CN115379879A - 用于预防和治疗纤维化疾病的抗Claudin-1单克隆抗体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及使用抗Claudin‑1单克隆抗体及其药物合成物在患者中预防和/或治疗纤维化疾病，尤其是肺纤维化、肾纤维化或皮肤纤维化。还说明了施用此类单克隆抗体或其药物合成物来预防和/或治疗肺纤维化、肾纤维化或皮肤纤维化的方法。

Description

用于预防和治疗纤维化疾病的抗Claudin-1单克隆抗体

相关专利申请

本申请要求2019年11月12日提交的欧洲专利申请EP 19 208 560.3的优先权。所述欧洲专利申请通过本发明的整体引用，成为本发明的一部分。

背景技术

纤维化疾病的特征在于纤维结缔组织过度沉积(此过程称为纤维化)，可导致身体器官和组织的正常结构和功能出现进行性退化。纤维化的定义为组织或器官出现过度生长、硬化和/或瘢痕化。这是由于胞外基质(ECM)的组分(如胶原蛋白和纤连蛋白)在发炎或受损组织内或周围过度积累(Wynn等人，《自然医学》，2012年，18:1028-1040)，可导致永久性瘢痕、器官功能不全，最终死亡。纤维化是由各种刺激(包括持续性感染、遗传性障碍、自身免疫反应、过敏反应、化学损伤、辐射、组织损伤)诱导的许多慢性炎症反应的最终常见病理结果。几乎身体的每个器官或组织都可能发生纤维化，心脏、肺脏、肾脏、肝脏和皮肤更容易发生纤维化(Rockey等人，《新英格兰医学杂志》，2015年，372:1138-1149)，而胰腺、肠道、眼部(Wynn，《病理学杂志》，2008年，214:199-210)、神经系统(Kawano等人，《细胞和组织研究》，2012年，349:169-180)、纵隔(Parish和Rosenow，《呼吸与危重症医学研讨会》，2002年，23:135-143)、腹膜后腔(Caiafa等人，《放射影像学》，2013年，33:535-552)、关节和肌腱等其他组织或器官不容易发生纤维化。

与终末期癌症类似，人纤维化疾病的预后不良。这是全球发病率和死亡率日益增长的一个原因。由于纤维化是多个器官系统中各种疾病病理的一个主要特点，因此，据估计，在美国，纤维化疾病所导致的全因死亡率约占45％(Wynn，《自然综述-免疫学》，2004年，4:583-594)。与纤维化疾病相关的主要健康问题还是由于我们还不完全了解潜在发病机制、纤维化疾病病因和临床表现的异质性显著、缺乏适当且经充分验证的生物标志物，最重要的是，目前尚无有效的疾病修饰治疗剂。实际上，目前仅有两种专用于治疗纤维化疾病的药物近期获得批准。

考虑到全世界纤维化疾病患者的经济负担以及治疗手段的局限性，人们迫切需要采用新策略来预防和/或治疗纤维化。

发明内容

本发明涉及用于预防和/或治疗纤维化疾病(尤其是肾纤维化、肺纤维化和皮肤纤维化)的系统和策略。本发明具体涉及使用抗Claudin-1抗体预防和/或治疗肾纤维化、肺纤维化和皮肤纤维化。实际上，发明人已表明，在体内，抗Claudin-1单克隆抗体在肺脏、肾脏和皮肤中与其靶点特异性结合，无任何可检测毒性。此外，发明人使用最先进的小鼠模型(视为肺纤维化最重要的临床前模型)证明，所述抗Claudin-1单克隆抗体可在不影响总体生存期或体重的情况下预防肺纤维化的形成，并降低肺纤维化水平，无可检测的不良作用。发明人还表明，所述抗Claudin-1单克隆抗体与在肾癌和肺癌细胞上表达的Claudin-1结合，并逆转肺细胞中一种临床基因特征的纤维化相关不良预后。此外，发明人已表明，肺和肾纤维化中的Claudin-1表达与疾病相关。因此，在不同的肾纤维化、肺纤维化和炎症性肠病患者队列中，Claudin-1基因表达增加。在单侧输尿管梗阻(UUO)小鼠模型中，所述抗Claudin-1单克隆抗体对肾纤维化具有明显及高度显著的抗纤维化作用。所述抗Claudin-1mAb还可改善阿霉素诱导肾纤维化小鼠模型中的血清肌酐和BUN。此外，发明人发现了越来越多的证据，表明与肝脏相比，所述抗Claudin-1单克隆抗体在肾脏和肺脏中的抗纤维化作用涉及不同的机制。

因此，一方面，本发明提供了一种抗Claudin-1抗体或其生物活性片段，用于预防或治疗选自肺纤维化、肾纤维化和皮肤纤维化的一种纤维化疾病。

在某些实施例中，所述肺纤维化代表慢性肺病的终末期，而慢性肺病选自：特发性肺纤维化(IPF)、特发性非特异性间质性肺炎(NSIP)、隐源性机化性肺炎(COP)、Hamman-Rich综合征、淋巴细胞性间质性肺炎(LIP)、呼吸性细支气管炎伴间质性肺病、脱屑性间质性肺炎或特发性淋巴样间质性肺炎和特发性胸膜肺实质弹力纤维增生症。

在某些实施例中，所述肺纤维化由感染(如COVID19相关感染)引起。

在某些实施例中，所述肺纤维化与慢性阻塞性肺病相关。

在某些实施例中，所述纤维化疾病为肺纤维化，所述抗Claudin-1抗体或其生物活性片段与选自皮质类固醇、抗纤维化剂、吡非尼酮、尼达尼布和抗酸药物的至少一种治疗剂和/或与选自肺移植、高压氧疗法和肺康复的一种治疗程序联合施用。

在其他实施例中，所述肾纤维化为肾间质纤维化或肾小球硬化症。

在某些实施例中，所述肾纤维化与慢性肾病相关。

在某些实施例中，所述纤维化疾病为肾纤维化，所述抗Claudin-1抗体或其生物活性片段与选自抗高血压药、1,25-二羟基维生素D3、促红细胞生成素、血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素II受体拮抗剂AST-120和聚苯乙烯磺酸钙的至少一种治疗剂和/或与选自透析和肾移植的一种治疗程序联合施用。

在某些实施例中，所述皮肤纤维化与选自局限性硬皮病(硬斑病、线状硬皮病)、系统性硬皮病、移植物抗宿主病(GVHD)、肾源性纤维化皮肤病、混合性结缔组织病、硬皮病、硬化性黏液水肿、嗜酸性筋膜炎、着色芽生菌病、肥厚性瘢痕和瘢痕疙瘩的一种病症相关。在某些实施例中，所述皮肤纤维化由一种医疗干预(例如，放疗)、化学品的环境或职业接触(例如，在由L-色氨酸诱导的嗜酸粒细胞增多肌痛综合征中)；以及接触某些物理因子(物理创伤、手术损伤、皮肤热灼伤或冰灼伤)诱导。

在某些实施例中，所述纤维化疾病为皮肤纤维化，所述抗Claudin-1抗体或其生物活性片段与选自甲氨蝶呤、吗替麦考酚酯、环磷酰胺、环孢素、托珠单抗、利妥昔单抗和非苏木单抗的至少一种治疗剂和/或与一种治疗程序(例如，紫外线辐射)联合施用。

在某些实施例中，用于预防或治疗肺纤维化、肾纤维化或皮肤纤维化的所述抗Claudin-1抗体为单克隆抗体。

在某些实施例中，所述抗Claudin-1单克隆抗体的表位与2008年7月29日以登录号DSM ACC2931、DSM ACC2932、DSM ACC2933、DSM ACC2934、DSM ACC2935、DSM ACC2936、DSMACC2937和DSM ACC2938在DSMZ保藏的一种杂交瘤细胞系所分泌的单克隆抗体的表位相同。

在某些实施例中，所述表位强烈依赖Claudin-1第一胞外环中保守基序W(30)-GLW(51)-C(54)-C(64)的保守性。

在其他实施例中，所述抗Claudin-1抗体为单克隆抗体，由2008年7月29日以登录号DSM ACC2931、DSM ACC2932、DSM ACC2933、DSM ACC2934、DSM ACC2935、DSM ACC2936、DSMACC2937和DSM ACC2938在DSMZ保藏的一种杂交瘤细胞系分泌。

在其他实施例中，所述抗Claudin-1抗体为单克隆抗体，包含2008年7月29日以登录号DSM ACC2931、DSM ACC2932、DSM ACC2933、DSM ACC2934、DSM ACC2935、DSM ACC2936、DSM ACC2937和DSM ACC2938在DSMZ保藏的一种杂交瘤细胞系所分泌的单克隆抗体的六个互补决定区(CDR)。

在某些实施例中，用于预防或治疗肺纤维化、肾纤维化或皮肤纤维化的所述抗Claudin-1抗体为人源化抗体。

所述人源化抗Claudin-1抗体可为单克隆抗体，包含以登录号DSM ACC2938保藏的杂交瘤细胞系所分泌的单克隆抗体OM-7D3-B3的所有六个CDR，其中，OM-7D3-B3的可变重链包含氨基酸序列SEQ ID NO：1，OM-7D3-B3的可变轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO：2，所述人源化抗Claudin-1单克隆抗体进一步包含：

a)至少一个抗体可变重链(VH)，其中包含氨基酸序列SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5，或

b)至少一个抗体可变轻链(VL)，其中包含氨基酸序列SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8。

例如，所述人源化抗Claudin-1单克隆抗体可包含：

a)两个抗体可变重链(VH)，这两个可变重链均包含氨基酸序列SEQ ID NO：3、SEQID NO：4或SEQ ID NO：5，或

b)两个抗体可变轻链(VL)，这两个可变轻链均包含氨基酸序列SEQ ID NO：6、SEQID NO：7或SEQ ID NO：8。

例如，所述人源化抗Claudin-1单克隆抗体可包含：

1)两个抗体可变重链(VH)(包含氨基酸序列SEQ ID NO：3)以及两个抗体可变轻链(VL)(包含氨基酸序列SEQ ID NO：6[H3L3])；或

2)两个抗体可变重链(VH)(包含氨基酸序列SEQ ID NO：3)以及两个抗体可变轻链(VL)(包含氨基酸序列SEQ ID NO：7[H3L1])；或

3)两个抗体可变重链(VH)(包含氨基酸序列SEQ ID NO：3)以及两个抗体可变轻链(VL)(包含氨基酸序列SEQ ID NO：8[H3L2])；或

4)两个抗体可变重链(VH)(包含氨基酸序列SEQ ID NO：4)以及两个抗体可变轻链(VL)(包含氨基酸序列SEQ ID NO：6[H1L3])；或

5)两个抗体可变重链(VH)(包含氨基酸序列SEQ ID NO：4)以及两个抗体可变轻链(VL)(包含氨基酸序列SEQ ID NO：7[H1L1])；或

6)两个抗体可变重链(VH)(包含氨基酸序列SEQ ID NO：4)以及两个抗体可变轻链(VL)(包含氨基酸序列SEQ ID NO：8[H1L2])；或

7)两个抗体可变重链(VH)(包含氨基酸序列SEQ ID NO：5)以及两个抗体可变轻链(VL)(包含氨基酸序列SEQ ID NO：6[H2L3])；或

8)两个抗体可变重链(VH)(包含氨基酸序列SEQ ID NO：5)以及两个抗体可变轻链(VL)(包含氨基酸序列SEQ ID NO：7[H2L1])；或

9)两个抗体可变重链(VH)(包含氨基酸序列SEQ ID NO：5)以及两个抗体可变轻链(VL)(包含氨基酸序列SEQ ID NO：8[H2L2])。

在某些实施例中，所述人源化抗Claudin-1单克隆抗体为完整抗体，其同种型选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在某些实施例中，可对这些同种型进行工程化改造，从而提供附加特性，例如，减弱或增强Fc受体介导的相互作用，或减弱或增强抗体的半衰期和分布特性。

本发明还提供了一种药物合成物，包含有效量的抗Claudin-1抗体或其生物活性片段以及至少一种可药用载体或赋形剂，用于在受试者中预防或治疗选自肺纤维化、肾纤维化和皮肤纤维化的一种纤维化疾病。

在此类药物合成物的使用中，所述肺纤维化、肾纤维化和皮肤纤维化的定义如上；所述抗Claudin-1抗体或其生物活性片段的定义如上。

本发明进一步提供了一种在受试者中预防或治疗肺纤维化、肾纤维化或皮肤纤维化的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的抗Claudin-1抗体或其生物活性片段。在此类预防和/或治疗方法中，所述肺纤维化、肾纤维化和皮肤纤维化的定义如上；所述抗Claudin-1抗体或其生物活性片段的定义如上。

在阅读优选实施例的以下详细说明后，本发明的这些目的及其他目的、优势和特征对于本领域的普通技术人员来说显而易见。

附图说明

图1.抗CLDN1 mAb在小鼠体内的生物分布。向小鼠(n＝6/每组/时间点)注射500μgAlexa fluor 750对照mAb(灰条)或CLDN1特异性mAb(蓝条)，并在注射后(A)24小时或(B)48小时将其处死。使用包含特定滤光片组的IVIS Lumina 50设备，在每个指定器官中进行特异性荧光检测，并以平均效率的形式表示。横线表示均值。结果显示了6只小鼠的均值±均值标准误差。*p<0.05，**p<0.01(曼-惠特尼检验)。

图2.抗CLDN1 mAb在用于预防和早期治疗肺纤维化的最先进小鼠模型中显著减少肺纤维化。(A)预防和早期治疗研究设计。六周龄雌性C57BL/6J小鼠接受气管内博来霉素雾化(3mg/kg)，从而诱导肺纤维化，并随机接受运载体、CLDN1特异性mAb和地塞米松(阳性对照品)治疗21天。每组各包括18只小鼠。(B)与运载体组相比，在CLDN1 mAb组中，Ashcroft纤维化评分显著降低。以均值(三角形)、中位数(直线)、第一和第三四分位数(箱子底部和顶部)的形式表示数据。(C)对每个治疗组中的一个代表性小鼠肺脏进行马松三色染色。(D)Kaplan-Meier曲线表明，与运载体组相比，经地塞米松治疗小鼠的生存率显著降低。(E)在地塞米松组中，在实验期间观察到小鼠体重显著降低。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，N.S.＝无意义。

图3.抗CLDN1 mAb在用于后期治疗肺纤维化的最先进小鼠模型中减少肺纤维化。(A)后期治疗研究设计。六周龄雌性C57BL/6J小鼠接受气管内博来霉素雾化(3mg/kg)，从而诱导肺纤维化，并随机接受运载体、抗人CLDN1特异性mAb或尼达尼布(阳性对照品)治疗7-21天。每组各包括18只小鼠。(B)在CLDN1 mAb组中，肺羟脯氨酸含量显著降低。两个治疗组的体重无差异。以均值(三角形)、中位数(直线)、第一和第三四分位数(箱子的底部和顶部)的形式表示数据。(C)对每个治疗组中的一个代表性小鼠肺脏进行马松三色染色。(D)Kaplan-Meier曲线表明各组之间无差异。(E)在所有组中，在实验期间均未观察到小鼠体重显著降低。*p<0.05，N.S.＝无意义。

图4.靶向CLDN1(在肾RPTEC/TERT1和肺A549细胞系上表达)的人源化CLDN1特异性mAb的结合特性。如图所示，使用浓度渐增的人源化H3L3 CLDN1特异性mAb培养细胞。代表性直方图显示了每个特异性细胞系饱和点时人源化H3L3 CLDN1特异性mAb的结合情况：(A)RPTEC/TERT1(50μg/mL)以及(B)A549(20μg/mL)。在使用PE标记抗人抗体培养后，通过流式细胞术测量结合情况，并使用Cytoflex和FlowJo V10进行分析。通过使用PE平均荧光强度(MFI)，应用R 3.5.1中的Michaelis-Menten数学模型，分别确定(C)RPTEC/TERT1(50μg/mL)以及(D)A549(20μg/mL)细胞所表达的人源化H3L3CLDN1特异性mAb和CLDN1之间相互作用的结合常数K_d。图中显示了每个特异性细胞系饱和点时人源化H3L3 CLDN1特异性mAb的结合情况。

图5.CLDN1特异性MAb逆转PLS，并减少A549细胞中的TGF-β信号传导。(A)在进行或不进行TGF-β(5ng/mL)和CLDN1 mAb(20μg/mL)治疗24小时的情况下，培养A549细胞24小时。提取RNA，采用nCounter Nanostring技术测量PLS基因表达情况，并通过基因集合富集分析(GSEA)进行定量评估。热图显示：PLS状态为预后不良(橙色)或良好(绿色)；(底部)PLS预后不良或良好基因诱导(红色)或抑制(蓝色)的显著性。(B)相对基因表达值显示通过CLDN1特异性mAb治疗调控的两种预后不良、差异表达基因(SERPINB2和FMO1)的均值和均值标准误差(n＝3，倍数变化-1.7，****p值<0.0001)。NT：不治疗。(C)使用TGF-β信号传导报告基因质粒pGL4.48[luc2P/SBE/Hygro](Promega公司)对4549个细胞进行转染，并在37℃温度下，使用对照品或CLDN1特异性mAb(50μg/mL)处理3小时。在37℃温度下，使用含有TGF-β(10ng/mL)的培养基刺激细胞3小时。根据归一化至Mock样本的发光强度，计算倍数变化(显示均值和均值标准误差)(n＝6，CLND1 mAb n＝5，****p值<0.0001，**p值<0.01)。

图6.博来霉素诱导皮肤纤维化模型。剃出一个1.5×1.5cm的小鼠皮肤区域，每隔一天在四个角上经皮施用1.0mg/kg博来霉素(BLM)，持续4周。处死小鼠，对皮肤区域进行采样，从而进行胶原蛋白检测、组织学和生物化学分析。

