CN110882381B - 重组IFN-λ1蛋白在制备防治炎症性骨丢失药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及重组IFN‑λ1蛋白在制备防治炎症性骨丢失药物中的应用。为解决骨感染所导致严重炎症性骨丢失状态时，其因大量炎症因子释放触发的因破骨细胞过度激活而引起的骨代谢失衡的问题，申请人经实验摸索发现重组IFN‑λ1蛋白可以调控破骨细胞分化融合的过程，减少破骨细胞分化过程中的炎症因子释放，以解决在炎性状态下破骨细胞过度激活的难题，达到保护炎症性骨丢失效果。

Description

重组IFN-λ1蛋白在制备防治炎症性骨丢失药物中的应用
技术领域
本发明属于骨科生物防治技术领域，涉及重组IFN-λ1蛋白在制备防治炎症性骨丢失药物中的应用。
背景技术
骨感染是骨折及骨科手术最常见而严重的并发症之一，既往因对其认识和治疗手段的局限而一直困扰着临床医生。金黄色葡萄球菌是其主要致病菌，约占创伤性骨髓炎检出致病菌的65％～70％。骨感染后常常导致过度的炎症性骨质破坏、骨不连，造成骨折不愈合或延迟愈合。成骨细胞及破骨细胞是参与骨重建的主要细胞，二者共同调节使骨组织保持动态平衡。在感染状态下，急、慢性的炎症刺激可以改变这种动态平衡，影响骨的愈合。因此，开发一种可以通过强效抗炎的作用达到调节骨基质平衡的药物是一种可行的策略。
正常骨组织通过骨修复重建自身微小损伤，保持结构、载荷和钙离子的稳态平衡。成骨细胞(Osteoblast，OB)和破骨细胞(Osteoclast，OC)是骨重建过程中的两种主要细胞。在生理状态下，成骨细胞与破骨细胞共同作用，保持骨形成与骨吸收的动态平衡。在骨感染状态下，由于持续性的金黄色葡萄球菌及毒力因子的作用，促进大量炎症因子的释放，可能使成骨细胞和破骨细胞的正常生物学行为发生改变，打破这种动态平衡。
破骨细胞(Osteoclasts)由单核细胞/巨噬细胞系分化而来，是人体骨骼系统中唯一具有吸收和重塑骨骼形态的生理性多核巨细胞。骨感染导致的过度骨质丢失除了与成骨细胞的功能受到抑制以外，还可能与破骨细胞的过度活化有关。在破骨细胞的分化过程中，两种细胞因子RANKL和M-CSF起到了至关重要的作用。活化的NFATc1促进破骨细胞标记基因的表达，如抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)和调节破骨细胞生成和吞噬骨基质功能的组织蛋白酶K(cathepsin K(CTSK))等。在金黄色葡萄球菌感染存在的情况下，大量的炎性细胞被募集至感染部位，释放大量的炎症介质可能促进破骨细胞的分化。通常情况下，促炎因子包括TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-11、IL-17等通过增加破骨细胞分化，促进骨吸收增强。近期，有文献报道金黄色葡萄球菌可直接促使破骨细胞分化。另外，金黄色葡萄球菌的毒力因子如肽聚糖以及脂多糖(LPS)可以直接作用于破骨细胞，促使破骨细胞形成。金黄色葡萄球菌所释放的脂多糖(LPS)导致的骨感染中，成骨细胞及破骨细胞的正常生物学行为会发生一系列改变，正常的骨重建过程改变，导致骨不连或过度的骨质丢失。金黄色葡萄球菌及其毒素通过直接或间接方式损伤成骨细胞与破骨细胞共同维持的骨基质动态平衡，抑制成果细胞活性，诱导其凋亡，使成骨分化过程受到抑制；同时，促进破骨细胞分化，使骨吸收能力增强。
在不同起源的造血细胞被细菌感染后可诱导表达干扰素λ1(Interferonλ1，IFN-λ1)。IFN-λ1通过结合特殊的异二聚体受体复合物起始信号的转导和发挥生物学作用，其与Ⅰ型IFN共享相同的JAK-STAT信号传导途径，促进一组共同基因的表达。因此，IFN-λ1表现出一些与Ⅰ型IFN相同的性质，如抗炎、抗病毒、抗增殖、体内抗肿瘤及免疫调节等生物学活性。有文献报道，对不同的单核细胞进行对比后发现，用LPS刺激外周血单核细胞，只产生IFN-λ1，而且IFN-λ1的表达量比用LPS刺激不成熟或成熟的树突状细胞的表达量低。但是，未见IFN-λ1用于炎症性骨丢失治疗的相关报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供重组IFN-λ1蛋白在制备防治炎症性骨丢失药物中的应用。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
重组IFN-λ1蛋白在制备防治炎症性骨丢失药物中的应用。
优选的，所述炎症性骨丢失的介导因素选自以下任一种或几种：破骨细胞融合或分化成熟，成熟破骨细胞噬骨能力增强，抑制破骨细胞融合、分化或成熟不同阶段相关基因表达，破骨细胞分化成熟过程中炎症因子的释放，破骨细胞分化成熟过程中NF-κB信号通路的形成，破骨细胞分化成熟过程中HMGB1介导的NLRP3炎症小体形成，破骨细胞分化成熟过程中激活JAK-STAT信号通路的形成。
