JP2001526774A

JP2001526774A - Ｐ―セレクチンアッセイおよびその使用方法

Info

Publication number: JP2001526774A
Application number: JP52275198A
Authority: JP
Inventors: デイルサンドロ，マーガレット，アール．; フレデリック，バート; ガンブズ，シンディー，アイ．
Original assignee: セントコア，インコーポレイテッド
Priority date: 1996-11-13
Filing date: 1997-11-13
Publication date: 2001-12-18
Also published as: WO1998021591A8; AU5355298A; CA2277094A1; EP0946877A1; WO1998021591A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、個体由来の試料中の膜結合Ｐ−セレクチンおよび／または可溶性Ｐ−セレクチンのレベルをモニターすることにより、血小板の活性化状態に影響を及ぼす「抗血小板」剤の効果を評価する方法に関する。１つの態様において、Ｐ−セレクチンのレベルは、血小板を含有する試料〔例えば、血液試料、血小板高含有血漿（ＰＲＰ）〕において、膜結合Ｐ−セレクチンのアッセイを用いてモニターされる。他の態様において、Ｐ−セレクチンのレベルは、予め血小板を除去されている試料〔例えば、血小板低含有血漿（ＰＰＰ）血清〕において、可溶性Ｐ−セレクチンのアッセイを用いてモニターされる。本発明の他の概念は、膜結合Ｐ−セレクチンおよび可溶性Ｐ−セレクチンの両方を測定して、抗血小板療法を受けた患者の血小板活性化をモニターすることを含む。本方法は、膜結合Ｐ−セレクチンおよび／または可溶性Ｐ−セレクチンのレベルに影響を及ぼす血小板活性化状態に対する抗血小板療法の効果をモニターするのに有用である。抗血小板療法は、血小板活性化の所望レベルを維持するように調整されうる。他の概念において、本発明は、試料中の可溶性Ｐ−セレクチンのレベルを決定する工程を含む、血管介入術、とくに冠動脈介入術が血小板活性化状態に及ぼす影響を評価する方法に関する。抗血小板療法は、基底活性状態または他の所望の血小板活性化状態を達成させるために、開始または調整されうる。

Description

【発明の詳細な説明】Ｐ−セレクチンアッセイおよびその使用方法関連出願本願は、１９９６年１１月１３日出願の米国特許出願第０８/７４８，３８７号明細書の一部継続出願であり、その完全な教示は参照により明細書に取り込まれる。発明の背景血小板は、動脈血栓症や急性虚血性冠動脈症候群において重要な役目を果たしているとされている［ガワズら（Gawaz，M．et al.）、"直接血管形成で試験した急性心筋梗塞における血小板機能"Circulation，93:229-237（1996）；トリップら（Trip，M.D．et al．）、"心筋梗塞の生存者における血小板過敏性および予後"N．Engl．J．Med.，322:1549-1554(1990)；ヒルシュ（Hirsh，J．）、"過敏性血小板および冠動脈疾患の合併症"N．Engl．J．Med.，316:1543-1544(1989) ；フリンクら（Frink，R.J．et al.）、"心筋梗塞に関連する死における冠動脈血栓症および血小板／フィブリン微塞栓"Br．Heart．J.，59:196-200(1988)］。血小板は、トロンビン、内皮下相互作用、人工表面との接触、およびある種の免疫複合体の存在を含む多くの刺激を介して活性化される［ベロンら（Bellon，J. L．et al．）、"人工心臓弁をもつ患者を追跡調査するためのβ−トロンボグロブリンおよび血小板第４因子の測定"Sem．in Thromb．and Hemost.，19(Suppl 1 ):178-182(1993)；シャルフら（Scharf，R.E．et al．）、"血灌流血管形成−傷害冠動脈における血小板活性化：フローサイトメトリー検出"Arteriosclerosis and Thrombosis，12:1475-1487(1992)］。ひとたび活性化された血小板は、膜糖蛋白質ＧＰＩＩｂ/ＩＩＩａ複合体上にフィブリノーゲン結合部位を露出し、フィブリノーゲン架橋を介して血小板凝集が起きる[マックイーバー（McEver，R.P.）、"血小板膜糖蛋白質の臨床的意義"Hematol．Oncol．Clin． North Am.，4:87-103(1990)；ドゥーら（Du，X．et al．）、"リガンド「活性」インテグリンα_IIbβ₃（血小板ＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａ）""Cell，65:409-416(199 1)]。Ｐ−セレクチンはＣＤ６２、ＧＭＰ−１４０またはＰＡＤＧＥＭとして知られ、白血球輸送を調節する接着受容体のセレクチンファミリーの１つである[ローレンスとスプリンガー（Lawrence，M.B．and T.A．Springer）、Cell，65:859（ 1991)；ジョンストンら（Johnston，G.I．et al．）、Cell，56:1033-1044（198 9)；マックイーバー（McEver，R.P.）、米国特許第５，３７８，４６４号明細書 ]。Ｐ−セレクチンは、活性化されていない血小板のα顆粒、および内皮細胞のヴァイベル-パラーデ体に存在する内在性膜糖蛋白質である［ペールシュケ（Pee rschke，E.I.B．）、Am．J．Clin．Pathol.，98:455（1992）；マックイーバー（McEver，R.P.）、1993，"Ｐ−セレクチンを介した白血球相互作用"Structure ，Function and Regulation of Molecules Involved in Leukocyte Adhesion中、リプスキーら（Lipsky，P.E．et al．）編、（Springer Verlag，New York）1 35-150頁］。血小板や内皮がトロンビン、ホルボールエステル、またはＡＤＰを含むアゴニストにより活性化されると、分泌粒子から細胞表面へのＰ−セレクチン転位が起き、その合成はサイトカイン類によっても増大する[ステルンベルグら（Sternberg，P.E．et al.）、1985，"血小板のα顆粒膜蛋白質（ＧＭＰ−１４０）は活性化後の血漿上で発現される"J．Cell Biol.，101:880-886(1985)]。血小板上のＰ−セレクチン発現を最大５０倍に増大させ、血栓形成につながる血小板−白血球（単球、好中球）接着相互作用と内皮細胞−白血球付着相互作用を誘導することができる[ウェンら（Wen，D．et al.）、J．Lab．Clin．Med.，124 :447(1994)；ラーセンら（Larsen，E．et al．）、"ＰＡＤＧＥＭ蛋白質：活性化血小板と好中球および単球との相互作用を仲介するレセプター"Cell，59:305- 312(1989)；ハンブルガーとマックイーバー（Hamburger，S.A．and R. P．McEver）、"ＧＭＰ−１４０は刺激された血小板の好中球への接着を仲介する "Blood，75:550-554(1990)]。α顆粒膜は、表面に結合した小管系の膜と融合し、Ｐ−セレクチンなどの糖蛋白質が特異的抗体により検出されうる表面上に拡散する[ヌルデンら（Nurden，A.T．