图7.测试皮肤纤维化新治疗方法的研究设计。研究包括正常小鼠、博来霉素(BLM)+运载体(腹膜内给药)、BLM+伊马替尼(腹膜内给药)(50mg/kg)(作为阳性对照组)以及BLM+抗CLDN1特异性mAb。进行生物化学和组织病理学检测，并收集临床数据。

图8.皮肤厚度和皮肤纤维化定量。分别采用苏木精和伊红(HE)以及马松三色(MT)染色对皮肤厚度和皮肤纤维化进行定量。伊马替尼在减少皮肤厚度方面具有显著作用，并具有减少皮肤纤维化的趋势。

图9.CLDN1在纤维化肾病和肺病中过表达。(A)以信号强度值的形式显示膜性肾小球肾炎(MG)(左图，GSE11585)和纤维化肾组织(右图，GSE60685)患者的肾脏组织与健康肾脏中的CLDN1基因表达。(B)CLDN1表达与纤维化慢性肾病相关。患者队列(GSE115857，健康组织：n＝6，膜性肾小球肾炎(MG)：n＝11)、局灶性节段性肾小球硬化症(FSGS)(GSE129973，未受影响切片：n＝20，FSGS切片：n＝20)肾组织中的CLDN1表达。如示例8的“材料和方法”所述，对CLDN1 mRNA表达进行分析，并以信号强度值的形式显示。(C)左图：以信号强度值的形式显示IPF和不同病因肺纤维化患者的肺组织与健康肺组织(分别为GSE2052和GSE24988)中的CLDN1基因表达。尺度上的差异由不同类型的阵列和归一化方法导致，并不反映绝对表达水平。斯图登t检验，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。

图10.抗CLDN1 mAb靶向TNFα-NFκB调控的CLDN1表达，并通过干扰EMT编程来抑制肺成纤维细胞活化。(A-B)图中显示了表达肺成纤维细胞(A)和肾成纤维细胞(B)的α-SMA上人源化抗CLDN1 mAb的CLDN1表达和结合的代表性图像。对照mAb无结合，因此确认了染色的特异性。(C)分别使用TNFα(20ng/ml)、IKK-16(1μM)、TNFα+IKK16或运载体对照品(Mock)对肾成纤维细胞(左图)和肺成纤维细胞(右图)进行处理，并对抗CLDN1 mAb H3L3的结合情况进行荧光流式细胞分析。图中显示了每种条件下与肺成纤维细胞或肾成纤维细胞结合的抗CLDN1 mAb与对照mAb的ΔMFI(如示例6“材料和方法”部分所述，在每种条件下重复进行三次的三个实验的合并分析)。(D)图中显示了通过抗CLDN1 mAb与对照mAb对与肺成纤维细胞活化(左图)和IPF患者肺成纤维细胞中的EMT编程(HALLMARK_EPITHELIAL_MESENCHYMAL_TRANSITION)(右图)有关的基因进行调控的情况。热图显示了逆转的显著性(FDR)。(E)以读长计数的形式显示经抗CLDN1 mAb处理或经对照mAb处理的肺成纤维细胞中EMT标志物FN1(左图)、N-钙粘蛋白(中图)和SNAI2(右图)的RNA-Seq基因表达数据。箱形图表示中位数(-)、第一和第三四分位数(箱子的底部和顶部)以及单一数据点(●)。斯图登t检验。*p值<0.05，***p值<0.001，****p值<0.0001。

图11.PEC在鲍氏囊中的位置。鲍氏囊内衬壁层上皮细胞(PEC)(绿色)。在血管极处，PEC直接与足细胞(蓝色)(脏层足细胞)相连。具有不同表型或标记表达谱且在不同疾病状态下迁移或增殖增加的PEC为aPEC(红色)。近端肾小管上皮细胞以黄色显示。缩略语：PEC：壁层上皮细胞；aPEC：活化PEC。此图改编自Shankland等人，《肾脏病学与高血压新见》，2013年，22:302-309)。

图12.炎症应激下CLDN1表达的增加与PEC分化相关。(A-B)炎症应激诱导PEC分化和CLDN1过表达。使用TNFα对人肾上皮细胞(HREpic)进行处理，共处理6天。通过qRT-PCR分析基因表达情况。图中显示了从重复进行三次的两个独立实验中获得的均值+标准差(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001，T检验)。(C)在TNFα处理后，对CLDN1蛋白表达进行蛋白免疫印迹法分析。图中显示了两个实验中的一个代表性实验。(D)代表性直方图显示了人源化H3L3CLDN1特异性mAb在HREPic上的结合情况。在TNFα处理后24小时，通过流式细胞术评估结合情况。(E)CLDN1基因沉默减少了TNFα和胶原蛋白4A(COL4A)的表达。CLDN1基因沉默。使用靶向CLDN1表达的特异性siRNA(siCLDN1)或非靶向siRNA(siCTRL)，对HREpic细胞进行逆转导，并采用TNFα在转染后48小时进行处理。通过qRT-PCR分析基因表达情况。图中显示了从重复进行三次的一个实验中获得的均值+标准差(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001，T检验)。

图13.使用CLDN1特异性mAb进行处理，减少了PEC活化和增殖。(A)实验程序(参见示例7)。人肾上皮细胞(HREpic)以3D的形式生长，使用TNFα和莫维组单抗(CTRL)或H3L3(抗CL DN1 mAb)对其进行处理，共处理6天。(B)通过ATP定量，评估细胞增殖/活性。共进行四次实验。图中显示了一个实验。(C)CLDN1特异性mAb减少了TNFα表达和PEC活化。使用CLDN1特异性mAb(H3L3)或对照抗体(莫维组单抗)对HREpic细胞进行处理，共处理6天。通过qRT-PCR分析基因表达情况。图中显示了从重复进行三次的一个实验中获得的均值+标准差(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001，T检验)。

图14.(A)CLDN1表达与肺纤维化相关。患者队列(GSE2052，健康组织：n＝11，IPF组织：n＝13)、肺纤维化(GSE24988，健康组织：n＝11，纤维化组织：n＝129)肺组织中的CLDN1表达。如示例8的“材料和方法”所述，对CLDN1 mRNA表达进行分析，并以信号强度值的形式显示。(B)CLDN1表达与COVID-19肺病相关。对照健康患者(GSE2052，健康组织：n＝11)和COVID-19患者队列(GSE150316，n＝15)肺组织中的CLDN1表达。如示例8的“材料和方法”所述，对CLDN1 mRNA表达进行分析，并以信号强度值的形式显示。

图15.CLDN1表达与溃疡性结肠炎相关。患者队列IBD组织中的CLDN1表达。GSE9452(非炎症性粘膜：n＝18，炎症性粘膜：n＝8)；GSE38713(对照品：n＝13，缓解UC：n＝8，非粘膜UC：n＝7，粘膜UC：n＝15)和GSE38713(对照品：n＝8，CD：n＝11，UC：n＝5)。如示例8的“材料和方法”所述，对CLDN1 mRNA表达进行分析，并以信号强度值的形式显示。UC：溃疡性结肠炎，CD：克罗恩病。

图16.在单侧输尿管梗阻(UUO)模型中，CLDN1表达与纤维化慢性肾病相关。肾纤维化小鼠模型(UUO)中的CLDN1表达(GSE60685，健康组织：n＝12，纤维化组织：n＝13)。如示例8的“材料和方法”所述，对CLDN1 mRNA表达进行分析，并以信号强度值的形式显示。

图17.在UUO肾纤维化小鼠模型中，抗CLDN1 mAb对纤维发生的影响。研究方案：在第0天，在麻醉下对七周龄雌性C57BL/6J小鼠进行UUO手术。从第0天到第13天，施用人源化抗CLDN1 mAb(500μg/小鼠，腹膜内给药，每周两次，n＝8)、替米沙坦(30mg/kg，口服给药，每天一次，n＝8)或运载体对照品(n＝8)。

图18.使用运载体、抗CLDN1 mAb或替米沙坦(用作对照品)治疗13天后，单侧输尿管梗阻(UUO)小鼠(单侧输尿管梗阻诱导肾间质纤维化模型)的体重变化。参见示例9。

图19.(A)接受运载体、抗CLDN1 mAb或替米沙坦(用作对照品)治疗的UUO小鼠在处死时的体重；(B)右肾重量以及(C)左肾重量。参见示例9。

图20.生物化学。(A)接受运载体、抗CLDN1 mAb或替米沙坦(用作对照品)治疗的UUO小鼠的血浆尿素氮以及(B)肾羟脯氨酸。参见示例9。

图21.组织学分析。接受运载体、抗CLDN1 mAb或替米沙坦(用作对照品)治疗的UUO小鼠PAS肾脏切片的代表性显微照片。参见示例9。

图22.天狼星红染色肾脏。天狼星红染色肾脏切片的代表性显微照片以及显示接受运载体、抗CLDN1 mAb或替米沙坦(用作对照品)治疗的UUO小鼠肾脏切片纤维化面积的照片。参见示例9。

图23.F4/80免疫染色肾脏。接受运载体、抗CLDN1 mAb或替米沙坦(用作对照品)治疗的UUO小鼠F4/80免疫染色肾脏切片的代表性显微照片。参见示例9。

图24.人体组织染色揭示了人肾脏中的靶点结合情况：使用(A)抗CLDN1 mAb或(B)同种型对照品对健康人肾脏的冰冻切片进行染色，从而证明靶点结合情况。在鲍氏膜和足细胞(箭头)处观察到不同的染色情况。

图25.不同形式人肾脏纤维化病理的组织学评估。使用抗CLDN 1多克隆抗体对福尔马林固定组织切片进行染色，并与正常的健康肾脏进行比较。缩略语：ANCA(抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎)；FSGS(局灶性节段性肾小球硬化症)；CS(皮质类固醇)和CyA(环孢素A)。

图26.阿霉素诱导肾纤维化模型的血清肌酐和BUN数据(单位：mg/dl)(在SMC实验室进行)。向每组的八只阿霉素诱导肾病雄性BALB/c小鼠腹膜内施用运载体[盐水]、抗CLDNA 1 mAb(250μg/小鼠，每周两次)27天，或将VPA(＝丙戊酸，含0.4％丙戊酸的饮用水)用作对照品。

定义

在整个说明书中，使用并在以下段落中定义了多个术语。

在本发明中，术语“受试者”是指人类或另一种哺乳动物(例如，灵长类动物、狗、猫、山羊、马、猪、小鼠、大鼠、家兔等)，可能患上纤维化疾病，但不一定患有这种疾病。非人受试者可为转基因或以其他方式进行修饰的动物。在本发明的许多实施例中，所述受试者为人类。在此类实施例中，所述受试者通常被称为“个体”或“患者”。术语“个体”并不表示特定年龄，因此包括新生儿、儿童、青少年和成年人。更具体地说，术语“患者”是指患有某种疾病的个体。在本发明的实践中，患者通常确诊患有纤维化疾病。

在本发明中，术语“治疗”用于描述一种具有如下目的的方法或过程：(1)延迟或预防某种疾病或病症(在此为纤维化疾病)发作；(2)减缓或阻止所述疾病或病症的症状进展、加重或恶化；(3)使所述疾病或病症的症状得到改善；或(4)治愈所述疾病或病症。可在所述疾病或病症发作前进行治疗，从而实现预防作用。可替代地或此外，可在所述疾病或病症发作后进行治疗，从而实现治疗作用。

术语“纤维化疾病(fibrotic disease)”和“纤维化疾病(fibrotic disorder)”在本发明中可互换使用，具有相关领域所理解的含义，是指一种临床病症，特征在于，组织生长失调和破损健康组织瘢痕化，可导致几乎任何身体器官的正常功能受到破坏，包括心脏、肺脏、肾脏、肝脏和皮肤。

在本发明中，“药物合成物”被定义为包含有效量的至少一种抗Claudin-1抗体(或其生物活性片段)以及至少一种可药用载体或赋形剂。

在本发明中，术语“有效量”是指足以达到预定目的(例如，在细胞、组织、系统或受试者中产生预期生物或药物反应)的任何量的化合物、药剂、抗体或合成物。例如，在本发明的某些实施例中，所述目的可为：预防纤维化疾病发作；减缓、减轻或阻止所述纤维化疾病的症状进展、加重或恶化；使所述疾病的症状得到改善或治愈所述疾病。

术语“可药用载体或赋形剂”是指不会干扰活性成分的生物活性有效性且其给药浓度对宿主没有过度毒性的载体介质。此术语包括溶剂、分散介质、包衣、抗菌防霉剂、等渗剂、吸收延迟剂等。将此类介质和药剂用于药物活性物质在本领域众所周知(例如，参见“雷明顿药物科学”，E.W.Martin，第18版，1990年，马克出版公司：宾夕法尼亚州伊斯顿，所述参考文献通过本发明的整体引用，成为本发明的一部分)。

术语“人Claudin-1(或CLDN1)”是指具有NCBI登录号NP_066924所示序列的蛋白或在HCV受纳人群中很常见的任何天然变体。Claudin-1的术语“胞外结构域”或“胞外域”是指Claudin-1序列中延伸到胞外空间(即，细胞外的空间)的区域。

在本发明中，术语“抗体”是指包含与抗原进行免疫特异性结合的抗原结合位点的任何免疫球蛋白。因此，术语“抗体”不仅包括整个抗体分子，而且包括抗体片段以及抗体和抗体片段的变体(包括衍生物)，只要所述衍生物和片段保持特异性结合能力即可。此术语包括单克隆抗体和多克隆抗体。此术语还包括其结合结构域与免疫球蛋白结合结构域同源或很大程度上同源的任何蛋白。这些蛋白可来自天然来源，或部分或全部通过合成产生。

当涉及抗体时，术语“特异性结合”是指抗体与预定抗原结合。一般而言，所述抗体的结合亲和力至少为1×10⁷M^-1，与预定抗原的结合亲和力至少是与非特异性抗原(例如，BSA、酪蛋白)结合亲和力的两倍。

在本发明中，术语“人源化抗体”是指一种包含非人类高变区氨基酸残基和人类构架区(FR)氨基酸残基的嵌合抗体。特别是，人源化抗体包含以下所有或基本所有组分：至少一个、通常两个可变结构域，其中，所有或基本所有互补决定区(CDR)均为人抗体的互补决定区。人源化抗体可选包含源自人抗体的至少一部分抗体恒定区。抗体(例如，非人抗体)的“人源化形式”是指进行人源化的抗体。

当涉及蛋白或多肽时，术语“分离”是指由于来源或操作，蛋白或多肽与其天然结合或在最初获得时其所结合的至少某些组分分离。可替代性地或此外，通过“分离”，这意味着通过人工产生或合成目标蛋白或多肽。

术语“蛋白”、“多肽”和“肽”在本发明中可互换使用，是指各种长度、采用其中性(不带电)形式或盐形式、未经修饰或经糖基化、侧链氧化或磷酸化修饰的氨基酸序列。在某些实施例中，所述氨基酸序列为全长天然蛋白。在其他实施例中，所述氨基酸序列为全长蛋白的一个小片段。在其他实施例中，通过连接至氨基酸侧链的其他取代基(如糖基单位、脂质或无机离子(如磷酸盐))以及与链的化学转换有关的修饰(如巯基氧化)，对所述氨基酸序列进行修饰。因此，术语“蛋白”(或其对等术语)旨在包括全长天然蛋白的氨基酸序列或其片段，会进行一些修饰，但不会显著改变其特异性。特别是，术语“蛋白”包括蛋白异构体，即，由相同基因编码但其pI和/或MW不同的变体。此类异构体的氨基酸序列可能不同(例如，由于等位基因变异、可变剪接或有限蛋白水解)，或可替代地，可通过差异翻译后修饰(例如，糖基化、酰化、磷酸化)产生。

当涉及蛋白时，术语“类似物”是指一种多肽，其功能与蛋白相似或相同，但其氨基酸序列不一定与蛋白的氨基酸序列相似或相同，其结构也不一定与蛋白的结构相似或相同。优选地，在本发明的背景下，蛋白类似物的氨基酸序列至少与蛋白的氨基酸序列30％相同，更优选地，至少35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％相同。

当涉及蛋白时，术语“片段”和术语“部分”是指一种多肽，其氨基酸序列包含蛋白氨基酸序列的至少5个保守氨基酸残基(优选地，至少约：10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、250个或更多保守氨基酸残基)。蛋白片段可能具有或可能不具有蛋白的功能活性。

术语“生物活性”在本发明中用于描述蛋白变体、类似物或片段，是指分子与蛋白具有充分的氨基酸序列同一性或同源性，从而具有与蛋白相似或相同的特性。例如，在本发明的许多实施例中，抗Claudin-1抗体的生物活性片段为保留整个抗体抗原结合能力的一个片段。

在本发明中，术语“同源”(或“同源性”)与术语“同一性”是同义词，是指两个多肽分子之间或两个核酸分子之间的序列相似性。当两个比较序列中的一个位置被相同碱基或相同氨基酸残基占据时，相应分子在此位置同源。两个序列之间的同源性百分比对应于两个序列共享的匹配或同源位置数量除以比较位置数量再乘以100。一般而言，当比对两个序列，以提供最大同源性时，进行比较。同源氨基酸序列具有相同或相似的氨基酸序列。相似残基是参考序列中相应氨基酸残基的保守取代或“允许点突变”。参考序列中残基的“保守取代”是在物理上或功能上与相应参考残基相似的取代，例如，大小、形状、电荷、化学特性相似，包括形成共价键或氢键的能力等。特别优选的保守取代满足Dayhoff等人针对“可接受点突变”所定义的标准(“蛋白质序列和结构图谱”，1978年，国家生物医学研究基金会，(华盛顿特区)，增刊3，22:354-352)。

