CN104411826A

CN104411826A - 使用腺病毒和化学二聚体的选择性细胞寻靶

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Publication number: CN104411826A
Application number: CN201380021787.3A
Authority: CN
Inventors: C·奥谢; S·米亚克-斯托纳; C·帕沃斯
Original assignee: Salk Institute for Biological Studies
Current assignee: Salk Institute for Biological Studies
Priority date: 2012-03-13
Filing date: 2013-03-13
Publication date: 2015-03-11
Also published as: JP6170999B2; WO2013138505A1; CA3215250A1; EP2825649A1; EP2825649B1; US20150017127A1; US9913866B2; CA2867129A1; CN110592123A; JP2015511822A; EP2825649A4; AU2013232101B2; CA2867129C; AU2013232101A1; US20180147245A1

Abstract

本发明提供了用化学二聚体使腺病毒再靶向细胞的组合物和方法。具体地，本发明提供了含有核酸的重组腺病毒，所述核酸包含衣壳-二聚化试剂结合物的缀合物和配体-二聚化试剂结合物的缀合物。

Description

使用腺病毒和化学二聚体的选择性细胞寻靶

关于作为ASCII文本文件提交的“序列表”，表格或计算机程序列表附件

序列表记录在文件92159-868148_ST25.TXT中，该文件创建于2013年3月13日，780,854字节，机器格式IBM-PC，MS-Windows操作系统，并且以引用的方式纳入本文。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2012年3月13日提交的美国临时申请No.61/610,416的优先权，所述临时申请为了所有目的全文纳入本文。

背景技术

癌症是一种使人衰弱的疾病，其每年导致50万以上的死亡。非常需要更有效的、更具选择性的和更安全的癌症疗法。现有的用于这类普遍的、威胁生命的疾病的疗法——例如化学疗法和外科手术，很少能消除所有恶性细胞，并且经常表现出超过治疗益处的有害副作用。

一种有可能解决目前癌症治疗的很多弱点的方法是溶瘤腺病毒疗法(Pesonen,S.et al.,Molecular Pharmaceutics,.8(1):p.12-28(2010))。这些病毒被设计为特异性地在癌细胞中复制，而不伤害正常细胞。一种设计改造肿瘤选择性的方式是使腺病毒感染靶向肿瘤细胞上上调的受体，所述受体是例如，EGFR家族成员(Zhang H,Berezov A,Wang Q,Zhang G,Drebin J,Murali R,et al..ErbB receptors:from oncogenes to targeted cancer therapies.J Clin Invest.2007；117(8):2051-8.PMCID:1934579)、CEACAM(Li HJ,Everts M,Pereboeva L,Komarova S,Idan A,Curiel DT,.Adenovirus tumor targeting and hepatic untargeting by a coxsackie/adenovirus receptor ectodomain anti-carcinoembryonic antigen bispecific adapter.Cancer Res.2007；67(11):5354-61)、EpCAM(Haisma HJ,Pinedo HM,Rijswijk A,der Meulen-Muileman I, Sosnowski BA,Ying W,et al..Tumor-specific gene transfer via an adenoviral vector targeted to the pan-carcinoma antigen EpCAM.Gene Ther.1999；6(8):1469-7)和HLA-A1/MAGE-A1(de Vrij J,Uil TG,van den Hengel SK,Cramer SJ,Koppers-Lalic D,Verweij MC,et al..Adenovirus targeting to HLA-A1/MAGE-A1-positive tumor cells by fusing a single-chain T-cell receptor with minor capsid protein IX.Gene Ther.2008；15(13):978-89)。关于腺病毒靶向的各种策略的综述，参见(Noureddini SC,Curiel DT.Genetic targeting strategies for adenovirus.Mol Pharm.2005；2(5):341-7；Nicklin SA,Wu E,Nemerow GR,Baker AH.The influence of adenovirus fiber structure and function on vector development for gene therapy.Mol Ther.2005；12(3):384-93)。

腺病毒(Ad)是一个自我复制的生物机器。其由包裹在蛋白衣壳中的线性双链36kb的DNA基因组组成。Ad需要人宿主细胞来进行复制。其侵袭并劫持细胞复制机器以进行复制而且一旦组装就诱导溶解性细胞死亡以逃离所述细胞并扩散和侵袭周围细胞(图1)。从来没有系统能近似模拟Ad的自主性(autonomy)和效率，但是，申请人已经开发了新的策略来系统地操纵Ad基因组以形成新的腺病毒。今后，在能够操纵Ad基因组的情况下，申请人可以直面涉及该病毒的难题并重新设计该病毒以使其能发挥肿瘤特异性感染、复制和细胞杀伤的作用。

目前，腺病毒载体依赖单个细胞受体进行它们的摄取，这严重限制了它们的治疗潜力。Ad5感染主要通过外部病毒衣壳上的尾丝(fiber)蛋白与人上皮细胞上的柯萨奇腺病毒受体(CAR)之间的相互作用介导。不幸的是，很多癌症细胞不表达CAR，例如间质肿瘤细胞和致命的转移性肿瘤细胞。由于感染细胞的能力限制了病毒的复制/杀伤，因此需要通过非CAR的受体来感染肿瘤细胞的病毒，理想地，所述受体为肿瘤细胞上特异性上调的那些受体。本发明通过提供病毒组合物以及通过化学接头(adaptor)将病毒衣壳以化学方法连接至多种细胞受体的方法解决了本领域的这些和其他需求。本文提供了一种新的、可诱导的、遗传编码的化学接头系统，所述系统使感染再靶向多种细胞类型，并且在病毒复制时不会丢失。可使用本文提供的组合物定制溶瘤病毒以在感染过程中靶向不同的细胞受体。

发明内容

在一方面，本发明提供了编码衣壳-二聚化试剂结合物的缀合物和配体-二聚化试剂结合物的缀合物的重组核酸。

在另一方面，提供了包含本文(包括其实施方案)提供的重组核酸的重组腺病毒。

在另一方面，提供了包含衣壳-二聚化试剂结合物的缀合物的重组腺病毒。

在另一方面，提供了包含本文(包括其实施方案)提供的重组腺病毒的细胞。

在另一方面，提供了一种形成靶向腺病毒癌细胞的构建体的方法。所述方法包括用本文提供的重组腺病毒感染细胞，从而形成腺病毒感染的细胞。使所述腺病毒感染的细胞表达所述重组核酸，从而形成配体-二聚化试剂结合物的缀合物和包含衣壳-二聚化试剂结合物的缀合物的重组腺病毒。使所述重组腺病毒和所述配体-二聚化试剂结合物的缀合物与二聚化试剂接触。使所述重组腺病毒和配体-二聚化试剂结合物的缀合物与所述二聚化试剂结合，从而形成所述靶向腺病毒癌细胞的构建体。

在另一方面，提供了靶向细胞的方法。所述方法包括使本文(包括其实施方案)提供的重组腺病毒与细胞接触。

在另一方面，提供了靶向癌症患者中的癌细胞的方法。所述方法包括将本文提供的重组腺病毒给予癌症患者。使所述重组腺病毒感染癌症患者中的细胞，从而形成腺病毒感染的细胞。使所述腺病毒感染的细胞表达所述重组核酸，从而形成配体-二聚化试剂结合物的缀合物和包含衣壳-二聚化试剂结合物的缀合物的重组腺病毒。将二聚化试剂给予所述癌症患者。使所述重组腺病毒和所述配体-二聚化试剂结合物的缀合物与所述二聚化试剂结合，从而形成靶向腺病毒癌细胞的构建体。使所述靶向腺病毒癌细胞的构建体与癌细胞结合，从而靶向所述癌症患者中的癌细胞。

在另一方面，提供了靶向细胞的方法。所述方法包括使本文提供的重组腺病毒与第一细胞接触。使所述重组腺病毒感染所述第一细胞，从而形成腺病毒感染的细胞。使所述腺病毒感染的细胞表达所述重组核酸，从而形成配体-二聚化试剂结合物的缀合物和包含衣壳-二聚化试剂结合物的缀合物的重组腺病毒。使所述配体-二聚化试剂结合物的缀合物和所述重组腺病毒与二聚化试剂接触。使所述重组腺病毒和所述配体-二聚化试剂结合物的缀合物与所述二聚化试剂结合，从而形成靶向腺病毒细胞的构建体。使所述靶向腺病毒细胞的构建体与第二细胞结合，从而靶向该细胞。

附图说明

图1：溶瘤病毒癌症疗法的一般原理。

图2：腺病毒的结构特征以及带有方框内的转录单元和标记的基因的腺病毒基因组的图谱。

图3：申请人开发的Adsemly和Ad-SlicR腺病毒基因组操纵策略的示意略图。图3A上图：将Ad基因组分成通过可变剪接表达多个基因的早期(E1-4)转录单元和晚期(L1-5)转录单元。箭头代表腺病毒所使用的多基因转录单元，所述腺病毒类似操纵子的功能组织。将所述基因组分成转录单元和功能单元(“部件”)并将其克隆到质粒中(图3A下图)。所述部件的文库包括突变体、可变血清型和转基因。进行了病毒的系统性多位点特异性体外组装(Adsemly或Ad-SLIC)以及重建。图3B:将腺病毒基因组(图3B上部)分成各个组件(图3B第二部分，从上部看)。在单个载体上进行诱变以构建文库部件(图3B第三部分，从上部看)，并且所述病毒在体外组装(图3B底部)以生成新的腺病毒。

图4：腺病毒尾丝蛋白三聚体的条带示意图。N末端(左边)结合到衣壳的表面，C-末端结节(knob)结构域离病毒核心最远。已经将柔性H1环结节结构域被用于肽插入片段以赋予尾丝新的特性。

图5：免疫抑制性的抗肿瘤药物和抗生素雷帕霉素以及雷帕霉素类似物(rapalog)AP21967的结构。

图6：利用组件的构建和组合以系统地制备新腺病毒中的突变组合的基因组组装策略。

图7：Ad122是表达带有FRB插入片段的尾丝的有活力的腺病毒。Ad-122是表达带有FRB插入片段的尾丝的有活力的腺病毒。图7A：使用抗尾丝的抗体4D2(Abcam)对Ad-122和野生型Ad5感染48小时后的293E4细胞的裂解物进行的蛋白质印迹分析。图7B：Ad-122感染48小时后的293E4细胞的明场图像和GFP荧光图像(显示出显著的CPE)。

图8：从Ad5E3区域表达FRB-尾丝和FKBP的基因结构。图8A)野生型Ad5E3区域。图8B)FRB插入到尾丝基因中。图8C)使用Furin-2A自动切割序列来共翻译表达FKBP。图8D)使用尾丝转录物上的IRES元件来共转录表达FKBP。图8E)用FKBP替换E3B编码的蛋白(RIDα、RIDβ、14.7k)。

图9：AD-178在感染期间表达FKBP。感染后24小时和60小时，收集感染的293E4细胞的裂解物，并用抗尾丝的抗体(图9上图)和抗FKBP的抗体ab2918(Abcam；图9下图)检测。

图10：FRB-尾丝结节结构域与雷帕霉素/VHH-FKBP和VHH靶标的复合物的条带模型。带有FRB结构域的Ad5结节三聚体(PDB ID 1KNB)与作为VHH的C-末端融合蛋白的FKBP(PDB ID 1NSG)形成复合物，并结合其靶标(PDB ID 3EBA)。图10A)俯视视角的模型。图10B)侧面视角的模型，表明如果VHH和FKBP的N末端融合，则其结合界面背对着所述病毒颗粒。

图11.使用免疫荧光检测感染的293E4细胞中尾丝和CEA VHH-FKBP的定位。用Ad-177(CEA VHH-FKBP、FRB-尾丝)或Ad-199(CEA VHH-FKBP、野生型尾丝)感染293E4细胞并在感染后30小时加入500nM雷帕霉素或仅加入溶剂(EtOH)。在第36小时对细胞进行固定并用抗尾丝的抗体4D2或抗FBKP的抗体ab2918(Abcam)对细胞染色。

图12.当通过尾丝基因5’IRES进行调控时，FKBP融合蛋白没有可检测地累积。用重组腺病毒感染293E4细胞。收集细胞并通过免疫印迹检测可溶性蛋白中尾丝和FKBP的表达。(图12上图)FRB-尾丝在感染期间累积。(图12下图)检测不到VHH-FKBP(约32kDa)。

图13.对MDA MB 468进行的雷帕霉素诱导的EGFR-再靶向Ad5感染的代表性ImageXpress图像。在存在500nM雷帕霉素或不存在雷帕霉素的情况下通过感染293E4细胞制备表达GFP报告分子的Ad-178，并用上清液感染培养中的MDA MB 468。图13左边部分代表用未稀释的病毒上清液进行的感染；图13右边部分代表用稀释16倍的病毒上清液进行的感染。

图14.对MDA MB 453进行的雷帕霉素诱导的EGFR-再靶向Ad5感染的代表性ImageXpress图像。在存在500nM雷帕霉素或不存在雷帕霉素的情况下通过感染293E4细胞制备表达GFP报告分子的Ad-178，并将上清液用于感染培养中的MDA MB 453。图14左边部分代表用未稀释的病毒上清液进行的感染；图14右边部分代表用稀释8倍的病毒上清液进行的感染。

图15.对MDA MB 231进行的雷帕霉素诱导的EGFR-再靶向Ad5感染的代表性ImageXpress图像。在存在或不存在500nM雷帕霉素的情况下通过感染293E4细胞制备表达GFP报告分子的Ad-178，并将上清液用于感染培养中的MDA MB 231。图15左边部分代表用未稀释的病毒上清液进行的感染；图15右边部分代表用稀释8倍的病毒上清液进行的感染。

图16.对HS578T进行的雷帕霉素诱导的EGFR-再靶向Ad5感染的代表性ImageXpress图像。在存在或不存在500nM雷帕霉素的情况下通过感染293E4细胞制备表达GFP报告分子的Ad-178，并将上清液用于感染培养中的HS578T。图16左边部分代表用未稀释的病毒上清液进行的感染；图16右边部分代表用稀释4倍的病毒上清液进行的感染。

图17.对U87进行的雷帕霉素诱导的EGFR-再靶向Ad5感染的代表性ImageXpress图像。在存在或不存在500nM雷帕霉素的情况下通过感染293E4细胞制备表达GFP报告分子的Ad-178，并将上清液用于感染培养中的U87。图17左边部分代表用未稀释的病毒上清液进行的感染；图17右边部分代表用稀释8倍的病毒上清液进行的感染。

图18.用雷帕霉素诱导的EGFR再靶向腺病毒来感染一组乳腺癌细胞系。在存在或不存在500nM雷帕霉素的情况下通过感染293E4细胞制备表达GFP报告分子的Ad-178，并将上清液稀释50倍用于感染培养中的细胞。在感染后24小时通过对GFP阳性核进行ImageXpress分析来测定感染的细胞的百分数。柱状图中的每一对柱子显示了在不存在雷帕霉素时(左柱)或存在雷帕霉素时(右柱)制备的表达GFP报告分子的Ad-178对乳腺癌细胞系的感染。柱状图从左到右分别示出了对如下细胞的感染：MDA MB468细胞(不加雷帕霉素时为90％；加入雷帕霉素时为96％)、MDA MB415细胞(不加雷帕霉素时为69％；加入雷帕霉素时为55％)、MDA MB453(不加雷帕霉素时为16％；加入雷帕霉素时为73％)、MDA MB231(不加雷帕霉素时为16％；加入雷帕霉素时为78％)、BTS49(不加雷帕霉素时为37％；加入雷帕霉素时为74％)和HS578(不加雷帕霉素时为0％；加入雷帕霉素时为28％)。