et al．）、Nouv．Rev．Fr．Hematol.，35:67( 1993)]。Ｐ−セレクチンは、炎症性刺激に反応した白血球の血管内皮および血小板への接着を引き起こすＰ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、およびＬ−セレクチンを含む３種類の構造的に関連した膜糖蛋白質の１つである。各セレクチン分子は、Ｃ型レクチンに特有のＮＨ₂末端炭化水素基認識ドメインと、それに続くＥＧＦ様モチーフと、補体調節蛋白質に含まれるものと類似のコンセンサス反復配列と、膜貫通ドメインと、細胞質テール（cytoplasmic tail）を含んでいる［ウシヤマら（Ushiyama，S．et al．）、J．Biol．Chem.，268:15229(1993)］。Ｐ−セレクチンの場合、これらのドメインはそれぞれ別のエキソンによってコードされている。内皮細胞ライブラリーから得られたクローニングデータから、補体調節蛋白質反復配列の数が異なる２種類と、膜貫通ドメインを欠き可溶性であると予想される３番目のものとの３種類の型のＰ−セレクチンが存在することが示された［ダンロップら（Dunlop，L.C．et al．）、"循環血漿蛋白質としてのＧＭＰ− １４０のキャラクタリゼーション"J．Exp．Med.，175:1147-1150(1992)］。その後、ヒト血小板は、膜貫通ドメインの有無にかかわらず、ほぼ等量のＰ−セレクチンをコードしたｍＲＮＡを含んでいることが判明した［ジョンストンら（John ston，G.I．et al．）、J．Biol．Chem.，265:21381(1990)］。可溶型のＰ−セレクチンが健常ドナーの血漿から単離されている。この精製蛋白質は、血小板膜Ｐ−セレクチンの分子量（３ｋＤ以下、還元状態）とほぼ同じ分子量（非還元状態）を有し、ポリクローナルおよびモノクローナル抗Ｐ−セレクチン抗体によって免疫ブロットされた。分析的ゲル濾過研究で、血漿Ｐ−セレクチンは膜貫通ドメインを欠くモノマーとして溶出されることが示された。固定化血小板と同様にプラスチック結合好中球上に固定化させたところ、精製血漿Ｐ−セレクチンは、膜結合型と同じ好中球受容体に結合した［ダンロップら（Dunlop，L.C．et al ．）、"循環血漿蛋白質としてのＧＭＰ−１４０のキャラクタリゼーション"J．E xp．Med.，175:1147-1150(1992)］。血小板が可溶性Ｐ−セレクチンをコードするｍＲＮＡを含んでいるとすれば、血漿型のＰ−セレクチンは、エキソン１４によってコードされる膜貫通配列を欠く選択的スプライシングされた可溶性Ｐ−セレクチンを含む可能性が高い。しかしながら、膜結合Ｐ−セレクチンのタンパク分解により血漿Ｐ−セレクチンの一部が生じる可能性があることを示唆する証拠がある。例えば、観察されたやや低い分子量は、膜Ｐ−セレクチンのＮ末端またはＣ末端の蛋白質分解によるか、グリコシル化低下などの翻訳後修飾のわずかな違いのいずれかによって、これを説明することができる[チョンら（Chong，B.H ．et al.）、Blood，83:1535(1994)]。したがって、血漿Ｐ−セレクチンは、膜結合Ｐ−セレクチンの蛋白質分解だけでなく、ＲＮＡスプライスバリアントによっても産生される可能性が残る。発明の要旨本発明は、個体由来の試料のＰ−セレクチンのレベルをモニターすることにより、血小板の活性化状態に影響を及ぼす「抗血小板」剤の効果を評価する方法に関する。１つの態様においては、膜結合Ｐ−セレクチンのアッセイを用いて、血小板を含む試料（例えば血液試料、血小板高含有血漿（ＰＲＰ））のＰ−セレクチンのレベルをモニターする。別の態様においては、可溶性Ｐ−セレクチンのアッセイを用いて、予め血小板が除去されている試料［例えば血小板低含有血漿（ＰＰＰ）、血清］のＰ−セレクチンのレベルを測定する。好ましい態様においては、Ｓ１２、Ｗ４０、Ｇ１、およびＶＨ１０を含むモノクローナル抗体などの抗Ｐ−セレクチン抗体（１つ以上の抗体）または同様のエピトープ特異性を有する抗体を用いて、Ｐ−セレクチンを免疫学的に検出する。非蛍光的免疫結合アッセイを用いて膜結合Ｐ−セレクチンを測定することが好ましく、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて可溶性Ｐ−セレクチンを測定することがさらに好ましい。とくに好ましい態様においては、サンドイッチＥＬＩＳＡを用いて可溶性Ｐ−セレクチンを測定する。また、膜結合Ｐ−セレクチンと可溶性Ｐ−セレクチンの両者を、場合によっては同時に測定して、Ｐ−セレクチンのプロフィールを確立することもとくに好ましい。該方法は、膜結合Ｐ−セレクチンおよび／または可溶性Ｐ−セレクチンのレベルに反映される、抗血小板療法が血小板活性化に及ぼす影響をモニターするのに有用である。それゆえに、所望の血小板活性化レベルを維持するように、治療を調整することができる。例えば、膜結合Ｐ−セレクチンおよび／または可溶性Ｐ −セレクチンのレベルを測定することにより、健常者または患者における血小板の基底活性化状態を評価することができ、上記基底活性化状態またはその他の所望の血小板活性化状態を達成するように、療法を調整することができる。本明細書に示すように、経皮的冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）を行ったところ、可溶性Ｐ−セレクチンのレベルの上昇を導いた。また、静脈血栓障害の１つである深部静脈血栓症（ＤＶＴ）の二次診断を有する血管手術後患者においては、術前の可溶性Ｐ−セレクチンのレベルも上昇ならびに血管介入術後の高レベルを示した。したがって、別の概念において、本発明は、とくに冠動脈疾患を有する患者における、（すなわち１つ以上の）血管介入術（例えば心血管介入、冠動脈介入）および冠動脈介入術がとくに血小板活性化状態に及ぼす影響を評価する方法であって、試料の可溶性Ｐ−セレクチンのレベルを測定する工程を含む方法に関する。例えば、血管造影術、血管形成術[例えばバルーン法、冠動脈硬化切除術、レーザー血管形成術、またはその他の適当な方法(ロータブレーション(rotablat ion)および／またはステント留置の有無を問わない)]、冠動脈バイパス手術、ステント留置（例えば冠動脈ステント）、および／またはその他の血管介入術（例えば血管手術、血管移植、末梢ステント配備、人工弁または人工血管挿入術（例えば自己血管移殖術、非自己血管移植術、または人工血管移植術など）が、可溶性Ｐ−セレクチンのレベルによって示される血小板活性化状態に及ぼす影響を評価することができ、基底活性化状態またはその他の所望の内因性血小板活性化状態を達成するように抗血小板療法を維持または調整することができる。同様に、静脈血栓障害とくに深部静脈血栓症を有する患者において、可溶性Ｐ−セレクチンのレベルによって示される血小板活性化状態を評価することができ、血小板活性化を抑えるように抗血小板療法を開始または調整することができる。図面の簡単な説明添付図面に図解されるように、以下の本発明の好ましい態様のさらに詳細な説明により、上記本発明の特徴および利点を明確にするであろう。図面の重要性は、本発明の本質を説明することにある。図１は、膜結合Ｐ−セレクチンの測定に有用な放射免疫測定法を説明する概略図である。