术语“标记”、“使用可检测药剂标记”和“使用可检测基团标记”在本发明中可互换使用。这些术语用于说明一个实体(例如，抗体)在与另一个实体(例如，抗原)结合后被可视化。优选地，选择一种可检测药剂或基团，使其生成可测量且其强度与所结合实体数量有关的信号。蛋白和多肽(包括抗体)的标记方法在本领域众所周知。可添加或偶联到通过光谱学、光化学、生物化学、免疫化学、电气、光学或化学手段或任何其他适当的手段直接或间接可检测的标记，从而制备标记多肽。适当的可检测药剂包括但不限于各种配体、放射性核素、荧光染料、化学发光剂、微粒、酶、比色标记、磁性标记和半抗原。

除非另有说明，或从上下文中可以看出，否则，当涉及某个数字时，术语“大约”和“约”通常包括在所述数字±10％范围内的数字(大于或小于所述数字)(除非此类数字将超过可能值的100％)。

具体实施方式

如上所述，本发明涉及使用抗Claudin-1抗体预防和/或治疗纤维化疾病。特别是，本发明涉及使用抗Claudin-1抗体预防和/或治疗肺纤维化、肾纤维化和皮肤纤维化。

I–抗Claudin-1抗体

发明人之前已研发出靶向人Claudin-1的单克隆抗体，并证明这些单克隆抗体可在体内治愈HCV感染，且无可检测的不良作用(参见EP 08 305 597和WO 2010/034812)。然后，发明人表明，抗Claudin-1单克隆抗体会干扰干细胞信号传导，并在基于肝细胞的模型系统中逆转源自患者的肝细胞癌(HCC)风险特征，使其适用于预防和/或治疗各种病因的肝细胞癌(HCC)(参见EP 15 159 872和WO 2016/146809)。发明人目前已证明，抗Claudin-1抗体可用于预防或治疗纤维化疾病，尤其是肺纤维化，如特发性肺纤维化(IPF)。

在本发明实践中可使用的抗Claudin-1抗体包括靶向Claudin 1的任何抗体。在本发明实践中可使用的抗Claudin-1抗体示例特别包括由发明人研发的多克隆和单克隆抗CLDN1抗体(参见EP 08 305 597和WO 2010/034812，Fofana等人，《胃肠病学》，2010年，139(3):953-64，964.e1-4)。如这些文件所述，通过基因免疫产生八种单克隆抗体，其靶向Claudin 1的胞外结构域，因此可有效抑制HCV感染。所述单克隆抗Claudin-1抗体被称为OM-4A4-D4、OM-7C8-A8、OM-6D9-A6、OM-7D4-C1、OM-6E1-B5、OM-3E5-B6、OM-8A9-A3和OM-7D3-B3。因此，适用于本发明实践的抗Claudin-1抗体包括2008年7月29日以登录号DSMACC2931、DSM ACC2932、DSM ACC2933、DSM ACC2934、DSM ACC2935、DSM ACC2936、DSMACC2937和DSM ACC2938由INSERM和GENOVAC在DSMZ(德国微生物菌种保藏中心，地址：Inhoffenstraβe 7B,38124Braunschweig,Germany)保藏的任何一种杂交瘤细胞系所分泌的单克隆抗体(如EP 08 302 597和WO 2010/034812所述)。

适用于本发明实践的其他抗Claudin-1抗体包括表位与上文所列任何一种杂交瘤细胞系所分泌的抗Claudin-1单克隆抗体相同的单克隆抗体。在某些实施例中，所述表位强烈依赖Claudin-1第一胞外环中保守基序W(30)-GLW(51)-C(54)-C(64)的保守性(参见EP08 305 597和WO 2010/034812)。

适当抗Claudin-1抗体的其他示例包括以下参考文献中所公开的抗体：第EP 1167 389号欧洲专利、第6,627,439号美国专利、第WO 2014/132307号国际专利申请、第WO2015/014659号和第WO 2015/014357号国际专利申请以及Yamashita等人，《药理学与实验治疗学杂志》，2015年，353(1):112-118。

适用于本发明的抗Claudin-1抗体可为多克隆抗体或单克隆抗体。

还可通过本领域已知的任何其他适当方法来制备所述抗Claudin-1抗体，而不是将上述杂交瘤细胞用作抗体来源。例如，可通过重组DNA方法来制备抗Claudin-1单克隆抗体。这些方法通常包括分离对所需抗体进行编码的基因、将基因转移至适当载体中并在细胞培养系统中大量表达。使用常规程序(例如，使用能够与对小鼠抗体重链和轻链进行编码的基因进行特异性结合的寡核苷酸探针)，很容易分离对所需单克隆抗体进行编码的基因或DNA，并对其进行测序。杂交瘤细胞系可作为此类DNA的优选来源。适用于以重组方式产生抗体的宿主细胞包括但不限于适当的哺乳动物宿主细胞，如CHO、HeLa或CV1。适当的表达质粒包括但不限于pcDNA3.1 Zeo、pIND(SP1)、pREP8(可从英杰公司(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)购买获得)等。所述抗体基因可通过MLV载体、牛痘病毒载体等病毒或逆转录病毒载体进行表达。可通过标准方法，使细胞在适当的培养基(例如，DMEM和RPMI-1640培养基)中生长。所述抗Claudin-1抗体可以单链抗体的形式表达。可通过标准方法对以重组方式产生的抗体进行分离和纯化。例如，可通过蛋白A纯化、硫酸铵或乙醇沉淀、酸萃取、阴离子或阳离子交换色谱法、磷酸纤维素色谱法、疏水作用色谱法、亲和色谱法(如蛋白A)、羟基磷灰石色谱法、凝集素色谱法或这些方法的任何适当组合，从细胞培养物中回收并纯化抗Claudin-1单克隆抗体。高效液相色谱法(HPLC)也可用于纯化。

可替代地，可从商业来源获得本发明所述的抗Claudin-1抗体。

在某些实施例中，使用天然形式的抗Claudin-1抗体。在其他实施例中，将所述抗体截短(例如，通过酶切或其他适当方法)，从而提供免疫球蛋白片段或部分，尤其是生物活性片段或部分。抗Claudin-1抗体的生物活性片段或部分包括保留抗体与整个抗体的抗原结合(尤其是与Claudin-1的胞外结构域结合)的能力的片段或部分。

抗Claudin-1抗体的生物活性片段或部分可为抗体(例如，包含抗Claudin-1单克隆抗体所有6个CDR的抗体)的Fab片段或部分、F(ab’)₂片段或部分、可变结构域或一个或多个CDR(互补决定区)。可替代地，抗Claudin-1抗体的生物活性片段或部分可源自抗体蛋白的羧基部分或末端，并包含一个Fc片段、一个Fd片段或一个Fv片段。

可通过本领域已知的任何适当方法来产生本发明所述的抗Claudin-1抗体片段，包括但不限于酶切(例如，完整抗体的蛋白水解)、合成或重组技术。例如，F(ab')₂、Fab、Fv和ScFv(单链Fv)抗体片段可在哺乳动物宿主细胞或大肠杆菌中表达，并由其分泌。也可使用抗体基因，以各种截短形式产生抗体，其中，已将一个或多个终止密码子引入天然终止位点的上游。可通过常规技术以化学方式将抗体的各个部分连接在一起，或采用基因工程化改造技术以连续蛋白的形式进行制备。

可采用修饰的形式产生本发明所述的抗Claudin-1抗体(或其生物活性片段)，如融合蛋白(即，与多肽实体连接的免疫球蛋白分子或其片段)。优选地，所述融合蛋白保留了抗体的生物活性。可选择与抗Claudin-1抗体或其生物活性片段融合的多肽实体，使所得融合蛋白具有任何有利特性。例如，可选择所述多肽实体，使重组融合蛋白的表达增加。可替代地或此外，例如，通过在亲和色谱法中作为配体，所述多肽实体可促进融合蛋白纯化。可向重组蛋白中添加一个蛋白酶切位点，从而在纯化后，从所述多肽实体中最终分离所需序列。当目标为稳定性时，还可选择所述多肽实体，从而提高融合蛋白的稳定性。适当多肽实体的示例包括多组氨酸标签，因此可在镍螯合柱上轻松纯化所得融合蛋白。适当多肽实体的其他示例包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、麦芽糖B结合蛋白或蛋白A。

可对本发明所述的抗Claudin-1抗体重新进行工程化改造，从而优化稳定性、溶解度、体内半衰期或与其他靶点的结合能力。可改变任何或所有这些特性的基因工程化改造方法以及化学方法在本领域众所周知。例如，已知抗体恒定区的添加、删除和/或修饰均在治疗所用抗体的生物利用度、分布和半衰期方面发挥着特别重要的作用。抗体类别或子类由抗体的Fc或恒定区(介导效应子功能)决定，如存在，可提供重要的附加特性。

通过本领域众所周知的DNA改组技术，可生成本发明的其他融合蛋白(例如，参见第5,605,793号、第5,811,238号、第5,830,721号、第5,834,252号和第5,837,458号美国专利)。

本发明所述的抗Claudin-1抗体还可为“人源化”抗体：可通过各个残基的定点诱变或通过整个区域的移植或化学合成来取代与人类序列中的残基不同的残基，从而使啮齿动物动物抗体和人类序列之间的序列差异最小化。还可通过重组方法产生人源化抗体。在抗体的人源化形式中，CDR区之外的一些、大多数或所有氨基酸被人免疫球蛋白分子中的氨基酸取代，而一个或多个CDR区内的一些、大多数或所有氨基酸未发生变化。只要不显著改变所得抗体的生物活性，即可对氨基酸进行少量的添加、删除、插入、取代或修饰操作。适当的人“取代”免疫球蛋白分子包括IgG1、IgG2、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgD或IgE分子或其片段。可替代地，可通过突变(去免疫化作用)对啮齿动物抗体中存在的T细胞表位进行修饰，从而产生在人类中可用于治疗目的的非免疫原性啮齿动物抗体(参见网页：accurobio.com)。

在某些实施例中，本发明所述的人源化抗Claudin-1抗体为发明人之前在EP 16305 317和WO 2017/162678中描述的抗体。此类人源化抗Claudin-1单克隆抗体包含以登录号DSM ACC2938保藏的杂交瘤细胞系所分泌(见上文)的大鼠单克隆抗体OM-7D3-B3的所有CDR，其中，OM-7D3-B3的可变重链包含氨基酸序列SEQ ID NO：1，OM-7D3-B3的可变轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO：2，所述人源化抗体进一步包含：

a)至少一个抗体可变重链(VH)，其中包含氨基酸序列SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5，或

b)至少一个抗体可变轻链(VL)，其中包含氨基酸序列SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8，

其中，SEQ ID NO：1(OM-7D3-B3的可变重链)为以下核酸序列，其中，所述CDR以粗体和下划线显示：

其中，SEQ ID NO：2(OM-7D3-B3的可变轻链)为以下核酸序列，其中，所述CDR以粗体和下划线显示：

其中，SEQ ID NO：3为人源化可变重链H3的序列：

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCLGSGFSFSSYGMNWVRQAPGKGLEWVASISPSGSYFYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMTSLRAEDTAIYYCARLPGFNPPFDHWGQGTLVTVSS，

其中，SEQ ID NO：4为人源化可变重链H2的序列：

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSSYGMNWVRQAPGKGLEWVTSISPSGSYFYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARLPGFNPPFDHWGQGTLVTVSS，

其中，SEQ ID NO：5为人源化可变重链H1的序列：

EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFSFSSYGMNWVRQAPGKGLEWVSSISPSGSYFYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLPGFNPPFDHWGQGTLVTVSS，

其中，SEQ ID NO：6为人源化可变轻链L3的序列：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGGNVDWYQWKPGKAPKLLIYGASNRYTGVPDRFRGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLQYKNNPWTFGGGTKVEIK，

其中，SEQ ID NO：7为人源化可变轻链L2的序列：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGGNVDWYQWKPGKAPKLLIYGASNRYTGVPSRFRGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLQYKNNPWTFGQGTKVEIK，以及

其中，SEQ ID NO：8为人源化可变轻链L1的序列：

DIQMTQSPATLSVSPGERATLSCKASQNVGGNVDWYQWKPGQAPRLLIYGASNRYTGIPARFRGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCLQYKNNPWTFGQGTKVEIK。

例如，此类人源化抗Claudin-1单克隆抗体可包含：

a)两个抗体可变重链(VH)，这两个可变重链均包含氨基酸序列SEQ ID NO：3、SEQID NO：4或SEQ ID NO：5，或

b)两个抗体可变轻链(VL)，这两个可变轻链均包含氨基酸序列SEQ ID NO：6、SEQID NO：7或SEQ ID NO：8。

例如，此类人源化抗Claudin-1单克隆抗体可包含：

1)两个抗体可变重链(VH)(包含氨基酸序列SEQ ID NO：3)以及两个抗体可变轻链(VL)(包含氨基酸序列SEQ ID NO：6[H3L3])；或

2)两个抗体可变重链(VH)(包含氨基酸序列SEQ ID NO：3)以及两个抗体可变轻链(VL)(包含氨基酸序列SEQ ID NO：7[H3L1])；或

3)两个抗体可变重链(VH)(包含氨基酸序列SEQ ID NO：3)以及两个抗体可变轻链(VL)(包含氨基酸序列SEQ ID NO：8[H3L2])；或

4)两个抗体可变重链(VH)(包含氨基酸序列SEQ ID NO：4)以及两个抗体可变轻链(VL)(包含氨基酸序列SEQ ID NO：6[H1L3])；或

5)两个抗体可变重链(VH)(包含氨基酸序列SEQ ID NO：4)以及两个抗体可变轻链(VL)(包含氨基酸序列SEQ ID NO：7[H1L1])；或

6)两个抗体可变重链(VH)(包含氨基酸序列SEQ ID NO：4)以及两个抗体可变轻链(VL)(包含氨基酸序列SEQ ID NO：8[H1L2])；或

7)两个抗体可变重链(VH)(包含氨基酸序列SEQ ID NO：5)以及两个抗体可变轻链(VL)(包含氨基酸序列SEQ ID NO：6[H2L3])；或

8)两个抗体可变重链(VH)(包含氨基酸序列SEQ ID NO：5)以及两个抗体可变轻链(VL)(包含氨基酸序列SEQ ID NO：7[H2L1])；或

9)两个抗体可变重链(VH)(包含氨基酸序列SEQ ID NO：5)以及两个抗体可变轻链(VL)(包含氨基酸序列SEQ ID NO：8[H2L2])。

所述人源化抗Claudin-1抗体可为完整的单克隆抗体，其同种型选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。可替代地，所述人源化抗Claudin-1抗体可为选自Fv、Fab、F(ab')2、Fab'、dsFv、scFv、sc(Fv)2和双体的单克隆抗体片段。

本发明所述的抗Claudin-1抗体(或其生物活性变体或片段)可与一个或多个其他分子实体进行功能连接(例如，通过化学偶联、基因融合、非共价结合或其他方式)。此类修饰抗体(或偶联抗体)的制备方法在本领域众所周知(例如，参见“亲和技术。酶纯化：B部分”，《酶学方法》，1974年，第34卷，Jakoby和Wilneck(编辑)，学术出版社：纽约州纽约；以及Wilchek和Bayer，《分析生物化学》，1988年，171:1-32)。优选地，分子实体附着于抗体分子上不会干扰所得偶联物结合特性的位置，例如，不参与抗体与其靶点特异性结合的位置。

所述抗体分子和分子实体之间可进行共价连接或直接连接。或者，可替代地，所述抗体分子和分子实体之间可通过连接基团进行共价连接。这可使用本领域众所周知的任何稳定双功能剂(包括同功能和异功能连接物)来完成。

在某些实施例中，将本发明所述的抗Claudin-1抗体(或其生物活性片段)与可检测药剂偶联。可使用任何可检测药剂，包括但不限于各种配体、放射性核素(例如，³H、¹²⁵I、¹³¹I等)、荧光染料(例如，异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛和荧光胺)、化学发光剂(例如，荧光素、荧光素酶和水母发光蛋白)、微粒(例如，量子点、纳米晶体、磷光体等)、酶(例如，在ELISA中使用的酶，即辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)、比色标记、磁性标记和生物素、地高辛或其他半抗原和蛋白(抗血清或单克隆抗体可用)。

可与本发明所述抗Claudin-1抗体(或其生物活性片段)偶联的其他分子实体包括但不限于直链或支链亲水聚合基团、脂肪酸基团或脂肪酯基团。

因此，在本发明的实践中，可以全长抗体、其生物活性变体或片段、嵌合抗体、人源化抗体和抗体衍生分子的形式使用抗Claudin-1抗体，所述抗体衍生分子包含抗Claudin-1抗体重链或轻链可变区中的至少一个互补决定区(CDR)，包括以下分子：Fab片段、F(ab’)₂片段、Fd片段、Fabc片段、Sc抗体(单链抗体)、双体、单独抗体轻单链、单独抗体重链、抗体链和其他分子之间的嵌合融合体以及抗体偶联物(如与治疗剂或可检测药剂偶联的抗体)。优选地，本发明所述的抗Claudin-1抗体相关分子保留抗体与其抗原(尤其是Claudin-1的胞外结构域)结合的能力。

本领域的技术人员应理解，在本发明的实践中，可使用靶向Claudin-1的其他化合物，包括但不限于小分子和siRNA。

II-治疗和/或预防纤维化疾病

A.适应症

发明人已表明，抗Claudin-1抗体特异性靶向肺脏、肾脏和皮肤，在最先进的特发性肺纤维化(IPF)模型中，能够预防和治疗肺纤维化，且无任何明显的不良作用。因此，可在预防和/或治疗肺纤维化、肾纤维化和皮肤纤维化的方法中使用上述定义的抗Claudin-1抗体或其生物活性片段。

可使用抗Claudin-1抗体或其生物活性片段或包含此类抗体或片段的药物合成物来实现本发明的治疗方法(参见下文)。这些方法通常包括向有需要的受试者(即，确诊患有肺纤维化、肾纤维化或皮肤纤维化的患者)施用有效量的抗Claudin-1抗体、其生物活性片段或其药物合成物。可通过本领域的技术人员已知的任何给药方法进行给药(参见下文)。

