特性を示す本発明のコアペプチドおよび／また
はペプチド類似体は、活性であるとみなす。 後述の実施例に示すように、高度のＬＣＡＴ活性化（３８％以上）を示すコア
ペプチドは、通常、小型の脂質単層小胞（ｌｉｐｉｄｉｃ ｓｍａｌｌ ｕｎｉ
ｌａｍｅｌｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ；ＳＵＶ）の存在下では有意なα−ヘリック
ス構造をとり（２２個以上のアミノ酸残基を含有する未ブロックのペプチドと１
８個以下のアミノ酸残基を含有するブロックされたペプチドの場合には６０％以
上のヘリックス構造であり、１８個以下のアミノ酸を含有する未ブロックのペプ
チドの場合には４０％以上のヘリックス構造である）、ＬＣＡＴ活性化を殆ど示
さないか、または全く示さないペプチドは、α−ヘリックス構造を殆どとらない
。しかしながら、脂質の存在下で有意なヘリックス構造を示すペプチドであって
も、ＬＣＡＴに有意な影響を与えない場合もある。 同様に、有意なＬＣＡＴ活性化を示すコアペプチドは典型的には脂質に結合す
るが、脂質結合を示すペプチドであってもＬＣＡＴ活性化に有意な影響を与えな
い場合もある。 そのため、当業者であれば、脂質の存在下でα−ヘリックスを形成し、脂質に
結合する本明細書に記載のコアペプチドの能力が活性にとって重要である一方、
多くの場合においてこれらの特性で十分とは言えないことも理解できるであろう
。従って、好適な実施形態では、本発明のコアペプチドを一連のスクリーニング
にかけ、有意な薬理活性を示すコアペプチドについて選別を行う。 第一の段階では、後述の第７節に記載するＣＤアッセイを用いて、脂質の存在
下でα−ヘリックスを形成する能力についてコアペプチドをスクリーニングする
。次いで、脂質の存在下（約５μＭの濃度、約３０の脂質：ペプチドモル比）で
、少なくとも４０％がヘリックスであるペプチドまたは少なくとも６０％がヘリ
ックスであるペプチドを、後述の第７節に記載する蛍光アッセイを用いて、脂質
に結合する能力についてスクリーニングする。当然のことながら、蛍光Ｔｒｐ（
Ｗ）またはＮａｌ残基を含むコアペプチドに限って、蛍光によって脂質結合をス
クリーニングする。しかしながら、蛍光残基を含まないペプチドの場合でも、脂
質の存在下でらせん度が増加すれば脂質へ結合することは明らかである。 次いで、ＳＵＶの存在下（０．５〜１０μＭのペプチド、１〜５０の範囲の脂
質：ペプチドモル比）で脂質結合を示すコアペプチドを薬理活性についてスクリ
ーニングする。当然のことながら、スクリーニング対象の薬理活性は、ＡｐｏＡ
−Ｉアゴニストの所望の用途に依存するものである。好適な実施形態では、本明
細書に記載の方法においてＬＣＡＴを活性化するペプチドが特に有用であるため
、ＬＣＡＴを活性化する能力についてコアペプチドをスクリーニングする。天然
のヒトＡｐｏＡ−Ｉと比べて少なくとも約３８％のＬＣＡＴ活性化を示すコアペ
プチド（後述の第８節に記載するＬＣＡＴ活性化アッセイを用いて判定）が好適
であり、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％以上のＬＣＡＴ活性化を
示すコアペプチドが特に好適である。 ５．２． ＡｐｏＡ−ＩをコードするＤＮＡベクターおよびＤＮＡカセット 本発明によれば、天然のＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−Ｉの改変型またはＡｐｏＡ
−Ｉ活性を有するペプチド（アゴニストと超アゴニストを含む）をコードするヌ
クレオチド配列を、カセットまたは適当な発現ビヒクル、即ち、挿入されたコー
ド配列の転写と翻訳に必要なエレメントを含むベクター、またはＲＮＡウイルス
ベクターの場合には複製と翻訳に必要なエレメントを含むベクター中へ挿入する
。本発明のヌクレオチド配列は、ｅｘ ｖｉｖｏとｉｎ ｖｉｖｏの両方の遺伝
子治療プロトコルで、「裸の」ＤＮＡ構築物として投与することができる。Ａｐ
ｏＡ−Ｉペプチドおよびアゴニストをコードする裸ＤＮＡプラスミドを被験者に
注射し、細胞にうまく取り込ませてペプチドとして発現させる（Ｆｅｌｇｎｅｒ
ら、米国特許第５，５８０，８５９号、引用によりその全文を本書に含める）。
「裸の」ＤＮＡはまた、非脂質のカチオン重合体との複合体またはリポソームと
の複合体の状態で投与して、細胞の取込みを増強することも可能である。 本発明のもう一つの実施例では、発現ビヒクルを、そのペプチドを発現する適
当な標的細胞中にトランスフェクトする。使用される発現系に応じて、次いで発
現されたペプチドを当該技術分野で周知の手順により分離する。組換えタンパク
質とペプチドを生成する方法は当該技術分野で周知である（例えば、Ｍａｎｉａ
ｔｉｓら、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．；Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒ
ｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ
ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅ
ｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ．Ｙ．を参照）。 本発明によれば、ＤＮＡカセットには、確実にＡｐｏＡ−Ｉペプチドが正しく
プロセシングされて宿主細胞から分泌されるようにＡｐｏＡ−Ｉのプレプロ体（
ｐｒｅ−ｐｒｏｆｏｒｍｅ）とプロ体（ｐｒｏｆｏｒｍ）をコードするヌクレオ
チド配列が含まれる。ＡｐｏＡ−Ｉのプレプロ体には、宿主細胞からＰｒｏＡｐ
ｏＡ−Ｉが分泌される際に切断されるアミノ末端に１８ａａリーダー配列または
シグナル配列が含まれている。ＡｐｏＡ−Ｉのリーダー配列は標準的な長さと疎
水性を有し（Ｄａｖｉｓら、１９８０、Ｎａｔｕｒｅ ２８３：４３３−４３８
を参照）、例えばアラニンなど小さい側鎖を有するアミノ酸で終結するものであ
る。例としては、限定するものではないが、以下のリーダー配列を本発明のＤＮ
ＡカセットとＤＮＡベクターに組込むことができる：５’ＭＫＡＡＶＬＴＬＡＶ
ＬＦＬＴＧＳＱＡ３’（配列番号： ）または５’ＭＫＡＡＶＬＡＶＡＬＶＦＬ
ＴＧＣＱＡ３’（配列番号： ）。宿主細胞からペプチドを分泌させる任意の配
列が本発明に使用できる。 ＡｐｏＡ−Ｉ、ＰｒｏＡｐｏＡ−Ｉのプロ体は、配列Ｒ−Ｈ−Ｆ−Ｗ−Ｑ−Ｑ
（配列番号： ）またはＸ−Ｅ−Ｆ−Ｘ−Ｑ−Ｑ（配列番号： ）を有する６ア
ミノ酸アミノ末端伸長を含む。特定のプロテアーゼによってプロセグメントが細
胞外で切断されると、ＡｐｏＡ−Ｉの血漿形（ｐｌａｓｍａ ｆｏｒｍ）が生成
する。本発明によれば、６アミノ酸伸長をコードする配列は、コードされたＡｐ
ｏＡ−Ｉペプチドが宿主細胞から分泌されたときに、確実に正しくプロセシング
されるよう本発明のＤＮＡカセットおよびＤＮＡベクターに組込むことができる
。 生産効率を増加させるため、酵素切断部位によって分離されたペプチドの多重
単位（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｕｎｉｔ）をコードするようにポリヌクレオチドを設
計することができる。即ち、ホモポリマー（反復ペプチド単位）またはヘテロポ
リマー（異なるペプチドが一緒に連なったもの）のいずれも、このように遺伝子
工学的に作製することができる。得られるポリペプチドは、ペプチド単位を回収
するために切断することができる（例えば、適当な酵素での処理によって）。こ
れにより単一のプロモーターによって生産されるペプチドの収量を増やすことが
できる。好適な実施形態では、ポリシストロン性ポリヌクレオチドを設計し、多
重ペプチド（即ち、ホモポリマーまたはヘテロポリマー）をコードする単一のｍ
ＲＮＡを転写させることができる（各コード領域は、キャップに依存しない翻訳
制御配列、例えば、Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ ３３４：
３２０−３２５により記述された配列などの内部リボゾーム侵入部位（ＩＲＥＳ
）に機能し得る形で連結させる）。好適な実施形態では、ＩＲＥＳはヒト免疫グ
ロブリンＨ鎖結合タンパク質（ＢｉＰ）ｍＲＮＡの５’非コード領域から誘導さ
れる（Ｍａｃｅｊａｋら、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ ３５３：９０−９４）。好
ましくは、ＩＲＥＳ領域はピコルナウイルスＩＲＥＳ領域配列から誘導され、Ｉ
ＲＥＳ配列はエンテロウイルス、ライノウイルス、カルジオウイルス、およびア
フタウイルスのＩＲＥＳ配列、Ａ型肝炎ウイルスのＩＲＥＳ配列、Ｂ型肝炎ウイ
ルス配列およびＣ型肝炎ウイルスのＩＲＥＳ配列からなる群より選択される。適
切なウイルス発現系に用いる場合には、ｍＲＮＡによりコードされる各ペプチド
の翻訳は、例えばＩＲＥＳにより、転写産物の内部で行われるよう指令される。
このように、ポリシストロン性構築物が単一の大型ポリシストロン性ｍＲＮＡの
転写を指令し、これが今度は複数の個々のペプチドの翻訳を指令する。このアプ
ローチによって、ポリタンパク質の生成と酵素によるプロセシングが不要となり
、また単一のプロモーターによって得られるペプチドの収量が有意に増加し得る
。 様々の宿主発現ベクター系を利用して本明細書に記載のペプチドを発現するこ
とができる。本発明によれば、（１）本発明のＡｐｏＡ−Ｉペプチドを発現し、
（２）哺乳動物細胞内で機能し得る発現制御エレメント（例えば、プロモーター
とエンハンサー）を利用し、および（３）高コピー数でＡｐｏＡ−Ｉヌクレオチ
ド配列を発現する任意の宿主発現系を使用することができる。好適な実施形態に
は、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子治療プロトコルを使用して遺伝
子操作される場合に、ヒト細胞内でＡｐｏＡ−Ｉペプチドおよびアゴニストをコ
ードするヌクレオチド配列のコピー数を増加させる任意の発現系がある。例とし
ては、限定するものではないが、適当なコード配列を含む組換えバクテリオファ
ージＤＮＡおよびプラスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌などの微
生物、適当なコード配列を含む組換え酵母または真菌発現ベクターで形質転換さ
れた酵母または糸状菌、適当なコード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（
例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系、適当なコード配列を含む組
換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスやタバコモ
ザイクウイルス）に感染している植物細胞系または適当なコード配列を含む組換
えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細
胞系、または動物細胞系が挙げられる。 発現系の発現エレメントは長さと特異性が異なる。使用する宿主／ベクター系
に応じて、哺乳動物（好ましくは、ヒト）宿主細胞系で機能し得る多くの転写お
よび翻訳エレメント（構成性プロモーターおよび誘導性プロモーター等）のうち
の任意のものを発現ベクターで使用することができる。好適な実施形態では、本
発明のベクターおよびカセット中に組込まれる発現エレメントは、天然のＡｐｏ
Ａ−Ｉ遺伝子の発現を調節するシス−およびトランス−調節エレメントである。
特に、転写調節エレメントおよびエンハンサーエレメントは、ＡｐｏＡ−Ｉ遺伝
子の上流−２２２から−１１０に位置するヌクレオチド配列中に見出される。例
えば、ＡｐｏＡ−Ｉ調節タンパク質−１（ＡＲＰ−１）用の結合部位では、ステ
ロイドホルモン受容体のスーパーファミリーのメンバーが、ＡｐｏＡ−Ｉ遺伝子
の上流の−２２２から−１１０のＤＮＡ領域に位置する肝臓特異的転写エンハン
サー内にある。ＡＲＰ−１を結合するためのコンセンサス配列は、５’ＴＧＡＡ
ＣＣＣＴＴＧＡＣＣＣＣＴ３’（配列番号： ）である（Ｌａｄｉａｓら、１９
９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：５６１−５６５を参照）。追加のＡｐｏＡ−Ｉ
転写調節配列とエンハンサーエレメントは、Ｓｏｒｃｉ−Ｔｈｏｍａｓら、１９
９１、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１８０４５−１８
０５０、Ｄａｉら、１９９０、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９０：３０５−
３１０、Ｒｏｔｔｍａｎら、１９９１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌｏｇｙ １１：３８１４−３８２０に開示されている。 細菌、植物、昆虫または哺乳動物の細胞系でクローニングを行う場合には、哺
乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモータ
ー）または哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例えば、アデノウイルス後期
プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を使用でき；発現産
物の多重コピーを含む細胞系を生成する場合には、ＳＶ４０、ＢＰＶおよびＥＢ
Ｖ系ベクターを適当な選択マーカーとともに使用することができる。 哺乳動物宿主細胞では、多くのウイルス系発現系を使用することができる。ア
デノウイルスを発現ベクターとして使用する場合には、目的のＡｐｏＡ−Ｉペプ
チドコード配列を、例えば、後期プロモーターと３連（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）
リーダー配列などのアデノウイルス転写／翻訳制御複合体にライゲートすること
ができる。次いでこのキメラ遺伝子を、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ
組換えによってアデノウイルスゲノムに挿入することができる。ウイルスゲノム
の非必須領域（例えば、Ｅ１またはＥ３領域）へ挿入すれば、生存可能で且つ感
染宿主内でＡｐｏＡ−Ｉペプチドを発現し得る組換えウイルスが得られる。（例
えば、ＬｏｇａｎおよびＳｈｅｎｋ、１９８４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１、３６５５−３６５９を参照）。挿入されたＡｐｏＡ−
Ｉペプチドコード配列の効率的な転写には、特定の開始シグナルもまた必要であ
る。これらのシグナルにはＡＴＧ開始コドンと隣接配列が含まれる。それ自身の
開始コドンと隣接配列を含む完全なＡｐｏＡ−Ｉを適当な発現ベクターに挿入す
る場合は、追加の翻訳調節シグナルは必要ではない。しかしながら、ＡｐｏＡ−
Ｉペプチドコード配列の一部のみを挿入する場合には、おそらくＡＴＧ開始コド
ンを含む外来性の翻訳制御シグナルを供給しなければならない。さらに、全イン
サートの翻訳を確保するためには、開始コドンは所望のコード配列のリーディン
グフレームと読取り枠が合っていなければならない。これらの外来性の翻訳制御
シグナルと開始コドンの起源は多岐にわたり、天然および合成のいずれであって
もよい。発現の効率は、適当な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネータ
ーなどを組込むことで強化することができる（Ｂｉｔｔｎｅｒら、１９８７、Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３、５１６−５４４を参照）。 本発明のペプチドを生成するための他の発現系は、当業者には明らかであろう
。 ５．２．１． ＡｐｏＡ−Ｉをコードするウイルスベクター 本発明によれば、ＡｐｏＡ−ＩアゴニストやＡｐｏＡ−Ｉ活性を有するペプチ
ドをコードする上述のヌクレオチド配列およびＤＮＡカセットを、適当なウイル
スベクターに遺伝子操作することができる。本明細書で述べるウイルスベクター
は本発明のヌクレオチド配列を供給するためのｉｎ ｖｉｖｏにおける遺伝学的
アプローチにとって特に有益である。本発明によれば、天然のＡｐｏＡ−Ｉを発
現するように遺伝子操作されたウイルスベクターは本発明には含まれない。 本発明の実施については、例えば肝細胞、大腸および小腸の細胞、内皮細胞な
どの疾患標的細胞に対して適切な指向性を示すウイルス、または標的細胞に対し
て適切な指向性を示すように遺伝子操作を行うウイルスを、ＡｐｏＡ−Ｉアゴニ
ストペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むように遺伝子操作する。本発
明の実施については、肝細胞と大腸および小腸の細胞に対して指向性を示すウイ
ルスが本発明の特に好ましい実施形態である。本発明に従って使用できるウイル
スベクターとしては、限定するものではないが、ヘパドナウイルス、アデノウイ
ルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、パルボウイル
ス、ワクシニアウイルスなどが挙げられる。 一つの具体的な実施形態では、肝細胞に対して本来指向性を有するヘパドナウ
イルスなどの弱毒化ウイルスを、本発明に従って遺伝子治療用に遺伝子操作して
使用することができる。ヘパドナウイルスは、天然のＡｐｏＡ−ＩおよびＡｐｏ
Ａ−Ｉをコードするヌクレオチド配列を、天然のＡｐｏＡ−ＩおよびＡｐｏＡ−
Ｉを本来発現する細胞および器官に送達するように遺伝子操作できる。外来ＤＮ
Ａ配列を挿入するための領域として作用し得るヘパドナウイルス・ゲノムの領域
が存在する。特に、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の表面抗原タンパク質（ｐｒｅ
−Ｓ１およびｐｒｅ−Ｓ２）をコードする配列は、ＡｐｏＡ−Ｉペプチドおよび
アゴニストをコードするＤＮＡ配列の挿入のための標的となり得る。例えば、Ａ
ｐｏＡ−Ｉペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ｐｒｅ−Ｓ１ ｍＲＮＡ
のプロモーターであるＴＡＴＡ様配列の下流（位置２７８）に挿入するか、また
はｐｒｅ−Ｓ２ ｍＲＮＡのプロモーターであるＳＶ４０様プロモーターの下流
（位置３１６６）に挿入することができる。これらの領域の下流に外来性のコー
ド配列を挿入することで、他の重要なウイルス活性を壊すことなくウイルス遺伝
