在本發明中，吾人揭示新研究，其首次表明λ干擾素家族之細胞介素在活體外及活體內均具有直接作用之抗纖維化效應，且此等蛋白質可用於設計對治療多種類型之纖維化有效的新方法。 除非另外規定，否則本文中所使用之所有科學及技術術語具有與熟習屬於本發明之此項技術者通常所理解相同之含義。本文中所提及之所有公開案及專利以引用之方式併入。 應瞭解，可組合本文中所描述之實施例中之任一者。 本發明提供用於治療纖維化之λ干擾素。本發明亦提供λ干擾素之用途，以供製備用於治療纖維化之藥物。本發明進一步提供一種用於治療纖維化之方法，其包含投與治療有效量之λ干擾素。 干擾素(IFN)為具有保護宿主免遭病毒感染及免疫反應調節之不同作用的細胞介素之重要類別。基於其結構特徵、受體用途及生物活性以及其在不同類型之間變化之宿主防禦中之作用來識別干擾素之三種不同類型(I型、II型及III型)。 I型IFN (在人類中為IFN-α/β/ω/ε/κ)具有較強抗病毒活性且能夠在多種細胞類型中誘發強效抗病毒反應(Huang等人1993)。IFN-α/β結合被稱為IFNαR之異二聚體跨膜受體(由IFNAR1及IFNAR2亞單元組成)，其在與配位體結合後，觸發激酶、JAK1及TYK2之活化，接著磷酸化胞內域中之特定酪胺酸受體。此產生STAT1及STAT2信號傳導分子之對接位點，從而引起其之募集及後續的磷酸化。經磷酸化STAT募集IFN調節因子9 (IRF9)，其一起形成經IFN-刺激之基因因子3 (ISGF3)，該經IFN-刺激之基因因子進入細胞核中且驅動IFN刺激基因(ISG)之轉錄。 II型類別僅包括IFN-γ，其歸類為Th1型細胞介素，該細胞介素刺激對保護宿主抵抗病原性微生物(諸如結核分枝桿菌(
Mycobacterium tuberculosis
) (Bach等人1997))重要的經細胞介導之免疫反應，在腫瘤免疫性中起重要作用且放大I型IFN之抗病毒活性。因此，出於保護宿主免遭感染及腫瘤侵襲二者之目的，I型IFN及II型IFN一起作用以活化先天性免疫反應及後天性免疫反應二者(Biron等人2001)。 IFN為II類細胞介素之大家族的一部分，該家族包括六種IL-10-相關之細胞介素：IL-10、IL-19、IL-20、IL-22、IL-24及IL-26 (Kotenko 2002)且由於其經由共用其胞外域中之共同基元的受體傳導信號而歸類在一起。此等受體包含II類細胞介素受體家族(CRF2)且通常為由2種不同受體鏈(即α受體亞單元及β受體亞單元)組成之雜二聚體(Stahl等人1993)。一般而言，α亞單元為主要細胞介素結合蛋白，且β亞單元為形成高親和力結合位點及信號轉導所需。 III型IFN或IFN-λ最新加入CRF2家族。其表明IL-10-相關之細胞介素之結構特徵且誘發比I型IFN更受限之細胞群體(亦即，上皮細胞及某些免疫細胞)中之抗病毒活性(Kotenko等人，2003；Sheppard等人，2003)。在人類中，III型IFN家族由4種緊密相關之蛋白質IFN-λ1、IFN-λ2、IFN-λ3及IFN-λ4 (亦分別稱為IL-29、IL-28A、IL-28B及IFNL4)組成，而小鼠僅具有IFN-λ2及IFN-λ3 (亦分別稱為IL-28A及IL-28B)。其為高度同源的；IFN-λ2與IFN-λ3之間的胺基酸一致性為約96%，且IFN-λ1與IFN-λ2/IFN-λ3之間的一致性為約81%。IFN-λ4最相似於IFN-λ3，但此等蛋白質僅共用約30%一致性，且IFN-λ4主要在胞內且人體中極少分泌(Hong等人2016)。 IFN-λ受體複合物由特定IFN-λ受體鏈1 (IFN-λR1或IL-28RA)及經共用IL-10受體鏈2 (IL-10R2或IL-10Rβ)組成。藉由四種配位體中之任一者接合IFN-λ受體複合物導致JAK1及TYK2之活化，轉錄因子STAT1、STAT2及IRF9之活化，以形成經IFN刺激之基因因子3 (ISGF3)。ISGF3藉由與數百經IFN刺激之基因(ISG)之啟動子中的經IFN刺激之元件(ISRE)結合來調節基因轉錄，該經IFN刺激之基因包括與包括
OAS1
、
MX1
、
EIF2AK2
(經雙鏈RNA活化之蛋白激酶)及IRF7之抗病毒表現型相關聯的大量基因。比較性cDNA微陣列分析展示藉由III型IFN (IFN-λ)誘發之基因之譜系基本上與藉由I型IFN (IFN-α/β)誘發的譜系相同(Doyle等人2006)。總之，儘管使用不同受體，I型IFN及III型IFN二者均活化ISGF3 (Zhou等人2007)，且因此誘發類似轉錄反應。 即使藉由I型IFN或III型IFN誘發之基因表現之模式非常相似，然而藉由IFN-α誘發之基因表現之相對幅值通常大於IFN-λ。此可反映經由I型受體相較於III型受體傳導信號之相對強度中之差異或可簡單地反映此等配位體之對應受體之表現量的差異。 IFN-λ之晶體結構展現典型II類細胞介素之四螺旋束結構，其中IFN-λ之最接近結構同源物為IL-22 (Gad等人2009)，且可表明IFN-λ及IL-22具有平行功能，從而分別保護上皮組織免遭病毒感染及細菌感染。IFN-λR1受體鏈上之結合位點在所有四種IFN-λ中非常保守，而IL-10R2上之結合位點很難定義(Miknis等人2010)。IFN-λR1由兩個各自約100個胺基酸之不同纖維結合蛋白(fibronectin)III型域構成。配位體-受體介面包括IFN位點上之螺旋A、環AB及螺旋F，以及主要來自IFN-λR1之N端域及域間鉸鏈區的環。配位體與受體之間的結合模式支援經由氫鍵合介導之初始長程離子相互作用，接著進行疏水相互作用以完成擬合。 IFN-λ回應於病毒感染而由多種造血細胞及上皮細胞表現。檢測黏膜上皮表面上之入侵病毒的模式識別受體經由轉錄因子NF-κB、IRF3、IRF7及Med23引發轉錄反應(Osterlund等人2007，Griffiths等人2013)。I型IFN及III型IFN在調節黏膜介面處之抗病毒防禦中之作用經展示為冗餘及獨特的，視病毒及進入點而定。腸上皮細胞排他性地對III型IFN反應，其以非冗餘方式調節對親上皮細胞病毒(諸如輪狀病毒)之控制(Pott等人2011)。里奧病毒(Reoviruses)引發其在腸上皮細胞中之感染，但可穿透腸上皮層以造成小鼠之系統性感染；III型IFN限制在腸上皮細胞中之初始複製，但I型IFN對預防系統性感染而言為必不可少的(Mahlakoiv等人2015)。I型IFN及III型IFN之區室化在呼吸道中較不清楚，其中在兩個IFN系統之間存在一定程度之冗餘(Mordstein等人2008)。因此，氣管上皮細胞表現兩種IFN類型之受體，而腸上皮細胞僅表現IFN-λ受體。 IFN-λR1受體表現在某些情形中主要受上皮細胞及某些免疫細胞亞組(諸如單核球衍生之巨噬細胞、漿細胞樣樹突狀細胞及NK細胞)限制。IFN-λR1在NK細胞中之活化與IFN-γ之最大產量及抗腫瘤活性有關，該抗腫瘤活性可為與其他刺激協同介導或與其他細胞類型組合之效應(Souza-Fonseca-Guimaraes等人2015)。由於限制IFN-λR1對免疫細胞及上皮細胞限制之表現，III型IFN之免疫調節效應受限，但當局部黏膜反應足以控制病毒時極有效的抗病毒。此與在對感染反應期間I型IFN之廣泛活性相反，且因此在控制需要普遍免疫活化之嚴重或系統性感染中較為適當。 以下參考描述信號傳導中之差異及I型干擾素與III型干擾素之間的生物效應：Wack等人2015、Chow及Gale 2015、Hemann等人2017、Broggi等人2017、Blumer等人2017、Chiriac等人2017、Bhushal等人2017、Andreakos等人2017，以及Bhushal等人2017。 