肺纤维化。术语“肺纤维化(lung fibrosis)”和“肺纤维化(pulmonaryfibrosis)”在本发明中可互换使用，是指许多已知或未知病因的病症，它们会导致间质性肺损伤，然后导致纤维化，最终丧失肺弹性。这些病症会导致持续咳嗽、胸痛、呼吸困难和疲劳等症状。

可根据本发明所述的方法进行治疗的肺纤维化可由任何因素导致，包括但不限于长期接触某些毒素(例如，硅尘、石棉纤维、硬金属粉尘、煤尘、谷尘、鸟类和动物粪便)；某些病症(例如，皮肌炎、多发性肌炎、混合性结缔组织病、全身性红斑狼疮、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病和肺炎)；放疗(例如，用于治疗肺癌或乳腺癌)；以及某些药物(例如，化疗药物(如甲氨蝶呤和环磷酰胺)、心脏药物(如胺碘酮)；某些抗生素(如呋喃妥因和乙胺丁醇)；以及抗炎药(如利妥昔单抗和柳氮磺胺吡啶))。

在某些实施例中，可根据本发明所述的方法进行治疗的肺纤维化可能没有明确的潜在病因。那么，将使用术语“特发性肺纤维化”。

在某些实施例中，使用本发明所述的治疗方法进行治疗的所述肺纤维化选自：特发性肺纤维化(IPF)、特发性非特异性间质性肺炎(NSIP)、隐源性机化性肺炎(COP)、Hamman-Rich综合征(也称为急性间质性肺炎)、淋巴细胞性间质性肺炎(LIP)、呼吸性细支气管炎伴间质性肺病、脱屑性间质性肺炎或特发性淋巴样间质性肺炎和特发性胸膜肺实质弹力纤维增生症。

在某些优选实施例中，所述肺纤维化为特发性肺纤维化。

在某些实施例中，所述肺纤维化与慢性阻塞性肺病相关。慢性阻塞性肺病(COPD)是一种进行性呼吸疾病，特征在于气道阻塞、长期呼吸问题和气流不良。

在某些实施例中，所述肺纤维化由感染(如COVID19相关纤维化)引起。

向肺纤维化患者施用抗Claudin-1抗体或其药物合成物，可减缓、减少、阻止或减轻疾病的进展，尤其是并发症(如肺性高血压、右侧心力衰竭、呼吸衰竭、肺癌或其他肺部并发症，如肺部血块、肺部萎陷或肺部感染)的发生。

可替代地或此外，向肺纤维化患者施用抗Claudin-1抗体或其药物合成物，可使所述个体的至少一种症状(包括但不限于干咳、气短、疲劳、肌肉疼痛、关节疼痛和体重减轻)得到改善。

可替代地或此外，向肺纤维化患者施用抗Claudin-1抗体或其药物合成物，有助于避免或至少延迟肺移植。

在某些实施例中，向具有肺纤维化风险的受试者施用本发明所述的方法，例如，接触已知与肺纤维化相关的某些毒素的人、接受放疗的人或使用某些药物进行治疗的人。施用抗Claudin-1抗体或其药物合成物可预防疾病发生或在极早期预防疾病进展。

通过本领域的任何已知检测和测试(用于诊断影响患者的肺纤维化)，对本发明所述治疗的作用进行监测。此类检测和测试包括但不限于成像测试(如胸部X光检查、计算机断层扫描(CT)和超声心动图)；肺功能测试(如肺功能检查(例如，肺量测定法)、脉搏血氧仪、运动应激测试和动脉血气测试)；或支气管镜活检或手术活检。

在本发明所述肺纤维化预防或治疗方法的某些实施例中，单独施用抗Claudin-1抗体(或其生物活性片段)或其药物合成物。在其他实施例中，抗Claudin-1抗体(或其生物活性片段)或其药物合成物与至少一种其他治疗剂和/或治疗程序联合施用。可在施用所述治疗剂或治疗程序之前、施用所述治疗剂或治疗程序时和/或施用所述治疗剂或治疗程序之后，施用所述抗Claudin-1抗体(或其生物活性片段)或其药物合成物。

可与抗Claudin-1抗体(或其生物活性片段)或其药物合成物联合施用的治疗剂可选自本领域已知会在肺纤维化治疗或管理方面产生有利作用的各种生物活性化合物。此类治疗剂的示例包括但不限于免疫抑制剂(如皮质类固醇)、抗纤维化剂(如环孢素或秋水仙碱)、经美国食品药品监督管理局(FDA)批准的新药(如吡非尼酮

和尼达尼布

)；以及治疗胃食管返流病(GERD)(一种消化疾病，常见于特发性肺纤维化患者)的抗酸药物。治疗程序的示例包括但不限于氧疗法(使呼吸和运动更容易，预防或减少由血氧水平低而引起的并发症，降低心脏右侧的血压，并改善睡眠和幸福感)；肺康复(有助于管理症状，并通过提高身体忍耐力和肺效率来改善日常功能)；以及肺移植(提高生活质量，延长患者寿命)。

因此，在某些实施例中，本发明所述的肺纤维化治疗方法与选自皮质类固醇、环孢素、秋水仙碱、吡非尼酮、尼达尼布以及抗酸药物(用于治疗胃食管返流病(GERD))的一种治疗剂联合施用。可替代地或此外，本发明所述的肺纤维化治疗方法与选自肺移植、高压氧疗法和肺康复的一种治疗程序联合施用。

还考虑在预防和/或治疗纵隔纤维化的方法中使用上述定义的抗Claudin-1抗体或其生物活性片段。纵隔纤维化(或纤维性纵隔炎)是一种病症，特征在于钙化纤维化，会影响肺间区域(纵隔)，其中包含心脏、大血管、气管、食管和淋巴结。

肾纤维化。术语“肾纤维化(kidney fibrosis)”和“肾纤维化(renal fibrosis)”在本发明中可互换使用。无论潜在病因如何，肾纤维化均为慢性肾病的标志。肾纤维化的病理所见特征在于进行性组织瘢痕，包括肾小球硬化症、肾小管间质纤维化和肾实质丧失(包括肾小管萎缩、毛细血管和足细胞丧失)。所有肾病均伴有肾纤维化，这是一种进行性过程，最终会导致终末期肾衰竭(ESRD)(一种需要透析或肾移植的毁灭性疾病)。肾功能慢性恶化很大程度上取决于肾纤维化程度，因此，人们认为，抑制纤维化进展，即可抑制慢性肾衰竭的发生。术语“慢性肾衰竭”是指肾功能不可逆地逐渐恶化且无法维持生命体稳态的一种状态。

可根据本发明所述的方法进行治疗的肾纤维化可由任何因素导致，包括但不限于某些病症(肾病，如肾小球疾病(例如，肾小球硬化症、肾小球肾炎)、慢性肾功能不全、急性肾损伤、高血压、多囊性肾病、膀胱输尿管反流、肾盂肾炎(复发性肾感染)和自身免疫性疾病(如糖尿病))；某些医疗干预(如肾切除术，一种有时对肾癌患者进行并且可能影响剩余肾脏功能的治疗程序；肾衰竭后透析；以及置管)；以及某些药物(化疗和免疫抑制疗法，对肾脏产生有害效应，在大多数情况下会导致肾纤维化；长期使用锂和非甾体抗炎药)。

在某些实施例中，使用本发明所述的治疗方法进行治疗的肾纤维化选自肾间质纤维化和肾小球硬化症。

向肾纤维化患者施用抗Claudin-1抗体或其药物合成物可减缓、减少、阻止或减轻疾病的进展，尤其是并发症(如体液潴留，包括肺水肿；高钾血症(血液中钾的含量突然升高)；心血管疾病；免疫应答减少；心包炎；以及终末期肾病)的发生。

可替代地或此外，向肾纤维化患者施用抗Claudin-1抗体或其药物合成物，可使所述个体的至少一种症状(包括但不限于恶心、呕吐、食欲不振、疲劳和虚弱、肌肉痉挛、体液潴留(浮肿或肿胀)、胸痛、气短和高血压)得到改善。

可替代地或此外，向肾纤维化患者施用抗Claudin-1抗体或其药物合成物，有助于避免或至少延迟透析或肾移植。

通过本领域的任何已知检测和测试(用于诊断影响患者的肾纤维化)，对本发明所述治疗的作用进行监测。此类检测和测试包括但不限于成像测试(如超声波)；血检(测定肌酐和尿素水平)；尿检和活检。

在某些实施例中，单独施用抗Claudin-1抗体(或其生物活性片段)或其药物合成物。在其他实施例中，抗Claudin-1抗体(或其生物活性片段)或其药物合成物与至少一种其他治疗剂和/或治疗程序联合施用。可在施用所述治疗剂或治疗程序之前、施用所述治疗剂或治疗程序时和/或施用所述治疗剂或治疗程序之后，施用所述抗Claudin-1抗体(或其生物活性片段)或其药物合成物。

可与抗Claudin-1抗体(或其生物活性片段)或其药物合成物联合施用的治疗剂可选自本领域已知会在肾纤维化治疗或管理方面产生有利作用的各种生物活性化合物。此类治疗剂的示例包括但不限于抗高血压药(为了减轻肾小球负担)；补充1,25-二羟基维生素D3或促红细胞生成素(由肾脏分泌)；血管紧张素转换酶抑制剂(如卡托普利、依那普利、地拉普利、咪达普利、喹那普利、替莫普利、培哚普利叔丁胺盐和赖诺普利)和血管紧张素II受体拮抗剂(如氯沙坦、缬沙坦、坎地沙坦西酯、替米沙坦、奥美沙坦酯和厄贝沙坦)(除通过降低肾小球血压抑制肾衰竭进展之外，已知其本身还具有肾保护作用)；利尿剂(消肿)；AST-120

(一种吸附肠道内有害物质的吸附碳)；以及聚苯乙烯磺酸钙(一种吸附肠道内钾的离子交换树脂)。治疗程序的示例包括透析和肾移植。所述透析可为血液透析或腹膜透析。在血液透析中，机器将过滤血液中的废物和过多体液。在腹膜透析中，插入腹部的导管使腹腔充满吸附废物和过多体液的透析液。在一段时间后，从体内排出携带废物的所述透析液。

因此，在某些实施例中，本发明所述的肾纤维化治疗方法与选自抗高血压药、1,25-二羟基维生素D3、促红细胞生成素、血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素II受体拮抗剂、AST-120

和聚苯乙烯磺酸钙的一种治疗剂联合施用。可替代地或此外，本发明所述的肾纤维化治疗方法与选自透析和肾移植的一种治疗程序联合施用。

还考虑在预防和/或治疗腹膜后纤维化的方法中使用上述定义的抗Claudin-1抗体或其生物活性片段。腹膜后纤维化是一种罕见的炎症性疾病，其中，在腹膜后腔(包含肾脏、主动脉、肾道和各种其他结构的体腔)中，纤维组织异常形成。

皮肤纤维化。术语“皮肤纤维化(skin fibrosis)”、“皮肤纤维化(dermalfibrosis)”和“皮肤纤维化(cutaneous fibrosis)”在本发明中可互换使用，是指因病理创伤愈合反应而导致的皮肤过度瘢痕化。皮肤纤维化的特征在于成纤维细胞增殖和过度合成以及胞外基质(ECM)蛋白(如胶原蛋白、弹性蛋白和原纤蛋白)沉积。在临床上，皮肤纤维化表现为皮肤区域变厚、变紧、变硬。最终，皮肤纤维化可导致皮肤挛缩，影响关节的屈伸能力。尽管存在与皮肤纤维化相关的发病率和社会经济负担，但有效的治疗选择有限。现有疗法都有明显的副作用，即使使用联合疗法，进展和复发也常有发生。

可根据本发明所述的方法进行治疗的皮肤纤维化可由任何因素导致，包括但不限于某些病症(局限性硬皮病(硬斑病、线状硬皮病)、系统性硬皮病、移植物抗宿主病(GVHD)、肾源性纤维化皮肤病、混合性结缔组织病、硬皮病、硬化性黏液水肿、嗜酸性筋膜炎、着色芽生菌病、肥厚性瘢痕和瘢痕疙瘩)；某些医疗干预(放疗诱导皮肤纤维化)；各种化学品的环境或职业接触(例如，在由L-色氨酸诱导的嗜酸粒细胞增多肌痛综合征中)；以及接触某些物理因子(例如，由物理创伤、手术损伤、皮肤热灼伤或冰灼伤诱导的皮肤纤维化)。

向皮肤纤维化患者施用抗Claudin-1抗体或其药物合成物，可减缓、减少、阻止或减轻皮肤病的进展，例如，纤维化扩散到未受影响的皮肤区域，和/或可减缓、减少、阻止或减轻并发症(如毁容、皮肤挛缩、患肢功能减损以及扩散到内部器官)的发生。

可替代地或此外，向皮肤纤维化患者施用抗Claudin-1抗体或其药物合成物，可使所述个体的至少一种症状(包括但不限于皮肤区域变厚、变紧、变硬)得到改善。

通过本领域的任何已知检测和测试(用于诊断影响患者的皮肤纤维化)，对本发明所述治疗的作用进行监测。例如，在此类检测和测试中，使用硬度计测量皮肤硬度和/或绷紧度，使用皮肤弹性测试仪对皮肤弹性进行定量，使用超声检查设备评估局部皮肤及皮下血流并进行数字红外皮肤热成像。皮肤纤维化诊断的其他无创性方法包括超声波扫描、弹性成像、共聚焦显微镜检查和光学相干断层扫描。

在本发明所述皮肤纤维化预防或治疗方法的某些实施例中，单独施用抗Claudin-1抗体(或其生物活性片段)或其药物合成物。在其他实施例中，抗Claudin-1抗体(或其生物活性片段)或其药物合成物与至少一种其他治疗剂和/或治疗程序联合施用。可在施用所述治疗剂和/或治疗程序之前、施用所述治疗剂和/或治疗程序时和/或施用所述治疗剂和/或治疗程序之后，施用所述抗Claudin-1抗体(或其生物活性片段)或其药物合成物。

可与抗Claudin-1抗体(或其生物活性片段)或其药物合成物联合施用的治疗剂可选自免疫抑制药(如甲氨蝶呤、吗替麦考酚酯、环磷酰胺和环孢素)、托珠单抗(抗IL-6受体抗体)、利妥昔单抗(抗CD20抗体)和非苏木单抗(抗TGF-β抗体)，它们的临床结果很好。

可替代地或此外，所述抗Claudin-1抗体(或其生物活性片段)或其药物合成物可与皮肤纤维化治疗中所使用的治疗程序(如紫外线疗法)联合施用。

B.给药

可通过任何适当途径向有需要的受试者施用所需剂量的抗Claudin-1抗体或其生物活性片段(可选在使用一种或多种适当的可药用载体或赋形剂配制后)。各种递送系统已知，并可用于施用抗体，包括片剂、胶囊、注射溶液、脂质体内封装、微粒、微胶囊等。给药方法包括但不限于皮肤、皮内、肌肉内、腹膜内、病灶内、静脉内、皮下、鼻内、肺部、硬膜外和口服途径。可通过任何方便的或其他适当的途径来施用抗Claudin-1抗体、其生物活性片段或其药物合成物，例如，通过输注或团注、通过上皮或粘膜层吸收(例如，口腔粘膜、支气管粘膜、直肠和肠粘膜等)。可全身或局部给药。本领域的普通技术人员理解，在发明抗体与其他治疗剂联合施用的实施例中，可通过相同途径(例如，静脉内)或不同途径(例如，静脉内或口服)施用所述抗体和治疗剂。

C.剂量

可施用一定剂量的抗Claudin-1抗体或其生物活性片段(可选在使用一种或多种适当的可药用载体或赋形剂配制后)，使递送量对预期目的有效。给药途径、制剂和给药剂量将取决于预期治疗作用、需治疗病症(如已存在)的严重程序、是否存在任何感染、患者的年龄、性别、体重和一般健康状况、所用抗体或合成物的效力、生物利用度和体内半衰期、是否使用合并疗法以及其他临床因素。在治疗过程中，主治医生很容易确定这些因素。可替代地或此外，可在使用动物模型(例如，黑猩猩和小鼠)的研究中确定给药剂量。根据这些或其他方法调整剂量，从而达到最大疗效，这在本领域众所周知，并且在经培训医生的能力范围内。在使用抗Claudin-1抗体进行研究时，将出现有关适当剂量水平和治疗持续时间的更多信息。

根据本发明进行的治疗可包括单剂量或多剂量。因此，可在某段时间内持续不变地或定期以及按特定间隔(例如，每小时、每天、每周(或按一些其他多天间隔)、每月、每年(例如，在长效缓释剂型中))施用抗Claudin-1抗体或其生物活性片段(或其药物合成物)。可替代地，在给定时间段内，可多次进行所述递送，例如，每周两次或多次；每月两次或多次等。所述递送可为一段时间内的连续递送，例如，静脉内递送。

一般而言，抗Claudin-1抗体或其生物活性片段(或其药物合成物)的给药量优选在约1ng/kg-100mg/kg受试者体重的范围内，例如，约100ng/kg-50mg/kg受试者体重；或约1μg/kg-10mg/kg受试者体重；或约100μg/kg-1mg/kg受试者体重。

III-药物合成物

如上所述，可单独施用抗Claudin-1抗体(及相关分子)，或作为药物合成物施用。因此，本发明提供了药物合成物，其中包含有效量的本发明所述抗Claudin-1抗体或其生物活性片段以及至少一种可药用载体或赋形剂，用于预防和/或治疗纤维化疾病，尤其是肺纤维化、肾纤维化和皮肤纤维化。在某些实施例中，所述合成物进一步包含一种或多种其他生物活性剂。