ＡＣＤはクエン酸デキストロース；ＰＧＥ１はプロスタグランジンＥ１；ＰＲＰは血小板高含有血漿；ＰＰＰは血小板低含有血漿；ＰＭＡはホルボールミリステートアセテート； ¹²⁵Ｉ-Ｓ１２ＩｇＧは¹²⁵Ｉ標識抗Ｐ−セレクチンモノクローナル抗体（Ｍａｂ）Ｓ１２。図２は、可溶性Ｐ−セレクチンの測定に有用な酵素結合免疫吸着測定法（ＥＩＡまたはＥＬＩＳＡ）のステップを説明する概略図である。該測定法においては、血小板低含有血漿（ＰＰＰ、ＥＬＩＳＡ緩衝液で４倍に希釈した）を、ビオチン化抗Ｐ−セレクチンモノクローナル抗体Ｓ１２ＩｇＧおよびストレプトアビジン結合ＨＲＰ(ストレプトアビジン-ＨＲＰ)と同時に、抗Ｐ−セレクチン抗体Ｗ４０被覆マイクロタイタープレートに添加する。ＨＲＰはセイヨウワサビペルオキシダーゼ；ＯＰＤはＨＲＰの基質であるＯ-フェニレンジアミン二塩酸塩。その他の略号は図１に示したものと同様である。図３は、ヒト２９３トランスフェクタントの組織培養上清から精製した組換え生産した短縮型Ｐ−セレクチンの濃度を上昇させて（３．２ｎｇ／ｍｌから３２０ｎｇ／ｍｌ）、実施例２で説明する可溶性Ｐ−セレクチンＥＬＩＳＡを用いて作成した標準曲線である。アッセイフォーマットは、Ｗ４０被覆マイクロタイタープレートを用いた。ビオチン化Ｓ１２抗体およびストレプトアビジン-ＨＲＰと同時に標準品をプレートに添加し、２時間保温した。２０分後、４ＮのＨ₂ＳＯ₄によりＯＰＤ存在下での発色を停止させた。０．９９６以上の相関係数が得られた。データの最適適合として、対数間適合を選択した。アッセイの測定間精度と測定内精度はＣＶ＜１０％である。図４Ａ〜４Ｂは、放射免疫測定法（ＲＩＡ、実施例１）を用いて測定した血小板膜Ｐ−セレクチン発現量の用量依存性上昇を示したグラフである。図４Ａは、最終濃度範囲が５〜５００ｎＭのＰＭＡによって活性化させた血小板に対する¹² ⁵ Ｉ-Ｓ１２の結合量の用量依存性上昇を示す。図４Ｂは、ＰＭＡ用量滴定の血小板Ｐ−セレクチン発現量の活性化指標を示す。発現された内因性Ｐ−セレクチンと、全ての利用可能なＰ−セレクチンの発現を刺激するように設定された条件下で発現することができるＰ−セレクチンとの比を活性化の指標とした。図５は、ＲｅｏＰｒｏ^R（最終濃度５μｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下でＰＭＡの滴定によって活性化された２名のドナーの血小板の活性化指標を示したグラフである。両名のドナーはいずれも、ＰＭＡ滴定の範囲内では、ＲｅｏＰｒｏ^R存在下での活性化指標が低かったことから、ＲｅｏＰｒｏ^Rは、予想に反して、Ｐ−セレクチン発現によって測定する血小板活性化を低下させたことがわかる。図６は、５μｇ／ｍｌのＲｅｏＰｒｏ^TMの存在下（黒塗りバー）またはＲｅｏＰｒｏ^TMの非存在下（白抜きバー）で、ＰＭＡ（０ｎＭ、２０ｎＭ、１００ｎＭまたは５００ｎＭのＰＭＡ）とともに保温した全血試料から調製した血小板低含有血漿(ＰＰＰ)における、ＥＬＩＳＡ（実施例２）による可溶性Ｐ−セレクチンの産生量および検出量の平均値を示した棒グラフである。生産はＰＭＡに対して用量応答性を示し、ＲｅｏＰｒｏは、予想に反し、２４時間の実験期間中、活性化血小板によって産生される可溶性Ｐ−セレクチンを減少させた。このグラフは、さまざまな濃度のＰＭＡで刺激した３名のドナーの全血のデータを示す。図７は、膜結合Ｐ−セレクチンの測定に有用なアッセイであるフローサイトメトリーアッセイによる分析用試料の調製法を説明する概略図である。図では、アッセイに用いたさまざまな試薬について、以下の略号を用いた：ＡＣＤはクエン酸デキストロース；ＰＧＥ₁はプロスタグランジンＥ₁；ＰＲＰは血小板高含有血漿；Ａ／ＰはアピラーゼとプロスタグランジンＥ₁；ＭＴＢは改変タイロード緩衝液；ＦＩＴＣはフルオレセインイソチオシアナート；ＰＭＡはホルボール１２ -ミリステート１３−アセテート；Ｓ１２−ＦＩＴＣはＦＩＴＣ標識抗Ｐ−セレクチンモノクローナル抗体（Ｍａｂ）Ｓ１２。図８は、膜結合Ｐ−セレクチンの測定に有用な容積測定キャピラリーサイトメトリー系による分析用試料の調製法を説明する概略図である。図では、アッセイに用いたさまざまな試薬について、以下の略号を用いた：ＡＣＤはクエン酸デキストロース；ＰＧＥ₁はプロスタグランジンＥ₁；ＷＢは全血；Ａ／ＰはアピラーゼとプロスタグランジンＥ₁；ＭＴＢは改変タイロード緩衝液；ＣＤ６１−Ｃｙ５は実質的にすべての血小板上に存在する受容体に結合するＣｙ５標識Ｍａｂ；Ｓ１２／Ｗ４０−Ｃｙ５はＣｙ５標識抗Ｐ−セレクチンＭａｂのＳ１２およびＷ４０の等量混合物。図９は、患者試料から得た血漿中の可溶性Ｐ−セレクチンの測定に有用な容積測定キャピラリーサイトメトリー系による分析用試料の調製法を説明する概略図である。図では、アッセイに用いたさまざまな試薬について、以下の略号を用いた：ＡＣＤはクエン酸デキストロース；Ａ／ＰはアピラーゼとプロスタグランジンＥ₁；ＰＰＰは血小板低含有血漿;Ｗ４０は９．７μＭのポリスチレン粒子の被覆に用いたＰ−セレクチン特異的Ｍａｂ；Ｓ１２−Ｃｙ５はＣｙ５標識Ｐ−セレクチン特異的Ｍａｂ。発明の詳細な説明本発明は、個体由来の試料におけるＰ−セレクチンのレベルをモニターすることにより、血小板の活性化状態に影響を及ぼす「抗血小板」剤の効果を評価する方法に関する。１つの態様においては、膜結合Ｐ−セレクチンのアッセイを用いて、血小板を含む試料（例えば血液試料、血小板高含有血漿（ＰＲＰ））のＰ− セレクチンのレベルをモニターする。別の態様においては、可溶性Ｐ−セレクチンのアッセイを用いて、予め血小板が除去されている試料〔例えば血小板低含有血漿(ＰＰＰ)、血清〕のＰ−セレクチンのレベルを測定する。Ｐ−セレクチンの検出にはさまざまな方法が利用できる。好ましい態様においては、モノクローナル抗体Ｓ１２またはモノクローナル抗体Ｗ４０などの抗Ｐ−セレクチン抗体（すなわち、１つ以上の抗体）を用いて、Ｐ−セレクチンを免疫学的に検出する。ポリクローナル抗体および／またはモノクローナル抗体の混合物を用いることができる（例えばネズミＷ４０、Ｓ１２およびＧ１モノクローナル抗体のカクテル）。例えば、被験者から試料（例えば組織および／または体液）を取得し、適当なアッセイを用いて、Ｐ−セレクチンのレベルを評価することができる。適当なアッセイとしては、ＦＡＣＳ分析、放射免疫測定法、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）などの免疫学的方法などが挙げられ、化学発光測定法も含まれる。Ｐ−セレクチンという用語は、成熟蛋白質などのＰ−セレクチン分子（例えば血小板由来のもの、内皮由来のもの、膜結合したもの、可溶性のもの）、Ｐ−セレクチンの多型変異体または対立遺伝子変異体、およびその他のアイソフォーム（例えば選択的スプライシングまたはその他の細胞プロセスによって産生されたもの）、および上記のものの修飾または非修飾型（例えばグリコシル化されたもの、グリコシル化されていないもの）を含む。Ｐ−セレクチンまたはその一部に対して反応する抗体を、本発明の方法において用いることができる。好ましい態様においては、抗体は、膜結合Ｐ−セレクチンおよび／または可溶性Ｐ−セレクチンあるいはその一部に特異的に結合する〔例えば、フリエら（Furie et al.）、米国特許第４，７８３，３３０号明細書；その教示はすべて、参照により本明細書に取り込まれる］。抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよく、抗体という用語は、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両者を包含するものとする。ポリクローナルおよびモノクローナルという用語は、抗体調製物の均一性の程度をいうものであって、特定の製造方法に限定するものではない。単離Ｐ−セレクチンおよび／または組換えＰ−セレクチンあるいはその一部（合成ペプチドなどの合成分子を含む）などの適当な免疫原に対する抗Ｐ−セレクチン抗体を生成させることができる。１つの態様においては、単離Ｐ−セレクチンおよび／または組換えＰ−セレクチンあるいはその一部（例えばペプチド）に対する抗体、または組換えＰ−セレクチンを発現する宿主細胞に対する抗体を生成させることができる［ジョンストンら（Johnston，G.I．et al．）、Cell，56 :1033-1044（1989）；およびマックエバー（McEver，R.P.）、米国特許第５，３７８，４６４号明細書；両文献の全教示は、参照により本明細書に取り込まれる］。また、トランスフェクト細胞などの組換えＰ−セレクチンを発現する細胞を免疫原として使用したり、受容体に結合する抗体のスクリーニングに使用したりすることができる[例えば、チュンザラパイら（Chuntharapai et al．）、J．Im munol.，152:1783-1789（1994）；チュンザラパイら（Chuntharapai et al．）、米国特許第５，４４０，０２１号明細書参照]。免疫抗原の調製、およびポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の製造は、適当な技術を用いて行うことができる。さまざまな方法が記載されている[ 例えばコフラーら(Kohler et al.)、Nature，256:495-497（1975）ならびにEur ．J．Immunol．6:511-519（1976）；ミルステインら（Milstein et al．）、Nat ure 266:550-552（1977）；コプロウスキーら（Koprowski et al.）、米国特許第４，１７２，１２４号明細書；ハーローとレーン（Harlow，E．and D．Lane）、1988，Antibodies:A Laboratory Manual，(Cold Spring Harbor Laboratory:C old Spring Harbor，NY);Current Protocols in Molecular Biology，Vol．２(S upplement 27，Summer'94)，アウスベルら（Ausubel，F.M．et al.）編、(John Wiley & Sons:New York，NY)，Chapter 11，(1991)]。通常、適当な不死細胞株（例えばＳＰ２／０などの骨髄腫細胞株）と抗体産生細胞とを融合させることによってハイブリドーマを製造する。抗体産生細胞、好ましくは脾臓またはリンパ節の細胞は、目的の抗原で免疫した動物から得ることができる。融合細胞（ハイブリドーマ）は、選択培養条件を用いて単離し、限界希釈法によってクローン化することができる。所望の特異性を有する抗体を産生する細胞は、適当なアッセイ（例えばＥＬＩＳＡ）によって選択することができる。必要な特異性を有する抗体を製造または単離する他の方法としては、例えばライブラリーから組換え抗体を選択する方法や、ヒト抗体全レパートリーを産生しうるトランスジーニック動物（例えばマウス）の免疫化に依存する方法がある［例えばジャコボビッツら（Jacobovits et al．）、Proc．Natl．Acad．Sci．USA ，90:2551-255(1993)；ジャコボビッツら（Jacobovits et al．）、Nature，362 :255-258(1993)；ロンベルグら（Lonberg et al.）、米国特許第５，５４５，８０６号明細書；スラニら（Surani et al．）、米国特許第５，５４５，８０７号明細書参照］。単鎖抗体およびキメラ抗体、ヒト化抗体(humanized antibodies)、または霊長類化抗体(primatized antibodies)[ＣＤＲ移植抗体(CDR grafted antibody)]、またはベニヤ抗体(veneered antibodies)、ならびに異なる種に由来する部分からなるキメラ単鎖抗体、ＣＤＲ移植単鎖抗体、またはベニヤ単鎖抗体なども、本発明および抗体という用語の範囲に含まれる。これらの抗体のさまざまな部分は、常法により化学的に連結させたり、遺伝子工学技術を用いて、連続(contiguou s)蛋白質として調製することができる。例えば、キメラ鎖またはヒト化鎖をコードする核酸を発現させて、連続蛋白質を製造することができる［例えばキャビリーら（Cabilly et al.）、米国特許第４，８１６、５６７号明細書；キャビリーら（Cabilly et al.）、欧州特許第０，１２５，０２３Ｂ１号明細書；ボスら(B oss et al.)、米国特許第４，８１６、３９７号明細書；ボスら（Boss et al.）、欧州特許第０，１２０，６９４Ｂ１号明細書；ノイベルガーら（Neuberger，M .S．et al.）、国際公開第８６／０１５３３号パンフレット；ノイベルガーら（ Neuberger，M.S．et al.）、欧州特許第０，１９４，２７６Ｂ１号明細書；ウインター（Winter）、米国特許第５，２２５，５３９号明細書；ウインター（Wint er）、欧州特許第０，２３９，４００Ｂ１号明細書；クイーンら（Queen et al. ）、欧州特許第０，４５１、２１６Ｂ１号明細書；およびパドランら(Padlan，E .A．et al.)、欧州特許第０５ｌ９５９６Ａ１号明細書参照］。また、霊長類化抗体についてはニューマンら[(Newman，R．et al.)、BioTechnology，10:1455-1 460(1992)]を、単鎖抗体についてはラドナーら(Ladner et al.)、米国特許第４，９４６，７７８号明細書およびバードら(Bird，R.E．et al.)、Science，242: 423-426（1988）を参照されたい。また、キメラ抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体、ベニヤ抗体、または単鎖抗体の断片を含む抗体の機能的断片を生産することもできる。上記抗体の機能的断片としては、Ｐ−セレクチンと反応するものが挙げられる。例えば、Ｐ−セレクチンまたはその一部に結合しうる抗体断片も本発明に包含され、具体的にはＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ）’断片などが挙げられるが、これらに限定されない。かかる断片は、酵素分解または組換え技術によって製造することができる。例えば、パパインまたはペプシン分解により、それぞれＦａｂ断片またはＦ（ａｂ’）₂断片を生成することができる。抗体は、予め１つ以上の終止コドンを天然終止部位の上流に導入しておいた抗体遺伝子を用いて、様々な短縮型として製造することもできる。例えば、該重鎖部分をコードするキメラ遺伝子はＦ（ａｂ’）₂重鎖のＣＨ₁ドメインとヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列を含むように、設計されうる。