JP2008249552A - 可溶性血小板膜糖タンパク質ｖｉの測定系 - Google Patents

Abstract

【課題】血栓及びその他の血管性疾患を検出し治療するための診断方法及び治療剤を提供する。
【解決手段】血小板膜糖タンパク質ＶＩ（ＧＰＶＩ）、フラグメント、又はその天然変異体に対して産生されるモノクローナル抗体を用いたＧＰＶＩの測定方法、特に血液、体液中の可溶性ＧＰＶＩを測定するＥＬＩＳＡ系について記載する。又、抗ＧＰＶＩモノクローナル抗体の産生方法、及びこれらの抗体を用いて、特に血栓及びその他の血管性疾患を治療する方法について記載する。
【選択図】なし

Description

本発明は、血小板膜糖タンパク質ＶＩ（以下、血小板膜糖タンパク質ＶＩを「ＧＰＶＩ」と言う）、フラグメント、又はその天然変異体に対して産生された抗体、抗ＧＰＶＩ抗体を産生する方法、及びこれらの抗体の試験、診断及び免疫治療剤、特に血栓及びその他の血管性疾患を検出し治療するための診断及び治療剤としての使用に関する。

血小板は、恒常性の制御及び創傷治癒に必須の小さく無核の血液細胞である。循環している血小板は、通常の条件下ではかなり静止状態にある。しかし、血管が破壊されるか又は損傷を受けると、血小板は、血液凝固及び血塊形成に導く複雑で相互に連結した細胞プログラムを開始する種々の因子に曝露される。このことは、Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｋ．Ｓ．Ａｕｔｈｉ，Ｓ．Ｐ．Ｗａｔｓｏｎ，及びＶ．Ｖ．Ｋａｋａｒ（編）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，１９９３に総説されている。これらの細胞プログラムの活性化は、膜粘着特性、血小板凝集並びに血管収縮因子及び線維素溶解因子の放出において劇的な増加をもたらす。結果として、血塊が外傷部位で形成され、血管壁中の任意の穴をふさぎ、線維芽細胞の侵入及び修復のための基礎が提供される。

凝固過程における初期の事象は、２つの主な要素、粘着と活性化とに機能的に分けることができる。粘着は、血小板が損傷した血管壁に「くっつく」過程であるが、活性化は、複雑な生理的変化を細胞の内部で開始する。これらの２つの過程は一緒になって、血小板凝集、栓子形成、及び最終的には成熟血塊をもたらす。これらの事象は、損傷部位に対する血液損失の制限に必須であるが、血小板粘着及び活性化は、罹患状態の悪化にも寄与する恐れがある。例えば、凝固は罹患血管の閉塞を引き起こすことができ、虚血を導き、重要な組織、例えば心臓及び脳に損傷をもたらす。恒常性及び血栓形成における血小板の二重の役割は、Ｒｕｇｇｅｒｉ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，８：１２２７〜１２３４（２００２）に総説されている。

これらの過程のほとんどの工程は、細胞外リガンドと血小板細胞膜に埋め込まれた特異的受容体との相互作用に依存する。ｉｎ ｖｉｖｏでは、血小板の作用における最初の目に見える変化は、内皮損傷により裸出された内皮の領域への血小板の粘着である。裸出された内皮で露出されることになる微小分子構成要素のうち、コラーゲンは、血小板と最も反応性が高いと考えられている。コラーゲンは、直接的及び間接的経路を通して血小板粘着を助け、血小板凝集の開始及び栓子形成に必要な凝固活性の発生により血小板を活性化もする。Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒ，Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．３７：１〜１６（１９７７）。

血小板と内皮下層との間の最初の接触は、血小板糖タンパク質複合体ＧＰＩｂ−Ｖ−ＩＸと、露出した内皮下層に結合したフォンウィルブランド因子（ｖＷｆ）との相互作用を伴う。この相互作用は、可逆過程とみられ、血管壁に沿った血小板の「転がり」により表されるように、安定な粘着には不十分である。Ｒｕｇｇｅｒｉ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，８：１２２７〜１２３４（２００２）。ｖＷｆ相互作用は循環血小板を完全には固定化しないが、高血流条件下では血小板の粘着に必須である。糖タンパク質ＧＰＩａ−ＩＩａ（インテグリンα_２β_１としても知られる）を介しての内皮下層コラーゲンへの血小板のその後の非可逆的結合は、ｖＷｆ相互作用事象を安定化し、血小板を血管壁に硬くつなぎとめる。ｖＷｆとは違って、コラーゲン粘着はよりゆっくりした過程とみられ、低血流条件下でのみ、又は血小板がｖＷｆ相互作用により部分的に抑止された後に有効である。さらに、ＧＰＩａ−ＩＩａ結合は、血管壁に対する血小板の扁平化（伸展）を誘発する。この伸展は、フィブロネクチン、ビトロネクチン及びトロンボスポンジンを含むその他の内皮下層接着因子の結合を促進する。これらの伸展後の相互作用は、血管壁への血小板の粘着をさらに安定化する。

ＧＰＩａ−ＩＩａは、α及びβサブユニットを含むインテグリンである。これらの通常のコンホメーションにおいて、インテグリンはそれらの天然リガンドに対して低い親和性を有するが、他の細胞受容体により発生するシグナルを通して高親和性受容体に変換され得る。Ｎｉｅｓｗａｎｄｔ Ｂ及びＷａｔｓｏｎ ＳＰ．Ｂｌｏｏｄ １０２：４４９〜４６１（２００３）。ＧＰＩａ−ＩＩａ及びその他のコラーゲン受容体を刺激することにより、生理的変化が宿主に誘導される。これらのうち、細胞表面粘着特性が変更されると、血小板−血小板凝集及び種々の生物活性化合物の分泌がもたらされる。これらの化合物は、血管収縮剤のエピネフリン、及びトロンビンを活性化し、成熟血塊のフィブリン繊維へのフィブリノゲンの重合を誘導するプロ凝固因子（ｐｒｏｃｌｏｔｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）を含む。さらに、活性化された血小板はＡＤＰ及びトロンボキサンＡ_２（ＴＸＡ_２）を放出する。これらの強力な血栓形成性因子は、最初の活性化シグナルを増幅し、さらなる血小板を活性化された状態に引き込む。

ＧＰＩａ−ＩＩａに加えて、少なくとも２つのその他のコラーゲン受容体、すなわちＧＰＩＶ（ＣＤ３６）及びＧＰＶＩが血小板細胞表面で発現される（ＦａｒｎｄａｌｅＲＷら、Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ ２：５６１〜５７３，２００４で総説されている）。これらの血小板コラーゲン受容体の機能の手がかりは、ヒトの患者の変異体の試験から来ている。ヒト患者の変異体の試験は、ＧＰＶＩが血小板−コラーゲン相互作用において主要な役割を演じているが、ＧＰＩＶの寄与は小さいことを示唆する。これらの試験は、ＧＰＩａ−ＩＩａ又はＧＰＶＩのいずれかを欠損した個体の実質的な数が、ＧＰＩａ−ＩＩａ又はＧＰＶＩを発現する個体と比較して少し長い出血時間を示すことも示す。ＧＰＩａ−ＩＩａ欠損は、通常、ＧＰＶＩの欠損よりもより深刻な出血障害に導く。にもかかわらず、これらの患者は、ＧＰＩｂ欠損により引き起こされるベルナールスリエ症候群又はＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａ欠損により引き起こされるグランツマン血小板無力症の個体で見られるような深刻な出血傾向をほとんど示さない。

ヒト変異体及び最近のｉｎ ｖｉｔｒｏデータの知見によると、３つのコラーゲン受容体が協力して作用してコラーゲン−血小板相互作用を媒介することが示唆される。例えばｉｎ ｖｉｔｒｏでは、コラーゲン受容体部位に特異的な抗体を用いて各コラーゲン受容体の活性を阻止することが現在では可能である。個別に、各抗体は、コラーゲンへの血小板の粘着を部分的に阻害し、抗体の対の組み合わせは、特にＧＰＩａ−ＩＩａ及びＧＰＶＩが同時に阻害されるときには、著しくより阻害的である。さらに、これらの試験は、ＧＰＩＶ、ＧＰＩａ−ＩＩａ及びＧＰＶＩが、二価の金属カチオン要求性により機構的に区別可能な２つの別個の経路を通して血栓に寄与することを示す。

生化学的情報及び配列情報は、ＧＰＩａ−ＩＩａがカチオン依存性インテグリン型受容体であることを示す。これに対して、生化学的試験は、ＧＰＩＶ及びＧＰＶＩが二価金属カチオンを要求せず、したがって非インテグリン型であることを明らかにする。非インテグリンクラスのものについて、ヒト対象の観察は、最初の粘着過程においてＧＰＶＩがＧＰＩＶよりもより重要であることを明らかに示唆する。実際に、ＧＰＩａ−ＩＩａ機能が二価カチオンをキレート化することにより阻止されるｉｎ ｖｉｔｒｏ実験において、ＧＰＶＩに誘導される抗体はコラーゲン−血小板相互作用を完全に解消する。Ｎａｋａｍｕｒａら Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：４３３８〜４３４４，（１９９８）。

ＧＰＶＩは、等電点電気泳動及び電気泳動により約３０年前に最初に同定された。最近まで、その機能は完全に定義されておらず、還元条件下で約６２ｋＤａの分子質量を有する血小板糖タンパク質として知られているのみであった。しかし、１９８７年の初めごろ、Ｍｉｎｏｒｕ Ｏｋｕｍａ博士らが、加速度的な血小板破壊及び循環血小板数の減少を特徴とする出血／挫傷形成症候群である血小板減少性紫斑病の形を有する数人の患者を試験した。Ｏｋｕｍａ博士の幾人かの患者の血小板は、ＡＤＰ、トロンビン、リストセチン及びカルシウムイオノフォア（Ａ２３１８７）を含むほとんどのアゴニストに応答して正常に凝集したが、明らかにコラーゲンには反応がなかった。さらに、これらの血小板は、６２ｋＤａ糖タンパク質の量が減少していたか又は完全に欠損していたことが見出された。Ｓｕｇｉｙａｍａら、Ｂｌｏｏｄ ６９：１７１２〜２０（１９８７）；Ｍｏｒｏｉら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８４：１４４０〜４５（１９８９）；Ｒｙｏら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３９：２５〜３１（１９９２）；及びＡｒａｉら、Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．８９：１２４〜１３０（１９９５）。

ＧＰＶＩ機能の初期の試験における重要な被験者が、Ｏｋｕｍａ博士の血小板減少性紫斑病患者の１人から得られた。この患者は、説明のつかない著しい出血を示し、ＨＬＡ一致血小板の注入により処置された。その後、患者の血液を詳細に調べると、ＧＰＶＩの完全欠損が明らかになった。

最も驚くべきことに、この患者は完全にＧＰＶＩを欠損しているので、その免疫系によって注入された血小板のＧＰＶＩ分子が外来抗原と特定され、ＧＰＶＩに対するポリクローナル抗体が産生された。Ｓｕｇｉｙａｍａら、Ｂｌｏｏｄ ６９：１７１２〜２０（１９８７）。

天然の抗体は、単一抗原エピトープに特異的な２つの同じ結合部位で構成される。これらの２つの抗原特異的部分は、共通の基部又はＦｃドメインにより連結され、２つの同一抗原分子に結合可能な複合体を形成する。さらに、抗体の二価の性質がＦｃドメインの凝集性の特性と関連して、多くの特異的抗原分子の架橋及び凝集を可能にする。Ｏｋｕｍａ博士は、患者の血清からの二価の抗体が、正常血小板と混合したときに著しい凝集応答を引き起こしたことを見出した。逆に、抗原特異的ドメインが、連結Ｆｃドメインの酵素的除去により一価にされると、得られるＦａｂフラグメントは正常血小板のコラーゲン誘発凝集を解消し、血小板−コラーゲン粘着を阻害した。

Ｏｋｕｍａ博士は、親切なことに、科学界がこの希少な血清を利用することを可能にした。遺憾なことに、その供給は限られており、その発見の周囲の環境は、実質的に再現不可能である。Ｏｋｕｍａ血清はＧＰＶＩ機能への多くの試験を可能にし、ＧＰＶＩとしてのタンパク質を同定する唯一の方法を長く提供していたが、最近、Ｃ型レクチンであるコンバルキシン（ｃｏｎｖｕｌｉｘｉｎ）が高い親和性でＧＰＶＩに特異的に結合し、ＧＰＶＩタンパク質を同定するプローブとして標識できることが見出された。Ｆｒａｎｃｉｓｈｅｔｔｉら、Ｔｏｘｉｃｏｎ ３５：１２１７〜２８（１９９７）；Ｐｏｌｇａｒｅｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（２４）：１３５７６〜８３（１９９７）；Ｊａｎｄｒｏｔ−Ｐｅｒｒｕｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（２）：２７０３５〜４１（１９９７）。コンバルキシンは、熱帯のガラガラヘビであるクロタルス・ドゥリッセウス・テリフィカス（Ｃｒｏｔａｌｕｓ ｄｕｒｉｓｓｕｓ ｔｅｒｒｉｆｉｃｕｓ）からの毒成分である。その未変性多価形態において、コンバルキシンは血小板凝集並びにプロ凝集因子及びプロ凝固因子の分泌の強力な誘導剤である。コンバルキシンの多価の性質は、凝集効果に重要である。この反応の基礎生理学的性質は不明であるが、個別のコンバルキシンサブユニットはＧＰＶＩになおも結合するが、凝集を誘導するよりもむしろ阻害する。一価のコンバルキシンは、コラーゲン誘発シグナルの細胞内部への伝達を阻止することが示唆されている。

さらにより最近になって、完全ＧＰＶＩ配列が決定された。Ｃｌｅｍｅｔｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２９０１９〜２４（１９９９）；国際公開第００／６８３７７号；Ｊａｎｄｒｏｔ−Ｐｅｒｒｕｓら、Ｂｌｏｏｄ ９６：１７９８〜８０７（２０００）；Ｅｚｕｍｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．２７７：２７〜３６（２０００）。ＧＰＶＩは、免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、Ｆｃ受容体γ鎖（ＦｃＲγ鎖）と非共有結合する。Ｇｉｂｂｉｎｓら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４１３：２５５〜２５９（１９９７）；Ｔｓｕｊｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２３５２８〜２３５３１（１９９７）。ＧＰＶＩへのコラーゲンの結合が、ＦｃＲγのチロシンリン酸化を誘導すると現在は考えられている。リン酸化されたＦｃＲγは、次いで、Ｓｙｋのリン酸活性化を含む細胞内事象のカスケードを最終的に誘導するＳｙｋキナーゼと、ホスホリパーゼＣ−γ２とを補充する。これらの事象は、最終的に、細胞内カルシウム濃度並びにプロ凝集因子及びプロ凝固因子の分泌の増加をもたらす。したがって、ＦｃＲγ鎖は、ヒト及びマウスの血小板において受容体のシグナル伝達部分として作用する。Ｃｌｅｍｅｔｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２９０１９〜２９０（１９９９）；Ｊａｎｄｒｏｔ−Ｐｅｒｒｕｓら、Ｂｌｏｏｄ ９６：１７９８〜１８０７（２０００）；Ｇｉｂｂｉｎｓら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４１３：２５５〜２５９（１９９７）；Ｔｓｕｊｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２３５２８〜２３５３１（１９９７）。

ＧＰＶＩ媒介の場合を含め、血小板の活性化は血小板のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）を刺激することもできる。Ｊｕｒａｓｚら、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．９０：１０４１〜１０４３（２００２）。さらに、血小板の活性化はある種の細胞表面レセプターの消失又は発現低下をもたらす。この表面レセプターの消失又は発現低下は、活性化した血小板ＭＭＰにより媒介される、細胞外ドメインのタンパク分解的な開裂又はシェディング（Ｓｈｅｄｄｉｎｇ）を伴う。かかるシェディングの２つの具体例は、ヒト血小板上のＧＰＩｂα及びＧＰＶＩのＭＭＰによるタンパク分解的開裂である。Ｂｅｒｇｍｅｉｅｒら、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．９５：６６７〜６８３（２００４）；Ｂｅｒｇｍｅｉｅｒら、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．９１：９５１〜９５８（２００４）；Ｇａｒｄｉｎｅｒら、Ｂｌｏｏｄ １０４：３６１１〜３６１７（２００４）；Ｓｔｅｐｈｅｎｓら、Ｂｌｏｏｄ １０５：１８６〜１９１（２００５）。

ＧＰＶＩの発現低下及びその細胞外ドメイン（外部ドメイン、可溶性ＧＰＶＩ（以下、「可溶性血小板膜糖タンパク質ＶＩ」を「可溶性ＧＰＶＩ」と言う）の血漿中へのシェディングがマウス血小板において観察され、ヒト血小板においても示唆された。Ｂｏｙｌａｎら、Ｂｌｏｏｄ １０４：１３５０〜１３５５（２００４）；Ｎｉｅｓｗａｎｄｔら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９３：４５９〜４７０（２００１）；Ｓｕｇｉｙａｍａら、Ｂｌｏｏｄ ６７：１７１２〜１７２０（１９８７）。最近の２つの研究では、ＧＰＶＩ特異的アゴニストであるコラーゲン、コラーゲン関連ペプチド（ＣＲＰ）及びコンバルキシン（ｃｏｎｖｕｌｘｉｎ）による活性化に反応して、血小板から可溶性ＧＰＶＩが徐々にシェディングすることが記載されている。Ｂｅｒｇｍｅｉｅｒら、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．９１：９５１〜９５８（２００４）；Ｇａｒｄｉｎｅｒら、Ｂｌｏｏｄ １０４：３６１１〜３６１７（２００４）。両方の研究において、ＭＭＰ特異的阻害剤は、アゴニストが誘発する可溶性ＧＰＶＩのシェディングを少なくともｉｎ ｖｉｔｒｏ条件下で阻止した。

ＧＰＶＩを介した血小板活性化に反応する可溶性ＧＰＶＩのシェディングは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいても起こるように思われる。このことは、マウス内への抗マウスＧＰＶＩラット抗体の注射が可溶性ＧＰＶＩのシェディングをもたらすという観察によって支持される。Ｎｉｅｓｗａｎｄｔら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９３：４５９〜４６９（２００１）。抗ヒトＧＰＶＩ抗体が、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス内を循環しているヒト血小板から可溶性ＧＰＶＩのシェディングを誘発し得ることも示された。Ｂｏｙｌａｎら、Ｂｌｏｏｄ １０８：９０８〜９１４（２００６）。さらに、血小板表面上のＧＰＶＩ量が、重度の心筋梗塞患者において上昇することが報告された。Ｓａｍａｈａら、Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ｍｏｎｉｔ．１１：ＣＲ２２４〜ＣＲ２２９（２００５）；Ｂｉｇａｌｋｅら、Ｅｕｒ．Ｈｅａｒｔ Ｊ．２７：２１６５〜２１６９（２００６）。この研究者たちは、血小板特異的血栓症マーカーとして、患者血中の血小板表面上のＧＰＶＩ量を測定することが、心筋虚血が起こる前にリスクを有する患者を特定する助けになり得ることを提案した。

ＧＰＶＩを欠損する患者は、軽い出血素因を有し、その血小板はコラーゲンに対する反応性が弱い。Ｓｕｇｉｙａｍａら、Ｂｌｏｏｄ ６９：１７１２〜１７２０（１９８７）；Ｍｏｒｏｉら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８４：１１４０〜１４４５（１９８９）；Ａｒａｉら、Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍｔｏｌ．８９：１２４〜１３０（１９９５）。ＧＰＶＩ欠損ヒト血小板又は抗ＧＰＶＩ Ｆａｂフラグメントで阻止された血小板（患者の血清から得た）を用いた試験は、高及び低せん断速度での固定化コラーゲンとの血小板の相互作用の欠如及び高せん断での固定化ｖＷｆへの堅い粘着の減少を明確に示した。Ｇｏｔｏら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０６：２６６〜２７２（２００２）。

ＧＰＶＩ欠損表現型をももたらすＦｃＲγ鎖を欠損するノックアウトマウスを用いた試験、又はＧＰＶＩを枯渇させたマウスを用いた試験は、これらの知見を確かめたが、これらの動物の尾部出血時間は、少し長くなっていた。Ｎｉｅｓｗａｎｄｔら、Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ２０：２１２０〜２１３０（２００１）。ＧＰＶＩ欠損でＦｃＲγ陽性マウスは、野生型及びＧＰＶＩ−ヘテロ接合性マウスのものと類似の出血時間を示した。ＧＰＶＩ欠損マウスからの血小板は、コラーゲン及びコンバルキシンに応答して凝集せず、流動条件下で固定化コラーゲンへの粘着が劇的に低減されており、ＧＰＶＩが血小板のコラーゲン誘発機能及び血栓症において主要な役割を演じることが確かめられた。Ｋａｔｏら、Ｂｌｏｏｄ １０２：１７０１〜１７０７（２００３）。

ＧＰＶＩがコラーゲン誘発血小板活性化の主要な受容体であり、シグナル伝達のための重要な経路であることが現在では受け入れられている。Ｉｃｈｉｎｏｈｅら、Ｊ．ＢｉｏｌＣｈｅｍ．２７０（４７）：２８０２９〜２８０３６（１９９５）；Ｔｓｕｊｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（２８）：２３５２８〜３１（１９９７）。これに対して、血小板の他の主要なコラーゲン受容体であるＧＰＩａ−ＩＩａは、血栓成長に導く安定な粘着及び伸展をもたらすカチオン依存性過程に主に関与する。Ｎｉｅｓｗａｎｄｔ及びＷａｔｓｏｎ，Ｂｌｏｏｄ １０２：４４９〜４６１（２００３）で総説されている。

ＧＰＶＩに対する抗体のような当分野におけるＧＰＶＩアンタゴニストの必要性が、不適切な血小板凝集及び血塊形成が広い範囲のヒト疾患、最も一般的には血管性疾患における主要な原因学的因子であるという遺憾な事実により、注目されている。動脈及び静脈の内壁への血小板の過剰な沈着は、感受性の高い組織への血流を減少させる動脈硬化症及び動脈硬化プラークに寄与する。最終的には、この血小板依存性の増強は、急性心筋梗塞、慢性不安定狭心症、一過性虚血、脳卒中、末梢血管疾患、動脈血栓、肺塞栓症、再狭窄及び種々のその他の症状を発現し得る。

これらの症状は、血管内で発生する、血栓と呼ばれる異常な血塊により典型的に開始する。血塊が一旦発生すると、血塊を通過する連続した血流が、血塊を付着から自由にして破壊しやすい。このような自由に流れる血塊は、塞栓として知られる。塞栓は、通常、循環系の狭い点で捕捉されるまで血流中を移動する。この閉塞が脳、肺又は冠状動脈で発生し、疼痛、身体障害又は死をもたらし得る。

血管内の血塊は、自然発生の硬化症、敗血症ショック又は血管への物理的損傷を原因とし得る。実際に、血管性疾患を診断及び治療するために用いられる観血性の高い方法（例えば血管移植片、診査及び留置カテーテル、ステント、シャント及びその他のデバイス）自体が血管壁を損傷する。このことは血小板を活性化し、凝集を刺激し、最終的には血栓及び塞栓の形成を導き、患者の生命及び健康をさらに危険にさらす。