为了实现预期预防和/或治疗作用，可通过任何有效给药途径施用任何有效量的所述抗体或药物合成物。根据给药途径和所需剂量，最佳药物制剂可能有所不同。此类制剂可能影响体内释放的物理状态、稳定性、速率以及所施用活性成分的体内清除速率。

可以单位剂型配制所述药物合成物，以易于给药及确保剂量均匀。在本发明中，“单位剂型”这一表达是指用于待治疗患者的一个物理离散单位的抗Claudin-1抗体或其生物活性片段。但是，应理解，将由主治医生在合理医学判断的范围内决定所述合成物的每日总剂量。

A.制剂

可根据已知技术，使用适当的分散剂或润湿剂以及助悬剂来配制注射制剂(例如，无菌注射水性或油性混悬剂)。所述无菌注射制剂还可为无毒肠道外可接受稀释剂或溶剂的无菌注射溶液、混悬剂或乳剂，例如，作为2,3-丁二醇溶液。可使用的可接受运载体和溶剂包括水、林格氏液(美国药典)和等渗氯化钠溶液。此外，通常以溶液或悬浮介质的形式使用无菌固定油。为此，可使用任何温和的固定油，包括合成单甘油酯和双甘油酯。在制备注射制剂时，还可使用油酸等脂肪酸。无菌液体载体在用于胃肠外给药的无菌液体形式的合成物中很有用。

例如，可通过细菌保留过滤器进行过滤，或在无菌固体合成物形式(在使用前可溶解或分散在无菌水或其他无菌注射介质中)中添加无菌剂，对注射制剂进行灭菌。例如，可通过静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下注射来施用无菌溶液或混悬剂形式的液体药物合成物。可通过单次推注或连续输注的形式进行注射。必要或需要时，所述合成物可包含一种局部麻醉剂，用于减轻注射部位的疼痛。

为了延长活性成分(此处为抗Claudin-1抗体或其生物活性片段)的作用，通常需要减缓皮下或肌肉内注射成分的吸收。可将成分溶解或悬浮在油性载体中，从而延迟胃肠外给药活性成分的吸收。在可生物降解聚合物(如聚丙交酯-聚乙交酯)中形成微囊化活性成分矩阵，从而制备储库型注射制剂。根据活性成分与聚合物的比率以及所用特定聚合物的性质，可控制成分释放速率。其他可生物降解聚合物的示例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。还可将活性成分包封在与身体组织相容的脂质体或微乳中，从而制备储库型注射制剂。

口服给药液体剂型包括但不限于可药用乳剂、微乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂、酏剂和加压合成物。除抗Claudin-1抗体或其生物活性片段之外，所述液体剂型可包含本领域常用的惰性稀释剂，例如，水或其他溶剂、增溶剂和乳化剂，如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油类(尤其是棉籽、花生、玉米、胚芽、橄榄、蓖麻和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯及其混合物。除惰性稀释剂之外，所述口服合成物还可包含润湿剂、助悬剂、防腐剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、增稠剂、颜色和粘度调节剂、稳定剂或渗透调节剂等佐剂。适当口服给药液体载体的示例包括水(可能包含上述添加剂，例如，纤维素衍生物，如羧甲基纤维素钠溶液)、醇类(包括一元醇和多元醇，如乙二醇)及其衍生物以及油类(例如，分馏椰子油和花生油)。对于加压合成物，所述液体载体可为卤代烃或其他可药用抛射剂。

口服给药固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、粉剂和颗粒剂。在此类固体剂型中，可将抗Claudin-1抗体或其生物活性片段可与至少一种生理上可接受的惰性赋形剂或载体(如柠檬酸钠或磷酸二钙)以及以下一项或多项混合：(a)填充剂或增量剂(如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸)；(b)粘合剂(如羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶)；(c)保湿剂(如甘油)；(d)崩解剂(如琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠)；(e)溶液阻滞剂(如石蜡)；吸收加速剂(如季铵化合物)；(g)润湿剂(如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯)；(h)吸收剂(如高岭土和膨润土；以及(i)润滑剂，如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷硫酸钠)及其混合物。适用于固体制剂的其他赋形剂包括表面改性剂，如非离子和阴离子表面改性剂。表面改性剂的代表性示例包括但不限于泊咯沙姆188、苯扎氯铵、硬脂酸钙、鲸蜡硬脂醇、聚西托醇乳化蜡、脱水山梨糖醇酯、胶体二氧化硅、磷酸盐、十二烷基硫酸钠、硅酸镁铝和三乙醇胺。在胶囊剂、片剂和丸剂的情况下，所述剂型还可包含缓冲剂。

在使用乳糖或牛奶糖以及高分子量聚乙二醇等赋形剂的软硬填充明胶胶囊中，还可将相似类型的固体合成物用作填充剂。可制备带有包衣和外壳(如肠溶包衣、控释包衣和药物配制领域众所周知的其他包衣)的片剂、糖衣丸剂、胶囊剂、丸剂和颗粒剂固体剂型。它们可选包含乳浊剂，还可以是一种合成物，仅仅或优选在肠道的某个部分可选以延迟方式释放活性成分。可使用的包埋合成物示例包括聚合物和蜡。

在某些实施例中，可能需要向需治疗的部位(例如，肺脏、肾脏或皮肤)局部施用发明合成物。可通过各种方式来实现这一点，包括但不限于在手术(移植)期间进行局部输注、局部涂抹、注射、通过导管、通过支架或其他植入剂或通过吸入器。

为了进行局部给药，可优选将所述合成物配制为凝胶、乳膏、洗剂或软膏，其中可包含水、甘油、醇类、丙二醇、脂肪醇、甘油三酯、脂肪酸酯或矿物油等载体。其他局部用载体包括液体石油、棕榈酸异丙酯、聚乙二醇、乙醇(95％)、聚氧乙烯单月桂酸酯(5％)水溶液或十二烷基硫酸钠(5％)水溶液。必要时，可添加其他材料，如抗氧化剂、保湿剂、粘度稳定剂以及类似药剂。

此外，在某些情况下，预计可将所述药物合成物放在置于皮肤上、皮肤内或皮肤下的经皮器械中。此类器械包括通过被动或主动释放机构释放活性成分的贴剂、植入剂和注射剂。经皮给药包括身体表面和所有身体通道内粘膜层(上皮和粘膜组织)的所有给药。可使用洗剂、软膏、泡沫剂、贴剂、混悬剂、溶液剂和栓剂(直肠和阴道)形式的本发明合成物，进行此类给药。

可使用包含一种活性成分(即，抗Claudin-1抗体或其生物活性片段)以及一种载体(对皮肤无毒)的经皮贴剂实现经皮给药，这样即可通过皮肤递送成分，便于全身吸收到血流中。所述载体可采用任何形式，如软膏和乳膏、糊剂、凝胶和封闭器械。所述软膏和乳膏可为粘性液体或水包油型或油包水型半固体乳剂。糊剂可能适用，其中包含分散于石油或亲水性石油(含活性成分)中的吸附粉末。各种封闭器械均可用于将活性成分释放到血流中，如盖在包含活性成分(包含或不包含载体)的容器上的半透膜或包含活性成分的基质。

可使用可可油(其中添加或不添加蜡，从而改变栓剂的熔点)和甘油等传统材料制备栓剂。还可使用水溶性栓剂基质，如各种分子量的聚乙二醇。

生产各种制剂的材料和方法在本领域众所周知，可适用于本发明的实践。适当的抗体递送制剂可见“雷明顿药物科学”，E.W.Martin，第18版，1990年，马克出版公司：宾夕法尼亚州伊斯顿。

B.其他生物活性剂

在某些实施例中，抗Claudin-1抗体或其生物活性片段仅为本发明所述药物合成物的活性成分。在其他实施例中，所述药物合成物进一步包含一种或多种生物活性剂。适当生物活性剂的示例包括但不限于治疗剂，如抗病毒剂、抗炎剂、免疫调节剂、镇痛药、抗微生物剂、激酶抑制剂、信号抑制剂、抗菌剂、抗生素、抗氧化剂、防腐剂及其组合。其他适当生物活性剂的示例包括适用于治疗肺纤维化以及适用于治疗肾纤维化、肺纤维化或皮肤纤维化(如上文所列疾病)的治疗剂。

在此类药物合成物中，可将所述抗Claudin-1抗体和其他治疗剂组合在一种或多种制剂中，从而实现所述抗Claudin-1抗体和治疗剂的同时、单独或连续给药。更具体地说，可配制一种发明合成物，以便一起或单独施用所述抗体和治疗剂。例如，可将抗Claudin-1抗体和治疗剂配制在一种合成物中。可替代地，可单独保存(例如，在不同合成物和/或容器中)并施用Claudin-1抗体和治疗剂。

C.药包或药盒

另一方面，本发明提供了一种包含一个或多个容器(例如，西林瓶、安瓿瓶、试管、烧瓶或瓶子)的药包或药盒，所述容器装有发明药物合成物的一种或多种成分，允许施用抗Claudin-1抗体或其生物活性片段。

可采用固体(例如，冻干)或液体剂型提供药包或药盒的不同成分。通常适合在相应的容器中等分或以浓缩的形式提供每种成分。药包或药盒可包含用于重组冻干成分的介质。优选密闭保存所述药盒的各个容器，以便进行商业销售。

在某些实施例中，一个药包或药盒包含一种或多种其他治疗剂(如上所述)。可选地，所述容器可能附有通知或药品说明书(采用监管药品或生物制品生产、使用或销售的政府机构所规定的形式)，此通知反映，所述机构已批准为向人类施用而进行生产、使用或销售。所述药品说明书通知可包含根据本发明所公开的治疗方法使用药物合成物的说明。

药盒中或药盒上可能存在标识符，例如，条形码、射频、ID标签等。例如，所述标识符可用于唯一标识药盒，以便进行质量控制、库存控制、跟踪工作站之间的移动情况等。

示例

以下示例对本发明实现和实践的某些优选形式进行了说明。但是，应理解，所述示例仅用于说明目的，并不旨在限制本发明的范围。此外，除非示例中的说明用过去时态表示，否则文本(如说明书的剩余内容)并不旨在表明实际进行了实验或实际获得了数据。

示例1：体内抗Claudin-1单克隆抗体生物分布材料和方法

试剂和抗体。如上所述，产生所述抗Claudin-1单克隆抗体(抗CLDN1 mAb–OM-7D3-B3)(Fofana等人，《胃肠病学》，2010年，139:953-964，e1-4)。还使用了对照mAb(大鼠IgG2b克隆体LTF-25，Bio X Cell公司)。

活体脊椎动物的研究实验。经道德委员会批准后，根据地方法律，在INSERM 1110单元动物设施中进行了体内实验(CREMEAS，项目编号：AL/02/19/08/12和AL/01/18/08/12)。

抗体生物分布。使用Alexa-fluor 750(RD-Biotech公司(法国贝桑松))标记抗体。向八周龄Balb/c小鼠腹膜内注射500μg Alexa-fluor 750标记CLDN1特异性mAb或对照mAb。如上所述，在24小时和48小时采集器官(Krieger等人，《肝病学》，2010年，51:1144-1157)，并使用IVIS Lumina 50(Xenogen-Caliper-Perkin-Elmer)进行离体器官特异性荧光检测，并以平均效率的形式表示。

统计分析。使用曼-惠特尼检验。p值≤0.05时，认为具有意义。使用GraphPadPrism 6软件进行统计分析。

结果

抗Claudin-1抗体生物分别。发明人对Balb/c小鼠中抗CLDN1单克隆抗体的体内生物分布进行了测量，并将其与对照单克隆抗体进行了比较。图1中的结果表明，在皮肤、肾脏、肺脏、肠道和肝脏中观察到抗CLDN1单克隆抗体富集(参见图1(A)(在24小时测量)和图1(B)(在48小时测量))(Mailly等人，《自然生物技术》，2015年，33(5):549-554)。

示例2：在博来霉素诱导肺纤维化模型中，抗Claudin-1单克隆抗体在预防纤维化方面的体内疗效

材料和方法

在博来霉素诱导肺纤维化模型中，抗人CLDN1单克隆抗体纤维化预防作用的检查方案。从日本SLC公司(日本)获得无病原体六周龄雌性C57BL/6J小鼠。在第0天，使用

(Penn-Century(美国))，以3.0mg/kg的剂量(每只动物50μL的体积)单次气管内施用盐酸博莱霉素(BLM，Nippon Kayaku(日本))的盐溶液，诱导54只小鼠发生肺纤维化。在每个时段，在第0天开始治疗前一天，根据体重，将小鼠随机分为3组，每组各包括18只小鼠。在实验期内，每天测量个体的体重。每天监测小鼠的生存情况、临床体征和行为。

小鼠组。第1组(运载体)：从第0天到第20天，每周以5mg/kg的体积向18只博来霉素诱导肺纤维化模型小鼠腹膜内施用运载体[盐水]一次。第2组(抗CLDN1 mAb)：从第0天到第20天，每周以500μg/小鼠的剂量向18只博来霉素诱导肺纤维化模型小鼠腹膜内施用添加抗CLDN1 mAb的运载体一次。第3组(地塞米松)：从第0天到第20天，每天以0.25mg/kg的剂量(10mL/kg的体积)使18只博来霉素诱导肺纤维化模型小鼠口服添加地塞米松的纯水一次。在第21天处死所有组中的小鼠。

生存、生物化学和组织学分析。在第21天处死所有组中的小鼠，以进行生存和组织学检测。使用Kaplan-Meier生存方法建立生存曲线，并通过时序检验进行比较。根据常规方法对肺切片进行组织学分析：马松三色染色和Ashcroft评分估计。

统计检验。通过克鲁斯卡尔-沃利斯检验进行统计检验。P值<0.05时，认为具有统计学意义。

图2(A)对所述研究设计进行了总结。

结果

与运载体组相比，抗CLDN1 mAb组的Ashcroft评分显著降低(各自的均值±标准差为3.9±1.5和2.8±0.9，p<0.05)。与运载体组相比，地塞米松组的Ashcroft评分趋于降低(图2(B))。图2(C)显示了马松三色染色肺切片的代表性显微照片。

在治疗期内，第21天前的小鼠死亡情况如下：在运载体组的18只小鼠中，4只小鼠死亡。在抗CLDN1 mAb组的18只小鼠中，5只小鼠死亡。在地塞米松组的18只小鼠中，10只小鼠死亡。与运载体组相比，地塞米松组的生存率显著降低。运载体组和抗CLDN1 mAb组的生存率无显著差异(图2(D))。

以较基线(第0天)的体重变化百分比的形式表示体重。在第4-16天、第18天、第19天和第21天，地塞米松组的平均体重变化显著低于运载体组的平均体重变化。在研究期内的任何一天，运载体组和抗CLDN1 mAb组之间体重变化均无显著差异(图2(E))。

示例3：在博来霉素诱导肺纤维化模型中，抗Claudin-1单克隆抗体在治疗纤维化方面的体内疗效

材料和方法

在博来霉素诱导肺纤维化模型中，抗人CLDN1单克隆抗体纤维化治疗作用的检查方案。将从日本SLC公司(日本)获得无病原体六周龄雌性C57BL/6J小鼠。在第0天，使用戊巴比妥钠对54只小鼠进行麻醉，并使用

(Penn-Century(美国))，以3mg/kg的剂量(每只动物50μL的体积)气管内施用博来霉素(批号：771840，Nippon Kayaku(日本))。将小鼠转移至干净的笼子(休息的笼子)中，直至从麻醉中恢复。分别在两天进行所述博来霉素给药，每天分配相同数量的小鼠。在每个时段，在第7天开始治疗前一天，根据体重，将博来霉素诱导肺纤维化模型小鼠随机分为3组，每组各包括18只小鼠。每天监测小鼠的生存情况、临床体征和行为。

小鼠组。第1组(运载体)：从第7天到第20天，每周以5mg/kg的体积向18只博来霉素诱导肺纤维化模型小鼠腹膜内施用运载体[盐水]一次。第2组(抗CLDN1 mAb)：从第7天到第20天，每周以500μg/小鼠的剂量向18只博来霉素诱导肺纤维化模型小鼠腹膜内施用添加抗CLDN1 mAb的运载体一次。第3组(尼达尼布)：从第7天到第20天，每天以100mg/kg的剂量(10mL/kg的体积)使18只博来霉素诱导肺纤维化模型小鼠口服添加尼达尼布的纯水一次。在第21天处死所有组中的小鼠，以进行随后的检测。

生存、生物化学和组织学分析。在第21天处死所有组中的小鼠，以进行生存和组织学检测。使用Kaplan-Meier生存方法建立生存曲线，并通过时序检验进行比较。根据常规方法评估肺羟脯氨酸含量。

统计检验。通过克鲁斯卡尔-沃利斯检验进行统计检验。P值<0.05时，认为具有统计学意义。

图3(A)对所述研究设计进行了总结。

结果

与运载体组相比，抗CLDN1 mAb组的肺羟脯氨酸含量显著降低(各自的均值±标准差为52±8.3和45.3±8.4，p<0.05)。与运载体组相比，尼达尼布组的肺羟脯氨酸含量趋于降低(均值±标准差为51.3±9.0，图3(B))。

图3(C)显示了马松三色染色肺切片的代表性显微照片。

运载体组和治疗组的生存率和体重无显著差异(参见图3(D-E))。

示例4：评估抗Claudin-1单克隆抗体在肺纤维化和肾纤维化中的治疗应用

为了研究CLDN1特异性mAb在肺纤维化和肾纤维化中的治疗潜在应用，发明人对CLDN1特异性mAb与肾细胞系(RPTEC/TERT1)和肺细胞系(A549)中细胞的结合情况进行了评估。此外，他们还对A549肺细胞中进行性肝特征和TGF-β信号传导的诱导和逆转情况进行了评估。