图19.用雷帕霉素诱导的EGFR再靶向腺病毒感染一组乳腺癌细胞系。在存在或不存在500nM雷帕霉素的情况下通过感染293E4细胞制备表达GFP报告分子的Ad-178，并将上清液稀释50倍用于感染培养中的不同癌细胞。在感染后24小时通过对GFP阳性核进行ImageXpress分析来确定感染的细胞的百分数。柱状图中的每一对柱子显示了在不存在雷帕霉素时(左柱)或存在雷帕霉素时(右柱)制备的表达GFP报告分子的Ad-178对癌细胞系的感染。柱状图从左到右分别示出了对如下细胞的感染：U2OS骨肉瘤细胞系(不加雷帕霉素时为52％；加入雷帕霉素时为24％)、H1299肺癌细胞系(不加雷帕霉素时为78％；加入雷帕霉素时为78％)、A549肺癌细胞系(不加雷帕霉素时为37％；加入雷帕霉素时为66％)和U87恶性胶质瘤细胞系(不加雷帕霉素时为11％；加入雷帕霉素时为50％)。

图20.用于以Ad-178感染MDA MB 453的EGFR再靶向的雷帕霉素浓度优化。在感染293E4细胞期间，在存在或不存在各种雷帕霉素浓度的情况下制备表达GFP报告分子的Ad-178，并将上清液用于感染培养中的MDA MB 453细胞。在感染后24小时通过对GFP阳性细胞的FACS分析来测定感染的细胞的百分数。GFP阳性细胞的百分数分别如下：在0nM雷帕霉素下为54.13％、在10nM雷帕霉素下为58.96％、在25nM雷帕霉素下为68.23％、在50nM雷帕霉素下为76.75％、在100nM雷帕霉素下为70.73％和在500nM雷帕霉素下为71.76％。

图21.依赖于EGFR的Ad-178感染。通过FACS对感染进行定量，对表达腺病毒递送的GFP基因的细胞进行计数，每次>30k件事件。图21A:在存在或不存在50nM雷帕霉素的情况下制备的腺病毒，所述腺病毒在尾丝上带有遗传编码的FRB结构域插入片段并含有EGFRVHH-FKBP融合蛋白，用所述腺病毒感染有或没有shRNA-介导的EGFR 敲低的MDA MB 453细胞。图21B：在存在或不存在50nM雷帕霉素的情况下制备腺病毒，所述腺病毒仅在尾丝上带有遗传编码的FRB结构域插入片段，用所述腺病毒感染有或没有shRNA-介导的EGFR敲低的MDA MB 453细胞。图21C：通过蛋白质免疫印记确认MDA MB 453细胞中稳定的、shRNA-介导的EGFR敲低。

图22.雷帕霉素诱导的Ad-178的EGFR再靶向增强了对HS578T的细胞杀伤。用于感染后9天的代谢活性百分数对比未感染细胞的使用WST-1试剂的CPE测定。在图例中显示的时间点向细胞加入50nM雷帕霉素。显示的数据点是三次重复的样品的平均值。

图23.用对照Ad、或用编码与FKBP融合的配体的Ad对细胞系进行靶向感染。所述病毒编码与FKBP融合的CEACAM单域抗体片段(CEA VHH-FKBP)、与FKBP融合的EGFR单域抗体片段(EGFR VHH-FKBP)或与FKBP融合的保护性抗原的结构域4(D4-FKBP)。在存在或不存在100nM雷帕霉素的情况下通过感染293E4细胞制备腺病毒，并将上清液用于感染目标细胞系：图23A示出了对MDA MB231的感染。图23B示出了对MDA MB453的感染。图23C示出了对MDA MB468的感染。图23D示出了对HS578T的感染。图23E示出了对BT474的感染。图23F示出了对MCF7的感染。图23G示出了对CHO K1的感染。图23H示出了对CHO R1.1的感染。在柱顶部的数字代表GFP(即感染的)细胞的百分数。

图24.使用AP21967和包含突变的FRB结构域的Ad对细胞系进行靶向感染。在存在或不存在100nM雷帕霉素或100nM AP21967的情况下通过感染293E4细胞制备腺病毒，并将上清液用于感染目标细胞系：图24A示出了对MDA MB453的感染。图24B示出了对MDA MB468的感染。图24C示出了对HS578T的感染。图24D示出了对MCF7的感染。在柱顶部的数字代表GFP(即感染的)细胞的百分数。

图25.用AP21967和包含突变的FRB结构域的Ad对细胞系进行靶向感染。用一系列浓度的AP21967或100nM雷帕霉素通过感染293E4细胞制备含有位于衣壳中的FRB突变体的EGFR-靶向腺病毒，并将上清液用于感染MDA MB 453。在柱顶部的数字代表GFP(即感染的)细胞的百分数。

图26.对异位表达配体-FKBP融合蛋白——EGFR VHH-FKBP的细胞系的靶向感染。在293E4细胞中瞬时表达配体-FKBP融合蛋白(或作为对照的GFP)，并用Ad-122转染细胞。在存在或不存在100nM雷帕霉素的情况下制备所述病毒，并将上清液用于感染MDA MB 231。在柱顶部的数字代表GFP(即感染的)细胞的百分数。

图27A-C.用对照Ad、或编码和FKBP融合的配体的Ad对细胞系进行靶向感染。在存在或不存在100nM雷帕霉素的情况下通过感染293E4细胞制备所述腺病毒，并将上清液用于感染所述目标细胞系。图27A的上图示出了对MDA MB231的感染。图27A的中图示出了对MDA MB453的感染。图27A的下图示出了对MDA MB468的感染。图27B的上图示出了对HS578T的感染。图27B的中图示出了对BT474的感染。图27B的下图示出了对MCF7的感染。图27C的上图示出了对CHO K1的感染。图27C的下图示出了对CHO R1.1的感染。在柱顶部的数字代表GFP(即感染的)细胞的百分数。

具体实施方式

I.定义

“核酸”指的是单链或双链形式脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其多聚体，以及它们的互补序列。所述术语包括含有已知的核酸类似物或修饰的主链残基或修饰的连接的核酸，所述核酸可以是合成的、天然存在的和非天然存在的，具有与参照核酸相似的结合特性，并且以与参考核酸类似的方式代谢。这样的类似物的实例包括，但不限于，硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、磷酸甲酯、手性磷酸甲酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。

本文使用的术语“Ad5”和“腺病毒基因组”指的是SEQ ID NO:108中列出的核酸序列。

除非另有说明，特定的核酸序列也暗含其保守性修饰的变体(例如，简并密码子置换)和互补序列以及明确指定的序列。具体地，简并密码子置换可以通过产生其中一个或多个所选(或所有)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷置换的序列来实现(Batze等,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；Rossolini等人,Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。术语核酸可与基因、 cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸互换使用。

特定的核酸序列还暗含“剪接变体”。相似地，由核酸编码的特定的蛋白质暗含由该核酸的剪接变体编码的任何蛋白。“剪接变体”，顾名思义，是基因可变剪接的产物。转录后，可将起始的核酸转录物剪接以使不同的(可变的)核酸剪接产物编码不同的多肽。剪接变体的产生机制不同，但是都包括外显子的可变剪接。通过通读转录从相同的核酸衍生的不同多肽也包含在此定义中。剪接反应的任何产物(包括所述剪接产物的重组体形式)包括在此定义中。钾通道剪接变体的实例在Leicher等,J.Biol.Chem.273(52):35095-35101(1998)中论述。

可采用本领域熟知的常规连接和限制性酶切技术构建含有所需的治疗基因的编码和调控序列的合适的载体(见Maniatis等人,in Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York(1982))。可以对分离的质粒、DNA序列、或合成的寡核苷酸进行切割、加尾和重新连接以形成所需的形式。

当将核酸与另一核酸序列置于功能性关系中时，该核酸被“可操作地连接”。例如，如果前序列或分泌性前导序列的DNA被表达为参与多肽分泌过程中的前蛋白，那么所述前序列或分泌性前导序列的DNA与所述多肽的DNA可操作地连接；或者如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么该启动子或增强子与所述编码序列可操作地连接；如果核糖体结合位点位于可促进翻译的位置，那么所述核糖体结合位点与所述编码序列可操作地连接。一般，“可操作地连接”意指连接的DNA序列是相邻的，并且，在分泌性前导序列的情况下是邻近的并且处于阅读相中。然而，增强子不必是邻接的。通过在适宜的限制酶切位点处连接来实现连接。如果这样的位点不存在，则依据常规实践使用合成的寡核苷酸接头或连接体。

在两条或多条核酸或多肽序列的上下文中，术语“相同”或“同一性”百分数指的是使用以下描述的使用默认参数的BLAST或BLAST2.0序列比对算法或通过手动比对以及视觉观察(见，例如，NCBI网址等)测定的相同的或者具有特定百分数的相同氨基酸残基或核苷酸的两条或多条序列或亚序列(即在比较窗口或指定区域内进行最大相关性的比较和比对时，在指定的区域内大约60％同一性、优选65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％、99％、或更高的同一性)。然后将这些序列称为“基本相同的”。该定义也指的是，或者可以应用于测试序列的互补(compliment)序列。所述定义还包括具有缺失和/或添加的序列、以及具有置换的那些序列。如下所述，所述优选的算法可产生缺口(gap)等。优选地，同一性存在于长度为至少约25个氨基酸或核苷酸的区域内，或更优选地，在长度为至少约50-100个氨基酸或核苷酸的区域内。

在序列比对时，一般一种序列作为测试序列与之比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入电脑，如果需要的话，指定序列坐标，并指定序列算法程序参数。优选地，使用默认程序参数，或者指定替代参数。然后基于所述程序参数，序列比较算法计算所述测试序列相对于参考序列的序列同一性百分数。

本文使用的“比较窗口”包括涉及具有任何一个选自如下邻接位置数目的区段：20-600、通常约50-约200、更通常约100-约150，其中在将两个序列以最佳方式进行比对后，可以将一条序列与具有相同数目邻接位置的参考序列进行比较。用于比较的序列比对方法是本领域熟知的。可通过以下方法进行最佳的用于比较的序列比对，例如，通过Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源算法，通过Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源比对算法，通过Pearson&Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444(1988)的相似性搜索法，通过这些算法的计算机化工具(Wisconsin Genetics软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,WI)，或者通过人工比对和视觉观察(见例如，Current Protocol in Molecular Biology(Ausubel等,eds.1995增刊))。

适合用于测定序列同一性和序列相似性百分数的算法的优选实例为BLAST和BLAST2.0算法，所述算法分别记载于在Altschul等，Nuc.Acids Res.25:3389-3402(1977)和Altschul等，J.Mol.Biol.215:403-410(1990)中。使用具有本文所述参数的BLAST和BLAST2.0来测定本发明的核酸和蛋白的序列同一性百分数。本领域已知，进行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心公开获得。该算法包括首先通过鉴定查询序列中的具有长度W的短的字串，来鉴定高计分序列对(HSP)，当将所述短字串与数据库序列中的具有相同长度的字串进行比对时，所述短的字串匹配或者满足一些阳性值的阈值得分T。T被称为相邻字串得分阈值(Altschul等，上文)。这些起始相邻字串匹配(hit)作为种子用于起始搜索寻找包含它们的更长的HSP。只要累积比对得分可增加，就将所述字串匹配沿着每条序列双向延伸。对于核酸序列，使用参数M(一对匹配残基的奖分；通常>0)和N(错配残基的罚分；通常<0)计算累积得分。对于氨基酸序列，使用得分矩阵来计算累积得分。所述字串匹配在每个方向上的延伸在下列情况下会终止：当累积比对得分从其最大获得值降低了数量X时；由于一个或多个负得分残基比对的累积，所述累积得分达到零或更低时；或者到达任一序列的末端时。所述BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核酸序列)使用字串长度(W)为11、期望值(E)为10、M＝5、N＝-4以及两条链的比较作为默认值。对于氨基酸序列，所述BLASTN程序使用字串长度(W)为3、期望值(E)为10以及BLOSUM62得分矩阵(见Henikoff&Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915(1989))比对(B)为50、期望值(E)为10、M＝5、N＝-4以及两条链的比较作为默认值。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文可以互换使用，是指氨基酸残基的多聚体。所述术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是对应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸多聚体，以及天然存在的氨基酸多聚体和非天然存在的氨基酸多聚体。

术语“氨基酸”指的是天然存在的和合成的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸，以及后来被修饰的那些氨基酸，例如，羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物指的是具有和天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即，与氢、羧基、氨基和R基团结合的α-碳，例如，高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这类类似物具有修饰的R基团(例如正亮氨酸)或者修饰的肽主链，但是保留着和天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物指的是具有与氨基酸通常的化学结构不同，但是以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的化学化合物。

本文中的氨基酸可被称为其通常已知的IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的三字母符号或单字母符号。类似地，核苷酸可被称为其通常接受的单字母密码。

“保守性修饰变体”适用于氨基酸和核酸序列。就具体的核酸序列而言，保守性修饰变体指的是编码相同的或基本相同的氨基酸序列的那些氨基酸，或者当核酸不编码氨基酸序列时，保守性修饰变体指的是其基本相同的序列。由于遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸编码任何给定的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在每一个由一个密码子指定为丙氨酸的位置上，所述密码子可改变为任何一个所述的相应密码子，而不会改变所编码的多肽。这类核酸改变是“沉默改变”，其是保守性修饰改变的一种。本文中每一条编码多肽的核酸序列也描述了所述核酸的每一种可能的沉默改变。技术人员会理解，核酸中的每一个密码子(除了AUG，其通常是甲硫氨酸的唯一密码子，以及TGG，其通常是色氨酸的唯一密码子)都可被修饰从而产生功能相同的分子。因此，对于表达产物而言，而并未对于实际探针序列而言，编码多肽的核酸的每一个沉默改变都暗含在每一个所述序列中。

对于氨基酸序列，技术人员应理解，对核酸、肽、多肽或蛋白序列进行能够改变、添加或删除所编码的序列中的单个氨基酸或小百分比的氨基酸的单个置换、删除或添加，这类单个置换、删除或添加产生“保守性修饰变体”，在所述保守性修饰变体中所述改变导致氨基酸被化学上相似的氨基酸所置换。提供了功能相似的氨基酸的保守性置换表是本领域熟知的。这类保守性修饰变体除了包括上述之外，还包括本发明的多态变体、种间同源序列和等位基因。

下列八组中每组都含有相互之间为保守性置换的氨基酸。1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(见，例如，Creighton,Proteins(1984))。