したがって、血小板凝集及び血塊形成を制御又は減少させるための方法は、これらの疾患の管理において久しく求められてきた目標である。

コラーゲン誘発による血小板活性化は、シェディングを通して可溶性ＧＰＶＩの血漿量の上昇ももたらし得る。したがって、患者由来血漿中の可溶性ＧＰＶＩの測定値は、存在する任意の血管損傷又は血栓症の重症度に直接関係し得る。したがって、血漿中の可溶性ＧＰＶＩを検出及び定量する改良法を開発する必要性がある。かかる方法は、不適当な血小板凝集及び凝塊形成の高感度の指標を提供し、このような病状の早期の診断、監視及び予防を実現し得る。

本発明は、当分野で以前に報告されたものよりも、コラーゲン誘発血小板機能に対する強力な阻害剤であるＧＰＶＩ特異的抗体を提供する。したがって、本発明のＧＰＶＩ特異的抗体は有用な抗血栓剤となり得るものであり、他の抗血栓剤の投与にしばしば付随する副作用を減少させた可能性がある。

本発明の１つの態様は、約７、４、３、２、１、０．６μｇ／ｍｌ未満又はこの範囲内に含まれる任意の値のＩＣ５０でコラーゲン誘発血小板凝集を阻害する、ＧＰＶＩポリペプチド、ペプチド又はその天然変異体に特異的なモノクローナル抗体を提供する。ＧＰＶＩポリペプチド、ペプチド又はその天然変異体に特異的なモノクローナル抗体は、コラーゲン誘発血小板粘着を、１、０．５、０．２、０．１μｇ／ｍｌ未満又はこの範囲内に含まれる任意の値のＩＣ５０で阻害もしてよい。

本発明の別の態様は、１０^−８Ｍ以下のＫｄでＧＰＶＩポリペプチド、ペプチド又はその天然変異体に特異的に結合する、ＧＰＶＩポリペプチド、ペプチド又はその天然変異体に特異的なモノクローナル抗体を提供する。別の実施形態において、本発明の抗ＧＰＶＩ抗体は、１０^−９Ｍ以下のＫｄでＧＰＶＩポリペプチド、ペプチド又はその天然変異体に特異的に結合する。本発明のモノクローナル抗体は、コラーゲン誘発ＡＴＰ分泌及び／又はコラーゲン誘発トロンボキサンＡ_２形成をも阻害する。

モノクローナル抗体は、活性抗体フラグメントを含む。活性抗体フラグメントは、化学的、酵素的又は組換え的に産生される、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ）_２フラグメント、又はＧＰＶＩポリペプチド、ペプチド若しくはその天然変異体に特異的な少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むペプチドを含んでよい。本発明のある実施形態において、ＣＤＲは、配列番号１〜２４の配列のいずれか１つ又はそれらの変異体を含み、ここで、ＣＤＲ変異体は、ＧＰＶＩポリペプチド、ペプチド又はその天然変異体に特異的に結合する。抗体の例はＯＭ１、ＯＭ２、ＯＭ３及びＯＭ４を含む。

本発明は、血小板を、ＧＰＶＩポリペプチド、ペプチド又はその天然変異体に特異的なモノクローナル抗体と接触させることによる、血小板凝集、コラーゲン誘発ＡＴＰ分泌、コラーゲン誘発トロンボキサンＡ_２形成及び／又は血小板粘着を阻害する方法をも提供する。

本発明は、さらに、ＧＰＶＩポリペプチド、ペプチド又はその天然変異体に特異的なモノクローナル抗体を産生する方法を提供する。上記の方法は、ＧＰＶＩ欠損宿主をＧＰＶＩ抗原で免疫して抗体を得ることを含む。ＧＰＶＩ欠損宿主は、例えば、ＧＰＶＩヘテロ接合性宿主及びホモ接合性ＧＰＶＩノックアウト宿主を含む。本発明の別の態様は、上記の方法により産生される、ＧＰＶＩポリペプチド、ペプチド又はその天然変異体に特異的なモノクローナル抗体を提供する。

本発明は、本発明のＧＰＶＩ特異的モノクローナル抗体の薬学的有効量を含む抗血栓組成物をも提供する。上記の抗血栓剤は、患者を治療するために用いてよい。つまり、本発明の１つの態様は、例えば、血管性疾患の治療を必要とする患者を治療する方法を提供する。

本発明は、さらに可溶性ＧＰＶＩを検出及び定量するための高感度アッセイを提供する。このアッセイには、第１のＧＰＶＩ特異抗体及び第２のＧＰＶＩ特異抗体が含まれる。本発明の第１のＧＰＶＩ特異抗体は可溶性ＧＰＶＩを捕捉することができ、本発明の第２のＧＰＶＩ特異抗体は捕捉された可溶性ＧＰＶＩを検出することができる。第１の抗体は固相支持体に固定化することができ、第２の抗体には標識を付けることができる。２つの抗体は可溶性ＧＰＶＩに非競合的に結合することができる。このアッセイは生体試料中、例えば血清又は血漿中の可溶性ＧＰＶＩの量を測定するのに有用である。

本発明はまた、血管疾患又は血栓症を発症する危険性があるか、又は有している個体から得られた試料中の可溶性ＧＰＶＩを定量する方法及びキットを提供する。可溶性ＧＰＶＩの量は存在する血管疾患又は血栓症の重症度に関係し得るので、該方法及びキットは、かかる疾患の予防、診断及び治療に有用である。血管疾患は、例えば血小板異常、血小板減少症、脳血管疾患、末梢血管疾患及び心血管疾患を含む。

本発明は、さらに、ＧＰＶＩ抗原を本発明のＧＰＶＩ特異的モノクローナル抗体及び試験化合物と接触させ、モノクローナル抗体のＧＰＶＩ抗原への結合の阻害を測定することによる抗血栓剤を同定する方法を提供する。ＧＰＶＩ抗原、ＧＰＶＩ特異的モノクローナル抗体及び試験化合物は、いずれの順序で加えてもよい。例えば、ＧＰＶＩ抗原を試験化合物と接触させた後に、ＧＰＶＩ特異的モノクローナル抗体と接触させてよい。別の例では、ＧＰＶＩ抗原を、ＧＰＶＩ特異的モノクローナル抗体及び試験化合物と同時に接触させてもよい。

上記の一般的な記載と以下の詳細な説明の両方は、例示及び説明のためのみであり、請求される本発明を限定しないと理解すべきである。

本明細書に組み込まれ、その一部分をなす添付の図面は、本発明のいくつかの実施形態を説明し、明細書本文と共に本発明の原理を説明する役目をなす。

本発明は、限定されないが血小板凝集、粘着、コラーゲン誘発ＡＴＰ放出及びトロンボキサンＡ_２（ＴＸＡ_２）形成を含むコラーゲン誘発血小板応答の強力な阻害剤である新規なＧＰＶＩ特異的抗体を表す。本発明は、抗ＧＰＶＩ抗体を産生する方法をも表す。本発明の抗ＧＰＶＩ抗体は、血栓形成を阻害するため及び抗血栓治療を必要とする患者を治療するために有用となり得る。

用語「抗体」は、モノクローナル抗体を含む。本発明のモノクローナル抗体は、活性抗体フラグメント、例えばＦ（ａｂ’）_２及びＦａｂフラグメント、並びに組換えで産生された任意の結合パートナーを含む。抗体は、それらがＧＰＶＩポリペプチド、ペプチド又はその天然変異体に、１０^−７Ｍ以下の解離定数（Ｋｄ）で結合するならば、「特異的に結合する」と定義される。本発明の実施形態において、抗ＧＰＶＩ抗体は、ＧＰＶＩポリペプチド、ペプチド又はその天然変異体に、１０^−８Ｍ以下のＫｄで特異的に結合する。別の実施形態において、本発明の抗ＧＰＶＩ抗体は、ＧＰＶＩポリペプチド、ペプチド又はその天然変異体に、１０^−９Ｍ以下のＫｄで特異的に結合する。結合パートナー又は抗体の親和性は、従来の技術を用いて、例えば^１２５Ｉ標識ＩｇＧ又はそのフラグメントの飽和結合等温線を測定することによるか、又はＡｎａｌｙｚｉｎｇ Ｄａｔａ ｗｉｔｈ ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（１９９９），ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡのＭｏｔｕｌｓｋｙにより記載されるようにして非線形回帰分析を用いる非標識ＩｇＧによる^１２５ＩｇＧの相同置換により、容易に測定できる。その他の方法は当分野で知られており、例えばＳｃａｔｃｈａｒｄら、Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，５１：６６０（１９４９）により記載されるものがある。ＧＰＶＩポリペプチド、ペプチド又はその天然変異体は、米国公開第２００３／０１８６８８５号に記載されており、その全体を本明細書に参照として組み込む。

抗体は、種々の起源、例えばウマ、雌ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ニワトリ、ウサギ、マウス、ハムスター又はラットから、当分野で公知の手順を用いて容易に産生してよい。本発明のある実施形態において、宿主動物はアルメニアハムスターである。別の実施形態において、宿主動物はＧＰＶＩ欠損動物である。本明細書で用いる場合、「ＧＰＶＩ欠損」とは、野生型動物に比べて、ある動物中での内因性ＧＰＶＩ産生量の約５０％以上の減少を指す。内因性ＧＰＶＩ産生量の減少は、ＧＰＶＩ産生が完全に阻害されるようなものであってもよい。ＧＰＶＩ欠損動物は、当分野で知られるいくつかの方法により産生してよい。これらは、動物における核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）レベルでのＧＰＶＩ産生の操作を含んでよい。ＧＰＶＩ欠損動物は、限定されないが、ノックアウト（例えばＧａｌｌｉ−Ｔａｌｉａｄｏｒｏｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ１８１：１〜１５，１９９５；Ｒｏｂｂｉｎｓ，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７３：３〜９，１９９３；Ｈｅｒｇｕｅｕｘら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃ．２５：３０〜３２，１９９３を参照されたい）、ノックイン（Ｃｏｌｕｃｃｉ−Ｇｕｙｏｎら、Ｃｅｌｌ ７９：６７９〜６９４，１９９４；Ｌｅ Ｍｏｕｅｌｌｉｃら、ＰＮＡＳ８７：４７１２〜４７１６，１９９０；Ｈａｎｋｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：６７９〜６８２，１９９５；Ｗａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ ３７９：８２３〜８２５，１９９６）、変異（Ａｓｋｅｗら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３：４１１５〜４１２４，１９９３；Ｓｔａｃｅｙら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：１００９〜１０１６，１９９５；Ｈａｓｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ ３５０：２４３〜２４６，１９９１；Ｖａｌａｎｃｉｕｓら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１：１４０２〜１４０８，１９９１；Ｗｕら、ＰＮＡＳ ９１：２８１９〜２８２３，１９９４；Ｈｏｒｉｅら、Ｇｅｎｅ１６６：１９７〜２０４，１９９５；Ｔｏｔｈら、Ｇｅｎｅ １７８：１６１〜１６８，１９９６）、欠失（Ｙｏｕら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．，１５：２８５〜２８８，１９９７；Ｈｏｌｄｅｎｅｒ−Ｋｅｎｎｙら、Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ １４：８３１〜８３９，１９９２）、アンチセンスオリゴヌクレオチド技術（Ｗａｇｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８４０〜８４４，１９９６；Ｋｉｔａｊｉｍａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５８：１７９２〜１７９５，１９９２；Ｕｒｂａｎら、Ｆａｒｍａｃｏ．５８：２４３〜５８，２００３；Ｏｒｕｍら、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．３：２３９〜４３，２００１；Ｓｏｈａｉｌら、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２：２６４〜７１，２０００；Ｓｍｉｔｈら、Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．１１：１９１〜８，２０００）、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）技術（Ｓｃｈｅｒｒら、Ｃｕｒｒ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．１０：２４５〜５６，２００３；Ｎｉｓｈｉｋｕｒａ，Ｃｅｌｌ １０７：４１５〜４１８，２００１；Ｈａｎｎｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ ４４１８：２４４〜２５１，２００２；米国特許第５５０６５５９号）を含む方法によるか、又は任意のその他の化学品、自然発生、組換え又は合成のペプチド、ポリペプチド、タンパク質、多糖類、小分子及び宿主におけるＧＰＶＩ産生を減少させるか又は阻害するように設計されたその他の化合物を用いることにより産生してよい。

理論に拘わる訳ではないが、内因性ＧＰＶＩを産生しないか又は通常量よりも少量産生する宿主は、通常レベルのＧＰＶＩを産生するものより強いＧＰＶＩに対する免疫反応を開始し得る。つまり、低用量でコラーゲン誘発血小板応答、例えば血小板凝集、血栓形成及び／又は血小板活性化を阻害するのにより効果的であるＧＰＶＩに対する抗体が、ＧＰＶＩを産生する通常の宿主から得られるものに比べて産生されてよい。ノックアウト動物において抗体を産生する方法は、Ｐａｓｓら、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５８：２９８〜３０５（２００３）；Ｚｌｏｔら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．４０：７６〜８４（１９９９）；Ｄｅｃｌｅｒｃｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：８３９７〜８４００（１９９５）；及びＣａｓｔｒｏｐら、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ １９３：２８１〜２８７（１９９５）に記載されている。

宿主は、その全体を本明細書に参照として組み込む米国特許公開第２００３／０１８６８８５Ａ１に記載されるようにして免疫してよい。簡単に説明すると、宿主は、限定されないが、血小板又はその他のＧＰＶＩ発現細胞から単離された未変性のＧＰＶＩポリペプチド、ペプチド又はその天然変異体；原核又は真核細胞から発現された組換えのＧＰＶＩポリペプチド、ペプチド又はその天然変異体の組み換え形；ヒトを含む種々の種から得られる血小板；ＧＰＶＩポリペプチド、ペプチド又はその天然変異体を発現する細胞；ＧＰＶＩポリペプチド、ペプチド又はその天然変異体をコードする核酸；或いはそれらのいずれかの組み合わせを含む「ＧＰＶＩ抗原」を用いて免疫してよい。

精製ＧＰＶＩポリペプチド、又はアジュバント若しくは担体に複合化したＧＰＶＩポリペプチドのアミノ酸配列に基づくペプチドは、典型的には、宿主動物に腹腔内投与される。ＧＰＶＩポリペプチドの免疫原性は、アジュバント、例えばフロイントの完全又は不完全アジュバントの使用を通して増強してよい。ブースター免疫化の後に、少量の血清試料を採取して、ＧＰＶＩポリペプチドに対する反応性を試験する。このような測定に有用な種々のアッセイの例は、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（編），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８８に記載されるもの；及び向流免疫電気泳動（ＣＩＥＰ）、放射性免疫測定法、放射性免疫沈降法（ＲＩＰ）、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ドットブロットアッセイ及びサンドイッチアッセイ並びにＦＡＣＳのような方法を含む。米国特許第４３７６１１０号及び第４４８６５３０号を参照されたい。

モノクローナル抗体は、公知の方法を用いて容易に産生でき、例えば米国特許第ＲＥ３２０１１号、第４９０２６１４号、第４５４３４３９号及び第４４１１９９３号；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｋｅｎｎｅｔｔ，ＭｃＫｅａｒｎ及びＢｅｃｈｔｏｌ（編），１９８０に記載される方法を参照されたい。簡単に説明すると、宿主動物は、約１週間の間隔で、任意にアジュバントの存在下にＧＰＶＩ抗原を腹腔内注射される。免疫化は、抗体の所望の力価が達成されるまで行われる。

マウス血清は、次いで、ＧＰＶＩ−ＦｃＲγ鎖をトランスフェクションしたＣＨＯ細胞を用いるＦＡＣＳ分析によるか、又は当分野で知られる任意のその他の方法により分析する。選択されたマウスに、ＧＰＶＩ抗原のブースター用量を与える。３日後に、マウスを屠殺し、その脾臓細胞を、確立されたプロトコルに従って、市販の骨髄腫細胞であるＰ３Ｕ１（ＡＴＣＣ）と融合させる。骨髄腫細胞を血清フリー培地で数回洗浄し、マウス脾臓細胞と融合させる。融合剤は、５０％ＰＥＧ（Ｒｏｃｈｅ）である。融合物を、ＨＡＴ添加ＤＭＥＭ培地を含む８枚の９６ウェル平底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種し、１〜２週間増殖させる。得られたハイブリドーマからの上清を回収し、ＧＰＶＩ及びＦｃＲγ鎖を発現するＣＨＯ細胞を用いるＦＡＣＳ分析を行うことにより、抗ＧＰＶＩ抗体の存在を分析する。ＦＡＣＳ分析は、ＣＨＯ細胞抗原に対する抗体を産生するクローンを排除するために、野生型ＣＨＯ細胞を用いても行われる。陽性のクローンは、大量培養で増殖させることができ、続いて、上清をプロテインＡ又はＧ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で精製する。ＧＰＶＩポリペプチド及びペプチドに対する抗体を産生するのに多くの方法を用いることができ、この実施形態は、本発明の範囲を限定するものではないことが理解される。

本発明のモノクローナル抗体は、別の技術、例えば、参照として本明細書に組み込まれるＡｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓら、「モノクローナル抗体発現ライブラリ：ハイブリドーマの迅速な代替法（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ：Ａ Ｒａｐｉｄ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｔｏ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ）」，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３：１〜９（１９９０）に記載されるものを用いて産生してよい。同様に、例えば特異的結合抗体をコードする遺伝子の可変領域を組み込む組換えＤＮＡ技術を用いて構築された結合パートナーは、本発明のモノクローナル抗体に含まれる。このような技術は、Ｌａｒｒｉｃｋら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，７：３９４（１９８９）に記載される。

その他のタイプの抗体を、当分野常識と連係して産生してもよい。例えば、抗イディオタイプ抗体を、Ｋｎｉｇｈｔら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ３２：１２７１〜８１（１９９５）に記載されるように、宿主を精製モノクローナル抗ＧＰＶＩ抗体の抗原結合部位を含む抗原で免疫にし、得られた血清又はモノクローナル上清の活性を試験することにより得てよい。本発明のある実施形態において、抗イディオタイプ抗体は、宿主を本発明の抗ＧＰＶＩ抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むペプチドで免疫にすることにより得てよい。本発明の抗イディオタイプ抗体は、活性抗イディオタイプ抗体フラグメントを含み、これは、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）_２又は抗ＧＰＶＩ抗体に特異的に結合する少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むペプチドを含む化学的、酵素的又は組換え的に産生された抗イディオタイプ抗体フラグメントのことをいう。さらに、本発明は、Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９（１９８８）に記載される生合成ＧＰＶＩ抗体結合部位；Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４（１９８９）に記載される単離された重鎖可変ドメインを含む単一ドメイン抗体；及びＧＰＶＩポリペプチドに特異的に結合可能であるヒト抗体の要素を含むように加工された抗体を含む。抗ＧＰＶＩ抗体は、全てが参照として本明細書に組み込まれるＶｅｎｔｏｒら、Ａｎｎ Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３５５（１９９４）及び本明細書中に引用される参考文献に記載されるファージディスプレイ技術を用いて産生してもよい。

本発明の抗体は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）_２、又はＧＰＶＩポリペプチド、ペプチド若しくはその天然変異体に特異的に結合する少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むペプチドを含む、化学的、酵素的又は組換え的に産生された抗体フラグメントのことをいう活性抗体フラグメントも含む。ペプシン又はパパインを用いる通常の酵素学的方法は、Ｆｃ抗体ドメインを除去して二価のＦ（ａｂ）_２及び一価のＦａｂフラグメントを産生する。これらの方法は、基本的にはＧｏｒｉｎｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０３：１１３２（１９６９）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ１：ＤＭ Ｗｉｅｒ（編），Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ａｌｄｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ，１９９７；及びＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（編），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８８；並びに米国特許第４４７０９２５号（Ａｕｄｉｔｏｒｅ−Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ）に記載され、これらの全ては参照として本明細書に組み込まれる。

無傷のＧＰＶＩ特異的抗体、及び抗体フラグメント、例えばＦａｂ及びＦ（ａｂ）_２フラグメントは、薬剤又は担体分子に共有結合させてよい。さらに、本発明のＧＰＶＩ特異的抗体は、直接又は適切な担体分子を介して架橋して、多価複合体を形成してよい。ある実施形態において、Ｆ（ａｂ）_２フラグメントは、Ｒｅｎｏら（米国特許第５５０６３４２号）（参照として本明細書に組み込まれる）に記載されるようにして、共有架橋結合により代謝的に安定化させる。

ＧＰＶＩポリペプチド、ペプチド又はその天然変異体に特異的なモノクローナル抗体は、リガンド（コラーゲン）依存性結合による血小板活性化を阻止する能力について試験してよい。血小板の機能を阻止するモノクローナル抗体は、有用な抗血栓剤となり得る。

本発明の抗体は、ヒト化してもよい。ヒト抗体及びヒト化抗体は、したがって、臨床上の使用が好ましい。例えばＬｏＢｕｇｌｉｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：４２２０〜２４（１９８９）；Ｍｅｒｅｄｉｔｈら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３３，２３〜２９（１９９２）；Ｓａｌａｈら、Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ３：１９〜２４（１９９２）；Ｋｎｉｇｈｔら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ３２：１２７１〜８１（１９９５）；及びＬｏｃｋｗｏｏｄら、Ｑ．Ｊ．Ｍｅｄ．８９：９０３〜１２，（１９９６）を参照されたい。

完全ヒト抗体の開発は、通常、ヒト免疫Ｂリンパ球の適切な起源を必要とする。ヒト抗体を産生するある方法は、免疫されていない個体から得られ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養に付されていた未処理のＢ細胞のプールからの、適切な特異性を有するＢリンパ球の免疫化及び増殖を伴う。Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ，第ＩＩ巻，Ｍａｓｓｅｙｅｆｆら（編），ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｂＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，第２９８〜３２５頁（１９９２）のＯｈｌｉｎ及びＢｏｒｒｅｂａｅｃｋ；Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｄｏｙｌｅら（編），Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ Ｌｔｄ．，Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ ２５Ｅ：１．１〜７（１９９３）のＯｈｌｉｎ及びＢｏｒｒｅｂａｅｃｋ。ＨＩＶ−１糖タンパク質に対するヒト抗体は、この方法により開発された。Ｏｈｌｉｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６８：３２５〜３３１（１９８９）；Ｏｈｌｉｎら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８９：２９０〜２９５（１９９２）；Ｄｕｅｎａｓら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８９：１〜７（１９９６）。より最近では、ヒト免疫細胞を移植された動物又はヒト免疫グロブリン遺伝子座全体を導入された動物を用いるｉｎ ｖｉｖｏ技術が開発された。Ｉｌａｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．４：１０２〜１０９（２００２）；Ｉｓｈｉｄａら、Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ４：９１〜１０２（２００２）。完全ヒト抗体は、これらの動物を種々のヒト抗原で免疫することにより産生された。

ヒト化抗体は、モノクローナル抗体のほとんど又は全ての構造部分を、対応するヒト抗体配列で置換することにより産生してよい。結果として、抗原特異的な可変領域又は相補性決定領域（ＣＤＲ）が非ヒト配列で構成されたハイブリッド分子が産生される。ヒト化抗体を設計するための種々のストラテジが、Ｗｉｎｔｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３〜９９（１９９１）；Ｈａｒｒｉｓ，ＢＣＳＴＢＳ５ ２３（４）：１０３５〜３８（１９９５）；Ｉｍｐｏｒｔａｎｔ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ．（１９９０）のＭｏｒｒｉｓｏｎ及びＳｃｈｌｏｍ；Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９４），Ａｎｎｕａｌ ＲｅｐｏｒｔｓのＬ．Ｐｒｅｓｔａ「ヒト化モノクローナル抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ）」；並びにＧｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｙｅａｒ ｌｍｍｕｎｏｌ．１９９３，第７号，第１１０〜１１８頁，（Ｃ．Ｔｅｒｈｏｒｓｔ，Ｆ．Ｍａｌｖａｓｉ及びＡ．Ａｌｂｅｒｔｉｎｉ（編）Ｂａｓｅｌ，ＫａｒｇｅｒのＡ．Ｌｅｗｉｓ及びＪ．Ｃｒｏｗｅ「「最適」フレームワーク選択及び組換えポリメラーゼ連鎖反応によるヒト化モノクローナル抗体の産生（Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｙ‘Ｂｅｓｔ Ｆｉｔ’Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）」で総説され、これらのそれぞれが参照として本明細書に組み込まれる。