材料和方法

细胞系。分别从与Irwin Davidson博士和Izabella Sumara博士合作的IGBMC获得所述肾癌细胞系RPTEC/TERT1和肺癌细胞系A549(均来自ATCC)。根据提供商说明书培养这两个细胞系：使所述RPTEC/TERT1肾癌细胞在添加hTERT RPTEC Growth Kit和0.1mg/mLG418的ATCC配制DMEM:F12培养基中生长。使所述A549肺癌细胞在添加10％胎牛血清的ATCC配制F-12K培养基中生长。

结合研究。使用EDTA(4mM)溶液使细胞去附着，并重悬于4℃含1％FBS的PBS中。然后，使用浓度渐增的人源化H3L3 CLDN1特异性mAb培养150000个细胞(参见WO/2017/162678)，在按1:100的稀释度使用PE标记抗人抗体进行培养后，通过流式细胞术读取结合信号，并使用Cytoflex和FlowJo V10进行分析。在每次抗体培养后，使用含1％FBS的PBS洗涤两次。使用PE平均荧光强度(MFI)建立每个细胞系的结合曲线，并应用R 3.5.1中的Michaelis-Menten数学模型计算相互作用的K_d。

PLS研究。在12孔板(30000个细胞/孔)上接种A549细胞，并在使用或不使用TGF-β(5ng/mL)(Peprotech公司)和CLDN1特异性mAb(20μg/mL)的情况下培养24小时。然后，使用Promega Reliaprep试剂盒提取RNA，并通过nCounter Nanostring，使用125nm确定PLS的诱导作用。

TGF-β信号传导报告基因检测。根据制造商说明书，使用Fugene和TGF-β信号传导报告基因质粒pGLA4.48[luc2P/SBE/Hygro](Promega公司)对A549细胞进行转染。在转染后，在37℃温度下，向细胞中添加包含对照mAb或CLDN1特异性mAb(50μg/mL)的新鲜培养基，持续3小时。在37℃温度下，向包含TGF-β(10ng/mL)(Sigma公司)的细胞中添加新鲜培养基，持续3小时。在室温下培养孔板15分钟，然后在室温下添加ONE-Glo底物(Promega公司)3分钟。使用Berthold酶标仪读取上清液的发光强度。

结果

CLDN1 mAb与在RPTEC/TERT1肾细胞系和A549肺细胞系上表达的CLDNA结合。研究发现，CLDN1 mAb使两个细胞系的表位饱和：50μg/mL(肾癌细胞系RPTEC/TERT1)(图4(A))和20mg/mL(肺癌细胞系A549)(图4(B))，因此，K_d分别为53(图4(C))和16.3nM(图4(D))。这些结果证实，CLDN1特异性mAb可与肾细胞和肺细胞所表达的CLDN1结合。

CLDN1 mAb逆转A549肺细胞系中PLS的纤维化相关预后不良状态。为了进一步研究CLDN1作为纤维化和癌变驱动因子的功能作用，发明人评估了CLDN1 mAb分子是否调节临床PLS(患者纤维化和肝病进展、癌症风险和死亡率的一个32基因特征预测因子)的表达(Hoshida等人，《新英格兰医学杂志》，2008年，359:1995-2004；Hoshida等人，《胃肠病学》，2013年，144:1024-1030；King等人，《肠道》，2015年，64:1296-1302；Nakagawa等人，《癌细胞》，2016年，30:879-890；Goossens等人，《临床胃肠病学和肝病学》，2016年，14:1619-1628)。在不存在应激诱导剂的情况下，所述A549细胞系已知可诱导临床PLS(FDR＝0.018(预后不良基因)和0.012(预后良好基因))。使用CLDN1 mAb治疗24小时，可逆转临床PLS(FDR＝0.094(预后不良基因)和0.095(预后良好基因))(图5(A))。在使用CLDN1特异性mAb后，两种PLS预后不良基因(SERPINB2和FMO1)显著下调，倍数变化小于1.5(图5(B))。这些数据表明，CLDN1在肺纤维化细胞系模型中作为临床PLS预后不良的一个驱动因子，并支持CLDN1 mAb作为候选治疗靶点的潜在作用。

CLDN1 mAb减少A549肺细胞中的TGF-b信号传导。TGF-β在肺成纤维细胞分化成肌成纤维细胞中必不可少，而此类分化是组织纤维化发生的一个关键步骤。此外，据报告，纤维化肺中的TGF-β表达增加。TGF-β促进ECM产生，包括胶原蛋白、层粘连蛋白和纤连蛋白(Saito等人，《国际分子科学杂志》，2018年，19(8):2460)。为了进一步研究CLDN1特异性mAb对肺细胞中TGF-β信号传导的作用，使用TGF-β(10ng/mL)和CLDN1特异性mAb对转染SBE(TGF-β信号传导报告基因质粒)A549细胞进行处理，结果导致TGF-β报告基因活性显著降低(图5(B))。

结论

CLDN1特异性mAb与肾(RPTEC/TERT1)细胞系和肺(A549)细胞系的CLDN1表达细胞结合。此外，还将调节A549中PLS(纤维化预测因子)的逆转作用。这表明了CLDN1特异性mAb在减轻纤维化进展中的作用。最后，结果表明，CLDN1 mAb可减少TGF-β信号传导(肺纤维化的一个重要通路)。总之，这些数据表明了CLDN1特异性mAb对肺纤维化和肾纤维化的潜在治疗作用。

示例5：评估抗Claudin-1单克隆抗体在皮肤纤维化-BLM诱导皮肤纤维化模型中的治疗应用

系统性硬皮病(SSc)是一种未知病因的慢性结缔组织病。其特征在于皮肤和内部器官纤维化。在SSc的晚期，大多数患者会出现组织纤维化和器官功能障碍，导致死亡率增加。SSc的对症治疗目前有限，因果疗法期待已久。

博来霉素(BLM)诱导皮肤纤维化模型是一种特征明确的皮肤纤维化疾病模型，常用于研究的SSc生物通路。所述BLM模型包括SSc的关键病理生理学特征：表皮肿大和皮肤纤维化，这使此模型对简单的SSc概念证明研究以及抗纤维化分子的体内筛选很有吸引力(Yamamoto等人，《皮肤病学研究杂志》，1999年，112:456)。

材料和方法

BLM模型和采样。如图6中的方案所示，在4周的时间内，每隔一天向预先剃毛的小鼠背部皮下注射所述BLM。注射部位位于1.5cm²方形剃毛区域的四个角，交替使用这四个角(角1、角2、角3、角4、角1等)。使用皮肤打孔器剪出一个5mm的圆形，用于进行胶原蛋白定量。将剩余完整区域切成3个矩形，一个用于组织学分析，另外两个用于生物化学分析。对BLM诱导皮肤纤维化模型中的皮肤样本进行HE染色，结果表明，在BLM注射后28天，厚度增加。同时，皮下脂肪层出现萎缩和收缩。

伊马替尼对皮肤纤维化的作用。甲磺酸伊马替尼是一种针对c-Abl、PDGFR以及几种其他酪氨酸激酶的酪氨酸激酶抑制剂(Alfiya等人，《关节炎和风湿病》，2009年，60:219)。c-Abl在通过TGF-β通路诱导ECM蛋白方面至关重要。其抑制作用可减少EMC组分的合成。伊马替尼可阻断PDGFR的酪氨酸激酶活性，从而干扰PDGF信号传导(Alfiya等人，《关节炎和风湿病》，2009年，60:219)。图7显示了所述研究设计。

结果

图8显示了获得的结果。研究发现，伊马替尼可显著减少皮肤厚度和皮肤纤维化面积。

使用CLDN1特异性mAb(而非伊马替尼)进行相似实验。

示例6：与肝脏相比，肾脏和肺脏中抗CLDN1 mAb介导的抗纤维化作用所涉及的机制不同

考虑到CLDN1在上皮-间质转化(EMT)中的明确作用(Stebbing等人，《致癌基因》，2013年，32:4671-4872；Shiozaki等人，《PLoS One》，2012年，7:e38049；Suh等人，《致癌基因》，2013年，32:4873-4882；Zhang等人，《癌症靶标》，2016年，7:87449-87461)以及其与肝纤维化疾病的相关性，发明人旨在通过在慢性肾病和肝病患者的临床队列中的CLDN1表达分析、抗CLDN1 mAb在动物模型中的作用评估以及患者成纤维细胞的扰动研究，研究CLDN1作为驱动因子和治疗靶点对肾纤维化和肺纤维化的作用。

材料和方法

免疫荧光。为了对肺纤维化和肾纤维化进行免疫荧光表征，在8腔室盖玻片(Lab-Tek II#1.5，西格玛奥德里奇公司)上接种细胞。第二天，使用PBS将细胞洗涤两次，并在室温下使用4％PFA固定15分钟，然后使用0.1×Triton-X透化10分钟。在两个洗涤步骤后，使用10％FBS阻断细胞30分钟。在4℃温度下，整晚使用抗α-SMA Ab(1:100，ab5694，艾博抗公司(法国))和抗CLDN1 mAb H3L3或对照mAb莫维组单抗(分别为10μg/mL)进行一级抗体染色。使用PBS洗涤细胞，并按1:200的稀释度使用山羊抗人Alexa Fluor 488和山羊抗兔Alexa Fluor 647二级抗体(Jackson公司(英国))进行培养。使用DAPI(1μg/mL)进行核染色，并使用落射荧光显微镜使细胞可视化。

肺成纤维细胞和肾成纤维细胞的扰动研究。在12孔板上以5×10⁴个细胞/cm²的密度接种IPF患者(#HPCPFIPF-05，BioIVT)的原代人类病变肺实质成纤维细胞以及肾成纤维细胞(#P10666，Innoprot)，并使用TNFα(10ng/ml)、TNFα(10ng/ml)+IKK16(1μM)或运载体对照品处理24小时，然后对抗CLDN1 mAb结合情况进行流式细胞术分析，或使用抗CLDN1 mAb或同种型对照品(分别为50μg/mL)培养3天，以进行随后的全基因组RNAseq分析。

流式细胞术。通过流式细胞术，对肺成纤维细胞和肾成纤维细胞上人CLDN1的膜表达进行分析。简而言之，使用人源化CLDN1特异性抗体H3L3(10μg/mL)对每个条件下的100000个细胞进行染色(重复三次)。将对照同种型mAb用作阴性对照品。使用PE偶联人特异性二级抗体检测一级抗体。使用Cytoflex B2R2V0(贝克曼库尔特有限公司)获取数据，并使用CytExpert 2.1和FlowJo v10(贝克曼库尔特有限公司)进行分析。对CLDN1表达进行计算，即经CLDN1特异性抗体染色细胞与经对照IgG染色细胞的平均荧光强度差异。

全基因组RNA-Seq分析。使用TruSeq链式mRNA样本制备试剂盒(Illumina公司，件号：RS-122-2101)和300ng总RNA，生成RNA-Seq文库。简而言之，在使用附着poly-T oligo的磁珠进行纯化后，在94℃温度下使用二价阳离子使mRNA分裂2分钟。使用逆转录酶和随机引物将裂解的RNA片段复制到第一链cDNA中。在使用DNA聚合酶I和RNase H合成第二链cDNA时，用dUTP代替dTTP，从而实现链特异性。在添加单一“A”碱基以及随后在双链cDNA片段上连接接头后，使用PCR对产物进行纯化和富集(98℃温度下，30秒；[98℃温度下，10秒，60℃温度下，30秒，72℃温度下，30秒]×12个周期；72℃温度下，5分钟)，以创建cDNA文库。使用AMPure XP磁珠(贝克曼库尔特有限公司)进行纯化，进一步去除剩余的PCR底物，并使用2100生物分析仪(安捷伦公司)对最后的cDNA文库进行质量检查和定量。根据Illumina公司的说明书，在Illumina HiSeq 4000上以单读50碱基读长的形式对文库进行测序。使用RTAv2.7.3和bcl2fastq v2.17.1.14进行图像分析和碱基识别。使用HISAT2(Kim等人，《自然-方法》，2015年，12:357-360)将读长映射到人类基因组hg19。

生物信息学和统计分析。通过斯图登t检验，比较肺病和肾病队列中的CLDN1基因表达(肾病：GSE115857和GSE129973；肺纤维化：GSE2052(Pardo等人，《PLoS医学》，2005年，2；e251)。经抗CLDN1 mAb或对照mAb处理的肺成纤维细胞中的EMT标志物表达源自RNA-seq数据，通过斯图登t检验比较读长计数。p值<0.05时，认为结果具有统计学意义。为了对RNA-seq通路分析进行统计分析，通过基因集合富集分析(GSEA)对肺成肌纤维细胞活化(Peyser等人，《美国呼吸系统细胞和分子生物学杂志》，2019年，61:74-85)和EMT(HALLMARK_EPITHELIAL_MESENCHYMAL_TRANSITION和BUDHU_LIVER_CANCER_METASTASIS_UP(Budhu等人，《癌细胞》，2006年，10:99-111)进行评估，或GSEA预先评分FDR<0.25(Subramanian等人，《美国国家科学院院刊》，2005年，102:15545-15550。

结果

为了研究CLDN1在肾纤维化和肺纤维化患者中作为治疗靶点的相关性，发明人对其在慢性肾病患者以及纤维化相关慢性肺病患者中的表达进行了分析。

CLDN1基因表达与慢性肾病相关。由于糖尿病性肾病(终末期肾衰竭和肾纤维化的主要原因)，CLDN1在局灶性节段性肾小球硬化症中过表达(Calle等人，《国际分子科学杂志》，2020年，21:2806；Hasegawa等人，《自然-医学》，2013:19:1496-1504)。研究发现，在肾小球肾炎患者中，CLDN1上调，这表明，在慢性肾病发病机制中涉及CLDN1(图9(A))。

CLDN1基因表达与肺纤维化相关。支持CLDN1在器官纤维发生中的作用，CLDN1在特发性肺纤维化(IPF)患者中过表达(图9(B))。这些数据共同表明了CLDN1在器官慢性纤维发生疾病中的作用。

为了介绍作用机制，发明人在CLDN1表达方面对肾成肌成纤维细胞和肺成肌成纤维细胞进行了描述。如图10(A)和图(B)所示，所述抗CLDN1 mAb与在肺成纤维细胞以及肾成纤维细胞上表达的CLDN1特异性结合。此外，研究发现，与肝脏类似，通过肾成纤维细胞(图10(C)，左图)和肺成纤维细胞(图10(D)，右图)中的TNFα-NFκB，可调控所述抗CLDN1 mAb的CLDN1膜表达。

通过RNAseq和GSEA，对经抗CLDN1 mAb或对照mAb处理的肺成纤维细胞中的肺成纤维细胞活化标志物的近期表征基因集进行了功能评估(Peyser等人，《美国呼吸系统细胞和分子生物学杂志》，2019年，61:74-85)，结果表明抗CLDN1 mAb具有显著的抗纤维化作用(图10(D))。此外，所述抗CLDN1 mAb显著抑制肺成纤维细胞中的EMT编程，这表明，与肝脏相比，肾脏和肺脏中抗CLDN1 mAb介导的抗纤维化作用涉及潜在不同的机制(图10(D)，右图)。事实上，研究发现，在经抗CLDN1 mAb处理的肺成纤维细胞中，EMT标志物(如纤连蛋白和N-钙粘蛋白)以及转录调节因子SNAI2(SLUG)显著下调(图10(E)。

示例7：肾小球壁层上皮细胞作为慢性肾纤维化的新治疗靶点以及肾小球壁层上皮细胞表型上CLDN1特异性单克隆抗体(H3L3)的慢性肾病治疗作用

慢性肾病(CKD)代表一组异质性疾病，特征在于肾脏结构和功能在数月或数年中出现不可逆变化(Webster等人，《柳叶刀》，2017年，389:1238-1252)。在所有高收入和中等收入国家以及许多低收入国家中，糖尿病和高血压为CKD的主要原因。无论其潜在病因如何，慢性肾病的特征均在于进行性和不可逆元损失、慢性炎症和纤维化以及肾脏再生能力降低，最终导致终末期肾病和/或死亡(

等人，《国际肾脏》，2017年，91:70-85)。随着疾病进展，CKD患者生活质量下降，社会经济状况变差。现有疗法的有效性有限，只能延迟疾病进展，帮助控制体征和症状。此外，尽管取得了重大进展，但仍缺少有效的治疗方法来预防肾纤维化(Ruiz-Ortega等人，《自然综述-肾脏病学》，2020年，16:269-288)。因此，迫切需要新的靶点和疗法。

肾小球疾病是终末期肾病的主要原因。肾小球是位于肾单位起点的特殊毛细血管网。肾小球的尿腔被一层称为鲍氏囊的基膜包围，单层肾小球壁层上皮细胞(PEC)将附着在此基膜上(图11)。所述基膜、PEC以及称为足细胞的另一种特殊细胞类型构成肾小球滤过屏障，过滤血液中的水和溶质(Kitching等人，《美国肾脏病学会临床杂志》，2016年，11:1664-1674)。肾小球细胞对于正常生理来说至关重要，但也是各种有害过程的靶点。在过去的十年里，PEC在肾小球疾病进展中的作用受到越来越多的关注(Shankland等人，《肾脏病学与高血压新见》，2013年，22:302-309)。多项研究表明，通过产生过多的胞外基质蛋白或积聚并导致新月体形成，肾小球硬化症涉及PEC活化、迁移和增殖(Smeets等人，2011年，22:1262-1274；Kuppe等人，《国际肾脏》，2019年，96:80-93；Le Hir等人，《国际肾脏》，2003年，63:591-599)。此外，活化PEC产生促炎性分子，导致参与肾小球硬化症进展的炎性细胞(即，巨噬细胞亚群)浸润(Kanemoto等人，《实验室研究》，2003年，83:1615-1625；Djudjaj等人，《美国肾脏病学会杂志》，2016年，27:1650-1664；Garcia等人，《美国病理学杂志》，2003年，162:1061-1073)。因此，PEC作为有吸引力的治疗靶点。但是，仍仅部分了解介导PEC活化和增殖的信号通路。