子発現の調節下にこれらの外来性コード配列が置かれる。 アデノウイルスは、遺伝子治療に使用できる別のウイルスベクターである。ア
デノウイルスは肝臓と呼吸上皮に遺伝子を送達する特に興味深いビヒクルである
。アデノウイルスは本来呼吸上皮に感染し、そこに軽症の疾患を引き起こす。ア
デノウイルス系の送達系の他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮細胞、および筋
肉である。アデノウイルスは非分裂細胞に感染し得るという利点を有する。Ｋｏ
ｚａｒｓｋｙとＷｉｌｓｏｎ、１９９３、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉ
ｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ３：４９９−５０３
には、アデノウイルス系の遺伝子治療が概説されている。この他、Ｇｅｒａｒｄ
ら、１９９６年、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ．ｉｎ Ｌｉｐｉｄｏｌｏｇｙ ７
：１０５−１１１には、ＡｐｏＡ−Ｉの送達手段としてのアデノウイルス媒介遺
伝子導入が記載されている。Ｂｏｕｔら、１９９４、ＨｕｍａｎＧｅｎｅ Ｔｈ
ｅｒａｐｙ ５：３−１０では、アカゲザルの呼吸上皮に遺伝子を導入するため
のアデノウイルスの使用が実証されている。遺伝子治療における他のアデノウイ
ルス使用例は、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４
３１−４３４；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９２、Ｃｅｌｌ ６８：１４３−１
５５；およびＭａｓｔｒａｎｇｅｌｉら、１９９３年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅ
ｓｔ．９１：２２５−２３４に見られる。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）もまた
、遺伝子治療での使用が提案されている（Ｗａｌｓｈら、１９９３、Ｐｒｏｃ．
Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２０４：２８９−３００）。 例えば、ＡｐｏＡ−Ｉ ペプチドのヘテロポリマー（即ち、酵素の切断部位に
よって、またはＩＲＥＳ 配列によって分離されたＡｐｏＡ−Ｉアゴニストおよ
びスーパーアゴニストを含むヘテロポリマー）をコードするカセットが、遺伝子
操作で都合良くアデノウイルスに入れられる。本発明に従って操作されることが
できるアデノウイルスの遺伝子発現を制御するのに必要な遺伝子配列は、Ｅ１領
域、Ｅ３領域、または右のＩＴＲとＥ４領域の間である。これらの領域は目的の
ＴＲＥで置き換えられ、遺伝子組み換えアデノウイルスゲノムのパッケージング
によってウイルス粒子の中に組み入れられる。 遺伝子組み換えウイルスを目的として外来性ＤＮＡ配列を挿入するために、好
ましい部位として次の３つのアデノウイルスの領域がある。それは、（１）ＥＩ
Ａ領域および主要な後期プロモーター（ＭＬＰ）；（２）３つの部分からなるリ
ーダーと一緒になったＭＬＰ；（３）Ｅ３領域の置き換え、である。Ｅ３領域は
組織培養によりウイルスパッケージングのために必須ではないことが示された。
ＥＩＡおよびＭＬＰ領域に外来性ＤＮＡ配列を挿入することによって生じるキメ
ラウイルスは２９３細胞中の成長によってレスキューされるかまたは、失われた
機能をイン−トランスで提供するヘルパーウイルスによって同時形質導入される
。 神経系への自然な走性を示すヘルペスシンプレックスウイルスは、修飾して、
肝細胞または内皮細胞に感染させ、またＡｐｏＡ−Ｉペプチドをコードする望ま
しいヌクレオチド配列を含ませても良い。例えば、ＡｐｏＡ−Ｉペプチドのヘテ
ロポリマーをコードするカセットは、ＩＣＰ４遺伝子配列またはＶＰ１６遺伝子
配列のような、ＨＳＶの初期プロモーション領域の下流で、これらの配列の発現
を増強するために遺伝子操作される。ＨＳＶのいくつかの構造遺伝子は、遺伝子
組み換えウイルスを目的とする外来性ＤＮＡ配列の挿入のための標的にできる。
例えば、構造的グリコプロテイン、ｇＢ、ｇＤおよびｇＨをコードするヌクレオ
チド配列は、外来性ＤＮＡ配列を挿入するための領域とすることができる。しか
し、置換され、および／または分裂したこれらの遺伝子産物は、結果として生じ
る遺伝子組み換えウイルス株の作製のために、ベクターによってイン−トランス
で提供され、および／または宿主細胞によって発現される。 ヒトのレトロウイルス、例えばＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−２、またはヒト
リンパ球への走性を示す動物のレトロウイルス、例えばウシの白血病ウイルス、
モロニーマウス白血病ウイルス、ラウス関連ウイルス、およびネコの白血病ウイ
ルスが、肝細胞を標的にするために使われる。レトロウイルスの複製に必要な配
列はＬＴＲに位置しており、それ故、外来性ＤＮＡ配列、即ち目的ＡｐｏＡ−Ｉ
ペプチドのコードする配列は下流に挿入される。レトロウイルスに感染した細胞
では、ウイルス転写は組み込まれたウイルスＤＮＡ、プロウイルスから生じ、そ
れはそれ自身の調節配列を含む転写ユニットを表す。プロウイルスの発現は（１
）プロウイルスが組み込まれた部位；（２）細胞の生理的状況；（３）ウイルス
のＬＴＲ に依存する。プロウイルスの発現は殆ど完全に宿主にコードされた酵
素に依存する。 ウイルスのＬＴＲはウイルスＲＮＡの３つの断片、Ｒ、Ｕ５、およびＵ３配列
の由来する。Ｒまたは重複配列は短い断片で初期（３０〜６０ヌクレオチド）、
ウイルスＲＮＡ中、最左端（５’）および右端（３’）に、２倍存在する。Ｕ５
配列はウイルスＲＮＡの５’末端に存在する。Ｕ３配列はＲ配列から上流に位置
し、サイズは最も広範囲にわたり（０．２〜１．２ｋｂ）、配列相同性である。 発現のウイルス特異的制御は主にＲＮＡ合成の増強、促進、開始およびポリア
デニル化のための信号を含む長い末端反復配列（ＬＴＲ）に依存する。転写は左
側ＬＴＲにおけるＲ配列の左端で開始される。ウイルス転写は細胞のタイプＩＩ
ＲＮＡポリメラーゼによって触媒され、右のＬＴＲの右側の近くで転写後ポリ
アデニル化される。すべてのＬＴＲのＵ３領域はＣＣＡＡＴおよびＴＡＴＡＡボ
ックスを持っている。エンハンサー機能はプロモータードメインから上流に、Ｕ
３に見いだされる種々の長さ（７２〜１０１ヌクレオチド）の反復配列に局在し
ている。モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＴＶ）ＬＴＲのＵ３における配列
はＭＭＴＶ−感染細胞のグルココルチコイド治療に応じて増強される、ウイルス
発現のレベルを決定することも見いだされた。 ヒトＴ細胞への自然の走性を示すマウスパルボウイルス（ＭＶＭ）は肝細胞ま
たは腸の内皮細胞に感染させるために修飾してもよい。ＭＶＭの場合は、ウイル
スのＤＮＡ複製の最初の段階に必要な主要なシス作用因子が上流の“初期”プロ
モーター、Ｐ４で見いだされている。（Ｃｏｔｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９
２，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９０：３６５−３７７）初期プロモーターはウイルス
転写のための開始プロモーターで初期、そのＴＡＴＡＡボックスはＭＶＭゲノム
の左端から４マップ単位のところに初期、１５０番目のヌクレオチドのあたりに
ある。ＭＶＭ ＤＮＡ複製の起源として必須のシス作用機能もこの領域に見いだ
されている。この領域の丁度下流にあるＡｐｏＡ−１ペプチドのコード配列のよ
うな外来性ＤＮＡ配列を挿入することにより、これを、他の必須のウイルス活性
、即ちＤＮＡ複製を崩壊させることなく、ウイルス遺伝子発現の制御下に置く。 プロトタイプのラブドウイルスである水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）は哺乳
類の細胞において遺伝子治療で本発明のＡｐｏＡ−１ペプチドを発現するために
用いられることができる。ＶＳＶは封入動物ウイルスの中で最も簡単なもので、
非常に高い力価まで成長し、大量に調製することができる。外来性のグリコプロ
テインが、肝細胞あるいは小腸や大腸の細胞をウイルスベクターの標的とするた
めに、ＶＳＶ Ｇの封入タンパク質に挿入される。ＶＳＶ Ｇ遺伝子は本発明の
ＡｐｏＡ−Ｉペプチドをコードするヌクレオチド配列を受け入れるに十分な大き
さがある。（Ｓｃｈｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１１３５９−１１３６５参照） アルファウイルスに基づく発現ベクター、封入プラス鎖ＲＮＡウイルスのプロ
トタイプ、はまた本発明のＡｐｏＡ−Ｉペプチドをコードするヌクレオチドの効
果的な発現を媒介するために遺伝子操作できる。通常は脊椎動物の細胞に対して
細胞致死性であるが、アルファウイルスに適応性変異を施した変異種はアルファ
ウイルスベクターの非細胞変性複製を行う事ができる。ＡｐｏＡ−Ｉペプチドを
コードしたヌクレオチド配列は複製、ならびにＲＮＡプロモーターが不完全なア
ルファウイルスゲノムの構造遺伝子の中に組み込まれる。シス作用性配列を含む
欠陥のあるヘルパーＲＮＡｓは複製が不完全なアルファウイルスベクターをパッ
ケージするために必要である（Ｆｒｏｌｏｖ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１１３７１−１１３７７）。
ＶＳＶやアルファウイルスに加えて、インフルエンザウイルス、ラバブウイルス
、パラインフルエンザウイルス、ブニャウイルスも同様の技術で、本発明のＡｐ
ｏＡ−Ｉペプチドをコードするヌクレオチド配列の送達と発現のために遺伝子操
作される。 上記のウイルスベクターは例示であり、本発明を限定するものではない。Ａｐ
ｏＡ−Ｉペプチドおよびアゴニストをコードするヌクレオチド配列を、標的細胞
へ安全に送達するために遺伝子操作される任意のウイルスベクターを本発明に従
って使用してもよい。 ５．２．２ ＡｐｏＡ−Ｉを発現する宿主細胞 本発明は動物細胞または細胞系、好ましくはヒトの細胞または細胞系に於いて
上記のようなＡｐｏＡ−ＩおよびＡｐｏＡ−Ｉ活性を表すペプチドの発現を包含
し、これはその後ｉｎ ｖｉｖｏで投与されうる。ＡｐｏＡ−ＩおよびＡｐｏＡ
−Ｉ活性を表すペプチドを発現するために本発明に従って使用できる宿主細胞は
、繊維芽細胞、Ｃａｃｏ−２細胞、上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞、肝細胞、大
腸や小腸から単離される細胞などを含むがこれらに限定されるものではない。本
発明の好ましい実施形態としては、ＡｐｏＡ−ＩおよびＡｐｏＡ−Ｉ活性を表す
ペプチドを発現するために、宿主細胞として肝細胞、および小腸から単離される
細胞が用いられる。 本発明の宿主細胞は、脂質代謝におけるＡｐｏＡ−Ｉの役割をさらに理解する
ためのモデルシステムとしての有用性も持つ。 本発明の１つの実施形態として、宿主細胞は、形質導入された細胞を受け取る
ことになる個体である受容者（患者）から、あるいは提供者から得られる。本発
明に従って遺伝子組み換えされる細胞の例としては、肝細胞、胆嚢細胞、小腸細
胞、上皮細胞、内皮細胞（小血管、大血管から単離される細胞を含む）が挙げら
れるが、それらに限定されるものではない。単離細胞はトランスフェクトされる
か、または本明細書に記載したＤＮＡとウイルスベクターにより形質導入される
。形質導入された細胞は、次いで受容者にグラフトされるかまたは移植される。 本発明のもう１つの実施形態としては、一時的および永久的な組換え細胞系を
作製し、天然のアポリポタンパク質Ａまたは他のアポリポタンパク質のコード配
列が、修飾されたプレプロアポリポタンパク質Ａ−Ｉ、修飾プロアポリポタンパ
ク質Ａ−Ｉ、または修飾されたＡｐｏＡ−ＩもしくはＡｐｏＡ−Ｉアゴニストの
コード配列によって置き換えられる。 挿入配列の発現を調節するか、または遺伝子産物を特定の設計様式に改変およ
びプロセシングするような宿主細胞株を選択してもよい。そのようなタンパク質
生成物の修飾（例えば、グリコシル化）とプロセッシング（例えば、切断）はタ
ンパク質の機能のために重要である。異なる宿主細胞によって、タンパク質およ
び遺伝子産物の翻訳後のプロセッシングや修飾の特徴的かつ特異的なメカニズム
を有している。適した細胞系または宿主系を、発現されるべき外来性蛋白の正し
い修飾を確実にするように選択することができる。この目的のために遺伝子産物
の一次転写、グリコシル化、リン酸化のための細胞組織を有する真核宿主細胞を
用いてもよい。そのような哺乳動物の宿主細胞は、ＣＨＯ，ＶＥＲＯ，ＨｅＬａ
，ＣＯＳ，ＭＤＣＫ，２９３，３Ｔ３，およびＷＩ３８細胞系を含むがこれらに
限定されるものではない。 ＡｐｏＡ−Ｉアゴニスト活性を持つ天然ＡｐｏＡ−Ｉまたはペプチドの長期間
の高収率生産のために、安定にこれらのペプチドを発現する哺乳動物の宿主細胞
を作製してもよい。ウイルス性の複製起源を含む発現ベクターを用いるよりもむ
しろ、宿主細胞は、適当な発現制御因子（例えばプロモーター、エンハンサー、
配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）および選択マーカーによ
って制御されるＤＮＡで形質転換できる。外来性ＤＮＡの導入に続いて、遺伝子
操作された細胞を１〜２日間富化栄養培地で成長させ、それから選択した培地に
移動する。組換えプラスミド中の選択可能マーカーのおかげで、選択に対する耐
性を与え、細胞の染色体中にプラスミドを安定に組み込ませ、成長させて核（ｆ
ｏｃｉ）を形成させ、それをまたクローン化して細胞系にまで拡大することがで
きる。この方法は細胞系を製造するのに有利に使用される。この方法はＡｐｏＡ
−ＩおよびＡｐｏＡ−Ｉペプチドの遺伝子産物を発現する細胞系を設計するのに
有利に使用される。そのような細胞系はＡｐｏＡ−ＩやＡｐｏＡ−Ｉペプチド遺
伝子産物の内因性活性に影響を及ぼす化合物のスクリーニングや評価に特に有用
である。 多くの選択系が用いられる。即ち、ヘルペスシンプレックスウイルスのチミジ
ンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，１９７７，Ｃｅｌｌ １１：２２３
）、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂ
ａｌｓｋａ ＆ Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，１９６２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ４８：２０２６）、およびアデニン−ホスホリボシルトラ
ンスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ，ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｃｅｌｌ ２２：８１７
）遺伝子がそれぞれｔｋ⁻，ｈｇｐｒｔ⁻またはａｐｒｔ⁻細胞中で用いられる
が、これらに限定されるものではない。また抗代謝耐性は、以下の遺伝子につい
て選択する基準として使用できる：ｄｈｆｒこれはメトレキセートに対する耐性
を与える。（Ｗｉｇｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：３５６７； Ｏ’Ｈａｒｅ，ｅｔ ａｌ．，１
９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８： １５２７）
； ｇｐｔ これはミコフェノール酸への耐性を与える。（Ｍｕｌｌｉｇａｎ
＆ Ｂｅｒｇ，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７
８： ２０７２）； ｎｅｏこれはアミノグリコシドＧ４１８への耐性を与える
（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ，ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ．１５０：１）；ならびにｈｙｇｒｏこれはハイグロマイシンへの耐性
を与える（Ｓａｎｔｅｒｒｅ，ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｇｅｎｅ ３０： １
４７） 例えば、ＡｐｏＡ−Ｉペプチドのヘテロポリマーをコードするカセットは上に
詳述したように、アデノウイルスの中に有利に設計される。 ５．２．３ ＡｐｏＡ−Ｉを発現するトランスジェニック動物 本発明はまた遺伝子治療のための有用性を持つことに加えて、脂質代謝におけ
るＡｐｏＡ−Ｉの役割をさらに理解するためのモデル系として、本発明のトラン
スジェニック動物のＡｐｏＡ−Ｉヌクレオチド配列の発現を包含する。マウス、
ラット、ウサギ、モルモット、ミニブタ、ヤギ、ヒト以外の霊長類（例えばヒヒ
、サル、チンパンジー）などの任意の動物種がＡｐｏＡ−Ｉトランスジェニック
動物を作るために使われるが、これらに限定されるものではない。 ＡｐｏＡ−Ｉ導入遺伝子を動物に導入して、トランスジェニク動物の第一世代
を作るために、当該分野で公知の技術を用いることができる。このような技術に
は、前核微量注入（Ｈｏｐｐｅ，Ｐ．Ｃ．ａｎｄ Ｗａｇｎｅｒ，Ｔ．Ｅ．，１
９８９，Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，８７３，１９１）； レトロウイルスを媒
介とした細菌ラインへの遺伝子導入（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｒ ｅｔ ａ
ｌ．，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ８２：
６１４８−６１５２）；胚幹細胞における遺伝子標的（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，ｅｔ
ａｌ．，１９８９，Ｃｅｌｌ ５６：３１３−３２１）；胚のエレクトロポレ
ーション（Ｌｏ，１９８３，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ３：１８０３−１８１４）；な
らびに精子を媒介とした遺伝子導入（Ｌａｖｉｔｒａｎｏ ｅｔ ａｌ．，１９
８９，Ｃｅｌｌ ５７：７１７−７２３）；等が挙げられるが、これらに限定さ
れない。そのような技術の総説としては、参照によりその全体が本明細書に援用