ＧＰＶＩポリペプチド、ペプチド又はその天然変異体に特異的な抗体は、Ｉｇ特異的吸着、例えばプロテインＡクロマトグラフィー又は固定化ＧＰＶＩペプチドを用いるアフィニティクロマトグラフィーによる抗ＧＰＶＩ抗体の選択及び精製によりヒト化してもよい。重鎖及び軽鎖を標準的な手段により分離し、それぞれの鎖を精製してよい。それぞれの鎖のアミノ酸部分配列を決定してよく、縮重オリゴヌクレオチドを各鎖について、Ｌａｔｈｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８３：１〜１２（１９８５）の方法に従って産生してよい。これらの抗体鎖をコードするＤＮＡを、次いで、クローニングし、ＰＣＲ又はその他の標準的な方法により抗ＧＰＶＩ抗体産生細胞から配列決定してよい。

抗体のＤＮＡ及びアミノ酸配列は、分析して、ヒト重鎖及び軽鎖の既知の配列と比較してよい。配列比較に基づいて、ＧＰＶＩ特異的抗体鎖は、非ヒトＤＮＡの部分をヒト配列で置換してヒト化し、ＧＰＶＩに対する特異性を有するキメラ抗体を形成してよい。ある実施形態において、ＧＰＶＩ特異的抗体は、Ｓｕｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：２１４〜２１８（１９８７）により記載される発現ベクターを用いて、ヒトＪ１及びＫ定常領域を用いてヒト化される。非ヒト−ヒトハイブリッドの産生のための方法は当分野で公知であり、例えばＫｎｉｇｈｔら、Ｍｏｌ．ｌｍｍｕｎｏｌ ３２：１２７１〜８１（１９９５）；米国特許第５７０５１５４号（Ｄａｌｉｅら）；第５６９３３２２号（Ｃｒｅｅｋｍｏｒｅら）；第５６７７１８０号（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら）；第５６４６２５３号（Ｗａｌｌａｃｅら）；第５５８５０９７号（Ｂｏｌｔら）；第５６３１３４９号（Ｄｉａｍａｎｔｓｔｅｉｎら）；及び第５５８０７７４号（Ｂｅａｖｅｒｓら）（それぞれが参照として本明細書に組み込まれる）に詳細に記載される。高親和性キメラ抗体産生を最大限にするために、Ｑｕｅｅｎら（米国特許第５５８５０８９号）及びＱｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：１００２９〜３３（１９８９）の方法を用いてよい。

ヒト化抗体は、Ｒａｄｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：８９１０〜８９１５（１９９８）及びＳｔｅｉｎｂｅｒｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３６０７３〜３６０７８（２０００）で教示され、Ｓｏｎら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２８６：１８７〜２０１（２００４），Ｌｅｅら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２７：２０１〜２１０（２００４），及び当業者により例証されているように、ファージディスプレイのアプローチを用いて産生してもよい。

抗原に結合する抗体分子の部分は、重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変（Ｖ）領域の少数のアミノ酸で構成される。これらのアミノ酸は、Ｖ領域の折り畳みにより近接にされる。ＩｇＧの可変領域のアミノ酸配列の比較は、ほとんどの可変性は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる３つの領域にあることを示す。各鎖（Ｈ及びＬ）は、３つのＣＤＲを含む。異なる特異性の抗体は異なるＣＤＲを有するが、全く同じ特異性の抗体は、通常、同一又は高度に保存されたＣＤＲを有する。本発明は、本発明のＧＰＶＩ抗体の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）又はその変異体を含むモノクローナル抗体又はペプチドを包含する。本発明は、配列番号１〜２４のアミノ酸配列の少なくとも１つ又はその変異体を含むモノクローナル抗体又はペプチドを包含する。

本明細書においてＣＤＲを含む抗体又はペプチドの「変異体」は、配列番号１〜２４に実質的に同一のアミノ酸配列を含むが、１又は複数の欠失、挿入又は置換により配列番号１〜２４のものとは異なるアミノ酸配列を有する抗体又はペプチドのことをいう。変異体は、対応するＣＤＲを含む抗体又はペプチドに比べて、ＧＰＶＩポリペプチド、ペプチド又はその天然変異体に対する結合親和性の少なくとも７０、８０、９０又は１００％を維持する。結合親和性は、例えばＦｕｊｉｍｕｒａら、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．８７：７２８〜７３４（２００２）により教示され、以下の実施例４に例証されるような当分野で知られる任意の方法により測定してよい。変異体は、配列番号１〜２４に好ましくは少なくとも６０％、６５％、７０％、８０％、８５％又は９０％同一のＣＤＲを含む。パーセントでの同一性は、例えば、Ｄｅｖｅｒｅｕｘら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：３８７，１９８４）により記載され、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＵＷＧＣＧ）から入手可能なＧＡＰコンピュータプログラム、バージョン６．０を用いて配列情報を比較することにより決定できる。ＧＡＰプログラムは、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ ２：４８２，１９８１）により改訂されたＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０）のアラインメント法を用いる。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメータは：（１）ヌクレオチドについて単項比較マトリックス（同一には１の値及び非同一には０の値を含む）、及びＳｃｈｗａｒｔｚ及びＤａｙｈｏｆｆ編，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，第３５３〜３５８頁，１９７９に記載されるようなＧｒｉｂｓｋｏｖ及びＢｕｒｇｅｓｓ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：６７４５，１９８６）の加重比較マトリックス；（２）各ギャップについて３．０のペナルティ値及び各ギャップでの各記号についてさらなる０．１０のペナルティ値；並びに（３）末端ギャップについてペナルティなしを含む。

変異体は、保存的に置換された配列を含んでよい。保存的置換とは、所定のアミノ酸残基を同様の生理化学的特徴を有する残基で置換することをいう。保存的置換の例は、１つの脂肪族残基の別のものへの置換、例えばＩｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ若しくはＡｌａを互いに、又は極性残基の別のものへの置換、例えばＬｙｓとＡｒｇ；ＧｌｕとＡｓｐ；若しくはＧｌｎとＡｓｎの間の置換を含む。その他のこのような保存的置換、例えば同様の疎水性特徴を有する領域全体の置換が知られている。

候補の抗ＧＰＶＩ抗体は、当分野で知られる種々のアッセイを用いて血小板粘着及び活性化への影響をスクリーニングしてよい。これらは、例えば、米国特許第５６８６５７１に記載の血小板粘着阻害剤アッセイ；Ｂｒｏｗｎ及びＬａｒｓｏｎ（ＢＭＣ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２：９〜１５，２００１）に記載されるように、より低容量の血液及びより少ない抗体の使用を可能にするＤｉａｚ−Ｒｉｃａｒｔら（Ｂｌｏｏｄ ８２：４９１〜４９６，１９９３）の定常フローアッセイの変法；Ｍａｔｓｕｎｏら（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ ９２：９６０〜９６７，１９９６）及びＮａｋａｍｕｒａら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（８）：４３３８〜４４，１９９８）（Ｎａｋａｍｕｒａ法）（それぞれ参照として本明細書に組み込まれる）に記載されるプレートアッセイを含む。それぞれの場合において、候補ＧＰＶＩアゴニスト又はアンタゴニストは、Ｍｇ^２＋の存在下又は不在下に反応成分と、予め又は同時にインキュベートしてよい。Ｍｇ^２＋が存在しないときのインキュベーションは、残りのコラーゲン依存性活性が、ＧＰＶＩ受容体により主に媒介されるようにＧＰＩａ／ＩＩａの機能を阻止する。

Ｎａｋａｍｕｒａ法の変法を用いて、静的条件下での固定化酸不溶性原線維コラーゲンへの血小板粘着を測定してよい。Ｎａｋａｍｕｒａアッセイの変法を、簡単に以下に記載する。本来のアッセイへの主な変更は、^５１Ｃｒ標識血小板を未標識の血小板に変えることと、粘着の測定が市販のキットを用いる粘着性血小板により放出されるＬＤＨ活性の定量によることである。当業者は、試験される特定の抗ＧＰＶＩ抗体の観点でアッセイ条件にその他の変更を加える方法を認識している。

粘着アッセイ：マイクロタイタープレートのウェルを、Ｉ型酸不溶性ウマ腱原線維コラーゲンで被覆する。４×１０^８／ｍｌの濃度の血小板を、タイロード−ＨＥＰＥＳ緩衝液又はＭｇ^２＋（１ｍＭ）を補ったタイロード−ＨＥＰＥＳ緩衝液に懸濁し、粘着アッセイを以前に記載されたようにして（Ｔａｎｄｏｎら、Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．８９：１２４〜３０，１９９５）行う。簡単に説明すると、血小板を抗体溶液のような試料と室温で３０分間インキュベートした後に、それらをコラーゲンで被覆したウェルに加える。粘着を、Ｍｇ^２＋の存在下又は非存在下に室温で６０分間行う。粘着しなかった血小板を、ウェルを繰り返し洗浄することにより除去し、粘着した血小板をＴｒｉｔｏｎＸ−１００に溶解する。比色アッセイに基づく市販のＬＤＨ測定キット（ＣｙｔｏＴｏｘ９６，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を用いて、放出されるＬＤＨ活性を測定する。

ＡＴＰ放出及びトロンボキサンＡ_２（ＴＸＡ_２）発生のアッセイ：コラーゲン誘発ＡＴＰ放出を、デュアルチャンネル発光式凝集測定装置（モデル６５０ＣＡ−Ｃｈｒｏｎｏｌｏｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｈａｖｅｒｔｏｗｎ ＰＡ，ＵＳＡ）を用いて測定する。簡単に説明すると、多血小板血漿（血小板の計数を貧血小板血漿（ＰＰＰ）を用いて３×１０^８／ｍｌに調整）を、ルシフェラーゼ−ルシフェリン試薬（Ｃｈｒｏｎｏｌｏｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）と混合する。血小板を、試験抗体溶液、例えばＦａｂフラグメントの存在下又は非存在下に３７℃で５分間インキュベートした後に、コラーゲンで攻撃する。凝集とＡＴＰ放出とを同時に測定する。所望の時間に、ＴＸＡ_２の合成を阻害する阻害剤のカクテルの添加により反応を停止する。血小板懸濁物の上清を小さいチューブに移し、コラーゲン誘発ＴＸＡ_２形成を測定するまで−２０℃で凍結させる。ＴＸＡ_２は、ＴＸＡ_２の安定な代謝産物であるＴＸＢ_２と同様にして測定される。

血小板凝集アッセイ：抗血栓活性を検出又は測定するための単純な方法は、Ｓｕｎら、Ｊ Ｃａｒｄｉｖａｓｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍｃｏｌ．４０：５５７〜５８５（２００２）に記載される血小板凝集アッセイにより提供される。抗ＧＰＶＩ抗体、すなわち無傷のＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）_２若しくはＦａｂフラグメント、又は対照緩衝液（０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ．ＨＣＩ，ｐＨ７．４）を、多血小板血漿（２００μｌ）を含むキュベットに加える。混合物を、凝集測定装置の加熱モジュール中で、３７℃で３〜５分間インキュベートした後に、コラーゲンとの凝集を誘発する。キュベットを、レーザ散乱により粒子形成の動態を、及び光透過の変化により凝集を測定する４チャンネル凝集測定装置（ＡＧ１０ Ｋｏｗａ，Ｊａｐａｎ）に入れる。凝集を、０．５〜４μｇ／ｍｌのコラーゲンを用いて開始する。コラーゲンの最適濃度は、光透過で少なくとも７０％の変化を与えるものであり、各実験について測定される。凝集を、コラーゲンの添加後少なくとも８〜１０分間監視する。

ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ：ＧＰＶＩ特異的抗体又は抗体フラグメントは、Ｄｉａｚ−Ｒｉｃａｒｔら（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１６：８８３〜８８８，１９９６）により開発された系を用いてさらに分析してよい。このアッセイは、ＧＰＶＩ抗体の血小板に対する流動条件下での影響を、内皮除去したウサギ大動脈及びヒト内皮細胞マトリクスを用いて測定する。

ｉｎ ｖｉｖｏアッセイ：ＧＰＶＩ抗体又は抗体フラグメントのｉｎ ｖｉｖｏ活性を、Ｃｏｌｌｅｒ及びＳｃｕｄｄｅｒ，Ｂｌｏｏｄ ６６：１４５６〜５９（１９８５）；Ｃｏｌｌｅｒら、Ｂｌｏｏｄ ６８：７８３〜８６（１９８６）；Ｃｏｌｌｅｒら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ８０：１７６６〜７４（１９８９）；Ｃｏｌｌｅｒら、Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１０９：６３５〜３８（１９８８）；Ｇｏｌｄら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ７７，６７０〜７７（１９８８）；及びＭｉｃｋｅｌｓｏｎら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ．２１：３９３〜４０５（１９８９）に記載されるような血小板機能の標準モデルを用いて分析してよい。

上記の試験は、本発明のＧＰＶＩ特異的抗体が、他者により以前に報告されるものよりもより有効であることを明らかにする。具体的には、本発明のＧＰＶＩ特異的抗体は、当分野の抗体よりも低いＩＣ_５０でコラーゲン誘発血小板凝集を阻害する。用語「ＩＣ_５０」は、５０％阻害が観察される、ゼロより大きい任意の正の値の濃度として当分野で知られている。コラーゲン誘発血小板凝集の阻害を誘発するＩＣ_５０は、血小板との接触から５分以内に７０〜９０％の血小板凝集を誘導するコラーゲンの濃度を用いて決定した。用語「阻害」又は「阻害する」とは、任意の表現型特性の減少若しくは休止、又はその特性の発生、程度若しくは可能性の減少又は休止のことをいう。血小板凝集に関しては、「阻害」とは、血小板凝集の測定可能な減少又は休止のことをいう。このような阻害は、上記の試験、又は当分野で知られるその他の任意の方法により検出してよい。同様に、血小板粘着に関する「阻害」とは、表面への血小板粘着の測定可能な減少又は休止のことであり、このような阻害は、上記の試験、又は当分野で知られるその他の任意の方法により検出してよい。

本発明のＧＰＶＩ特異的抗体は、コラーゲン誘発血小板凝集を、約７、４、３、２、１、０．６ｇ／ｍｌ未満、又はこの範囲内に含まれる任意の値のＩＣ_５０で阻害する。本発明のＧＰＶＩ特異的抗体は、コラーゲン誘発血小板粘着も、約１、０．５、０．２、０．１μｇ／ｍｌ若しくはそれ未満又はこの範囲内に含まれる任意の値のＩＣ_５０で阻害する。本発明のＧＰＶＩ特異的抗体は、コラーゲン誘発ＡＴＰ分泌及び／又はコラーゲン誘発トロンボキサンＡ_２形成をも阻害する。本発明のＧＰＶＩ特異的抗体は、活性抗体フラグメントを含む。活性抗体フラグメントは、化学的、酵素的又は組換え的に産生されたＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ）_２フラグメント、及びＧＰＶＩポリペプチド、ペプチド又はその天然変異体に特異的な少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むペプチドを含む。

本発明のＧＰＶＩ特異的抗体は、既知の方法に従って医薬組成物中に処方してよい。本発明の医薬組成物は、少なくとも１つのＧＰＶＩ特異的抗体を含み、限定されないが、無傷のモノクローナル抗体；Ｆａｂフラグメント；Ｆ（ａｂ）_２フラグメント；及び少なくとも１つのＣＤＲ配列又はその変異体を含むペプチドを含む。ＧＰＶＩ特異的抗体は、その他の既知の活性物質と組み合わせてよい。

本発明の組成物は、限定されないが、希釈剤（例えばＴｒｉｓ−ＨＣＩ、酢酸塩、リン酸塩、水）、防腐剤（例えばチメロサール、ベンジルアルコール、パラベン）、乳化剤、塩、ポリマー、緩衝液、溶解剤、アジュバント及び／又は担体を含む薬学的に許容される賦形剤と混合した少なくとも１つのＧＰＶＩ特異的抗体を含む。適切な賦形剤及びそれらの処方は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，第２０版，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（２０００）に記載される。さらに、このような組成物は、ポリマー化合物、例えばポリ酢酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲルなどに組み込まれるか、又はリポソーム、マイクロエマルジョン、ミセル、単層、多層若しくは複合層の小胞、赤血球ゴースト又はスフェロブラストに組み込まれた、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、金属イオンと複合化したＧＰＶＩ特異的抗体を含んでよい。

本発明は、活性化又は休止血小板をＧＰＶＩに指向された抗体と接触させることを含む、例えば血小板凝集又は血小板粘着を阻害することにより血栓を阻害する方法も含む。「血栓を阻害する」とは、血栓性事象の減少若しくは休止、又は患者、患者集団若しくはｉｎ ｖｉｔｒｏ試験系における血栓性事象の発生、程度若しくは可能性における減少のことをいう。本発明は、本明細書において、血栓又は血小板凝集又は血小板活性化の発生、可能性又は程度を減少する抗血栓治療を必要とする任意のヒト又は非ヒト動物と定義される患者の治療、又はヒト及び非ヒト動物を含む、治療が血管性疾患の治療について有益である任意の対象に関する。このような治療される非ヒト動物は、限定されないが、マウス、ラット、ウサギ、魚類、鳥類、ハムスター、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ウシ（ｃａｔｔｌｅ）及びヒト以外の霊長類を含む、全ての家畜及び野生の脊椎動物を含む。

患者の治療は、本発明の抗ＧＰＶＩ抗体含有組成物の薬学的有効量を投与することを含む。当業者は、最適投与量及びこれらの組成物の投与のための投与スケジュールを経験的に決定してよい。にもかかわらず、薬学的有効量は、測定可能な抗血栓効果、例えばｉｎ ｖｉｖｏ若しくはｉｎ ｖｉｔｒｏで測定される血栓、血小板凝集又は血小板活性化の発生、程度又は可能性における減少を提供するか、或いは患者における血管性疾患、血塊若しくは塞栓形成又は虚血性事象の可能性、発生又は程度における測定可能な減少を提供する量である。

薬学的有効量は、治療の経過の間に単一用量又は複数用量として投与されてよい。本発明の範囲内のキットは、１回又は複数回用量の薬学的有効量の本発明の抗ＧＰＶＩ抗体含有組成物を含有する容器を含む。このようなキットは、単独か、適切な薬学的に許容される希釈剤及び／又はその他の賦形剤と混合又は懸濁されたか、或いは投与の前に、適切に許容される希釈剤及び／又はその他の賦形剤と混合又は懸濁されるように調剤された抗ＧＰＶＩ抗体を包含する。

本発明の組成物は、当業者が精通した任意の方法、例えばボーラス注射、連続的又は間欠的点滴による静脈内投与により投与してよい。別の実施形態において、組成物は、腹腔内、体腔内（ｉｎｔｒａｃｏｒｐｏｒｅａｌｌｙ）、関節内、心室内、くも膜下腔内、筋肉内、皮下、局所、扁桃腺、粘膜、鼻腔内、経皮、膣内、経口又は吸入により投与してよい。

本発明のＧＰＶＩ特異的抗体は、抗血栓剤として有用となり得る化合物をスクリーニングするのに用いてもよい。スクリーニング方法は、ＧＰＶＩ抗原を試験化合物及びＧＰＶＩ特異的抗体と接触させ、ＧＰＶＩ特異的抗体のＧＰＶＩポリペプチド、ペプチド又はその天然変異体への結合の阻害を測定することを含む。ＧＰＶＩ抗原、ＧＰＶＩ特異的抗体及び試験化合物は、いずれの順序で加えてもよい。例えば、ＧＰＶＩ抗原を試験化合物と接触させた後でＧＰＶＩ特異的モノクローナル抗体と接触させてよい。別の例において、ＧＰＶＩ抗原は、ＧＰＶＩ特異的モノクローナル抗体及び試験化合物と同時に接触させてよい。

結合の阻害は、試験化合物が、ＧＰＶＩ特異的抗体と同じＧＰＶＩ上の結合部位について競合するか、又は該結合部位を阻害することを示唆する。抗血栓剤のスクリーニングに関する「ＧＰＶＩ抗原」は、限定されないが、血小板又はその他のＧＰＶＩ発現細胞から単離された未変性のＧＰＶＩポリペプチド、ペプチド又はその天然変異体；原核若しくは真核細胞から発現された組換えＧＰＶＩポリペプチド、ペプチド又はその天然変異体；或いはＧＰＶＩポリペプチド、ペプチド又はその天然変異体を発現する細胞のことをいう。試験化合物は、任意の化学品、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド又は核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）であってよい。試験化合物は、自然発生であってよいか、又は当分野で知られた方法により合成されてもよい。本発明のスクリーニング方法は、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）法を用いてよい。ハイスループットスクリーニング法は、Ｋｈａｎｄｕｒｉｎａら、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．６：３５９〜６６（２００２）；Ｋｕｍｂｌｅ，Ａｎａｌ Ｂｉｏａｎａｌ Ｃｈｅｍ．３７７：８１２〜８１９（２００３）；及びＢｌｅｉｃｈｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ ２：３６９〜３７８（２００３）に総説されている。

ＧＰＶＩ特異的抗体又はその抗体フラグメントのＧＰＶＩ抗原への結合を阻害すると同定される化合物は、本明細書に開示される任意の方法又は当分野で知られたその他の方法により、血小板へのその効果についてさらに試験されてよい。これらの血小板の機能は、コラーゲン誘発血小板凝集、コラーゲン誘発血小板粘着、コラーゲン誘発ＡＴＰ分泌及びコラーゲン誘発トロンボキサンＡ_２形成を含む。

本発明はまた、宿主細胞内での組換え発現によるヒトＧＰＶＩ外部ドメイン（可溶性ＧＰＶＩ）を生成する方法を含む。可溶性ＧＰＶＩに対する好適な発現ベクターは、標準的な分子生物学的方法により作製することができる。組換え可溶性ＧＰＶＩはその分泌を促進するシグナルぺプチドを含有してもよい。シグナルぺプチドは当該技術分野において知られているいかなるシグナルぺプチドであってもよく、天然、人工又は異種シグナルぺプチド、例えばＩｇκ軽鎖のシグナルペプチドを含む。発現された可溶性ＧＰＶＩは修飾部、例えば、検出又は精製を促進するぺプチドタグを含有してもよい。かかるぺプチドタグは、特に、ヒスチジンタグ、Ｖ５タグ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、マルトース結合性タンパク質（ＭＢＰ）タグ、ビオチンアクセプターぺプチド（ＢＡＰ）タグ、ストレプトアビジン結合性ぺプチド（Ｓｔｒｅｐ−ＩＩ）タグ、カルモジュリン結合性ぺプチド（ＣＢＰ）タグ、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、ｍｙｃタグ、及びＦＬＡＧタグを含む。可溶性ＧＰＶＩの発現に使用される宿主細胞は原核性であっても真核性であってもよい。例えば、真核宿主細胞はＣＨＯ細胞であってもよい。