PEC表征已确定使PEC区别于其他肾小球细胞类型的不同标志物。这些标志物包括CD44(一种独特的活化PEC标志物)和Claudin 1(CLDN1)(一种在血液过滤中发挥重要作用的紧密连接蛋白)(Ohse等人，《美国生理学杂志：肾脏生理学》，2009年，297:F1566-F1574；Yu，《美国肾脏病学会杂志》，2015年，26:11-19)。研究表明，表达CD44和CLDN1的肾小球细胞参与肾小球硬化症(Smeets等人，《美国肾脏病学会杂志》，2011年，22:1262-1274)。此外，Hasegawa等人证明，肾小球中的CLDN1过表达与糖尿病性肾病的严重程度和蛋白尿(肾损伤的一个早期标志物)增加相关(Hasegawa等人，《自然-医学》，2013年，19:1496-1504)。因此，CLDN1过表达在CKD发生中具有致病作用。近期，发明人的实验室研发出一种靶向CLDN1的高度特异性人源化单克隆抗体，用于临床预防和治愈丙肝感染以及肝纤维化治疗(Mailly等人，《自然生物技术》，2015年，33:549-554；Fofana等人，《胃肠病学》，2010年，139:953-964，064.e1-4；Colpitts等人，《肠道》，2017年，67(4):736-745)。利用表达CLDN1的PEC在CKD中的潜在致病作用，本研究目的的是评估PEC表型上CLDN1特异性单克隆抗体(H3L3)的CKD治疗作用。

材料和方法

试剂和抗体。已对人源化抗CLDN1 mAb(H3L3)和莫维组单抗(Mota)进行了说明(Colpitts等人，《肠道》，2017年，67(4):736-745)，由Evitria公司(施利伦)生产所述抗体。从Sigma公司购买TNFα。

细胞。从ScienCell研究实验室购买人肾上皮细胞(HREpic)，并根据制造商说明书使其在上皮细胞培养基中生长。

H3L3处理。为了进行2D培养，以5×10⁴个细胞/孔的密度在涂有多聚-L-赖氨酸的24孔板中接种细胞。24小时后，使用TNFα10ng/mL和Mota(10μg/mL)或H3L3(10μg/mL)对细胞进行处理。3天后，再使用TNFα和抗体处理细胞3天。共处理6天后，细胞裂解，通过qRT-PCR测量基因表达情况。为了进行3D培养，以5×10³个细胞/孔的密度在96孔超低附着板(Corning，西格玛奥德里奇公司(法国))中接种细胞。进行上述相同处理6天。根据制造商说明书，使用CellTitreGlo(Promega公司)，通过ATP定量评估细胞活性。

流式细胞术。在TNFα处理(10ng/mL)后24小时，通过流式细胞术，对人CLDN1在HREpic中的H3L3结合和表达进行分析。简而言之，将H3L3(10μg/mL)或Mota(10μg/mL)用作阴性对照品，对每个条件下的200000个细胞进行染色。使用Alexa fluor 647偶联人特异性二级抗体检测一级抗体。使用Cytoflex B2R2V0(贝克曼库尔特有限公司)获取数据，并使用CytExpert 2.1和FlowJo v10进行分析。以经H3L3染色细胞与经Mota染色细胞的平均荧光强度差异的形式显示CLDN1表达。

细胞培养实验中的基因表达分析。根据制造商说明书，使用RNAeasy Mini试剂盒(Quiagen公司(法国))从2D细胞培养物中进行总RNA提取。然后，在热循环仪(Bio-RadT100，Bio-Rad公司(美国加利福尼亚州赫拉克勒斯))上对250ng总RNA进行逆转录(H Minus第一链cDNA合成预混液，ThermoScientific(法国))。根据制造商说明书，在CFX96Touch实时PCR检测系统TaqMan基因表达检测试剂盒(ThermoFisher)上进行定量PCR。

统计学。以均值±标准差的形式表示数据，并在通过夏皮罗-威尔克正态性检验确定分布后，通过所示非配对斯图登t检验或双尾曼-惠特尼检验进行分析。对于2D培养，所有实验至少重复进行三次，对于3D培养，至少重复进行四次。p<0.05时，认为数据具有意义。使用GraphPad Prism 6软件对体外实验进行统计分析。

结果

作为壁层上皮细胞(PEC)的体外模型，发明人使用人肾上皮细胞(HREpic)(从人肾中分离的原代细胞)。它们呈现极化形态，再现了细胞培养过程中的PEC功能，如葡萄糖吸收和细胞因子产生(ScienCell研究实验室)。为了研究CLDN1在PEC中作为治疗靶点对肾小球疾病和慢性肾病(CKD)的作用，发明人首先使用肿瘤坏死因子α(TNFα)对细胞进行炎症应激处理。的确，TNFα是一种多效性细胞因子，在肾病(如肾小球肾炎)中发挥重要的炎症作用(Ernandez等人，《国际肾脏》，2009年，76:262-276)。如图12(A)所示，TNFα导致CLDN1表达显著增加，这与CD44(一种活化PEC标志物)表达增加相关(Shankland等人，《肾脏病学与高血压新见》，2013年，22:302-309)。此外，促炎基因表达(IL6、TNFα和CCL2)增加，表明进行了PEC活化(图12(B))。还在蛋白水平上证实了在炎症应激后CLDN1表达增加(图12(C))。在CLDN1基因沉默后，TNFα和胶原蛋白4A表达减少，这进一步证明了CLDN1在PEC活化和促炎/纤维化基因表达中的作用(图12(D))。有趣的是，通过流式细胞术分析证明，所述抗CLDN1mAb H3L3与PEC CLDN1结合(图12(E))。还在蛋白水平上证实了在炎症应激后CLDN1表达增加(图12(C))。由于发明人之前证明抗CLDN1 mAb仅与非连接CLDN1结合(Mailly等人，《自然生物技术》，2015年，33:549-554；Fofana等人，《胃肠病学》，2010年，139:953-964，064.e1-4；Colpitts等人，《肠道》，2017年，67(4):736-745)，H3L3最可能与PEC膜处的游离CLDN1胞外环结合。

由于CLDN1在活化PEC中过表达，发明人在3D培养模型中评估了H3L3对PEC增殖/活性的作用，再现了3D系统中的细胞间连接。正如预期的那样，他们观察到，在TNFα处理后，细胞增殖/活性增加。此外，初步数据表明，在H3L3处理后，细胞增殖/活性略有降低，这表明抗CLDN1 mAb可对PEC表型产生作用(参见图13(A))。在抗CLDN1 mAb治疗后，TNFα和CD44表达减少，这进一步支持了上述发现(参见图13(B))。

这些数据共同表明，PEC中的CLDN1过表达与炎症应激、细胞增殖有关，可能在CKD发病机制中发挥一定的作用。出于治疗目的，抗CLDN1 mAb可靶向在PEC中呈递的CLDN1。此外，从获得的数据中，可得出以下结论：在肾纤维化中，PEC为抗CLDN1 mAb的靶点，这种情况不同于在肝纤维化中所发生的情况。

示例8：纤维化队列中的CLDN1表达

为了研究CLDN1作为治疗靶点在不同纤维化疾病中的作用，发明人对其在肾纤维化、肺纤维化和炎症性肠病(IBD)患者中的表达进行了分析。从基因表达综合数据库中检索纤维化疾病中CLDN1基因表达水平的分析。

材料和方法

从基因表达综合数据库GEO(网站：www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中下载基因表达数据。单侧输尿管梗阻(UUO)模型的数据集为GSE60685(Lovisa等人，《自然-医学》，2015年，21:998-1009)；肾纤维化的数据集为GSE2052(Pardo等人，《PLoS医学》，2005年，2:e251)，COVID19为GSE15316。本研究所使用的炎症性肠病数据集为GSE9452(Olsen等人，《炎症性肠病》，2009年，15:1032-1038)、GSE38713(Planell等人，《肠道》，2013年，62:967-976)和GSE38713(Carey等人，《炎症性肠病》，2008年，14:446-457)。在综合数据库分析后，选择这些队列，发明人确定CLDN1基因作为微阵列数据的一部分。

结果

CLDN1基因表达与肺纤维化相关。CLDN1在与纤维化和EMT变化相关的病理性肺条件下过表达(Kaarteenaho-Wilk等人，《组织化学与细胞化学杂志》，2009年，57:187-195)。为了研究CLDN1作为治疗靶点在肺纤维化患者中的作用，发明人对其在肺纤维化患者中的表达进行了分析。CLDN1在各种病因的肺纤维化患者中过表达(图14(A))，这表明了CLDN1在器官纤维发生中的作用。值得注意的是，CLDN1在COVID19疾病(因肺部并发症(尤其是纤维化)而导致高发病率和死亡率的当前全球大流行)患者的肺脏中也上调(图14(B))(George等人，《柳叶刀-呼吸病学》，2020年，8:807-815。

CLDN1基因表达与溃疡性结肠炎相关。通过调节细胞增殖和炎症，CLDN1在肠道信号传导中发挥重要作用(Garcia-Hernandez等人，《纽约科学院年鉴》，2017年，1397:66-79)。此外，研究表明，CLDN1会加重结肠炎并影响康复，增加异型增生和炎症(Gowrikumar等人，《致癌基因》，2019年，38:6566；Pope等人，《肠道》，2014年，63:622-634)。在炎症性肠病(IBD)患者中，CLDN1蛋白表达以依赖于炎症的方式增加(Weber等人，《实验室研究》，2008年，88:1110-1120)。为了研究CLDN1作为治疗靶点在IBD患者中的作用，发明人对肺纤维化患者队列中的CLDN1表达进行了分析(图15)。CLDN1在溃疡性结肠炎患者中上调。

在单侧输尿管梗阻(UUO)模型的诱导肾纤维化中，CLDN1基因表达上调。单侧输尿管梗阻(UUO)模型用于诱导肾纤维化，UUO的主要特征是因尿流阻塞而导致肾小管损伤，从而导致氧化应激、炎症和肾纤维化(Martinez-Klimova等人，《生物分子》，2019年，9(4):141)。为了研究CLDN1在UUO中的作用，发明人对其在小鼠肾组织中的表达进行了分析。CLDN1在UUO样本中过表达，这表明其足以用于研究CLDN1在肾纤维化中的作用(图16)。

示例9：抗CLDN1 mAb在单侧输尿管梗阻(UUO)诱导肾间质纤维化中的体内疗效研究

本研究的目的是检查抗CLDN1 mAb对单侧输尿管梗阻诱导肾间质纤维化中的肾间质纤维化的作用。

材料和方法

测试物质。在发明人的实验室合成抗CLDN1 mAb的鼠化版本，并在本研究中使用。使用在293T细胞中表达的小鼠和人CLDN1进行亲和力研究，结果表明，尽管疗效明显较低，鼠化mAb与小鼠CLDN1结合。为了制备给药溶液，将盐溶液用作运载体，稀释所述抗CLDN1mAb。从勃林格殷格翰公司(法国)购买替米沙坦

在纯水中将其溶解。

单侧输尿管梗阻(UUO)手术。在第0天，在三种混合麻醉剂(美托咪定、咪达唑仑、布托啡诺)下，进行UUO手术。在剃毛后，切开腹部，取出左输尿管。在两点，使用4-0丝线将所述输尿管结扎。使用缝线缝合腹膜和皮肤，将小鼠转移至干净的笼子中，直至从麻醉中恢复。

给药途径。以100μL/小鼠的体积腹膜内施用所述抗CLDN1 mAb。以10μL/小鼠的体积口服替米沙坦。

治疗剂量。以500μg/100μL/小鼠的体积施用所述抗CLDN1 mAb。每天以30mg/kg的剂量施用替米沙坦一次。

动物。从日本SLC公司(日本)获得七周龄雌性C57BL/6J小鼠。在受控条件下，圈养动物，并喂食正常饮食(CE-2；日本CLEA公司(日本))。根据《日本药理学会动物使用指南》圈养并护理本研究所使用的所有动物。在温度(23±3℃)、湿度(50±20％)、光照(12小时人造光和黑暗循环；光照时间：8:00-20:00)和换气条件受控的SPF设施中饲养动物。实验室内保持高压，以防设施受到污染。在TPX笼子(日本CLEA公司)中圈养动物，每个笼子最多4只小鼠。在笼子中铺上无菌干净垫纸(日本SLC公司)，并每周更换一次。

随意提供无菌正常饮食，将其放在笼子顶部的金属盖子中。还在配有橡胶塞和吸管的水瓶中随意提供蒸馏水。每周更换水瓶一次、进行清洁、在高压灭菌器中灭菌并重复使用。

通过耳号钳识别小鼠。使用特定标识号标记每个笼子。

血浆生物化学测量。对于血浆生物化学，将非禁食血液采集到装有抗凝剂的聚丙烯管(Novo-Heparin，持田制药株式会社(日本))中，并在4℃温度下，以1000×g的离心力离心15分钟。采集上清液，并在使用前，在-80℃温度下储存。通过FUJI DRI-CHEM 7000(富士胶片公司(日本))对血浆尿素氮进行测量。

肾脏生物化学测量。为了对肾羟脯氨酸含量进行定量，通过如下酸碱水解法对冰冻左肾样本进行处理。在65℃的2N NaOH中溶解肾脏样本，并在121℃温度下高温灭菌20分钟。在121℃温度下，使用150μL 6N HCl将溶解样本(150μL)酸解20分钟，并使用含有10mg/mL活性炭的150μL 4N NaOH进行中和。向样本中加入AC缓冲液(2.2M乙酸/0.48M柠檬酸，150μL)，然后，通过离心采集上清液。从16μg/mL开始，通过反式-4-羟基-L-脯氨酸(西格玛奥德里奇公司(美国))的连续稀释，构建羟脯氨酸标准曲线。将所制备的样本和标准品(各400μL)与400μL氯胺T溶液(半井株式会社(日本))混合，并在室温下培养25分钟。然后，将所述样本与欧利希氏溶液(400μL)混合，并在65℃温度下加热20分钟，使其显色。在冰上冷却样本并离心去除沉淀物后，在560nm处测量各上清液的光密度。根据羟脯氨酸标准曲线计算羟脯氨酸的浓度。使用BCA蛋白检测试剂盒(Thermo Fisher Scientific(美国))测定肾脏样本的蛋白浓度，并使用此蛋白浓度对计算出的羟脯氨酸值进行归一化。以μg/mg蛋白的形式表示肾羟脯氨酸含量。

组织病理学分析。为了进行PAS染色，从石蜡块上切下切片，并根据制造商说明书使用希夫试剂进行染色(和光纯药工业株式会社)。为了观察肾小管损伤情况，使用数码相机(DFC295；徕卡显微系统公司(德国))，在100倍和400倍的放大倍数下捕获皮髓质区的明场像。

为了使胶原蛋白沉积可视化，使用天狼星红染色液(Waldeck公司(德国))对肾脏切片进行染色。为了对间质纤维化面积进行定量，使用数码相机(DFC295)，在200倍放大倍数下捕获皮髓质区的明场像，并使用ImageJ软件(国立卫生研究院(美国))测量5个场/切片中的阳性面积。

对于免疫组织化学，从石蜡块上切下切片，并进行脱蜡和再水化处理。使用0.3％H₂O₂将内源性过氧化物酶活性阻断5分钟，然后使用Block Ace(日本住友制药会社(日本))培养10分钟。在室温下，使用抗F4/80抗体(BMA生物医学(瑞士))的100倍稀释液培养切片1小时。在使用二级抗体(HRP-山羊抗大鼠抗体，英杰公司(美国))进行培养后，使用3,3’-二氨基联苯胺/H₂O₂溶液(日冷生物科学公司(日本))进行酶底物反应。为了对炎症面积进行定量分析，使用数码相机(DFC295)，在200倍和400倍放大倍数下捕获F4/80免疫染色切片的明场像。

采样。对于血浆样本，将非禁食血液采集到装有抗凝剂的聚丙烯管(Novo-Heparin)中，并在4℃温度下，以1000×g的离心力离心15分钟。采集20μL上清液，并在-80℃温度下储存，以供生物化学分析使用。在-80℃温度下储存剩余血浆，以便运输。

对于冰冻肾脏样本，采集左肾，并水平切成2块。将左肾上部固定在10％中性缓冲福尔马林中，然后包埋在石蜡中。在室温下储存石蜡块，以供组织学分析使用。沿冠状面将左肾下部切成2块。在液氮中将左肾下部速冻，并在-80℃温度下储存，以便运输。在液氮中将左肾后部速冻，并在-80℃温度下储存，以供肾脏生物化学分析使用。

统计检验。在GraphPad Prism 6(GraphPad软件公司(美国))上，通过邦费罗尼多重比较检验进行统计分析。P值<0.05时，认为具有统计学意义。当单尾t检验返回的P值<0.1时，假设存在某种趋势。以均值±标准差的形式表示结果。

实验设计和治疗

研究组。

第1组：运载体。从第0天到第13天，每周以100mL/小鼠的体积向8只UUO小鼠腹膜内施用运载体[盐水]两次。

第2组：抗CLDN1 mAb。从第0天到第13天，每周以500μg/100μL/小鼠的剂量向8只UUO小鼠腹膜内施用添加抗CLDN1 mAb的运载体两次。

第3组：替米沙坦。从第0天到第13天，每天以10mL/kg的体积及30mg/kg的剂量使8只UUO小鼠口服添加替米沙坦的纯水一次。

动物监测和处死。每天监测活性、临床体征和行为。在治疗前，每天测量个体的体重。在每次给药后，监测小鼠是否存在明显的中毒、垂死和死亡临床体征。在第14天，在异氟烷麻醉(辉瑞公司)下通过直接心脏穿刺放血，处死动物。