用在小鼠及黑猩猩之臨床前模型中及在活體外感染有C型肝炎病毒(HCV)之原代人類肝細胞(Thomas等人2012，Park等人2012)中及在人類臨床試驗(PhII BMS資料)中可用之資料確立IFN-λ對抗病毒療法之作用。可用IFN-λ靶向之病毒的範圍包括(但不限於)以下：A/B型流感、重症急性呼吸症候群(SARS)、冠狀病毒、H1N1、人類免疫缺陷病毒(HIV)、2型單純疱疹病毒(HSV2)、巨細胞病毒(CMV)、中東呼吸症候群(MERS)、諾如病毒(nororvirus)、輪狀病毒及伊波拉(Ebola) (Eslam及George 2015；Gresser 2015)。所有此等病毒靶向上皮細胞進入點且治療上可用IFN-λ靶向，該IFN-λ可活化此進入點處之IFN-λR1受體複合物。 大量臨床前研究已表明IFN-λ在諸如肝癌、黑素瘤、食道癌、神經內分泌腫瘤、結腸直腸癌、肺腺癌及伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)的腫瘤類型範圍內具有抗腫瘤活性(Sato等人2006，Zitzmann等人2006，Steen等人2010)。IFN-λ之抗腫瘤機制為腫瘤細胞誘發細胞凋亡且直接影響免疫細胞以增強先天性免疫刺激活性及後天性免疫刺激活性二者。IFN-λ在腫瘤微環境下經誘發，且經由IFN-λR1受體傳導信號經展示在IFN-λR1基因剔除小鼠中起著抗腫瘤作用，該基因剔除小鼠在經移植腫瘤模型中更易遭受肉瘤形成及死亡。IFN-λ治療延遲致死率且減輕肉瘤進展(Numasaki等人2007)。在癌症治療之情形下，可設想IFN-λ補充當前的IFN-α療法、免疫檢查點抑制劑或作為傳統抗癌劑(諸如硼替佐米(bortezomib)、替莫唑胺(temozolomide)、順鉑(cisplatin)或5-FU)之輔助(Guenterberg等人2010，Li等人2010)。 基因及官能性證據已表明IFN-λ在發炎性疾病(諸如哮喘、牛皮癬及類風濕性關節炎)中之保護作用。在哮喘之小鼠模型中，IFN-λ將疾病嚴重程度降至最低，減少嗜伊紅血球浸潤且表明遠離Th2細胞介素及Th17細胞介素之Th1免疫偏移效應(Koltsida等人2011)。在經小鼠膠原蛋白誘發之關節炎模型中，IFN-λ2治療藉由抑制IL-1及IL-17反應使得疾病消除，以及嗜中性白血球募集(Blazek等人2015)。在牛皮癬性病變中，Th17細胞經展示為IFN-λ來源，其中IFN-λ可抑制Th2細胞介素、IL-13 (Wolk等人2013)。IFN-λ在發炎及自身免疫疾病中之作用仍不明確。 三項有重大意義之針對HCV之全基因組關聯性研究(GWAS)已表明單核苷酸多形性(SNP)在INF-λ區域中為對經聚乙二醇化IFN-λ1/利巴韋林(ribavirin) (PEG-IFN/RBV)療法以及慢性HCV感染之自發性清除反應的最強單個預測因子。此等SNP映射至IFNL3/IFNL4基因座且經展示為對所有HCV基因型有效且在所有地理位置中(Ge等人2009，Suppiah等人2009，Tanaka等人2009)。IFNL3/IFNL4基因型在針對所有抗病毒療法(包括第一代直接作用之抗病毒藥物及第二代直接作用之抗病毒藥物二者)之預測治療結果中的作用亦擴展至其他病毒感染之廣泛清單(包括CMV、HSV及埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus；EBV))，且亦共感染有HCV/HIV及HCV/HBV(Rallon等人2010，Guo等人2013)。資料與IFN-λ在控制不同器官中之病毒感染中的主要作用相一致，尤其是上皮來源之彼等病毒感染。 存在兩種SNP (亦即rs12979860及rs8099917『反應者』基因型)在C型肝炎及B型肝炎病毒感染及非酒精性脂肪肝病中在肝纖維化中之作用及肝臟炎症及纖維化之加速的證據(Bochud等人2012，Eslam等人2015)。 IFNL3/IFNL4區域中之兩種功能變體經描述為與原始GWAS發現有關但可能存在許多其他仍未鑑別之貢獻因素。第一SNP為ΔG/TT (rs368234815)，其控制IFN-λ4之產生且亦預測HCV清除率(Prokunina-Olsson等人2013)。上代『ΔG』對偶基因編碼官能性IFN-λ4，其削弱HCV清除率且因此增加病毒負荷，而最新的(在演化術語中) rs368234815之『TT』對偶基因擾亂IFNL4之開讀框(擾亂蛋白質表現)且與經改進病毒清除率相關聯。此明顯異常可與主要胞內定位及IFNL4之不佳分泌有關且表明IFNL4可抑制分泌且因此抑制其他IFN-λ家族成員之功能。IFNL3之3'UTR區域中之第二SNP (rs4803217)影響IFNL3之信使RNA穩定性(McFarland等人2014)。儘管此等變體在預測肝纖維化(尤其在非HCV群)中之作用為未知的，但其與rs12979860呈連鎖不平衡，因此需要更多研究來展示是否存在任何相關性。 總而言之，迄今為止，IFN-λ經描述具有抗病毒及抗腫瘤活性、免疫炎症功能及體內恆定效應。在本發明中，吾人揭示IFN-λ乎意料地在活體外及活體內均具有直接作用之抗纖維化效應。實例表明λ干擾素蛋白質在活體內小鼠慢性腎病模型中及在具有來自肝臟、小腸、皮膚、腎臟及肺器官系統之相關原代細胞的活體外人類纖維化模型中具有抗纖維化效應。此等蛋白質因此具有作為多種類型之纖維化中之抗纖維化試劑的出人意料之潛能，且可用於設計對治療纖維化疾病有效之新療法。 術語λ干擾素(interferon-lambda/interferon-lambdas；IFN-λ/IFN-λs)在本文中可互換地使用以指代λ干擾素家族之細胞介素。λ干擾素蛋白質及λ干擾素受體亦由如表1中所展示之許多其他同義詞已知。
表 1
在一個實施例中，λ干擾素為IFN-λ1。 在一個實施例中，λ干擾素為IFN-λ2。 在一個實施例中，λ干擾素為IFN-λ3。 在一個實施例中，λ干擾素為IFN-λ4。 IFN-λ1、IFN-λ2、IFN-λ3及IFN-λ4之胺基酸及DNA序列展示於圖18中。 IFN-λ可用於形成融合蛋白，諸如Fc融合。Fc融合蛋白由與IFN-λ融合之抗體(例如，IgG)之Fc域組成。由於Fc域之相關性，Fc融合蛋白形成二聚體。如此IFN-λ可因此呈二聚體形式，以及單體形式。
功能性模擬物
在一個實施例中，λ干擾素為IFN-λ1之功能性模擬物。 在一個實施例中，λ干擾素為IFN-λ2之功能性模擬物。 在一個實施例中，λ干擾素為IFN-λ3之功能性模擬物。 在一個實施例中，λ干擾素為IFN-λ4之功能性模擬物。 術語「功能性模擬物」意謂具有與野生型蛋白質相同或類似之生物效應的分子。舉例而言，λ干擾素功能性模擬物可活化λ干擾素受體且驅動經IFN刺激之基因之轉錄。 在一個實施例中，功能性模擬物可降低如實例1中所描述之纖維化之活體內模型中的羥脯胺酸含量。在一個實施例中，功能性模擬物可抑制如實例2中所描述之纖維化之活體外模型中的纖維結合蛋白及/或膠原蛋白沈積。 在一個實施例中，λ干擾素功能性模擬物為IFN-λ1之片段。 在一個實施例中，λ干擾素功能性模擬物為IFN-λ2之片段。 在一個實施例中，λ干擾素功能性模擬物為IFN-λ3之片段。 在一個實施例中，λ干擾素功能性模擬物為IFN-λ4之片段。 在一個實施例中，λ干擾素功能性模擬物為IFN-λ1之變體。 在一個實施例中，λ干擾素功能性模擬物為IFN-λ2之變體。 在一個實施例中，λ干擾素功能性模擬物為IFN-λ3之變體。 在一個實施例中，λ干擾素功能性模擬物為IFN-λ4之變體。 變體λ干擾素可為或可包含圖18中所展示之特定序列中之一者的變體。舉例而言，變體可為圖18中之胺基酸序列中之任一者的取代、缺失或添加變體。IFN-λ之片段可例如具有大於50個胺基酸、大於100個胺基酸或大於150個胺基酸的大小。 相較於圖18中之特定胺基酸序列，變體λ干擾素可包含1、2、3、4、5、至多10、至多20或更多(通常至多50之最大值)個胺基酸取代、缺失及/或添加物。「缺失」變體可包含單個胺基酸缺失；較小胺基酸群缺失，諸如2、3、4或5個胺基酸；或較大胺基酸區域缺失，諸如特定胺基酸域或其他特徵之缺失。「取代」變體通常涉及用相同數目之胺基酸替換一或多個胺基酸且進行保守胺基酸取代。舉例而言，胺基酸可經具有類似特性之替代性胺基酸取代，例如另一種鹼性胺基酸、另一種酸性胺基酸、另一種中性胺基酸、另一種帶電荷胺基酸、另一種親水性胺基酸、另一種疏水性胺基酸、另一種極性胺基酸、另一種芳族胺基酸或另一種脂族胺基酸。表2中展示可用於選擇適合取代基的20種主胺基酸之一些特性。