抗体は、例えば放射性同位体やスピン標識や抗原（例えばＦＬＡＧタグなどのエピトープ標識）または酵素標識、蛍光基または化学発光基などの検出可能標識の導入または付着〔直接的または間接的（例えばリンカーを介する）〕により、修飾することができるという利点があることが認識されうるであろうし、このような修飾型も「抗体」という用語の範囲に含まれる。「デュアルアッセイ」または「Ｐ−セレクチンプロフィール」という用語は、可溶性および膜結合Ｐ−セレクチンの値を測定しうるアッセイをいう。両者の値を測定するアッセイにおいては、いずれかの値の上昇が、血小板活性化の存在の指標となりうる。「マーカー」または「血小板活性化マーカー」という用語は、可溶性Ｐ−セレクチンのレベルまたは膜結合Ｐ−セレクチンのレベルまたは両者のいずれかをいう。Ｐ−セレクチンの免疫学的評価該方法によれば、試験対象の生体試料とＰ−セレクチンに対する特異性を有する抗体とを、該抗体とＰ−セレクチンの複合体の形成に適した条件下に合わせ、複合体の形成を（直接的または間接的に）検出または測定することによって、試料に含まれる膜結合Ｐ−セレクチンおよび／または可溶性Ｐ−セレクチンをはじめとするＰ−セレクチンのアッセイを行うことができる。試料は、直接的または間接的（例えばヘルスケア施設から提供を受ける）に入手することができ、選んだ特定の試料（例えば全血、血小板高含有血漿、血小板低含有血漿、血清）およびアッセイ形式に適した方法によって調製することもできる。例えば、全血は、静脈穿刺法によりＡＣＤ−Ａ、ヘパリン、またはＥＤＴＡなどの抗凝血剤を含む容器中に採取するか、留置動脈ラインからこの容器に採取するなどの適当な方法により採取することができる。試料と抗体を合わせる方法および複合体形成を検出する方法もアッセイ形式に合わせて選択される。抗体は、放射性標識、蛍光標識、または化学発光標識など直接的に検出することができるもの、または酵素標識またはその他の抗原性または特異的な結合相手（例えばビオチン）など間接的に検出することができる適当な標識で標識することができる。このような標識の具体例としては、例えば蛍光標識（例えばフルオレセイン、ローダミン）、化学発光標識（例えばルシフェラーゼ）、放射性同位体標識（例えば³²Ｐ、¹²⁵Ｉ、¹ ³¹ Ｉ）、酵素標識（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ）、ビオチン、アビジン、スピン標識などが挙げられる。複合体における抗体の検出も、後で検出する（例えば標識を用いる）二次抗体を用いて免疫学的に行うことができる。従来の方法またはその他の適当な方法を用いて、抗体を直接的または間接的に標識することができる。血小板膜結合Ｐ−セレクチンの検出用アッセイ公知方法または将来開発される方法を、膜結合Ｐ−セレクチンを測定するために用いることができる。１つの態様においては、本発明は、血小板結合Ｐ−セレクチンの発現量を測定することにより、血小板活性化レベルへの抗血小板療法の効果を決定する方法を提供する。例えば、血小板を含有する試料を、抗体と該血小板上で発現されたＰ−セレクチンの複合体の形成と、複合体の形成の検出または測定（間接的または直接的）に適した条件下で、Ｐ−セレクチンに対する特異性を有する抗体と接触させることができる。とくに好ましい態様においては、放射性同位体共役免疫結合アッセイが用いられる。内因性血小板活性化は、与えられた試料について発現可能な全Ｐ−セレクチンの百分率として測定することかできる。図１は、用いることのできるアッセイの１つのタイプを示す（実施例１も参照）。例えば、内因性血小板活性化は、下記工程：（ａ）それぞれ前もって選ばれた数の血小板を含む第１と第２の血小板試料を得る工程；（ｂ）該第１試料と、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）、ＡＤＰ（アデノシンニリン酸）、トロンビン、コラーゲン、および／またはＴＲＡＰ（トロンビン受容体活性化ペプチド）などの血小板活性化アゴニストとを、該第１試料における血小板の活性化に適した条件下で、好ましくは該血小板を最大限に活性化させるのに有効な時間に渡り、好ましくは第２の試料を内因性血小板活性化レベルの維持に適した条件下に接触させる工程、（ｃ）好ましくは血小板上で発現されたＰ−セレクチンに結合するのに必要な量より過剰量にて、該２つの試料と、（ｉ）放射性標識を含有する抗Ｐ−セレクチン抗体、または（ｉｉ）放射性標識を含有する二次抗体との結合部位を含有する抗Ｐ−セレクチン抗体、など抗Ｐ−セレクチン抗体を含有する組成物とを、該抗Ｐ−セレクチン抗体と活性化血小板の標識複合体の形成に適した条件下に接触させる工程、（ｄ）該第１試料における複合体検出量と比較した該第２試料における複合体検出量を、該第２試料における血小板活性化の程度の指標として、該試料中の複合体の形成を測定（検出または定量）する工程、を含む免疫結合アッセイによって評価することができる。例えば、該第１試料における複合体検出量に対する該第２試料における複合体検出量を反映する比率は、該第２試料における血小板活性化の程度の尺度が得られる。放射免疫測定法を用いる場合、該第１試料に対する該第２試料の放射活性の比率を、該第２試料における血小板活性化の程度の指標として、各試料における標識複合体に含まれる放射活性を決定することにより、複合体の形成を評価することができる。第１と第２試料は同じドナーから採取したものであることが好ましい。とくに好ましい態様においては、第１と第２の試料をほぼ同時に採取する（例えは１名のドナーから得た１つの試料を分割したり、連続的に採取した２つの試料からそれぞれ得る）。本アッセイは、前単離工程や血小板数標準化を経ないで全血に対して行うこともでき、したかって実質的に処理時間が短縮される。例えば、血小板活性化レベルを測定しようとするドナーから全血試料を得ることができ、これを２分割することができる。一方の試料はＰＭＡなどの血小板アゴニストで処理して血小板を最大限に活性化させ、他方の試料は活性化アゴニストで処理しないで、内因性( イン・ビボ)活性化レベルを維持するように設定された条件下に維持する（例えばアプロチニン、テオフィリン、アピラーゼ、および／またはプロスタグランジンＥ₁などの活性化阻害剤の添加などによる）。放射性標識抗Ｐ−セレクチン抗体を両方の試料に加え、Ｐ−セレクチンへの特異的結合に適した条件下に試料を維持するが、結合が完了するまで維持することが好ましい。結合の程度が評価量である。該試料を処理して、非結合抗Ｐ−セレクチン抗体から複合体を分離することができる。例えば、試料を、タイロードの改変緩衝液などの血小板活性化状態を変化させない緩衝液で１：６に希釈し、３０％スクロースバリヤー(barrier )に重層し（例えばあらかじめローディングしておいた微量遠心管中で）、微量遠心分離（例えば１１，０００×ｇで４分間）することができる。放射性標識抗Ｐ−セレクチン抗体が結合したペレットをクリップし、ガンマカウンターで計数することができる。最大限に活性化させた試料に対する内因性活性化試料の放射活性の百分率を計算し、試料の活性化指数(ＡＩ)とすることができる。このようにして、内因性血小板活性化を、発現可能なＰ−セレクチンの総量の百分率として測定することかできる。