されるＧｏｒｄｏｎ，１９８９，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍａｌｓ，Ｉｎ
ｔｌ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１１５： １７１−２２９を参照のこと。 本発明はいくつかの、しかし全部ではない細胞に導入遺伝子を担持する動物（
すなわちモザイク動物）、ならびに全細胞にＡｐｏＡ−Ｉ導入遺伝子を担持する
トランスジェニック動物を提供する。導入遺伝子は単一の導入遺伝子として、ま
たはコンカテマー（例えばヘッド−ヘッド（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｈｅａｄ）タンデ
ムまたはヘッド−テイル（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ）タンデム）で組み込まれ
る。導入遺伝子はまた、Ｌａｓｃｏ ｅｔ ａｌ．の教示（Ｌａｓｃｏ，Ｍ．ｅ
ｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９
： ６２３２−６２３６）に従って、特定の細胞タイプ中に選択的に導入され、
活性化される。そのような細胞型特異的活性化に必要となる調節配列は、本発明
の特定の目的の細胞型に依存し、当業者には明らかであろう。ＡｐｏＡ−Ｉ導入
遺伝子が内因性ＡｐｏＡ−Ｉ遺伝子の染色体部位に組み込まれることが望まれる
場合、遺伝子標的化が好ましい。簡単に言えば、そのような技術が利用される場
合、内因性ＡｐｏＡ−Ｉ遺伝子と相同なヌクレオチド配列をいくつか含むベクタ
ーが、染色体配列との相同的組換えを介して、内因性ＡｐｏＡ−Ｉ遺伝子のヌク
レオチド配列の機能を破壊する組込みのために設計される。また、例えばＧｕら
（Ｇｕ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５，１０３−１０６）
の教示に従って、導入遺伝子を、特別の細胞型に選択的に導入し、その細胞型の
みにおいて内因性ＡｐｏＡ−Ｉを不活性化してもよい。そのような細胞型に特異
的な不活性化に要求される調節配列は、本発明の特定の目的の細胞型に依存し、
当業者には明白である。 ５．３ ＡｐｏＡ−Ｉペプチドを送達するための遺伝子治療法 また、本発明に従って天然のＡｐｏ−ＩまたはＡｐｏＡ−Ｉペプチドをコード
するヌクレオチド配列を送達するために、遺伝子治療法を用いることもできる。 本発明の遺伝子治療法は、動物、特にヒトを含む哺乳動物における任意の障害
を治療するのに使用でき、このためには血清ＨＤＬ濃度の上昇、ＬＣＡＴの活性
化、およびコレステロール流出およびＲＣＴの促進が有用である。このような症
状には、高脂血症、特に高コレステロール血症、およびアテローム硬化症などの
心臓血管疾患（アテローム硬化症の予防および既存の病気の治療を含む）；再狭
窄（例えば、バルーン式血管形成などの医療処置の結果発達するアテローム硬化
性プラークの予防または治療）；ならびに内毒血症（これはしばしば敗血症性シ
ョックを生じる）（例えばＧｏｕｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｌｉｐｉ
ｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ９４：１３９−１４６； Ｌｅｖｉｎｅ，ＷＯ９６／０
４９１４）などのその他の障害、が挙げられるがこれらに限定されない。 上記症状を治療するために、本発明の遺伝子治療法は単独で、または他の薬剤
での治療と組み合わせて使用できる。このような治療には、関与する薬剤の同時
投与または連続投与が含まれるが、これらに限定されない。 ５．３．１ 遺伝子置換治療 正常なＡｐｏＡ−Ｉペプチド発現および／またはＡｐｏＡ−Ｉペプチド産物活
性レベルの増加に関して、上記第５．１節に述べたＡｐｏＡ−Ｉペプチドヌクレ
オチド配列が、例えば異常脂肪血症または高脂血症の治療に利用される。そのよ
うな治療は例えば、遺伝子置換治療の形で行われる。特に、正常ＡｐｏＡ−Ｉペ
プチドまたは正常なＡｐｏＡ−Ｉペプチド機能を示すＡｐｏＡ−Ｉペプチド産物
の産生を指令するＡｐｏＡ−Ｉペプチドの部分の１つ以上のコピーがベクターを
用いて患者の適当な細胞に挿入される。ベクターはアデノウイルス、アデノ随伴
ウイルス、およびレトロウイルスベクター、および細胞にＤＮＡを導入する他の
粒子、例えばリポゾームを含むが、これらに限定されるものではない。 ＡｐｏＡ−Ｉタンパク質は肝臓で発現するので、そのような遺伝子置換治療技
術はＡｐｏＡ−Ｉペプチド配列を患者の中でこれらの細胞型に送達することがで
きなければならない。 もう１つの具体的な例では、送達のための技術はそのようなＡｐｏＡ−Ｉペプ
チド配列を、ＡｐｏＡ−Ｉペプチド配列が発現されるべき細胞の部位に直接投与
することを含む。 ＡｐｏＡ−Ｉペプチド発現および／またはＡｐｏＡ−Ｉペプチド産物活性の全
体のレベルを増加させるために利用される他の方法として、適当なＡｐｏＡ−Ｉ
発現細胞、好ましくは自己由来の細胞を、高脂血症の症状を治すために十分の量
を患者のしかるべき場所に導入することが含まれる。このような細胞は、組換え
型であってもよいし、非組換え型であってもよい。 患者の中でＡｐｏＡ−Ｉペプチド発現の全体レベルを増加させるために投与す
ることができる細胞には通常の細胞、好ましくはＡｐｏＡ−Ｉペプチドを発現す
る肝細胞である。 また、細胞、好ましくは自己由来細胞を、ＡｐｏＡ−Ｉペプチド配列を発現す
るように設計することができ、これは、異常脂肪血症の症状の回復に適する位置
で、患者に導入される。あるいは、損傷のないＡｐｏＡ−Ｉペプチドを発現し、
ＭＨＣ適合の個体から得られる細胞を利用することができ、それには例えば肝細
胞が含まれる。ＡｐｏＡ−Ｉペプチド配列の発現は必要な細胞型中でこのような
発現ができるように適当な遺伝子制御配列によってコントロールされる。そのよ
うな遺伝子制御配列は当業者にはよく知られている。そのような細胞に基づく遺
伝子治療技術も当業者にはよく知られている。例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，米国
特許第５，３９９，３４９号を参照のこと。当該文献は、本明細書中に参考とし
てその全体が組み込まれる。 投与される細胞が非自己由来のものである場合には、それらは導入する細胞に
対する宿主の免疫応答が発生するのを防ぐ、よく知られた技術を用いて投与され
る。例えば、細胞はカプセル化された形態で導入される。これにより、細胞のす
ぐ外側の環境との成分の交換を可能としつつ、導入された細胞が宿主の免疫系に
より（異物として）認識されないようにする。 ５．３．２ ｉｎ ｖｉｖｏにおける核酸の輸送 核酸の患者への輸送には、直接法か間接法かの２方法がある。直接法では、患
者に核酸または核酸担持ベクターを直接曝露し、間接法では、細胞をまずｉｎｖ
ｉｔｒｏで形質転換し、それから細胞置換療法のために患者に移植する。この２
つの手法は、それぞれｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子療法として知
られている。 一具体的態様では、核酸をｉｎ ｖｉｖｏで直接投与し、コード化した産物が
生産されるように発現させる。これは、当分野で公知の多くの手法のいずれでも
行いうる。例えば、適切な核酸発現ベクターの一部として所望の核酸を構築し、
それを細胞内に、例えば、欠陥ないしは弱毒化レトロウィルや他のウィルススベ
クターを用いて感染させることによって投与する方法（アメリカ特許Ｎｏ．４，
９８０，２８６参照）、裸のＤＮＡを直接注入する方法、微小粒子の打ち込み（
例えば、デュポンの遺伝子銃Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）を使うか、脂質または細胞表
面受容体または形質導入剤による被覆を使うか、リポソームまたは微小粒子また
は微小カプセル内の包接化を使う方法、細胞ないしは核内に入り込むことが判明
しているペプチドと連結して核酸を投与する方法――例えば核酸を、受容体−介
在細胞貪食作用を受けやすいリガンドに連結して投与する方法（例えば、Ｗｕ
ａｎｄ Ｗｕ，１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３
２参照。）（これは、特異的に受容体を発現している細胞型を標的するのに使用
し得る。）などがある。一具体的態様では、特異的受容体を標的することによっ
て、核酸が、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて細胞特異的取り込みや発現に対して標的に
なり得る（例えば、ＰＣＴ公報１９９２年４月１６日付ＷＯ９２／０６１８０
（Ｗｕら）； １９９２年１２月２３日付ＷＯ９２／２２６３５（Ｗｉｌｓｏｎ
ら）； １９９２年１１月２６日付ＷＯ９２／２０３１６（Ｆｒｉｎｄｅｉｓら
）；１９９３年７月２２日付ＷＯ９３／１４１８８（Ｃｌａｒｋｅら）；１９９
３年１０月１４日付ＷＯ９３／２０２２１（Ｙｏｕｎｇ））。別の態様では、リ
ガンドの中にエンドソームを壊す融合誘導ウィルス性ペプチドを含んだ核酸−リ
ガンド複合体が形成される。このことは核酸がリソソームによる分解を受けにく
いようになっていることを意味する。代替として、核酸は、相同的組み換えによ
って、細胞内に導入され、発現用宿主細胞ＤＮＡ内に取り込まれ得る（Ｋｏｌｌ
ｅｒ ＆ Ｓｍｉｔｈｉｅｓ，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８６：８９３２−８９３５；Ｚｉｊｌｓｔｒａ ら、１９８９，Ｎ
ａｔｕｒｅ ３４２：４３５−４３８）。 更に、別の態様では、核酸を、時間制御放出装置を使ってｉｎ ｖｉｖｏで投
与し得る。また、本核酸は、ｉｎ ｖｉｖｏで、本発明のＡｐｏＡ−Ｉペプチド
及びアゴニストを発現している細胞を含んだ装置を使って投与することもできる
。そうすることによって、核酸の受容者ないしは宿主による拒絶を防ぐことがで
きる。本装置を使用することによって、切断分子量として約３，５００〜５０，
０００ダルトンの蛋白質やペプチドは、透過性膜を通して拡散できる。 肝細胞を標的するＤＮＡないしはウイルスベクターのための一つの戦略は、肝
細胞上にアシアロ糖蛋白（ＡＳＰＧ）受容体が存在することに基づいている。こ
の受容体は、肝細胞表面上に特異的に発現している。アシアログリコペプチド−
蛋白質複合体およびアシアログリコペプチドを被覆した小胞は、種々の生物活性
剤を特異的にｉｎ ｖｉｖｏで肝臓に輸送することに使われてきた。Ａｉｔｉｅ
ら、１９８０，Ｐｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２７：５９２３−５９２
７；Ｈｉｌｄｅｎｂｒａｎｄｔら、１９８０，ＢＢＡ ６３１：４９９−５０２
。 ヌクレオチド配列の肝細胞への標的輸送する他の戦略は、ウイルスベクター、
つまりＡＳＰＧ受容体に対するリガンドを発現しているアデノウィルスやレトロ
ウィルスを遺伝子的に修飾することである。ウィルスの内在化は、ウィルス包膜
の、細胞表面受容体との特異的相互作用、それに引き続くウィルス／受容体複合
体の受容体介在貪食作用との特異的相互作用によって起こる。本発明に関連して
使用されるウィルスベクターについては、既に５．２．２章で議論した。 ５．３．３ ｅｘ ｖｉｖｏによる核酸の輸送 本発明の細胞置換治療で使用される遺伝子治療の別のアプローチとして、組織
培養内の細胞に遺伝子を輸送する方法がある。その方法には、エレクトロポーレ
ーション法（電気穿孔法）、リポフェクション法、リン酸カルシウム介在トラン
スフェクション法、ウィルス感染法がある。通常の輸送法としては、選択的マー
カーの細胞への輸送がある。細胞は選択にかけられ、輸送された遺伝子を取り込
み、それを発現している細胞が単離される。次いで、この細胞を患者に移送する
。 本態様では、核酸は、ｉｎ ｖｉｖｏ投与の前に細胞内に導入され、組換え細
胞とする。そのような導入は、公知のいかなる法により行われる。その手法は以
下のものを含むがこれに限らない。つまり、トランスフェクション法、エレクト
ロポーレーション法、微量注入法、核酸配列を含むウィルスベクターによる感染
法、細胞融合法、染色体介在遺伝子輸送法、微小細胞介在遺伝子輸送法、スフェ
ロプラスト法などである。外来遺伝子を細胞中に導入する方法として数多くの技
法が知られている（例えば、Ｌｏｅｆｆｌｅｒ ＆ Ｂｅｈｒ，１９９３，Ｍｅ
ｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５９９−６１８；Ｃｏｈｅｎら、１９９３，Ｍ
ｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ，２１７：６１８−６４４；Ｃｌｉｎｅ，１９８５，Ｐ
ｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．２９：６９−９２参照）。これらの方法は、受容者の
細胞の、生育上かつ生理的に必要な機能が阻害されないという前提の下で、本発
明に従って使用し得る。その手法を使えば、核酸が確実に細胞に輸送されるはず
であり、その結果、核酸は細胞内で発現可能となり、細胞の後続子孫に遺伝的に
伝達されかつ細胞内に発現可能となる。 得られた組み換え細胞を、当分野で公知の種々の手法により患者に移送するこ
とができる。好ましい態様では、上皮細胞を、例えば皮下注射することが挙げら
れる。他の態様では、、組み換え皮膚細胞（例えば、角質化細胞）は、患者に皮
膚移植片として適用される。組み換え血液細胞（例えば、造血幹細胞または始原
細胞）は、好ましくは静脈投与される。想定される細胞の使用量は、望まれる効
果、患者の状態などに依存し、この当分野に熟達している人によって決定されう
る。 組み換え細胞が遺伝子治療に用いられる一態様では、遺伝子またはプロモータ
ーサプレッサーをコードしているヌクレオチドを、細胞内ないしは細胞子孫内で
発現し得るように細胞内に導入し、そしてその組み換え細胞をｉｎ ｖｉｖｏで
治療効果を狙って投与する。一具体的態様では、幹細胞または始原細胞が使われ
る。単離され、ｉｎ ｖｉｔｒｏで維持されうるいずれの幹細胞および／または
始原細胞も、本発明の本態様に従って使用され得る。 ｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子治療アプローチの例として、これらの例に限った訳では
ないが、以下の手順が、本発明のＡｐｏＡ−Ｉを発現するよう遺伝子的に操作さ
れる肝細胞の単離や、その遺伝子操作された組み換え肝細胞の受容者への移植片
移植または組移植のために利用される。 本態様では、肝臓を供与者や、組換え肝細胞を受けることになっている個人、
つまり受容者から得る。この手順には、肝臓の一部を分離すること、肝臓から肝
細胞をコラーゲナーゼ溶液内での灌注によって分離することが含まれる。肝細胞
が無傷の肝臓から単離される場合には、肝臓から出る、いしは肝臓に入る血管内
にカテーテルを挿入し、カテーテルが挿入された血管を通してコラーゲナーゼ溶
液を灌注し、肝細胞を遊離させる。分離ないしは単離した後、肝細胞はプレート
上に置かれ、形質導入に適切な条件下で保管される。 例えば、高密度のラット肝細胞集団の単離と、この細胞を長期間培養保存する
多数の方法が提示されている。Ｋｏｃｈ，Ｋ．Ｓ．ａｎｄ Ｈ．Ｌ．Ｌｅｆｆｅ
ｒｔ，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，３４
９：１１１−１２７（１９８０）；ＭｃＧｏｗａｎ，Ｊ．Ａ．ら、Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｓｉｏｌｏｇｙ，１０８：３５３−３６３（
１９８１）；Ｂｉｓｓｅｌｌ，Ｄ Ｍ．ａｎｄ Ｐ．Ｓ．Ｇｕｚｅｌｉａｎ，Ａ
ｎｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅ
ｎｃｅｓ，３４９：８５−９６（１９８１）；ａｎｄ Ｅｎａｔ，Ｒ．ら、Ｐｒ
ｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１：１４１１−１４１５（１９８４）。こ
ういった方法は、本発明の方法で形質移入された肝細胞の単離と保管に使用でき
る。肝細胞は、下記および実施例１で示したように、ＢａｒｒｙおよびＦｒｉｅ
ｎｄによって開発された手順を修飾した方法、およびＬａｆｆｅｒｔにより記載
された灌注混合法を使って調製した。Ｌａｆｆｅｒｔ，Ｈ．Ｌ．ら、Ｍｅｔｈｏ
ｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，５８：５３６−５４４（１９７９）。この教
示は、参考としてここに取り入れた。 肝臓内に取り込まれ、発現している遺伝物質は、選択できるマーカーをコード
している遺伝物質を任意に含めることができる。従って、興味の対象となる遺伝
物質を含有しかつ発現している細胞を同定し、選択することが可能となる。 かくして、本発明の培養肝細胞中に導入されたＤＮＡまたはＲＮＡは、対象と
なる遺伝物質（ＤＮＡまたはＲＮＡ）や、場合によっては、選択可能なマーカー
をコードした遺伝物質を含有している。そのようなＤＮＡまたはＲＮＡを取り込
み遺伝物質（または取り込みＤＮＡ、取り込みＲＮＡ）と称する。取り込み遺伝
物質を含む肝細胞は、形質導入肝細胞と称する。この肝細胞は、対象となるＤＮ
ＡまたはＲＮＡを発現し、コードされた蛋白質ないしはポリペプチドを産生する
。 対象となるポリペプチドまたは蛋白質、場合によっては選択できるマーカー（
例えば、ネオマイシン耐性をコードしているｎｅｏ）をコードしている外来性Ｄ
ＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、下記および実施例Ｉ〜ＩＩＩに記載されるように
、肝細胞中に取り込まれる。上述したように、単離された肝細胞は、基質マトリ
ックス上にサブコンフルエントな密度で置かれ、Ｅｎａｔらが記載した、ホルモ
ン的に規定された培地中で維持される。Ｅｎａｔの教示は、参考としてここに示
した。Ｅｎａｔ，Ｒ．ら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎ
ａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ，８１：１４１１−１
４１５（１９８４）。 肝細胞維持の必要程度に応じて培地を変えた。 続いて、細胞を、対象となるＤＮＡ（例えば、その発現が肝細胞中で望まれて
いるポリペプチドをコード化しているＤＮＡ）を含む両種性レトロウィルスで感
染させ、場合によっては、肝細胞中に取り込まれ得る選択可能なマーカーをコー
ドしているＤＮＡで感染させた。この肝細胞を、組み換えゲノムを持つウィルス