当用于例如细胞、病毒、核酸、蛋白质或载体时，术语“重组的”表示，所述细胞、病毒、核酸、蛋白质或载体已经通过引入异源核酸或蛋白质或者通过改变天然氨基酸或者蛋白质而被修饰或者表示所述细胞源自这样修饰的细胞。因此，例如，重组的细胞表达在天然(非重组)形式的细胞中不存在的基因或者表达那些原本异常表达、低水平表达或根本不表达的天然基因。

短语“严格杂交条件”指的是在这种条件下通常在核酸的复杂混合物中，探针与其靶亚序列杂交而不与其它序列杂交。严格条件是序列依赖性的，并且在不同的环境下是不同的。较长的序列在较高温度下特异性杂交。核酸杂交的广泛指南见于Tijssen,Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes,“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays”(1993)。通常，将严格条件选择为在确定的离子强度和pH下比特定序列的热熔点(T_m)值低约5-10℃。T_m是(在确定的离子强度、pH和核酸浓度下)达到平衡后(靶序列过量存在时，在Tm下，平衡时50％的探针被占用)与靶序列互补的探针的50％与靶序列杂交时的温度。严格条件还可以通过加入去稳定剂(例如甲酰胺)来获得。对于选择性或特异性杂交，阳性信号至少两倍于背景，优选10倍于背景杂交。示例性的严格杂交条件可如下：在50％甲酰胺、5x SSC和1％SDS中，在42℃下孵育,或者，在5x SSC、1％SDS中，在65℃下孵育、在65℃下用0.2x SSC和0.1％SDS洗涤。

在严格条件下不与彼此杂交的核酸，如果其编码的多肽基本相同，则它们仍然是基本相同的。例如，当使用遗传密码允许的最大密码子简并性来构建核酸拷贝时，会发生这种情形。在这些情况下，核酸一般在中等严格杂交条件下进行杂交。示例性的“中等严格杂交条件”包括在40％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS的缓冲液中在37℃下杂交，并在45℃下用1X SSC洗涤。阳性杂交为至少两倍于背景。普通技术人员会容易地理解，其他杂交和洗涤条件可用于提供具有相似严格性的条件。确定杂交参数的其他指南在大量参考文献中提供，例如，Current Protocols in Molecular Biology,ed.Ausubel et al.,John Wiley&Sons。

对于PCR，尽管退火温度取决于引物长度而可在约32℃-48℃间变化，但是约36℃的温度一般用于低严格性扩增。尽管高严格性退火温度取决于引物长度和特异性而可在约50℃到约65℃范围内，但是对于高严格性PCR扩增，一般温度为约62℃。高和低严格性扩增的一般循环条件包括90℃-95℃变性阶段持续30sec-2min、退火阶段持续30sec-2min、以及约72℃延伸阶段持续1-2min。低和高严格性扩增反应的方案和指南在例如Innis et al.(1990)PCR Protocols,A Guide to Methods and Applications,Academic Press,Inc.N.Y.)中提供。

术语“转染作用”、“转导作用”、“转染”或“转导”可互换使用并被定义为将核酸分子或蛋白质引入到细胞的过程。使用非病毒或基于病毒的方法将核酸引入到细胞中。所述核酸分子可以是编码完整蛋白或者其功能部分的序列。一般，核酸载体包括蛋白表达必需的元件(例如，启动子、转录起始位点等)。转染的非病毒方法包括不使用病毒DNA或病毒颗粒作为递送系统而将核酸分子引入到细胞中的任何适当的方法。示例性的非病毒转染方法包括磷酸钙转染、脂质体转染、核转染、声致穿孔、热击转染、磁转染和电穿孔。对于基于病毒的方法，任何有用的病毒载体都可用于本文描述的方法中。病毒载体的实例包括，但不限于反转录病毒、腺病毒、慢病毒和腺-伴随病毒载体。在一些方面，使用腺病毒载体按照本领域熟知的常规步骤将核酸分子引入至细胞中。术语“转染作用”或“转导作用”也指的是将蛋白质从外部环境引入至细胞中。一般，蛋白质的转导作用或转染作用依赖于能够穿过细胞膜的多肽或蛋白质与目的蛋白的结合。参见，例如，Ford等，(2001)Gene Therapy8:1-4and Prochiantz(2007)Nat.Methods 4:119-20。

转染基因的表达可在宿主细胞中瞬时或稳定发生。在“瞬时表达”过程中，所述转染核酸没有整合到宿主细胞基因组中，并且在细胞分裂过程中未转移到子代细胞中。因为所述转染核酸的表达仅限于转染的细胞，因此所述基因的表达随着时间而都丢失。相比之下，当转染基因与另一个赋予转染细胞选择优势的基因共转染时，所述转染基因可发生稳定表达。这样的选择优势可以是对给予细胞的某种毒素的抗性。可通过转座子介导的将转染基因插入到宿主基因组中来进一步实现所述转染基因的表达。在转座子介导的插入过程中，所述基因以可预测的方式放置在两个转座子接头序列之间，所述两个转座子接头序列使得能够插入至宿主基因组中并随后被切除。

本文提到的“FKBP”或“FKBP蛋白或多肽”包括任何天然形式的FKBP蛋白、或其保持FKBP蛋白活性(例如，和FKBP相比，至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的活性)的变体。在一些实施方案中，和SEQ ID NO:66中列出的天然FKBP蛋白相比，在整个序列或序列的一部分(例如50、100、150或200个连续的氨基酸部分)上，变体具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。

本文提到的“FRB”或“FRB蛋白或多肽”包括任何天然形式的FRB蛋白、或其保持FRB蛋白活性(例如，和FRB相比，至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的活性)的变体。在一些实施方案中，和SEQ ID NO:69中列出的天然FRB蛋白相比，在整个序列或序列的一部分(例如50、100、150或200个连续的氨基酸部分)上，变体具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。

“EGFR”指的是对应于SEQ ID NO:21中列出的氨基酸序列的表皮生长因子受体。

“VHH”指的是单域抗体，所述单域抗体由能够选择性结合特定抗原(例如，EGFR)的单个单体可变抗体结构域组成。可从骆驼科动物(camelid)中存在的重链抗体设计改造得到VHH单域抗体。术语VHH或V_HH通篇可互换使用并且可根据它们在本领域中的常用含义使用。本文提供的“EGFR VHH”或“EGFR VHH蛋白”指的是特异性结合EGFR的VHH单域抗体。在一些实施方案中，所述EGFR VHH具有SEQ ID NO:4中列出的序列。在其他实施方案中，EGFR VHH与FKBP可操作地连接以形成配体-二聚化试剂结合物的缀合物。在一些其他实施方案中，所述配体-二聚化试剂结合物的缀合物具有SEQ ID NO:6中示出的序列。

本文提供的“CEA”或“CEACAM5”指的是癌胚抗原相关细胞黏附分子5(在本领域中也称为CD66)。本文提供的“CEA VHH”或“CEA VHH蛋白”指的是特异性结合CEA的VHH单域抗体。在一些实施方案中，所述CEA VHH具有SEQ ID NO:1中列出的序列。在其他实施方案中，所述CEA VHH与FKBP可操作地连接以形成配体-二聚化试剂结合物的缀合物。在一些其他实施方案中，所述配体-二聚化试剂结合物的缀合物具有SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列。

本文提供的“保护性抗原结构域4(D4)蛋白”指的是SEQ ID NO:94中列出的炭疽杆菌(Bacillus anthracis)保护性抗原结构域4。在一些实施方案中，D4与FKBP可操作地连接以形成配体-二聚化试剂结合物的缀合物。在一些其他实施方案中，所述配体-二聚化试剂结合物的缀合物具有SEQ ID NO:9中列出的氨基酸序列。

“对照”样品或数值指的是充当参照的样品，通常为已知的参照，用于与测试样品进行比较。例如，可从测试条件(例如，存在测试化合物)中获取测试样品，并将所述测试样品与来自已知条件(例如，不存在测试化合物(阴性对照)、或者存在已知化合物(阳性对照))中的样品进行比较。对照也可表示从很多测试或结果收集而来的平均值。本领域技术人员会理解，可设计对照用于评估任何数量的参数。例如，可设置对照以基于药理学数据(例如，半衰期)或治疗学量度(例如，副作用的比较)来比较治疗效果。本领域技术人员应理解哪些对照在给定的情形中有价值，并且应能够基于与对照数值进行的比较来分析数据。对照还可以对确定数据的显著性有价值。例如，如果对于给定参数的数值在对照中的变化性很大，则认为测试样品的变化不显著。

用于本文时，术语“癌症”指的是哺乳动物中的所有类型的癌症、肿瘤或恶性肿瘤，包括白血病、癌和肉瘤。示例性的癌症包括脑癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、头&颈癌、肝癌、肾癌、肺癌、非小细胞性肺癌、黑色素瘤、间皮瘤、卵巢癌、肉瘤、胃癌、子宫癌和髓母细胞瘤。另外的实例包括，霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、卵巢癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多症、原发性巨球蛋白血症、原发性脑瘤、原发性脑癌、恶性胰岛瘤(malignant pancreatic insulanoma)、恶性类癌、膀胱癌、恶变前皮肤病损、睾丸癌、淋巴瘤、甲状腺癌、神经母细胞瘤、食管癌、泌尿生殖道癌、恶性高钙血症、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌、内分泌和外分泌胰腺肿瘤以及前列腺癌。

术语“白血病”广义上指的是造血器官的进行性恶性疾病，并且一般由血液和骨髓中白细胞和它们的前体的异常增殖和发育来表征。白血病通常在临床上基于以下几点进行分类：(1)急性或慢性疾病的持续时间和特性；(2)涉及细胞的类型：骨髓细胞(骨髓内产生的)、淋巴细胞(淋巴生成的)或单核细胞；和(3)白血病或非白血病(亚白血病)血液中异常细胞数量的增加或非增加。P₃₈₈白血病模型能够预测体内抗白血病活性而被广泛接受。认为不管正在进行治疗的白血病的类型是什么，在P₃₈₈测定中测试为阳性的化合物通常在体内表现出一定水平的抗白血病活性。因此，本发明包括治疗白血病的方法，以及，优选地，治疗以下类型白血病的方法：急性非淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、慢性粒细胞性白血病、急性早幼粒细胞性白血病、成人T-细胞白血病、白细胞不增多性白血病、非白血性白血病(aleukocythemic leukemia)、嗜碱性粒细胞性白血病、干细胞性白血病、牛白血病、慢性髓细胞性白血病、皮肤白血病、胚细胞性白血病、嗜酸性粒细胞性白血病、格罗斯白血病、多毛细胞白血病、成血性白血病、成血细胞性白血病、组织细胞性白血病、干细胞性白血病、急性单核细胞性白血病、白细胞减少性白血病、淋巴性白血病、成淋巴细胞性白血病、淋巴细胞性白血病、成淋巴性白血病、淋巴样白血病、淋巴肉瘤细胞性白血病、肥大细胞白血病、巨核细胞白血病、小原粒性白血病、单核细胞性白血病、成髓细胞性白血病、髓细胞性白血病、骨髓性粒细胞性白血病、粒单核细胞性白血病、内格利白血病、浆细胞白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞性白血病、前髓细胞性白血病、里德尔细胞性白血病、席林白血病、干细胞性白血病、亚白血性白血病和未分化细胞性白血病。

术语“肉瘤”通常指的是由类似胚性结缔组织的物质组成的肿瘤并且通常由嵌入在纤维状物质或均一物质中的紧密堆积的细胞组成。可以用抗肿瘤的硫醇结合的线粒体氧化剂和抗癌剂的结合来治疗的肉瘤包括：软骨肉瘤、纤维肉瘤、淋巴肉瘤、黑肉瘤、黏液肉瘤、骨肉瘤、Abemethy's肉瘤、脂肪肉瘤(adipose sarcoma)、脂肪肉瘤(liposarcoma)、腺泡状软组织肉瘤、成釉细胞肉瘤、葡萄状肉瘤、绿色瘤肉瘤、绒毛膜癌、胚胎性肉瘤、肾母细胞瘤(Wilms'tumor sarcoma)、子宫内膜肉瘤、间质肉瘤、尤因氏肉瘤、筋膜肉瘤、成纤维细胞肉瘤、巨细胞肉瘤、粒细胞肉瘤、霍奇金肉瘤、特发性多发性色素沉着出血性肉瘤、B细胞免疫母细胞肉瘤、淋巴瘤、T细胞免疫母细胞肉瘤、延森肉瘤、卡波西肉瘤、枯氏细胞肉瘤、血管肉瘤、白血病性肉瘤、恶性间叶肉瘤、骨膜外肉瘤、网状细胞肉瘤、劳斯肉瘤、浆液囊性肉瘤、滑膜肉瘤和毛细管扩张性肉瘤。

术语“黑色素瘤”指的是起源于皮肤和其他器官的黑素细胞系统的肿瘤。可以用抗肿瘤药硫醇结合的线粒体氧化剂和抗肿瘤剂的结合治疗的黑色素瘤包括：例如，肢端雀斑样黑色素瘤、无黑色素黑色素瘤、良性幼年黑色素瘤、克劳德曼黑色素瘤、S91黑色素瘤、Harding-Passey 黑色素瘤、幼年型黑色素瘤、恶性雀斑样黑色素瘤、恶性黑色素瘤、结节性黑色素瘤、指甲下黑色素瘤(subungal melanoma)和浅表扩张性黑色素瘤。

术语“癌”指的是由易于浸润周围组织并产生转移的上皮细胞组成的恶性肿瘤(new growth)。可以用抗肿瘤药硫醇结合的线粒体氧化剂和抗肿瘤剂的结合治疗的示例性的癌包括，例如，腺泡癌(acinar carcinoma)、腺泡癌(acinous carcinoma)、腺样囊性癌(adenocystic carcinoma)、腺样囊性癌(adenoid cystic carcinoma)、腺癌、肾上腺皮质癌、肺泡癌、肺泡细胞癌、基底细胞癌(basal cell carcinoma)、基底细胞癌(carcinoma basocellulare)、基底细胞样癌、基底鳞状细胞癌、细支气管肺泡癌、细支气管癌、支气管原癌、脑样癌、胆管细胞癌、绒毛膜癌、胶体癌、粉刺状癌、子宫体癌、筛形癌、胸廓癌、皮肤癌、柱状癌、柱状细胞癌、导管癌、硬癌、胚胎性癌、髓样癌、表皮样癌、腺样上皮细胞癌、外植癌、溃疡性癌、硬癌(carcinoma fibrosum)、胶样癌(gelatiniforni carcinoma)、胶样癌(gelatinous carcinoma)、巨细胞癌(giant cell carcinoma)、巨细胞癌(carcinoma gigantocellulare)、腺癌、颗粒细胞癌、发母质癌、多血癌、肝细胞癌、许特尔细胞癌、粘液癌、hypemephroid carcinoma,幼稚型胚胎性癌、原位癌、表皮内癌、上皮内癌、克罗姆佩柯赫尔癌(Krompecher's carcinoma)、库尔契茨基细胞癌(Kulchitzky-cell carcinoma)、大细胞癌、豆状癌(lenticular carcinoma)、豆状癌(carcinoma lenticulare)、脂瘤样癌、淋巴上皮癌、髓样癌(carcinoma medullare)、髓样癌(medullary carcinoma)、黑色素癌、软癌、粘液癌(mucinous carcinoma)、粘液癌(carcinoma muciparum)、克鲁肯伯格瘤(carcinoma mucocellulare)、粘液表皮样癌、粘液癌(carcinoma mucosum)、粘液癌(mucous carcinoma)、粘液瘤样癌(carcinoma myxomatodes)、鼻咽癌、燕麦细胞癌、骨化性癌(carcinoma ossificans)、骨化性癌(osteoid carcinoma)、乳头状癌、门脉周癌、浸润前癌、鳞状细胞癌(prickle cell carcinoma)、粉刺癌(pultaceous carcinoma)、肾细胞癌、贮备细胞癌、肉瘤样癌、施奈德氏(schneiderian)癌、硬癌(scirrhous carcinoma)、阴囊癌、印戒细胞癌、单纯癌、小细胞癌、硬癌(solanoid carcinoma)、球形细胞癌、梭形细胞癌、髓样癌(carcinoma spongiosum)、鳞状癌、鳞状细胞癌 (squamous cell carcinoma)、绳捆癌、血管扩张性癌(carcinoma telangiectaticum)、血管扩张性癌(carcinoma telangiectodes)、移行细胞癌、结节性皮癌(carcinoma tuberosum)、结节性皮癌(tuberous carcinoma)、疣状癌和绒毛状癌。