組換え可溶性ＧＰＶＩは複数の用途、例えばＧＰＶＩポリぺプチド、ぺプチド、又はそれらの天然変異体を検出又は定量するアッセイ用の標準タンパク質として、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｖｏにおけるＧＰＶＩ相互作用分子（コラーゲン、ＣＲＰ、コンバルキシン等）との血小板相互作用の競合阻害剤として、ＧＰＶＩの細胞外ドメインに対する新規な抗体を産生するための動物の免疫用の抗原として、及びＧＰＶＩの細胞外ドメインに対する抗体の親和性選択又は精製用の手段として、有用となり得る。

組換え可溶性ＧＰＶＩは、本発明のＥＬＩＳＡ用、例えばヒト個体中の可溶性ＧＰＶＩ量の予防的又は治療的監視のため、生体内試料中の可溶性ＧＰＶＩの検出に用いるＥＬＩＳＡ用の標準タンパク質として用いることができる。組換え可溶性ＧＰＶＩは、ＧＰＶＩ相互作用分子、例えばコラーゲンとの血小板相互作用の競合阻害剤として用いることもでき、それにより血小板凝集、血液凝塊又は損傷した血管との血小板相互作用の他の望ましくない結果を予防又は低減する。組換え可溶性ＧＰＶＩは、新規又は改良ＧＰＶＩ特異抗体を選択するため、或いは任意のＧＰＶＩ特異抗体を精製するため、例えばアフィニティクロマトグラフィーにより精製するために固相支持体へ共有結合又は非共有結合していてもよい。本発明の１つの実施態様において、ＧＰＶＩ特異抗体は多数の異なるエピトープに対する抗体を含有する試料から選択又は精製することができ、それにより、実質的に汚染性抗体のない又は他の汚染性タンパク質のない、ＧＰＶＩ特異抗体の製剤を生成する。

本発明は、さらに生体試料中の可溶性ＧＰＶＩの高感度な検出及び定量を可能にするアッセイを提供する。かかるアッセイの１つの実施態様は第１及び第２のＧＰＶＩ特異抗体を用いるサンドイッチＥＬＩＳＡである。好適なＧＰＶＩ特異抗体は、本発明のモノクローナル抗体、例えばＯＭ１、ＯＭ２、ＯＭ３及びＯＭ４抗体を含む。本発明の第１及び第２の抗体は、コラーゲン誘発血小板凝集を約７、４、３、２、１、０．６μｇ／ｍｌ未満又はこの範囲に包含されるいかなる値のＩＣ_５０においても阻害することができ、ＧＰＶＩポリぺプチド、ぺプチド、又はそれらの天然変異体に１０^−８Ｍ以下のＫｄにおいて特異的に結合する。第１及び第２の抗体は互いに異なってもよい。ＯＭ１及びＯＭ２抗体はＧＰＶＩの非重複性エピトープを認識し、したがって同じ可溶性ＧＰＶＩ分子に同時に及び非競合的に結合することができる。ＥＬＩＳＡは第１の抗体、例えば固相支持体に固定化されているＯＭ１、及び第２の抗体、例えば可溶性ＧＰＶＩの検出及び定量を促進するための標識に直接又は間接的に結合しているＯＭ２を含んでいてもよい。かかる標識の１つの例はビオチンであり、ビオチンはアビジンとの高度に特異的な相互作用を介して検出することができる。標識の他の例は、ジゴキシゲニン、蛍光プローブ、金属錯体及び酵素を含む。好適な蛍光プローブはＣｙ３、Ｃｙ５、フィコエリトリン、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、量子ドット、クマリン蛍光プローブ、オキサゾール蛍光プローブ、及びＡｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ緑色蛍光タンパク質等の蛍光タンパク質、及びそれらの変種を含有してもよい。好適な金属錯体はユーロピウムクリプテート、金属カルボニル錯体、及びポルフィンを含有してもよい。好適な酵素はホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ及びルシフェラーゼを含有してもよい。可溶性ＧＰＶＩは第１の抗体によって固相支持体上に捕捉されてもよく、及び第２の抗体の結合において検出及び定量されてもよい。本発明のＥＬＩＳＡは、生体試料中の可溶性ＧＰＶＩを０．２〜５ｎｇ／ｍｌの低濃度において検出又は定量することが可能である。これは、可溶性ＧＰＶＩ量が一般に約６ｎｇ／ｍｌである健常なヒト個体の血漿中の可溶性ＧＰＶＩ、及び上昇した量の可溶性ＧＰＶＩを含有するヒト患者の血漿中の可溶性ＧＰＶＩを検出又は定量するのに十分な感度である。本発明のＥＬＩＳＡは、指示された時点又は指示された期間に及ぶ多数の時点に、ヒト個体の血中の可溶性ＧＰＶＩ量を監視するのに用いることができる。

本発明はさらに生体試料中又は試験試料中のＧＰＶＩポリぺプチド、ぺプチド、又はそれらの天然変異体の存在を検出又は定量するための方法及びキットを提供する。該方法は試料と上記本発明の第１の抗体との接触、試料と上記本発明の第２の抗体との接触、第１の抗体による可溶性ＧＰＶＩの捕捉、及び標識可能な第２の抗体による可溶性ＧＰＶＩの検出又は定量を含む。該キットは本発明の第１及び第２の抗体を含有し、第１の抗体は固定化されていてよく、第２の抗体は標識されていてよい。かかる方法及びキットは、異常量のＧＰＶＩポリぺプチド、ぺプチド、又はそれらの天然変異体と関連する症状を個体が発症する危険性が増大しているか、又はすでに患っているかを判定するために用いることができる。かかる病状には、免疫疾患、血管疾患及び他の疾患、例えば血小板減少症；血小板異常；不安定狭心症、急性心筋梗塞、冠動脈疾患、冠血行再建、心室血栓塞栓症、アテローム性動脈硬化症、プラーク形成等の心血管疾患；脳卒中、虚血等の脳血管疾患；慢性動脈閉塞症等の末梢血管疾患；下肢腫脹、潰瘍、肺塞栓症、腹部静脈血栓症等の静脈血栓塞栓疾患；癌転移、例えば癌性の大腸、胸部又は肝臓組織から誘導された腫瘍細胞の癌転移；肝臓疾患；及びある種の胎児疾患が挙げられる。

本発明では、ＧＰＶＩ欠損マウス（ＧＰＶＩ−ＫＯマウス）に、ＧＰＶＩ及びＦｃＲγを安定に発現するＣＨＯ細胞（ＣＧＰ６）を免疫して得られたモノクローナル抗体ＯＭ１、ＯＭ２、ＯＭ４を得た。ＧＰＶＩ−ＫＯマウスはＧＰＶＩを欠損し、高用量のコラーゲン及びコンバルキシン（ＧＰＶＩ特異的アゴニスト）には応答しない。ＧＰＶＩを注射すると、ＧＰＶＩ欠損マウス中の方が通常のマウス中より抗原性が高く、ＧＰＶＩ−欠損マウスを使用して得られたＯＭ１、ＯＭ２、ＯＭ４は、他の公知の抗体と比較して抗原に対して結合親和性の高い抗体であった。本発明者は、従来のＥＬＩＳＡアッセイに比べて、試料中に低濃度で存在する抗体でも検出可能な、より高検出感度で、特異性が高く、良好な再現性を有するＥＬＩＳＡアッセイ系の構築に成功した。本発明により、生体試料中の可溶性ＧＰＶＩを検出することが可能となり、延いては血栓関連疾患とその病態との関わりをモニターすることが可能となった。

かかる方法又はキットの１つの実施態様は、上記のＥＬＩＳＡを含む。キットは、個々の試料中のＧＰＶＩポリぺプチド、ぺプチド、又はそれらの変異体の測定量に基づいて、試験個体が、ＧＰＶＩポリぺプチド、ぺプチド、又はそれらの天然変異体の異常量に関連する障害を発症する危険性が高いか、又はすでに患っているかを判定するための使用説明書を含んでいてもよい。

本発明は、いずれの限定もしないことを意図する以下の実施例により説明される。

（実施例１）
モノクローナルＧＰＶＩ抗体の調製
正常なマウス（Ｂａｌｂ／ｃ、雌）、アルメニアハムスター（雄）及びＧＰＶＩノックアウトマウス（Ｏｔｓｕｋａ ＧＥＮインスティテュートで作出）を免疫して、以下に記載するようにしてモノクローナル抗体を産生した。

ＧＰＶＩノックアウトマウスを、以前に記載されたようにして作製した（Ｍｏｒｉら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．４３：２５１〜７，２００２）。ターゲティングベクターを、図１Ａに示すように、エキソン２の最後の５塩基からエキソン３の前半（ＣｌａＩ部位）までを含む１２９／Ｓｖマウスゲノムλクローン由来のＧＰＶＩ遺伝子のゲノムフラグメント（Ｅｚｕｍｉ Ｙ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍ ２７７：２７〜３６，２０００）を、ｐＭＣ１−ｎｅｏ−ｐｏｌｙＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）カセットで置き換えることにより構築した。直線化した構築物を、１２９／Ｓｖマウス由来のＡＢ２．２ ＥＳ細胞（Ｌｅｘｉｃｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｃ．，ＴｈｅＷｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）にエレクトロポレーションし、細胞をＧ−４１８中で選択した。Ｇ−４１８耐性ＥＳ細胞クローンを、エキソン２及び３での相同組換えの成功について、ＳｐｈＩ又はＫｐｎＩで消化したゲノムＤＮＡを５’又は３’外側プローブでそれぞれプローブすることにより、スクリーニングした（図１Ｂ；サザンブロッティングのデータは示さず）。相同組換えＥＳ細胞由来のキメラマウスを、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスと交配し、ヘテロ接合性変異体（Ｆ１）を得た。ホモ接合性変異体（Ｆ２）は、得られたヘテロ接合性変異体を交配させることにより得て、サザンブロッティングにより確認した。尾部小片から抽出したゲノムＤＮＡを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、マウスの遺伝子型を同定した。ホモ接合性変異体において、出生率、出生時体重、成長及び発育、メンデルの法則に従った分配、又は出血異常は観察されなかった。バックグラウンドが一致する野生型及びヘテロ接合性のマウスを対照として用いた。アルメニアハムスターは、Ｃｙｔｏｇｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｎｃ．Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡから得た。全ての動物は、Ｏｔｓｕｋａ Ｍａｒｙｌａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）のプロトコルに従って維持及び飼育した。

正常なマウスを、ＧＰＶＩ ｃＤＮＡ（「ｐ−ターゲット」）、ＧＰＶＩ−ＦｃＲγ鎖を発現するＣＨＯ細胞系（「ＣＧＰ６」、トランスフェクションは、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００を用いて行った）、ＧＰＶＩ−ＦｃＲγ発現ＣＨＯ細胞から精製したＧＰＶＩ（「ＰＧＰ６」）、ヒト血小板から精製した天然ＧＰＶＩ（「ｎＧＰ６」）及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現させた組換え部分ＧＰＶＩ（最初のＩｇドメインを欠く）（「ＰＡＧＰ６」）を用いて免疫した。ヒト血小板からの天然ＧＰＶＩ及びＧＰＶＩ−ＦｃＲγでトランスフェクションした細胞からのＰＧＰ６を、レクチンアフィニティ、イオン交換クロマトグラフィー及び米国公開第２００３／０１８６８８５号に記載のコンバルキシンアフィニティ法を組み合わせて精製した。

ＧＰＶＩ及びＦｃＲγを安定に発現するＣＨＯ細胞（「ＣＧＰ６」）を、全長ヒトＧＰＶＩ ｃＤＮＡ（「ｐ−ターゲット」）を含むｐＴａｒｇｅｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）と全長ＦｃＲγ ｃＤＮＡを含むｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｚｅｏｃｉｎベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いる同時トランスフェクションにより確立した。両方の受容体を発現する細胞を、Ｇ４１８及びゼオシンを補った培地で選択した。ＧＰＶＩの発現を、ポリクローナルヒト抗ＧＰＶＩ抗体（上記のＯｋｕｍａ博士の血清）又はＦＩＴＣ標識コンバルキシンを用いてＥｐｉｃ Ａｌｔｒａ ＦＡＣＳアナライザー（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）でのＦＡＣＳ分析により検出した。ＦｃＲγの発現の検出を、市販の抗ＦｃＲγポリクローナル抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いるイムノブロッティングにより行った。

組換え部分ＧＰＶＩを、ｐＥＴ２１ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）に、ヒトＧＰＶＩの最初のＩｇ全体を欠くＧＰＶＩポリペプチドをコードするｃＤＮＡを挿入することにより産生した。この部分タンパク質を、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）株で発現させた。発現させたタンパク質（「ＰＡＧＰ６」）を、製造業者の説明に従って封入体から精製した。

アルメニアハムスターを、ＣＧＰ６及びヒト血小板で免疫した。ＧＰＶＩノックアウトマウスも、ＣＧＰ６及びヒト血小板で免疫した。

ｐ−ターゲット以外の免疫原を、腹腔内注射した。ｐ−ターゲットは、皮内注射した。組換え又は精製タンパク質を、アジュバント（Ｔｉｔｅｒｍａｘ Ｇｏｌｄ，Ｃｙｔｒｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）とのエマルジョンとして注射した。いくつかの抗原は、マウスＩＬ−６（５００Ｕ／注射）と共に免疫して、免疫系を追加免疫した。動物を、１０〜５００００の血清力価が得られるまで免疫した。

モノクローナル抗体を、通常のハイブリドーマ技術を用いて産生した。融合パートナーとしては、Ｐ３Ｕ１細胞を用いた。陽性のハイブリドーマクローンのスクリーニングのために、ＦＡＣＳ分析を、Ｂｅｃｋｍａｎ ＣｏｕｌｔｅｒからのＥｐｉｃ Ａｌｔｒａ ＦＡＣＳアナライザーで、ＧＰＶＩ−ＦｃＲγ発現ＣＨＯ細胞を用いて行った。ＣＧＰ６免疫化動物について、ＦＡＣＳ分析をＧＰＶＩ−ＦｃＲγでトランスフェクションしたＣＨＯ細胞及びトランスフェクションしていない野生型ＣＨＯ細胞の両方を用いて、非ＧＰＶＩ抗体、例えばＣＨＯ細胞関連抗原に対する抗体を産生するクローンを区別した。

抗ＧＰＶＩ抗体を産生するハイブリドーマ細胞を、次いで、１０％胎児ウシ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＣＡ）（無視できる量のウシＩｇＧ＜１ｐｇ／ｍｌ血清を含有）を含む培地で増殖させた。ＩｇＧを、無細胞の培養上清から、Ｗａｔｅｒｓ６５０システム（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＭＡ）でのプロテインＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）又はプロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）アフィニティクロマトグラフィーにより精製した。マウスＩｇＧを、プロテインＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）でのアフィニティクロマトグラフィーにより精製した。ハムスターＩｇＧを、プロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）で精製した。プロテインＧに結合したＩｇＧを、アフィニティマトリクスから低ｐＨグリシン（ｐＨ２．７５）を用いて溶出し、塩基性溶液に回収して酸を中和し、機能性アッセイに用いるために生理食塩水中で透析した。プロテインＡに結合したハムスターＩｇＧは、ｐＨ勾配７．５〜３．０で溶出した。抗体はｐＨ４．５で溶出された。ほとんどの場合、抗体は、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で分析して＞９０％の純度であった。

二価のＦ（ａｂ’）_２フラグメントを、標準的な方法を用いるパパイン消化により無処置のＩｇＧから調製した。ＩｇＧ溶液（５ｍｇ／ｍｌ）を１００ｍＭクエン酸、ｐＨ６．５及び５．０ｍＭ ＥＤＴＡ中で作り、酵素のＩｇＧに対する比が１：５０（ｗｔ／ｗｔ）で、予め活性化したパパイン（システイン非含有）を用いて３７℃で１５時間消化した。反応を、新しく準備したヨードアセトアミドでクエンチし、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントを、未消化のＩｇＧ及びＦｃから、ＭｏｎｏＱカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）でのイオン交換クロマトグラフィーにより分離した。Ｆ（ａｂ’）_２を含有する画分をプールし、濃縮し、還元／アルキル化して一価のＦａｂフラグメントをＰａｒｈａｍら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．５３：１３３〜１７３（１９８２）の方法に従って得た。最後に、Ｆａｂフラグメントを、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）でのサイズ排除クロマトグラフィーにより均質に精製した。システイン存在下でのパパインによるＩｇＧの一価Ｆａｂへの直接変換は、回避した。なぜなら、パパインがＩｇＧを過剰消化し、不安定で小さいサイズのＦａｂフラグメントが増加する場合があるからである。

最初に、野生型Ｂａｌｂ／ｃマウスを、ヒト血小板からの精製ＧＰＶＩ（「ｎＧＰ６」）、ＧＰＶＩ ｃＤＮＡ含有プラスミド（「ｐ−ターゲット」）及びＧＰＶＩ−ＦｃＲγ鎖複合体発現ＣＨＯ細胞（「ＣＧＰ６」）を含む免疫原で、上記のようにして免疫した。表１を参照されたい。８５００を超えるクローンをスクリーニングした後に、ＧＰＶＩに対する明らかであるが穏やかな親和性を有する３つのクローンを同定した（２つはＣＧＰ６からであり、１つはＰＧＰ６からである）。驚くべきことに、ｐ−ターゲット、ｎＧＰＶＩ及びＰＡＧＰ６での免疫化からの５５００を超えるクローンが、生物活性を有するＧＰＶＩ陽性ローンを１つも生じなかった。増強された親和性及び生物活性を有する抗体を得る試みにおいて、動物の異なる種を免疫した。アルメニアハムスターをＣＧＰ６で免疫した。なぜなら、この免疫原は、野生型マウスにおいて２つの陽性クローンを産生したからである。ヒト血小板はその表面で天然ＧＰＶＩを発現するので、洗浄したヒト血小板も免疫原として用いた。７つのＧＰＶＩ陽性クローンをＣＧＰ６免疫化から、そしてヒト血小板免疫化から１つのクローンを得た。表２を参照されたい。

ＧＰＶＩノックアウト（ＧＰＶＩ−ＫＯ）マウスを、次いで免疫化の宿主として用いた。ＧＰＶＩ−ＫＯマウスはＧＰＶＩを欠損し、高用量のコラーゲン及びコンバルキシン（ＧＰＶＩ特異的アゴニスト）には応答しない。したがって、注射したＧＰＶＩはＧＰＶＩ欠損マウス中の方が抗原性が高く、したがってＧＰＶＩペプチドに高い親和性を有するＧＰＶＩ抗体を産生し得ると理論上想定した。ＧＰＶＩ−ＫＯマウスの免疫化の結果を表３に示す。ＧＰＶＩ−ＫＯマウスの洗浄ヒト血小板懸濁物による免疫化は、陽性クローンを全く産生しなかった。しかし、ＧＰＶＩ−ＫＯマウスのＣＧＰ６による免疫化で８種のクローンが得られ、これらはＦＡＣＳ分析における蛍光強度が大きく右側にシフトすることにより判定されるように、ＧＰＶＩに対して高い親和性を有した。

次いで、ＩｇＧ免疫グロブリンを、ＧＰＶＩ陽性クローンのうち、野生型マウスからの３クローン、ハムスター融合体からの８クローン、及びＧＰＶＩ−ＫＯマウス融合体からの８クローンから得た。ＩｇＧを、プロテインＧ（野生型及びＧＰＶＩ−ＫＯマウス）又はプロテインＡ（ハムスター）のいずれかを用いるアフィニティクロマトグラフィーにより、上記のようにして精製した。全てのクローンからの精製抗体は、０．１〜７μｇ／ｍｌ（１７クローン）及び１０〜３０μｇ／ｍｌ（２クローン）の比較的低濃度のＩｇＧで完全血小板凝集を誘発し、これらの抗体がＧＰＶＩとＦｃＲ ＩＩＡを架橋結合するか、又はＧＰＶＩ分子を架橋結合することが示唆された。ＧＰＶＩ−ＦｃＲＩＩＡ架橋結合の可能性を排除するために、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントを調製した。予備試験において、２つの抗体から調製したＦ（ａｂ’）_２フラグメントはヒト血小板を活性化したが、無処置のＩｇＧと比べると数倍高い濃度が必要であった。このことは、二価抗体によるＧＰＶＩ架橋結合が、観察された血小板活性化の原因であり得ることを確かにした。ＧＰＶＩ架橋結合を避けるために、全てのＦ（ａｂ’）_２フラグメントを還元／アルキル化によりＦａｂフラグメントに変換した。得られたＦａｂフラグメントは、無処置のＩｇＧがヒト血小板を活性化する濃度より数倍高い濃度まで試験したときに、ヒト血小板を活性化しなかった。

（実施例２）
ＧＰＶＩ特異的抗体は、コラーゲン誘発血小板凝集及び粘着の強力な阻害剤である
実施例１に従って産生されたＦａｂフラグメントの阻害能力を、静的及び流動条件下で、コラーゲン誘発血小板凝集及び固定化コラーゲンに対する血小板の粘着を含むコラーゲン誘発血小板機能について試験した。

抗体を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ血小板凝集について、次のようにして試験した。コラーゲン応答は個体のうちで変動するので、まず、添加から５分以内に７０〜９０％の血小板凝集を与えるコラーゲンの量を決定するために、コラーゲン投与実験を行った。さらに、このアッセイで用いたコラーゲンの種類は、応答に劇的に影響し得る。経験的に、酸不溶性ウマ腱コラーゲン（Ｎｙｃｏｍｅｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）は、最大の血小板凝集応答を示した。Ｎｉｅｓｗａｎｄｔ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２３９９８〜２４００２，２０００，及び米国特許公開第２００２／０１４１９９２号）、Ｌｅｃｕｔら（Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ １：２６５３〜２６６２，２００３）及びＭｏｒｏｉら（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．８９：９９６〜１００３，２００３）も酸不溶性ウマ腱コラーゲンを用いたが、その他はコラーゲンのより応答が少ない形、例えばウシコラーゲンＩ型繊維を用いた（Ｓｍｅｔｈｕｒｓｔら、Ｂｌｏｏｄ １０３：９０３〜９１１，２００４及び国際公開第０３／０５４０２０号）。以下に例証するアッセイにおいて、１〜４μｇ／ｍｌの酸不溶性ウマ腱コラーゲン（Ｎｙｃｏｍｅｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、血小板凝集に対する特定のＦａｂ調製物の阻害効果を調べた。用いたコラーゲンの種類は、Ｑｉａｎら（Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ １１：９７〜１０５，２００２）、国際公開第０１／００８１０号、国際公開第０２／０８０９６８号及びそれらの関連出願において用いられたものと同じである。しかし、以下で論じるように、本発明のＧＰＶＩ抗体は、Ｑｉａｎ、国際公開第０１／００８１０号及び国際公開第０２／０８０９６８号で開示されるＧＰＶＩ抗体に比べて有意に大きい阻害効果を示す。

血小板凝集アッセイを、抗凝血剤としての３．８％クエン酸三ナトリウム１／１０容量中に血液を採取することにより行った（Ｎａｋａｍｕｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（８）：４３３８〜４４，１９９８）。多血小板血漿（ＰＲＰ）を、全血を１８０×ｇで１５〜２０分間、室温で遠心分離することにより得た。血小板を計数し、血小板凝集試験を行う前に、貧血小板血漿中に３〜４×１０^８血小板／ｍｌに調整した。全ての実験は、採血から３〜４時間で行い、全ての時間、多血小板血漿を室温に保持した。凝集試験は、レーザ散乱により粒子形成の動態を、及び光スペクトルの可視領域の６５０ｎｍでの光透過により凝集の動態を測定する４チャンネル凝集測定装置ＡＧ１０（Ｋｏｗａ，Ｊａｐａｎ）で行った。多血小板血漿を、種々の量のＦａｂフラグメントと３７℃で１０分間インキュベートし（攪拌なしで５分間、次いで攪拌しながらさらに５分）、その後、酸不溶性ウマ腱コラーゲン（Ｎｙｃｏｍｅｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を加え、凝集を、さらに５〜１０分監視した。