一种防治炎症性骨丢失药物，其有效成分为重组IFN-λ1蛋白。
本发明的有益效果在于：
为解决骨感染所导致严重炎症性骨丢失状态时，其因大量炎症因子释放触发的因破骨细胞过度激活而引起的骨代谢失衡的问题，申请人经实验摸索发现重组IFN-λ1蛋白可以调控破骨细胞分化融合的过程，减少破骨细胞分化过程中的炎症因子释放，以解决在炎性状态下破骨细胞过度激活的难题，达到保护炎症性骨丢失效果。
实验结果发现，在有效剂量内，重组IFN-λ1蛋白对小鼠单核巨噬细胞系(RAW264.7)无毒性作用；在有效剂量内，重组IFN-λ1蛋白抑制RANKL和LPS诱导的小鼠原代骨髓单核巨噬细胞(BMMs)以及小鼠单核巨噬细胞系(RAW264.7)向破骨细胞成熟分化；在有效剂量内，重组IFN-λ1蛋白抑制RANKL和LPS诱导的小鼠原代骨髓单核巨噬细胞(BMMs)以及小鼠单核巨噬细胞系(RAW264.7)分化成熟的破骨细胞的噬骨能力；在有效剂量内，重组IFN-λ1蛋白浓度依赖性的抑制破骨细胞的融合；在有效剂量内，重组IFN-λ1蛋白在mRNA水平可以显著下调破骨细胞分化成熟过程中不同阶段的标志基因例如早期(CD9,PU1等)，成熟期(CTR，CTSK等)；在有效剂量内，重组IFN-λ1蛋白可以抑制NF-κB p65核转位以及负向时间依赖性调控NF-κB信号通路；在有效剂量内，重组IFN-λ1蛋白可以显著抑制在破骨细胞分化过程中HMGB1介导的NLRP3炎症小体的形成过程；在有效剂量内，重组IFN-λ1蛋白能够显著激活在破骨细胞分化过程中JAK-STAT信号通路；在有效剂量内，重组IFN-λ1蛋白能够抑制炎症因子在LPS诱导破骨细胞分化成熟的过程中的释放；在有效剂量内，重组IFN-λ1蛋白能够显著保护LPS局部注射导致的炎症性骨丢失以及抑制体内动物模型炎症因子的释放。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为IFN-λ1在感染骨组织中的表达较正常骨组织高。A图为KEGG pathway分析显示免疫相关信号通路在感染骨组织与正常骨组织的对比中发生显著变化；B图为RNA-Seq的结果显示IFN-λ1特异性相关受体IFNLR1在感染骨组织的表达高于正常骨组织；C图为免疫组织化学染色结果显示IFN-λ1阳性细胞的数量在感染骨组织中多于正常骨组织；D图为慢性血源性骨髓炎病人外周血中IFN-λ1的含量高于普通骨折未合并感染病人外周血。
图2为重组IFN-λ1蛋白的局部注射可以保护炎症性骨丢失。A图为具体动物实验实施步骤图；B图为micro-CT成像结果；C图为micro-CT骨参数分析结果；D图为HE与Masson切片染色结果；E图为HE切片染色骨组织所占面积的定量统计结果；F图为不同组小鼠外周血中炎症因子(TNF-α，IL-1β，IL-6)的含量。
图3为不同浓度重组IFN-λ1蛋白对RAW264.7细胞增殖的影响。A图为不同浓度重组IFN-λ1蛋白在RANKL与M-CSF诱导72小时条件下流式细胞术的检测图；B图为流式细胞术检测结果统计；C，D图为分别作用24小时与72小时后，细胞毒性的结果。横坐标为重组IFN-λ1蛋白的上样终浓度，纵坐标为450nm的吸光度值。
图4为重组IFN-λ1蛋白对破骨细胞分化以及噬骨能力的负向调控作用。A,C,E图为IFN-λ1蛋白作用下抑制RANKL与LPS诱导的破骨细胞分化的TRAP染色显微镜图；B,D,F图为重组IFN-λ1蛋白作用下每孔TRAP阳性破骨细胞的数量；G,H图为重组IFN-λ1蛋白作用下骨基质胶原板的陷窝显微镜图以及骨基质胶原板陷窝吸收分数统计；I图为重组IFN-λ1蛋白对破骨细胞噬骨能力的影响甲苯胺蓝染色结果以及骨表面吸收分数统计。
图5为重组IFN-λ1蛋白对破骨细胞形成以及多核破骨细胞形成的影响。A,B图为重组IFN-λ1蛋白对RANKL以及LPS诱导破骨细胞形成的FAK免疫荧光染色图与成熟破骨细胞数量及破骨细胞核数量的计数统计。
图6为重组IFN-λ1蛋白对破骨细胞分化过程NFATc1的调控。A图为重组IFN-λ1蛋白对NFATc1的核转位免疫荧光染色图；B图为细胞核内荧光强度的定量统计；C图为重组IFN-λ1蛋白抑制破骨细胞分化特异基因CD9，c-Fos，CTSK，PU1，NFATc1在早期破骨细胞分化阶段的mRNA水平的作用结果；D图为重组IFN-λ1蛋白抑制破骨细胞分化基因c-Fos，NFATc1在早期破骨细胞分化阶段的蛋白水平的作用结果；E图为重组IFN-λ1蛋白抑制破骨细胞分化基因c-Fos，NFATc1，CD9，CTSK，MMP9在成熟破骨细胞分化阶段的蛋白水平的作用结果；F图为重组IFN-λ1蛋白抑制破骨细胞分化基因c-Fos，NFATc1，mitf，CTSK，CTR在成熟破骨细胞分化阶段的mRNA水平的作用结果；G图为重组IFN-λ1蛋白抑制LPS诱导破骨细胞分化过程特异基因CTR，CTSK，OC-STAMP，mitf在mRNA水平的作用结果；H图为重组IFN-λ1蛋白在LPS诱导破骨细胞分化过程炎症因子(TNF-α，IL-1β，IL-6)在mRNA水平的作用结果。