すなわち、さらに、本発明は、（ａ）第１と第２の全血試料を得る工程、（ｂ）好ましくは該第２の全血試料を内因性血小板活性化レベルの維持に適した条件下に維持しながら、該第１試料とホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）などの血小板活性化アゴニストとを、該試料における血小板の活性化に適した条件下に、好ましくは該血小板を最大限に活性化させるのに有効な時間に渡り接触させる工程、（ｃ）該試料を、好ましくは血小板上で発現されたＰ−セレクチンに結合するのに必要な量より過剰量にて、（ｉ）放射性標識を有する抗Ｐ−セレクチン抗体、または（ｉｉ）放射性標識を有する第２抗体との結合部位を有する抗Ｐ−セレクチン抗体などの抗Ｐ−セレクチン抗体を含有する組成物とを、該抗Ｐ−セレクチン抗体と活性化血小板の標識複合体の形成に適した条件下に接触させる工程、（ｄ）該２つの試料における複合体の形成を決定（検出または測定）する工程であって、ここで、該第１試料の複合体検出量に対する該第２試料の複合体検出量を、該第２試料における血小板活性化の程度の指標とするを含む、血小板活性化を測定しようとするドナーの全血試料における内因性血小板活性化を測定するための放射性同位体共役免疫結合アッセイを提供する。上記のように、該第１試料において検出された複合体の量に対する該第２試料において検出された複合体の量を反映する比率は、該第２試料における血小板活性化の程度の尺度を提供しうる。膜結合Ｐ−セレクチンのレベルを評価する他の方法は、フローサイトメトリーがある。血小板または膜結合Ｐ−セレクチンを測定するためのフローサイトメトリーの方法は当該分野において公知である[シャッティルら（Shattil，Sanford J．et al.）、"活性化依存性のモノクローナル抗体およびフローサイトメトリを用いる全血中の活性化血小板の検出"Blood，Vol．70，No．１(July)，1987:pp 3 07-315；シャルフら（Scharf，Rudiger E.，et al.）、"血灌流血管形成術傷害冠動脈における血小板の活性化、フローサイトメトリー検出"Arteriosclerosis and Thrombosis，第12巻，第12号(１２月)，1992：1475-1487頁；これら文献の教示はすべて、参照により本明細書に取り込まれる]。また、本願の同時継続出願である１９９６年１１月１３日出願の「静脈血栓障害、血管介入、および抗血小板療法のモニタリングにおけるＰ−セレクチンの評価」という名称の米国特許出願第０８／７４８，３８７号明細書、および１９９７年１０月７日出願の「Ｐ−セレクチンのレベルの検出による血栓事象の診断」という名称の米国特許出願第０８／９４６，３５０号明細書の教示もすべて、参照により本明細書に取り込まれる。１つの例示においては、血小板を含有する試料とＰ−セレクチンに対する特異性を有する抗体とを、抗体と血小板上で発現されたＰ−セレクチンの複合体の形成に適した条件下に接触させ、複合体の形成の検出または測定(直接的または間接的)することができる。とくに好ましい態様においては、抗体Ｓ−１２をＦＩＴＣと共役させる。図７は、１つのタイプのフローサイトメトリーアッセイを説明する（実施例９も参照）。別の例示においては、膜結合Ｐ−セレクチンの値は、（ａ）血小板を含有する第１試料および第２試料を得る工程、（ｂ）対照とする該第１試料とホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）、ＡＤＰ（アデノシン二リン酸）、トロンビン、コラーゲン、および／またはＴＲＡＰ（トロンビン受容体活性化ペプチド）などの血小板活性化アゴニストとを、好ましくは、第２の試料を内因性血小板活性化レベルの維持に適した条件下に維持しながら、該第１試料における血小板の活性化に適した条件下に、好ましくは、該血小板を最大限に活性化させるのに有効な時間に渡って接触させる工程、（ｃ）好ましくは血小板上で発現されたＰ−セレクチンに結合するのに必要な量より過剰量にて、該試料と蛍光標識を有する抗Ｐ−セレクチン抗体などの抗Ｐ− セレクチン抗体から成る組成物とを、該抗Ｐ−セレクチン抗体と活性化血小板の標識複合体の形成に適した条件下に接触または染色させる工程、（ｄ）検出された複合体の量を、該第２試料における血小板活性化の程度の指標として、該２つの試料における複合体の形成を測定(検出または定量)する工程を含む、フローサイトメトリーによって評価することができる。膜結合Ｐ−セレクチンのレベルのもう１つのアッセイ法は、容積測定キャピラリーサイトメトリー系による分析に関する。容積測定キャピラリーサイトメトリー系の具体例としては、Biometric Imaging社（Mountain View，CA）製のＩＭＡＧＮ２０００^TMが挙げられる。図８および実施例１０で説明するように、Ｐ−セレクチン特異的抗体またはその混合物を用いて、膜結合Ｐ−セレクチンを測定する。抗体は蛍光物質で標識することが好ましい。使用する抗体は、それぞれ蛍光物質Ｃｙ５(Amersham-Searle社)で標識したＳ−１２とＷ−４０の混合物またはカクテルであることがさらに好ましい。容積測定キャピラリーサイトメトリー系は、事象数と蛍光強度を検出するものである。具体的には、（ａ）血小板を含有する試料を得る工程、（ｂ）該試料とアピラーゼやプロスタグランジンＥ₁などの安定化試薬とを接触させて、イン・ビトロの血小板活性化を防止し、かつ血小板上で発現されたＰ− セレクチンを安定化させて、イン・ビボの血小板活性化の尺度を得る工程、（ｃ）該試料と蛍光標識を有する抗Ｐ−セレクチン抗体などの抗Ｐ−セレクチン抗体から成る組成物とを、好ましくは血小板上で発現されたＰ−セレクチンに結合するのに必要な量より過剰量にて、該抗Ｐ−セレクチン抗体と活性化血小板の標識複合体の形成に適した条件下に接触または染色する工程、（ｄ）複合体検出量を、該試料における膜結合Ｐ−セレクチンのレベルの指標として、該試料における複合体の形成を決定（検出または測定）する工程、を含む、容積測定キャピラリーサイトメトリー系によって、膜結合Ｐ−セレクチンのレベルを評価することができる。合計血小板数を評価すれば、血小板活性化の程度の決定に役立つため、膜結合Ｐ−セレクチンに加え、合計血小板数を測定することが好ましい。試料を、実質的にすべての血小板に対して特異的である蛍光物質標識抗体と接触させた後、事象の数または蛍光強度を検出することによって、合計血小板数を測定することができる。抗体は、糖蛋白質ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ、ＣＤ６１，１０Ｅ５、ＣＤ４１、およびＣＤ４２など、実質的にすべての血小板上に存在する受容体に対して特異的である抗体が好ましい。これらの抗体は、蛍光物質Ｃｙ５(Amersham-Sear Ie社)によって標識することができる。例えば、（ａ）血小板を含有する試料を得る工程、（ｂ）該試料を、蛍光標識を有する抗ＧＰＩＩＢ／ＩＩＩａ抗体などの抗血小板抗体を含有する組成物とを、好ましくは血小板に結合するのに必要な量より過剰量にて、該抗Ｐ−セレクチン抗体と血小板の標識複合体の形成に適した条件下に接触または染色する工程、（ｃ）複合体の検出量を、該試料における合計血小板数の指標として、該試料における複合体の形成を決定（検出または測定）する工程、を含む方法で、容積測定キャピラリーサイトメトリー系により合計血小板数を評価することができる。これらの方法を用いて、Ｐ−セレクチンプロフィールから独立的にまたはその一部として膜結合Ｐ−セレクチンを測定して、血小板活性化を診断したり、抗血小板療法の有効性をモニターしたりすることができる。