本文中的“治疗有效剂量或治疗有效量”意指能产生给药目的疗效的剂量。准确的剂量和制剂取决于治疗的目的，并且可由本领域技术人员使用已知的技术来确定(见，例如，Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms(vols.1-3,1992)；Lloyd,The Art,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(1999)；Remington:The Science and Practice of Pharmacy,20th Edition,Gennaro,Editor(2003),and Pickar,Dosage Calculations(1999))。

术语“可药用的盐”或“可药用的载体”意指包括依据本文所述的化合物中的具体的取代基，使用相对无毒的酸或碱而制备的活性化合物的盐。当本发明化合物含有相对酸性的官能度时，可通过在净相(neat)或在合适的惰性溶剂中将中性形式的这类化合物与足量的所需碱接触在适合的惰性溶剂中接触来获得碱加成盐。可药用碱加成盐的实例包括：钠盐、钾盐、钙盐、铵盐、有机胺盐或镁盐、或相似的盐。当本发明化合物含有相对碱性的官能度时，可通过在净相或在合适的惰性溶剂中将中性形式的这类化合物的中性形式与足量的所需酸接触来获得酸加成盐。可药用酸加成盐的实例包括：衍生自无机酸如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸、碳酸氢盐(monohydrogencarbonic acid)、磷酸、磷酸氢盐(monohydrogenphosphoric acid)、磷酸二氢盐(dihydrogenphosphoric acid)、硫酸、硫酸氢盐(monohydrogensulfuric acid)、氢碘酸或亚磷酸等的酸加成盐；以及衍生自相对无毒的有机酸如乙酸、丙酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、富马酸、乳酸、扁桃酸、苯二甲酸、苯磺酸、对-甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸、甲磺酸等的盐。也包括氨基酸的盐例如精氨酸盐等和有机酸的盐例如葡糖醛酸或半乳糖醛酸等(见，例如Berge等,Journal of Pharmaceutical Science66:1-19(1977))。本发明某些特定的化合物同时含有使所述化合物转换成碱加成盐或酸加成盐的碱性和酸性官能度。本领域技术人员已知的其他可药用载体适用于本发明。

“受试者”、“个体”、或“患者”在本文中可互换使用，其指的是脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人。哺乳动物包括，但不限于，鼠科动物、猿类、人、家畜、比赛用动物(sport animals)和宠物。也包括在体外获得的或在体外培养的生物实体的组织、细胞和它们的后代。

II.组合物

本文尤其提供了用于感染多种不同细胞类型(例如癌细胞)的腺病毒组合物。例如，可使用本文提供的组合物将腺病毒感染再靶向肿瘤细胞上上调的受体(例如，EGFR、CEA、ErbB)。使用本文(包括其实施方案)提供的组合物时，可以通过设计能经由多于一种受体感染肿瘤细胞的重组腺病毒来克服肿瘤的异质性。本文提供的病毒组合物表达多肽结合对(如在表2中所列出的，例如，FKBP和FRB)，所述多肽结合对能够在化学二聚化试剂(例如，雷帕霉素)的存在下发生二聚化，从而形成三元复合物。所述三元复合物使病毒能够结合到特定的细胞表面受体上。所述三元复合物的组分可全部地或部分地由所述腺病毒基因组编码并且因此病毒复制过程中不会丢失，所述病毒复制过程确保所述病毒的随后再感染的能力。因此，在一方面，提供了编码衣壳-二聚化试剂结合物的缀合物和配体-二聚化试剂结合物的缀合物的重组核酸。所述衣壳-二聚化试剂结合物的缀合物包含与病毒衣壳蛋白(例如，纤维)可操作连接的二聚化试剂结合物(例如，FRB)。本文提供的二聚化试剂结合物是能够结合二聚化试剂的试剂。二聚化试剂结合物包括但不限于蛋白、化合物或小分子。在一些实施方案中，所述二聚化试剂结合物是FRB蛋白。二聚化试剂结合物的非限制性实例在本文提供的表2中列出。所述二聚化试剂结合物与所述二聚化试剂的结合可通过非共价的分子间相互作用(例如氢键、静电相互作用、疏水作用和范德华力)发生。所述衣壳-二聚化试剂结合物的缀合物包括病毒衣壳蛋白。术语衣壳指的是形成病毒外壳的任何组分(例如，衣壳蛋白或多肽)，其中所述衣壳可包括这些组分中的一种或多种。所述衣壳包括病毒外壳的任何合适的结构组分。在一些实施方案中，所述衣壳蛋白是腺病毒衣壳蛋白。衣壳蛋白的非限制性实例是L3II(六邻体)(例如，编码形成衣壳的三角面的大的结构蛋白)、L1IIIa(例如，编码有助于稳定衣壳的小的结构蛋白)、L2III(五邻体)(例如，编码形成衣壳顶角的大的结构蛋白，其中尾丝从所述衣壳顶角伸出)、L2pVII(例如，编码与组蛋白H3具有同源性并和衣壳内的病毒DNA相关联的核心结构蛋白)、以及L5IV(尾丝)(例如，编码从五邻体基底伸出并负责受体结合的大的结构蛋白)。在一些实施方案中，所述腺病毒衣壳蛋白是一种尾丝蛋白。

在细胞中表达时，所述二聚化试剂结合物和所述病毒衣壳蛋白形成衣壳-二聚化试剂结合物的缀合物，所述衣壳-二聚化试剂结合物的缀合物能够通过所述二聚化试剂结合物(例如，FRB)结合到二聚化试剂(例如，雷帕霉素)上并且通过衣壳蛋白(例如，尾丝)整合到病毒衣壳上。因此，在一些实施方案中，所述衣壳-二聚化试剂结合物的缀合物包含衣壳蛋白和二聚化试剂结合物。在其他实施方案中，所述衣壳蛋白与所述二聚化试剂结合物可操作地连接。通过与所述二聚化试剂结合，所述衣壳-二聚化试剂结合物的缀合物可连接到所述配体-二聚化试剂结合物的缀合物上。所述配体-二聚化试剂结合物的缀合物包含细胞表面受体的特异性配体(例如，EGFR VHH)，所述配体与第二二聚化试剂结合物(例如，FKBP)可操作地连接。本文提供的配体是蛋白，所述蛋白具有结合细胞表面上表达的分子的能力。配体和相应的细胞受体的非限制性实例在表3中列出。在一些实施方案中，所述配体是EGFR VHH蛋白。在其他实施方案中，所述二聚化试剂结合物是FKBP。在一些实施方案中，所述配体是CEA VHH蛋白。在其他实施方案中，所述二聚化试剂结合物是FKBP。在一些实施方案中，所述配体是保护性抗原结构域4(D4)蛋白。在其他实施方案中，所述二聚化试剂结合物是FKBP。在一些实施方案中，所述配体-二聚化试剂结合物的缀合物包含配体和二聚化试剂结合物。在一些实施方案中，所述配体与所述二聚化试剂结合物可操作地连接。在一些实施方案中，所述配体是抗体。在一些其他实施方案中，所述抗体是单域抗体。在一些实施方案中，多个配体与所述二聚化试剂结合物可操作地连接，其中所述多个配体是各自不同的。所述多个配体可与所述二聚化试剂结合物的一个末端或两个末端可操作地连接。在一些实施方案中，所述多个配体以串联形式与所述二聚化试剂结合物的一个末端或两个末端可操作地连接。在一些实施方案中，所述二聚化试剂结合物是亲免素蛋白。在一些其他实施方案中，所述亲免素蛋白是FKBP蛋白。在一些其他实施方案中，所述FKBP蛋白是人FKBP蛋白。在一些其他实施方案中，所述人FKBP蛋白是FKBP12。在其他实施方案中，所述配体能够结合细胞。在其他实施方案中，所述细胞是肿瘤细胞。

本文尤其提供了表达上述重组核酸的重组腺病毒。因此，在另一方面，提供了包含本文(包括其实施方案)提供的重组核酸的重组腺病毒。在一些实施方案中，所述腺病毒是复制缺陷型(replication incompetent)的腺病毒。在其他实施方案中，所述腺病毒是可复制型腺病毒。当所述腺病毒是可复制型腺病毒时，其能够通过结合至特定的细胞表面受体(例如EGFR)而感染细胞、在所述细胞中复制，从而产生能够感染其他细胞的新的病毒后代。相比之下，复制缺陷型腺病毒能够通过结合至特定的细胞表面受体而进入细胞并在所述细胞中表达腺病毒基因组。但是，复制缺陷型腺病毒缺少产生新的病毒后代所必需的基因，并因此不能随后感染其他细胞。

在另一方面，提供了包含衣壳-二聚化试剂结合物的缀合物的重组腺病毒。如上文所述，衣壳-二聚化试剂结合物的缀合物包括与二聚化试剂结合物(例如，FRB)可操作地连接的衣壳蛋白(例如，尾丝)。所述二聚化试剂结合物(例如，FRB)与所述二聚化试剂(例如，雷帕霉素)的结合将所述重组腺病毒连接至所述二聚化试剂。因此，所述包含衣壳-二聚化试剂结合物的缀合物的重组腺病毒可结合至二聚化试剂。本文提供的二聚化试剂是能够结合至衣壳-二聚化试剂结合物的缀合物的二聚化试剂结合物以及配体-二聚化试剂结合物的缀合物的二聚化试剂结合物结合的试剂。在一些实施方案中，所述二聚化试剂结合衣壳-二聚化试剂结合物的缀合物的二聚化试剂结合物。所述二聚化试剂可结合配体-二聚化试剂结合物的缀合物的二聚化试剂结合物以及衣壳-二聚化试剂结合物的缀合物的二聚化试剂结合物。因此，在一些实施方案中，所述二聚化试剂还结合到配体-二聚化试剂结合物的缀合物上。二聚化试剂可通过非共价的分子间相互作用(例如氢键、静电相互作用、疏水作用和范德华力)结合所述二聚化试剂结合物。在一些实施方案中，所述二聚化试剂共价地结合到所述二聚化试剂结合物上。本文提供的二聚化试剂可以是天然存在的物质(例如雷帕霉素、脱落酸)或合成的物质(例如，小分子、化合物)。本文提供的本发明的二聚化试剂的实例在表2中列出。在一些实施方案中，所述二聚化试剂是化合物。在一些其他实施方案中，所述化合物是雷帕霉素。在传统意义上，雷帕霉素指的是CAS注册号53123-88-9。雷帕霉素抑制mTOR激酶并被用作免疫抑制剂和抗癌治疗。在一些其他实施方案中，所述二聚化试剂是雷帕霉素类似物。本文提供的雷帕霉素类似物是不能抑制细胞mTOR激酶活性的雷帕霉素类似物。在一些其他实施方案中，所述雷帕霉素类似物是AP21967。在一些实施方案中，所述二聚化试剂是抗癌药物。

如上所述，本文提供的组合物包括重组腺病毒，所述重组腺病毒包含重组核酸，其包括衣壳-二聚化试剂结合物和配体-二聚化试剂结合物的缀合物。因此，所述重组腺病毒还可包含配体-二聚化试剂结合物的缀合物。在其他实施方案中，所述配体-二聚化试剂结合物的缀合物是异位表达的。在所述配体-二聚化试剂结合物的缀合物为异位表达时，所述编码配体-二聚化试剂结合物的缀合物的核酸不形成所述重组腺病毒中包括的重组核酸的一部分。在所述配体-二聚化试剂结合物的缀合物为异位表达时，其可由用所述重组腺病毒感染的细胞的基因组编码。

在一些实施方案中，所述重组腺病毒包含多个配体-二聚化试剂结合物的缀合物，其中每个配体-二聚化试剂结合物的缀合物可以是不同的。例如，在所述重组腺病毒包含多个配体-二聚化试剂结合物的缀合物时，所述重组腺病毒可包含第一配体-二聚化试剂结合物的缀合物、第二配体-二聚化试剂结合物的缀合物和第三配体-二聚化试剂结合物的缀合物，并且每个配体-二聚化试剂结合物的缀合物都是不同的。因此，所述第一配体-二聚化试剂结合物的缀合物可包括第一配体和第一二聚化试剂结合物，所述第二配体-二聚化试剂结合物的缀合物可包括第二配体和第二二聚化试剂结合物，其中所述第一配体不同于所述第二配体并且所述第一二聚体试剂结合物与所述第二二聚体试剂结合物是相同的或是不同的。例如，所述第一配体-EGFR VHH可与所述第一二聚化试剂结合物FKBP可操作地连接，所述第二配体CEA VHH可与所述第二二聚化试剂结合物AB1或FKBP可操作地连接。

另外，所述重组腺病毒可包含多个衣壳--二聚化试剂结合物的缀合物，其中每个衣壳-二聚化试剂结合物的缀合物可以是不同的。例如，在所述重组腺病毒包含多个衣壳-二聚化试剂结合物的缀合物时，所述重组腺病毒可包含第一衣壳-二聚化试剂结合物的缀合物、第二衣壳-二聚化试剂结合物的缀合物和第三衣壳-二聚化试剂结合物的缀合物，并且每个衣壳-二聚化试剂结合物的缀合物都是不同的。因此，所述第一衣壳-二聚化试剂结合物的缀合物可包括第一衣壳蛋白和第一二聚化试剂结合物，所述第二衣壳-二聚化试剂结合物的缀合物可包括第二衣壳蛋白和第二二聚化试剂结合物，其中，所述第一衣壳蛋白和所述第二衣壳蛋白可以是相同或不同的，并且所述第一二聚化试剂结合物和所述第二二聚体试剂结合物可以是相同的或是不同的。例如，所述第一衣壳蛋白尾丝可与所述第一二聚化试剂结合物FRB可操作地连接，并且所述第二衣壳蛋白尾丝可与所述第二二聚化试剂结合物PYL1可操作地连接。因此，在一个实施方案中，所述重组腺病毒包含第一衣壳-二聚化试剂结合物的缀合物(例如，尾丝/FRB)、第一配体-二聚化试剂结合物的缀合物(例如，EGFR VHH/FKBP)、第二衣壳-二聚化试剂结合物的缀合物(例如，尾丝/PYL1)，以及第二配体-二聚化试剂结合物的缀合物(例如，CEA VHH/AB1)。在第一二聚化试剂(即，雷帕霉素)的存在下，通过FRB和FKBP与雷帕霉素的结合将所述第一衣壳-二聚化试剂结合物的缀合物与所述第一配体-二聚化试剂结合物的缀合物连接起来。在存在第二二聚化试剂(即，脱落酸)的情况下，通过AB1和Pyl1与脱落酸的结合将所述第二衣壳-二聚化试剂结合物的缀合物与所述第二配体-二聚化试剂结合物的缀合物连接起来。因此，在雷帕霉素的存在下，所述重组腺病毒感染表达EGF受体的细胞，并且在脱落酸的存在下，同样的病毒可感染表达CEA的细胞。因此，所述同样的重组腺病毒能够根据所给予的二聚化试剂的存在情况感染不同的细胞类型。