静的条件下でのコラーゲンへの血小板粘着を、上記のＮａｋａｍｕｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：４３３８〜４３３４（１９９８）の変法を用いて調べた。簡単に説明すると、洗浄した血小板を、所望量のＦａｂフラグメントと３０分間、Ｍｇ^２＋の存在下及び非存在下で室温にてインキュベートし、その後、コラーゲン被覆したウェルに加えた（２μｇ／ウェルの酸不溶性ウマ腱コラーゲン）（Ｎｙｃｏｍｅｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。室温で６０〜９０分間のインキュベーションの後に、粘着しなかった血小板を生理食塩水で軽く洗浄して除去し、市販のＬＤＨキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＭＡ）を用いて粘着血小板のＬＤＨ含量を測定することにより定量した。

流動条件下での固定化コラーゲンへの血小板粘着は、Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）により開発されたフローチャンバ中で測定した。組換えヒルジン（ｈｉｒｕｄｉｎ）（５０単位／ｍｌ）で抗凝固した全血を、Ｆａｂフラグメント含有溶液と１５分間、３７℃でインキュベートし、その後、高せん断（２６００秒^−１，２分）で、コラーゲン被覆した（５μｇ／ｃｍ^２の酸不溶性ウマ腱コラーゲン）（Ｎｙｃｏｍｅｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）フローチャンバを通過させた。粘着しなかった血小板を、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、粘着した血小板をグルタルアルデヒド（０．５％ｗ／ｖ，１時間）で固定し、トルイジンブルー／ホウ酸ナトリウム（０．０５％，５分）で染色した。血小板による表面被覆率をデジタル画像解析により評価した。重複していない画像１０点から得た平均値を用いて表面積被覆率（％）を測定した。

選択した抗体のうち、４種のＩｇＧ、ＯＭ１、ＯＭ２、ＯＭ３及びＯＭ４からのＦａｂフラグメントが、ヒト血小板についてコラーゲン誘発血小板凝集を阻害した。表２、３及び４を参照されたい。コラーゲン誘発血小板凝集に対するＦａｂフラグメントの阻害能力の順序は、ＯＭ１＞ＯＭ２＞ＯＭ３＞ＯＭ４であった。コラーゲン誘発血小板凝集の阻害についての各抗体の平均ＩＣ_５０及びＳＤ値は、表４に示す。

表４：抗ＧＰＶＩ Ｆａｂフラグメントのヒト血小板のコラーゲン誘発凝集に対する影響及び非ヒト血小板への交差反応性

^＊用量応答曲線は、３人の異なる対象からの血液を用いて得られた。ＩＣ_５０値は、非回帰分析（ｎｏｎ−ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ）により算出した。値は、実験３回の平均値±ＳＤである。
^＊＊動物血小板との交差反応性は、個別のＦａｂフラグメントがコラーゲン誘発血小板凝集を阻害する能力と、ＦＡＣＳ分析における陽性右方シフトに基づいた。（＋）符号は、Ｆａｂフラグメントによるコラーゲン誘発凝集の阻害と陽性右方シフトを示すが、（−）符号は、どちらの試験においても反応がないことを示す。
^＊＊＊測定せず。

ラット、イヌ及びサルの血小板への各抗体の交差反応性も試験した。サル及びイヌの血液は、Ｃｏｖａｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ，Ｖｉｅｎｎａ，ＶＡから購入した。Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄｏｗｌｅｙラットは、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｉｌｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡから購入した。４種のＦａｂフラグメント全てが、サル血小板のコラーゲン誘発凝集を阻害した。面白いことに、ＯＭ４は、ラットの血小板と交差反応した。これらのＧＰＶＩ特異的抗体は、動物モデルにおいてＧＰＶＩ特異的抗体の効果を試験するのに有用な手段である。ＯＭ１、ＯＭ２、ＯＭ３及びＯＭ４抗体を産生するハイブリドーマは、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）に、２００４年４月２９日にＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５９３８、ＰＴＡ−５９３９、ＰＴＡ−５９４０及びＰＴＡ−５９４１としてそれぞれ寄託した。

比較のために、広く用いられているヒト−マウスキメラ抗ＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａ ＦａｂフラグメントであるＲｅｏＰｒｏ（登録商標）（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ，Ｉｎｃ．）と、抗ＧＰＩＩｂ−ＩＩＩｂモノクローナル抗体７Ｅ３のＦ（ａｂ’）_２フラグメント（Ｃｏｌｌｅｒ及びＳｃｕｄｄｅｒ，Ｂｌｏｏｄ ６６：１４５６〜１４５９，１９８５）を、ＧＰＶＩ特異的抗体を試験するのに用いた同じ条件下でいくつかの同じドナーについて試験した。ＲｅｏＰｒｏ（登録商標）は、コラーゲン誘発血小板凝集を、１．７１μｇ／ｍｌのＩＣ_５０で阻害した。つまり、ＯＭ１は、ＲｅｏＰｒｏ（登録商標）よりも大きい阻害能力を有したが、ＯＭ２はＲｅｏＰｒｏ（登録商標）と等しい能力であった。ＲｅｏＰｒｏ（登録商標）は、このアッセイにおいてＯＭ３及びＯＭ４よりも２〜４倍より強力であった。７Ｅ３ Ｆ（ａｂ’）_２はラット血小板と交差反応したが、ＲｅｏＰｒｏ（登録商標）はしなかった（表４を参照されたい）。

静的条件下でのＦａｂフラグメントの血小板粘着に対する影響も試験した。粘着は、Ｍｇ^２＋の存在下（ＧＰＩａ−ＩＩａ及びＧＰＶＩ依存性）及び非存在下（ＧＰＶＩ依存性）で行った。Ｍｇ^２＋非依存性粘着は、図２に示すように、ＧＰＶＩの存在に依存するのみであり、比較的低い濃度で４種全てのＦａｂにより阻害された（ＩＣ_５０は０．１〜１μｇ／ｍｌの範囲）。ＯＭ１、ＯＭ２及びＯＭ３は、類似の阻害活性であった（ＩＣ_５０は０．１〜０．２μｇ Ｆａｂ／ｍｌの範囲）が、ＯＭ４は、類似の阻害を達成するためにもう少し高い用量を必要とした（ＩＣ_５０は０．２〜１μｇ Ｆａｂ／ｍｌの範囲）。Ｍｇ^２＋依存性粘着過程は、Ｍｇ^２＋非依存性粘着過程に必要なものよりも比較的より高い用量のＦａｂフラグメントを必要とした（図２を参照されたい）。しかし、いずれのＦａｂも、血小板のコラーゲンへのＭｇ^２＋依存性粘着を完全に阻止することはできなかった。

静的条件下でのＦａｂフラグメントのＭｇ^２＋非依存性血小板粘着に対する影響は、さらにより低い用量（０．００１〜１μｇ Ｆａｂ／ｍｌ）を用いて繰り返した。図３に示すように、ＯＭ２及びＯＭ４ Ｆａｂフラグメントは、０．１μｇ Ｆａｂ／ｍｌで４０〜６０％の血小板粘着を阻害し、ＯＭ１及びＯＭ３ Ｆａｂフラグメントは、同じ濃度で１０〜２０％の粘着を阻害した。この相違は、バッチの違い及びドナーの変動性によるのであろう。結果として、Ｆａｂフラグメントの一連のＯＭは、０．５μｇ／ｍｌより低い濃度で、ＧＰＶＩ依存性（Ｍｇ^２＋非依存性粘着）を効果的に阻害する。

血小板粘着に対する抗ＧＰＶＩ Ｆａｂフラグメントの阻害効果についても、上記のようなｉｎ ｖｉｖｏの状況により近い条件下で試験した。ＯＭ１、ＯＭ２、ＯＭ３、ＯＭ４のＦａｂフラグメントは、高せん断条件（２６００秒^−１）下で、固定化コラーゲンへの血小板粘着を有意に阻害した。対照試料に比べて、抗ＧＰＶＩ Ｆａｂは、凝集物のサイズ及び形態に劇的な変化を誘発した（図４）。これに比べて、ＲｅｏＰｒｏ（登録商標）（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ，Ｉｎｃ．）も、凝集物の形成を妨げたが、コラーゲン繊維上に個々の血小板の均一な層が観察された（図４）。

凝集物の形態は、２つの事象：（１）血小板の一次単層で被覆された領域と（２）全体像に容積の次元を加える、その後の凝集物の形成との結果である。表面被覆率を伴う凝集物形成の抗ＧＰＶＩ Ｆａｂによる劇的な減少は、ＧＰＶＩが一次粘着過程に参加するだけでなく、血小板活性化及びその後の血栓成長を含む粘着後事象においても重要な役割を演じていることを示唆する。

凝集及び粘着アッセイは、本発明のＧＰＶＩ特異的抗体のＦａｂフラグメント、例えばＯＭ１、ＯＭ２、ＯＭ３及びＯＭ４は、血小板の機能の強力な阻害剤であることを証明する。これらは、Ｌｕｃｅｔら（Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ １：２６５３〜２６６２，２００３）、国際公開第０２／８０９６８号及び米国特許公開第２００４／０２５３２３６号に記載されるような組換え可溶性ＧＰＶＩ−Ｆｃ（ｒｓＧＰＶＩ−Ｆｃ）融合タンパク質をコードするｃＤＮＡで免疫されたマウスから産生されたマウスモノクローナル抗体９Ｏ１２．２のＦａｂフラグメントよりも、コラーゲン誘発血小板凝集の阻害において、より効力がある。さらに、ＯＭ抗体は、９０１２．２ Ｆａｂフラグメントよりも、コラーゲンへのＭｇ^２＋非依存性粘着の阻害において、より効力がある。

Ｎｉｅｓｗａｎｄｔ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２３９９８〜２４００２，２０００及び米国特許公開第２００２／０１４１９９２号）は、マウスＧＰＶＩに対するラットモノクローナル抗体、ＪＡＱ１を報告した。しかし、ＪＡＱ１の飽和濃度（２０μｇ／ｍｌ）は、コラーゲン誘発血小板凝集に対して限られた阻害効果しか示さなかった（米国特許公開第２００２／０１４１９９２号、段落２９を参照されたい）。さらに、ＪＡＱ１は、我々又は他者の手中で、ＦＡＣＳ分析又はウェスタンブロッティングにおいてヒトＧＰＶＩを認識しなかった（Ｔａｋａｙａｍａら、Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅｍｏｓｔ．１４：７５〜８１，２００３）。

他者は、単鎖Ｆｖｓ（ＳｃＦｖｓ）を産生している。例えば、Ｑｉａｎら（Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ １１：９７〜１０５，２００２）は、本発明で用いたのと同じコラーゲンを２μｇ／ｍｌ用いたコラーゲン誘発血小板凝集試験において８０〜９０μｇ／ｍｌのＩＣ_５０を有するＧＰＶＩの単鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）抗体を報告した。つまり、本発明のＧＰＶＩ特異的抗体は、Ｑｉａｎらに比べて、コラーゲン誘発血小板凝集の阻害効力が有意に高い。国際公開第０１／００８１０号、国際公開第０２／８０９６８号及びその関連出願に報告されているＳｃＦｖも、本発明のＧＰＶＩ特異的抗体に比べて、コラーゲン誘発血小板凝集の阻害のために有意に大きい濃度（１１０〜１５０μｇ／ｍｌのＳｃＦｖ）を必要とした。

同様に、Ｓｍｅｔｈｕｒｓｔら（Ｂｌｏｏｄ １０３：９０３〜９１１，２００４及び国際公開第０３／０５４０２０号）は、コラーゲン誘発血小板凝集において１２〜１６μｇ／ｍｌのＩＣ_５０を有するＧＰＶＩのＳｃＦｖ抗体を報告した。これに対して、ＯＭ１、ＯＭ２、ＯＭ３及びＯＭ４は、ＳｍｅｔｈｕｒｔのＳｃＦｖよりも強力である。さらに、米国特許第６２４５５２７号及び第６３８３７７９号が抗ＧＰＶＩ抗体を開示しているが、これらは、本発明のもののようにコラーゲン誘発血小板凝集を阻害するのに効果的な抗ＧＰＶＩ抗体の例を全く示さない。

（実施例３）
ＧＰＶＩ特異的抗体は、コラーゲン誘発分泌及びトロンボキサンＡ_２形成を阻害する
本発明のＧＰＶＩ特異的抗体のＦａｂフラグメントを、コラーゲン誘発分泌及びトロンボキサンＡ_２（ＴＸＡ_２）形成に対するそれらの影響についても試験した。分泌とは、血小板の高密度α顆粒からの生理活性内容物のアゴニスト誘発放出のことをいう。

アゴニスト誘発放出を定量するある方法は、化学発光法を用いるルシフェラーゼアッセイにより、媒質中のＡＴＰ含量を測定することである。多血小板血漿を、コラーゲン誘発ＡＴＰ分泌について、発光式凝集測定装置（Ｌｕｍｉ−ａｇｇｒｅｇｏｍｅｔｅｒ）（Ｃｈｒｏｎｏｌｏｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＰＡ）及びルシフェラーゼ−ルシフェリン試薬を用いて試験した。発光式凝集測定装置は、アゴニスト誘発血小板凝集とＡＴＰ分泌とを同時に測定する。簡単に説明すると、ヒト血液を、シリンジを用いて３．８％クエン酸三ナトリウムに直接加えた（血液：クエン酸塩を９：１容量）。多血小板血漿は、１８０×ｇで１５分間の遠心分離により調製した。多血小板血漿（３６０μｌ）を、４０μｌのルシフェラーゼ−ルシフェリン試薬（Ｃｈｒｏｎｏ−ｌｕｍｅ；Ｃｈｒｏｎｏｌｏｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＰＡ）と混合し、混合物を種々の量の試験Ｆａｂ、ＲｅｏＰｒｏ（登録商標）又は対照と３７℃で５分間インキュベートした。１〜４μｇ／ｍｌのコラーゲン（酸不溶性ウマ腱コラーゲン）（Ｎｙｃｏｍｅｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を５分で加え、凝集及びＡＴＰ分泌を８分間監視した。反応の最後（１０〜１１分）に、既知の量のＡＴＰ溶液を加えて、アゴニストでの攻撃の際に血小板により分泌されたＡＴＰ量を算出するために用いられる偏向を得た。

トロンボキサンＡ_２形成を、上記で用いたのと並行する試料で測定した。上記のコラーゲン添加工程の１０分後に、５００μＬの停止溶液（１３０ｍＭ ＮａＣｌ中の５０ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭインドメタシン）を２００μＬの多血小板血漿に加えて、トロンボキサンＡ_２形成を停止させた。懸濁液を１０００×ｇで４℃にて１０分間遠心分離した。上清を回収し、トロンボキサンＡ_２の安定な代謝産物であるトロンボキサンＢ_２について試験するまで−２０℃で凍結させた。トロンボキサンＢ_２は、市販のキット（Ｔｈｒｏｍｂｉｘａｎｅ Ｂ_２ Ｂｉｏｔｒａｋ Ａｓｓａｙ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて定量した。

ＯＭ１、ＯＭ２、ＯＭ３及びＯＭ４の全てのＦａｂフラグメントは、ヒト血小板からのコラーゲン誘発ＡＴＰ放出を強力に阻害した（表５）。ＯＭ１は、１μｇ／ｍＬで９０％を超える阻害を示した。ＯＭ２、ＯＭ３及びＯＭ４も、３μｇ／ｍＬで９０％を超える阻害を達成した。ＲｅｏＰｒｏ（登録商標）は、抗ＧＰＶＩ抗体よりもＡＴＰ分泌の阻害において効果がより小さく、抗ＧＰＶＩ Ｆａｂがコラーゲン誘発ＡＴＰ放出のよりよい阻害剤であることを示唆する。血小板から放出される二次アゴニストは、協調して血栓を成長させることが知られている。したがって、コラーゲン誘発分泌の阻害剤、例えば本発明のＧＰＶＩ特異的抗体は、血栓成長の強力な阻害剤である。

表５：ヒト血小板からのコラーゲン誘発ＡＴＰ放出に対する抗ＧＰＶＩ Ｆａｂフラグメントの影響^＊

^＊結果は、４人の異なる血小板ドナーから得た。

コラーゲン誘発トロンボキサンＡ_２発生も、ＯＭ１、ＯＭ２、ＯＭ３及びＯＭ４のＦａｂフラグメントにより強く阻害された（表６）。試験した４種のＦａｂフラグメントのうち、ＯＭ１は、１μｇ／ｍＬで９０％を超える阻害を示した。ＯＭ２及びＯＭ３も、３μｇ／ｍＬで９０％を超える阻害を達成した。ＯＭ４は、トロンボキサンＡ_２形成を３μｇ／ｍＬで約８６％阻害した。これに対して、ＲｅｏＰｒｏ（登録商標）は、１及び３μｇ／ｍＬでトロンボキサンＡ_２形成に対してほとんど又は全く阻害効果を示さなかった。ＧＰＶＩの遮断が、ＴＸＡ_２の発生及びコラーゲン粘着血小板上の活性化ＩＩｂ−ＩＩＩａ複合体の発現を阻害することも示されている（Ｎａｋａｍｕｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：４３３８，１９９８；Ｎａｋａｍｕｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１１８７９，１９９９）。したがって、抗ＧＰＶＩ ＦａｂフラグメントによるＴＸＡ_２発生の阻害は、本発明のＧＰＶＩ特異的抗体が、活性化ＩＩｂ−ＩＩＩａ複合体の発現を導く上流のシグナリング事象を阻害し、最終的にはその後の血栓成長を減弱化することを示唆する。

表６：ヒト血小板におけるコラーゲン誘発トロンボキサンＡ_２形成に対する抗ＧＰＶＩ抗体のＦａｂフラグメントの影響

^＊結果は、４人の異なるドナーからの血小板を用いて得た。

（実施例４）
ＧＰＶＩに対する抗ＧＰＶＩ抗体のＦａｂフラグメントの結合親和性及び反応性
結合親和性は、Ｆｕｊｉｍｕｒａら Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ８７：７２８〜３４（２００２）の方法に従って測定した。結合親和性の測定において用いた^１２５Ｉ標識抗体は、未標識のＩｇＧから、ヨード−ビーズ法（Ｐｉｅｒｃｅ，ＩＬ）に従って調製した。簡単に説明すると、１つのヨード−ビーズを、０．５ｍＣｉの無担体のＮａ^１２５Ｉ含有ヨウ素化緩衝液（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に浸漬し、その後、候補のＩｇＧ（１００μｇ）を加えた。室温で５分間のインキュベーションの後に、反応混合物をＰＤ１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）にかけて、^１２５Ｉに結合したＩｇＧを遊離のヨウ素から分離した。^１２５Ｉ−ＩｇＧを含む画分をカラムから溶出し、少量（１μｌ）をＴＣＡ沈殿に付した。沈殿したペレット及び得られた上清の両方をガンマカウンターでカウントして、ＩｇＧへの^１２５Ｉの取り込みを定量した。沈殿中に最大カウントを有する画分（＜９５％）をプールし、２８０ｎｍで分光光度計で読み取ってタンパク質濃度を測定した。既知の容量をガンマカウンターで再びカウントして、標識ＩｇＧの比放射能を得た。種々の抗体の比放射能は、０．３３〜０．９７μＣｉ／ｕｇ ＩｇＧの範囲であった。

結合親和性は、洗浄したヒト血小板（５×１０^８／ｍｌ）を１ｎＭの^１２５Ｉ−ＩｇＧと、種々の濃度の未標識相同ＩｇＧ（０〜５００ｎＭ）の存在下及び非存在下で１時間インキュベートすることにより測定した。遊離及び結合した放射活性は、混合物をＢＳＡ（生理食塩水中に１０％）溶液に重層し、１５０００×ｇで１０分間遠心分離することにより分離した。上清及びＢＳＡクッションの両方を注意深く除去した後に、チューブの先端を切断してペレットの放射活性を、ガンマカウンターでカウントした。８〜１０本の三点競合結合等温線（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ−ｐｏｉｎｔ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｉｓｏｔｈｅｒｍｓ）を、個別のＩｇＧの結合を評価するために得た。データは、非線形回帰分析ソフトウェアであるＰｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．ＣＡ）を用いて分析した。

結合親和性実験で、４種の抗体全てが、０．７〜１．７ｎＭの範囲の親和性で血小板に強く結合することが明らかになった（表７）。本発明の抗体を、当分野で報告されている抗体の結合親和性と比較した。ＲｅｏＰｒｏ（登録商標）（Ｋｄ＝６．２５±２．６×１０^−９Ｍ）（Ｓａｓｓｏｌｉら Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ８５：８６８〜９０２，２００１から）、ｓｃＦｖ−１０Ｂ１２（Ｋｄ＝７．９×１０^−７Ｍ）（Ｓｍｅｔｈｕｒｓｔら、Ｂｌｏｏｄ １０３：９０３〜９１，２００４から）及び９Ｏ１２．２−ＩｇＧ（Ｋｄ＝１８×１０^−９Ｍ）（国際公開第０２／０８０９６８号から）。ＲｅｏＰｒｏ（登録商標）及びｓｃＦｖ−１０Ｂ１２は、一価フラグメントであるが、この実施例で用いた一連のＯＭ及び９Ｏ１２．２は、ＩｇＧである。４種全てのＯＭは、ＲｅｏＰｒｏ（登録商標）、ｓｃＦｖ−１０Ｂ１２及び９Ｏ１２．２−ＩｇＧについて報告されたよりもより高い親和性でヒト血小板に結合した（表７）。一価のフラグメントは、通常、無処置の対応するＩｇＧに比べて親和性がいくらか低減されている。しかし、その減少は有意であるとは予想されないと思われる。

表７：抗ＧＰＶＩ抗体の結合親和性

一連のＯＭの結合の試験は、異なる個体からの血小板を用いる単独の実験による。各データ点は、３回測定した。
^＊Ｓａｓｓｏｌｉら Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ８５：８６８〜９０２（２００１）からのデータ。
^＊＊Ｓｍｅｔｈｕｒｓｔら、Ｂｌｏｏｄ １０３：９０３〜９１１（２００４）からのデータ。１０Ｂ１２は、ファージディスプレイ法により得られるＧＰＶＩに対するヒト特異的ｓｃＦｖ抗体である。
^＊＊＊国際公開第０２／０８０９６８号からのデータ。９Ｏ１２．２は、モノクローナル抗ＧＰＶＩ抗体である。