表 2
變體λ干擾素可具有與圖18中之胺基酸序列具有大於約60%或大於約70%，例如75%或80%，通常大於約85%，例如大於約90%或95%胺基酸一致性的胺基酸序列。變體可保留與圖18中之序列之至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性。變體通常保留約60%至約99%一致性、約80%至約99%一致性、約90%至約99%一致性或約95%至約99%一致性。胺基酸一致性之此程度可見於相關SEQ ID NO序列之全長兩端或序列之一部分上，諸如約20、30、50、75、100、150、200或更多個胺基酸兩端。 如本文中所使用之術語「一致性」指示在比對序列中之任何特定位置處，胺基酸殘基在序列之間一致。如本文中所使用之術語「類似性」指示在比對序列中之任何特定位置處，胺基酸殘基在序列之間具有類似類型。舉例而言，可用白胺酸取代異白胺酸或纈胺酸。通常可彼此取代之其他胺基酸包括但不限於： · 苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸(具有芳族側鏈之胺基酸)； · 離胺酸、精胺酸及組胺酸(具有鹼性側鏈之胺基酸)； · 天冬胺酸及麩胺酸(具有醯胺側鏈之胺基酸)；以及 · 半胱胺酸及甲硫胺酸(具有含硫側鏈之胺基酸)。 在一個實施例中，λ干擾素功能性模擬物為IFN-λ1之衍生物。 在一個實施例中，λ干擾素功能性模擬物為IFN-λ2之衍生物。 在一個實施例中，λ干擾素功能性模擬物為IFN-λ3之衍生物。 在一個實施例中，λ干擾素功能性模擬物為IFN-λ4之衍生物。 在一個實施例中，λ干擾素可為或可包含圖18中所展示之特定序列中之一者的衍生物。在一個實例中，衍生物可包括天然存在之胺基酸之結構類似物。或者，胺基酸可經修飾，例如經標記。 在一個實施例中，本發明之λ干擾素經聚乙二醇化，即λ干擾素共價連接至聚(乙二醇) (PEG)。用於產生經聚乙二醇化蛋白質之方法為此項技術中所熟知的，參見例如Chapman A等人, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 54: 531-545。 在一個實施例中，經聚乙二醇化λ干擾素為聚乙二醇化干擾素λ-1a「λ」。(Andersen等人，2013)。「λ」為最初在ZymoGenetics (現為Bristol-Myers Squibb之全資子公司)處研發之研究性III型干擾素治療劑。2016年將其授權給Eiger生物醫藥且目前在臨床進展中用於治療慢性肝炎δ病毒(HDV)感染。 在一個實施例中，λ干擾素功能性模擬物為抗體。 本發明之抗體分子可包含具有全長重鏈及輕鏈之完整抗體分子或其片段或抗原結合部分。術語抗體之「抗原結合部分」係指保留選擇性與抗原結合之能力的抗體之一或多個片段。經展示，抗體之抗原結合功能可由全長抗體之片段執行。抗體及其片段及抗原結合部分可為但不限於Fab、經修飾Fab、Fab'、經修飾Fab'、F(ab')
2
、Fv、單域抗體(例如，VH或VL或VHH)、scFv、二價抗體、三價抗體或四價抗體、雙scFv、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體以及以上中之任一者的抗原決定基-結合片段(參見例如Holliger及Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9):1126-1136；Adair及Lawson, 2005, Drug Design Reviews-Online 2(3)
,
209-217)。用於產生及製造此等抗體片段之方法為此項技術中所熟知(參見例如Verma等人, 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181)。用於本發明之其他抗體片段包括描述於國際專利申請案WO 2005/003169、WO 2005/003170及WO 2005/003171中之Fab及Fab'片段以及描述於國際專利申請案WO2009/040562中之Fab-dAb片段。多價抗體可包含多種特異性或可為單特異性(參見例如WO 92/22853及WO 05/113605)。此等抗體片段可使用熟習此項技術者已知之習知技術獲得，且該等片段可經篩選而以與完整抗體相同之方式進行應用。 本發明之抗體為λ干擾素功能性模擬物且引發與野生型蛋白質相同或類似之生物效應。舉例而言，抗體可與λ干擾素受體上之抗原決定基結合，從而活化受體信號傳導且驅動經IFN刺激之基因之轉錄。 在一個實施例中，λ干擾素衍生物為小分子化學實體(諸如分子量小於900道爾頓之化學實體)。 篩選化學文庫以標識可為潛在藥物候選物之小分子化學個體的方法為此項技術中所已知的。舉例而言，可在配位體-受體結合分析中或在器官纖維化之細胞培養模型中測試化學文庫，如實例2中所描述。
纖維化疾病
可使用本發明之λ干擾素治療的纖維化疾病之實例包括(但不限於)：肺纖維化，諸如特發性肺纖維化、矽肺病、過敏性肺炎、非特異性間質性肺炎、類風濕性肺、慢性阻塞性肺病及囊腫性纖維化；腎纖維化(包括管萎縮及間質纖維化)，諸如糖尿病性腎病、高血壓性腎硬化、局灶節段性腎小球硬化、IgA腎病、腎小球膜增生性絲球體腎炎、多囊性腎病、慢性同種移植腎病及肺出血腎炎病(Goodpastures disease)；肝纖維化及肝硬化，包括原發性硬化性膽管炎、原發性膽汁性肝硬化及非酒精性脂肪變性肝炎；以及心內膜纖維化、縱隔纖維化、骨髓纖維化、腹膜後纖維化、包裹性腹膜纖維化(encapsulating peritoneal fibrosis)、進展性大塊纖維化(progressive massive fibrosis)、腎源性系統性纖維化、克羅恩氏病(Crohn's disease)、瘢痕瘤、心肌梗塞、硬皮病、全身性硬化症及關節纖維化。 在一個實施例中，纖維化為腎臟纖維化(在此情況下IFN-λ可為IFN-λ1、IFN-λ2、IFN-λ3或IFN-λ4)。 在一個實施例中，纖維化為肺纖維化(在此情況下IFN-λ可為IFN-λ1、IFN-λ2、IFN-λ3或IFN-λ4)。 在一個實施例中，纖維化為小腸纖維化(在此情況下IFN-λ可為IFN-λ1、IFN-λ2、IFN-λ3或IFN-λ4)。 在一個實施例中，纖維化為皮膚纖維化(在此情況下IFN-λ可為IFN-λ1、IFN-λ2、IFN-λ3或IFN-λ4)。 在一個實施例中，纖維化為肝纖維化(在此情況下IFN-λ可為IFN-λ1、IFN-λ2、IFN-λ3或IFN-λ4)。 在一個實施例中，纖維化為腹膜纖維化(在此情況下IFN-λ可為IFN-λ1、IFN-λ2、IFN-λ3或IFN-λ4)。 在一個實施例中，纖維化為胰纖維化(在此情況下IFN-λ可為IFN-λ1、IFN-λ2、IFN-λ3或IFN-λ4)。 在一個實施例中，纖維化為動脈粥樣硬化(在此情況下IFN-λ可為IFN-λ1、IFN-λ2、IFN-λ3或IFN-λ4)。 在一個實施例中，纖維化選自由以下組成之群：腎臟纖維化、肺纖維化、小腸纖維化、皮膚纖維化、肝纖維化、腹膜纖維化、胰纖維化及動脈粥樣硬化。 在一個實施例中，纖維化選自由以下組成之群：腎臟纖維化、肺纖維化、小腸纖維化、皮膚纖維化、腹膜纖維化、胰纖維化及動脈粥樣硬化。 在一個實施例中，纖維化並不與微生物感染(例如，病毒感染)相關聯。因此，本發明中所治療之個體可為未患有感染(諸如病毒感染)之個體。舉例而言，該個體可為不具有已知可經IFN-λ治療之病毒感染的個體。該個體可為未經以下肝炎病毒感染之個體：諸如A型肝炎、B型肝炎或C型肝炎；流感病毒；重症急性呼吸症候群(SARS)病毒；冠狀病毒；人類免疫缺陷病毒(HIV)；2型單純疱疹病毒(HSV2)；巨細胞病毒(CMV)；中東呼吸症候群(MERS)病毒；諾如病毒；輪狀病毒；或伊波拉病毒。