在另一方面，本申请提供了包含本文(包括其实施方案)提供的重组腺病毒的细胞。在一些实施方案中，所述细胞是癌症患者中的癌细胞。在其他实施方案中，所述细胞是癌症患者中的非癌细胞。在一些实施方案中，所述细胞是有机体中的细胞。在一些其他实施方案中，所述有机体是哺乳动物。在一些其他实施方案中，所述哺乳动物是人。在其他实施方案中，所述细胞是培养皿中的细胞。在一些其他实施方案中，所述细胞是转化的细胞。

III.方法

在另一方面，本申请提供了形成靶向腺病毒癌细胞的构建体的方法。所述方法包括用本文提供的重组腺病毒感染细胞，从而形成腺病毒感染的细胞。使所述腺病毒感染的细胞表达所述重组核酸，从而形成配体- 二聚化试剂结合物的缀合物和包含衣壳-二聚化试剂结合物的缀合物的重组腺病毒。使所述重组腺病毒和所述配体-二聚化试剂结合物的缀合物与所述二聚化试剂接触。使所述重组腺病毒和配体-二聚化试剂结合物的缀合物与二聚化试剂结合，从而形成所述靶向腺病毒癌细胞的构建体。如上所述，所述重组核酸可包括多个衣壳-二聚化试剂结合物的缀合物和配体-二聚化试剂结合物的缀合物，从而使得表达所述重组核酸的腺病毒结合到多种不同的细胞表面受体上。

在另一方面，本申请提供了靶向细胞的方法。所述方法包括使细胞与本文(包括其实施方案)提供的重组腺病毒接触。在一些实施方案中，所述细胞是癌细胞。

在另一方面，本申请提供了靶向癌症患者中的癌细胞的方法。所述方法包括将本文提供的重组腺病毒给予癌症患者。使所述重组腺病毒感染所述癌症患者中的细胞，从而形成腺病毒感染的细胞。使所述腺病毒感染的细胞表达所述重组核酸，从而形成配体-二聚化试剂结合物的缀合物和包含衣壳-二聚化试剂结合物的缀合物的重组腺病毒。将二聚化试剂给予所述癌症患者。使所述重组腺病毒和所述配体-二聚化试剂结合物的缀合物结合至所述二聚化试剂，从而形成所述靶向腺病毒癌细胞的构建体。使所述靶向腺病毒癌细胞的构建体结合到癌细胞上，从而靶向所述癌症患者中的癌细胞。在一些实施方案中，所述细胞是癌细胞。在其他实施方案中，所述细胞是非癌细胞。

在另一方面，本申请提供了靶向细胞的方法。所述方法包括使第一细胞与本文提供的重组腺病毒接触。使所述重组腺病毒感染所述第一细胞，从而形成腺病毒感染的细胞。使所述腺病毒感染的细胞表达所述重组核酸，从而形成配体-二聚化试剂结合物的缀合物和包含衣壳-二聚化试剂结合物的缀合物的重组腺病毒。使所述配体-二聚化试剂结合物的缀合物和所述重组腺病毒与二聚化试剂接触。使所述重组腺病毒和所述配体-二聚化试剂结合物的缀合物结合至所述二聚化试剂，从而形成靶向腺病毒细胞的构建体。使所述靶向腺病毒细胞的构建体结合到第二细胞上，从而靶向所述细胞。在一些实施方案中，所述第一细胞和所述第二细胞构成有机体的一部分。

IV.具体实施方案

癌症是一种使人衰弱的疾病，其每年导致50万以上的死亡。非常需要更有效的、更具选择性的和更安全的癌症疗法。现有的用于这类普遍的、威胁生命的疾病的疗法——例如化学疗法和外科手术，很少能消除所有恶性细胞，并且经常表现出超过治疗益处的有害副作用。本发明提供了能够通过不同受体感染肿瘤细胞的强有力的重组病毒。这些病毒使得一种新的安全形式的有效且自我扩增的疗法成为可能，所述疗法打破了用于癌症的全身性遗传毒性治疗的模式。

一种有可能解决目前癌症治疗的很多弱点的方法是溶瘤腺病毒疗法(Pesonen,S.et al.,Molecular Pharmaceutics,.8(1):p.12-28(2010))。这些病毒被设计为特异性地在癌细胞中复制，而不伤害正常细胞。可通过利用腺病毒早期致癌蛋白(onco-protein)(例如，E1A)和Rb肿瘤抑制途径中的肿瘤突变之间的功能性重叠来设计改造这种选择性，所述Rb肿瘤抑制途径中的肿瘤突变源自失调的细胞周期进入(cell cycle entry)和病理性DNA复制(Poznic,M.,J Biosci,34(2):p.305-12(2009))。

腺病毒(Ad)是一个自我复制的生物机器。其由包裹在蛋白衣壳中的线性双链36kb的DNA基因组组成。Ad需要人宿主细胞来进行复制。其侵袭并劫持细胞复制机器以进行复制而且一旦组装就诱导溶解性细胞死亡以逃离所述细胞并扩散和侵袭周围细胞(图1)。从来没有系统能近似模拟Ad的自主性和效率，但是，申请人已经开发了两种新的策略来系统地操纵Ad基因组以形成新型腺病毒，如公开申请PCT/US2011/048006所述(其以引用的方式全文纳入本文并用于所有目的)。今后，在能够操纵Ad基因组的情况下，申请人可以直面涉及该病毒的难题并重新设计该病毒以使其能发挥肿瘤特异性感染、复制和细胞杀伤的作用。

目前，腺病毒载体依赖单个细胞受体进行它们的摄取，这严重限制了它们的治疗潜力。Ad5感染主要通过外部病毒衣壳上的尾丝蛋白与人上皮细胞上的柯萨奇腺病毒受体(CAR)之间的相互作用介导。不幸的是，很多癌症细胞不表达CAR，例如间质肿瘤细胞和致命的转移性肿瘤细胞。由于感染细胞的能力限制了病毒的复制/杀伤，因此申请人需要通过非CAR的受体来感染肿瘤细胞的病毒，理想地，所述受体为肿瘤细胞上特异性上调的那些受体。本文提供了遗传编码的可变换的靶向部分，其使得Ad5能够感染癌细胞，而不管所述癌细胞的CAR表达如何。申请人利用癌症药物——雷帕霉素(rap)的已知特性使带有FKBP和FRB结构域的异源蛋白二聚化，并且设计改造表达FRB-尾丝衣壳蛋白融合蛋白以及和FKBP融合的再靶向配体的病毒。在rap治疗时，通过多种再靶向配体诱导这些病毒来感染任何细胞类型。作为新的癌症疗法，这代表了化学和病毒武器的合理且有力的结合。另外，主要目标是通过设计改造病毒来克服肿瘤异质性，所述病毒能够通过多于一种的机制和受体来感染肿瘤细胞。申请人通过利用癌症药物——雷帕霉素(rap)的已知特性使带有FKBP和FRB结构域的异源蛋白发生二聚化而实现了这一点。雷帕霉素抑制了mTOR激酶并被用作免疫抑制试剂和抗癌治疗。通过设计改造FRB突变，在给予雷帕霉素类似物时也可使用不能抑制细胞mTOR激酶活性的雷帕霉素类似物来诱导对任何细胞类型的感染。在rap治疗时，可通过多种再靶向配体来诱导这些病毒感染任何细胞类型。

癌症一直是一种顽固性疾病而没有安全且可靠有效的治疗。在上个世纪，申请人关于癌症起源和癌症生物学的认识已经显著提高。但是，尽管申请人有了癌症作为遗传性疾病的新认识，但是用于不能切除的扩散性疾病的护理标准仍然是通常具有不可容忍的有毒副作用的遗传毒性治疗(例如化学疗法和放射性治疗)。虽然已经开发了药物来靶向致癌蛋白(oncogenice protein)，但是申请人无法治疗肿瘤抑制子的基因缺失。治疗这些癌症的一种方法是溶瘤病毒癌症疗法(图1)(Pesonen,S.et al.,Molecular Pharmaceutics,.8(1):p.12-28(2010))。

腺病毒已经被研究了半个多世纪，其对申请人关于哺乳动物细胞生物学核心的关键机制(例如，剪接、关键生长调控中心、转录和细胞周期)的了解作出了显著的贡献。Ad是包裹在蛋白衣壳中的小的双链36kb DNA病毒(图2)。Ad颗粒主要通过衣壳表面上的尾丝的结节-结构域与细胞表面分子之间的蛋白相互作用而与宿主细胞发生相互作用(图2)。腺病毒种属C的血清型5(Ad5)通过尾丝与主要存在于上皮细胞连接处的柯萨奇腺病毒和腺病毒受体(CAR)相互作用而感染细胞。像所有病毒一样，其完全依赖宿主细胞进行其繁殖。在将其基因组置于宿主细胞细胞核以后，由病毒蛋白协调组织一种程序来激活静息细胞中的细胞周期以复制病毒DNA。在Ad5生命周期结束时，当子代病毒体已经在细胞核中组装后，细胞的膜被裂解，释放出下一代的病毒。

操纵腺病毒趋向性

Ad5感染主要限于具有CAR的细胞，CAR与钙黏蛋白一起表达在上皮细胞的紧密连接处(Tomko,R.P.et al.,Proceedings of the NationalAcademy of Sciences,94(7):p.3352-3356(2009)；Bergelson,J.M.,et al.,Science,275(5304):p.1320-1323(1997))。不幸的是，转移杀死了大多数癌症患者，其中上皮到间质的转化(EMT)导致了钙黏蛋白和CAR的下调，引起侵袭并扩散至远处部位(Anders,M.,et al.,Br J Cancer,100(2):p.352-9(2009))。因此，很多恶性细胞不表达CAR而且不易被Ad5感染(Anders,M.,et al.,Br J Cancer,100(2):p.352-9(2009)；Dietel,M.,et al.,Journal of Molecular Medicine,89(6):p.621-630(2011)；Matsumoto,K.,et al.,Urology,66(2):p.441-446(2005))。已经采用很多方法以使Ad5再靶向不同的细胞受体，所述方法包括：对纯化的腺病毒颗粒进行化学修饰和用重组的二价“桥接”蛋白进行感染以在尾丝和受体之间形成复合物(综述见(Rein,D.T.,M.Breidenbach,and D.T.Curiel,Future Oncology,2(1):p.137-143(2006))。这些方法的缺点是对第一轮感染的限制，因为化学的/重组的靶向部分在病毒复制后会丢失。可通过直接修饰尾丝基因以编码靶向序列来克服该缺陷，但是，这种方法不是系统性的，因为申请人不能预测从头合成(de novo)的序列的折叠和其与病毒颗粒的正确组装。到目前为止，这种方法仅可用于插入小肽。

Adsembly和AdSLIC使得能够从基因组构建部件(building block)和外源部件(parts)的文库中系统地设计新的优化腺病毒的技术成为可能

腺病毒在多个应用中的潜力受到快速且系统地设计并结合多种遗传修饰的能力的制约。为了系统地将腺病毒重新设计为溶瘤试剂，需要工具以使得能够对腺病毒组件进行精确修饰。36kb的Ad5基因组由于其大小和丰富的限制性内切酶识别(RER)位点而很难操纵。到目前为止，在20世纪80年代里大多数重组Ad仅限于消化并选择较少RER位点的骨架，并且由于穿梭载体的遗留而继续保留下来。这些骨架已经累积了很多远不同于野生型序列的突变。复杂序列的传统克隆技术仍然很耗时且不是系统性的。

为了克服Ad5和目前方法的制约，申请人已经开发了两种新的技术，名为“Adsembly”和“AdSlicR”，这两种技术使得能够在一个小时内从基因组组成部件和异源元件在体外快速从头组装腺病毒基因组。使用生物信息学方法，基于种属间的进化保守序列、转录和功能模块，申请人将腺病毒基因组(36kb)分割成5个单元。这5个单元中的每一个均构成了基因组构建“部件文库”的可兼容部件，可通过设计改造突变或异源元件来改变每个单元的功能和多样性，并且可通过添加来自不同的腺病毒血清型、突变体和种属的等价单元来进一步扩展。为了构建新的具有独特性质的腺病毒，从所述文库中选择每个单元中的一个并使用Adsembly或Ad-SlicR在体外将它们快速重新组装成完整的基因组。可使用Adsembly通过多位点特异性重组来组装新的基因组(在1小时内)，一旦转染后，所述新的基因组从质粒骨架上自我切除(self-excises)下来并复制以产生新的病毒。利用了相同的文库基因组构建部件的AdSlicR是一种补充策略，其去除插入的重组序列以用于更强大的病毒复制(如果需要的话)和临床使用。操作作为小的模块质粒单元的多个基因组片段的简便性以及这些技术的系统性方法使得能够快速且精确地构建新的腺病毒。

腺病毒靶向：遗传编码的转换

溶瘤病毒疗法具有破坏大小不限的肿瘤肿块的潜力，但是仅仅在所述病毒穿过肿瘤脉管系统时以及感染从一个细胞扩散至另一个细胞时才产生破坏。Ad5的尾丝识别上皮细胞连接分子CAR(Tomko,R.P.et al.,Proceedings of the National Academy of Sciences,94(7):p.3352-3356(2009)；Bergelson,J.M.,et al.,Science,275(5304):p.1320-1323(1997))，CAR在肿瘤上以不同的水平表达(Rein,D.T.,M.Breidenbach,and D.T.Curiel,Future Oncology,2(1):p.137-143(2006)；Dmitriev,I.,et al.,J.Virol.,72(12):p.9706-9713(1998)；Bauerschmitz,G.J.,S.D.Barker,and A.Hemminki,Int J Oncol,21(6):p.1161-74(2002)；Breidenbach,M.,et al.,Hum Gene Ther.,15(5):p.509-18(2004)；Cripe,T.P.,et al.,Cancer Res,61(7):p.2953-60(2001)；Fechner,H.,et al.,Gene Ther,7(22):p.1954-68(2000)；Hemmi,S.,et al.,Hum Gene Ther,9(16):p.2363-73(1998)；Hemminki,A.and R.D.Alvarez,BioDrugs,16(2):p.77-87(2002)；Kanerva,A.,et al.,Clin Cancer Res,8(1):p.275-80(2002)； Li,Y.,et al.，Cancer Res,59(2):p.325-30(1999)；Miller,C.R.,et al.,Cancer Res,58(24):p.5738-48(1998)；Rein,D.T.,et al.,Int J Cancer,111(5):p.698-704(2004))，而且CAR的丢失与转移增加有关(Anders,M.,et al.,Br J Cancer,100(2):p.352-9(2009)；Dietel,M.,et al.,Journal of Molecular Medicine,89(6):p.621-630(2011)；Matsumoto,K.,et al.,Urology,66(2):p.441-446(2005))。Ad5不是一种天然的血源性病毒而且不会主动靶向和穿过脉管系统。这些因素限制了腺病毒载体用于基因表达和治疗的潜力。