に暴露させることにより、組み換えアデノウィルスまたはレトロウィルスで感染
させた（このため、対象となるＤＮＡは形質導入された）。このことによって、
組み換えレトロウィルスによって細胞が感染される結果となった。高力価両種性
ウィルスを用いることにより、肝細胞感染条件の最適化が可能である。 所望の遺伝物質を肝細胞中に導入するために使用されるウィルスストックは、
上述したように採取され、Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ（Ａｌｄｒｉｃｈ）で補充され、
肝細胞用の培地が加えられる。ウィルスの力価が高い場合には（例えば、約１０
^６ｃｆｕ／ｍｌ）、実質的に全肝細胞が感染を受け、形質導入細胞を選択する必
要性はない。一方、力価が極めて低い場合には、ｎｅｏまたはｈｉｓのような選
択可能なマーカーを持ったレトロウィルスベクターを使用する必要がある。選択
マーカーが使用される際には、ウィルスに暴露後、細胞がコンフルエンスになる
まで培養し、選択培地中に２分する（例えば、選択マーカーがｎｅｏであれはＧ
４１８を含む培地中で、選択マーカーがｈｉｓであればヒスチジノールを含むが
ヒスチジンを含まない培地に入れる）。 取り込んだ遺伝子物質を発現している肝細胞は、組織培養容器中でコンフルエ
ントになるまで増殖され、培養容器から分離され、体内に導入される。これは例
えば手術によって行われる。この場合には、対象となるヌクレオチド配列を発現
できる形質導入肝細胞で構成されている組織を、体内に移植片移植したり移植し
たりする。例えば、この組織は、肝臓に接触している腹腔内に移すこともできる
し、肝臓の上ないしは肝臓の近辺に移植することもできる。別途、形質導入肝細
胞を含む組織は、マイクロキャリアービーズに付着させ、受容者の腹膜腔内に（
例えば注射により）導入することもできる。このアプローチによって、野生型肝
細胞を或る系列のラットに移植する試みが成功裡に終わった。このラットは、Ｎ
ａｇａｓｅ無アルブミン血症ラットで、アルブミン合成能がなく、また移植動物
の血清アルブミン量が中程度レベルでに達していない。遺伝子的に修飾された肝
細胞を肝臓の中に直接注入することも可能である。 形質導入された肝細胞は、一旦個人の体内に導入されると、対象となる遺伝物
質によってコードされたホルモンや酵素や薬剤を継続的に供給し続けるようにな
る。本法によって供給されるホルモンや酵素や薬剤の量は、必要に応じて変更さ
れるか制御することができる（例えば、産生を規制しているかまたは影響を与え
る外部の信号や因子を使ったり、移植片の大きさないしは体内に導入する繊維芽
細胞の量を制御したり、移植片を取り除いたりする）。 ５．４ 薬物製剤および投与方法 本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける形質転換細胞のための、ＡｐｏＡ−Ｉまた
はＡｐｏＡ−ＩペプチドをコードするＤＮＡないしはウィルスベクターの輸送用
薬物製剤、またはｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子治療アプローチの
ための、ＤＮＡないしはウィルスベクターで形質転換された宿主細胞の輸送用薬
物製剤を含んでいる。 本発明のＡｐｏＡ−Ｉアゴニストは、動物の疾患治療、特にヒトを含む哺乳類
動物の治療に使用できる。この物質は、血清ＨＤＬ濃度を増加させ、ＬＣＡＴを
活性化し、コレステロール排出とＲＣＴを促進し、有用である。このような症状
には、高脂血症、特に高コレステロール血症、およびアテローム硬化症などの心
臓血管疾患（アテローム硬化症の治療および予防を含む）；再狭窄（例えば、バ
ルーン式血管形成などの医療処置の結果発達するアテローム硬化性プラークの予
防または治療）；しばしば高トリグリセリド血症に陥るエンドトキシン誘導ショ
ック等、その他の疾患が含まれるが、これらに限らない。（例えば、Ｇｏｕｎｉ
ら、１９９３，Ｊ，Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ９４：１３９−１４６；Ｌ
ｅｖｉｎ，ＷＯ９６／０４９１４参照）。 Ａｐｏａ−Ｉアゴニストは、単独ないしは先に述べた疾患の治療に使用される
他の薬剤と併用療法で使われる。その治療は、薬剤の同時投与ないしは連続投与
を含むが、これに限らない。 例えば、高コレステロール血症、アテローム硬化症の治療においては、Ａｐｏ
Ａ−Ｉアゴニストを発現している哺乳類宿主細胞を、現在、コレステロール低下
治療剤として用いられている例えば胆汁酸樹脂、ニコチン酸、および／またはス
タチン類のような１薬剤ないしは複数剤と併用して投与できる。そういった併用
処方は、各薬剤が、コレステロール合成および輸送において異なった目標に作用
するため、特に有益な治療有効をもたらす。つまり、胆汁酸樹脂は、コレステロ
ール再循環、カイロミクロン（脂肪小粒子）、ＬＤＬ集団数に影響を与え、ニコ
チン酸は主としてＶＬＤＬおよびＬＤＬ数に影響を与え、スタチン類はコレステ
ロール合成を阻害してＬＤＬ数を減少させる（多分ＬＤＬ受容体発現を増加させ
る）。一方、ＡｐｏＡ−Ｉアゴニストは、ＲＣＴに影響を与え、ＨＤＬを増加さ
せ、ＬＣＡＴ活性を増加させ、コレステロール流出を促進化する。 他の態様では、ＡｐｏＡ−Ｉアゴニストを発現している哺乳類宿主細胞は、高
脂血症、高コレステロール血症、アテローム硬化症のような心臓循環系疾患の治
療に、フィブレートと併用で使用し得る。フィブレートが心臓循環系疾患に対し
てその効果が確認されていないため、この処方もまた極めて有用である。 更に別の態様では、本発明のＡｐｏＡ−Ｉアゴニストは、エンドトキシンで誘
発された敗血症治療に現在使われている抗微生物剤、抗炎症剤と併用することが
できる。 本発明のヌクレオチド配列を発現しているＡｐｏＡ−Ｉアゴニストは、Ａｐｏ
Ａ−Ｉアゴニストを循環系中に輸送すべく、種々の方法で患者に投与できるペプ
チドないしはペプチド−脂質複合体として製剤化され得る。典型的な製剤型およ
び治療レジュメを以下に記す。 本発明のＡｐｏＡ−Ｉペプチドアゴニストを発現している哺乳類宿主細胞、Ｄ
ＮＡ−脂質複合体、またはＡｐｏＡ−Ｉアゴニストをコードしている「裸の」プ
ラスミドＤＮＡは、循環中の生物学的利用性を確実にできる適切ないかなる投与
ルートによっても投与し得る。このことは、静注（ＩＶ）、筋注（ＩＭ）、皮内
、皮下（ＳＣ）、腹腔内（ＩＰ）投与を含む非経口投与ルートによって、最も良
く達成することができる。但し、他の投与ルートも使用できる。例えば、経口投
与ルートで胃腸管からの吸収が達成され得る（食物摂取ルート、頬ルート、舌下
ルートを含むがこれに限らない）。但し、その際は、例えば口腔粘膜、胃および
／または小腸内の厳しい環境下にあっても、活性成分の分解を防いだり、分解を
最小限に留めるために、適切な剤型（例えば、腸コーティング剤）が使用される
。さらに、本発明になる物質を標的とする輸送系の中に入れて投与することもで
きる。例えば、肝臓を標的としたリポソーム内に入れて投与する。このリポソー
ムは、選択的に肝臓細胞を標的とする。別途、膣や直腸のような粘膜組織への投
与様式も、胃腸管内での分解を防いだり最小化するのに役立つ。さらに別の選択
肢として、本発明の製剤は、経皮的に（例えば、皮膚経由）または吸入により投
与できる。望ましい投与ルートは、本剤の受容者の状態、年齢、コンプライアン
スによって変わり得ることを理解するべきである。 実際に使用されるＡｐｏＡ−Ｉアゴニストまたはペプチド−脂肪複合体の投与
量は、投与ルートによって変わるし、本剤の循環血清中の濃度が１００ｍｇ〜２
ｇ／Ｌになるように調製されるべきである。ここで述べた動物モデル系で得られ
たデータでは、本発明のＡｐｏＡ−ＩアゴニストはＨＬＤ成分と関連性があり、
ヒトでの予測半減期は約５日間である。具体的には、本ＡｐｏＡ−Ｉアゴニスト
は、その濃度が０．５〜１００ｍｇ／ｋｇ（ＩＶ；ＩＭ；ＳＣでの用量）で１週
に１回の割合で静注投与を行う。別の具体例として、連続注入することによって
望ましい血清レベル、約０．５〜１００ｍｇ／ｋｇ／ｈｒ、ないしは間歇投与に
よって約０．５〜１００ｍｇ／ｋｇレベルを維持できる。 種々のＡｐｏＡ−Ｉアゴニストの毒性や治療効果は、細胞培養や実験動物を使
った標準的な薬学的手法で、ＬＤ_５０（個体集団の５０％が死亡にいたる用量）
やＥＤ_５０（個体集団の５０％が治療的に有効である用量）を定量した。毒性と
治療効果の間の用量比は、治療係数であり、 ＬＤ_５０／ＥＤ_５０比で表される
。大きな治療係数を示すＡｐｏＡ−Ｉペプチドアゴニストが望まれる。 ５．４．１． 薬物製剤 本発明の薬物製剤は、ｉｎ ｖｉｖｏで適切に投与ないしは輸送でき、薬学的
に許容される担体中に、活性成分として、ＡｐｏＡ−Ｉペプチドアゴニストを発
現している哺乳類宿主細胞、裸のＡｐｏＡ−Ｉペプチドまたは脂質との複合体を
コードしているＤＮＡ、リポソーム、非脂質性カチオンポリマーを含んでいる。 静注製剤は、水性または油性賦形剤中に活性成分が入った、無菌けん濁液、溶
液、エマルジョンを含んでいる。組成中には、けん濁化剤、安定化剤、分散剤の
ような製剤化剤を含んでいる。注射用製剤は、単位用量の様式、例えばアンプル
または複数用量容器として表され、また追加の保存剤を含むこともある。 別途、注射製剤は、適当な賦形剤を使って再製剤化できるように、使用前の状
態で、粉末の形で供給されてもよい。この賦形剤は、無菌で細菌発熱性物質を含
まない水、緩衡液、デキストローズ溶液などを含んでいる。粉末化の最終段階で
、ＡｐｏＡ−Ｉアゴニストペプチドを凍結乾燥するか、または同時に凍結乾燥さ
れたペプチド−脂質複合体を調製する。貯蔵製剤は、単位用量の形で供給され、
ｉｎ ｖｉｖｏで使用する際に再調製される。 持続した薬剤輸送のために、移植時投与の際に、活性成分は、例えば皮下注射
剤、皮膚下注射剤、筋肉内注射剤のような、貯蔵製剤として製剤化される。例と
して、活性成分は、適切な高分子物質ないしは疎水性物質（例えば、許容できる
油中でのけん濁液として）またはイオン交換樹脂、またはわずかしか溶けない誘
導体、例えばＡｐｏＡ−Ｉアゴニストのわずかしか溶けない塩の形として製剤化
される。 あるいは、経皮吸収のための活性成分をゆっくり放出する粘着性ディスク若し
くはパッチとして製造された経皮送達システムを使用してもよい。このために、
浸透エンハンサーを用いて、活性成分の経皮浸透を促進することができる。冠動
脈性心臓病および高コレステロール血症の患者に使用するためのニトログリセリ
ンパッチに本発明のＡｐｏＡ−Ｉアゴニストまたはペプチド−脂質複合体を含ま
せることは特に有益である。 経口投与のために、医薬組成物は、例えば、結合剤（例えば、ゲル化前トウモ
ロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、もしくはヒドロキシプロピル・メチル
セルロース）、充填剤（例えば、ラクトース、微結晶セルロースまたはリン酸水
素カルシウム）、界面活性剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、も
しくはシリカ）、崩壊剤（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｎｔ）（例えば、ジャガイモデ
ンプンもしくはナトリウムデンプングリコレート）、または湿潤剤（例えば、ラ
ウリル硫酸ナトリウム）などの製薬上許容される賦形剤と共に、従来の手段によ
って調製された錠剤またはカプセルの形態にされてもよい。錠剤は、当該分野で
周知の方法によって被覆されてもよい。経口投与のための液体調製物は、例えば
、溶液、シロップまたは懸濁液の形態にされてもよいし、または乾燥製品として
提供されて使用前に水もしくはその他の適切なビヒクルで構築されてもよい。そ
のような液体調製物は、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘
導体または水素添加食用脂肪）、乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）、
非水性ビヒクル（例えば、扁桃油、油性エステル、エチルアルコール、もしくは
分留植物油）、および防腐剤（例えば、メチルまたはプロピル−ｐ−ヒドロキシ
ベンゾエートまたはソルビン酸）などの製薬上許容される添加物と共に従来の手
法によって調製され得る。調製物は、緩衝塩、香味料、着色剤および甘味料を適
量含んでいてもよい。経口投与用の調製物は、活性化合物の制御された放出を得
るように適切に製剤化されることができる。 頬投与のために、組成物は、従来の手法によって製剤化された錠剤またはロゼ
ンジの形態にされうる。直腸および膣の投与経路のために、活性成分は、溶液、
（維持性浣腸のための）坐剤、または軟膏として製剤化されてもよい。 吸入による投与のために、適切な推進薬（例えば、ジクロロジフルオロメタン
、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素もし
くはその他の適切なガス）を使用して、圧縮パックまたは噴霧器から供給される
エアロゾールスプレーの形態で活性成分を適宜送達してもよい。圧縮エアロゾー
ルの場合、弁を設けて投与用量単位を決定して、一定量を送達できる。例えば吸
入器または注入器において使用するゼラチンなどのカプセルおよびカートリッジ
は、化合物および適切な粉末基剤（ラクトースまたはデンプンなど）の粉末混合
物を含んで製剤化され得る。 組成物は、所望であれば、活性成分を含む単位用量形態を１つ以上含むパック
またはディスペンサー器で供給されてもよい。パックは、例えば、発砲パックな
どの金属またはプラスチック箔からなっていてもよい。パックまたはディスペン
サー器には、投与指示書を付けてもよい。 ５．５ その他の用途 本発明のヌクレオチド配列によりコードされるＡｐｏＡ−Ｉペプチドとアゴニ
ストは、たとえば診断のために、血清中のＨＤＬを測定するｉｎ ｖｉｔｒｏア
ッセイに使うことができる。ＡｐｏＡ−Ｉアゴニストは血清中のＨＤＬ成分と結
合するので、アゴニストはＨＤＬ粒子数の「マーカー」として使うことができる
。さらにアゴニストはＲＣＴで有効なＨＤＬのサブ集団のマーカーとして使うこ
とができる。この目的のために、アゴニストを患者の血清サンプルに添加または
混合し、適当なインキュベーション時間が経過した後に、結合したＡｐｏＡ−Ｉ
アゴニストを検出することによりＨＤＬ成分をアッセイすることができる。これ
は、標識したアゴニスト（たとえば、放射性標識、蛍光標識、酵素標識、染料な
ど）を使うか、あるいはアゴニストに特異的な抗体（または抗体のフラグメント
）を使った免疫学的測定法により達成される。 あるいは、標識アゴニストをイメージング手法（たとえば、ＣＡＴスキャン、
ＭＲＩスキャン）に使用して、循環系を視覚化するか、あるいはＲＣＴを監視す
るか、あるいは脂肪条痕におけるＨＤＬの蓄積、アステローム性動脈硬化病変な
ど（ＨＤＬがコレステロール流出で活性である場合）を視覚化することができる
。 ６．実施例：ＬＣＡＴ活性化アッセイ 本発明のヌクレオチドによってコードされるペプチドの例を表ＶＩＩＩに列挙
する。この表には、同時に化学的に合成したペプチドも示す。遺伝的にコードさ
れたアミノ酸あるいは天然のＡｐｏＡ−Ｉと比べて３８％未満のＬＣＡＴ活性を
示すアミノ酸から成るペプチドに限り、本発明に含まれるものとする。列挙した
全てのペプチドは、ＬＣＡＴを活性化する能力についてｉｎ ｖｉｔｒｏで分析
した。ＬＣＡＴアッセイでは、卵ホスファチジルコリンまたは１−パルミトイル
−２−オレイル−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）および放射性標識コレステ
ロールからなる基質小胞（小型の単層小胞または「ＳＵＶ」）を、当量のペプチ
ドまたはＡｐｏＡ−Ｉ（ヒト血漿から分離）と予めインキュベートしておく。反
応はＬＣＡＴ（ヒト血漿から精製）を添加して開始させる。陽性対照として使用
した天然のＡｐｏＡ−Ｉは１００％の活性化活性を示す。ペプチドの「比活性」
（すなわち、活性単位（ＬＣＡＴ活性化）／単位量）は、最大のＬＣＡＴ活性化
を達成するペプチドの濃度として算出できる。たとえば、一連の濃度のペプチド
（たとえば、限界希釈）をアッセイして、ペプチドの「比活性」を判定できる。
ここで「比活性」は、アッセイにおける特定の時点（たとえば、１時間）におい
て最大のＬＣＡＴ活性化（すなわち、コレステロールのコレステロールエステル
への変換率）を達成する濃度である。たとえば反応１時間におけるコレステロー
ルの変換率を、使用したペプチドの濃度に対してプロットすれば、「比活性」は
プロット曲線のプラトーを達成するペプチドの濃度として定義できる。 ６．１ 基質小胞の調製 ＬＣＡＴアッセイで用いる小胞は卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）または１
−パルミトイル−２−オレイル−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）およびコレ
ステロールを２０：１のモル比で含むＳＵＶである。４０回のアッセイに十分な
小胞ストック溶液を調製するために、７．７ｍｇのＥＰＣ（または７．６ｍｇの
ＰＯＰＣ；１０μｍｏｌ）、７８μｇ（０．２μｍｏｌ）の４−^１４Ｃ−コレス
テロール、１１６μｇのコレステロール（０．３μｍｏｌ）を５ｍｌのキシレン
に溶解し、凍結乾燥する。その後、４ｍｌのアッセイ緩衝液を乾燥粉末に加え、
窒素雰囲気下に４℃で音波処理する。音波処理条件：Ｂｒａｎｓｏｎ ２５０ソ
ニケーター、１０ｍｍチップ、６．５分；アッセイ緩衝液：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
、０．１４Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４。音波処理した混合物
を１４，０００ｒｐｍ（１６，０００ｘｇ）で各回５分ずつ６回遠心分離してチ
タン粒子を分離する。得られる透明な溶液を酵素アッセイに使用する。 ６．２ ＬＣＡＴの精製 ＬＣＡＴを精製するために、ヒト血漿のデキストラン硫酸／Ｍｇ^２＋処理を行
ってリポタンパク質欠乏血清（ＬＰＤＳ）を取得し、これを順次フェニルセファ
ロース、アフィゲルブルー（Ａｆｆｉｇｅｌｂｌｕｅ）、コンカナバリンＡセフ
ァロースおよび抗ＡｐｏＡ−１アフィニティークロマトグラフィーでクロマトグ
ラフにかけた。代表的な精製を以下の表ＶＩＩにまとめて示す。 ６．２．１ ＬＰＤＳの調製 ＬＰＤＳを調製するために、５００ｍｌの血漿を５０ｍｌのデキストラン硫酸
（ＭＷ＝５０００００）溶液に加える。２０分攪拌する。３０００ｒｐｍ（１６
，０００ｘｇ）、４℃で３０分遠心分離する。さらなる精製のために上清（ＬＰ