ウェスタンブロッティング分析を行って、異なる種からのＧＰＶＩに対する一連のＯＭ抗体の反応性を測定した。異なる種からの血小板（１×１０^８／ｍｌ）を、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＰＭＳＦ及びＮＥＭ（各１ｍＭ）を含有する２％ＳＤＳに可溶化した。タンパク質は、４〜２０％のプレキャストＴｒｉｓ−グリシングラジエントミニゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で分離し、分割したタンパク質をニトロセルロース膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）に移した。個別のレーンを切り取り、ＴＢＳ−Ｔ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣＩ ｐＨ ７．４，１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び０．５％ Ｔｗｅｅｎ２０）中の５％スキムミルクで６０分間ブロックした。切断したニトロセルロースを、ＯＭ抗体（２μｇ／ｍｌ）又はビオチン化コンバルキシンと４℃で一晩インキュベートした。膜をＴＢＳ−Ｔで十分に洗浄し、室温で１時間、ＨＲＰ−結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＯＭ１、ＯＭ２及びＯＭ４）、ＨＲＰ結合ヤギ抗ハムスターＩｇＧ（ＯＭ３）又はストレプトアビジン−ＨＲＰ（ビオチン化コンバルキシン）のいずれかを用いてプローブした。膜を、大過剰のＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。免疫反応性のバンドを、高感度化学発光検出システム（ＥＣＬ−Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ，ＵＫ）を用いて視覚化した。

４種全てのＯＭ抗体は、イムノブロットにおいて、ヒト血小板からの変性ＧＰＶＩと反応した（図５）。同様の反応性は、サル血小板とも観察された（ブロットは示さず）。いずれの抗体も、マウス、ブタ、イヌ、ウサギ又はモルモットの血小板とは反応しなかった。ＯＭ４のみが、ラット血小板溶解物と陽性反応した。これらのデータは、一連のＯＭ抗体の全てがヒト及びサルからの血小板におけるＧＰＶＩを認識するが、ＯＭ４はラット血小板におけるＧＰＶＩもさらに認識することを示唆する。

（実施例５）
相補性決定領域（ＣＤＲ）
ＯＭ１、ＯＭ２、ＯＭ３及びＯＭ４の相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列を決定した。

全ＲＮＡを、ＯＭ１、ＯＭ２、ＯＭ３及びＯＭ４のハイブリドーマからＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて単離した。ｃＤＮＡを、ランダムプライマーを用いてＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で合成した。抗体の可変領域に相当するＤＮＡ配列を、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｐｆｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＨｅａｖｙ Ｐｒｉｍｅｒｓ又はＬｉｇｈｔ Ｐｒｉｍｅｒｓミックス（Ａｍｅｒｓｈａｍ）と共に用いてポリメラーゼ連鎖反応により増幅した。増幅したＤＮＡを、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に連結し、得られた構築物を、ＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、化学的コンピテント細胞に形質転換した。形質転換細胞を、カナマイシンの存在下で培養し、増幅したプラスミドを、Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ．Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ ＩＩ（Ｏｍｅｇａ Ｂｉｏ−ｔｅｋ）を用いて単離した。挿入ＤＮＡの配列決定を、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｅｒで、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。ＤＮＡ配列を分析して、ＯＭＩＧＡ ２．０ソフトウェア（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）を用いてアミノ酸配列に変換した。

ＯＭ１、ＯＭ２、ＯＭ３及びＯＭ４のＣＤＲを、表８に示す。

表８：抗ＧＰＶＩ抗体のＣＤＲ配列

（実施例６）
ＧＰＶＩと血栓症
血栓症におけるＧＰＶＩの役割は、ＧＰＶＩ枯渇又はＦｃＲγ−ＫＯ／ＧＰＶＩ欠損マウスを用いた以前の試験で示されている（Ｎｉｅｓｗａｎｄｔら、Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ ２０：２１２０〜２１３０（２００１））。ＧＰＶＩ枯渇又はＦｃＲγ−ＫＯ／ＧＰＶＩ欠損マウスは共に、ＦｃＲγ鎖を欠く。この実施例においては、血栓症におけるＧＰＶＩの関わりを、ＦＣＲγ鎖を欠損していないＧＰＶＩ−ＫＯマウスを用いて確かめた。

ＧＰＶＩノックアウトマウスは、上記のようにして得た。これらのマウスからの血小板は、高用量のコラーゲン（２０μｇ／ｍｌ）にもＧＰＶＩ特異的アゴニストであるコンバルキシン（３μｇ／ｍｌ）にも応答できなかったが、ＡＤＰ（５μＭ）には正常に応答した（図６）。野生型に比べて半分の量のＧＰＶＩを産生するヘテロ接合性ＧＰＶＩ欠損マウスは、コラーゲン及びコンバルキシンに対する応答が減少したが、アゴニストの用量を増加させると通常の応答が観察された（図６）。これらの知見は、血小板表面での主要なコラーゲン受容体としてのＧＰＶＩの役割を確実にする。

血栓症及び恒常性におけるＧＰＶＩの役割を、まず、致死的な肺血栓塞栓症を通常は誘導するコラーゲン−エピネフリンの同時注入により試験した（表９を参照されたい）。マウスにケタミン／キシラジン（１５０／１５ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ）で麻酔をかけ、コラーゲンとエピネフリンの混合物（８００／６０μｇ／ｋｇ）を、右頚静脈に注射した。次いで、マウスを１５分間観察し、次のように分類した：（ａ）注射の１０分以内に死亡した動物、及び（ｂ）１０分以内に緩和される一過性の呼吸困難を示した生残り動物。生残り動物の外科的創傷を縫合し、動物を動物施設に戻した。約８３％（１８匹のうち１５匹）のＧＰＶＩ野生型動物が、注射の５分以内に死亡した。全てのヘテロ接合性ＧＰＶＩ欠損マウス（１８匹のうち１８匹）が、注射の５分以内に死亡した。野生型及びヘテロ接合性の動物とは対照的に、約５５％のＧＰＶＩ−ＫＯマウス（ホモ接合性）は、コラーゲンとエピネフリンの致死的注射に対して生き残り、ＧＰＶＩがコラーゲンの注射により誘導される肺血栓塞栓症において重要な役割を演じることを示唆した。

表９：肺血栓塞栓症におけるＧＰＶＩの役割

表１０に示すように、ＧＰＶＩノックアウトマウスは、野生型及びヘテロ接合性マウスと本質的に同じ尾部出血時間を示した。ＧＰＶＩノックアウトマウスの出血時間を、血小板で見出され且つ血小板凝集及び血栓症に関わるβ３インテグリンを欠損するノックアウトマウスのものと比較した（Ｋａｉｒｂａａｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０３：２２９〜２３８，１９９９）。ＧＰＶＩ欠損マウスとは対照的に、ホモ接合性β３ノックアウトマウスは、継続して出血した。したがって、ｉｎ ｖｉｖｏでの抗ＧＰＶＩ Ｆａｂフラグメントの投与は、ＧＰＶＩノックアウトマウスでの出血時間は野生型マウスのものと同様であるので、これらが出血時間に大きく影響はしないことから、より安全であり得る。

表１０：野生型、ヘテロ接合性及びホモ接合性マウスにおける尾部出血時間：β３ノックアウトマウスとの比較

^＊Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １０３：２２９，１９９９
^＊＊野生型及びヘテロ接合性マウスと有意に異なる。ほとんどの場合、出血は、死を避けるために手操作で止めなければならなかった。

血栓症におけるＧＰＶＩの役割をさらに確かめるために、野生型、ヘテロ接合性及びＧＰＶＩ−ＫＯマウスからの全血を、Ｉ型コラーゲンで被覆したカバーガラス上に２６００秒^−１のせん断応力で灌流させた。ＧＰＶＩ−ＫＯマウスからの血小板は、コラーゲン繊維に粘着できなかったが、野生型及びＧＰＶＩ−ヘテロ接合性マウスからの血小板は、コラーゲン繊維に粘着して、大きい血栓を形成した。野生型マウスとＧＰＶＩ−ヘテロ接合性マウスとの間に、表面被覆率及び血栓形態における違いはなかった（図７）。

（実施例７）
カニクイザルでのｅｘ ｖｉｖｏコラーゲン誘発血小板凝集及び皮膚出血時間に対するＯＭ２ Ｆａｂフラグメントの影響
用量段階増加試験：ＯＭ２ Ｆａｂフラグメントは、カニクイザルの血小板を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏコラーゲン誘発血小板凝集アッセイにおいて、ＯＭ抗体のうちで最大の阻害効果を示したので、さらに試験した。ＯＭ２ Ｆａｂフラグメントを、用量を段階増加させながら、静脈内注射によりカニクイザルに投与し、ｅｘ ｖｉｖｏコラーゲン誘発血小板凝集及び皮膚出血時間に対するその影響を評価した。ＲｅｏＰｒｏ（登録商標）を、同様の方法で試験した。

吸入麻酔の下で、ＯＭ２ Ｆａｂフラグメント又はＲｅｏＰｒｏ（登録商標）を、１時間の間隔で前腕の橈側皮静脈に静脈内注射した。各注射の３０分後に、コラーゲン誘発血小板凝集の測定のために血液を採取した。多血小板血漿及び貧血小板血漿を、クエン酸三ナトリウムで抗凝血化した血液を連続遠心分離することにより調製した。血小板凝集を、採血から１時間後に比濁法で測定した。血小板凝集を誘導するのに用いたコラーゲンの濃度は、各サルからの血小板の反応性に応じて、５〜２０μｇ／ｍＬであった。皮膚出血時間は、抗体の各注射の３０分後に、前腕の筋肉をマンシェットを用いて４０ｍｍＨｇに締め付け、Ｔｒｉｐｌｅｔｔ Ｂｌｅｅｄｉｎｇ Ｔｉｍｅ Ｄｅｖｉｃｅ（Ｈｅｌｅｎａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を用いて皮膚を切開することにより測定した。創傷からの血流をろ紙で吸収し、出血が停止するまで又は１８００秒間、出血時間を測定した。抗体の累積用量を用いて、抗体の効果を評価した。

ＯＭ２ Ｆａｂフラグメントは、コラーゲン誘発血小板凝集に対して用量依存性の阻害効果を示した（図８）。０．２ｍｇ／ｋｇ以上の累積用量で、ＯＭ２ Ｆａｂフラグメントは８０％を超えて血小板凝集を阻害した。

ＲｅｏＰｒｏ（登録商標）は、コラーゲン誘発血小板凝集に対して用量依存性の阻害効果を示した（図８）が、０．３５ｍｇ／ｋｇ以上の累積用量で、８０％を超えて血小板凝集を阻害した。

ＯＭ２ Ｆａｂフラグメントは、０．８ｍｇ／ｋｇの累積用量で、皮膚出血時間を少し延長した（ベースライン値の２．４倍）（図９）。ＯＭ２ Ｆａｂフラグメントは、１８．８ｍｇ／ｋｇの累積用量で、出血時間を少し延長したが、出血時間は、０．８ｍｇ／ｋｇで観察された出血時間を超えなかった。

これに対して、ＲｅｏＰｒｏ（登録商標）は、皮膚出血時間を劇的に延長した（図９）。０．３５ｍｇ／ｋｇの累積用量で、平均出血時間は、ベースライン値より５分長かった。さらに、ＲｅｏＰｒｏ（登録商標）による出血時間の延長は、用量依存的であった。１．５５ｍｇ／ｋｇの累積用量で、出血時間はベースライン値より９．５倍長かった。

結果として、ＯＭ２ Ｆａｂフラグメントは、ＲｅｏＰｒｏ（登録商標）が示したのと同様に、ｅｘ ｖｉｖｏコラーゲン誘発血小板凝集に対する効果的な阻害効果を示した。しかし、皮膚出血時間に対するＯＭ２ Ｆａｂフラグメントの効果は、ＲｅｏＰｒｏ（登録商標）よりも穏やかであった。これらの結果は、ＧＰＶＩの遮断は、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａの遮断に比べたときに優れたリスク／便益比を示し、したがって、臨床治療により適するであろうことを示唆する。さらに、ＲｅｏＰｒｏ（登録商標）を０．４及び０．８ｍｇ／ｋｇで投与した後の１匹のサルの注射部位に、赤い斑点が観察された。数日後にこの斑点は消えたが、ＯＭ２ Ｆａｂ投与では異常は観察されなかった。

薬物動力学試験：ｅｘ ｖｉｖｏコラーゲン誘発血小板凝集及び皮膚出血時間に対する時間経過に伴うＯＭ２ Ｆａｂフラグメントの効果の変化を、ボーラス静脈内注射の後の３匹のカニクイザルにおいて評価した。ＲｅｏＰｒｏ（登録商標）による効果の変化を、同様にして評価した。

この試験について、０．４ｍｇ／ｋｇの用量を選択した。なぜなら、ＯＭ２ Ｆａｂフラグメント及びＲｅｏＰｒｏ（登録商標）が、ｅｘ ｖｉｖｏコラーゲン誘発血小板凝集を、それぞれ０．２ｍｇ／ｋｇ及び０．３５ｍｇ／ｋｇで阻害したからである。前腕の橈側皮静脈に抗体をボーラス静脈内注射した後に、血液を１、２、３、６及び２４時間で採取した。血小板凝集を、各採血の１時間後に、上記の用量段階増加試験に記載したようにして測定した。血小板凝集を誘導するのに用いたコラーゲンの濃度は、各サルからの血小板の反応性に応じて、この試験において５又は１０μｇ／ｍＬであった。出血時間も、抗体投与の１、２、３、６及び２４時間後に、上記の用量段階増加試験に記載したようにして測定した。

０．４ｍｇ／ｋｇで注射されたＯＭ２ Ｆａｂフラグメントは、ｅｘ ｖｉｖｏコラーゲン誘発血小板凝集を、投与の１、２、３及び６時間後に８０％を超えて阻害した（図１０）。注射の２４時間後に、血小板凝集はほぼ基礎レベルに回復した。

同様に、０．４ｍｇ／ｋｇで注射されたＲｅｏＰｒｏ（登録商標）は、投与の１及び２時間後に、ｅｘ ｖｉｖｏコラーゲン誘発血小板凝集を、８０％を超えて阻害した（図１０）。しかし、ＯＭ２ Ｆａｂフラグメントとは対照的に、血小板凝集は経時的に回復した：投与の３時間後に７３％の阻害、６時間後に４７％の阻害、２４時間後に６％の阻害。

図１１に示すように、ＯＭ２ Ｆａｂフラグメントは、投与後１〜６時間の間に皮膚出血時間を少し延長した（ベースライン値より１．７〜２．０倍長い）。出血時間は、血小板凝集の回復と一致して、注射の２４時間後にほぼベースライン値に戻った。

対照的に、ＲｅｏＰｒｏ（登録商標）は、投与の１時間後に出血時間を有意に延長した（ベースライン値より１０．７倍長い）（図１１）。出血時間の延長は、時間に依存してあまり目立たなくなった。

これらの結果は、血小板凝集に対するＯＭ２ Ｆａｂフラグメントの阻害の半減期が、ＲｅｏＰｒｏ（登録商標）のものよりも長いことを示す。さらに、これらの結果は、ＯＭ２ Ｆａｂフラグメントのリスク／便益比がＲｅｏＰｒｏ（登録商標）のものよりも優れることも示す。

（実施例８）
ラットにおけるｅｘ ｖｉｖｏコラーゲン誘発血小板凝集、出血時間及び血小板数に対するＯＭ４ Ｆａｂフラグメントの影響
ＯＭ４ Ｆａｂフラグメントを、ラットにおけるｅｘ ｖｉｖｏコラーゲン誘発血小板凝集、尾部及び爪出血時間についてさらに試験した。比較のために、ヒト血小板糖タンパク質複合体ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに対して産生された樹立マウス抗体に由来する７Ｅ３ Ｆ（ａｂ’）_２（ＣｏｌｌａｒらＪ．Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．７２：３２５〜３３８，１９８３）を、同様の方法で試験した。７Ｅ３ ＩｇＧを、ＡＴＣＣから得た７Ｅ３ハイブリドーマを用いる大量培養から得た。Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントを、ＣｏｌｌａｒらＪ．Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．７２：３２５〜３３８，１９８３に記載のようにして調製した。ラットを用いた予備実験では、ＯＭ４ Ｆａｂ及び７Ｅ３ Ｆ（ａｂ’）_２の最適用量は、それぞれ２０及び１０ｍｇ／ｋｇと決定された。ｅｘ ｖｉｖｏコラーゲン誘発血小板凝集は、ＯＭ４ Ｆａｂにより３０分間阻害されたままであり、その後、阻害は６０〜９０分で逆になったが、このことは、ラットにおいてＯＭ４ Ｆａｂのクリアランスが早いことを示唆する。全ての観察は、媒体、試験抗体及び参照抗体の投与の２０分後に行った。

成体の雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに、ケタミン／キシラジンで麻酔をかけた。薬剤投与、血圧／心拍数の記録及び血液採取のために、それぞれ大腿静脈、大腿動脈及び頚動脈にヘパリン充填カテーテルを挿入した。平衡化期間の後に、少量の血液（約１．２ｍＬ、１０Ｕ／ｍＬのヘパリンで抗凝固）を、血小板数のために頚動脈から採取した。１μｇ／ｍＬコラーゲンにより惹起した血小板凝集の程度を、全血凝集測定装置（Ｃｈｒｏｎｏ−ｌｏｇ，Ｈａｖｅｒｔｏｗｎ，ＰＡ）を用いて測定した。爪出血時間も、このときに、後肢のつま先の爪の１つを爪髄（ｎａｉｌ ｐｕｌｐ）を横切開する点で切り、爪の切断表面に接触しないようにして、血液を１５秒ごとに一片のろ紙に吸収することにより測定した。爪出血時間は、爪の切断からろ紙に血液が吸収されなくなる時点までの間に経過した時間として規定した。

媒体、ＯＭ４ Ｆａｂ又は７Ｅ３ Ｆ（ａｂ’）_２組成物を、大腿静脈に投与した。２０分で、２回目の血液試料を、上記のような凝集測定法及び血小板数測定のために採取した。最後の試料の採取の直後に、爪及び尾部出血時間を測定した。尾部出血時間は、鋭利なメスを用いて尾部の末端３ｍｍを除去し、末端２〜３ｃｍの尾部を３７℃の生理食塩水に浸漬することにより測定した。尾部出血時間は、尾部の切断から尾部の切断表面から血液が出なくなる時点までの間に経過した時間として規定した。各群（媒体、ＯＭ４ Ｆａｂ及び７Ｅ３ Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント）について６匹のラットを用いた。

ＯＭ４ Ｆａｂ及び７Ｅ３ Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントは共に、媒体に対して（Ｐ＜０．０５）、抗体フラグメントの投与の２０分後に、統計的に有意な程度の血小板凝集阻害を示した（図１２）。ＯＭ４ Ｆａｂ群において変動が少し大きかったが、阻害は非常に再現性があった。血圧及び体の芯の温度は、媒体、ＯＭ４ Ｆａｂ及び７Ｅ３ Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント化合物の投与によって変わらないままであった。

爪出血時間は、７Ｅ３ Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントの投与により劇的に延長されたが、ＯＭ４ Ｆａｂの投与は、試験した６匹の動物のうち４匹に影響を与えなかった（図１３Ａ）。２匹の動物において、爪出血時間は、ＯＭ４ Ｆａｂの投与により、２６及び３１分に延長された。これに対して、７Ｅ３ Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントは、１匹を除いて全ての場合において爪出血時間を３０分を超えるまで延長させ、この１匹では、爪出血は１８分で停止した（図１３Ａ）。７Ｅ３ Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントを投与された動物の平均爪出血時間は、スチューデントのｔ検定により示されるように、ＯＭ４ Ｆａｂ及び媒体よりも有意に長かった。ＯＭ４ Ｆａｂは、媒体と比較したときに、爪出血時間の有意な延長を誘導しなかった。

爪出血時間と同様に、７Ｅ３ Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントの投与により、全ての動物において尾部出血時間が劇的に延長されたが、ＯＭ４ Ｆａｂの投与は試験した６匹の動物のうち４匹で影響を示さなかった（図１３Ｂ）。２匹の動物において、尾部出血時間は２６及び＞３０分に延長された。これに対して、７Ｅ３ Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントは、全ての場合において尾部出血時間を３０分を超えるまで延長した（図１３Ｂ）。血小板数については、媒体、ＯＭ４ Ｆａｂ及び７Ｅ３ Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントの静脈内投与の有意な効果は示さなかった（図１４）。

この試験から得られたデータは、ＯＭ４ Ｆａｂ（２０ｍｇ／ｋｇ）及び７Ｅ３ Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント（１０ｍｇ／ｋｇ）が、コラーゲン誘発血小板凝集の同程度の阻害を惹起するが、７Ｅ３ Ｆ（ａｂ’）_２は、出血時間を有意に延長することを示す。出血時間にあまり影響を与えずに血小板機能を阻害するＯＭ４ Ｆａｂの能力は、これが治療的に有益であることを示唆する。ＯＭ４ Ｆａｂは、否定的な出血の副作用を示さずに、現在利用可能な血小板阻害剤と同様の有望な利益をもたらし得る。

（実施例９）
ラット動脈血栓症モデルでのＯＭ４ Ｆａｂフラグメントの影響
ＯＭ４ Ｆａｂフラグメントの影響を、ラットのｉｎ ｖｉｖｏ動脈血栓症モデルにおいても試験した。文献においてｉｎ ｖｉｖｏ血栓症の種々のモデルが報告されているが、Ｆｏｌｔｓ（例えばＣｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ８３（６補）：ＩＶ ３〜１４，１９９１を参照されたい）により開発されたモデルは、抗血栓剤の効能を試験するために広く用いられている。この元来のモデルは、イヌ冠状動脈において開発されたが、この試験においては、ラット頚動脈についての試験のためにこのモデルを改変した。簡単に説明すると、頚動脈を機械的に損傷し、その後、狭窄した。血管損傷及び血管の狭小化の組み合わせ（２つの条件は、血栓症の病原、すなわち動脈硬化及び狭窄を模倣する）は、血栓形成をもたらす。次いで、血管閉塞物をそれぞれ回収して置換することにより、血栓を機械的に除去して再構築できる。このことにより、以下でより詳細に論じる周期的流量減少（ｃｙｃｌｉｃ ｆｌｏｗ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ；ＣＦＲ）を起こす。抗血栓剤は、ＣＦＲの数を減少させるか、又はＣＦＲの形成を完全に防止し得る。

ラットにペントバルビタールを用いて麻酔をかけ（５０ｍｇ／ｋｇ，ｉ．ｐ．）、気管の挿管により機械的に人工呼吸させた。大腿静脈のセグメントを切開し、薬剤注入に用いた。頚動脈を、腹部頚部領域の正中線の切開により露出させ、結合組織を外して切開した。小さい流量プローブ（Ｔｒａｎｓｏｎｉｃ，１ＲＢ，Ｔｒａｎｓｏｎｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，Ｉｔｈａｃａ，ＮＹ）を動脈の末端において血流を測定した。２つの条件を適用することにより血栓症を誘発した。まず、一方のつめを閉じた持針器を用いて１０秒ずつ、動脈の中央露出部の３連交叉金具により、損傷を誘導した。次に、損傷部位に置かれたＣ形のバルーンからなる静脈閉塞物（１．５ｍｍ内径，Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｍｅｔｒｉｃ，Ｈｅａｌｄｓｂｕｒｇ，ＣＡ）を膨張させることにより、ベースラインの血液流量の５０％減少を適用した。血液流量は、血栓の形成により、約２〜５分のうちに０まで徐々に減少させた。バルーンを収縮させることにより、血栓を物理的に除去し、血液流量を直ちに回復させた。５０％血液流量減少の後に血液流量が０に減少したとき、及び血液流量が回復したときに、１のＣＦＲを計測した。５０％流量減少を再び適用した後に、血液流量は再び徐々に減少し、新しい血栓が形成されるにつれて次のＣＦＲをもたらした。３０分間の観察期間の間に、ＣＦＲの数を計数した。この数は、半分のサイクルまで回った。