对再靶向腺病毒摄取的尝试包括使用化学接头，所述化学接头能将病毒衣壳连接到再靶向配体上。一个实例是尾丝生物素化以提供用于和抗生物素蛋白再靶向配体发生高亲和力结合的化学连接体(Liu,Y.,P.Valadon,and J.Schnitzer,Virology Journal,7(1):p.316(2010))。但是，只能使用外源病毒才能实现再靶向，因为在病毒复制时化学修饰会丢失。遗传编码再靶向接头与病毒衣壳蛋白的融合是合乎需要的，但这也更具有挑战性。不幸的是，在衣壳蛋白中纳入大的配体会破坏它们的折叠/组装(Belousova,N.,et al.,J.Virol.,76(17):p.8621-8631(2002))。为了避免错误折叠，可将更小的多肽插入至尾丝H1环中(图6)(Belousova,N.,et al.,J Virol,76(17):p.8621-31(2002))。例如，RGD肽增强了整联蛋白辅助的摄取，但是不足以改变病毒的趋向性。尾丝和单链抗体(scFV)的融合也很有吸引力，但是当尾丝在细胞核中组装时，尾丝需要在ER/细胞液中加工(Kontermann,R.E.,Curr Opin Mol Ther,12(2):p.176-83(2010))。因此，尽管正努力地进行再靶向感染，但是体内的研究和结果一直都不令人满意(Waehler,R.,S.J.Russell,and D.T.Curiel,Nat Rev Genet,8(8):p.573-87(2007))。

理想的病毒会穿过血液/内皮层并通过不同受体感染肿瘤细胞。理想的系统是遗传编码的化学接头，所述化学接头可用于通过任何多个再靶向部分转换体内的病毒趋向性，而不会影响病毒的复制和安全性。本文提供了新的、可诱导的、遗传编码的化学接头系统，所述系统能够使感染再靶向多种细胞类型，并且在病毒复制时不会丢失。本发明因此克服了现有方法的局限性并具有一些优势。通过药物戒断可中断任何和受体再靶向相关的未预料到的毒性。另外，可在单个病毒中表达多个再靶向配体以靶向肿瘤细胞受体(例如，EGFR)和脉管系统(例如Von Willebrand因子/转铁蛋白)。

申请人利用免疫抑制和抗肿瘤药物——雷帕霉素(rap；图7)的已知特性使腺病毒的病毒衣壳蛋白尾丝再靶向可选的细胞受体。雷帕霉素可以用来诱导异源蛋白的异二聚体，如果一个蛋白融合至FKBP结构域(例如，再靶向配体)，另一个蛋白(例如，尾丝)融合至mTOR的FRB结构域的话(Chen,J.,et al.,Proc Natl Acad Sci U S A,92(11):p.4947-51(1995))。在用rap治疗时，尾丝会和再靶向配体发生异二聚化，使病毒能够感染所选择的细胞类型。雷帕霉素是FDA批准的大环内酯类抗生素并且在哺乳动物中具有理想的药代动力学性质。Rap诱导的异二聚化的高亲和力和稳定性已经被非常成功地用于多种应用，所述应用包括受体-配体复合物的噬菌体展示(de Wildt,R.M.,et al.,Proc Natl Acad Sci USA,99(13):p.8530-5(2002))、双功能蛋白的转录激活和重新构建(Clackson,T.,Chem Biol Drug Des,67(6):p.440-2(2006))。本申请提供了所述系统的新应用，该应用还利用了申请人之前关于rap的研究作为与溶瘤病毒的合理结合(O'Shea,C.,et al.,Embo J,24(6):p.1211-21(2005))。

开发一种用于使腺病毒再靶向肿瘤细胞受体的遗传编码的小分子控制的系统

目前的腺病毒载体的摄取对单个细胞受体的依赖性限制了它们全身递送的治疗潜力。为了克服这个问题，申请人设计了带有雷帕霉素诱导的、遗传编码的FRB/FKBP异二聚体的新Ad以使腺病毒能够再靶向肿瘤细胞受体。最后，该系统使得能够靶向血管生成肿瘤脉管系统中的受体以消除恶性肿瘤(例如TEM、TVM)，并且能够靶向高风险肿瘤例如乳腺癌中上调的标记物(例如，EGFR、HER2、TfR)。

FRB结构域插入到尾丝H1环中

赋予腺病毒趋向性的尾丝蛋白一般不允许有大的插入片段或修饰，因为尾丝三聚体正确折叠和组装成腺病毒颗粒对于可存活的后代是至关重要的。到目前为止，已经有效地将在C-末端的Ad5尾丝结节结构域上的插入序列限制为肽(Belousova,N.,et al.,J.Virol.,76(17):p.8621-8631(2002))。使用Adsembly(在图5中描述)将90个氨基酸的FRB结构域插入到尾丝的柔性H1环中，所述尾丝的柔性H1环能够容纳最高达100个氨基酸的插入片段而没有有害影响(Belousova,N.,et al., J.Virol.,76(17):p.8621-8631(2002))。

实验方法

将来自于申请人设计的基因组部件文库的野生型E3组件质粒——E_3-001(表1)用作将FRB序列插入尾丝基因中的模板。对E_3-001进行PCR扩增以生成用于插入至尾丝Thr546和Pro567之间的带有SLIC-兼容性末端的产物。从mTOR cDNA中PCR扩增mTOR的90个氨基酸的FRB结构域(Glu2025-Gln2114)并通过SLIC结合以生成E3-002(图8)。使用Adsembly策略将野生型E2、L3和E4组件与E3-002和E1-009(包含CMV驱动的GFP基因)结合以生成Ad-122基因组(图8)。申请人将所述Ad-122基因组转染到293E4细胞中，并收集病毒。不像很多大的配体(例如TrR)的插入，如来自E1报告基因的GFP荧光和所观察到的细胞病变效应(CPE)所证明的，FRB不抑制病毒的复制或组装以及有力的感染。如预测的FRB-尾丝(72.4kDa)迁移对比野生型尾丝(61.6kDa，图9)迁移所表明的，申请人通过蛋白质印迹证实了FRB-尾丝的表达。

从腺病毒基因组中表达FKBP再靶向部分

理想地，病毒基因组中FKBP的表达具有和尾丝的表达相匹配的相似时间选择(timing)和水平，以使得在rap的存在下FKBP能够和尾丝发生有效的二聚化。如在图10中总结的，申请人采用了一些策略以从所述基因组中表达FKBP。

实验方法

将在尾丝上带有FRB插入片段的E3-002质粒用作模板以引入图10中总结的策略所必需的序列。第一种方法是通过从尾丝转录物中以共翻译的形式表达FKBP以从腺病毒基因组中表达FKBP(图10C)。将所述FKBP序列置于在插入的Furin-2a序列之后的尾丝编码序列的下游。所述Furin-2a序列是一种优化的弗林(Furin)蛋白酶识别位点，其后是口蹄疫病毒2a自动切割位点(Fang,J.,et al.,Mol Ther,15(6):p.1153-1159(2007))。应生成等摩尔量的两种不同多肽：C-末端上带有残基精氨酸的FRB-尾丝分子，和N-末端上带有残基脯氨酸的FKBP蛋白。

成功克隆了所述序列，生成了E3-016，并使用Adsembly策略形成带有E1-009、E3-016和野生型E2、L3、和E4的全长基因组。和Ad-122的制备相似，将分离的上清液用于293E4细胞，但是没有由荧光或CPE 所指示的有效病毒复制。因此，采用替代的方法来表达FKBP，所述方法使用了在用于尾丝转录物的多聚A序列之前尾丝基因的3’末端上插入的IRES元件(图10D)。成功克隆了E3组件(E3-015)，并使用E1-009、E3-015和野生型E2、L3和E4生成完整的基因组(图8)。该病毒能够在293E4细胞中复制，但是在晚至感染后60个小时，通过蛋白质印记仍检测不到FKBP的表达(数据未显示)，由此表明尾丝转录物上IRES的效率对于表达FKBP而言是不理想的。最后的方法是利用腺病毒转录结构来表达FKBP。因为腺病毒的E3转录单元中的基因对于细胞培养物中的病毒复制是非必需的，因此用FKBP替换E3B转录物上编码RIDα、RIDβ、和14.7k的序列。克隆了E3组件(E3-048)并使用E1-009、野生型E2、L3和E4通过Adsembly来生成Ad-178(图8)。如荧光和CPE所证明的，该病毒能够在293E4细胞中复制。对感染细胞裂解物的蛋白质印记分析显示所述FKBP蛋白在感染的293E4细胞中累积(图11)。因此，使用该方法来形成新的表达FRB-尾丝和FKBP再靶向部分的病毒。

用于与FKBP融合的靶向部分

用于与FKBP融合的理想靶向蛋白是具有对特定癌细胞表面分子的强亲和力的稳定分子。开发了包括如下的很多方法：BN肽、EGF肽、TGFα、炭疽毒素PA、Tf、F3肽和VEGF(表3)。作为概念验证(proof of principle)，如下所述首先开发了VHH。使相似的实验方法适用于表3中列出的其他再靶向部分。最符合这些标准的一类蛋白是来自单域抗体(sdAb)的重链结构域(VHH)。骆驼科动物和鲨鱼编码sdAb，所述sdAb对来自一个可变链结构域(而不是大多数其他哺乳动物(例如啮齿类、人)所具有的两个可变链结构域(通常))的其特定靶标有特异性(Kontermann,R.E.,Curr Opin Mol Ther,12(2):p.176-83(2010))。虽然小的单链可变片段(scFV)已经被更广泛地使用，但是更小的和更稳定的VHH却具有独特优势，其不需要在翻译后形成二硫键来发挥功能。将FKBP与对癌细胞受体具有特异性的VHH融合以赋予理想的腺病毒靶向作用。为了用所述rap诱导的再靶向系统证明该效果，使用了最近鉴定的VHH，所述VHH对以下分子有特异性：癌胚抗原相关的细胞粘附分子5(CEA，也称为CEACAM5)(Vaneycken,I.,et al.,Journal of Nuclear Medicine,51(7):p.1099-1106(2010)；Behar,G.,et al., FEBS Journal,276(14):p.3881-3893(2009))——胃肠癌、乳腺癌、肺癌和卵巢癌的生物标记物(Duffy,M.J.,Clin Chem,47(4):p.624-630(2001))，和上皮生长因子受体(EGFR)(Gainkam,L.O.,et al.,Journal of nuclear medicine:official publication,Society of Nuclear Medicine,49(5):p.788-95(2008))——在很多上皮来源的癌症例如乳腺癌、头颈癌、前列腺癌、肺癌和皮肤癌中上调的分子。基于结构建模(图13)，将VHH结构域(CEA VHH、EGFR VHH)融合到FKBP的N末端上，以使得VHH/靶标相互作用和FKBP/rap/FRB二聚化界面都具有最小的位阻。

编码CEA VHH和EGFR VHH的基因序列是人密码子优化的，并分别基于由Behar et al.和Roovers et al.确定的蛋白质序列由Blue Heron Biotechnologies合成(Behar,G.,et al.,FEBS Journal,276(14):p.3881-3893(2009)；Roovers,R.,et al.,Cancer Immunology,Immunotherapy,56(3):p.303-317(2007))。使用SLIC，用插入的GSGSGST连接体序列将VHH序列融合到FKBP的N末端。使用本文所述的方法将这些融合蛋白克隆到E3组件中以生成Ad-177和Ad-178(表1)。图11显示了Ad-178感染的细胞中EGFR VHH-FKBP融合蛋白的表达，该表达类似于Ad-177中CEA VHH-FKBP的表达(数据未显示)。编码PA结构域4的基因序列是人类密码子优化的，并且基于Uniprot登录号P13423由Blue Heron Biotechnologies合成。使用SLIC，用插入的GSGSGST连接体序列将PA结构域4融合到FKBP的N末端。使用本文描述的方法将所述融合蛋白克隆到E3组件上以生成Ad-281(表1)。

使用免疫荧光检测雷帕霉素诱导的FRB-尾丝和VHH-FKBP融合蛋白的共定位。

通过免疫荧光或通过荧光标记的蛋白质检测蛋白在细胞中的共定位是一种评估蛋白是否有可能发生相互作用的方法。存在雷帕霉素和不存在雷帕霉素时FKBP向FRB-尾丝的定位(或反之亦然)的不同表明雷帕霉素诱导了它们的结合。对在显微镜载玻片上培养的用于对腺病毒表达的蛋白直接成像的293E4细胞进行感染。对具有500nM rap和溶剂对照的细胞中FRB-尾丝和VHH-FKBP融合蛋白进行评估以评估由于存在该药物而导致的任何定位上的不同。作为对照，使用Adsembly 策略构建病毒，所述病毒(Ad-199)表达CEA VHH-FKBP和野生型-尾丝，其是FRB依赖的rap诱导的FKBP共定位的对照。感染的293E4细胞的非共聚焦IF成像显示在rap存在下FRB-尾丝和VHH FKBP信号发生共定位(图14)。

通过雷帕霉素诱导的异二聚化对FRB-尾丝和VHH FKBP融合蛋白的免疫共沉淀(CoIP)

已经通过对来自感染的293E4细胞的裂解物进行FKBP的IP来对FRB-尾丝进行免疫共沉淀(反之亦然)。使用的病毒如下：实验组——Ad-177或Ad-178，用于评估rap诱导的FRB-FKBP结合；Ad-122(无FKBP、FRB-尾丝)，用于评估任何内源FKBP的二聚化的背景；和Ad-199(CEA VHH-FKBP、野生型尾丝)，用作阴性对照(完整的病毒列表见表1)。以10的感染复数(MOI)感染293E4细胞，并且在加入病毒后4小时更换培养基。在感染后24小时用500nM rap或溶剂对照(EtOH)处理细胞，并在感染后36小时收集细胞进行裂解。将总细胞提取物用于IP。

为了证明FRB/FKBP相互作用是生物学相关的并且该相互作用发生在腺病毒颗粒的表面，通过来自感染的293E4细胞的裂解物的非尾丝腺病毒衣壳蛋白对VHH-FKBP进行免疫共沉淀。另外，在加入rap和不加rap的情况下，通过CsCl梯度超速离心和阴离子交换对Ad-177和Ad-178进行纯化以观察在rap的存在下所述VHH-FKBP是否通过这些过程被(非免疫)沉淀/保留。