醫藥組合物、劑量及劑量方案
本發明之λ干擾素或其功能活性片段或衍生物可提供於醫藥組合物中。醫藥組合物通常為無菌，且可另外包含醫藥學上可接受之佐劑及/或載劑。 如本文中所使用，「醫藥學上可接受之載劑」包括生理學上相容之任何及全部溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑以及其類似者。載劑可適用於非經腸，例如靜脈內、肌內、皮內、眼內、腹膜內、皮下、脊椎或其他非經腸投與途徑，例如藉由注射或輸注。或者，載劑可適用於非-非經腸投與，諸如局部、表皮或黏膜投與途徑。載劑可適用於經口投與。視投與途徑而定，λ干擾素或其功能活性片段或衍生物可包覆在材料中，以保護其免受酸及可使其失活之其他自然條件的作用。 本發明之醫藥組合物可包括一或多種醫藥學上可接受之鹽。「醫藥學上可接受之鹽」係指保留親本化合物之所需生物活性且不賦予任何不期望之毒性作用之鹽。此等鹽之實例包括酸加成鹽及鹼加成鹽。 醫藥學上可接受之載劑包含水性載劑或稀釋劑。可在本發明之醫藥組合物中採用之適合水性載劑之實例包括水、緩衝水及鹽水。其他載劑之實例包括乙醇、多元醇(諸如甘油、丙二醇、聚乙二醇及其類似者)及其適合之混合物、植物油(諸如橄欖油)以及可注射之有機酯(諸如油酸乙酯)。在許多情況下，組合物中將需要包括等張劑，例如糖、多元醇(諸如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化鈉。 治療性組合物在製造及儲存條件下通常必須為無菌且穩定的。組合物可調配為溶液、微乳液、脂質體或適合於高藥物濃度之其他有序結構。 本發明之醫藥組合物可包含額外活性成分。 亦在本發明之範疇內的為包含本發明之λ干擾素及使用說明書之套組。該套組可進一步含有一或多種額外試劑，諸如如上文所論述之額外治療劑或預防劑。 本發明之λ干擾素或其調配物或組合物可經投與用於纖維化疾病之預防性及/或治療性治療。 在一個實施例中，纖維化疾病之治療為治療性治療。在治療性應用中，化合物以足以治癒、減輕或部分遏止病況或其症狀中之一或多者的量投與至患有如上文所描述之病症或病況的個體。此治療性治療可使得疾病症狀之嚴重程度降低，或無症狀週期之頻率或持續時間增加。將足以實現此之量定義為「治療有效量」。 在一個實施例中，纖維化疾病之治療為預防性治療。在預防性應用中，調配物以足以預防或降低病況或其症狀中之一或多者之後續效應的量投與至處於如上文所描述之病症或病況風險下的個體。將足以實現此之量定義為「預防有效量」。 用於各目的之有效量將取決於疾病或損傷之嚴重程度以及個體之體重及一般狀態。 投與之個體可為人類或非人類動物。術語「非人類動物」包括所有脊椎動物，例如哺乳動物及非哺乳動物，諸如非人類靈長類動物、羊、狗、貓、馬、牛、雞、兩棲動物、爬蟲等。通常向人類投與。 本發明之抗體/調節劑或醫藥組合物可使用此項技術中已知之多種方法中之一或多者而經由一或多種投與途徑來投與。如熟習此項技術者將瞭解，投與之途徑及/或模式將視所需結果而變化。本發明之醫藥組合物之投與途徑的實例包括靜脈內、肌內、皮內、眼內、腹膜內、皮下、脊椎或其他非經腸投與途徑，例如藉由注射或輸注。如本文中所使用之片語「非經腸投與」意謂除腸內及局部投與之外的投與模式，通常藉由注射進行。或者，本發明之醫藥組合物可經由非經腸途徑(諸如局部、表皮或黏膜投與途徑)來投予。本發明之醫藥組合物可用於經口投與。 本發明之醫藥組合物之適合劑量可藉由熟習之醫療從業者來測定。本發明之醫藥組合物中之活性成分之實際劑量程度可變化，以便獲得在對患者無毒性之情況下有效地達成特定患者、組合物及投與模式之所需治療反應之活性成分的量。所選劑量程度將視多種藥代動力學因素而定，該等因素包括所採用之本發明之特定組合物的活性；投與途徑；投與時間；經採用之特定化合物之排泄速率；治療持續時間；與所採用之特定組合物組合使用的其他藥物、化合物及/或材料；經治療患者之年齡、性別、體重、病況、一般健康狀況及先前病史；以及醫學技術中熟知之類似因素。 適合之劑量可例如在待治療患者之每公斤體重約0.01 µg至約1000 mg、通常每公斤體重約0.1 µg至約100 mg範圍內。舉例而言，適合之劑量可為每天每公斤體重約1 µg至約10 mg或每天每公斤體重約10 μg至約5 mg。 可調節劑量方案以提供最優所需反應(例如，治療反應)。舉例而言，可投與單次劑量，可隨時間投與若干分次劑量，或可依治療情況之緊急性所指示按比例減少或增加劑量。如本文中所使用之單位劑型係指適合作為單位劑量用於待治療之個體的實體上離散單位；各單位含有與所需醫藥載劑相關聯之經計算以產生所需治療性效應的預定量活性化合物。 投與可呈單次劑量或多個劑量。多個劑量可經由相同或不同途徑投與且及投與至相同或不同位置。或者，劑量可經由持續釋放調配物，在此情況下需要較不頻繁之投與。劑量及頻率可視患者中之拮抗劑之半衰期及所需治療持續時間而變化。 如上文所提及，本發明之調節劑/抗體或醫藥組合物可與一或多種其他治療劑一起共投與。 兩種或更多種試劑之組合投與可以多種不同方式達成。其均可以單一組合物之形式一起投與，或其可以單獨組合物形式作為組合療法之部分來投與。舉例而言，一者可在另一者之前、之後或與另一者同時投與。 在一個實施例中，本發明之λ干擾素與另一種治療活性化合物組合投與。在一個實施例中，另一種治療活性化合物為另一種抗纖維化治療劑。 或者，λ干擾素可
不
與另一種治療活性化合物組合投與。舉例而言，經λ干擾素治療之患者可為
未
經抗病毒劑治療之患者，該抗病毒劑諸如另一種干擾素(例如，I型干擾素或II型干擾素，諸如γ干擾素)。
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λ干擾素(IFN-λ)家族(稱為IFN-λ1 (IL-29)、IFN-λ2 (IL-28A)及IFN-λ3 (IL-28B))之細胞介素經由不同受體複合物傳導信號，該受體複合物由IFN-λR1 (IL-28R1)及介白素-10R2 (IL-10R2)受體鏈組成。 在慢性腎病(CKD)之小鼠阿德力黴素誘發模型中，使用水壓轉染活體內篩選，IFN-λ2及IFN-λ3經報告為成功結果。依據腎羥脯胺酸含量(腎膠原蛋白) 減少40%所測定之腎臟纖維化程度稱為成功結果。IFN-λ2及IFN-λ3二者亦藉由血清肌酐所量測而顯示相應地保留腎功能。此結果使接受含有阿德力黴素之鹽水轉染小鼠在第49天後之有條件存活率(亦即未達到晚期腎衰竭)為50%，而經IFN-λ2轉染者則增加至85%，及經IFN-λ3轉染者則為100%。為了在使用不同刺激之CKD之替代性模型中驗證此抗纖維化效應，藉由水壓轉染法，將IFN-λ1及IFN-λ3二者應用於慢性腎病之單側輸尿管阻塞(UUO)誘發之腎臟纖維化模型中，其中兩者均給予保護以免遭小管間質性纖維化。 已在幾種人類原代細胞活體外纖維化模型中證實IL-28R1配位體之抗纖維化效應，其顯現成熟累積之胞外基質(ECM)蛋白質。重組人類IFN-λ1、IFN-λ2及IFN-λ3在肝臟、肺、腸、皮膚及腎臟纖維化之原代人類細胞活體外模型中分別抑制纖維化相關之ECM蛋白質(纖維結合蛋白以及膠原蛋白I、III及IV)之累積。