ＤＳ）を用いる（約５００ｍｌ）。 ６．２．２ フェニルセファロースクロマトグラフィー フェニルセファロースクロマトグラフィーのために次の材料および条件を使用
した。 固相： フェニルセファロース・ファースト・フロー、高置換グレード、 Ｐｈａｒｍａｃｉａ カラム： ＸＫ２６／４０、ゲル床の高さ： ３３ｃｍ、Ｖ＝約１７５ｍｌ 流速： ２００ｍｌ／ｈｒ（サンプル） 洗浄： ２００ｍｌ／ｈｒ（緩衝液） 溶出： ８０ｍｌ／ｈｒ （蒸留水） 緩衝液： １０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐ
Ｈ７．４、０．０１％アジ化ナトリウム Ｔｒｉｓ緩衝液でカラムを平衡化し、
５００ｍｌのＬＰＤＳに２９ｇのＮａＣｌを加えてカラムにアプライする。波長
２８０ｎｍでの吸収がほぼ基底線になるまで数倍容量のＴｒｉｓ緩衝液で洗浄す
る。その後蒸留水で溶出する。タンパク質を含む画分をプールし（プールのサイ
ズ：１８０ｍｌ）、アフィゲルブルークロマトグラフィーに使用する。 ６．２．３ アフィゲルブルークロマトグラフィー フェニルセファロースからのプールを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．
４、０．０１％アジ化ナトリウムに対して４℃で一夜透析する。プール容量を限
外濾過（Ａｍｉｃｏｎ ＹＭ３０）で５０〜６０ｍｌにまで減らし、アフィゲル
ブルーカラムにローディングする。 固相： アフィゲルブルー、Ｂｉｏｒａｄ、１５３〜７３０１カラム、ＸＫ
２６／２０、 ゲル床の高さ： 約１３ｃｍ；カラム体積： 約７０ｍｌ 流速： ローディング： １５ｍｌ／ｈ 洗浄： ５０ｍｌ／ｈ Ｔｒｉｓ緩衝液でカラムを平衡化する。フェニルセファロースからのプールを
カラムにアプライする。同時に画分を集め始める。Ｔｒｉｓ緩衝液で洗浄する。
プールした画分（１７０ｍｌ）をＣｏｎＡクロマトグラフィーに使用した。 ６．２．４ ＣｏｎＡクロマトグラフィー アフィゲルブルーからのプールをＡｍｉｃｏｎ（ＹＭ３０）で３０〜４０ｍｌ
に減らし、ＣｏｎＡ出発緩衝液（１ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４、１ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＭｎＣｌ_２、１ｍＭ ＣａＣｌ_２、０．０１％アジ化
ナトリウム）に対して４℃で一夜透析した。 固相： ＣｏｎＡセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ） カラム： ＸＫ２６／２０、ゲル床の高さ： １４ｃｍ（７５ｍｌ） 流速： ローディング： ４０ｍｌ／ｈ 洗浄（出発緩衝液による）： ９０ｍｌ／ｈ 溶出： ５０ｍｌ／ｈ、０．２Ｍメチル−α−Ｄ−マンノシドを １ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．４に溶解したもの マンノシド溶出のタンパク質画分を集め（１１０ｍｌ）、限外濾過（ＹＭ３０
）により容量を４４ｍｌにまで減らした。ＣｏｎＡプールを２ｍｌのアリコート
に分割し、−２０℃で保存する。 ６．２．５ 抗ＡｐｏＡ−１アフィニティークロマトグラフィー 抗ＡｐｏＡ−１アフィニティークロマトグラフィーはＡｆｆｉｇｅｌ−Ｈｚ材
料（Ｂｉｏｒａｄ）で行ったが、この材料には抗ＡｐｏＡ−１が共有結合されて
いる。 カラム： ＸＫ１６／２０、Ｖ＝１６ｍｌ。カラムをＰＢＳ ｐＨ７．４で平衡
化した。カラムにローディングする前に２ｍｌのＣｏｎＡプールをＰＢＳに対し
て２時間透析した。 流速：ローディング：１５ｍｌ／ｈ 洗浄（ＰＢＳ） ４０ｍｌ／ｈ プールしたタンパク質画分（Ｖ＝１４ｍｌ）をＬＣＡＴアッセイに使用する。 カラムを０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）で再生して、結合されたＡ−
Ｉを溶出し（１００ｍｌ）、この手順の後すぐにＰＢＳで再平衡化する。 ６．３ 結果 ＬＣＡＴ活性化アッセイの結果を以下の表ＶＩＩＩに示す。 表Ｘにおいて、＊はＮ末端アセチル化およびＣ末端アミド化されているペプチ
ドを示す。＋はＮ末端ダンシル化されているペプチドを示す。ｓｐは実験条件下
で溶解性に問題があったペプチドを示す。ＸはＡｉｂ、ＺはＮａｌ、０は０ｒｎ
である。Ｈｅ（％）はらせん度のパーセントを示す。ｍｉｃｓはミセルを示す。
−は欠失されたアミノ酸を示す。 ７．実施例：アポＡ−Ｉペプチドの構造および脂質結合分析 上記の第６節に記載したようにして合成した精製ペプチドの構造特性および脂
質結合特性を、円偏光二色性（ＣＤ）、蛍光分光法および核磁気共鳴（ＮＭＲ）
によって測定した。 ７．１円偏光二色性 本実施例は、ペプチドの単独および脂質の存在下でのα−ヘリックスの二次構
造の割合（％）を測定するための好ましい方法を記載する。 ７．１．１実験方法 遠ＵＶ円偏光二色性スペクトルを熱電式セルホルダーおよび試料チェンジャー
を備えたＡＶＩＶ６２ＤＳ分光計（ＡＶＩＶ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｌａｋｅ
ｗｏｏｄ，ＮＪ，ＵＳＡ）を用いて１９０〜２６０ｎｍ間（０．５ｎｍまたは０
．２ｎｍ刻み）で記録した。装置は（＋）−１０−ショウノウ酸で較正した。各
試料について、それぞれ１０ｃｍ、５ｃｍ、１ｃｍおよび０．１ｃｍの経路長の
石英Ｓｕｐｒａｓｉｌセルを用いて１０^−７Ｍ〜１０^−４Ｍのペプチド濃度に対
して１〜３スキャンを集めた。バンド幅は１．５ｎｍに固定し、スキャンスピー
ドは波長１ステップあたり１ｓに固定した。報告したデータは少なくとも２個ま
たは３個の別個の測定値の平均である。 バックグラウンドを引き算（ｓｕｂｓｔｒａｃｔｉｏｎ）した後、スペクトル
を残基あたりのモル楕円率（ｍｏｌａｒ ｅｌｌｉｐｔｉｃｉｔｙ）（θ）（度
ｃｍ^−２ｄｍｏｌ^−１）に変換した。ペプチド濃度をアミノ酸分析により測定し
、またペプチドが発色団（トリプトファン、ダンシル、ナフチルアラニン）を含
む場合、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ λ１７ＵＶ／可視分光光度計による吸収光
度分析によっても測定した。 遊離の非結合ペプチド（５ｍＭのリン酸緩衝液中５μＭ、ｐＨ７．４）、ペプ
チド−ＳＵＶ複合体（２０：１ ＥＰＣ：Ｃｈｏｌ．、Ｒｉ＝３０およびＲｉ＝
５０）、ペプチド−ミセル複合体（１−ミリストイル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−
グリセロ−３−ホスファチジルコリン、Ｒｉ＝１００）、ならびに２，２，２−
トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）の存在下での遊離の非結合ペプチド（５μＭ
のペプチド、９０容量％ＴＦＥ）についてのＣＤスペクトルを得た。 Ｎ_２を吹き込みながら脂質をリン酸緩衝液（５ｍＭ、ｐＨ７．４）に５分間か
けて分散させ、その後、浴超音波処理器で超音波処理する（１．５時間）ことに
よりＳＵＶを得た。調製物の均質性をＦＰＬＣでチェックした。 脂質（６ｍＭの１−ミリストイル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−３−ホ
スファチジルコリン、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ、ＡＬ）をリン
酸緩衝液（５ｍＭ、ｐＨ７．４）にＮ_２を吹き込みながら５分間かけて分散させ
、撹拌することによりミセルを得た。 ペプチド−ＳＵＶ複合体を得るために、ＳＵＶをペプチド［５ｍＭリン酸緩衝
液中に５μＭ、ｐＨ７．４］にリン脂質−ペプチドモル比（Ｒｉ）１００で加え
た。 ペプチド−ミセル複合体を得るために、ミセルをペプチド（５ｍＭのリン酸緩
衝液中５μＭ、ｐＨ７．４）にＲｉ １００で加えた。 スペクトルはすべて３７℃で記録した。温度の関数としてのペプチド２１０（
配列番号２１０）の安定性（緩衝液中で遊離状態のもの、およびミセル状態のも
の）を一連の異なる温度でスペクトルを記録することにより測定した。 ペプチド２１０（配列番号２１０）のらせん度の程度も濃度の関数として測定
した。 ７．１．２らせん度測定 種々の条件におけるペプチドのらせん度の程度を、２２２ｎｍにおける平均残
基楕円率（ｍｅａｎ ｒｅｓｉｄｕｅ ｅｌｌｉｐｔｉｃｉｔｙ）（Ｃｈｅｎら
，１９７４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３：３３５０−３３５９）から、あ
るいはデータベース（Ｐｒｏｖｅｎｃｈｅｒ ＆ Ｇｌｏｃｋｎｅｒ，１９８１
，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０：３３−３７の１６ヘリックス参照スペクト
ル；Ｖｅｎｙａｍｉｎｏｖら，１９９３，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１４：
１７−２４の変性タンパク質参照スペクトル）で入手可能な参照スペクトルに対
して得たＣＤスペクトルをＣＯＮＴＩＮカーブフィッティング・アルゴリズムバ
ージョン２ＤＰ、ＣＤ−１パック（１９８２年８月）（Ｐｒｏｖｅｎｃｈｅｒ，
１９８２，Ｃｏｍｐｕｔ．Ｐｈｙｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２７：２１３−２２７，２
２９−２４２）を用いて比較することにより測定した。許容できる適合を、ＣＯ
ＮＴＩＮアルゴリズムによって得られた統計学的分析法を用いて決定した。全方
法の誤差は±５％のらせん度であった。 ７．１．３結果 遊離の非結合ペプチド（遊離）、ペプチド−ＳＵＶ複合体（ＳＵＶ）、ペプチ
ド−ミセル複合体（ｍｉｃｓ）およびペプチド−ＴＦＥ溶液（ＴＦＥ）のらせん
の程度（％）を下記の８．３節の表Ｘに報告する。 ペプチド２１０（配列番号２１０）はミセル中で５μＭの濃度で有意なαらせ
ん構造（６３％らせん度）を含む。さらに、αヘリックス構造は５〜４５°の温
度範囲にわたり完全に安定である（データは示さず）。ペプチド２１０（配列番
号２１０）のらせん度はまた、ＴＦＥの存在下でも増大する。このＴＦＥは、水
（ε＝７８．４）の誘電率を有意に低下させる（ε＝２６．７）ことにより、５
〜９０％（ｖ／ｖ）の間の濃度におけるαヘリックスおよびペプチド間の水素結
合を安定化する溶媒である。 下記の表ＶＩＩＩに関し、高度のＬＣＡＴ活性化（≧３８％）を示すペプチド
は、一般的に脂質の存在下で有意なαヘリックス構造を有するが（２２個以上の
アミノ酸を含む非ブロック化ペプチドまたは１８個以下のアミノ酸を含むブロッ
ク化ペプチドの場合にはらせん構造６０％以上；１８個以下のアミノ酸を含む非
ブロック化ペプチドの倍にはらせん構造４０％以上）、ほとんどあるいは全くＬ
ＣＡＴ活性化を示さないペプチドはほとんどαヘリックス構造を持たない。しか
しながら、いくつかの場合には、脂質の存在下で有意なαヘリックス構造を含む
ペプチドは有意なＬＣＡＴ活性化を示さない。したがって、本発明のコアペプチ
ドが脂質の存在下でαヘリックス構造を採用する能力は、本発明のコアペプチド
の重要な特徴であると考えられる。というのは、脂質の存在下でαヘリックスを
形成する能力は、ＬＣＡＴ活性化のための必要条件であると考えられるからであ
る。 ７．２蛍光分光法 上記の第６節で合成したペプチドの脂質結合特性を、トリプトファン（Ｔｒｐ
またはＷ）またはナフチルアラニン（Ｎａｌ）が存在する場合、標識ペプチドに
よる蛍光測定により試験した。蛍光スペクトルは、１５０Ｗのキセノンランプ、
２個のモノクロメーター（励起および発光）、最大８５０ｎｍまでの赤色に検出
感度を有する光電子増倍管Ｒ−９２８、および熱電式磁気撹拌セルホルダーを備
えたＳｐｅｘ（Ｊｏｂｉｎ−Ｙｖｏｎ）製のＦｌｕｏｒｏｍａｘにて記録した。
石英Ｓｕｐｒａｓｉｌキュベットをマイクロモル濃度レンジの測定に用いた。可
変スリット（０．４〜５ｎｍ）の装置により、用いたペプチドの濃度にしたがっ
て付帯（ｉｎｃｉｄｅｎｔ）および発光強度の調節をすることができる。報告し
た値は一般的に２〜４スペクトルの平均である。ペプチド濃度はＴｒｐ（トリス
緩衝液中ε_{２８０ｎｍ}＝５，５５０Ｍ^−１ｃｍ^−１）またはＮａｌ（メタノール
中ε_{２２４ｎｍ}＝９２，７７０Ｍ^−１ｃｍ^−１）の吸収バンドを用いてＰｈｉｌ
ｉｐｓ ＰＵ ８８００での吸収光度分析により決定する。 ペプチドの蛍光スペクトルをトリスＨＣｌ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ＝７．５）
中で脂質小胞の存在下および不存在下にて２９０ｎｍ〜４５０ｎｍで記録した。
凍結乾燥したリン脂質を緩衝液中で再水和し、分散し、Ｎ_２流下でチップ超音波
処理した後、小さい単層小胞が形成された。用いた脂質は卵のＰＣ／Ｃｈｏｌ．
（２０：１）またはＰＯＰＣ／Ｃｈｏｌ．（２０：１）のいずれかであった。ス
ペクトルを２μＭのペプチド濃度、３７℃の温度にて記録した。Ｔｒｐの場合に
は蛍光参照標準はＮ−アセチルトリプトファニルアミド（ＮＡＴＡ）であった。 ２μＭのペプチド溶液に脂質小胞を徐々に加えることにより脂質結合試験を行
った（スリット：励起では５ｎｍ、発光では１．５ｎｍ）。蛍光強度測定につい
て希釈効果を考慮に入れた。脂質濃度を１０〜６００μＭで変化させ、脂質とペ
プチドのモル比（Ｒｉ）を５〜３００で変化させた。励起の波長をＴｒｐとＮａ
ｌの両方について２８０ｎｍにセットした。 ７．２．１蛍光スペクトル分析 分光蛍光計に接続したＩＢＭ−ＰＣによりＳｐｅｘ製のＤＭ３００Ｆソフトウ
ェアを通してデータを直接記録し、処理した。スペクトルを溶媒寄与を引き算す
ることにより、そして波長に対する光電子増倍管応答の変化量を考慮したコンス
トラクタによって付与された係数の適用により補正した。 ペプチドの蛍光スペクトルを、その蛍光発光の最大値における波長およびトリ
プトファンで標識したペプチドの場合にはＮＡＴＡと比較したその量子収量によ
り特性付けた。脂質への結合のプロセスを、蛍光発光の最大値（λ_ｍａｘ）の波
長のシフト、ならびに脂質濃度に対する発光の相対蛍光強度の変化量を計算する
ことにより分析した。相対蛍光強度を下記の比：（Ｉ−Ｉ_０）λ_ｍａｘ／Ｉ_０λ
_ｍａｘと定義する。ＩおよびＩ_０の両方はペプチドの初期遊離状態、すなわち脂
質を含まない状態に対応する（λ_ｍａｘ）で決定される。Ｉは脂質とペプチドの
規定の比における強度であり、Ｉ_０は脂質の不存在下で測定した同パラメーター
である。これらのばらつきが無いのは、脂質を有するペプチドの相互作用が無い
ことに関連している。７．２．２． 結果および考察 （位置１０にＷ（ｔｒｐ）残基を含む以外はペプチド２１０（配列番号２１０
）に一次配列が似ている）ペプチド１９９（配列番号１９９）の脂質結合特性が
、表ＩＸに示されている。 ２μｍの濃度での緩衝液中のペプチド１９９（配列番号１９９）のトリプトフ
ァン蛍光発光（λ_ｍａｘ）の最大値は３４８ｎｍである。これは、ＮＡＴＡ（λ
ｍａｘ＝３５０ｎｍ）と比較したときに水性環境に比較的暴露されるトリプトフ
ァンに対応する。ペプチド１９９（配列番号１９９）は、トリプトファンの埋設
（トリプトファンの最大蛍光発光に対する波長は、３４８ｍｎから３２５ｎｍに
シフトする）および高蛍光強度エキサルテーション（表ＩＸを参照のこと）によ
り示されるように、ＥＰＣ／Ｃｈｏｌ（２０：１）小単層状小胞に、非常に効率
良く結合する。トリプトファン残基の埋設は、約１００の脂質対ペプチドのモル
比で最大である。 前掲の第７．１節で記載したように、円偏光二色性により測定した脂質の存在
下における高度ならせん度（ｈｅｌｉｃｉｔｙ）（２２アミノ酸以上のブロック
されていないペプチドまたは１８アミノ酸以下のブロックされたペプチドで６０
％以上；１８アミノ酸以下のブロックされていないペプチドで４０％以上）を示
した他のペプチドも、良好な脂質結合性を示した。もちろん、円偏光二色性スク
リーニングにより選択された全てのペプチドのなかで、蛍光により追跡すること
ができたもののみについて、その脂質結合性をテストした。７．３． 核磁気共鳴（ＮＭＲ） この実施例では、本発明のコアペプチドの構造を分析するためのＮＭＲ法につ
いて記載する。７．３．１ ＮＭＲサンプル調製 ペプチド５ｍｇを、内部化学シフト参照物質として微量の２，２−ジメチル−
２−シラ−５−ペンタンスルホン酸塩（ＤＳＳ）を含む９０％Ｈ_２Ｏ／１０％Ｄ
_２Ｏ中に溶解して、サンプルを調製した。これらのサンプルのうち幾つかは、ト
リフルオロエタノール（ＴＦＥ）（体積％で示される）を含んでいた。サンプル
の総量は、５００μｌであり、ペプチドの濃度は約５ｍＭであった。７．３．２ ＮＭＲ分光法 Ｂ−ＶＴ２０００温度調節ユニットを備えたＢｒｕｋｅｒ ＤＲＸ５００スペ
クトロメーターを用いて５００ＭＨｚで^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを得た。標準パ
ルス配列を用いて１次元および２次元実験を記録した（Ｔｗｏ Ｄｉｍｅｎｓｉ
ｏｎａｌ ＮＭＲ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，Ｅｄｓ．Ｗ．Ｒ．Ｃｒｏａｓｍ
ｕｎ ａｎｄ ＲＭＫ Ｃａｒｌｓｏｎ，１９９４，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅ
ｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ）。２秒間の低電力前飽和（ｌｏｗ ｐｏｗｅ
ｒ ｐｒｅｓａｔｕｒａｔｉｏｎ）により、水抑制が達成された。２次元実験を
、両次元において、時間比例位相増分（ＴＰＰＩ）および６０００Ｈｚのスペク
トル幅にてを用いて位相感受性モードで行った。典型的には、４０回のスキャン
を、２０４８個のデータポイントで４００ｔ_１の増分に対して共に加えた。ＩＮ
ＤＩＧＯ２ワークステーション（Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｇｒａｐｈｉｃｓ）上でＦＥ
ＬＩＸ９５ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ）を用
いてデータを処理した。データをゼロ充填して２Ｋ×２Ｋのデータマトリックス
を得て、４５°回転した二乗サイン−ベル関数でアポダイズ（ａｐｏｄｉｚｅ）
した。７．３．３ ＮＭＲアサインメント 文献（Ｗｕｔｈｒｉｃｈ，ＮＭＲ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，１９８６，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅ
ｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ）に記載されたようなＤＱＦＣＯＳＹ、ＴＯＣＳＹおよび
ＮＯＥＳＹスペクトルを用いた連続的なアサインメント技法を適用して、完全な
プロトン共鳴アサインメントを得た。集めたランダムコイル化学シフト（Ｗｉｓ
ｈａｒｔ ａｎｄ Ｓｙｋｅｓ，１９９４，Ｍｅｔｈｏｄ．Ｅｎｚ．２３９：３
６３−３９２）を対応する実験値から差し引くことにより、二次化学シフトをＨ
ＮおよびＨαプロトンについて計算した。７．３．４ 結果および考察 全体的な考察：両親媒性らせん状ペプチドは、ＮＭＲスペクトルに必要な高濃
度の水溶液中において凝集する傾向があり、高解像度スペクトルを得ることが難
しい。ＴＦＥは、ペプチドを可溶化すること、さらに、らせん特性を有するペプ
チドのらせん状立体配置を安定化することが知られている。代表的な例としてペ
プチド２１０（配列番号２１０）についてのＮＭＲスペクトル分光法による調査
結果が示された。Ｓｅｇｒｅｓｔのコンセンサス２２−ｍｅｒ（配列番号７５）
を比較研究した。 二次化学シフト。アミノ酸のプロトン化学シフトは、残基のタイプおよびペプ
チドまたはタンパク質の内部の部分的な２次構造に依存する（Ｓｚｌａｇｙｉ，
１９９５，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅ
ｓｏｎａｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ２７：３２５−４４３）。従って
、ランダム・コイル立体配置について集めた数値と実験によるシフトを比較する
ことにより、規則的な二次構造の同定が可能である。 α−ヘリックスの形成により、Ｈα共鳴が高磁場（ｕｐ−ｆｉｅｌｄ）（負）
にシフトする。幾つかの残基についての高磁場Ｈαシフトの観察結果は、らせん
構造の証拠として一般にとらえられる。２９５Ｋでの２５％ＴＦＥにおけるペプ
チド２１０（配列番号２１０）についてのＨα二次シフトは、残基４〜１５では
有意な負のシフトを示し、高いらせん状立体配置を示している。ペプチド２１０
（配列番号２１０）に比べてコンセンサス２２−ｍｅｒ（配列番号７５）のＨα
化学シフトにおいて小さな差が観察された。 αヘリックスの領域にあるアミノ酸残基のアミド水素の化学シフトも、ランダ
ムコイルで観察された化学シフトと比べて高磁場にシフトした。さらに、ＨＮシ
フトの周期性が観察でき、これは、らせんの巻きが周期的であることを反映して
いる。配列に沿ったシフトのばらつきの大きさは、らせん状ペプチドの両親媒性
に関係する。疎水性モーメントが高ければ、振幅はより大きくなる（Ｚｈｏｕ
ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：４３２０−４
３２６）。２９５Ｋでの２５％ＴＦＥにおけるペプチド２１０（配列番号２１０
）のＨＮ二次シフトは、らせんの両親媒性の性質に一致した振幅の挙動を見せる
。 アミノ酸の置換により、配列全体に沿った周期性がより顕著になる。このパタ
ーンは明らかに、ペプチド２１０（配列番号２１０）の両親媒性の性質がＳｇｒ
ｅｓｔのコンセンサス２２−ｍｅｒ（配列番号７５）に比べて強力であることを
反映している。４〜５個のらせんの巻きは無視してもよい。 アミドプロトンの二次シフトは、そのらせんから１巻き離れたカルボニル酸素
への水素結合の長さにより影響を受ける。従って、観察された化学シフト値の周
期性は、異なる水素結合の長さを反映する。この差は、らせん骨格のの全体的な
らせんカーブ形状と関係がある。疎水性残基は、凹部側に位置する。ペプチド２
１０（配列番号２１０）の二次シフトは、カーブ状のα−らせん立体配置を示す
。８．実施例：ＡｐｏＡ−Ｉアゴニストの薬物動態学 以下の実験を使用して、ＡｐｏＡ−Ｉアゴニストが血液循環中において安定で
あり、且つ血漿のＨＤＬ成分に関連していることを示すことができる。８．１ 放射性標識ペプチドの合成 Ｎ末端アミノ酸として^１４Ｃで標識したアミノ酸を結合することにより、放射
性標識ペプチドを合成する。この合成は、Ｌａｐａｔｓａｎｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅ
ｓｉｓ，１９８３，６７１−１７３に従って行った。簡単にまとめると、非標識
Ｎ末端アミノ酸２５０μＭを９％Ｎａ_２ＣＯ_３溶液２２５μｌ中に溶解し、９．
２５ＭＢｑ（２５０μＭ）^１４Ｃ標識Ｎ末端アミノ酸の溶液（９％Ｎａ_２ＣＯ_３
）に加えた。この液体を０℃にまで冷却し、０．７５ｍｌのＤＭＦ中の６００マ
イクロＭ（２０２ｍｇ）９−フルオレニルメチル−Ｎ−スクシンイミジルカーボ
ネート（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）と混合し、室温にて４時間振盪した。その後で、該
混合物をジエチルエーテル（２×５ｍｌ）およびクロロホルム（１×５ｍｌ）で
抽出し、残りの水性相を３０％ＨＣｌで酸性とし、クロロホルム（５×８ｍｌ）
で抽出した。有機相をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥し、濾過し、窒素のもとで体積を５ｍ
ｌに減らした。ＴＬＣにより純度を評価する（ＣＨＣｌ_３：ＭｅＯＨ：Ｈａｃ，
９：１：０．１ｖ／ｖ／ｖ，固定相ＲＰＴＬＣシリカゲル６０、Ｍｅｒｃｋ，Ｇ
ｅｒｍａｎｙ）。８．２ マウスにおける薬物動態学 各実験において、２．５ｍｇ／ｋｇの放射標識ペプチドを、通常のマウスの餌
を与えたマウスおよびアテローム発生Ｔｈｏｍａｓ−Ｈａｒｃｒｏｆｔ改変食餌
を与えたマウスに腹腔内注射した（ＶＬＤＬおよびＩＤＬコレステロールが非常
に上昇した）。血液サンプルを各時点で採取し、血漿中の放射能を評価する。８．３ ヒト血清中の安定性 ヒト血清中の本発明のＡｐｏＡ−Ｉアゴニストの安定性を以下のように示す。８．３．１ 実験方法 ^１４Ｃ標識ペプチド（前掲の第９．１節で記載したように調製）１００μｇを
、新鮮なヒト血漿２ｍｌ（３７℃）と混合し、直ちに（対照サンプル）、および
３７℃で８日間インキュベートしたあと（テストサンプル）、脱脂化する。脱脂
肪化は、２：１（ｖ／ｖ）クロロホルム：メタノールの当量で脂質を抽出するこ
とにより、行った。 これらのサンプルを逆相Ｃｌ８ ＨＰＬＣカラムに入れ、（０．１％ＴＦＡを
含む）アセトニトリルの直線勾配（３３分かけて２５〜５８％）を用いて溶出す
る。吸光度（２２０ｎｍ）および放射能により、溶出プロファイルを追跡する。８．４ プレ−β様粒子の形成 本発明のＡｐｏＡ−Ｉアゴニストが、プレ−β様粒子を形成する能力を、以下
のように示す。８．４．１ 実験方法 ヒトＨＤＬを、密度ｄ＝１．２１ｇ／ｍｌでのＫＢｒ密度勾配超遠心分離によ
り単離して上層画分を得たあと、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６ゲル濾過クロマトグラフ
ィーにより他のリポたんぱく質からＨＤＬを単離する。単離したＨＤＬを、Ｂｒ
ａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイにより測定したタンパク質含量に基づいた生理
食塩水で１．０ｍｇ／ｍｌの最終濃度に調整する。３００μｌのアリコートをこ
の単離したＨＤＬ調製物から取り出し、１００μｌの^１４Ｃ標識ペプチドと共に
３７℃にて２時間インキュベートする。１００μｌの生理食塩水を含有するブラ
ンク１つ、および４つの^１４Ｃ標識ペプチド（（ｉ）０．２０μｇ／μｌペプチ
ド：ＨＤＬ、比＝１：１５；（ｉｉ）０．３０μｇ／μｌペプチド：ＨＤＬ、比
＝１：１０；（ｉｉｉ）０．６０μｇ／μｌペプチド：ＨＤＬ、比＝１：５；お
よび（ｉｖ）１．００μｇ／μｌペプチド：ＨＤＬ、比＝１：３）の希釈物を含
む、５つの別々のインキュベーションを分析する。２時間インキュベートしたあ
と、サンプルのアリコート２００μｌ（総量＝４００μｌ）をＳｕｐｅｒｏｓｅ
６ゲル濾過カラムに入れ、リポタンパク質分離および分析を行い、１００μｌを
用いて該カラムに載せた全放射能を測定する。８．５ ヒトリポタンパク質とＡｐｏ−Ａ−Ｉアゴニストの会合 ８．５．１ 実験方法 本発明のＡｐｏＡ−Ｉアゴニストの、ヒトリポタンパク質画分と会合する能力
を、各リポタンパク質クラス（ＨＤＬ、ＬＤＬおよびＶＬＤＬ）および異なるリ
ポタンパク質クラスの混合物と共に^１４Ｃ標識ペプチドをインキュベートするこ
とにより、測定する。 ＨＤＬ、ＬＤＬおよびＶＬＤＬを、ｄ＝１．２１ｇ／ｍｌにてＫＢｒ密度勾配
超遠心分離により単離し、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６Ｂカラムサイズ排除カラムにてＦ
ＰＬＣにより精製する（クロマトグラフィーは、流速０．７ｍｌ／分、１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）の移動緩衝液、１１５ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ
および０．０１％ＮａＮ_３にて実行する）。^１４Ｃ標識ペプチドを、ＨＤＬ、Ｌ
ＤＬおよびＶＬＤＬ（ペプチド：リン脂質比が１：５（質量比））と共に、３７
℃にて２時間インキュベートする。必要量のリポタンパク質（量は、１０００μ
ｇを産生するのに必要な量に基づく）を、０．２ｍｌのペプチドストック溶液（
１ｍｇ／ｍｌ）と混合し、該溶液を、０．９％ＮａＣｌを用いて２．２ｍｌとす
る。 ３７℃にて２時間インキュベートしたあと、アリコート（０．１ｍｌ）を除去
して液体シンチレーションカウンターにより総放射能を測定し、残りのインキュ
ベーション混合物の密度をＫＢｒで１．２１ｇ／ｍｌに調節し、サンプルを１０
０，０００ｒｐｍ（３００，０００ｇ）で、４℃にて２４時間、Ｂｅｃｋｍａｎ
の卓上超遠心分離装置を用いてＴＬＡ１００．３ローターで遠心分離にかける。
得られた上清を、各サンプルの一番上から０．３ｍｌのアリコートを取り出して
分画し、合計５つの画分を得る。各画分０．０５ｍｌを、液体シンチレーション
カウントに用いる。一番上の２つの画分は、浮遊リポたんぱく質を含んでおり、
他の画分（３〜５）は、溶液中のタンパク質／ペプチドに対応する。８．６ 本発明のＡｐｏＡ−Ｉアゴニストはヒト血漿中のＨＤＬ脂質に選択的に
結合する ８．６．１ 実験方法 本発明のＡｐｏＡ−Ｉアゴニストがヒト血漿中のＨＤＬタンパク質に選択的に
結合することを示すために、ヒト血漿２ｍｌを^１４Ｃ標識ペプチド２０、４０、
６０、８０および１００μｇと共に３７℃にて２時間インキュベートする。該リ
ポタンパク質の密度を１．２１ｇ／ｍｌに調節し、ＴＬＡ１００．３ローターで
１００，００ｒｐｍ（３００，０００ｇ）、４℃にて３６時間遠心分離すること
により、分離する。上部９００μｌ（３００μｌの画分中）を取り出して分析す
る。各３００μｌの画分から取り出した５０μｌについて、放射能値をカウント
し、それぞれの画分から２００μｌをＦＰＬＣにより分析する（Ｓｕｐｅｒｏｓ
ｅ６／Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２コンビネーションカラム）。９．実施例：ＡｐｏＡ−Ｉアゴニストはコレステロール流出を促進する 本発明のＡｐｏＡ−Ｉアゴニストがコレステロール流出を促進することを示す
ために、ＨｅｐＧ肝癌細胞を６ウェル培養皿にのせ、コンフルエントになるまで
培養する。^３Ｈコレステロールを乾燥し、次にリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の
１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を加えて、該溶液を超音波処理し、この標識
溶液０．２ｍｌおよび成長培地１．８ｍｌを細胞に加えて、細胞を該コレステロ
ールで標識し、各ウェルが放射能の２μＣｉを含むようにする。細胞を該標識培
地とともに２４時間インキュベートする。 ペプチド（またはタンパク質）：ＤＭＰＣ複合体を、１：２のペプチド（また
はタンパク質）：ＤＭＰＣ比で調製する。該複合体を調製するために、ペプチド
または天然ヒトＡｐｏＡ−Ｉタンパク質をＰＢＳ中のＤＭＰＣ溶液に加え、室温
にて一晩インキュベートする（一晩かけることにより、溶液は透明になる）。最
終溶液中のペプチドまたはタンパク質濃度は、約１ｍｇ／ｍｌである。 標識培地を該細胞から除去し、該細胞をＰＢＳで洗浄してから複合体を添加す
る。成長培地１．６ｍｌを各ウェルに添加し、つぎにペプチド（またはタンパク
質）：ＤＭＰＣ複合体、およびウェルあたりの最終体積を２ｍｌするのに十分な
ＰＢＳを加える。最終ペプチドまたはＡｐｏＡ−Ｉ濃度は、約１、２．５、５、
７．５および２５μｇ／ｍｌ培地である。３７℃にて２４時間のインキュベーシ
ョン後、培地を除去し、細胞を１％ＢＳＡ／ＰＢＳ（２ｍｌ）で洗浄し、次にＰ
ＢＳ各２ｍｌで２回洗浄する。培地中への^３Ｈコレステロールの流出量を、液体
シンチレーションカウントにより測定する。１０．実施例：動物モデル系におけるＡｐｏＡ−Ｉアゴニストの使用 本発明のＡｐｏＡ−Ｉアゴニストの効率を、ウサギで示した。結果は、Ａｐｏ
Ａ−Ｉアゴニストの投与によりＨＤＬ様粒子の血清濃度が上昇することを示して
いる。１０．１．リン脂質／ペプチド複合体の調製 リン脂質（ＤＰＰＣ）およびペプチド１４６（配列番号１４６）からなる小盤
状粒子を、コール酸透析方法に従って調製した。リン脂質をクロロホルムに溶解
し、窒素流下において乾燥した。ペプチドを１〜２ｍｇ／ｍｌの濃度で緩衝液（
食塩水）に溶解した。コール酸を含有する緩衝液（４３℃）中に脂質膜を再び溶
解し、該ペプチド溶液を３−１のリン脂質／ペプチド比で加えた。この混合物を
４３℃にて一晩インキュベートしたあと、４３℃（２４時間）、室温（２４時間
）および４℃（２４時間）にて透析し、このとき温度地点において緩衝液（大量
）を３回変えた。該複合体を、注射および保存（４℃）用にフィルター滅菌（０
．２２μ）した。１０．２ ペプチド／リン脂質粒子の単離および特徴 該粒子を、ゲル濾過カラム（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６ＨＲ）上で分離し、該粒子
を含むピーク位置を、各画分中のリン脂質濃度を測定することにより同定した。
流出量より、ストークスの半径を測定することができた。該複合体中のペプチド
濃度を、１６時間の酸加水分解の後にフェニルアラニン含量（ＨＰＬＣ）を測定
することにより測定した。１０．３ ウサギへの注射 雄のニュージーランド白ウサギ（２．５〜３ｋｇ）に、１０〜１５ｍｌを超え
ない１回のボーラス注射で、リン脂質／ペプチド複合体（８ｍｇ／体重ｋｇのペ
プチド１４６（配列番号１４６）または１０ｍｇ／ｋｇ体重のＡｐｏＡ−Ｉ、ペ
プチドまたはタンパク質含量として表わされる）の用量で、静脈内注射した。扱
う前に、動物をやや鎮静化させた。血液サンプル（ＥＤＴＡで収集）を、注射の
前、注射の５、１５、３０、６０、２４０および１４４０分後に採取した。各サ
ンプルについてヘマトクリット（Ｈｃｔ）を測定した。サンプルを小分けし、分
析する前に−２０℃にて保存した。１０．４ ウサギ血清の分析 血漿脂質：総血漿コレステロール、血漿トリグリセリドおよび血漿リン脂質を
、市販されているアッセイ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｍａｎ
ｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ，６９２８０，Ｍ
ａｒｃｙ−ｌ’ｅｔｏｉｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いてその製造業者のプロトコ
ールに従って、酵素的に測定した。 リポタンパク質プロフィール。血漿をそのリポタンパク質画分に分離したあと
に得られた画分の血漿リポタンパク質プロファイルを、スクロース密度勾配にお
いて回転することにより、測定した。この画分を収集し、個々の画分それぞれに
おいて、リン脂質およびコレステロール含量を酵素的に測定した。１０．５ 結果 時間の関数としての８ｍｇ／ｋｇペプチド１４６（配列番号１４６）を注射し
たウサギのリポタンパク質プロフィール（ペプチド／ＤＰＰＣ複合体）。ＨＤＬ
コレステロール画分のコレステロール中の実質的な増加（画分＞１．０６ｍｇ／
ｍｌ）は、注射後５分で明白であり、約２４時間持続する。 以下に示す表Ｘに、濃度勾配超遠心により得られた複合ＨＤＬ画分のコレステ
ロールを示した。投与の２４０分後に、ＨＤＬコレステロールに最大の増加（９
０％）が見られた。投与の２４時間後においても、増加は７１．２％であった。 これらのデータから、ペプチド１４６／ＤＰＰＣ複合体（８ｍｇ／ｋｇ）の投
与により、急速かつ効果的な末梢コレステロールの移動が誘導される事がわかる
。 実施例１１：共凍結乾燥法によるペプチド−脂質複合体の調製 以下のプロトコルを使用してペプチド−脂質複合体を調製した。 １ｍｇのペプチド１４９（ＰＶＬＥＬＦＥＮＬＷＥＲＬＬＤＡＬＱＫＫＬＫ；
配列番号１４９）ペプチドを、キャップを有する１ｍｌの透明なガラスバイアル
（Ｗａｔｅｒｓ ＃ＷＡＴ００２５０５４）中の２５０μｌのＨＰＬＣグレード
のメタノール（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）に溶解した。室温で１０分間、時々
攪拌することによって、ペプチドの溶解を促進させた。この混合液に、３ｍｇの
ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ；Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ
Ｌｉｐｉｄｓ，９９％純度、製品＃８５０３５５）を含有するアリコートを１０
０ｍｇ／ｍｌの保存用メタノール溶液から添加した。メタノールの添加によって
混合液の量を４００μｌとし、室温で更に１０分間、混合液を断続的に攪拌した
。このチューブに２００μｌのキシレン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ ９９％
純度、ＨＰＬＣグレード）を添加し、チューブをそれぞれ１０秒間攪拌した。そ
れぞれのチューブの先端に２０ゲージの注射針で２個の小さな穴を開け、チュー
ブを液体窒素中でそれぞれ１５秒間凍結させ、真空下で一晩凍結乾燥した。この
チューブに２００ｍｌの０．９％ＮａＣｌ溶液を添加した。チューブを２０秒間
攪拌した。この時点で、チューブ内の溶液の外観は乳白色であった。次いでチュ
ーブを水浴上で３０分間、４１℃でインキュベートした。この後、この溶液は透
明になった（すなわち、外観上水と同様になった）。 １１．１ Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６ゲル濾過クロマトグラフィーによる複合体の性