雷帕霉素诱导的病毒趋向性的再靶向

由rap诱导的FKBP再靶向病毒的二聚化应使得它们能够基于靶向部分对细胞受体的亲和力通过不同的受体进行感染。用分别针对CEA和EGFR的Ad-177、Ad-178病毒证明了该原理。用Ad-177和Ad-178感染293E4细胞，并将细胞用50015nM rap或溶剂对照处理。感染后48小时从培养基中收集病毒并将其直接用于感染一组癌细胞系。在不同稀释度的感染培养基(即：未稀释的、2倍稀释的、4倍稀释的等)下，对细胞进行感染(一式两份)。通过用FACS和高通量成像对GFP阳性细胞的数目进行定量来确定感染。

也可在感染的细胞中异位表达FKBP-配体融合蛋白以使得在衣壳中带有插入的FRB结构域的重组腺病毒能够进行寻靶。如果重组腺病毒与FKBP-配体和二聚化试剂一起存在，会发生靶向复合物的组装，即使所述FKBP-配体不是由腺病毒基因组表达的。申请人瞬时异位表达EGFR VHH-FKBP(从质粒中)，接着用Ad-122感染细胞。在存在雷帕霉素的情况下，单独的Ad-122不能进行寻靶，但是在额外存在EGFR VHH-FKBP的情况下，存在增强的感染(图26)。异位表达FKBP-配体的能力使得能够快速筛选文库中的候选配体或配体，而不需要组装新的重组腺病毒基因组。例如，在多孔板中，每孔的细胞会瞬时表达配体-FKBP池，用Ad-122感染每一个孔，可将所得到的病毒上清液用于培养中的细胞以定量靶向作用的增强。可进一步单独检测配体-FKBP池中成员的种类。另外，可诱变处理有效的配体-FKBP克隆并对其进行重新筛选以增强靶向腺病毒感染的有效性。

验证再靶向特异性

应该确认从病毒的雷帕霉素制品中所观察到的效果——相互作用是通过与VHH靶向部分相互作用而得到的——以验证所述系统。在表现出再靶向和不同趋向性的病毒的情况中，通过以下方式验证特异性：通过使用不同的VHH融合蛋白，通过以shRNA敲低(knock down)CAR以及VHH的细胞靶标(例如，对于Ad-178的EGFR敲低)、或通过用外源抗体或VHH封闭细胞靶标(例如，在Ad-178感染之前加入过量的外源EGFR VHH进行封闭)。使用雷帕霉素类似物(raplogs)的备选的化学诱导二聚体系统(例如正交FRB/FKBP突变体)也可能是必需的，如果内源的mTOR或FKBP干扰了病毒组件组装。或者，可开发其他二聚化系统(Hubbard,K.E.,et al.,Genes&Development,24(16):p.1695-1708(2010))。

雷帕霉素类似物诱导的病毒趋向性的再靶向

由于雷帕霉素可能表现出不合需要的生物学效应，例如，生长和增殖停滞(Jacinto E,Hall MN.Tor signalling in bugs,brain and brawn.Nat Rev Mol Cell Biol.2003；4(2):117-26)，因此使用具有相同异二聚化能力的生物正交分子来使腺病毒感染再靶向。雷帕霉素类似物AP21967(图7)能够和FKBP以及突变的FRB结构域(mTOR突变T2098L)——而不是野生型FRB结构域——形成稳定的异二聚体(Bayle JH,Grimley JS,Stankunas K,Gestwicki JE,Wandless TJ,Crabtree GR.Rapamycin analogs with differential binding specificity permit orthogonal control of protein activity.Chem Biol.2006；13(1):99-107)。组装编码EGFR VHH-FKBP和突变的FRB修饰的尾丝的重组腺病毒(Ad-220)并使用雷帕霉素或AP21697测试其靶向作用。雷帕霉素和AP21697都能够使Ad-220发生再靶向，但是仅能用雷帕霉素而不能用AP21697使对照病毒进行靶向。

V.材料与方法

Adsembly

用以下提及的组件构建修饰的腺病毒。使用gateway DONR载体。在人Ad5的实例中，通过PCR获得E1模块并通过SLIC将其插入载体pDONR P1P4。用PCR扩增包含attL1和attL4重组位点的pDONR P1P4 attL1载体骨架并通过SLIC将其与Ad5E1模块结合。为了生成替代的反选择盒，对载体pDONR P1P4进行修饰。通过PCR扩增包含attP1和attP4重组位点的该载体骨架并将其与PheS_A294G突变和四环素抗性盒(来自pENTR L3-pLac-Tet-L2的pLac-Tet盒)结合以形成新的DONR载体。接着通过PCR扩增来自新的DONR载体的attR1-PheS_A294GTet(r)-attR4片段并将其插入到Adsembly DEST载体中。参见“MultiSitePro Plus”，Cat#12537-100和Sone,T.et al..J Biotechnol.2008Sep 10；136(3-4):113-21。

在人Ad5的实例中，通过gateway BP反应将E3模块插入到pDONR P5P3r载体中。通过gateway BP反应将E4模块插入到pDONR P3P2载体中。通过PCR扩增来自pDONR P5P2载体的attR5-ccdB-Cm(r)-attR2片段并将其插入到Adsembly DEST载体中。参见“MultiSitePro Plus”,Cat#12537-100和Sone,T.et al.J Biotechnol.2008Sep 10；136(3-4):113-21。

Adsembly DEST载体的载体骨架包含三种不同来源的组件。从质粒pUC19中扩增出Amp(r)盒和lacZ基因。将其与从质粒pSB3K5-I52002中得到的p15A复制起点结合，所述质粒pSB3K5-I52002是BioBricksiGEM 2007parts distribution的一部分。使质粒保持在较低(10-12)拷贝数的p15A ori对于降低E1毒性是必需的。最后，为了形成自我切除的病毒，从质粒pAdZ5-CV5-E3+上PCR得到酶ISceI的哺乳动物表达盒。将此盒克隆到载体骨架中以形成名为p15A-SceI的载体。这就是用于启动基因组组装的载体。在人Ad5的实例中，基因模块都是获自从野生型Ad5病毒中纯化的DNA或质粒pAd/CMV/V5/DEST(Invitrogen)。

关于人Ad5实例中的DEST载体，通过3-片段SLIC将E2和L3模块插入到质粒p15A-SceI中。通过PCR从质粒pDONR P5P2中获得侧翼有attR5和attR2位点的表达ccdB和Chlor(r)的反选择标记。通过PCR从载体pDONR P1P4PheSA_294G-Tet(参见上文)中获得第二反选择标记(PheS-Tet)。用设计改造至E2和L4模块末端的独特限制性内切酶酶切后，通过SLIC将这两个反选择标记插入到p15A-SceI E2-L4的右边(ccdB/Cm)和左边(PheS/Tet)以构建DEST载体(pDEST E2-L5)。

关于含有腺病毒基因模块的多位点gateway入门载体，在人Ad5的实例中，通过SLIC将E1模块插入到pDONR P1P4中。通过gateway BP反应将E3模块插入到pDONR P5P3R中。通过gateway BP反应将E4模块插入到pDONR P3P2中。

关于Amp(r)盒：质粒pUC19，p15A起点：质粒pSB3K5-I52002是BioBricksiGEM 2007parts distribution的一部分。关于腺病毒基因模块：从Ad5颗粒中纯化的DNA、或质粒pAd/CMV/V5/DEST(Invitrogen)。从Jon Chesnut(Invitrogen)获得DONR载体pDONR P1P4、P5P2、P5P3R、P3P2。从DH5α细菌基因组DNA中得到PheS基因并随后通过quick change对其进行突变以获得PheS_A294G突变体。关于Tet(r)基因，从Jon Chesnut(Invitrogen)获得质粒pENTR L3-pLac-Tet-L2。

关于所述Adsembly方法的实施方案，将20fmol的双DEST载体(通常包含侧翼有两个反选择盒的核心模块)与10fmol的包含基因模块的各其余入门载体结合。在Ad5的实例中，这包括将20fmol的E2-L3双DEST载体与各10fmol的E1模块入门载体、E3模块入门载体和E4模块入门载体结合。在一些情况下，增加一种或多种入门载体的量可提高效率(例如，对于Ad5，使用50fmol的E1模块入门载体)。将这些载体与2μl的LR Clonase II(Invitrogen)以10μl的终体积结合。将该反应在25℃过夜孵育(12-16小时)。通过加入1μl蛋白酶K(Invitrogen)并在37℃下孵育10分钟将反应终止。然后将5μl反应物转化到对ccdB基因产物敏感的高效感受态细菌中(>1e9cfu/μg)并将其铺板在YEG-Cl琼脂平板上(如Kast,P.Gene,138(1994)109-114 中描述的；当使用PheS_A294G反选择时)或铺板在其他适于所述载体中使用的反选择的合适培养基上。随后分离菌落并筛选完整的基因组。将完整的基因组直接转染293E4细胞，转染后5-9天产生了感染性颗粒。

关于PCR，使用Phusion酶(NEB)进行所有的PCR。从Ad5中获得腺病毒基因模块的PCR是使用1xHF缓冲液、200μM每种dNTP、0.5μM每种引物和10ng模板进行。对于E2-L2模块，还加入3％DMSO。模板为质粒pAd/PL-DEST(Invitrogen；对于E2-L2、L3-L4、和E4模块)或Ad5基因组DNA(对于E1和E3模块)。PCR条件如下。E2-L2和L3-L4：98℃30秒——10个循环(98℃10秒、65℃30秒(每2个循环温度降低1℃)、72℃7分钟——29个循环(98℃10秒、60℃30秒、72℃8分钟)——72℃10分钟——4℃保持。E3：98℃30秒——10个循环(98℃10秒、70℃30秒(每个循环温度降低0.5℃)、72℃2分钟30秒)——25个循环(98℃10秒、68℃30秒、72℃2分钟30秒)——72℃10分钟——4℃保持。E4：98℃30秒——6个循环(98℃10秒、63℃30秒(每个循环温度降低0.5℃)、72℃2分钟)——29个循环(98℃10秒、60℃30秒、72℃2分钟)——72℃5分钟——4℃保持。关于从纯化的病毒中获得病毒基因组DNA，将最高达100μl的纯化的病毒加入到300μl的裂解缓冲液中，所述裂解缓冲液包括10mM Tris pH8、5mM EDTA、200mM NaCl、和0.2％SDS。将混合物在60℃下孵育5分钟，接着加入5μl的蛋白酶K储液(约20mg/mL)并进一步在60℃下孵育1小时。接着将样品在冰上放置5分钟，以15K x g离心15分钟。移出上清液并将其加入到等体积的异丙醇中，充分混合，并在4℃下以15K x g离心15分钟。用70％乙醇洗涤片状沉淀物并在4℃下再次离心5分钟。干燥所述片状沉淀物并重悬待用。

关于SLIC，将线性片段用外切核酸酶在室温下在以下20μl反应体系中处理20分钟，所述反应体系为：50mM Tris pH8、10mM MgCl₂、50μg/mL BSA、200mM尿素、5mM DTT和0.5μl T4DNA聚合酶。通过加入1μl 0.5M EDTA，接着在75℃下孵育20分钟将反应终止。然后在新管中将等量的T4处理的DNA混合至体积约20μl。对于结合两个片段的SLIC，使用10μl的各反应。对于结合三个片段的SLIC，使用10μl的各反应。

通过加热到65℃并持续10分钟来使片段退火，接着以每5秒降低温度0.5℃的缓慢冷却至25℃。退火后，转化5μl反应物并筛选克隆。

再靶向病毒的制备

关于病毒产生、浓度和纯化，用感染性颗粒感染293E4细胞，并且在转染后约48小时(当CPE很明显时)，收集细胞并以500x g离心5分钟对细胞进行分离。通过3次冻/融将细胞裂解在TMN缓冲液中(10mM TrisCl pH 7.5、1mM MgCl₂、150mM NaCl)，并以3K x g和3.5K x g进行两轮15分钟的离心将细胞碎片去除。使用氯化铯梯度(0.5g/mL)通过37K x g超速离心18-24小时使病毒颗粒分带。收集所述条带并在4℃下在10k MWCO透析盒(Thermo Scientific)中于含有10％甘油的TMN中对其进行过夜透析(12-18小时)，接着储存于-80℃中。通过基于细胞的连续稀释度感染ELISA，使用腺病毒5型初级抗体(ab6982、Abcam)和ImmunoPure抗兔的碱性磷酸酶二抗(Thermo Scientific)相对于滴定(titered)的野生型标准品测定所纯化的病毒的滴度。

关于mTOR的FRB结构域插入到腺病毒尾丝上，通过SLIC将FRB结构域插入到Adsembly入门载体pENTR E3-L5的尾丝基因的H1-环区域中。从pRK5mTOR-myc(R.Shaw)中PCR扩增出mTOR的90个氨基酸的FRB结构域(氨基酸Glu2025-Gln2114)用于插入到PCR扩增的pENTR E3-L5中，所述FRB结构域的末端侧接于腺病毒尾丝H1环的Thr546和Pro547之间，以生成所得到的载体——pENTR E3-L5(FRB-尾丝)。

关于对AP21967结合特异性的mTOR的FRB结构域的突变，使用标准技术在Adsembly入门载体pENTR E3-L5(FRB-尾丝)和pENTR E3-L5(ΔRID、EGFR VHH-FKBP、FRB-尾丝)中对FRB结构域进行突变。将残基Thr2098(mTOR编号)突变为Leu。这产生了Adsembly入门载体pENTR E3-L5(FRB*-尾丝)和pENTR E3-L5(ΔRID,EGFR VHH-FKBP、FRB*-尾丝)。

关于用于感染的腺病毒编码的荧光报告分子，将GFP序列插入腺病毒E1A基因的5’端以生成由Zhao,L.J.et al..J Biol Chem.2006Dec1；281(48):36613-23描述的融合蛋白。使用所述的C-连接体序列对GFP基因进行PCR扩增用于插入到PCR扩增的pENTR E1中，所述GFP 基因的末端位于腺病毒E1A的起始密码子侧翼，以生成所得到的载体——pENTR E1(GFP-E1A)。

关于从病毒基因组中表达FKBP，通过SLIC将FKBP序列插入到pENTR E3-L5中，由此替换了腺病毒的RIDα、RIDβ和14.7K基因。从pcDNA-FKBP12-Crluc(S.Gambhir)中PCR扩增出FKBP基因，用于插入到PCR扩增的pENTR E3-L5和pENTR E3-L5(FRB-尾丝)(缺少从RIDα的起始密码子到14.7K的终止密码子之间序列)中，以生成所得到的载体pENTR E3-L5(ΔRID、FKBP)和pENTR E3-L5(ΔRID、FKBP、FRB-尾丝)。构建了替代的FKBP插入位置(location)，但是免疫印迹显示其在感染过程中似乎不导致FKBP的积累(E1转录产物上C-末端IRES驱动的表达、尾丝转录产物上C-末端IRES驱动的表达，或尾丝-Furin2A-FKBP自动切割序列)。