此點可見於若干模型中，該等模型包括肝臟星狀細胞、肝臟星狀-肝細胞共培養物(均經基底基質及TGFβ誘發)、肝臟星狀-上皮細胞共培養物、經TGFβ誘發之小腸纖維母細胞、經IL-1α-誘發之真皮纖維母細胞、角質細胞真皮纖維母細胞共培養物、腎近端小管上皮細胞-腎臟纖維母細胞共培養物及單一培養物、及肺小氣管上皮細胞-IPF肺纖維母細胞共培養物。在腎小球硬化之更複雜腎小球類器官模型中，應用來自患有復發性腎病症候群之患者的血漿，造成足細胞數量之損失及內縮過程與足突(pedicel)均與導致腎小球硬化及腎纖維化之許多腎小球疾病中所見之足細胞消失及損失之方式一致。將重組IFN-λ2應用於此模型中時，則完全防止由此患者血漿造成之足細胞之改變。 IL-28R1配位體經展示在活體外纖維化篩選及活體內纖維化篩選二者中具有強效抗纖維化效應。強效效應已描述於腎纖維化之活體內小鼠模型中以及具有來自肝臟、小腸、皮膚、腎臟及肺器官系統之相關原代細胞的大量活體外人類纖維化模型中。此等蛋白質因而具有作為多種類型之纖維化中之抗纖維化試劑的出人意料之潛能。方法 小鼠活體內 IL-28A 及 IL-28B 在慢性腎病 (CKD) 之阿德力黴素誘發腎臟纖維化模型中之效應
至少6週齡且體重大於24 g之雌性Balb/c小鼠在合適之水壓轉染表現載體中經由cDNA (或用於成對研究之cDNA對)之尾靜脈經受IV注射。7天之後，以11 mg/kg IP給予小鼠阿德力黴素(小紅莓(doxorubicin))且監測49天。每天監測小鼠之體重及健康狀況；終止已損失大於40%之起始體重或展示晚期腎衰竭之體徵的彼等小鼠並收集資料。在49天研究時期結束時，終止所有小鼠且收集腎及血清以用於分析。使用QuickZyme分析方法(QuickZyme Biosciences)來量測腎臟羥脯胺酸且使用三酶法來量測血清肌酐並讀出為μg/ml血清肌酐。將在曲線上標記為「鹽水」之鹽水加阿德力黴素群中之腎臟纖維化(羥脯胺酸)視為最大疾病反應。此設定在100%且用於在整個治療組中標準化。未經治療之動物不接收阿德力黴素且各篩選實驗含有接收阿德力黴素及HGF之cDNA的「HGF」群。HGF用作抗纖維化陽性對照，其中＞40%之羥脯胺酸減少用於品質控制。IL-28 及 IL-29 在小鼠單側輸尿管阻塞誘發之腎臟纖維化模型中之效應 用於 水壓轉染小鼠 IL2 8B 及人類 IL29 之 DNA 建構
藉由使用NheI-XhoI限制性消化將編碼人類IL29前驅蛋白(NP_742152.1)之DNA序列(NM_172140.1)插入至pLive載體(Mir5420, Mirus Bio LLC, 545 Science Dr., Madison, WI 53711 USA)中，隨後同源末端之DNA連接來產生用於水壓轉染之DNA構築體。使用載體及插入物二者之BamHI-XhoI限制性消化策略，隨後連接將編碼小鼠IFNL3 (NP_796370)之基因(mRNA Ref Seq NM_177396)構築體選殖至pLive (Mirus)中。藉由DNA定序來驗證至pLive中之基因插入物。該基因之前為直接在編碼信號序列之起始甲硫胺酸之ATG上游之CCACC序列。此載體具有卡那黴素(resistance)抗性基因及允許大腸桿菌中之DNA擴增的pUC來源。此外，此載體具有小鼠最小白蛋白啟動子以轉錄由任一側上之內含子側接之人類IFNL-1基因。[pLive載體允許肝臟中之長期蛋白質表現。] 使用限制溶液中之內毒素之量的質體分離套組(HiSpeed Plasmid Giga EF，Qiagen)將用於水壓轉染之DNA構築體自具有此構築體之大腸桿菌培養物分離。對質體DNA進行Sanger定序以驗證插入。 Kanefuji等人及Liu等人描述水壓轉染之典型載體。藉由水壓轉染( HDT) 表現蛋白質
在TransIT-EE媒劑中用50 µg之pLIVE-人類IL-29、pLIVE-小鼠IL-28B或pLIVE SEAP載體(Mirus Bio，目錄號MIR 5320)水壓轉染小鼠。含有載體之溶液經靜脈內快速(小於2.5秒)注射2 ml體積。在水壓注射之前誘發用異氟醚全身麻醉且在注射後維持至少1分鐘。定量來自小鼠血清之小鼠 IL-28B 及 人類 IL-29
使用中尺度發現(meso scale discovery；MSD)定量分析使用市售抗體對(RnD系統，目錄號DY1598B)來定量小鼠IL-28B，且小鼠血清經1/100稀釋以置放於線性標準曲線上。使用MSD U-plex人類IL-29抗體組(目錄號B21WD)來定量人類IL-29，且小鼠血清經1/100稀釋以置放於線性範圍中。單側輸尿管阻塞 (UUO) 誘發之慢性腎病之腎臟纖維化模型
重至少19 g之雄性C57BL/6小鼠(Charles River)經受單側輸尿管阻塞(UUO)誘發之慢性腎病之腎臟纖維化模型。 使用異氟醚誘發之全身麻醉且在適於外科手術技術之無菌條件下進行手術。小鼠經受開腹術，隨後使用3.0 Mersilk結紮線紮緊左輸尿管。肌肉壁使用5-0 Vicryl以持續模式密封，其中使用5-0 Vicryl藉由表皮下縫合來閉合皮膚。恰當鎮痛係在手術之前及手術之後投與。 在如結果中所詳述之恰當時間處獲取血液樣本。使用公認的小鼠限制器限制小鼠，且經由尾刺法自尾靜脈獲取30 µl血液，從而使用吸液管準確量測血液樣本。此樣本經置放於0.2 ml PCR管(Thermo)中且短暫離心(20,000 g，5分鐘)以脫離儘可能多的血清，將血清置放於新的PCR管中且在-80℃下儲存。 在第19天或第21天，使用異氟醚麻醉小鼠，藉由心臟穿刺將血液移除至血清管(Sarstedt)中，且藉由頸椎脫位術殺死小鼠。移除左腎，且二分之一快速冷凍於液氮中並在-80℃下儲存。剩餘一半經置放於10%中性緩衝福馬林中，在組織處理器中脫水且嵌入石蠟以用於組織學分析。石蠟塊在薄樣切片機上以4 µm切片且將其安放於載玻片上。載玻片接著經脫蠟及水合，在用酸化水洗滌之前用天狼星紅(PSR)染色。切片經脫水，清潔且蓋上蓋玻片。使切片乾燥且接著使用濱松切片掃描器掃描。 將全部切片圖像導入至Definiens Developer XD 64中且使用亮視野模組進行分析。簡言之，人工地標註皮質區以根據分析移除髓質。針對不少於四個圖像之訓練資料集上之單獨標記物來測定標記物臨限水準(例如，PSR染色)。分析算法接著運行於專用伺服器上以測定各個別標記物之高於臨限強度的標記物面積，且將高於臨限強度之各標記物之面積判定為皮質區之一部分。人類活體外胞外基質纖維化分析量測 a) 細胞培養物
所有胞外基質(ECM)累積分析係在384孔黑色透明底部板(Greiner目錄號781090)中進行，其中介質、細胞數量/孔、培育時間及刺激隨所使用之原代細胞類型而變化。 人類肝臟星狀細胞(HHSteC) (ScienCell，目錄號sc-5300) (第4代)及人類肝內膽上皮細胞(ScienCell，目錄號sc-5100) (第3代)共培養物以1000個細胞/孔(1:1比率)接種於25 uL具有補充劑(ScienCell，目錄號sc-sc-4101-prf)之無酚紅上皮細胞介質(EpiCM-prf)中。單一培養物中之人類星狀細胞(ScienCell)以1000個細胞/孔接種於星狀細胞介質(ScienCell)中，且人類星狀細胞及肝細胞(ScienCell)以1000個細胞/孔(1:1比率)下共培養於混合培養介質(ScienCell)中。 人類小腸纖維母細胞(ScienCell)以2000個細胞/孔接種於腎上皮細胞基底介質+0.5% FCS及補充劑(ATCC)中。 人類真皮皮膚纖維母細胞生長於纖維母細胞生長介質中且人類角質細胞生長於角質細胞介質中且以1500個細胞/孔接種。纖維母細胞-角質細胞共培養物(9:1比率)生長於1:1介質混合物中且以1500個細胞/孔接種。 人類腎近端小管上皮細胞(RPTEC，Innoprot)及人類腎纖維母細胞(HRF，InnoProt)以2000個細胞/孔(比率1:1)接種於使用腎上皮細胞基底介質(ATCC) + 0.5% FCS及補充劑(ATCC)之共培養物中。 人類小氣管上皮細胞(ATCC)生長於基底生長介質加支氣管上皮細胞生長套組補充劑(ATCC)中且IPF134肺纖維母細胞(ATCC)生長於纖維母細胞生長介質(Lonza)中。以2000個細胞/孔(1:1比率)接種共培養物。b) 細胞生長之量測