结果

目前的慢性肾病(如糖尿病性肾病)治疗方法包括替米沙坦(一种肾素-血管紧张素受体拮抗剂)，通过影响EMT，其在肾纤维发生中发挥保护作用(Balakumar等人，《药理学研究》，2019年，146:104314)。但是，由于疗效有限，目前替米沙坦在治疗慢性肾病和纤维化中的作用仅为辅助作用(Ruiz-Ortego等人，《自然综述-肾脏病学》，2020年，16，269-288；Balakumar等人，《药理学研究》，2019年，146:104314)。为了研究CLDN1在肾纤维发生中作为潜在靶点的情况，在单侧输尿管梗阻(UUO)肾纤维化小鼠模型中，与替米沙坦相比，对人源化抗CLDN1 mAb H3L3的作用进行了研究(Chevalier等人，《国际肾脏》，2009年，75:1145-1152)(参见图17(A)中的研究方案)。

体重变化和一般状况。如图18所示，在治疗期内的任何一天，运载体组和治疗组的平均体重无显著差异。在治疗期内，所有三个研究组均无死亡；所有动物的一般状况均未恶化。

处死之日的体重和肾脏重量。如图19(A)和表1所示，在处死之日，观察到运载体组和治疗组的平均体重无显著差异。如图19(B)所示，与运载体组相比，抗CLDN1 mAb组的平均右肾重量趋于增加。运载体组和替米沙坦组的平均右肾重量无显著差异。如图19(C)所示，与运载体组相比，抗CLDN1 mAb组的平均左肾重量增加。运载体组和替米沙坦组的平均左肾重量无显著差异。

表1.体重和肾脏重量

生物化学。血浆尿素氮。如图20(A)和表2所示，与运载体组相比，替米沙坦组的血浆尿素氮水平趋于增加。运载体组和抗CLDN1 mAb组的血浆尿素氮水平无显著差异。

肾羟脯氨酸。如图20(B)和表2所示，与运载体组相比，替米沙坦组的肾羟脯氨酸含量趋于降低。运载体组和抗CLDN1 mAb组的肾羟脯氨酸含量无显著差异。

表2.生物化学。

组织学分析。PAS染色。图21显示了PAS染色肾脏切片的代表性显微照片。运载体组中的肾脏切片出现炎性细胞浸润、重度肾小管扩张、萎缩和皮质区PAS阳性铸型形成。PAS染色证明，抗CLDN1 mAb组和替米沙坦组的炎性细胞浸润低于运载体组。

天狼星红染色和纤维化面积。图22显示了天狼星红染色肾脏切片的代表性显微照片。与运载体组相比，抗CLDN1 mAb组和替米沙坦组的胶原蛋白成比例面积(天狼星红阳性面积)显著减少(见表3)。

表3.纤维化面积

F4/80免疫染色。图23显示了F4/80免疫染色肾脏切片的代表性显微照片。在运载体组的肾脏切片中，肾小球区和皮质区均出现炎性细胞浸润。F4/80免疫染色证明，抗CLDN1mAb组和替米沙坦组的炎性细胞浸润低于运载体组。

如天狼星红染色和肾羟脯氨酸含量所示，运载体组出现肾纤维化。使用抗CLDN1mAb进行治疗，结果表明，与运载体组相比，纤维化面积明显及高度显著地减少，并且与运载体组相比，在血浆尿素氮检测中无毒性或增加迹象。因此，UUO小鼠肾组织的组织学分析表明，与对照组相比，抗CLDN1 mAb肾脏切片中的纤维化面积(天狼星红阳性面积)减少，中值为2.89％(Q1-Q3 1.52-4.25％)，而对照组的中值则为7.49％(Q1-Q3 5.6–9.36％)。虽然在体内还出现显著的抗纤维化作用，但是，使用替米沙坦进行治疗，会增加血浆尿素氮(一种慢性肾病的预后不良标志物)(Seki等人，《BMC肾脏病学》，2019年，20:115)。相比之下，所述抗CLDN1 mAb对血浆尿素氮无明显影响。最后，通过F4/80染色，对小鼠肾脏进行了组织学评估，结果表明，所述抗CLDN1 mAb可抑制巨噬细胞浸润。

结论

总之，本研究获得的结果表明，在所用UUO模型中，所述鼠化抗人抗CLDN1 mAb对肾纤维化具有明显及高度显著的抗纤维化作用。

示例10：CLDN1在人健康肾组织中的表达

材料和方法

测试物质。使抗CLDN1 mAb的人源化版本和同种型对照品生物素化(Squarix公司(德国))，并在本研究中使用。查尔斯河实验室(法国埃夫勒)提供健康人体组织(鲜冻)，按照特定程序，使用生物素化人源化抗CLDN1 mAb对其进行染色。使用甲醛锌将组织固定2分钟，使用PBS吐温(Sigma P3563)进行洗涤，并使用含有0.3％H₂O₂的PBS淬灭内源性过氧化物酶活性20分钟。在含有1％吐温20和10％人血清的缓冲液中，使用10μg抗体培养组织切片1小时，使用PBS洗涤2次30分钟，并根据制造商说明书使用Streptavidin HRP试剂盒(KirElite，Vector公司)进行检测。

结果

图24显示，在肾小球的鲍氏膜和足细胞(箭头)处，观察到不同的Claudin 1特异性染色情况。小管弱染色不具有特异性，因为在同种型对照抗体中也观察到这一点(在查尔斯河实验室(法国埃夫勒)进行研究)。

示例11：CLDN1在人纤维化肾组织中的表达

材料和方法

测试物质。通过标准方法，使用兔多克隆抗CLDN1抗体Ab(Elabscience，E-AB-30939)对一系列福尔马林固定固定切片进行染色。由Solange Moll教授提供组织(日内瓦大学(瑞士))。

结果

图25显示了健康组织和病变组织之间的鉴别染色，在肾纤维化组织中观察到较强的信号：在(1)ANCA(抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎)肾小球肾炎的新月体和(2)经皮质类固醇(CS)和/或环孢素A(CyA)处理的I型和II型FSGS(局灶性节段性肾小球硬化症)中演示了染色情况。这表明，Claudin-1作为靶点，在不同形式的人肾纤维化中过表达。此外，Claudin-1的这种过表达与接受最先进疗法(如皮质类固醇和环孢素A)的患者的治疗状态无关。

示例12：使用抗Claudin-1单克隆抗体改善肾功能并预防肾纤维化

使用阿霉素诱导肾病模型进行本研究。

材料和方法

所述阿霉素诱导肾病(ADR)模型是一种特征明确的慢性肾病疾病模型，反映了因原发性局灶性节段性肾小球硬化症(FSGS)而导致的人类肾病。所述阿霉素诱导肾病模型是一种小鼠模型，模拟了人FSGS(局灶性节段性肾小球硬化症)。根据当地的道德和动物护理标准，在SMC实验室(日本东京)进行疗效研究。在第0天，即以13mg/kg的剂量、10mL/kg的体积向小鼠静脉内施用阿霉素(盐酸阿霉素，和光纯药工业株式会社(日本))的0.9％盐溶液时，开始对阿霉素诱导肾病模型进行诱导。

向每组的八只阿霉素诱导肾病雄性BALB/c小鼠腹膜内施用运载体[盐水]、抗CLDNA 1mAb H3L3(250μg/小鼠，每周两次)27天，或将VPA(＝丙戊酸，含0.4％丙戊酸的饮用水)用作阳性对照品。通过FUJI DRI-CHEM 7000(富士胶片公司(日本))对血清肌酐和BUN(血浆尿素氮)进行测量。

结果

图26显示，与对照组和丙戊酸治疗组相比，抗Claudin 1 mAb治疗组的血清肌酐和血清BUN降低，虽不显著，但很明显。这表明，使用抗Claudin 1抗体进行治疗，可改善肾功能和健康状态(这些标志物减少便是证明)，所取得的治疗效益优于完善的标准治疗方法。

其他实施例

从所公开发明的说明书和实践中，本领域的技术人员可明确了解本发明的其他实施例。本说明书和示例仅用作示例，本发明的真实范围如权利要求所述。

序列表

<110> 斯特拉斯堡大学

法国国家健康与医学研究院

阿伦蒂斯治疗股份公司

<120>用于预防和治疗纤维化疾病的抗Claudin-1单克隆抗体

<130> BCT200317 QT

<150> EP 19 208 560.3

<151> 2019-11-12

<160> 8

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OM-7D3-B3的可变重链

<400> 1

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Leu Gly Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Pro Ser Gly Ser Tyr Phe Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Pro Gly Phe Asn Pro Pro Phe Asp His Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Val Val Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 2

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OM-7D3-B3的可变轻链

<400> 2

Asn Thr Val Met Thr Gln Ser Pro Thr Ser Met Phe Met Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Met Asn Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Gly Asn

20 25 30

Val Asp Trp Tyr Gln Trp Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Met

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Arg Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Met Gln Thr

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Lys Asn Asn Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Leu Lys

100 105

<210> 3

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化可变重链H3

<400> 3

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Leu Gly Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Pro Ser Gly Ser Tyr Phe Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Pro Gly Phe Asn Pro Pro Phe Asp His Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 4

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化可变重链H2

<400> 4

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Thr Ser Ile Ser Pro Ser Gly Ser Tyr Phe Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Pro Gly Phe Asn Pro Pro Phe Asp His Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 5

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化可变重链H1

<400> 5

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Pro Ser Gly Ser Tyr Phe Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Pro Gly Phe Asn Pro Pro Phe Asp His Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 6

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化可变轻链L3

<400> 6

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Gly Asn

20 25 30

Val Asp Trp Tyr Gln Trp Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Arg Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Lys Asn Asn Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 7

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化可变轻链L2

<400> 7

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Gly Asn

20 25 30

Val Asp Trp Tyr Gln Trp Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Arg Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Lys Asn Asn Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 8

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化可变轻链L1

<400> 8

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Gly Asn

20 25 30

Val Asp Trp Tyr Gln Trp Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Arg Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Lys Asn Asn Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

Claims (21)

1.一种抗Claudin-1抗体或其生物活性片段，用于在受试者中预防或治疗选自肾纤维化、肺纤维化和皮肤纤维化的一种纤维化疾病。

2.根据权利要求1所述的抗Claudin-1抗体或其生物活性片段，其中，所述肺纤维化选自：特发性肺纤维化(IPF)、特发性非特异性间质性肺炎(NSIP)、隐源性机化性肺炎(COP)、Hamman-Rich综合征、淋巴细胞性间质性肺炎(LIP)、呼吸性细支气管炎伴间质性肺病、脱屑性间质性肺炎或特发性淋巴样间质性肺炎和特发性胸膜肺实质弹力纤维增生症。

3.根据权利要求1所述的抗Claudin-1抗体或其生物活性片段，其中，所述肺纤维化与慢性阻塞性肺病相关，或者，肺纤维化为COVID19相关性纤维化。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的抗Claudin-1抗体或其生物活性片段，其中，所述纤维化疾病为肺纤维化，所述抗Claudin-1抗体或其生物活性片段与选自皮质类固醇、抗纤维化剂、吡非尼酮、尼达尼布和抗酸药物的至少一种治疗剂和/或与选自肺移植、高压氧疗法和肺康复的一种治疗程序联合施用。

5.根据权利要求1所述的抗Claudin-1抗体或其生物活性片段，其中，所述肾纤维化为肾间质纤维化或肾小球硬化症。

6.根据权利要求1或权利要求5所述的抗Claudin-1抗体或其生物活性片段，其中，所述肾纤维化与慢性肾病相关。

7.根据权利要求1、5和6中任一项所述的抗Claudin-1抗体或其生物活性片段，其中，所述纤维化疾病为肾纤维化，所述抗Claudin-1抗体或其生物活性片段与选自抗高血压药、1,25-二羟基维生素D3、促红细胞生成素、血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素II受体拮抗剂AST-120和聚苯乙烯磺酸钙的至少一种治疗剂和/或与选自透析和肾移植的一种治疗程序联合施用。

8.根据权利要求1所述的抗Claudin-1抗体或其生物活性片段，其中，所述皮肤纤维化与选自局限性硬皮病、系统性硬皮病、移植物抗宿主病(GVHD)、肾源性纤维化皮肤病、混合性结缔组织病、硬皮病、硬化性黏液水肿、嗜酸性筋膜炎、着色芽生菌病、肥厚性瘢痕和瘢痕疙瘩的一种病症相关。

9.根据权利要求1或权利要求8所述的抗Claudin-1抗体或其生物活性片段，其中，所述抗Claudin-1抗体或其生物活性片段与选自甲氨蝶呤、吗替麦考酚酯、环磷酰胺、环孢素、托珠单抗、利妥昔单抗和非苏木单抗的至少一种治疗剂和/或与至少一种治疗程序联合施用。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的抗Claudin-1抗体或其生物活性片段，其中，所述抗Claudin-1抗体为单克隆抗体。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的抗Claudin-1抗体或其生物活性片段，其中，所述抗Claudin-1抗体为单克隆抗体，其表位与2008年7月29日以登录号DSM ACC2931、DSMACC2932、DSM ACC2933、DSM ACC2934、DSM ACC2935、DSM ACC2936、DSM ACC2937和DSMACC2938在DSMZ保藏的一种杂交瘤细胞系所分泌的抗Claudin-1单克隆抗体的表位相同。

12.根据权利要求11所述的抗Claudin-1抗体或其生物活性片段，其中，所述表位强烈依赖Claudin-1第一胞外环中保守基序W(30)-GLW(51)-C(54)-C(64)的保守性。

13.根据权利要求1-10中任一项所述的抗Claudin-1抗体或其生物活性片段，其中，所述抗Claudin-1抗体为单克隆抗体，由2008年7月29日以登录号DSM ACC2931、DSM ACC2932、DSM ACC2933、DSM ACC2934、DSM ACC2935、DSM ACC2936、DSM ACC2937和DSM ACC2938在DSMZ保藏的一种杂交瘤细胞系分泌。

14.根据权利要求1-12中任一项所述的抗Claudin-1抗体或其生物活性片段，其中，所述抗Claudin-1抗体为单克隆抗体，包含2008年7月29日以登录号DSM ACC2931、DSMACC2932、DSM ACC2933、DSM ACC2934、DSM ACC2935、DSM ACC2936、DSM ACC2937和DSMACC2938在DSMZ保藏的一种杂交瘤细胞系所分泌的抗Claudin-1单克隆抗体的六个互补决定区(CDR)。

15.根据权利要求1-12和14中任一项所述的抗Claudin-1抗体或其生物活性片段，其中，所述抗Claudin-1抗体为人源化抗体。

16.根据权利要求15所述的抗Claudin-1抗体或其生物活性片段，其中，所述抗Claudin-1抗体为人源化单克隆抗体，包含以登录号DSM ACC2938保藏的杂交瘤细胞系所分泌的单克隆抗体OM-7D3-B3的所有六个CDR，其中，OM-7D3-B3的可变重链包含氨基酸序列SEQ ID NO：1，OM-7D3-B3的可变轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO：2，所述人源化单克隆抗体进一步包含：

a)至少一个抗体可变重链(VH)，其中包含氨基酸序列SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQID NO：5，或

b)至少一个抗体可变轻链(VL)，其中包含氨基酸序列SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQID NO：8。

17.根据权利要求16所述的抗Claudin-1抗体或其生物活性片段，其中，所述抗Claudin-1人源化单克隆抗体包含：

a)两个抗体可变重链(VH)，这两个可变重链均包含氨基酸序列SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：4或SEQ ID NO：5，或

b)两个抗体可变轻链(VL)，这两个可变轻链均包含氨基酸序列SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：7或SEQ ID NO：8。

18.根据权利要求17所述的抗Claudin-1抗体或其生物活性片段，其中，所述抗Claudin-1人源化单克隆抗体包含：

1)两个抗体可变重链(VH)(包含氨基酸序列SEQ ID NO：3)以及两个抗体可变轻链(VL)(包含氨基酸序列SEQ ID NO：6[H3L3])；或

2)两个抗体可变重链(VH)(包含氨基酸序列SEQ ID NO：3)以及两个抗体可变轻链(VL)(包含氨基酸序列SEQ ID NO：7[H3L1])；或

3)两个抗体可变重链(VH)(包含氨基酸序列SEQ ID NO：3)以及两个抗体可变轻链(VL)(包含氨基酸序列SEQ ID NO：8[H3L2])；或

4)两个抗体可变重链(VH)(包含氨基酸序列SEQ ID NO：4)以及两个抗体可变轻链(VL)(包含氨基酸序列SEQ ID NO：6[H1L3])；或

5)两个抗体可变重链(VH)(包含氨基酸序列SEQ ID NO：4)以及两个抗体可变轻链(VL)(包含氨基酸序列SEQ ID NO：7[H1L1])；或

6)两个抗体可变重链(VH)(包含氨基酸序列SEQ ID NO：4)以及两个抗体可变轻链(VL)(包含氨基酸序列SEQ ID NO：8[H1L2])；或

7)两个抗体可变重链(VH)(包含氨基酸序列SEQ ID NO：5)以及两个抗体可变轻链(VL)(包含氨基酸序列SEQ ID NO：6[H2L3])；或

8)两个抗体可变重链(VH)(包含氨基酸序列SEQ ID NO：5)以及两个抗体可变轻链(VL)(包含氨基酸序列SEQ ID NO：7[H2L1])；或

9)两个抗体可变重链(VH)(包含氨基酸序列SEQ ID NO：5)以及两个抗体可变轻链(VL)(包含氨基酸序列SEQ ID NO：8[H2L2])。

19.根据权利要求15-18中任一项所述的抗Claudin-1抗体或其生物活性片段，其中，所述人源化抗体为完整抗体，其同种型选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。

20.一种药物合成物，包含有效量的抗Claudin-1抗体或其生物活性片段以及至少一种可药用载体或赋形剂，用于在受试者中预防或治疗选自肺纤维化、肾纤维化和皮肤纤维化的一种纤维化疾病。

21.根据权利要求20所述的药物合成物，其中，所述纤维化疾病的定义见权利要求2-9中的任一项，和/或其中，所述抗Claudin-1抗体或其生物活性片段的定义见权利要求10-19中的任一项。

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