損傷前の群において、生理食塩水又は２０ｍｇ／ｋｇのＯＭ４ Ｆａｂフラグメントのいずれかを、機械的損傷を与える２分前に静脈内ボーラス注射により与えた。次いで、ＣＦＲを３０分間記録した。

損傷後の群において、ＣＦＲは、内皮損傷及び流量５０％減少により開始した。ＣＦＲを１５分間観察し、その後、媒体又は２０ｍｇ／ｋｇのＯＭ４ Ｆａｂフラグメントの静脈内ボーラス注射を行った。次いで、ＣＦＲを３０分間記録した。

独立ｔ検定を用いて、生理食塩水の群及びＯＭ処理前群又はＯＭ処理後群におけるＣＦＲの数を比較した。Ｐ＜０．０５を有意とみなした。

損傷前群：機械的損傷前に２０ｍｇ／ｋｇで注射したＯＭ４ Ｆａｂフラグメントは、ＣＦＲの数を１０．５±４．１（平均値±ＳＤ）から４．１±５．２に減少させた（図１５Ａ）。この減少は、統計的に有意であった（ｐ＜０．０２、ｔ検定）。

損傷後群：ＣＦＲを確立した後に２０ｍｇ／ｋｇで注射したＯＭ４ Ｆａｂフラグメントも、ＣＦＲの数を１２．２±３．８から３．５±３．６に減少させた（図１５Ｂ）。この減少も、統計的に有意であった（ｐ＜０．００３、ｔ検定）。この結果は、ＯＭ４ Ｆａｂフラグメントは、血小板と内皮下コラーゲンとの間の相互作用が開始された後であっても、血栓形成を阻害できることを証明する。さらに、これらの結果は、抗ＧＰＶＩ抗体が、臨床状況において血栓性疾患を引き起こすとされている内皮損傷／血液流量撹乱により誘導されるｉｎ ｖｉｖｏ動脈血栓症形成を強力に阻害できることを示唆する。

（実施例１０）
ＧＰＶＩの占有率とコラーゲン誘発血小板凝集の阻害との関係
血小板表面上のＧＰＶＩ占有率と、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのヒト血小板におけるビオチン化ＯＭ２ Ｆａｂフラグメントによるコラーゲン誘発血小板凝集に対する阻害効果との関係を調べた。

ＯＭ２ Ｆａｂフラグメントを、Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてビオチン化した。ビオチン溶液（１５０μＬ，蒸留水中に１０ｍｇ／ｍＬ）を、Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）中のＯＭ２ Ｆａｂフラグメント溶液（５ｍｇ，２ｍｇ／ｍＬ）に加えた。反応チューブを氷上で２時間インキュベートした。遊離のビオチンを除去するために、反応混合物を、生理食塩水に対して冷室で一晩透析した。

血液を、１／１０容量の３．８％クエン酸三ナトリウム抗凝固剤中に３人の健康なドナーから採取し、多血小板血漿を、室温にて１８０×ｇで１５分の遠心分離により得た。血小板を計数し、貧血小板血漿を用いて３×１０^８血小板／ｍＬに調整した。凝集の測定を、採血から４時間以内に行った。凝集試験は、ＡＧ１０凝集測定装置（Ｋｏｗａ，Ｊａｐａｎ）にて行った。多血小板血漿を、ビオチン化ＯＭ２ Ｆａｂフラグメント（０、０．１、０．３、０．５、０．７、１、３、１０及び２０μｇ／ｍＬ）と３７℃で１０分間インキュベートし、その後、コラーゲンを加えて、凝集をさらに５〜１０分間監視した。７０〜９０％の凝集を誘導するのに必要なコラーゲンの用量は、抗体の評価の前に各ドナーについて決定した。

多血小板血漿（３×１０^８血小板／ｍＬ、各４００μＬ）を、ビオチン化ＯＭ２ Ｆａｂフラグメント（０、０．１、０．３、０．５、０．７、１、３、１０及び２０μｇ／ｍＬ）と室温で１０分間インキュベートした。次いで、洗浄した血小板を次のようにして調製した。多血小板血漿に１μｇ／ｍＬのＰＧＥ_１、１ｍＭ ＥＤＴＡ及びＥＧＴＡを補い、２０００×ｇで１０分間遠心分離した。血漿を捨てた後に、血小板のペレットをペレット洗浄緩衝液（ＰＷＢ：１ｍＭ ＥＤＴＡ及びＥＧＴＡ、０．１％ＮａＮ_３、１００ｎｇ／ｍＬ ＰＧＥ_１及び０．３５％ＢＳＡを補ったリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）に懸濁した。次いで、血小板を遠心分離して再び洗浄した。洗浄した血小板を少量のＰＷＢに懸濁し、血小板を計数した。最後に、洗浄した血小板（１×１０^８血小板／ｍＬ）を、等容量の１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００含有リン酸緩衝生理食塩水と混合することにより可溶化した。

ビオチン化ＯＭ２ Ｆａｂフラグメントを、捕捉試薬としてストレプトアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ，２１１２５）を、及び検出試薬としてヤギ抗マウスＩｇＧ抗体−ＨＲＰ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｑｕａｌｅｘ，Ａ１０６ＰＵ）を用いるＥＬＩＳＡ法により定量した。

３人全てのドナーにおいて、コラーゲン誘発血小板凝集は、３μｇ／ｍＬの濃度でのビオチン化ＯＭ２ Ｆａｂフラグメントにより、７５％を超えて阻害された。

占有率アッセイにおいて、占有率は、２０μｇ／ｍＬのビオチン化ＯＭ２ Ｆａｂフラグメントで１００％であると見積もられた（結合した量：２６．４±５．５ｎｇ／５×１０^７血小板）。図１６に示すように、結合したＯＭ２ Ｆａｂフラグメントは３μｇ／ｍＬで飽和した（２４．３±３．５ｎｇ／５×１０^７血小板）。３μｇ／ｍＬのビオチン化ＯＭ２ Ｆａｂフラグメントの占有率は、９２％であった。この結果は、血小板表面で９０％を超えるＧＰＶＩの占有率が、コラーゲン誘発血小板凝集に対して最大限の阻害効果を発揮するのに必要であることを示唆する。

結論として、本発明のＧＰＶＩ特異的抗体は、有用な抗血栓剤となり得る。上記で証明されたように、ＧＰＶＩ特異的抗体は、コラーゲンにより誘発される血小板機能の強力な阻害剤である。

（実施例１１）
組換え可溶性ＧＰＶＩの調製
ＧＰＶＩの外部ドメインからなる組換え可溶性ＧＰＶＩポリぺプチドを、生体試料中のシェディングした可溶性ＧＰＶＩを検出、定量するためのＥＬＩＳＡ用の標準タンパク質として産生した。

ヒトＧＰＶＩ（アミノ酸残基２２〜２１９）の外部ドメインをコードするＤＮＡ配列を標準的なＰＣＲ操作により増幅した。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩ及びＮｏｔｌ制限酵素により消化し、ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔｌの部位からプラスミドｐＥＦ１／ＳｅｃＴａｇＡ／Ｖ５ＨｉｓＡ中に挿入した。このベクターは、挿入ＤＮＡ配列によりコードされたポリぺプチドのＮ末端に融合したＩｇκ軽鎖のシグナルぺプチド、及びそのＣ末端に融合したＶ５及びＨｉｓｘ６ぺプチドをコードする。図１７Ａは、Ｎ末端にＩｇシグナルぺプチド、続いてＧＰＶＩ外部ドメインの２つの免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン、さらにＣ末端にＶ５及びＨｉｓｘ６のぺプチドタグを含む、生成可溶性ＧＰＶＩポリぺプチドの構造を示す。

得られたプラスミドは、製造業者による記載に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＣＨＯ−Ｋ１細胞中にトランスフェクトした。トランスフェクトＣＨＯ細胞は、限界希釈によりクローン化し、個々のＧ４１８抵抗性クローンを選択マーカーＧ４１８の存在下で増殖させた。個々の細胞クローンの培養媒体中で分泌された可溶性ＧＰＶＩ量を、サンドイッチＥＬＩＳＡ（実施例１２参照）を用いて比較した。最大量の可溶性ＧＰＶＩを産生するクローンをさらなる使用のために選択した。選択された可溶性ＧＰＶＩ発現ＣＨＯ細胞は、２．０〜２．５％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）及び１００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）媒体中で、３７℃、５％ＣＯ_２含有雰囲気中、ローラーボトルにおいて培養した。

該細胞が集密に達したとき、培養上清を採集した。培養上清を４℃、１５０００×ｇで４５分間遠心分離し、細胞及び細胞残屑を除去した。澄明化した上清をＡｍｉｃｏｎ ＹＭ１０フィルター−アセンブリ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて２０倍に濃縮した。次に、組換え可溶性ＧＰＶＩを抗ＧＰＶＩ抗体（ＯＭ１）結合セファロース（商標）を用いるアフィニティクロマトグラフィーにより精製した。Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ製のＨｉＴｒａｐ（商標）ＮＨＳ活性化ＨＰカラムを用いて、製造業者の使用説明書に従ってセファロース（商標）ビーズにＯＭ１ＩｇＧを結合させた。濃縮上清をＰＢＳで平衡化させたＯＭ１結合セファロース（商標）カラム上に載せた。低親和性の結合性タンパク質を除くため、洗浄液のＯＤ２８０ｎｍがベースライン（＜０．０１）まで戻るまで、ＰＢＳでカラムを十分に洗浄した。カラム結合可溶性ＧＰＶＩは、ＰＢＳ中の３ＭのＫＳＣＮで溶出した。タンパク質を含有する画分（ＯＤ２８０ｎｍの測定により評価した）をプールし、ＰＢＳ中で透析し、濃縮し、−２０℃で保管した。可溶性ＧＰＶＩの純度及び分子量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価した。

図１７Ｂは、左のレーンに分子量マーカー及び右のレーンに組換え可溶性ＧＰＶＩを有するクーマシー染色ＳＤＳポリアクリルアミドゲルを示す。マーカータンパク質の分子量が示されている（ｋＤａ単位）。有意な汚染性ポリペプチドがないことから明らかなように、組換え可溶性ＧＰＶＩは実質的に純粋であり、還元性条件下で４０ｋＤａの見掛け分子量を有する。可溶性ＧＰＶＩが真正であることは、ウェスタンブロットとＥＬＩＳＡアッセイにおいてビオチニル化したコンバルキシン、ＯＭ１及びＯＭ２のＩｇＧとの反応性を示すことにより確認された。さらに、Ｈｉｓｘ６及びＶ５ペプチドタグの存在が、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて抗Ｈｉｓ及び抗Ｖ５モノクローナル抗体との反応性を示すことにより確認された。これらの結果は、高度に精製された組換え可溶性ＧＰＶＩ製剤が得られ、可溶性ＧＰＶＩ特異的ＥＬＩＳＡ用の標準タンパク質を含め、種々の用途に用いることができることを示す。

（実施例１２）
生体試料中の可溶性ＧＰＶＩ測定用の高感度ＥＬＩＳＡ。
生体試料中で生成する可溶性ＧＰＶＩの高感度に検出及び定量する方法を開発した。この方法は、例えば、急性若しくは慢性の血栓症又は他の血管疾患を有する患者から得られる血液試料中の可溶性ＧＰＶＩ量の観察に有用である。

この実施例は、サンドイッチＥＬＩＳＡを提供する。すなわち、捕捉ＧＰＶＩ特異抗体（ＯＭ１）をプラスチックウェル等の固相支持体上に固定化した。ウェルを非特異タンパク質によりブロックした後、可溶性ＧＰＶＩを加えた。次に、非競合の標識ＧＰＶＩ特異抗体（ビオチニル化ＯＭ２Ｆａｂ）を加え、捕捉された可溶性ＧＰＶＩをストレプトアビジンに複合化したホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）により検出及び定量した。図１８はこのサンドイッチＥＬＩＳＡの基本的な特性を示す。図１８Ａは、モノクローナルＧＰＶＩ特異抗体ＯＭ１、ＯＭ２、ＯＭ３及びＯＭ４により認識されたＧＰＶＩエピトープの重複の有無を示す。ＯＭ１及びＯＭ２抗体は非重複エピトープを認識し、したがってＧＰＶＩへの結合に対して互いに競合しない。図１８ＢはＥＬＩＳＡによる可溶性ＧＰＶＩの捕捉及び検出の原理を示す。

ＯＭ１及びＯＭ２ＩｇＧを生成するハイブリドーマを、５％ウシ胎児血清（無視し得る量のウシＩｇＧ＜１μｇ／ｍｌを含む）を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中、３７℃、ローラーボトル中で増殖させた。細胞の増殖が至適密度に達し次第、細胞を３５００×ｇ、３０分間の遠心分離により除き、得られた上清をさらに０．２μｍのフィルターを通すろ過により澄明化した。ろ過した上清をＷａｔｅｒｓ６５０タンパク質分離システムを用い、流速５〜６ｍｌ／分でＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上に入れた。洗浄液のＯＤ２８０ｎｍがベースライン（＜０．０１）に戻るまでカラムを十分に洗浄した。結合したＩｇＧを低ｐＨのグリシン−ＨＣＬ緩衝液（ｐＨ２．７５）を用い、カラムから直接１／１０容量の１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０中に溶出した。タンパク質を含有する画分（ＯＤ２８０ｎｍの測定により評価した）をプールし、濃縮し生理食塩水に対し十分に透析した。各ＩｇＧの純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価したところ、８８から９２％の範囲であった。

ＯＭ２モノクローナル抗体のＦａｂフラグメントをパパイン消化により調製した。１００ｍＭのクエン酸、ｐＨ６．５中のＯＭ２ ＩｇＧ（５ｍｇ／ｍｌ）、及び５．０ｍＭのＥＤＴＡを含み、システイン（１０ｍＭ）により補助された溶液をパパイン（Ｓｉｇｍａ；２８ｍｇ／ｍｌストック）により、酵素：ＩｇＧ比１：１００（ｗ／ｗ）で３７℃で３時間消化した。消化は新たに調製されたヨードアセトアミド（最終濃度３０ｍＭ）により停止し、ＦａｂフラグメントをＭｏｎｏＱカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）のイオン交換クロマトグラフィーにより未消化のＩｇＧ及びＦｃフラグメントから分離した。Ｆａｂ含有画分をプールし、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）のサイズ排除クロマトグラフィーにより濃縮及び精製して均質にした。Ｆａｂフラグメントを等張生理食塩水（０．９％）に対して十分に透析し、ＰＭ１０フィルターを有するＡｍｉｃｏｎ濃縮ろ過ユニットを用い、１０ｍｇ／ｍｌに濃縮し、０．２２μｍのフィルターを通してろ過し、４℃で保管した。ＯＭ２Ｆａｂ製剤の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価したところ、９５から９８％の範囲であった。

供給元（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）から提供された使用説明書に基づき、ＯＭ２ ＦａｂをＮＨＳ−ビオチンを用いてビオチニル化した。すなわち、ＯＭ２ Ｆａｂ（１〜５ｍｇ／ｍｌ）を１００ｍＭ炭酸塩／３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０に対して透析した。ＮＨＳ−ビオチン溶液を加え（ＩｇＧ：ＮＨＳ−ビオチン比が１：１０（ｍｏｌ／ｍｏｌ））、混合物を１から３時間室温でインキュベートした。結合反応は１／１０容量の１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０を加えることにより終結させ、反応混合物をＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対して十分に透析し、遊離のビオチンを除去した。ビオチニル化ＯＭ２ Ｆａｂを少量単位で４℃で保管した。

９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｍｅｘｉｓｏｒｂ，Ｎｕｎｃ）を各ウェルに１００μｌのＩｇＧ溶液（ＰＢＳ中の１μｇ／ｍｌのＩｇＧ／０．０５％のアジド）を添加し、混合物を４℃で一晩インキュベートすることによりＯＭ１ ＩｇＧで被覆した。ＩｇＧ溶液を除去し、ウェルをＰＢＳＴ（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）で洗浄し、未占有部位を３００μｌのブロック緩衝液（例えば、ＰＢＳ／５％ソルビトール／１％ＢＳＡ／０．１％アジド）により室温で１〜２時間又は４℃で一晩ブロックした。可溶性ＧＰＶＩ測定開始前にウェルをＰＢＳＴで１度すすいだ。１００μｌの適当に希釈した試験試料（血漿）又は標準（組換え可溶性ＧＰＶＩ）をウェルに加え、室温で１〜２時間又は４℃で一晩インキュベートし、ウェルに固定化したＯＭ１捕捉抗体により血漿可溶性ＧＰＶＩ又は組換え可溶性ＧＰＶＩを捕捉した。ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄した後、各ウェルにビオチニル化ＯＭ２ Ｆａｂ（１００μｌの０．１μｇ／ｍｌ溶液）を加え、室温で１時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄し、未結合のビオチニル化ＯＭ２ Ｆａｂを除去した。ストレプトアビジン−ＨＲＰ（１００μｌ／ウェルの１：６０００希釈液；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を各ウェルに加え、室温で３０分間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで３回すすいだ後、１００μｌの基質溶液（Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ，ＫＰＬ）を各ウェルに加えた。室温で１０分間インキュベートした後、酵素反応を停止液（５０μｌ／ウェルの１ＭＨ_２ＳＯ_４）を加えることにより終結させた。酵素反応から得られる発色強度をプレートリーダー（Ｐｏｗｅｒ ｗａｖｅ ＨＴ；ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）により４５０ｎｍの波長で測定した。

図１９はＥＬＩＳＡにより得られた結果の一例を示す。増大する濃度の組換え可溶性ＧＰＶＩ（実施例１１参照）をウェルに加え（０．１ｎｇ／ｍｌから５．０ｎｇ／ｍｌの範囲内）、上記のようにして検出した。得られた曲線は、開発されたＥＬＩＳＡが生体試料中の０．２ｎｇ／ｍｌの低濃度の可溶性ＧＰＶＩ及び２．５ｎｇ／ｍｌの高濃度の可溶性ＧＰＶＩを確実に測定できることを示す。健常なヒトボランティアにおいて、可溶性ＧＰＶＩの血漿濃度は平均して約６ｎｇ／ｍｌであった。したがって、これらの結果は、本発明のＥＬＩＳＡが健常なヒト個体の血漿中の可溶性ＧＰＶＩレベル又は高められた可溶性ＧＰＶＩシェディングに関連した病態を有する患者の血漿中の可溶性ＧＰＶＩレベルを検出及び定量するのに十分に高感度であることを示す。

（実施例１３）
ヒト血小板からの可溶性ＧＰＶＩの時間に依存した及びアゴニストに誘発されたＧＰＶＩシェディングの観察
ヒト血小板からのアゴニスト誘発可溶性ＧＰＶＩのシェディングのメカニズム及び経過を、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイシステムを用いて検討した。可溶性ＧＰＶＩシェディングにおけるＧＰＶＩ特異的及び非ＧＰＶＩ特異的アゴニストの効果を比較した。

健常ドナーから誘導されるヒトの多血小板血漿を、血小板アゴニストＡＤＰ、トロンビンレセプター活性化ぺプチド（ＴＲＡＰ）、コラーゲン、コラーゲン関連ぺプチド（ＣＲＰ）及びコンバルキシン（ガラガラヘビの毒液タンパク質）の最適な投与量（約９０％の血小板凝集を生成する）により処置し、血小板凝集及び可溶性ＧＰＶＩのシェディングを誘発した。コラーゲン、ＣＲＰ及びコンバルキシンがそれらのＧＰＶＩとの相互作用により血小板を主に活性化させ、それによりＧＰＶＩ特異的アゴニストと称呼される。一方、ＡＤＰ及びＴＲＡＰは異なるレセプターを利用して血小板を活性化し、それにより非ＧＰＶＩ特異的アゴニストと称呼される。Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．９６：１７６〜１７５（２００６）。試験アゴニストにより１０分以内に誘発される最大血小板凝集及び２時間にわたるアゴニスト誘発可溶性ＧＰＶＩシェディングを測定するために、実験を計画した。実験計画を図２０に示す。

アゴニストの調製
ＡＤＰ及びＴＲＡＰ（ＳＦＬＬＲＮ−ＮＨ_２）をＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙから粉末として購入した。ＡＤＰを１０ｍＭの濃度で生理食塩水中に溶解し、少量単位で−２０℃で保管した。ＡＤＰ溶液の使用濃度は、使用当日に生理食塩水中に調整し、氷上に保持した。未使用のＡＤＰはその日の終わりに廃棄した。

ＴＲＡＰ（１０ｍＭ）の原液は希酢酸（５ｍＭ）中で調製し、少量単位で−２０℃で保管した。使用当日に、原液を希酢酸で所望の濃度に希釈し、希釈したＴＲＡＰ溶液を氷上に保持した。２〜３日以内に使用する場合、ＴＲＡＰの希釈した使用溶液は４℃で保管するか、さもなければ廃棄した。

酸不溶性タイプ１ウマコラーゲンであって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｅｘ ｖｉｖｏのコラーゲン誘発血小板凝集実験を遂行するために最も一般に使用されるコラーゲンをＮｙｃｏｍｅｄから１ｍｇ／ｍｌで購入した。使用前に、原液を製造元から供給された緩衝液で１００から２００μｇ／ｍｌに希釈した。希釈溶液は４℃で保管した。

ＣＲＰ、繰り返されたＧＰＯ（グリシン、プロリン及びヒドロキシプロリン）配列を含有する４０−ｍｅｒペプチドは、Ｄｒ．Ｍｉｃｈｉｎｏｒｉ Ｔａｎａｋａ、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｏｔｓｕｋａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．により合成して頂いた。ＣＲＰ単量体はＭｏｒｔｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３０６：３３７〜３４４（１９９５）において記載された方法により、ＥＭグレードグルタルアルデヒド（０．２５％）を用い、４℃で２から３時間架橋することにより重合した。このＣＲＰ調製物は、３１．２５〜６２ｎｇ／ｍｌでヒト及びサルの血小板の最大凝集（７０〜９０％）を誘発した。ＣＲＰはＰＢＳ中１ｍｇ／ｍｌで４℃で保管した。ＣＲＰの非常に希釈した使用溶液は、その日の終わりに廃棄した。

コンバルキシンは、熱帯ガラガラヘビの凍結乾燥した毒液（Ｃｒｏｔａｌｕｓ ｄｕｒｉｓｓｕｓ ｔｅｒｒｉｆｉｃｕｓ；Ｓｏｅｒｅｎｓｅｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｒａｚｉｌ）からＰｏｌｇａｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１３５７６〜８３（１９９７）に記載のサイズ排除クロマトグラフィーにより調製した。精製したコンバルキシンはコラーゲン希釈緩衝液（５ｍＭ酢酸／１４５ｍＭ ＮａＣｌ／５ｍＭグルコースｐＨ３．０）中、４℃で保管した。コンバルキシン調製物は、１０〜２０ｎｇ／ｍｌでヒト及びサルの血小板の最大凝集（７０〜９０％）を常に誘発した。