图7为重组IFN-λ1蛋白抑制破骨细胞分化过程NF-κB信号通路，NLRP3炎症小体的形成以及促进JAK-STAT信号通路。A图为重组IFN-λ1蛋白对NF-κB p65的核转位免疫荧光染色图；B图为核转位阳性细胞的所占比例；C图为细胞核内荧光强度的定量统计；D图为重组IFN-λ1蛋白干预下IκB，p-IκB，p65，p-p65在RANKL诱导15min,30min,45min,60min的表达情况；E,F图为重组IFN-λ1在RANKL与LPS诱导破骨细胞形成过程中HMGB1，RAGE，NLRP3在蛋白水平的表达情况；G，H图为重组IFN-λ1在RANKL与LPS诱导破骨细胞形成过程中HMGB1，NLRP3在mRNA水平的表达情况；I图为重组IFN-λ1蛋白干预下Jak1，p-Jak1，Tyk2，p-Tyk2,Stat1,p-Stat1,Stat2,p-Stat2在RANKL诱导15min,30min,45min,60min的表达情况；
图8为重组IFN-λ1蛋白抑制破骨细胞融合分化进而保护炎症性骨丢失的相关信号通路模拟示意图。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
RAW264.7是小鼠单核巨噬细胞系以及BMMs为小鼠原代单核巨噬细胞，在RANKL以及M-CSF的刺激诱导下可以向破骨细胞分化，是研究破骨细胞分化、融合、成熟、噬骨等生物学行为的常用的细胞模型。同时破骨细胞与成骨细胞、骨细胞、基质细胞等都有密切的关联和耦合作用，是体内骨基质动态平衡及电解质稳态的重要调控元素。炎症性骨丢失往往由过多的炎性因子的释放导致的过度骨吸收，是破骨细胞过度活化的结果。故选择RAW264.7和BMM作为细胞模型，研究重组IFN-λ1蛋白对RANKL与LPS诱导的破骨细胞生成的影响十分适宜。观察重组IFN-λ1蛋白抑制炎性因子释放以及炎症相关信号通路，是否抑制破骨细胞特异相关基因的表达及其对破骨细胞噬骨能力的影响，从而阐述重组IFN-λ1蛋白在制备用于防治炎症性骨丢失的药物中的应用及机制。
1)感染骨组织与正常骨组织转录组水平的基因检测
通过收集金黄色葡萄球菌性骨髓炎的感染骨组织(3例)以及长骨骨折的未感染骨组织(3例)，在液氮条件下加入TRIzol，提取总RNA，在cBot Cluster Generation系统上用TruSeq PE Cluster试剂盒(v3-cBot-HS,Illumia)来生成DNA簇，具体方法参考说明书；采用Illumina Hiseq 4000平台对文库进行测序；用HTSeq v0.6.1来计算每个基因的read数量，计算每百万reads中来自于某基因每千碱基长度的reads数(RPKM)，并以RPKM值来代表基因表达水平；采用DE Seq R package(1.10.1)分析两组间差异基因，所产生的P值用Benjamini and Hochberg方法来控制假阳性率。变化倍率大于1.5并且差异概率值大于0.8的基因被认为是差异表达的基因(Differentiated expressed genes，DEGs)；基于KEGG数据库，构建信号通路调控网络。
结果如图1中A,B所示：由图可见，KEGG pathway分析显示免疫相关信号通路在感染骨组织与正常骨组织的对比中发生显著变化；IFN-λ1特异性相关受体IFNLR1在感染骨组织的表达高于正常骨组织。
2)组织学水平与外周血中检测IFN-λ1的表达
(1)免疫组织化学染色(IFN-λ1)：取出组织，用切片机进行切片，切片厚度约为30微米。后将切片用0.1M磷酸缓冲液(PBS)冲洗3次，每次约10分钟；切片用体积浓度50％乙醇溶液在摇床上清洗切片30分；用质量浓度50％乙醇与质量浓度30％H2O2混合液清洗切片30分。质量浓度5％的BSA封闭液封闭切片30分钟。抗体稀释液(PBH)稀释一抗后，切片在室温下一抗孵育震荡过夜，然后在4℃震荡孵育两晚。切片用0.1M磷酸缓冲液清洗3次，每次10分钟。据产品说明书按比例稀释二抗，避光孵育二抗2h。0.1M磷酸缓冲液清洗切片3次，每次15分钟。DAB混合液孵育切片10分钟。加入葡萄糖氧化酶后2～3分钟，显微镜下观察着色情况；Tris缓冲液清洗切片3次，每次约10分钟。质量浓度4％明胶涂于切片上并风干过夜。将切片依次放入体积浓度95％的乙醇溶液和无水乙醇中，每次15分钟，然后用Histolene清洗20分钟，最后覆盖玻片。