状解析 ペプチド１４９（配列番号１４９）を含有するペプチド−リン脂質複合体を、
文献に記載されているような共凍結乾燥によって調製した。調製物は、１ｍｇの
ペプチド及び４ｍｇのＤＰＰＣを重量で含有していた。２００μｌの０．９％Ｎ
ａＣｌ中で複合体を再構成した後、複合体２０μｌ（１００μｇのペプチド１４
９を含有）を、液体相として０．９％ＮａＣｌを使用し、流速０．５ｍｌ／分で
Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６カラムにかけた。波長２８０ｎｍの吸
光度と散乱により、クロマトグラフィーをモニターした。画分１ｍｌを採取した
。２０μｌの画分を含有するアリコートに対し、製造者により供給される指示に
従ってｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｅｓ Ｅｎｚｙｍａｔ
ｉｑｕｅ ＰＡＰ １５０ ｋｉｔ（＃６１４９１）を使用してリン脂質含量を
アッセイした。リン脂質およびＵＶ吸光度の大部分は、共に数分画中に回収され
た。ピークは、約１５．８ｍｌであった。この溶出容積は、ストーク（Ｓｔｏｋ
ｅｓ）の直径８７オングストロームに相当した。 比較の為に、ペプチド１４９複合体と同様のカラムを用い同じ条件下で、２０
μｌのヒトＨＤＬ_２を別のクロマトグラフィーにかけた。ＨＤＬ_２を以下のよう
に調製した。３００ｍｌの凍結ヒト血漿（Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｌｕｔｓｐｅｎ
ｄｚｅｎｔｒａｌｅ、＃１１８５１９０）を解凍し、固体臭化カリウムを用い密
度１．２５にした。これを、２０℃にて、Ｔｉ４５遠心機（Ｂｅｃｋｍａｎ）を
用い、４０，０００ｐｒｍで４５時間遠心した。浮遊層を採集し、蒸留水に対し
て透析した。固体臭化カリウムを用い密度１．０７に調節し、前述のように７０
時間遠心した。下層（試験管底部から１ｃｍ上まで）を採集し、アジ化ナトリウ
ムを０．０１％となるように加え、クロマトグラフィーにかけるまで、４℃で４
日間保存した。カラム溶出液は、波長２５４ｎｍの吸光度または散乱によりモニ
ターした。既知の分子量およびＳｔｏｋｅｓの直径を持つ一連のタンパク質を標
準に用い、粒子のＳｔｏｋｅｓの直径を計算するためにカラムの較正を行った（
Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｇｅｌ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ
Ｋｉｔ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、１９
８５年４月改訂）。ＨＤＬ_２は、保持容積１４．８ｍｌと共に溶出され、Ｓｔｏ
ｋｅｓの直径１０８ｎｍに相当した。 ここに記載された特別な実施形態は、本発明の範囲を限定するものではない。
実際、ここに記載されている物に加えて、本発明の様々な修正が、前述の記述お
よび付随する図表から、当技術分野の専門家に対し、明らかになるであろう。そ
のような修正は、請求の範囲に当てはまると解釈される。 ここに様々な出版物が引用されているが、これらの開示はそのまま参照として
組み入れられる。

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒトＡｐｏＡ−Ｉのヌクレオチド配列（配列番号 ）及びアミノ酸
配列（配列番号 ）。

【図２】構造Ｉで示されるコアペプチドをコードするヌクレオチド配列（配
列番号 ）。

【図３】構造ＩＩで示されるコアペプチドをコードするヌクレオチド配列（
配列番号 ）。

【図４】構造ＩＩＩで示されるコアペプチドをコードするヌクレオチド配列
（配列番号 ）。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 9/00 Ａ６１Ｐ 9/10 １０１ 9/10 31/04 １０１ 43/00 １１１ 31/04 Ｃ０７Ｋ 7/06 43/00 １１１ 7/08 Ｃ１２Ｎ 5/10 14/47 // Ｃ０７Ｋ 7/06 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 7/08 5/00 Ｂ 14/47 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (71)出願人 コルナット，イサベル ドイツ連邦共和国 ディー−68535 エデ ィンゲン−ネッカーハウゼン，メイゼンヴ ェグ 10 (71)出願人 メッツ，グンテル ドイツ連邦共和国 ディー−68535 エデ ィンゲン−ネッカーハウゼン，レシンクシ ュトラーセ 14 (71)出願人 デュホーク，ジーン フランス国 エフ−33600 ペサック，ル ー ヤクエス プレバート，７ (72)発明者 ダシュー，ジーン−ルイス アメリカ合衆国 47401 インディアナ州， ブルーミントン，シェルウッド ヒルズ ドライブ 777 (72)発明者 セクル，リネート ドイツ連邦共和国 ディー−68526 ラデ ンバーク，ヴィケムシュトラーセ 13 (72)発明者 バトナー，クラウス ドイツ連邦共和国 ディー−74925 エフ ェンバッハ，イーチェンドルフシュトラー セ ６ (72)発明者 コルナット，イサベル ドイツ連邦共和国 ディー−68535 エデ ィンゲン−ネッカーハウゼン，メイゼンヴ ェグ 10 (72)発明者 メッツ，グンテル ドイツ連邦共和国 ディー−68535 エデ ィンゲン−ネッカーハウゼン，レシンクシ ュトラーセ 14 (72)発明者 デュホーク，ジーン フランス国 エフ−33600 ペサック，ル ー ヤクエス プレバート，７ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA04 CA05 CA06 DA02 EA04 GA11 4B065 AA90X AB01 BA02 CA24 CA44 4C084 AA01 AA13 BA01 BA08 DC50 MA17 MA23 MA28 MA31 MA34 MA35 MA37 MA52 MA55 MA56 MA60 MA63 MA66 NA14 ZA362 ZA412 ZB352 ZC212 ZC332 ZC352 ZC422 4H045 AA10 AA30 BA10 BA14 BA16 BA17 CA40 EA23 FA74 【要約の続き】

Claims (68)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＡｐｏＡ−１アゴニストをコードするヌクレオチド配列であ
   って、ＡｐｏＡ−１アゴニストが、 （ｉ）脂質の存在下で両親媒性αヘリックスを形成し、次の構造式（Ｉ）： Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｘ_５−Ｘ_６−Ｘ_７−Ｘ_８−Ｘ_９−Ｘ_１０−Ｘ_１１−Ｘ
   _１２−Ｘ_１３−Ｘ_１４−Ｘ_１５−Ｘ_１６−Ｘ_１７−Ｘ_１８−Ｘ_１９−Ｘ_２０−Ｘ
   _２１−Ｘ_２２−Ｘ_２３ からなる１５〜２９残基ペプチドもしくはペプチド類似体、またはその薬学的に
   許容される塩： 上記式中、 Ｘ_１はＰｒｏ（Ｐ）、Ａｌａ（Ａ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ａｓｎ（
   Ｎ）またはＡｓｐ（Ｄ）であり； Ｘ_２は脂肪族残基であり； Ｘ_３はＬｅｕ（Ｌ）またはＰｈｅ（Ｆ）であり； Ｘ_４は酸性残基であり； Ｘ_５はＬｅｕ（Ｌ）またはＰｈｅ（Ｆ）であり； Ｘ_６はＬｅｕ（Ｌ）またはＰｈｅ（Ｆ）であり； Ｘ_７は親水性残基であり； Ｘ_８は酸性または塩基性残基であり； Ｘ_９はＬｅｕ（Ｌ）またはＧｌｙ（Ｇ）であり； Ｘ_１０はＬｅｕ（Ｌ）、Ｔｒｐ（Ｗ）またはＧｌｙ（Ｇ）であり； Ｘ_１１は親水性残基であり； Ｘ_１２は親水性残基であり； Ｘ_１３はＧｌｙ（Ｇ）または脂肪族残基であり； Ｘ_１４はＬｅｕ（Ｌ）、Ｔｒｐ（Ｗ）またはＧｌｙ（Ｇ）であり； Ｘ_１５は親水性残基であり； Ｘ_１６は疎水性残基であり； Ｘ_１７は疎水性残基であり； Ｘ_１８はＧｌｎ（Ｑ）、Ａｓｎ（Ｎ）または塩基性残基であり； Ｘ_１９はＧｌｎ（Ｑ）、Ａｓｎ（Ｎ）または塩基性残基であり； Ｘ_２０は塩基性残基であり； Ｘ_２１は脂肪族残基であり； Ｘ_２２は塩基性残基であり； Ｘ_２３は存在しないか、塩基性残基である；または （ｉｉ）残基Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、Ｘ_７、Ｘ_８、Ｘ_９、Ｘ_{１
   ０}、Ｘ_１１、Ｘ_１２、Ｘ_１３、Ｘ_１４、Ｘ_１５、Ｘ_１６、Ｘ_１７、Ｘ_１８、Ｘ_{１
   ９}、Ｘ_２０、Ｘ_２１およびＸ_２２のうち１個以上８個までが欠失されている構造
   式（Ｉ）の欠失型；または （ｉｉｉ）残基Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、Ｘ_７、Ｘ_８、Ｘ_９、Ｘ
   _１０、Ｘ_１１、Ｘ_１２、Ｘ_１３、Ｘ_１４、Ｘ_１５、Ｘ_１６、Ｘ_１７、Ｘ_１８、Ｘ
   _１９、Ｘ_２０、Ｘ_２１、Ｘ_２２またはＸ_２３のうち少なくとも１個が他の残基で
   保存的に置換されている構造式（Ｉ）の改変型； からなる、上記ヌクレオチド配列。
2. 【請求項２】 ヒトＡｐｏＡ−１と比べて少なくとも約３８％のＬＣＡＴ活
   性化活性を示す、請求項１記載のヌクレオチド配列によりコードされるＡｐｏＡ
   −１アゴニスト。
3. 【請求項３】 構造式（Ｉ）の改変型である、請求項１記載のヌクレオチド
   配列によりコードされるＡｐｏＡ−１アゴニスト。
4. 【請求項４】 疎水性残基が構造式（Ｉ）に従って確定されており、少なく
   とも１個の非確定残基が他の残基で保存的に置換されている、請求項３記載のヌ
   クレオチド配列によりコードされるＡｐｏＡ−１アゴニスト。
5. 【請求項５】 Ｘ_１がＰｒｏ（Ｐ）、Ｇｌｙ（Ｇ）またはＡｌａ（Ａ）であり； Ｘ_２がＡｌａ（Ａ）、Ｌｅｕ（Ｌ）またはＶａｌ（Ｖ）であり； Ｘ_３がＬｅｕ（Ｌ）またはＰｈｅ（Ｆ）であり； Ｘ_５がＬｅｕ（Ｌ）またはＰｈｅ（Ｆ）であり； Ｘ_６がＬｅｕ（Ｌ）またはＰｈｅ（Ｆ）であり； Ｘ_９がＬｅｕ（Ｌ）またはＧｌｙ（Ｇ）であり； Ｘ_１０がＬｅｕ（Ｌ）、Ｔｒｐ（Ｗ）またはＧｌｙ（Ｇ）であり； Ｘ_１３がＬｅｕ（Ｌ）またはＧｌｙ（Ｇ）であり； Ｘ_１４がＬｅｕ（Ｌ）、Ｔｒｐ（Ｗ）またはＧｌｙ（Ｇ）であり； Ｘ_１６がＡｌａ（Ａ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｌｅｕ（Ｌ）またはＰ
   ｈｅ（Ｆ）であり； Ｘ_１７がＬｅｕ（Ｌ）またはＧｌｙ（Ｇ）であり； Ｘ_２１がＬｅｕ（Ｌ）であり；そして Ｘ_４、Ｘ_７、Ｘ_８、Ｘ_１１、Ｘ_１２、Ｘ_１５、Ｘ_１８、Ｘ_１９、Ｘ_２０、Ｘ_{２
   ２}およびＸ_２３のうち少なくとも１個が他の残基で保存的に置換されている、請
   求項４記載のＡｐｏＡ−１アゴニスト。
6. 【請求項６】 親水性残基が構造式（Ｉ）に従って確定されており、少なく
   とも１個の非確定残基が他の残基で保存的に置換されている、請求項３記載のＡ
   ｐｏＡ−１アゴニスト。
7. 【請求項７】 Ｘ_４がＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）であり； Ｘ_７がＬｙｓ（Ｋ）またはＡｒｇ（Ｒ）であり； Ｘ_８がＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）であり； Ｘ_１１がＡｓｎ（Ｎ）またはＧｌｎ（Ｑ）であり； Ｘ_１２がＧｌｕ（Ｅ）またはＡｓｐ（Ｄ）であり； Ｘ_１５がＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）であり； Ｘ_１８がＧｌｎ（Ｑ）、Ａｓｎ（Ｎ）またはＬｙｓ（Ｋ）であり； Ｘ_１９がＧｌｎ（Ｑ）、Ａｓｎ（Ｎ）またはＬｙｓ（Ｋ）であり； Ｘ_２０がＬｙｓ（Ｋ）であり； Ｘ_２２がＬｙｓ（Ｋ）であり； Ｘ_２３が存在しないか、Ｌｙｓ（Ｋ）であり；そして Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_５、Ｘ_６、Ｘ_９、Ｘ_１０、Ｘ_１３、Ｘ_１４、Ｘ_１６、Ｘ
   _１７およびＸ_２１のうち少なくとも１個が他の残基で保存的に置換されている、
   請求項６記載のＡｐｏＡ−１アゴニスト。
8. 【請求項８】 Ｘ_３がＬｅｕ（Ｌ）またはＰｈｅ（Ｆ）であり、Ｘ_６がＰｈ
   ｅ（Ｆ）であり、Ｘ_９がＬｅｕ（Ｌ）またはＧｌｙ（Ｇ）であり、Ｘ_１０がＬｅ
   ｕ（Ｌ）、Ｔｒｐ（Ｗ）またはＧｌｙ（Ｇ）であり、そしてＸ_１、Ｘ_２、Ｘ_５、
   Ｘ_１３、Ｘ_１４、Ｘ_１６、Ｘ_１７およびＸ_２１のうち少なくとも１個が他の残基
   で保存的に置換されている、請求項７記載のＡｐｏＡ−１アゴニスト。
9. 【請求項９】 置換する残基が置換される残基と同じサブカテゴリーに分類
   される、請求項５または７記載のＡｐｏＡ−１アゴニスト。
10. 【請求項１０】 構造式（Ｉ）の欠失型である、請求項１記載のヌクレオチ
    ド配列によりコードされるＡｐｏＡ−１アゴニスト。
11. 【請求項１１】 ペプチドまたはペプチド類似体の１つのヘリックスターン
    が欠失される、請求項１０記載のＡｐｏＡ−１アゴニスト。
12. 【請求項１２】 構造式（Ｉ）の２２〜２３残基ペプチドまたはペプチド類
    似体である、請求項１記載のヌクレオチド配列によりコードされるＡｐｏＡ−１
    アゴニスト。
13. 【請求項１３】 Ｘ_１がＰｒｏ（Ｐ）、Ａｌａ（Ａ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（
    Ｑ）またはＡｓｐ（Ｄ）であり； Ｘ_２がＡｌａ（Ａ）、Ｌｅｕ（Ｌ）またはＶａｌ（Ｖ）であり； Ｘ_３がＬｅｕ（Ｌ）またはＰｈｅ（Ｆ）であり； Ｘ_４がＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）であり； Ｘ_５がＬｅｕ（Ｌ）またはＰｈｅ（Ｆ）であり； Ｘ_６がＬｅｕ（Ｌ）またはＰｈｅ（Ｆ）であり； Ｘ_７がＬｙｓ（Ｋ）またはＡｒｇ（Ｒ）であり； Ｘ_８がＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）であり； Ｘ_９がＬｅｕ（Ｌ）またはＧｌｙ（Ｇ）であり； Ｘ_１０がＬｅｕ（Ｌ）、Ｔｒｐ（Ｗ）またはＧｌｙ（Ｇ）であり； Ｘ_１１がＡｓｎ（Ｎ）またはＧｌｎ（Ｑ）であり； Ｘ_１２がＧｌｕ（Ｅ）またはＡｓｐ（Ｄ）であり； Ｘ_１３がＬｅｕ（Ｌ）またはＧｌｙ（Ｇ）であり； Ｘ_１４がＬｅｕ（Ｌ）、Ｔｒｐ（Ｗ）またはＧｌｙ（Ｇ）であり； Ｘ_１５がＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）であり； Ｘ_１６がＡｌａ（Ａ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｐｈｅ（Ｆ）またはＧ
    ｌｙ（Ｇ）であり； Ｘ_１７がＧｌｙ（Ｇ）またはＬｅｕ（Ｌ）であり； Ｘ_１８がＧｌｎ（Ｑ）、Ａｓｎ（Ｎ）またはＬｙｓ（Ｋ）であり； Ｘ_１９がＧｌｎ（Ｑ）、Ａｓｎ（Ｎ）またはＬｙｓ（Ｋ）であり； Ｘ_２０がＬｙｓ（Ｋ）であり； Ｘ_２１がＬｅｕ（Ｌ）であり； Ｘ_２２がＬｙｓ（Ｋ）であり；そして Ｘ_２３が存在しないか、Ｌｙｓ（Ｋ）である、 請求項１記載のヌクレオチド配列によりコードされるＡｐｏＡ−１アゴニスト。
14. 【請求項１４】 Ｘ_２３が存在しない、請求項１３記載のＡｐｏＡ−１アゴ
    ニスト。
15. 【請求項１５】 Ｘ_１８またはＸ_１９の一方がＧｌｎ（Ｑ）またはＡｓｎ（
    Ｎ）であり、Ｘ_１８またはＸ_１９の他方がＬｙｓ（Ｋ）である、請求項１３記載
    のＡｐｏＡ−１アゴニスト。
16. 【請求項１６】 Ｘ_９、Ｘ_１０、Ｘ_１３、Ｘ_１４、Ｘ_１５およびＸ_１７のそ
    れぞれがＧｌｙ（Ｇ）以外のものである、請求項１３記載のＡｐｏＡ−１アゴニ
    スト。
17. 【請求項１７】 Ｘ_９、Ｘ_１０、Ｘ_１３、Ｘ_１４、Ｘ_１５およびＸ_１７の１
    つがＧｌｙ（Ｇ）であり、その他がＧｌｙ（Ｇ）以外のものである、請求項１３
    記載のＡｐｏＡ−１アゴニスト。
18. 【請求項１８】 次のペプチド： からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＡｐｏＡ−１アゴニストをコー
    ドする、請求項１記載のヌクレオチド配列。
19. 【請求項１９】 ＡｐｏＡ−１アゴニストをコードするヌクレオチド配列で
    あって、ＡｐｏＡ−１アゴニストが、 （ｉ）脂質の存在下で両親媒性αヘリックスを形成し、次の構造式（ＩＩ）：
    Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｘ_５−Ｘ_６−Ｘ_７−Ｘ_８−Ｘ_９−Ｘ_１０−Ｘ_１１−Ｘ
    _１２−Ｘ_１３−Ｘ_１４−Ｘ_１５−Ｘ_１６−Ｘ_１７−Ｘ_１８−Ｘ_１９−Ｘ_２０−Ｘ
    _２１−Ｘ_２２−Ｘ_２３からなる１５〜２９残基ペプチドもしくはペプチド類似体
    、またはその薬学的に許容される塩： 上記式中、 Ｘ_１はＰｒｏ（Ｐ）、Ａｌａ（Ａ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ａｓｎ（
    Ｎ）またはＡｓｐ（Ｄ）であり； Ｘ_２は脂肪族残基Ｖａｌ（Ｖ）またはＬｅｕ（Ｌ）であり； Ｘ_３はＬｅｕ（Ｌ）またはＰｈｅ（Ｆ）であり； Ｘ_４はＧｌｕ（Ｅ）であり； Ｘ_５は脂肪族残基であり； Ｘ_６はＬｅｕ（Ｌ）またはＰｈｅ（Ｆ）であり； Ｘ_７はＧｌｕ（Ｅ）またはＬｅｕ（Ｌ）であり； Ｘ_８はＡｓｎ（Ｎ）またはＧｌｎ（Ｑ）であり； Ｘ_９はＬｅｕ（Ｌ）であり； Ｘ_１０はＬｅｕ（Ｌ）、Ｔｒｐ（Ｗ）またはＧｌｙ（Ｇ）であり； Ｘ_１１は酸性残基であり； Ｘ_１２はＡｒｇ（Ｒ）であり； Ｘ_１３はＬｅｕ（Ｌ）またはＧｌｙ（Ｇ）であり； Ｘ_１４はＬｅｕ（Ｌ）、Ｐｈｅ（Ｆ）またはＧｌｙ（Ｇ）であり； Ｘ_１５はＡｓｐ（Ｄ）であり； Ｘ_１６はＡｌａ（Ａ）であり； Ｘ_１７はＬｅｕ（Ｌ）であり； Ｘ_１８はＡｓｎ（Ｎ）またはＧｌｎ（Ｑ）であり； Ｘ_１９は塩基性残基であり； Ｘ_２０は塩基性残基であり； Ｘ_２１はＬｅｕ（Ｌ）であり； Ｘ_２２は塩基性残基であり； Ｘ_２３は存在しないか、塩基性残基である；または （ｉｉ）残基Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、Ｘ_７、Ｘ_８、Ｘ_９、Ｘ_{１