可溶性Ｐ−セレクチン検出のためのアッセイ可溶性Ｐ−セレクチンを測定するために、いかなる現在公知の方法または将来開発される方法をも用いうる。本発明は、抗血小板治療剤および／または血管介入術による治療を受けた患者の血漿における可溶性Ｐ−セレクチンのレベルを決定することにより、抗血小板療法および／または血管介入術（例えばＰＴＣＡ）が血小板活性化レベルに及ぼす影響を決定する方法を提供する。血小板活性化状態は、治療前、治療中、および／または治療後に評価することができるため、選択された時点において、基底状態に比較した患者の内因性血小板活性化状態の変化を検出することができる。内因性血小板活性化レベルを適当な対照（例えば健常者）のレベルと比較することによって、血小板活性化亢進状態を評価することもできる。好ましい態様においては、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて可溶性Ｐ−セレクチンを測定し、とくに好ましい態様においては、サンドイッチＥＬＩＳＡを用いる。図２は、行うことのできる１つのアッセイタイプを説明したものである(実施例２も参照)。１つの態様においては、ネズミＷ４０を捕捉抗体として用い、ネズミＳ１２をディテクター抗体(detector antibody)として用いる。適当な試料中の可溶性Ｐ−セレクチンを検出する場合、試料（例えば血液）を採取するが、例えば血清または血漿を調製することによって（例えば血小板低含有血漿の単離）、試料から血小板を除去(一部または全部)することが好ましい。追加のＰ−セレクチンの産生（例えば血小板からの分泌やタンパク分解による）によるものなど可溶性Ｐ−セレクチンのアーチファクト増大を低下させるのに適した時間内に血小板を除去するように試料を処理することが好ましい。例えば、約１時間以内、好ましくはただちに、上記処理を開始することが望ましい。試料は、さらに適宜処理することができる（例えばアッセイ緩衝液（例えばＥＬＩＳＡ希釈液）による希釈）。したがって、本発明は、（ａ）ディテクター抗体が捕捉抗体によって認識されるものとは異なるＰ−セレクチンエピトープを認識するように、該抗Ｐ−セレクチン抗体と可溶性Ｐ−セレクチンの複合体の形成に適した条件下で、適当な試料と、（ｉ）ビオチン化抗Ｐ−セレクチンＭａｂ（例えばＳ１２）とＨＲＰ−ストレプトアビジン、または（ｉｉ）ＨＲＰ結合抗Ｐ−セレクチンＭａｂなどディテクターとしての抗Ｐ−セレクチン抗体を含有する組成物と、抗Ｐ−セレクチン捕捉抗体を結合させた（直接的または間接的に）マイクロタイタープレートなどの固相支持体とを合わせる工程、（ｂ）該試料における複合体の形成を測定する工程を含む、酵素結合免疫吸着測定法などのアッセイを用いて、適当な試料(例えば血清、血小板低含有血漿(ＰＰＰ))における可溶性Ｐ−セレクチンを測定することで、抗血小板療法および／または血管介入術（例えばＰＴＣＡ）が血小板活性化レベルに及ぼす影響を測定する方法を提供する。マイクロタイタープレート、ディップスティック、ビーズ、またはその他の適当な支持体などの固相支持体は、抗Ｐ−セレクチン抗体で直接的または間接的に被覆することができる。例えは、マイクロタイタープレートは、抗Ｐ−セレクチン抗体で被覆することができ、ビオチン化抗Ｐ−セレクチンＭａｂをストレプトアビジン被覆支持体に加えてもよい。さまざまな固相支持体および固定化または被覆化方法を用いることができ、目的の形式に応じて選ぶことができる。とくに好ましい態様においては、試料（または可溶性Ｐ−セレクチン標準物質）を、ディテクター抗体と同時に固相支持体と任意にディテクターをモニターすることができる（すなわち、１つ以上の）試薬と合わせる。例えば、試料（例えばＰＰＰ）は、（ａ）ＨＲＰ結合抗Ｐ−セレクチンＭａｂまたは（ｂ）ビオチン化抗Ｐ−セレクチンＭａｂおよびＨＲＰ−ストレプトアビジンと同時に固相支持体と合わせることができる。上記のようにして、適当な試料について、既知量の可溶性Ｐ−セレクチン標準物質を調製し、処理することができ、検出されたＰ−セレクチンの量の定量に用いることができ、標準物質に対する相対的レベルを測定することができる。１つの態様においては、可溶性短型Ｐ−セレクチンを標準物質として用いる。検出された複合体の量を適当な対照と比較して、レベルが上昇しているかどうかを評価することができる。例えば、血管介入術後の可溶性Ｐ−セレクチンのレベルを、個体の基底レベル（例えば術前または術中に測定したもの）、または健常者または適当な対照におけるレベルと比較することができる。本発明の１つの態様においては、凝血促進ゲルを有するまたはもたない、抗凝血剤の非存在下で凝固させるドナー由来全血から単離した血清に対して、アッセイを行うことができる。例えば、全血を採取することができる（例えば血清分離用に設計された凝血促進ゲルプラグの存在下または非存在下、抗凝血剤の非存在下でバキュテイニナー（vacutaininer）に採取する）。血液を凝血させ、凝血細胞ペレット上面から血清を採取することができる。血清は、上記ＥＬＩＳＡ形式でただちにアッセイしてもよいし、-７０℃で凍結させてから分析してもよい。凝血の過程で、表面にＰ−セレクチンを発現している可能性のある血小板微小粒子が遊離する。血清を１０７，０００×ｇで３時間超遠心分離に付したところ、上記可溶性Ｐ−セレクチンＥＬＩＳＡ形式では微小粒子結合Ｐ−セレクチンは検出されなかった(表１)。表１からわかるように、血清中に検出された可溶性Ｐ− セレクチンの量は、試料を、血清から微小粒子を除去するであろう手順である超遠心分離に付した後でも変化しなかった。したがって、ＥＬＩＳＡは血清中の可溶性Ｐ−セレクチンのみを測定することになる。このアッセイにおいては、血清中の可溶性Ｐ−セレクチンの平均量は、血漿中で見られるものより上昇している (表１)。表１微小粒子を除去するための超遠心分離は、W40-S12 Mab ELISAで検出される可溶性P-セレクチンを顕著に変えない表１は、１０７，０００×ｇで３時間の超遠心分離を行っても、血漿または血清の可溶性Ｐ−セレクチンＥＬＩＳＡにおけるＰ−セレクチンの検出量は変化しないことを示す。これらの結果から、超遠心分離により除去されるはずの微小粒子は、可溶性Ｐ−セレクチンＥＬＩＳＡにおいては検出されないが、血漿Ｐ−セレクチンのみか検出されていることを示唆する。表中、ＡＣＤ−Ａは酢酸デキストロース溶液Ａを示す。すなわち、とくに好ましい態様においては、適当な試料における可溶性Ｐ−セレクチンを測定するアッセイは、下記工程：（ａ）適当な試料（例えば血漿）を得る工程、（ｂ）マイクロタイタープレートを、抗Ｐ−セレクチン捕捉抗体（例えはＷ４０）で被覆、またはビオチン化抗Ｐ−セレクチン捕捉抗体（例えばＷ４０）をマイクロタイタープレートなどのストレプトアビジン被覆固相支持体に添加する工程、（ｃ）抗Ｐ−セレクチンディテクター抗体が、捕捉抗体によって結合されるものとは異なるＰ−セレクチンエピトープに結合するように、該マイクロタイタープレートに、試験対象の試料（例えばＥＬＩＳＡ希釈液で最終的に４倍に希釈したもの）と、（ｉ）ＨＲＰ結合抗Ｐ−セレクチンディテクター抗体（例えばＨＲＰ−Ｓ１２）または（ｉｉ）ビオチン化抗Ｐ−セレクチンディテクター抗体（例えばビオチン化ＭａｂＳ１２）とＨＲＰストレプトアビジンなどのディテクター抗体および任意に検出用試薬を含有する組成物とを、好ましくは同時に添加し、これらのものを該抗Ｐ−セレクチン抗体と可溶性Ｐ−セレクチンの複合体との形成に適した条件下、好ましくは結合を最大化させる条件下で保温する工程、（ｄ）捕捉抗体と可溶性Ｐ−セレクチンとディテクター抗体とを含有する複合体（例えば洗浄により）を分離する工程、（ｅ）該複合体における可溶性Ｐ−セレクチンの量を測定する工程、を含む。