(2)人外周血血清ELISA检测(IFN-λ1)：从2018年9月至2018年12月之间收集就诊于中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院骨科的金黄色葡萄球菌性骨髓炎病人与长骨骨折未并发感染的病人的外周血，在12000g，4℃条件下离心收集上层血清，利用博奥森公司的IFN-λ1的ELISA试剂盒进行检测，绘制标准曲线，得出不同分组病人的IFN-λ1含量。
结果所示：如图1中C、D在组织学水平IFN-λ1阳性细胞的数量在感染骨组织中多于正常骨组织；定量分析方面，慢性血源性骨髓炎病人外周血中IFN-λ1的含量高于普通骨折未合并感染病人外周血。
3)重组IFN-λ1蛋白明显改善LPS局部注射导致的炎症性骨丢失
3.1LPS导致的炎症性骨丢失动物模型的构建
取18只8周龄陆军军医大学动物实验中心C57BL/6J雌性小鼠，体重为18-22g。重组IFN-λ1购买自美国sigma公司。戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉，颅骨局部注射相关药物，分组如下，连续给药14天，小鼠被随机分为三组，每组6只；
PBS组：每只给药100μL；
LPS组：每只给药100μL(10mg/kg)；
LPS+IFN-λ1:每只给药100μL(0.2mg/kg IFN-λ1+10mg/kg LPS)；
3.2、骨质量参数检测
完成14天给药后每只小鼠分离颅骨，去除多余颅内组织以及周围软组织，固定。眼球采血获得血液样本。通过小动物micro-CT检测骨微结构进行分析。管电压为50kV，管电流为0.1mA，分辨率为8mm。颅骨扫描区域限定为颅缝中点为圆心，半径为3cm的圆。选定的感兴趣区(ROI)的3D参数用于数据分析，包括骨小梁数量、骨小梁厚度、骨小梁分离度和相对骨体积分数。血液样本用于分析炎症因子含量包括：TNF-α，IL-1β与IL-6。
结果所示：如图2所示，相对于隐性对照组(PBS组)，LPS组小鼠的骨密度和骨体积分数明显下降，同时骨小梁数量、相对骨体积分数也有所降低。然而，通过IFN-λ1给药后，小鼠的骨小梁数量、相对骨体积分数相对LPS组都显著提高。并且炎症因子的释放在IFN-λ1干预条件下，显示出明显的抑制效应。结果具有统计学差异(P<0.05)。因此得出结论IFN-λ1能够对LPS给药导致的炎症性骨丢失起到保护作用并且抑制炎症因子的释放。
4)不同浓度重组IFN-λ1蛋白对破骨细胞前体无毒性
流式细胞术：将RAW264.7细胞暴露于不同浓度的IFN-λ1(0ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL)48小时后，检测吞噬处理后细胞凋亡水平；根据BD流式凋亡试剂盒说明书，提前将100X buffer稀释为1X，4℃预冷；收集孔板中培养基上清至15ml离心管中，每孔加入TrypLE 1ml，37℃消化3min；吹打孔板底部使细胞分散，将消化后细胞悬液移至对应15ml离心管中，200g/min，离心5min；弃上清，加入提前配置的1×buffer重悬；台盼蓝计数，用1×buffer将各样本统一为106细胞/ml；每个样本取100μl，并加入5μl碘化丙锭(PI)和5μl膜连蛋白V，室温避光孵育15分钟；孵育结束，每个样本加入300μl 1×buffer终止反应；96目铜网过滤，并于1小时内流式上机，检测各样本PI和APC荧光强度；用Flow Jo软件在FSC/SSC界面去除左下角碎片，再分析PI和APC通道荧光强度，并计算各个象限中细胞的比例。
CCK-8检测：将RAW264.7细胞以1×103个/well接种于96孔板，待细胞长满后弃掉培养基，培养基成分为：DMEM高糖培养液+体积百分数10％胎牛血清+质量浓度1％双抗(青链霉素)，以终浓度为0(空白对照组)、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL将IFN-λ1加入各个含新鲜培养基的孔板中，分别培养24h和72h，利用CCK-8法对细胞活性进行检测，观察IFN-λ1作用下RAW264.7细胞增殖作用的影响。
结果所示：如图3中A与B，在流式细胞术检测中，不同浓度IFN-λ1作用下总凋亡细胞的数目未发生明显变化。在CCK-8细胞毒性检测中，24h组或是72h组中，不同浓度的IFN-λ1(小于200ng/mL)对破骨细胞分化过程中的细胞增殖无明显影响。
5)重组IFN-λ1蛋白减少RANKL与LPS诱导的TRAP阳性细胞产生
分组情况：
组1：RANKL(0ng/mL)诱导，无IFN-λ1对照组；