关于再靶向部分与FKBP的基因融合，FRB-尾丝与FKBP的雷帕霉素依赖性的复合物的PyMol 3D建模显示了将靶向部分融合至FKBP的N末端的好处。在具有EGFR结合特异性的骆驼科抗体可变重链(VHH)(EGFR VHH)的情况中，由Blue Heron Biotech基因合成EGFR VHH，并通过SLIC使用GSGSGST连接体序列将其插入到pENTR E3-L5(ΔRID、FKBP)和pENTR E3-L5(ΔRID、FKBP、FRB-尾丝)中FKBP的N-末端，以生成质粒pENTR E3-L5(ΔRID、EGFR VHH-FKBP)和pENTR E3-L5(ΔRID、EGFR VHH-FKBP、FRB-尾丝)。

再靶向实验

关于雷帕霉素诱导的经由EGFR进行的EGFR VHH-FKBP再靶向腺病毒感染，使用Adsembly用pENTR E1(GFP-E1A)、pENTR E3-L5(ΔRID、EGFR VHH-FKBP、FRB-尾丝)、pENTR E4和pDEST E2-L5构建病毒(以下称为Ad-178)以感染一组癌细胞系。以MOI 10用Ad-178感染293E4细胞。感染24小时后将50nM雷帕霉素加入到培养基中。通过用Ad-178感染MDA MB 453来测试一系列雷帕霉素浓度以优化雷帕霉素浓度。感染后48小时，收集含有感染性颗粒的培养基并通过0.22μm细孔过滤器对其进行过滤。以连续稀释的形式用所述过滤的培养基感染在避光(black walled)的96孔板或6孔板中的一组癌细胞系，并将相似方法制备的病毒(不加雷帕霉素)作为对照平行感染相同组细胞。感染后3小时更换培养基。

关于雷帕霉素类似物诱导的经由EGFR进行的EGFR VHH-FKBP再靶向腺病毒感染，使用Adsembly用pENTR E1(GFP-E1A)、pENTR E3-L5(ΔRID、EGFR VHH-FKBP、FRB*-尾丝)、pENTR E4和pDEST E2-L5构建病毒，以下称为Ad5-220。以MOI 10用Ad5-220感染293E4细胞。感染后24小时将100nM AP21967加入到培养基中。感染后48小时，收集含有感染性颗粒的培养基并通过0.22μm细孔过滤器对其进行过滤。用所述过滤的培养基感染12孔板中的癌细胞系，并将用相似方法制备的病毒(加雷帕霉素或不加AP21967)作为对照平行感染相同组细胞。感染后1小时更换培养基。

关于使用异位表达的配体-FKBP的雷帕霉素类似物诱导的再靶向腺病毒感染，用EGFR VHH-FKBP(或作为对照的GFP)瞬时转染293E4细胞，并且转染后24小时，以MOI 10用Ad-122对其进行感染。感染后24小时将100nM雷帕霉素加入到培养基中。感染后48小时，收集含有感染性颗粒的培养基并通过0.22μm细孔过滤器对其进行过滤。用所述过滤的培养基感染接种在12孔板中的MDA MB 231细胞。感染后1小时更换培养基。

关于感染效率的定量，通过用ImageXpress软件在25ImageXpress Micro上计数GFP阳性细胞百分数来以高容量成像对96孔板进行定量。通过使用FACScan的FACS(BD Biosciences)计数GFP阳性细胞百分数来对6孔板或12孔板的感染效率进行定量。

关于EGFR VHH再靶向腺病毒对EGFR的特异性，将来自Engelman,J.A.et al..J Clin Inv.2006Oct 2；116(10):2695-706的有效shRNA B序列克隆到pLentiX2puro载体(Addgene)中H1启动子的控制下，并将其用于生成慢病毒以介导MDA MB 453乳腺癌细胞中EGFR的敲低。用抗EGFR shRNA的构建体或编码针对荧光素酶基因的shRNA的对照慢病毒转导MDA MB 453，并在2μg/mL的嘌呤霉素下对其进行筛选。通过对总蛋白中的EGFR进行免疫印迹来对敲低效率进行定量。在6孔板中对所选择的MDA MB 453重复如上所述的再靶向测定，并通过使用FACScan的FACS(BD Biosciences)对感染效率进行定量。

VI.表格

表1：设计的新病毒的概述。

表2.二聚化试剂(DA)、所述衣壳-二聚化试剂结合物的缀合物(DABC)的二聚化试剂结合物，和所述配体-二聚化试剂结合物的缀合物(DABL)的二聚化试剂结合物的实例。

表3.所述配体-二聚化试剂结合物的缀合物包含的配体以及这些配体所结合的相应细胞表面受体的实例。

VII.实施方案

实施方案1.一种重组核酸，其编码衣壳-二聚化试剂结合物的缀合物和配体-二聚化试剂结合物的缀合物。

实施方案2.实施方案1的重组核酸，其中所述衣壳-二聚化试剂结合物的缀合物包含衣壳蛋白和二聚化试剂结合物。

实施方案3.实施方案2的重组核酸，其中所述衣壳蛋白与所述二聚化试剂结合物可操作地连接。

实施方案4.实施方案3的重组核酸，其中所述衣壳蛋白是腺病毒衣壳蛋白。

实施方案5.实施方案4的重组核酸，其中所述腺病毒衣壳蛋白是尾丝蛋白。

实施方案6.实施方案3的重组核酸，其中所述二聚化试剂结合物是FRB蛋白。

实施方案7.实施方案1的重组核酸，其中所述配体-二聚化试剂结合物的缀合物包含配体和二聚化试剂结合物。

实施方案8.实施方案7的重组核酸，其中所述配体与所述二聚化试剂结合物可操作地连接。

实施方案9.实施方案7的重组核酸，其中所述配体能够结合细胞。

实施方案10.实施方案9的重组核酸，其中所述细胞是肿瘤细胞。

实施方案11.实施方案7的重组核酸，其中所述配体是抗体。

实施方案12.实施方案11的重组核酸，其中所述抗体是单域抗体。

实施方案13.实施方案7的重组核酸，其中所述二聚化试剂结合物是亲免素蛋白。

实施方案14.实施方案13的重组核酸，其中所述亲免素蛋白是FKBP蛋白。

实施方案15.实施方案14的重组核酸，其中所述FKBP蛋白是人FKBP蛋白。

实施方案16.实施方案15的重组核酸，其中所述人FKBP蛋白是FKBP12。

实施方案17.一种重组腺病毒，所述腺病毒包含实施方案1-16中之一的重组核酸。

实施方案18.实施方案17的重组腺病毒，其中所述腺病毒是一种复制缺陷型腺病毒。

实施方案19.实施方案17的重组腺病毒，其中所述腺病毒是一种可复制型腺病毒。

实施方案20.一种重组腺病毒，所述腺病毒包含衣壳-二聚化试剂结合物的缀合物。

实施方案21.实施方案20的重组腺病毒，其中所述衣壳-二聚化试剂结合物的缀合物结合至二聚化试剂。

实施方案22.实施方案21的重组腺病毒，其中所述二聚化试剂是化合物。

实施方案23.实施方案22的重组腺病毒，其中所述化合物是雷帕霉素。

实施方案24.实施方案21的重组腺病毒，其中所述二聚化试剂是抗癌药物。

实施方案25.实施方案21的重组腺病毒，其中所述二聚化试剂还结合至配体-二聚化试剂结合物的缀合物。

实施方案26.一种细胞，所述细胞包含实施方案20-25中任一项的重组腺病毒。

实施方案27.一种形成靶向腺病毒癌细胞的构建体的方法，所述方法包括：(i)用实施方案17的重组腺病毒感染细胞，从而形成腺病毒感染的细胞；(ii)使所述腺病毒感染的细胞表达所述重组核酸，从而形成配体-二聚化试剂结合物的缀合物和包含衣壳-二聚化试剂结合物的缀合物的重组腺病毒；(iii)使所述重组腺病毒和所述配体-二聚化试剂结合物的缀合物与二聚化试剂接触；(iv)使所述重组腺病毒和所述配体-二聚化试剂结合物的缀合物与所述二聚化试剂结合，从而形成所述靶向腺病毒癌细胞的构建体。

实施方案28.一种靶向细胞的方法，所述方法包括使细胞与实施方案20-25中任一项的重组腺病毒接触。

实施方案29.实施方案28的方法，其中所述细胞为癌细胞。

实施方案30.一种靶向癌症患者中的癌细胞的方法，所述方法包括：(i)将实施方案17的重组腺病毒给予癌症患者；(ii)使所述重组腺病毒感染所述癌症患者中的细胞，从而形成腺病毒感染的细胞；(iii)使所述腺病毒感染的细胞表达所述重组核酸，从而形成配体-二聚化试剂结合物的缀合物和包含衣壳-二聚化试剂结合物的缀合物的重组腺病毒；(iv)将二聚化试剂给予所述癌症患者；(v)使所述重组腺病毒和所述配体-二聚化试剂结合物的缀合物与所述二聚化试剂结合，从而形成靶向腺病毒癌细胞的构建体；(vi)使所述靶向腺病毒癌细胞的构建体结合至癌细胞，从而靶向所述癌症患者中的所述癌细胞。

实施方案31.实施方案30的方法，其中所述细胞为癌细胞。

实施方案32.实施方案30的方法，其中所述细胞为非癌细胞。

实施方案33.一种靶向细胞的方法，所述方法包括：(i)使第一细胞与实施方案17的重组腺病毒接触；(ii)使所述重组腺病毒感染所述第一细胞，从而形成腺病毒感染的细胞；(iii)使所述腺病毒感染的细胞表达所述重组核酸，从而形成配体-二聚化试剂结合物的缀合物和包含衣壳-二聚化试剂结合物的缀合物的重组腺病毒；(iv)使所述配体-二聚化试剂结合物的缀合物和所述重组腺病毒与二聚化试剂接触；(v)使所述重组腺病毒和所述配体-二聚化试剂结合物的缀合物结合至所述二聚化试剂，从而形成靶向腺病毒细胞的构建体；(vi)使所述靶向腺病毒细胞的构建体结合至第二细胞，从而靶向所述细胞。

实施方案34.实施方案33的方法，其中所述第一细胞和所述第二细胞构成有机体的一部分。

实施方案35.实施方案33的方法，其中所述第一细胞和所述第二细胞构成组织培养皿的一部分。

Claims

1.一种重组核酸，其编码衣壳-二聚化试剂结合物的缀合物和配体-二聚化试剂结合物的缀合物。

2.权利要求1的重组核酸，其中所述衣壳-二聚化试剂结合物的缀合物包含衣壳蛋白和二聚化试剂结合物。

3.权利要求2的重组核酸，其中所述衣壳蛋白与所述二聚化试剂结合物可操作地连接。

4.权利要求3的重组核酸，其中所述衣壳蛋白是腺病毒衣壳蛋白。

5.权利要求4的重组核酸，其中所述腺病毒衣壳蛋白是尾丝蛋白。

6.权利要求3的重组核酸，其中所述二聚化试剂结合物是FRB蛋白。

7.权利要求1的重组核酸，其中所述配体-二聚化试剂结合物的缀合物包含配体和二聚化试剂结合物。

8.权利要求7的重组核酸，其中所述配体与所述二聚化试剂结合物可操作地连接。

9.权利要求7的重组核酸，其中所述配体能够结合细胞。

10.权利要求9的重组核酸，其中所述细胞是肿瘤细胞。

11.权利要求7的重组核酸，其中所述配体是抗体。

12.权利要求11的重组核酸，其中所述抗体是单域抗体。

13.权利要求7的重组核酸，其中所述二聚化试剂结合物是亲免素蛋白。

14.权利要求13的重组核酸，其中所述亲免素蛋白是FKBP蛋白。

15.权利要求14的重组核酸，其中所述FKBP蛋白是人FKBP蛋白。

16.权利要求15的重组核酸，其中所述人FKBP蛋白是FKBP12。

17.一种重组腺病毒，其包含权利要求1-16中之一的重组核酸。

18.权利要求17的重组腺病毒，其中所述腺病毒是一种复制缺陷型腺病毒。

19.权利要求17的重组腺病毒，其中所述腺病毒是一种可复制型腺病毒。

20.一种重组腺病毒，其包含衣壳-二聚化试剂结合物的缀合物。

21.权利要求20的重组腺病毒，其中所述衣壳-二聚化试剂结合物的缀合物结合至二聚化试剂。

22.权利要求21的重组腺病毒，其中所述二聚化试剂是化合物。

23.权利要求22的重组腺病毒，其中所述化合物是雷帕霉素。

24.权利要求21的重组腺病毒，其中所述二聚化试剂是抗癌药物。

25.权利要求21的重组腺病毒，其中所述二聚化试剂还结合至配体-二聚化试剂结合物的缀合物。

26.一种细胞，其包括权利要求20-25中任一项的重组腺病毒。

27.一种形成靶向腺病毒癌细胞的构建体的方法，所述方法包括：

(i)用权利要求17的重组腺病毒感染细胞，从而形成腺病毒感染的细胞；

(ii)使所述腺病毒感染的细胞表达所述重组核酸，从而形成配体-二聚化试剂结合物的缀合物和包含衣壳-二聚化试剂结合物的缀合物的重组腺病毒；

(iii)使所述重组腺病毒和所述配体-二聚化试剂结合物的缀合物与二聚化试剂接触；

(iv)使所述重组腺病毒和所述配体-二聚化试剂结合物的缀合物与所述二聚化试剂结合，从而形成所述靶向腺病毒癌细胞的构建体。

28.一种靶向细胞的方法，所述方法包括使细胞与权利要求20-25中任一项的重组腺病毒接触。

29.权利要求28的方法，其中所述细胞为癌细胞。

30.一种靶向癌症患者中的癌细胞的方法，所述方法包括：

(i)将权利要求17的重组腺病毒给予癌症患者；

(ii)使所述重组腺病毒感染所述癌症患者中的细胞，从而形成腺病毒感染的细胞；

(iii)使所述腺病毒感染的细胞表达所述重组核酸，从而形成配体-二聚化试剂结合物的缀合物和包含衣壳-二聚化试剂结合物的缀合物的重组腺病毒；

(iv)将二聚化试剂给予所述癌症患者；

(v)使所述重组腺病毒和所述配体-二聚化试剂结合物的缀合物与所述二聚化试剂结合，从而形成靶向腺病毒癌细胞的构建体；

(vi)使所述靶向腺病毒癌细胞的构建体结合至癌细胞，从而靶向所述癌症患者中的所述癌细胞。

31.权利要求30的方法，其中所述细胞为癌细胞。

32.权利要求30的方法，其中所述细胞为非癌细胞。

33.一种靶向细胞的方法，所述方法包括：

(i)使第一细胞与权利要求17的重组腺病毒接触；

(ii)使所述重组腺病毒感染所述第一细胞，从而形成腺病毒感染的细胞；

(iv)使所述配体-二聚化试剂结合物的缀合物和所述重组腺病毒与二聚化试剂接触；

(v)使所述重组腺病毒和所述配体-二聚化试剂结合物的缀合物结合至所述二聚化试剂，从而形成靶向腺病毒细胞的构建体；

(vi)使所述靶向腺病毒细胞的构建体结合至第二细胞，从而靶向所述细胞。

34.权利要求33的方法，其中所述第一细胞和所述第二细胞构成有机体的一部分。

35.权利要求33的方法，其中所述第一细胞和所述第二细胞构成组织培养皿的一部分。