在37℃、5% CO2
下培育7天後，遵循製造商之說明書使用PrestoBlue®細胞存活率反應劑(Thermo Fischer Scientific)評估細胞生長。c) ECM 累積之量測 個別 ECM 組分之量測 ： 免疫螢光法
在37℃下於5% CO2
中培養7天後，在PBS中洗滌細胞且在37℃下用20 µl/孔之0.25 M NH4
OH/25 mM Tris (Sigma-Aldrich)溶解15 min。接著在PBS中洗滌基質3次，在-20℃下固定於40 μl 100%甲醇中30 min且在使用抗纖維結合蛋白(eBiosciences)、抗膠原蛋白I (Millipore)、抗膠原蛋白III (Millipore)、抗膠原蛋白IV (eBiosciences)及抗膠原蛋白V (Abcam)抗體進行染色之前在PBS中洗滌3次。使用「Cellomics CellHealth」概況分析生物應用(profiling bioapplication)下之3通道協定及10×物鏡(新X1攝相機)用2×2格化儲存(1.104
×1.104
像素/視野)在Arrayscan HC讀取器(Cellomics)上掃描板。總 ECM 組分之量測 ： Flamingo™ 染色
在遵循製造商之說明書使用Flamingo™螢光凝膠染色試劑(BioRad)進行染色之前，在Flowfusor水中洗滌免疫螢光培養板3次。使用「Cellomics CellHealth」概況分析生物應用下之2通道協定在及10×物鏡(新X1相機)用2×2格化儲存(1.104
×1.104
像素/視野)在Arrayscan HC讀取器(Cellomics)上掃描培養板。產生 3D 人類腎小球球狀體之方法 球狀體產生及治療
將Nano-shuttle-PL (目錄號657841)添加至T75燒瓶，該燒瓶具有分別由布里斯托大學(University of Bristol)提供、生長於RPMI 1640 (10% FCS，5ML L-麩醯胺酸及1XITS，Gibco)及EBM-2介質中、具有來自Lonza之補充套組(目錄號CC4147)的經穩定轉染之GFP標記肌動蛋白、條件性永生化之經SV40感染之足細胞及人類腎小球內皮細胞(HRGEC)。經GFP轉染之足細胞藉由FACS來確認。使用TrypLE Express (Gibco)搜集所有細胞且以5000個細胞/孔將磁化HRGEC接種於96孔較低黏著性Greiner板(目錄號655976)中。將Greiner球狀體驅動(目錄號655830)置放於96孔板下6 h且球狀體在37℃/5% CO2
/100%濕度下生長於EBM-2介質中。移除驅動，且以5000個細胞/孔接種磁化GFP足細胞。隔夜下返回驅動且分化球狀體10天從而使用保持驅動每3天饋料。接著用呈15%最終濃度、加或減IL-28A (10,000 ng/mL)或僅介質之人類FSGS血漿處理球狀體7天。固定及染色
在4℃下於10%福馬林/1% Triton X-100/PBS中固定且滲透球狀體3小時。在3×10 min PBS洗滌後，球狀體在4℃下於PBS中遞升系列之甲醇：25%、50%、75%、95%中脫水30 min，且留於100%甲醇中隔夜。使球狀體在相同遞減系列中復水且在4℃下在含有3% BSA之PBST (含有0.1% Triton X-100之PBS)中結塊隔夜之前如前所述在PBS中洗滌。在4 × 30 min PBST洗滌後，添加二級抗體(1:500/PBST：Alexa GAR-AF647及GAM-AF555)。為增強GFP信號，以1:200添加抗GFP-AF488持續24 h。在×20放大率下使用YokoGawa共焦定量1 (CQ1)捕獲圖像之前，洗滌球狀體(4 × 30 min/PBST)。足細胞細胞 - 標記物面積定量
將最大強度投影導入Definiens Developer XD 64中且使用免疫螢光模組進行分析。人工地標註球狀體面積，且測定個別標記物之標記物臨限水準，且運行分析演算法以測定各標記物之高於臨限強度之標記物面積。將高於臨限強度之各標記物之面積判定為球狀體面積之一部分。結果 (1) 慢性腎病 (CKD) 之小鼠阿德力黴素誘發模型 小鼠 IL-28A (IFNL2)
在小鼠阿德力黴素CKD模型中之纖維化改性蛋白質之篩選中最初識別為水壓轉染之cDNA對之一個成員(n=15隻小鼠)。相對於鹽水轉染對照組(p=0.02) (圖1(a)及圖1(b))及基於血清肌酐含量之標準化腎功能(p＜0.05) (圖1(c))，轉染對如藉由總的腎羥脯胺酸所量測減少了51%腎臟纖維化。在重複研究中確認IL-28A之抗纖維化效應，從而在相同模型中獨立地轉染IL-28A cDNA (n=每組22隻小鼠)。相對於鹽水對照組(p=0.0004) (圖2(a)及圖2(b))，IL-28A如藉由總的腎羥脯胺酸所量測減少了48%腎臟纖維化，而腎功能喪失返回至正常範圍，如藉由血清肌酐所量測。(相較於未經治療之阿德力黴素鹽水對照組(p＜0.0001)中之4.8 μg/ml，在IL-28A組中平均血清肌酐 = 1 μg/ml；平均未經治療組血清肌酐 =0.8 μg/ml) (圖2(c))。如藉由晚期腎衰竭症狀所量測之條件性存活率自鹽水治療之阿德力黴素組中之50%增加至用小鼠IL-28A轉染之彼等組中之85% (圖2(d))。第49天，來自存活小鼠((未經治療(n=8)、未經治療之阿德力黴素動物(n=20)及IL-28A水壓轉染之動物(n=19))之所有腎臟經固定，嵌入石蠟，經切片且用梅森氏三色染色法(masson's trichrome；MT)或天狼星紅(PSR)染色且在濱松切片掃描器上進行成像。一個未經治療之動物、三個未經治療之阿德力黴素動物及三個經IL-28B治療之阿德力黴素動物之經PSR染色之腎臟的例示性及代表性圖像展示於圖5(f)中。在主要在腎小球基底膜中且亦在腎小球膜基質中增強PSR染色之情況下，阿德力黴素治療已使得約50%腎小球呈現出明顯的腎小球硬化。在腎小管間質中，在大於70%皮質中存在一致小管基底膜擴張，其中大量小管呈現扁平上皮，從而造成小管架構顯著喪失，其中小管之極大擴張導致無刷狀緣之較大內腔。此等區域具有輕度至中度細胞浸潤。 IL-28A之應用幾乎完全預防了腎小球硬化之病徵，其中幾乎無小腎小球基底膜增厚之跡象。22隻動物中僅2隻展示出未經治療動物之顯著上皮平坦化病徵及內腔擴張特徵。其餘動物具有在大於80%皮質附近呈現接近正常之腎小管間質，其中幾乎無小管基底膜之效應。 用PSR染色之48個小鼠腎臟樣本使用Definiens軟體經受較高含量圖像分析，且將在三個組中量測之PSR染色之面積繪製為PSR染色面積百分比(圖5(g))。相同48個小鼠腎臟切片藉由具備腎病理學專門知識的兩個人經受纖維化程度之盲法病理評估。腎科學專家使用介於0至10點量表(0展示無纖維化，且10展示最高纖維化)範圍內之評分對經PSR染色之切片進行評分。相比於未經治療組(圖5(h))，IL-28A治療展示病理學分數之顯著47%降低(p＜0.0001)。第二個腎科學專家使用1至10量表(1展示無纖維化且10展示最高纖維化)對48個經MT染色之切片進行人工地評分。此外相對於未經治療組(圖5(i))，IL-28A治療組表明纖維化重塑程度之明顯改進(p＜0.0001)。小鼠 IL-28B (IFNL3)