组2：RANKL(50ng/mL)诱导，无IFN-λ1对照组；
组3：RANKL(50ng/mL)诱导，100ng/mL IFN-λ1实验组；
组4：LPS(100ng/mL)诱导，无IFN-λ1实验组；
组5：LPS(100ng/mL)诱导，100ng/mL IFN-λ1实验组；
将RAW264.7细胞与BMM细胞以3×103个/well接种于96孔板，待细胞长满后弃掉培养基，培养基成分为：DMEM高糖培养液与α-MEM+体积百分数10％胎牛血清+质量浓度1％双抗(青链霉素)，以终浓度为100ng/mL将IFN-λ1加入各个含新鲜培养基的孔板中，同时以RANKL(50ng/mL)、M-CSF(50ng/mL)或者LPS(100ng/mL)诱导RAW264.7或者BMM细胞向破骨细胞分化。诱导培养72h或者120h后行抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色。弃置培养基后用PBS清洗3次，一次3min。质量浓度4％多聚甲醛固定20min，PBS清洗3次，一次3min。抗酒石酸酸性磷酸酶染液染色(0.1mg/ml of naphthol AS-MX phosphate,0.3mg/ml of Fast RedViolet LB复染)。避光染色1h，弃置染液。PBS漂洗3次后每孔加入100μL PBS待观察。光镜下可见TRAP阳性细胞被染成紫红色(图4中A、C、E)。根据细胞核数量统计TRAP阳性细胞个数，分别统计TRAP阳性总细胞数(图4中B、D、F)。
结果所示：在IFN-λ1的干预条件下，TRAP阳性成熟破骨细胞的数量具有相同的抑制效应趋势。证明IFN-λ1具有浓度依赖性抑制破骨细胞的生成(**P＜0.01)。
6)重组IFN-λ1蛋白抑制RANKL与LPS诱导的成熟破骨细胞的噬骨能力
分组情况：
组1：RANKL(0ng/mL)诱导，无IFN-λ1对照组；
组2：RANKL(50ng/mL)诱导，无IFN-λ1对照组；
组3：RANKL(50ng/mL)诱导，100ng/mL IFN-λ1实验组；
组4：LPS(100ng/mL)诱导，无IFN-λ1实验组；
组5：LPS(100ng/mL)诱导，100ng/mL IFN-λ1实验组；
将RAW264.7细胞与BMM细胞以4×103个/well接种于骨基质胶原板与铺200μm小牛骨片的48孔板，待细胞长满后弃掉培养基，培养基成分为：DMEM高糖培养液+体积百分数10％胎牛血清+质量浓度1％双抗(青链霉素)，以终浓度为100ng/mL将IFN-λ1加入各个含新鲜培养基的孔板中，同时以RANKL(50ng/mL)、M-CSF(50ng/mL)或者LPS诱导RAW264.7细胞与BMM细胞向破骨细胞分化(除外空白对照组)。96小时后取出含小牛骨片的48孔板，弃置培养基。质量浓度10％漂白剂(HClO)室温漂白5min。双蒸水清洗3遍，每次5min。室温下放置至干燥(3-5小时)。甲苯胺蓝染液染色5min。双蒸水漂洗3-5遍，每次5min。每孔加入200μl双蒸水或1×PBS，光镜下观察。骨表面经破骨细胞吸收后可被甲苯胺蓝染成蓝色，根据蓝色噬骨面积的大小和占总骨片表面积的百分比评价破骨细胞的噬骨能力。骨基质胶原板在质量浓度10％漂白剂(HClO)室温漂白5min。双蒸水清洗3遍，每次5min。在室温干燥条件下，通过光镜下观察。
结果所示：未加入RANKL或LPS诱导的空白对照组无骨吸收。加入RANKL(50ng/mL)、M-CSF(50ng/mL)或者LPS诱导，无IFN-λ1对照组骨吸收面积比例与实验组相比最大(**P<0.01)。各实验组随着IFN-λ1的干预，破骨细胞骨吸收能力显著下降(**P＜0.01)。
7)重组IFN-λ1蛋白抑制RANKL与LPS诱导的多核成熟破骨细胞的融合
分组情况：
组1：RANKL(0ng/mL)诱导，无IFN-λ1对照组；
组2：RANKL(50ng/mL)诱导，无IFN-λ1对照组；
组3：RANKL(50ng/mL)诱导，100ng/mL IFN-λ1实验组；
组4：LPS(100ng/mL)诱导，无IFN-λ1实验组；
组5：LPS(100ng/mL)诱导，100ng/mL IFN-λ1实验组；