    ０}、Ｘ_１１、Ｘ_１２、Ｘ_１３、Ｘ_１４、Ｘ_１５、Ｘ_１６、Ｘ_１７、Ｘ_１８、Ｘ_{１
    ９}、Ｘ_２０、Ｘ_２１およびＸ_２２のうち１個以上８個までが欠失されている構造
    式（ＩＩ）の欠失型；または （ｉｉｉ）残基Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、Ｘ_７、Ｘ_８、Ｘ_９、Ｘ
    _１０、Ｘ_１１、Ｘ_１２、Ｘ_１３、Ｘ_１４、Ｘ_１５、Ｘ_１６、Ｘ_１７、Ｘ_１８、Ｘ
    _１９、Ｘ_２０、Ｘ_２１、Ｘ_２２またはＸ_２３のうち少なくとも１個が他の残基で
    保存的に置換されている構造式（ＩＩ）の改変型； からなる、上記ヌクレオチド配列。
20. 【請求項２０】 ヒトＡｐｏＡ−１と比べて少なくとも約３８％のＬＣＡＴ
    活性化活性を示す、請求項１８記載のヌクレオチド配列によりコードされるＡｐ
    ｏＡ−１アゴニスト。
21. 【請求項２１】 構造式（ＩＩ）の改変型である、請求項１８記載のヌクレ
    オチド配列によりコードされるＡｐｏＡ−１アゴニスト。
22. 【請求項２２】 疎水性残基が構造式（ＩＩ）に従って確定されており、少
    なくとも１個の非確定残基が他の残基で保存的に置換されている、請求項２０記
    載のヌクレオチド配列によりコードされるＡｐｏＡ−１アゴニスト。
23. 【請求項２３】 Ｘ_１がＰｒｏ（Ｐ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ａｓｎ（Ｎ）またはＡｌａ（Ａ）であり
    ； Ｘ_２がＡｌａ（Ａ）、Ｌｅｕ（Ｌ）またはＶａｌ（Ｖ）であり； Ｘ_３がＬｅｕ（Ｌ）またはＰｈｅ（Ｆ）であり； Ｘ_５がＬｅｕ（Ｌ）であり； Ｘ_６がＰｈｅ（Ｆ）であり； Ｘ_９がＬｅｕ（Ｌ）であり； Ｘ_１０がＬｅｕ（Ｌ）、Ｔｒｐ（Ｗ）またはＧｌｙ（Ｇ）であり； Ｘ_１３がＬｅｕ（Ｌ）またはＧｌｙ（Ｇ）であり； Ｘ_１４がＬｅｕ（Ｌ）、Ｐｈｅ（Ｆ）またはＧｌｙ（Ｇ）であり； Ｘ_１６がＡｌａ（Ａ）であり； Ｘ_１７がＬｅｕ（Ｌ）であり； Ｘ_２１がＬｅｕ（Ｌ）であり；そして Ｘ_４、Ｘ_７、Ｘ_８、Ｘ_１１、Ｘ_１２、Ｘ_１５、Ｘ_１８、Ｘ_１９、Ｘ_２０、Ｘ_{２
    ２}およびＸ_２３のうち少なくとも１個が他の残基で保存的に置換されている、請
    求項２１記載のＡｐｏＡ−１アゴニスト。
24. 【請求項２４】 親水性残基が構造式（ＩＩ）に従って確定されており、少
    なくとも１個の非確定残基が他の残基で保存的に置換されている、請求項２０記
    載のヌクレオチド配列によりコードされるＡｐｏＡ−１アゴニスト。
25. 【請求項２５】 Ｘ_４がＧｌｕ（Ｅ）であり； Ｘ_７がＧｌｕ（Ｅ）であり； Ｘ_８がＡｓｎ（Ｎ）またはＧｌｎ（Ｑ）であり； Ｘ_１１がＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）であり； Ｘ_１２がＡｒｇ（Ｒ）であり； Ｘ_１５がＡｓｐ（Ｄ）であり； Ｘ_１８がＡｓｎ（Ｎ）またはＧｌｎ（Ｑ）であり； Ｘ_１９がＬｙｓ（Ｋ）であり； Ｘ_２０がＬｙｓ（Ｋ）であり； Ｘ_２２がＬｙｓ（Ｋ）であり； Ｘ_２３が存在しないか、Ｌｙｓ（Ｋ）であり；そして Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_５、Ｘ_６、Ｘ_９、Ｘ_１０、Ｘ_１３、Ｘ_１４、Ｘ_１６、Ｘ
    _１７およびＸ_２１のうち少なくとも１個が他の残基で保存的に置換されている、
    請求項２３記載のＡｐｏＡ−１アゴニスト。
26. 【請求項２６】 Ｘ_３がＬｅｕ（Ｌ）またはＰｈｅ（Ｆ）であり、Ｘ_６がＰ
    ｈｅ（Ｆ）であり、Ｘ_９がＬｅｕ（Ｌ）であり、Ｘ_１０がＬｅｕ（Ｌ）、Ｔｒｐ
    （Ｗ）またはＧｌｙ（Ｇ）であり、そしてＸ_１、Ｘ_２、Ｘ_５、Ｘ_１３、Ｘ_１４、
    Ｘ_１６、Ｘ_１７およびＸ_２１のうち少なくとも１個が他の残基で保存的に置換さ
    れている、請求項２３記載のＡｐｏＡ−１アゴニスト。
27. 【請求項２７】 置換する残基が置換される残基と同じサブカテゴリーに分
    類される、請求項２２または２４記載のＡｐｏＡ−１アゴニスト。
28. 【請求項２８】 構造式（ＩＩ）の欠失型である、請求項１８記載のヌクレ
    オチド配列によりコードされるＡｐｏＡ−１アゴニスト。
29. 【請求項２９】 ペプチドまたはペプチド類似体の１個のヘリックスターン
    が欠失される、請求項２７記載のＡｐｏＡ−１アゴニスト。
30. 【請求項３０】 構造式（ＩＩ）の２２〜２３残基ペプチドまたはペプチド
    類似体である、請求項１８記載のヌクレオチド配列によりコードされるＡｐｏＡ
    −１アゴニスト。
31. 【請求項３１】 Ｘ_１がＰｒｏ（Ｐ）、Ａｌａ（Ａ）、Ｇｌｙ（Ｇ）またはＡｓｎ（Ｎ）であり
    ； Ｘ_２がＡｌａ（Ａ）、Ｌｅｕ（Ｌ）またはＶａｌ（Ｖ）であり； Ｘ_３がＬｅｕ（Ｌ）またはＰｈｅ（Ｆ）であり； Ｘ_４がＧｌｕ（Ｅ）であり； Ｘ_５がＬｅｕ（Ｌ）であり； Ｘ_６がＰｈｅ（Ｆ）であり； Ｘ_７がＬｅｕ（Ｌ）またはＧｌｕ（Ｅ）であり； Ｘ_８がＡｓｎ（Ｎ）またはＧｌｎ（Ｑ）であり； Ｘ_９がＬｅｕ（Ｌ）であり； Ｘ_１０がＬｅｕ（Ｌ）、Ｔｒｐ（Ｗ）またはＧｌｙ（Ｇ）であり； Ｘ_１１がＧｌｕ（Ｅ）であり； Ｘ_１２がＡｒｇ（Ｒ）であり； Ｘ_１３がＬｅｕ（Ｌ）またはＧｌｙ（Ｇ）であり； Ｘ_１４がＬｅｕ（Ｌ）、Ｐｈｅ（Ｆ）またはＧｌｙ（Ｇ）であり； Ｘ_１５がＡｓｐ（Ｄ）であり； Ｘ_１６がＡｌａ（Ａ）であり； Ｘ_１７がＬｅｕ（Ｌ）であり； Ｘ_１８がＡｓｎ（Ｎ）またはＧｌｎ（Ｑ）であり； Ｘ_１９がＬｙｓ（Ｋ）であり； Ｘ_２０がＬｙｓ（Ｋ）であり； Ｘ_２１がＬｅｕ（Ｌ）であり； Ｘ_２２がＬｙｓ（Ｋ）であり；そして Ｘ_２３が存在しないか、Ｌｙｓ（Ｋ）である、 請求項１８記載のヌクレオチド配列によりコードされるＡｐｏＡ−１アゴニスト
    。
32. 【請求項３２】 Ｘ_２３が存在しない、請求項３０記載のＡｐｏＡ−１アゴ
    ニスト。
33. 【請求項３３】 Ｘ_１０、Ｘ_１３およびＸ_１４のそれぞれがＧｌｙ（Ｇ）以
    外のものである、請求項３０記載のＡｐｏＡ−１アゴニスト。
34. 【請求項３４】 Ｘ_１０、Ｘ_１３またはＸ_１４の１つがＧｌｙ（Ｇ）であり
    、その他がＧｌｙ（Ｇ）以外のものである、請求項３１記載のＡｐｏＡ−１アゴ
    ニスト。
35. 【請求項３５】 次のペプチド： からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＡｐｏＡ−１アゴニストをコー
    ドする、請求項１８記載のヌクレオチド配列。
36. 【請求項３６】 ＡｐｏＡ−１アゴニストをコードするヌクレオチド配列で
    あって、ＡｐｏＡ−１アゴニストが、 （ｉ）脂質の存在下で両親媒性αヘリックスを形成し、次の構造式（ＩＩＩ）
    ：Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｘ_５−Ｘ_６−Ｘ_７−Ｘ_８−Ｘ_９−Ｘ_１０−Ｘ_１１−
    Ｘ_１２−Ｘ_１３−Ｘ_１４−Ｘ_１５−Ｘ_１６−Ｘ_１７−Ｘ_１８からなる１４〜２２
    残基ペプチドもしくはペプチド類似体： 上記式中、 Ｘ_１はＰｒｏ（Ｐ）、Ａｌａ（Ａ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ａｓｎ（Ｎ）またはＧｌ
    ｎ（Ｑ）であり； Ｘ_２は脂肪族アミノ酸であり； Ｘ_３はＬｅｕ（Ｌ）であり； Ｘ_４は酸性アミノ酸であり； Ｘ_５はＬｅｕ（Ｌ）またはＰｈｅ（Ｆ）であり； Ｘ_６はＬｅｕ（Ｌ）またはＰｈｅ（Ｆ）であり； Ｘ_７は塩基性アミノ酸であり； Ｘ_８は酸性アミノ酸であり； Ｘ_９はＬｅｕ（Ｌ）またはＴｒｐ（Ｗ）であり； Ｘ_１０はＬｅｕ（Ｌ）またはＴｒｐ（Ｗ）であり； Ｘ_１１は酸性アミノ酸またはＡｓｎ（Ｎ）であり； Ｘ_１２は酸性アミノ酸であり； Ｘ_１３はＬｅｕ（Ｌ）、Ｔｒｐ（Ｗ）またはＰｈｅ（Ｆ）であり； Ｘ_１４は塩基性アミノ酸またはＬｅｕ（Ｌ）であり； Ｘ_１５はＧｌｎ（Ｑ）またはＡｓｎ（Ｎ）であり； Ｘ_１６は塩基性アミノ酸であり； Ｘ_１７はＬｅｕ（Ｌ）であり； Ｘ_１８は塩基性アミノ酸である；または （ｉｉ）残基Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、Ｘ_７、Ｘ_８、Ｘ_９、Ｘ_{１
    ０}、Ｘ_１１、Ｘ_１２、Ｘ_１３、Ｘ_１４、Ｘ_１５、Ｘ_１６、Ｘ_１７およびＸ_１８の
    うち１個以上８個までが欠失されている構造式（ＩＩＩ）の欠失型；または （ｉｉｉ）残基Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、Ｘ_７、Ｘ_８、Ｘ_９、Ｘ
    _１０、Ｘ_１１、Ｘ_１２、Ｘ_１３、Ｘ_１４、Ｘ_１５、Ｘ_１６、Ｘ_１７またはＸ_１８
    のうち少なくとも１個が他の残基で保存的に置換されている構造式（ＩＩＩ）の
    改変型； からなる、上記ヌクレオチド配列。
37. 【請求項３７】 ヒトＡｐｏＡ−１と比べて少なくとも約３８％のＬＣＡＴ
    活性化活性を示す、請求項３６記載のヌクレオチド配列によりコードされるＡｐ
    ｏＡ−１アゴニスト。
38. 【請求項３８】 構造式（ＩＩＩ）の改変型である、請求項３６記載のヌク
    レオチド配列によりコードされるＡｐｏＡ−１アゴニスト。
39. 【請求項３９】 疎水性残基が構造式（ＩＩＩ）に従って確定されており、
    少なくとも１個の非確定残基が他の残基で保存的に置換されている、請求項３８
    記載のヌクレオチド配列によりコードされるＡｐｏＡ−１アゴニスト。
40. 【請求項４０】 Ｘ_１がＰｒｏ（Ｐ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ａｓｎ（Ｎ）またはＡｌａ（Ａ）であり
    ； Ｘ_２がＡｌａ（Ａ）、Ｌｅｕ（Ｌ）またはＶａｌ（Ｖ）であり； Ｘ_３がＬｅｕ（Ｌ）であり； Ｘ_５がＬｅｕ（Ｌ）またはＰｈｅ（Ｆ）であり； Ｘ_６がＬｅｕ（Ｌ）またはＰｈｅ（Ｆ）であり； Ｘ_９がＬｅｕ（Ｌ）またはＴｒｐ（Ｗ）であり； Ｘ_１０がＬｅｕ（Ｌ）またはＴｒｐ（Ｗ）であり； Ｘ_１３がＬｅｕ（Ｌ）、Ｔｒｐ（Ｗ）またはＰｈｅ（Ｆ）であり； Ｘ_１７がＬｅｕ（Ｌ）であり；そして Ｘ_４、Ｘ_７、Ｘ_８、Ｘ_１１、Ｘ_１２、Ｘ_１４、Ｘ_１５、Ｘ_１６およびＸ_１８の
    うち少なくとも１個が他の残基で保存的に置換されている、請求項３９記載のＡ
    ｐｏＡ−１アゴニスト。
41. 【請求項４１】 親水性残基が構造式（ＩＩＩ）に従って確定されており、
    少なくとも１個の非確定残基が他の残基で保存的に置換されている、請求項３８
    記載のＡｐｏＡ−１アゴニスト。
42. 【請求項４２】 Ｘ_４がＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）であり； Ｘ_７がＡｒｇ（Ｒ）またはＬｙｓ（Ｋ）であり； Ｘ_８がＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）であり； Ｘ_１１がＡｓｎ（Ｎ）またはＧｌｕ（Ｅ）であり； Ｘ_１２がＧｌｕ（Ｅ）であり； Ｘ_１４がＬｙｓ（Ｋ）またはＡｒｇ（Ｒ）であり； Ｘ_１５がＧｌｎ（Ｑ）またはＡｓｎ（Ｎ）であり； Ｘ_１６がＬｙｓ（Ｋ）またはＡｒｇ（Ｒ）であり； Ｘ_１８がＡｓｎ（Ｎ）またはＧｌｎ（Ｑ）であり；そして Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_５、Ｘ_６、Ｘ_９、Ｘ_１０、Ｘ_１３およびＸ_１７のうち少
    なくとも１個が他の残基で保存的に置換されている、請求項４１記載のＡｐｏＡ
    −１アゴニスト。
43. 【請求項４３】 Ｘ_３がＬｅｕ（Ｌ）であり、Ｘ_６がＰｈｅ（Ｆ）であり、
    Ｘ_９がＬｅｕ（Ｌ）またはＴｒｐ（Ｗ）であり、Ｘ_１０がＬｅｕ（Ｌ）またはＴ
    ｒｐ（Ｗ）であり、そしてＸ_１、Ｘ_２、Ｘ_５、Ｘ_１３およびＸ_１７のうち少なく
    とも１個が他の残基で保存的に置換されている、請求項４１記載のＡｐｏＡ−１
    アゴニスト。
44. 【請求項４４】 置換する残基が置換される残基と同じサブカテゴリーに分
    類される、請求項４０または４２記載のＡｐｏＡ−１アゴニスト。
45. 【請求項４５】 構造式（ＩＩＩ）の欠失型である、請求項３６記載のヌク
    レオチド配列によりコードされるＡｐｏＡ−１アゴニスト。
46. 【請求項４６】 ペプチドまたはペプチド類似体の１個のヘリックスターン
    が欠失される、請求項４５記載のＡｐｏＡ−１アゴニスト。
47. 【請求項４７】 構造式（ＩＩＩ）の１８残基ペプチドまたはペプチド類似
    体である、請求項３６記載のヌクレオチド配列によりコードされるＡｐｏＡ−１
    アゴニスト。
48. 【請求項４８】 Ｘ_１がＰｒｏ（Ｐ）、Ａｌａ（Ａ）、Ｇｌｙ（Ｇ）またはＡｓｎ（Ｎ）であり
    ； Ｘ_２がＡｌａ（Ａ）、Ｌｅｕ（Ｌ）またはＶａｌ（Ｖ）であり； Ｘ_３がＬｅｕ（Ｌ）であり； Ｘ_４がＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）であり； Ｘ_５がＬｅｕ（Ｌ）またはＰｈｅ（Ｆ）であり； Ｘ_６がＬｅｕ（Ｌ）またはＰｈｅ（Ｆ）であり； Ｘ_７がＡｒｇ（Ｒ）またはＬｙｓ（Ｋ）であり； Ｘ_８がＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）であり； Ｘ_９がＬｅｕ（Ｌ）またはＴｒｐ（Ｗ）であり； Ｘ_１０がＬｅｕ（Ｌ）またはＴｒｐ（Ｗ）であり； Ｘ_１１がＧｌｕ（Ｅ）またはＡｓｎ（Ｎ）であり； Ｘ_１２がＧｌｕ（Ｅ）であり； Ｘ_１３がＬｅｕ（Ｌ）、Ｔｒｐ（Ｗ）またはＰｈｅ（Ｆ）であり； Ｘ_１４がＡｒｇ（Ｒ）またはＬｙｓ（Ｋ）であり； Ｘ_１５がＧｌｎ（Ｑ）またはＡｓｎ（Ｎ）であり； Ｘ_１６がＡｌｇ（Ｒ）またはＬｙｓ（Ｋ）であり； Ｘ_１７がＬｅｕ（Ｌ）であり； Ｘ_１８がＡｓｇ（Ｒ）またはＬｙｓ（Ｋ）である、 請求項３６記載のヌクレオチド配列によりコードされるＡｐｏＡ−１アゴニスト
    。
49. 【請求項４９】 次のペプチド： からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＡｐｏＡ−１アゴニストをコー
    ドする、請求項３６記載のヌクレオチド配列。
50. 【請求項５０】 ヒトＡｐｏＡ−１と比べて少なくとも約３８％のＬＣＡ
    Ｔ活性化活性を示し、次の構造式（ＩＶ）： を有する多量体ＡｐｏＡ−１アゴニストをコードするヌクレオチド配列または
    その薬学的に許容される塩： 上記式中、 各ｍは独立して０〜１の整数であり、 ｎは０〜１０の整数であり、 各ＨＨは独立して請求項１または１８または３６記載のペプチドまたはペプチ
    ド類似体であり、 各ＬＬは独立して二官能性リンカーである。
51. 【請求項５１】 請求項１、１８または３６記載のヌクレオチド配列により
    コードされるペプチドを発現する宿主細胞。
52. 【請求項５２】 請求項１７、３５または４９記載のヌクレオチド配列によ
    りコードされるペプチドを発現する宿主細胞。
53. 【請求項５３】 請求項５０記載のヌクレオチド配列によりコードされるペ
    プチドを発現する宿主細胞。
54. 【請求項５４】 ＡｐｏＡ−１アゴニストをコードするヌクレオチド配列お
    よび製薬上許容される担体、賦形剤または希釈剤を含有する医薬組成物であって
    、 ＡｐｏＡ−１アゴニストが請求項１、１８または３６記載のヌクレオチド配列に
    よりコードされる、上記医薬組成物。
55. 【請求項５５】 ＡｐｏＡ−１アゴニストをコードするヌクレオチド配列お
    よび製薬上許容される担体、賦形剤または希釈剤を含有する医薬組成物であって
    、 ＡｐｏＡ−１アゴニストが請求項１７、３５または４９記載のヌクレオチド配列
    によりコードされる、上記医薬組成物。
56. 【請求項５６】 ＡｐｏＡ−１アゴニストをコードするヌクレオチド配列お
    よび製薬上許容される担体、賦形剤または希釈剤を含有する医薬組成物であって
    、 ＡｐｏＡ−１アゴニストが請求項５０記載のヌクレオチド配列によりコードされ
    る、上記医薬組成物。
57. 【請求項５７】 前記ヌクレオチド配列がヌクレオチド−脂質複合体の形を
    しており、該複合体がＡｐｏＡ−１アゴニストをコードするヌクレオチド配列と
    脂質からなる、請求項５４記載の医薬組成物。
58. 【請求項５８】 異常脂肪血と関連した障害をもつ被験体に有効量の請求項
    １、１８または３６記載のヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列を発現す
    る宿主細胞を投与することを含んでなる、該被験体の治療方法。
59. 【請求項５９】 ＡｐｏＡ−１アゴニストがＡｐｏＡ−１アゴニストと脂質
    からなるＡｐｏＡ−１アゴニスト−脂質複合体の形をしている、請求項５８記載
    の方法。
60. 【請求項６０】 ＡｐｏＡ−１アゴニストが医薬組成物の形をしており、該
    組成物がＡｐｏＡ−１アゴニストと製薬上許容される担体、賦形剤または希釈剤
    を含有する、請求項５８記載の方法。
61. 【請求項６１】 異常脂肪血と関連した障害が高コレステロール血症である
    、請求項５８記載の方法。
62. 【請求項６２】 異常脂肪血と関連した障害が心血管性の疾病である、請求
    項５８記載の方法。
63. 【請求項６３】 異常脂肪血と関連した障害がアテローム硬化症である、請
    求項５８記載の方法。
64. 【請求項６４】 異常脂肪血と関連した障害が再狭窄である、請求項５８記
    載の方法。
65. 【請求項６５】 異常脂肪血と関連した障害がＨＤＬまたはＡｐｏＡ−１不
    全症である、請求項５８記載の方法。
66. 【請求項６６】 異常脂肪血と関連した障害が高トリグリセリド血症である
    、請求項５８記載の方法。
67. 【請求項６７】 異常脂肪血と関連した障害が代謝症候群である、請求項５
    ８記載の方法。
68. 【請求項６８】 内毒素血症と関連した障害である敗血症性ショックの被験
    体に有効量の請求項１、１８または３６記載のヌクレオチド配列または該ヌクレ
    オチド配列を発現する宿主細胞を投与することを含んでなる、該被験体の治療方
    法。