在小鼠阿德力黴素CKD模型中之纖維化改性蛋白質之篩選中最初亦識別為水壓轉染之cDNA對之一個成員(n=每組15隻小鼠)。相對於鹽水轉染對照組(p=0.00086) (圖3(a)及圖3(b))及基於血清肌酐含量之標準化腎功能(不顯著) (圖3(c))，轉染對如藉由總的腎羥脯胺酸所量測減少了59%腎臟纖維化。在重複研究中確認IL-28B之抗纖維化效應，從而在相同模型中獨立地轉染IL-28B cDNA (n=每組22隻小鼠)。相對於鹽水對照組，如藉由總的腎羥脯胺酸所量測之腎臟纖維化減小了65% (p=0.0000018) (圖4(a)及圖(b))，而相比於未經處理之鹽水對照組中之顯著增加，腎功能返回至正常(相較於未經處理之阿德力黴素鹽水對照組中之平均值3.2 μg/ml (p＜0.05)，在IL-28B組中平均血清肌酐 = 1.2 μg/ml；平均未經處理組血清肌酐 = 0.8 μg/ml) (圖4(c))。條件性存活率自未經處理之阿德力黴素動物中之＜50%增加至接收IL-28 B之彼等組中之100% (圖4(d))。第49天，來自存活小鼠((未經處理(n=10)、未經處理之阿德力黴素動物(n=18)及IL-28B水壓轉染之動物(n=22))之所有腎臟經固定，嵌入石蠟，經切片且用蘇木素及伊紅(H&E)或天狼星紅(PSR)染色且在濱松切片掃描器上進行成像。一個未經治療之動物、三個未經治療之阿德力黴素動物及三個經IL-28B治療之阿德力黴素動物之經PSR染色之腎臟的例示性及代表性圖像展示於圖5(a)中。未經治療之小鼠腎臟具有廣泛的腎小球硬化及小管間質性纖維化，伴隨顯著的管基底膜擴張、小管上皮之平坦化、帶有刷狀緣喪失及管萎縮之廣泛管擴張。相比之下，經IL28B治療之小鼠大部分受保護免遭兩種類型之纖維化重塑。用PSR染色之50個小鼠腎臟樣本使用Definiens軟體進行較高含量圖像分析，且將在三個組中量測之PSR染色面積繪製為PSR染色面積百分比(圖5(b))。相對於未經治療之腎臟中之3倍增加，IL-28B治療組經PSR染色之面積經標準化(p＜0.0001)。相同50個小鼠腎臟切片藉由具備腎病理學專門知識之三個人經受纖維化程度之盲法病理評估。臨床病理學家使用介於0至4點量表(0展示無纖維化，且4展示最高纖維化)範圍內之評分對經H&E染色之切片進行評分。相比於未經治療組(圖5(c))，IL-28B治療展示病理學分數之顯著45%降低(p＜0.01)。兩個腎科學專家使用1至10量表(1展示無纖維化且10展示最高纖維化)對50個PSR染色切片進行人工地評分。相對於未經治療組(圖5(d)及圖5(e))，IL-28B治療組同樣表明纖維化重塑程度之明顯改進(p＜0.0001)。(2) 器官纖維化之原代人類細胞活體外模型 (2.1) 肝纖維化
生長於塑膠上之人類原代星狀細胞為自活化的且累積如藉由ECM蛋白質纖維結合蛋白、膠原蛋白IV以及膠原蛋白I及III之含量所量測的大量基礎含量之胞外基質。此ECM累積可藉由用重組IL-28A以劑量依賴性方式處理培養物來抑制(圖6(a))。人類原代星狀細胞與原代人類肝細胞(1:1比率)之共培養產生基底胞外基質，該基底胞外基質亦可藉由用重組人類IL-28A以劑量依賴性方式處理來抑制，其中纖維結合蛋白、膠原蛋白IV以及膠原蛋白I及III減少(圖6(b))。 星狀細胞單一培養物及星狀-肝細胞共培養物二者之TGFβ1刺激均誘發ECM蛋白質、纖維結合蛋白、膠原蛋白IV以及膠原蛋白I及III之進一步增加。經TGFβ1刺激之星狀細胞單一培養物或與IL-28A或IL-28B之星狀-肝細胞共培養物之處理表明在IL-28A或IL-28B之最高濃度10 μg/ml下對任何ECM蛋白質之任何增加的幾乎完全抑制，其中兩種抑制呈劑量依賴性方式。在經TGFβ1刺激之肝細胞中之所有ECM蛋白質中IL-28A比IL-28B更強效(圖7(a)及圖7(b))。相較於僅TGFβ1處理，經TGFβ1刺激之共培養物ECM之圖像在經IL-28A或IL-28B處理之共培養物之存在下展示ECM數量之明顯減少，此與圖像分析定量相一致(圖8)。(2.2) 小腸纖維化
用TGFβ1 (10 ng/ml)刺激之人類小腸纖維母細胞誘發胞外基質蛋白、纖維結合蛋白以及膠原蛋白I及III。相對於對照TGFβ1刺激，纖維結合蛋白含量藉由IL-28A、IL-28B及IL-29 (10 ng/ml)顯著地抑制，其中分別抑制76%、73%及83%。膠原蛋白I及III藉由IL-28A、IL-28B及IL-29 (10 ng/ml)分別抑制48%、33%及35%。相對於對照TGFβ1刺激，膠原蛋白IV僅藉由IL-28A (10 μg/ml下抑制37%)顯著地抑制(圖9)。(2.3) 皮膚纖維化
與原代角質細胞共培養之人類原代真皮纖維母細胞(9:1比率)僅藉由共培養累積大量纖維結合蛋白、膠原蛋白I及III以及膠原蛋白IV。使用3個單獨批次之與單個供體角質細胞組合之纖維母細胞，用IL-28A或IL-28B處理培養物。ECM蛋白質相對於未經處理之培養物之抑制百分比用所有3個纖維母細胞批次及所繪製之平均抑制來量測(圖10)。IL-28A及IL-28B二者在10 μg/ml之最大濃度下以類似功效完全抑制所有4種基質蛋白。IL-28A及IL-28B二者展示在10 ng/ml與10000 ng/ml之間的Col IV ECM標記物之劑量依賴性抑制。使用prestoblue分析測試細胞存活率，從而展示IL-28A或IL-28B在任何所測試濃度下均無毒性(圖10)。 真皮纖維母細胞-角質細胞共培養物在1250 ng/ml至10000 ng/ml之較窄濃度範圍內經IL-29、IL-28A及IL-28B處理。此展示纖維結合蛋白、膠原蛋白I及III以及膠原蛋白IV相對於對照共培養物之劑量依賴性抑制(圖11)。膠原蛋白IV在所有所測試濃度下藉由IFNL抑制最多(圖11)。如藉由Presto Blue細胞存活率分析(圖11)所測定，細胞存活率不受用IL-29、IL-28A或IL-28B處理影響。 相較於在1250 ng/ml及10000 ng/ml二者下經IL-29、IL-28A及IL-28B處理之共培養物，未經處理之皮膚共培養物之圖像確認在10 ug/ml IFNL之存在下藉由圖像分析所測定之ECM累積的總預防(圖12)。 最後，在單一培養物中用IL-1α (10 ng/ml)刺激人類真皮纖維母細胞以誘發ECM蛋白質纖維結合蛋白、膠原蛋白I及III以及膠原蛋白IV。用IL-28A或IL-28B處理經IL-1α刺激之纖維母細胞單一培養物表明針對所有ECM蛋白質之促基質反應之強效抑制，其中在10 μg/ml之最大濃度下完全抑制基質。在所有批次之纖維母細胞中，IL-28A比IL-28B更強效，其中描繪一個代表性實例(圖13)。IL-28A或IL-28B對細胞存活率無影響，如藉由prestoblue所量測(圖13)。(2.4) 腎臟纖維化