将RAW264.7细胞与BMM细胞以2×103个/well接种于96孔板，待细胞长满后弃掉培养基，培养基成分为：DMEM高糖培养液+体积百分数10％胎牛血清+质量浓度1％双抗(青链霉素)，以终浓度为0、100ng/mL将IFN-λ1加入各个含新鲜培养基的孔板中，同时以RANKL(50ng/mL)、M-CSF(50ng/mL)或者LPS诱导RAW264.7细胞与BMM细胞向破骨细胞分化。诱导培养72h或者120h后行FAK(Actin Cytoskeleton and Focal Adhesion Staining)免疫荧光染色。细胞取出后弃置培养基，1×PBS洗两遍，4％多聚甲醛室温下固定20min，1×PBS洗两遍。质量浓度0.1％Triton X-100穿透细胞5min，1×PBS洗两遍。封闭缓冲液(质量浓度1％BSA in 1×PBS)固定30min。一抗(Anti-Vincμlin)于封闭缓冲液稀释至工作浓度(体积比1：300)，室温孵育细胞1h。1×冲洗缓冲液(质量浓度0.05％Tween-20in 1×PBS)洗三遍，每次5-10min。二抗(Alexa Fluor 488Goat Anti-Mouse IgG(H+L)抗体,Invitrogen)稀释至工作浓度(体积比1：500)，同时加入TRITC标记的鬼笔环肽(体积比1:500)。室温下共同孵育1h。1×wash buffer洗三遍，每次5-10min。室温下DAPI(体积比1:1000)复染细胞核5min，1×冲洗缓冲液洗三遍，每次5-10min。荧光显微镜观察细胞。统计视野下破骨细胞数量，以及破骨细胞平均核数。
结果所示：在100ng/mL IFN-λ1干预下，多核破骨细胞(细胞核数量大于3)的形成受到了明显的抑制，**P＜0.01(图5)。同时可见成熟破骨细胞细胞核的数量降低，**P＜0.01(图5)。
8)重组IFN-λ1蛋白抑制RANKL诱导的NFATc1的核转位过程
分组情况：
组1：RANKL(0ng/mL)诱导，无IFN-λ1对照组；
组2：RANKL(50ng/mL)诱导，无IFN-λ1对照组；
组3：RANKL(50ng/mL)诱导，100ng/mL IFN-λ1实验组；
将RAW264.7细胞以5×103个/well接种于铺上玻片的48孔板，待细胞长满后弃掉培养基，培养基成分为：DMEM高糖培养液+体积百分数10％胎牛血清+质量浓度1％双抗(青链霉素)，以终浓度为0、100ng/mL将IFN-λ1加入各个含新鲜培养基的孔板中，同时以RANKL(50ng/mL)、M-CSF(50ng/mL)诱导RAW264.7细胞。诱导培养24h后行免疫荧光染色。细胞取出后弃置培养基，1×PBS洗两遍，质量浓度4％多聚甲醛室温下固定20min，1×PBS洗两遍。质量浓度0.1％Triton X-100穿透细胞5min，1×PBS洗两遍。封闭缓冲液(质量浓度1％BSA in1×PBS)固定30min。一抗(Anti-NFATc1)于封闭缓冲液稀释至工作浓度(体积比1：300)，室温孵育细胞1h。1×冲洗缓冲液(质量浓度0.05％Tween-20in 1×PBS)洗三遍，每次5-10min。二抗(Alexa Fluor 488Goat Anti-Mouse IgG(H+L)抗体,Invitrogen)稀释至工作浓度(体积比1：500)，室温下共同孵育1h。1×wash buffer洗三遍，每次5-10min。室温下DAPI(体积比1:1000)复染核5min，1×冲洗缓冲液洗三遍，每次5-10min。激光共聚焦显微镜观察。统计NFATc1入核数量以及细胞核内平均荧光强度。
结果所示：如图6中A、B，在100ng/mL IFN-λ1干预下，细胞核内的平均荧光强度显示出强效的抑制效应。
9)重组IFN-λ1蛋白抑制破骨细胞分化不同阶段特异基因的表达
分组情况：
组1：RANKL(0ng/mL)诱导，无IFN-λ1对照组；
组2：RANKL(50ng/mL)诱导，无IFN-λ1对照组；
组3：RANKL(50ng/mL)诱导，100ng/mL IFN-λ1实验组；
组4：LPS(100ng/mL)诱导，无IFN-λ1实验组；
组5：LPS(100ng/mL)诱导，100ng/mL IFN-λ1实验组；
将RAW264.7细胞以1×105个/well接种于6孔板，待细胞长满后弃掉培养基，培养基成分为：DMEM高糖培养液+体积百分数10％胎牛血清+质量浓度1％双抗(青链霉素)，以终浓度为0、100ng/mL将IFN-λ1加入各个含新鲜培养基的孔板中，同时以RANKL(50ng/mL)、M-CSF(50ng/mL)或者100ng/mL LPS诱导RAW264.7细胞向破骨细胞分化。诱导培养24h，72h后取出，弃置培养基，用Trizol裂解细胞，提取细胞内的总RNA，实时定量RT-PCR以及WesternBlot对目的基因Ctsk、c-Fos、NFATc1、CTR、mitf、OC-STAMP、PU1、CD9、进行定量检测，β-actin作为内参对照。用CFX96 touch quantitative PCR system进行扩增，每孔加入SYBR(II)7.5μl，(PCR)水5.1μl，cDNA 1.2μl，上下引物各0.6μl，反应体系15μl。每组3个复孔。反应条件：(1)95℃30s；(2)40个循环，95℃5s，60℃30s；(3)80个循环，60℃30s，55℃10s；由PCR仪器自动计算得出目的基因相对含量，采用2-ΔΔCT法分析。