実験操作の間、アゴニストの全ての使用溶液は氷上で保持した。

試料の調製及び実験の実施
アゴニスト誘発血小板凝集に悪影響を与えるいかなる薬物も摂取していない３人の健康なボランティアのドナーから血液を集めた。ドナーの一人は、２つの別の場合において血液を２回提供した。２シリンジ法を用い、抗凝固剤として１／１０容量の３．８％のクエン酸三ナトリウム中に血液を採取した。多血小板血漿を１８０×ｇで室温で２０分間遠心分離することにより得た。血小板の数を計測し、血小板の乏しい血漿を用いて３×１０^８個の血小板／ｍｌに調整した。全ての実験は血液採取後４時間以内に行った。凝集研究はＡＧ１０血小板凝集計（Ｋｏｗａ、Ｊａｐａｎ）において行った。試験アゴニストにより試みる前に、凝集計内で多血小板血漿を３７℃で１〜２分間攪拌した（１１００ｒｐｍ）。凝集が１０分間続いた。次いで凝集管を取り除き、攪拌しながら３７℃に維持した。所望の時間間隔（アゴニスト添加後０、１０、３０、６０、及び１２０分）で試料を管から取り出し、１４０００ｇで５分間回転させて血小板を含まない上清を得、１０００００ｇで２時間回転させて血小板活性化の間に形成されるマイクロパーティクルも含まない、血小板を含まない上清を得た。得られた上清は、実施例１２に記載されたサンドイッチＥＬＩＳＡ法による可溶性ＧＰＶＩの定量まで−２０℃で保管した。

実験結果
全てのアゴニストは、時間に依存する可溶性ＧＰＶＩシェディングを誘発した。しかし、ＧＰＶＩ特異的アゴニスト（すなわち、コラーゲン、ＣＲＰ及びコンバルキシン）は、非ＧＰＶＩ特異的アゴニスト（すなわち、ＡＤＰ及びＴＲＡＰ）に比べ、顕著により多くの可溶性ＧＰＶＩシェディングを確実に誘発した。

図２１はＥＬＩＳＡにより得られたデータを示す。データは、３人のドナーから得られた多血小板血漿により行った４つの実験の平均を示す。それによって、２つの別の場合において血液はドナーの一人から２回採取した。アゴニストに応答する可溶性ＧＰＶＩシェディングの定量は、試験試料のＯＤ４５０ｎｍにおける読み取りとプレートリーダーのソフトウェアにより生成される標準曲線の直線部分との相関に基づいた。エラーバーは標準偏差を反映する。図２１は血小板を含まない上清（血小板凝集除去）並びに血小板−及びマイクロパーティクルを含まない上清（マイクロパーティクル除去）の両方についてのデータを示す。血小板−及びマイクロパーティクルを含まない上清についてのデータ（可溶性ＧＰＶＩ量は時間と共にプロットする）を図２２においても示す。表１２は同じデータを表の形式において提供する。

結果は、ヒト血漿中に存在する可溶性ＧＰＶＩの基礎レベルが約９．５５±２．５２ｎｇ／ｍｌであることを示す（図２１−２２及び表１２；対照）。さらに、この値はいかなるアゴニストも添加されない状態において、２時間の試験期間全体にわたって一定に維持した。したがって、血小板は攪拌条件下でいかなる多量の可溶性ＧＰＶＩも上清血漿中にシェディングさせず、生理食塩水単独では可溶性ＧＰＶＩのシェディングを誘発しない。

しかし、アゴニスト、例えばＡＤＰ、ＴＲＡＰ、コラーゲン、ＣＲＰ及びコンバルキシンの最適投与量により試みると、可溶性ＧＰＶＩのヒト血小板からの経時的のシェディングが観察される。非ＧＰＶＩ特異的アゴニストＡＤＰ（１０μＭ）及びＴＲＡＰ（１５μＭ）は強い血小板凝集を誘発するが、中等度の可溶性ＧＰＶＩのシェディングを誘発するのみであり、２時間の時点で可溶性ＧＰＶＩ ３８〜４０ｎｇ／ｍｌの最大量に到達する（図２１−２２及び表１２；ＡＤＰ及びＴＲＡＰ）。ＧＰＶＩ特異的アゴニストのコラーゲン（２μｇ／ｍｌ）、ＣＲＰ（３１．２５ｎｇ／ｍｌ）及びコンバルキシン（１０ｎｇ／ｍｌ）は同じ時間内に顕著により多くの可溶性ＧＰＶＩのシェディング（６０〜８０ｎｇ／ｍｌ）を誘発した（図２１−２１及び表１２：コラーゲン、ＣＲＰ及びコンバルキシン）。注目すべきは、可溶性ＧＰＶＩのシェディングは沈殿なしに少なくとも２時間継続するスロープロセスに見える。さらに、ＧＰＶＩ特異的アゴニストは非ＧＰＶＩ特異的アゴニストに比べ顕著により多くのシェディングを誘発する。

要約すると、これらの結果は生体試料中の可溶性ＧＰＶＩの生理的量を測定するための本発明のサンドイッチＥＬＩＳＡの有用性を確認する（例えば実施例１２参照）。さらに、結果はＥＬＩＳＡの特異的な用途、すなわち、ＧＰＶＩ特異的アゴニスト、障害された血管系の大部分の血栓を作る成分であるコラーゲンを含む、による血小板の活性化に反応するヒトドナーから誘導された多血小板血漿中の可溶性ＧＰＶＩのシェディングを検出及び定量する用途を示す。本発明はこのように健康な個体若しくは血管疾患を発症する危険性の増大した個体における可溶性ＧＰＶＩ量の予防監視用として、又は血管疾患を有する患者における、例えば治療期間中における可溶性ＧＰＶＩ量の診断監視用として用いることができる。

本明細書は、その全てについて全体が本明細書に参照として組み込まれる、本明細書に引用した参考文献の教示を考慮して最も完全に理解される。本発明のその他の実施形態は、本明細書及び本明細書に開示される本発明の実施を考慮して、当業者には明らかである。本明細書及び実施例は例示に過ぎないとみなし、本発明の真の範囲及び精神は、前記請求の範囲により示すことを意図している。

表１２：ヒト血小板からのアゴニスト誘発、経時的可溶性ＧＰＶＩのシェディング

^＊４つの異なる試料からのＥＬＩＳＡの結果の平均、各２回測定
^＊＊４つの異なる試料からのＥＬＩＳＡの標準偏差、各２回測定

ＧＰＶＩノックアウトマウスの作製の模式図である。図１Ａは、ＧＰＶＩの野生型対立遺伝子、エキソン２及び３での相同組換えのために用いられるターゲティングベクター並びに得られる変異対立遺伝子を示す。図１Ｂは、野生型及び変異のゲノムにおける制限酵素切断に由来する５’及び３’断片のサイズの違いを示す。 ０．１〜１００μｇ／ｍｌでのＯＭ１、ＯＭ２、ＯＭ３及びＯＭ４のＦａｂフラグメントの、静的条件下での原線維コラーゲンへの血小板（ヒト）粘着に対する効果を示す棒グラフである。 ０．００１〜１μｇ／ｍｌでのＯＭ１、ＯＭ２、ＯＭ３及びＯＭ４のＦａｂフラグメントの、静的条件下での原線維コラーゲンへのＭｇ^２＋非依存性（ＧＰＶＩ依存性）ヒト血小板粘着に対する効果を示す棒グラフである。 ＯＭ１、ＯＭ２、ＯＭ及びＯＭ４のＦａｂフラグメント並びにＲｅｏＰｒｏ（登録商標）の、高せん断応力（２６００秒^−１）条件下での酸不溶性コラーゲンへの血小板（ヒト）粘着に対する効果を示す。 ヒト血小板溶解物中のＧＰＶＩと反応する一連のＯＭ抗体（ＯＭ１、ＯＭ２、ＯＭ３及びＯＭ４）及びコンバルキシン（ＣＶＸ）のウェスタンブロットである。 ＧＰＶＩノックアウト動物においてコラーゲン及びコンバルキシンにより誘発される血小板凝集の完全な欠失を示す。 ＧＰＶＩノックアウトマウスからの血小板の、酸不溶性コラーゲンへの高せん断応力条件下での相互作用の欠失を示す。 ＯＭ２ Ｆａｂフラグメント及びＲｅｏＰｒｏ（登録商標）の、カニクイザルにおけるｅｘ ｖｉｖｏコラーゲン誘発血小板凝集への影響を示すグラフである。 ＯＭ２ Ｆａｂフラグメント及びＲｅｏＰｒｏ（登録商標）の、カニクイザルにおける皮膚出血時間に対する影響を示すグラフである。 ＯＭ２ Ｆａｂフラグメント及びＲｅｏＰｒｏ（登録商標）の、カニクイザルにおけるボーラス注射（０．４ｍｇ／ｋｇ）後の時間に対する抗凝集効果を示すグラフである。 ＯＭ２ Ｆａｂフラグメント及びＲｅｏＰｒｏ（登録商標）の、カニクイザルにおけるボーラス注射（０．４ｍｇ／ｋｇ）後の皮膚出血時間に対する時間経過効果を示すグラフである。 ＯＭ４ Ｆａｂ及び７Ｅ３ Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントの、ラットでのｅｘ ｖｉｖｏコラーゲン誘発血小板凝集に対する影響を示す。 ＯＭ４ Ｆａｂ及び７Ｅ３ Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントの、ラットでの出血時間に対する影響を示す。図１３Ａは、爪出血時間への影響を示し、図１３Ｂは、尾部出血時間への影響を示す。 ＯＭ４ Ｆａｂ及び７Ｅ３ Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントの、ラットでの血小板数への影響を示す。 内皮損傷の前（図１５Ａ）及び後（図１５Ｂ）に投与したときの、ＯＭ４ Ｆａｂフラグメントの、ラットでの動脈血栓形成への影響を示す棒グラフである。 ビオチン化ＯＭ２ Ｆａｂフラグメントの、ヒト血小板へのｉｎ ｖｉｔｒｏでの濃度依存性結合を示すグラフである。 組換え可溶性ＧＰＶＩタンパク質の産生及び精製を示す図である。図１７Ａは組換え可溶性ＧＰＶＩの構造を示す図である。図１７ＢはＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中の組換え可溶性ＧＰＶＩを示す図である。 可溶性ＧＰＶＩを検出するためのＥＬＩＳＡの概略図である。図１８ＡはＧＰＶＩ特異抗体ＯＭ１、ＯＭ２、ＯＭ３及びＯＭ４により認識されるエピトープの関係を示す図である。図１８ＢはＥＬＩＳＡシステムの説明図である。 標準タンパク質として精製した組換え可溶性ＧＰＶＩを用いる、ＥＬＩＳＡによる生体試料中の可溶性ＧＰＶＩの定量を示す図である。曲線はＥＬＩＳＡの感度及び範囲を示す。 生体試料中の血小板からシェディングするアゴニスト誘発可溶性ＧＰＶＩの検出方法を示す図である。 ＧＰＶＩ特異的及び非ＧＰＶＩ特異的アゴニストによる血小板活性化に反応して、ヒトドナーからの多血小板血漿中にシェディングした可溶性ＧＰＶＩの検出を示すグラフである。 ＧＰＶＩ特異的及び非ＧＰＶＩ特異的アゴニストで活性化した際の、ヒト血小板からシェディングする可溶性ＧＰＶＩの経過を示す。

Claims (33)

1. 試料中の可溶性血小板膜糖タンパク質ＶＩ（以下、「血小板膜糖タンパク質ＶＩ」を「ＧＰＶＩ」と言い、「可溶性血小板膜糖タンパク質ＶＩ」を「可溶性ＧＰＶＩ」と言う）ポリぺプチド、ぺプチド、又はそれらの天然変異体を検出する方法であって、以下の段階：
   ａ．試料とＧＰＶＩポリぺプチド、ぺプチド、又はそれらの天然変異体に特異的な第１のモノクローナル抗体とを接触させる段階、
   ｂ．試料中のＧＰＶＩポリぺプチド、ぺプチド、又はそれらの天然変異体を第１のモノクローナル抗体により捕捉する段階、
   ｃ．試料とＧＰＶＩポリぺプチド、ぺプチド、又はそれらの天然変異体に特異的な第２のモノクローナル抗体とを接触させる段階、及び
   ｄ．第２のモノクローナル抗体によりＧＰＶＩポリぺプチド、ぺプチド、又はそれらの天然変異体を検出する段階、
   を含み、第１及び第２のモノクローナル抗体がコラーゲン誘発血小板凝集を７μｇ／ｍｌ未満のＩＣ_５０において阻害し、ＧＰＶＩポリぺプチド、ぺプチド、又はそれらの天然変異体に１０^−８Ｍ未満のＫｄにおいて特異的に結合し、
   第１及び第２のモノクローナル抗体が異なる方法。
2. 第１のモノクローナル抗体及び第２のモノクローナル抗体がＯＭ１、ＯＭ２、ＯＭ３及びＯＭ４から選択される、請求項１に記載の方法。
3. 第１のモノクローナル抗体がＯＭ１であり、第２のモノクローナル抗体がＯＭ２である、請求項２に記載の方法。
4. 第１のモノクローナル抗体が固定化されている、請求項１に記載の方法。
5. 第２のモノクローナル抗体が標識されている、請求項１に記載の方法。
6. 前記標識がビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光プローブ、金属錯体及び酵素から選択される、請求項５に記載の方法。
7. 試料が血漿又は血清である、請求項１に記載の方法。
8. 試料中の少なくとも０．２ｎｇ／ｍｌのＧＰＶＩポリぺプチド、ぺプチド、又はそれらの天然変異体を検出することが可能である、請求項１に記載の方法。
9. 試料中の可溶性ＧＰＶＩポリぺプチド、ぺプチド、又はそれらの天然変異体の定量方法であって、以下の段階：
   ａ．試料とＧＰＶＩポリぺプチド、ぺプチド、又はそれらの天然変異体に特異的な第１のモノクローナル抗体とを接触させる段階、
   ｂ．試料中のＧＰＶＩポリぺプチド、ぺプチド、又はそれらの天然変異体を第１のモノクローナル抗体により捕捉する段階、
   ｃ．試料とＧＰＶＩポリぺプチド、ぺプチド、又はそれらの天然変異体に特異的な第２のモノクローナル抗体とを接触させる段階、及び
   ｄ．第２のモノクローナル抗体によりＧＰＶＩポリぺプチド、ぺプチド、又はそれらの天然変異体を定量する段階、
   を含み、第１及び第２のモノクローナル抗体がコラーゲン誘発血小板凝集を７μｇ／ｍｌ未満のＩＣ_５０において阻害し、ＧＰＶＩポリぺプチド、ぺプチド、又はそれらの天然変異体に１０^−８Ｍ未満のＫｄにおいて特異的に結合し、
   第１及び第２のモノクローナル抗体が異なる方法。
10. 試料中の可溶性ＧＰＶＩポリぺプチド、ぺプチド、又はそれらの天然変異体を検出する方法であって、以下の段階：
    ａ．試料とＧＰＶＩポリぺプチド、ぺプチド、又はそれらの天然変異体に特異的な第１のモノクローナル抗体とを接触させる段階、
    ｂ．試料中のＧＰＶＩポリぺプチド、ぺプチド、又はそれらの天然変異体を第１のモノクローナル抗体により捕捉する段階、
    ｃ．試料とＧＰＶＩポリぺプチド、ぺプチド、又はそれらの天然変異体に特異的な第２のモノクローナル抗体とを接触させる段階、及び
    ｄ．第２のモノクローナル抗体によりＧＰＶＩポリぺプチド、ぺプチド、又はそれらの天然変異体を検出する段階、
    を含み、ＧＰＶＩ抗原及びヒト血小板を用いてＧＰＶＩ欠損宿主を免疫する段階において第１及び第２のモノクローナル抗体が産生され、前記ＧＰＶＩ欠損宿主がＧＰＶＩノックアウトマウスであり、エキソン２の最後の５塩基からエキソン３の前半をｐＭＣＩ−ネオポリＡで置き換えＧＰＶＩ遺伝子のゲノムフラグメントとし、前記ＧＰＶＩ抗原はヒトＧＰＶＩ ｃＤＮＡ及びＦｃＲγ鎖のｃＤＮＡ全長と一緒にＣＨＯ細胞中に共トランスフェクトし、第１及び第２のモノクローナル抗体はＧＰＶＩポリぺプチド、ぺプチド、又はそれらの天然変異体に１０^−８Ｍ未満のＫｄにおいて特異的に結合し、並びに第１及び第２のモノクローナル抗体は重複しないエピトープを認識し、ＧＰＶＩポリぺプチド、ぺプチド、又はそれらの天然変異体への結合において互いに競合しない方法。
11. 第１のモノクローナル抗体及び第２のモノクローナル抗体が、ＯＭ１、ＯＭ２、ＯＭ３及びＯＭ４から選択される、請求項９に記載の方法。
12. 第１のモノクローナル抗体がＯＭ１であり、第２のモノクローナル抗体がＯＭ２である、請求項１１に記載の方法。
13. 第１のモノクローナル抗体が固定化されている、請求項９に記載の方法。
14. 第２のモノクローナル抗体が標識されている、請求項９に記載の方法。
15. 前記標識がビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光プローブ、金属錯体及び酵素から選択される、請求項１４に記載の方法。
16. 試料が血漿又は血清である、請求項９に記載の方法。
17. 試料中の少なくとも０．２ｎｇ／ｍｌのＧＰＶＩポリぺプチド、ぺプチド、又はそれらの天然変異体を定量することが可能である、請求項９に記載の方法。
18. ＧＰＶＩポリぺプチド、ぺプチド、又はそれらの天然変異体に特異的な第１及び第２のモノクローナル抗体を含有する、試料中の可溶性ＧＰＶＩポリぺプチド、ぺプチド、又はそれらの天然変異体を検出又は定量するためのアッセイシステムであって、第１及び第２のモノクローナル抗体がコラーゲン誘発血小板凝集を７μｇ／ｍｌ未満のＩＣ_５０において阻害し、ＧＰＶＩポリぺプチド、ぺプチド、又はそれらの天然変異体に１０^−８Ｍ未満のＫｄにおいて特異的に結合し、第１及び第２のモノクローナル抗体が異なるアッセイシステム。
19. 第１のモノクローナル抗体及び第２のモノクローナル抗体が、ＯＭ１、ＯＭ２、ＯＭ３及びＯＭ４から選択される、請求項１８に記載のアッセイシステム。
20. 第１のモノクローナル抗体がＯＭ１であり、第２のモノクローナル抗体がＯＭ２である、請求項１９に記載のアッセイシステム。
21. 第１のモノクローナル抗体が固定化されている、請求項１８に記載のアッセイシステム。
22. 第２のモノクローナル抗体が標識されている、請求項１８に記載のアッセイシステム。
23. 前記標識がビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光プローブ、金属錯体及び酵素から選択される、請求項２２に記載のアッセイシステム。
24. 試料が血漿又は血清である、請求項１８に記載のアッセイシステム。
25. 試料中の少なくとも０．２ｎｇ／ｍｌのＧＰＶＩポリぺプチド、ぺプチド、又はそれらの天然変異体を検出又は定量することが可能である、請求項１８に記載のアッセイシステム。
26. 試料中の可溶性ＧＰＶＩポリぺプチド、ぺプチド、又はそれらの天然変異体を検出するためのアッセイシステムであって、以下の段階：
    ａ．試料とＧＰＶＩポリぺプチド、ぺプチド、又はそれらの天然変異体に特異的な第１のモノクローナル抗体とを接触させる段階、
    ｂ．試料中のＧＰＶＩポリぺプチド、ぺプチド、又はそれらの天然変異体を第１のモノクローナル抗体により捕捉する段階、
    ｃ．試料とＧＰＶＩポリぺプチド、ぺプチド、又はそれらの天然変異体に特異的な第２のモノクローナル抗体とを接触させる段階、及び
    ｄ．第２のモノクローナル抗体によりＧＰＶＩポリぺプチド、ぺプチド、又はそれらの天然変異体を検出する段階、
    を含み、ＧＰＶＩ抗原及びヒト血小板を用いてＧＰＶＩ欠損宿主を免疫する段階において第１及び第２のモノクローナル抗体を製造し、前記ＧＰＶＩ欠損宿主がＧＰＶＩノックアウトマウスであり、エキソン２の最後の５塩基からエキソン３の前半をｐＭＣＩ−ネオポリＡで置き換えＧＰＶＩ遺伝子のゲノムフラグメントとし、前記ＧＰＶＩ抗原はヒトＧＰＶＩｃＤＮＡ及びＦｃＲγ鎖のｃＤＮＡ全長と一緒にＣＨＯ細胞中に共トランスフェクトし、第１及び第２のモノクローナル抗体はＧＰＶＩポリぺプチド、ぺプチド、又はそれらの天然変異体に１０^−８Ｍより低いＫｄにおいて特異的に結合し、並びに第１及び第２のモノクローナル抗体は重複しないエピトープを認識し、ＧＰＶＩポリぺプチド、ぺプチド、又はそれらの天然変異体への結合において互いに競合しないアッセイシステム。
27. 試料中の可溶性ＧＰＶＩポリぺプチド、ぺプチド、又はそれらの天然変異体を検出又は定量するためのキットであって、ＧＰＶＩポリぺプチド、ぺプチド、又はそれらの天然変異体に特異的な第１及び第２のモノクローナル抗体を含有し、第１及び第２のモノクローナル抗体がコラーゲン誘発血小板凝集を７μｇ／ｍｌ未満のＩＣ_５０において阻害し、ＧＰＶＩポリぺプチド、ぺプチド、又はそれらの天然変異体に１０^−８Ｍ未満のＫｄにおいて特異的に結合し、第１及び第２のモノクローナル抗体が異なるキット。
28. 第１のモノクローナル抗体及び第２のモノクローナル抗体が、ＯＭ１、ＯＭ２、ＯＭ３及びＯＭ４から選択される、請求項２７に記載のキット。
29. 第１のモノクローナル抗体がＯＭ１であり、第２のモノクローナル抗体がＯＭ２である、請求項２８に記載のキット。
30. 第１のモノクローナル抗体が固定化されている、請求項２７に記載のキット。
31. 第２のモノクローナル抗体が標識されている、請求項２７に記載のキット。
32. 前記標識がビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光プローブ、金属錯体及び酵素から選択される、請求項３１に記載のキット。
33. 試料中の可溶性ＧＰＶＩポリぺプチド、ぺプチド、又はそれらの天然変異体を検出するためのキットであって、以下の段階：
    ａ．試料とＧＰＶＩポリぺプチド、ぺプチド、又はそれらの天然変異体に特異的な第１のモノクローナル抗体とを接触させる段階、
    ｂ．試料中のＧＰＶＩポリぺプチド、ぺプチド、又はそれらの天然変異体を第１のモノクローナル抗体により捕捉する段階、
    ｃ．試料とＧＰＶＩポリぺプチド、ぺプチド、又はそれらの天然変異体に特異的な第２のモノクローナル抗体とを接触させる段階、及び
    ｄ．第２のモノクローナル抗体によりＧＰＶＩポリぺプチド、ぺプチド、又はそれらの天然変異体を検出する段階、
    を含み、ＧＰＶＩ抗原及びヒト血小板を用いてＧＰＶＩ欠損宿主を免疫する段階において第１及び第２のモノクローナル抗体を製造し、前記ＧＰＶＩ欠損宿主がＧＰＶＩノックアウトマウスであり、エキソン２の最後の５塩基からエキソン３の前半をｐＭＣＩ−ネオポリＡで置き換えＧＰＶＩ遺伝子のゲノムフラグメントとし、前記ＧＰＶＩ抗原はヒトＧＰＶＩｃＤＮＡ及びＦｃＲγ鎖のｃＤＮＡ全長によりＣＨＯ細胞中に共トランスフェクトし、第１及び第２のモノクローナル抗体はＧＰＶＩポリぺプチド、ぺプチド、又はそれらの天然変異体に１０^−８Ｍより低いＫｄにおいて特異的に結合し、並びに第１及び第２のモノクローナル抗体は重複しないエピトープを認識し、ＧＰＶＩポリぺプチド、ぺプチド、又はそれらの天然変異体への結合において互いに競合しないキット。

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