置放於與人類原代腎纖維母細胞之共培養物(以2000個細胞/孔接種，比率1:1)中之人類原代腎近端小管上皮細胞(RPTEC)產生強健ECM，纖維結合蛋白以及膠原蛋白I及III較高。此共培養物使用用於添加細胞介素之3種不同添加方案經IL-29、IL-28A或IL-28B處理。 首先，在第0天將IL-29、IL-28A及IL-28B添加至腎共培養物且培育該培養物7天。所有3種細胞介素以劑量依賴性方式強效地抑制纖維結合蛋白以及膠原蛋白I及III之累積(圖14(a))。IL-29表明最強效應，其中在IL-28A與IL-28B之間幾乎無差異。細胞存活率不受細胞介素處理損害(圖14(a))。 其次，在第0天將IL-29、IL-28A及IL-28B添加至RPTEC細胞，24小時後添加纖維母細胞且接著使培養物持續總共7天，之後量測ECM。在此，IL-29、IL-28A及IL-28B均以劑量依賴性方式再次抑制纖維結合蛋白以及膠原蛋白I及III之累積(圖14(b))。當在藉由添加纖維母細胞來引發ECM之共培養誘發24小時之前將細胞介素添加至RPTEC而非同時添加至兩種細胞(圖14(a)與圖14(b)之比較)時，抑制ECM蛋白質之程度在IFNL之存在下較大。 最後，在第0天將IL-29、IL-28及IL-28B添加至纖維母細胞。二十四小時後添加RPTEC且在量測纖維結合蛋白以及膠原蛋白I及III時使共培養持續總共7天。將IFNL添加至纖維母細胞，首先亦展示ECM蛋白質之顯著抑制(圖14(c))，但相較於在第0天將細胞介素添加至共培養物以及在纖維母細胞24小時前將細胞介素添加至RPTEC，降低了IL-29、IL-28A及IL-29B之功效。此觀測指向在介導抗纖維化表現型之RPTEC中之經IL-28R1介導之信號傳導反應，其導致在上皮及纖維母細胞細胞類型而者之共培養物中之ECM信號之抑制。為明確表明添加IFNL至不同細胞類型之次序相比於同步添加之差異效應，針對纖維結合蛋白(圖15(a))以及Col I及III (圖15(b))重新繪製IL-28A、IL-28B及IL-29資料，從而展示不同添加方案對各個別IL-28R1配位體之抑制程度的相對效應。在IL-28A、IL-28B或IL-29之某些較低濃度下，細胞及細胞介素之同步添加相較於首先添加至RPTEC (在纖維母細胞前)之間的差異達成統計顯著性且將此等值標示在曲線上。 細胞存活率不受在共培養物之替代細胞之前首先將細胞介素添加至RPTEC或纖維母細胞損害，如prestoblue所讀出(圖14(a)、圖14(b)及圖14(c))。 相較於IL-28A、IL-28B及IL-29治療之共培養物，未經處理之共培養物之代表性圖像(總共16個視野中之一個每治療)展示IL-29、IL-28A及IL-28B之劑量依賴性效應以及在1000 ng/ml IL-29之存在下觀測到之接近完全抑制(圖16)，從而確定圖像分析資料。(2.5) 肺纖維化
與自特發性肺部纖維化(IPF)患者分離之肺纖維母細胞共培養之人類原代小氣管肺上皮細胞(2000細胞/孔，1:1比率)在培養7天之後產生強健總ECM (藉由紅鶴染色量測)且對ECM標記物、纖維結合蛋白、膠原蛋白I及III以及膠原蛋白IV呈陽性。IL-28A或IL-28B對纖維結合蛋白含量無顯著影響。然而，IL-28B表明在最大濃度10 μg/ml下膠原蛋白I及III、膠原蛋白IV以及紅鶴染色劑之顯著抑制(圖17)。然而，IL-28A之效應較不明顯。在7天中藉由IL-28A或IL-28B，細胞存活率無變化(圖17)。(3) 器官纖維化之原代人類細胞模型 (3.1) 肝纖維化
共培養人類原代星狀細胞與原代人類肝內膽上皮細胞(1:1比率)產生基底胞外基質，該基底胞外基質亦可以劑量依賴性方式藉由用重組人類IL-28A及IL-29處理來抑制，其中纖維結合蛋白、膠原蛋白IV以及膠原蛋白I及III減少(圖19)。(3.2) 3D 腎小球球狀體模型
腎小球球狀體由磁化人類原代腎小球內皮細胞之內核與可維持於穩定培養物中至多3週之溫度條件性人類足細胞之外核建構。用來自患有局灶性節段性腎小球硬化(FSGS)之患者的15%復發性血漿處理腎小球球狀體誘發來自外核之經GFP標記之足細胞的喪失，其可在IL-28A之存在下受到保護。來自健康志願者之血漿對足細胞無影響。綠色螢光足細胞細胞標記物區域之定量表明對於IL-28A治療顯著增加之FSGS復發血漿存在的顯著降低(圖20(a)、圖20(b)及圖20(c))。FSGS之臨床進展之特徵在於足細胞之消失及喪失。此模型重建對來自FSGS血漿中之循環因子之足細胞的影響且提出IL-28療法之臨床轉譯性以預防相關聯之腎病症候群及腎小球硬化。(4) 腎臟纖維化之小鼠單側輸尿管堵塞模型 (UUO) (4.1) 藉由水壓轉染( HDT) 遞送之小鼠 IL28B
藉由HDT接收對照SEAP載體之動物中之UUO腎臟表明在手術後21天此模型之典型皮質中之小管間質性纖維化，伴隨管基底膜之廣泛擴張、基底膜之較強膠原蛋白染色(特定言之髓射線內之較強染色)、上皮細胞體積之廣泛喪失、管萎縮、近側管刷狀緣之喪失以及廣泛小管間質性浸潤。少於15%之小管具有接近正常之架構。髓質經有效地破壞且丟失，而對腎小球之改變最小(圖21(a))。 在UUO前1天用小鼠IL-28B進行HDT之動物中之UUO腎臟以及在UUO後7天用小鼠IL-28B進行HDT之動物中之彼等UUO腎臟均展示在手術後21天保護免遭皮層小管間質性纖維化(圖21(a))。管基底擴張及膠原蛋白染色在藉由HDT接收小鼠IL-28B之兩個組中比在接收對照載體之UUO小鼠中低至少30%至40%。兩個IL28B組均保留有管架構，其中較少上皮平坦化及萎縮發生。在HDT之前自第1天已HDT之彼等中30%與40%之間的小管展示接近正常之結構，且在隨後治療之彼等中略微較低(20%至30%)。相較於對照載體組，間質性浸潤在兩個IL-28組中大致為40%。IL28組均不具有對髓結構之任何顯著保護。總體而言，IL28B藉由HDT之較早及較晚遞送二者對腎皮質中之UUO誘發之纖維化重塑均具有顯著保護作用。 天狼星紅(PSR)染色膠原蛋白切片使用definiens圖像分析算法來定量，從而當繪製為總膠原蛋白面積(圖21(b))或較高強度膠原蛋白面積(圖21(c))時，展示在第1天或在第7天遞送之小鼠IL-28B相對於經對照質體處理之小鼠的統計學上顯著之保護作用。此與如上文所描述之染色切片之視覺組織學評估一致。 在小鼠UUO模型中HDT後21天達到之小鼠IL28B蛋白質之血清含量係藉由ELISA來量測且在所有組中在43 ng/ml與485 ng/ml之間。在對照SEAP HDT小鼠中未量測到小鼠IL28B蛋白質，因此含量低於4 ng/ml，該值為所使用之分析的定量下限(LLQ)。(4.2) 藉由水壓轉染( HDT) 遞送之人類 IL-29
相比於SEAP對照質體治療組(圖23(a))，當模型終止時，在所有小鼠中藉由HDT遞送之人類IL-29在第0天(轉染之後24小時)及第19天均展示顯著蛋白質表現。在未經轉染或SEAP對照小鼠血清中未檢測到人類IL-29。 未經處理之19天UUO展示針對此模型之典型組織學改變。在所有腎臟中存在腎髓質廣泛破壞及喪失。皮質顯示管基底膜之廣泛擴張，伴隨顯著間質性膠原蛋白累積，如藉由增加之天狼星紅(PSR)染色所展示。在整個皮質中亦存在細胞至間質中之顯著浸潤。管上皮結構經顯著損壞。大部分上皮細胞體積丟失且一般顯得扁平，包括少數具有擴張內腔之小管。值得注意地，多於80%小管經受廣泛萎縮且在多數情況下完全收縮。由於喪失通暢，故在大多數情況下難以區分小管內腔，其中上皮細胞自腎單位管基底膜明顯地移位且存在於內腔中。 自UUO時間用IL-29處理之第19天UUO腎臟在結構明顯地保留之情況下對僅接收SEAP載體之彼等具有顯著不同外觀。髓質經破壞，但仍然存在且具有比75%動物中之未經處理之UUO更加可辨別之結構。在皮質中，較低水準之放大率下之主要觀測為大量小管，其相較於SEAP UUO具有經擴張管內腔。然而，在此將通常與未經處理之UUO中之極扁平上皮細胞及管基底膜擴張相關聯時，用IL-29處理，上皮細胞具有保留體積，存在最少擴張之管基底膜及小管之架構顯著保留而具有極少乃至無萎縮及管塌陷之跡象。存在明顯較低水準之間質性膠原蛋白及管基底膜之經減少擴張。總體而言，IL-29之應用顯著減少了由UUO所造成之小管間質性纖維化，伴隨較少間質性膠原蛋白及管架構之顯著保留，如藉由圖23(b)中之代表性圖像所展示。 所有天狼星紅(PSR)染色膠原蛋白切片使用definiens圖像分析算法來定量，從而展示第1天遞送之人類IL-29在繪製為總染色膠原蛋白面積時相對於對照SEAP質體治療小鼠的統計學上顯著之保護作用(圖23(c))。此與如上文所描述之染色切片之視覺組織學評估一致。