引物序列如表1所示。
表1.引物序列
Figure BDA0002324487120000111
结果所示：如图6中C、D显示，100ng/mL IFN-λ1抑制破骨细胞早期标志物Ctsk、c-Fos、PU1、CD9、和NFATc1在mRNA水平的表达，并且在蛋白水平上抑制c-Fos和NFATc1在蛋白水平的表达(**P＜0.01)。如图6中E、F显示100ng/mL IFN-λ1抑制成熟破骨细胞标志物Ctsk、c-Fos、NFATc1、CTR和mitf在mRNA水平的表达(**P<0.01),同时在蛋白水平上抑制Ctsk、CD9、MMP9、c-Fos和NFATc1的表达。可得出结论IFN-λ1通过抑制破骨细胞分化特异性基因的表达进而抑制破骨细胞的分化，形成，成熟和骨吸收能力。
10)重组IFN-λ1蛋白抑制破骨细胞分化过程中NF-κB信号通路
(1)重组IFN-λ1蛋白抑制RANKL诱导的NF-κB p65核转位
分组情况：
组1：RANKL(0ng/mL)诱导，无IFN-λ1对照组；
组2：RANKL(50ng/mL)诱导，无IFN-λ1对照组；
组3：RANKL(50ng/mL)诱导，100ng/mL IFN-λ1实验组；
将RAW264.7细胞以5×103个/well接种于铺上玻片的48孔板，待细胞长满后弃掉培养基，培养基成分为：DMEM高糖培养液+体积百分数10％胎牛血清+质量浓度1％双抗(青链霉素)，以终浓度为0、100ng/mL将IFN-λ1加入各个含新鲜培养基的孔板中，同时以RANKL(50ng/mL)、M-CSF(50ng/mL)诱导RAW264.7细胞。诱导培养24h后行免疫荧光染色。细胞取出后弃置培养基，1×PBS洗两遍，质量浓度4％多聚甲醛室温下固定20min，1×PBS洗两遍。质量浓度0.1％Triton X-100穿透细胞5min，1×PBS洗两遍。封闭缓冲液(1％BSA in1×PBS)固定30min。一抗(Anti-NF-κB p65)于封闭缓冲液稀释至工作浓度(体积比1：300)，室温孵育细胞1h。1×冲洗缓冲液(质量浓度0.05％Tween-20in 1×PBS)洗三遍，每次5-10min。二抗(Alexa Fluor 647Goat Anti-Mouse IgG(H+L)抗体,Invitrogen)稀释至工作浓度(体积比1：500)，室温下共同孵育1h。1×wash buffer洗三遍，每次5-10min。室温下DAPI(体积比1:1000)复染细胞核5min，1×冲洗缓冲液洗三遍，每次5-10min。激光共聚焦显微镜观察。统计NF-κB p65入细胞核阳性细胞数量以及细胞核内平均荧光强度。
结果所示：如图7中A、B、C显示，在100ng/mL IFN-λ1干预下，细胞核内的平均荧光强度显示出强效的抑制效应以及NF-κB p65入核阳性细胞数量在逐渐减少。
(2)重组IFN-λ1蛋白抑制NF-κB p65信号通路
分组情况：
组1：RANKL(50ng/mL)诱导，诱导时间为15min；
组2：RANKL(50ng/mL)诱导，诱导时间为30min；
组3：RANKL(50ng/mL)诱导，诱导时间为45min；
组4：RANKL(50ng/mL)诱导，诱导时间为60min；
组5：RANKL(50ng/mL)+100ng/mL IFN-λ1诱导，诱导时间为15min；
组6：RANKL(50ng/mL)+100ng/mL IFN-λ1诱导，诱导时间为30min；
组7：RANKL(50ng/mL)+100ng/mL IFN-λ1诱导，诱导时间为45min；
组8：RANKL(50ng/mL)+100ng/mL IFN-λ1诱导，诱导时间为60min。
RAW264.7细胞在含RNAKL的6孔板中培养，用100ng/mL RANKL刺激。用放射免疫沉淀法(RIPA)裂解缓冲液溶解细胞。蛋白质经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转入聚偏氟乙烯(PVDF)膜，在质量浓度5％脱脂乳中封闭1小时后，在4℃下用各种特异性一抗(IκB，p-IκB，p65，p-p65)在4℃处轻轻摇动一夜，然后用辣根过氧化物酶(HRP)结合的二抗孵育膜。然后用增强化学发光试剂检测抗体反应性(美国药典生物技术公司，Piscataway，NJ)，在图像量化LAS 4000上显示。
结果所示：如图7中D显示，在100ng/mL IFN-λ1干预下，p-IκB和p-p65的表达呈现出时间依赖性的抑制效应。。
11)重组IFN-λ1蛋白抑制HMGB1介导的NLRP3炎症小体形成以及炎症因子释放的机制
分组情况：
组1：RANKL(0ng/mL)诱导，无IFN-λ1对照组；
组2：RANKL(50ng/mL)诱导，无IFN-λ1对照组；
组3：RANKL(50ng/mL)诱导，100ng/mL IFN-λ1实验组；
组4：LPS(100ng/mL)诱导，无IFN-λ1实验组；
组5：LPS(100ng/mL)诱导，100ng/mL IFN-λ1实验组；
将RAW264.7细胞以1×105个/well接种于6孔板，待细胞长满后弃掉培养基，培养基成分为：DMEM高糖培养液+体积百分数10％胎牛血清+质量浓度1％双抗(青链霉素)，以终浓度为0、100ng/mL将IFN-λ1加入各个含新鲜培养基的孔板中，同时以RANKL(50ng/mL)、M-CSF(50ng/mL)或者100ng/mL LPS诱导RAW264.7细胞向破骨细胞分化。诱导培养24h，72h后取出，弃置培养基，用Trizol裂解细胞，提取细胞内的总RNA，实时定量RT-PCR以及WesternBlot对目的基因NLRP3,HMGB,IL-6，IL-1β，TNF-α进行定量检测，β-actin作为内参对照。用CFX96 touch quantitative PCR system进行扩增，每孔加入SYBR(II)7.5μl，(PCR)水5.1μl，cDNA 1.2μl，上下引物各0.6μl，反应体系15μl。每组3个复孔。反应条件：(1)95℃30s；(2)40个循环，95℃5s，60℃30s；(3)80个循环，60℃30s，55℃10s；由PCR仪器自动计算得出目的基因相对含量，采用2-ΔΔCT法分析。引物序列为表2。
表2.引物序列
Figure BDA0002324487120000131
结果所示：如图7中E、F、G、H显示，在100ng/mL IFN-λ1干预下，NLRP3,HMGB1,的表达在mRNA与蛋白水平呈现出强效的抑制效应，并且炎症因子IL-6，IL-1β，TNF-α的表达在mRNA水平也被降低。
12)重组IFN-λ1蛋白在破骨细胞分化过程中激活JAK-STAT信号通路
分组情况：
组1：RANKL(50ng/mL)诱导，诱导时间为15min；
组2：RANKL(50ng/mL)诱导，诱导时间为30min；
组3：RANKL(50ng/mL)诱导，诱导时间为45min；
组4：RANKL(50ng/mL)诱导，诱导时间为60min；
组5：RANKL(50ng/mL)+100ng/mL IFN-λ1诱导，诱导时间为15min；
组6：RANKL(50ng/mL)+100ng/mL IFN-λ1诱导，诱导时间为30min；
组7：RANKL(50ng/mL)+100ng/mL IFN-λ1诱导，诱导时间为45min；
组8：RANKL(50ng/mL)+100ng/mL IFN-λ1诱导，诱导时间为60min。
RAW264.7细胞在含RNAKL的6孔板中培养，用100ng/mL RANKL刺激。用放射免疫沉淀法(RIPA)裂解缓冲液溶解细胞。蛋白质经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转入聚偏氟乙烯(PVDF)膜，在质量浓度5％脱脂乳中封闭1小时后，在4℃下用各种特异性一抗(Jak1，p-Jak1，Tyk2，p-Tyk2,Stat1,p-Stat1,Stat2,p-Stat2)在4℃处轻轻摇动一夜，然后用辣根过氧化物酶(HRP)结合的二抗孵育PVDF膜。然后用增强化学发光试剂检测抗体反应性(美国药典生物技术公司，Piscataway，NJ)，在图像量化LAS 4000上显示。
结果所示：如图7中I显示，在100ng/mL IFN-λ1干预下，p-Jak1,p-Tyk2,p-Stat1,p-Stat2的表达在蛋白水平呈现出强效的促进效果，进而提示我们IFN-λ1在破骨细胞的形成过程中可以激活JAK-STAT信号通路。
结果所示：如图8中显示，在IFN-λ1干预下通过JAK-STAT与NF-κB信号通路抑制破骨细胞的分化融合进而达到保护炎症性骨丢失效果的相关模拟示意图。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (1)

1.重组IFN-λ1蛋白在制备防治LPS诱导的炎症性骨丢失药物中的应用；所述LPS诱导的炎症性骨丢失的介导因素选自以下任一种或几种：TRAP阳性细胞产生，成熟破骨细胞的噬骨能力增强，多核成熟破骨细胞的融合，破骨细胞分化不同阶段特异基因的表达，HMGB1介导的NLRP3炎症小体形成以及炎症因子释放。
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