Ｐ−セレクチンの典型的なアッセイとしては、プレートを１次抗体で被覆し、血漿を添加し、プレートを洗浄し、２次標識抗体を添加し、プレートを洗浄し、結合した第２の抗体を定量する連続アッセイである。しかしながら、結合動態を調べたところ、同時形式では、２次抗体のオフ率が低下し、アッセイはより高感度であることが示された（実施例２）。したがって、固相支持体を捕捉抗体（例えばＷ４０）で被覆し、血漿とディテクター抗体（例えばＳ１２）を同時に添加する同時形式により、感度を高めることができるため、この態様が好ましい。複合体における可溶性Ｐ−セレクチンの量は、さまざまな方法によって測定することができる。例えば、ＨＲＰを標識として用いる場合、ＯＰＤなどの適当な基質を添加して、結合した抗Ｐ−セレクチンＭａｂに正比例し、したがって試料中の可溶性Ｐ−セレクチンに正比例する色強度（例えば光学密度によって評価する）を生ぜしめることができる。結果は、適当な対照（例えば標準物質、健常者におけるＰ−セレクチンのレベル、同じドナーから得た試料のベースラインレベルのＰ−セレクチンのレベル）と比較することができる。例えば、試料の代わりに既知量の可溶性Ｐ−セレクチン標準物質を用いてアッセイを行い、標準曲線を作成することができる。次いで、既知量の可溶性Ｐ−セレクチン標準物質によって産生される複合体の量に対する試料中の複合体形成量を測定することができる。可溶性Ｐ−セレクチンのもう１つの測定法は、容積測定キャピラリーサイトメトリー系を利用するものである。図９は、容積測定キャピラリーサイトメトリー系が行うことができる１つのタイプのアッセイを説明したものである（実施例１１も参照）。１つの態様においては、ネズミＷ４０を捕捉抗体として用い、ネズミＳ１２をディテクター抗体として用いる。容積測定キャピラリーサイトメトリー系を利用して可溶性Ｐ−セレクチンを測定する場合、上記ＥＬＩＳＡおよびサンドイッチＥＬＩＳＡで用いる抗体検出コンセプトが適用される。上記ＥＬＩＳＡ法は、用いる支持体表面と検出方法が容積測定キャピラリーサイトメトリー系による測定に適したものとなるように適合させることができる。上記したように、適当な試料を取得する。適当な時間内、好ましくは１時間以内に血小板が除去され、追加のＰ−セレクチンの産生によるものなどの可溶性Ｐ −セレクチンのアーチファクト増大を低下させるように、試料を処理する。さらに、イン・ビトロの血小板活性化を安定化させ、防止する試薬を添加することができる。これらの安定化試薬の具体例としてはアピラーゼやＰＧＥ₁などが挙げられる。Ｐ−セレクチンに対して特異的な抗体を、ビーズ、固相支持体ストリップ、または修飾キャピラリー表面などの支持体表面上に被覆または固定化する。試料を、被覆面と接触させる。被覆抗体はＷ４０であることが好ましい。あるいは、さらに好ましくは、Ｐ−セレクチンまたはＰ−セレクチンと被覆抗体の複合体に対して特異的な別の抗体を試料と接触させることも可能である。この第２の抗体を、Ｃｙ５などの蛍光物質で検出可能な状態に標識する。次いで、容積測定キャピラリーサイトメトリー系で、可溶性Ｐ−セレクチンの指標としての蛍光強度を測定することができる。すなわち、とくに好ましい態様においては、下記工程：（ａ）例えば血漿などの適当な試料を得る工程（ｂ）支持体表面を抗Ｐ−セレクチン捕捉抗体（例えばＷ４０）で被覆、またはストレプトアビジン被覆固相支持体にビオチン化抗Ｐ−セレクチン捕捉抗体（例えばＷ４０）を添加する工程、（ｃ）試験対象の試料と、ディテクター抗体および蛍光物質（例えばＣｙ５−Ｓ１２）などの検出試薬を含有する組成物であって、抗Ｐ−セレクチンディテクター抗体は捕捉抗体によって結合されるものとは異なるＰ−セレクチンエピトープに結合することを特徴とする組成物とを、好ましくは同時に添加し、これらのものを該抗Ｐ−セレクチン抗体と可溶性Ｐ−セレクチンの複合体の形成に適した条件下、好ましくは結合を最大化させる条件下で保温する工程、（ｄ）容積測定キャピラリーサイトメトリー系または同様の系を用いて、該複合体における可溶性Ｐ−セレクチンの量を測定する工程を含む、容積測定キャピラリーサイトメトリー系で、適当な試料中のＰ−セレクチンを評価することができる。可溶性Ｐ−セレクチンを単独で、またはＰ−セレクチンプロフィールの一部として測定すると、血小板活性化の指標または診断が得られ、抗血小板療法のモニタリングが可能になる。同様に、これらの方法を利用したキットまたは系により、Ｐ−セレクチンプロフィールの指標を測定することができる。診断適用本方法は、膜結合Ｐ−セレクチンおよび／または可溶性Ｐ−セレクチンレベルによって反映される、血小板活性化に対する抗血小板療法の効果をモニターするのに有用である。処置は、所望のレベルの血小板活性化を達成するように調節されうる。従って、本方法は、抗血小板療法の必要性が示されるかまたは抗血小板療法を変更すべき場合に、評価するために使用されうる。得られる結果に基づいて、治療は、維持されるかまたは調節（増加されるかまたは減少される、開始されるまたは中止されるを含む）されうる。例えば、正常な個体または患者における血小板の基底の活性化状態は、膜結合Ｐ−セレクチンおよび／または可溶性Ｐ −セレクチンのレベルを測定することによって評価され得、そして治療は、このような基底の活性化状態または他の所望の血小板活性化状態を達成するために調節されうる。従って、基底の活性化状態についての抗血小板療法の効果は、本方法に従って評価されうる。請求項に記載の方法は、それぞれ独立して可溶性Ｐ− セレクチンおよび膜結合Ｐ−セレクチンを利用することができるか、またはＰ− セレクチンプロフィールの場合は共に利用することができる。Ｐ−セレクチンプロフィールは、血小板活性化のため、ならびに抗血小板療法の必要性をモニターおよび決定するための特定の感受性マーカーを提供する。驚くべきことに、GPIIb/IIIaブロッカー、ReoPro^TM、糖蛋白質IIb/IIIa（GPII b／IIIa）に対して導入されたキメラFab抗体断片は血小板活性化を低下させ、そしてＰ−セレクチンレベルを低下させることが発見されている。ReoPro^TM（abci ximabおよびc7E3 Fabとも呼ばれる）はまた、αV β３ビトロネクチンレセプターと交差反応する（Coller，B.S.ら、「新規の抗血小板試薬：血小板GPIIb/IIIa アンタゴニスト」Thrombosis and Haemostasis、74：302−308（1993）；Genett a，T.B.およびV.F．Mauro「ABCIXIMAB：血管形成術で使用される新規の抗凝血剤」Ann．Pharmocother．、30：251−257（1996））。本明細書中で記載する研究は、膜結合Ｐ−セレクチンアッセイ（例えば、RIA）および可溶性Ｐ− セレクチンアッセイ（例えば、ELISA）の両方について、GPIIb／IIIaブロッカーであるReoPro^TM（abciximab、c7E3 Fab）の有効性をモニターすることにおける有用性を示す。これらの結果は、膜結合Ｐ−セレクチンレベルが、ステント血栓症のイヌモデルでの7E3抗体の投与後、または冠状血管の血管形成術を受けた患者へのReoPro^Rの投与後にフローサイトメトリーでモニターした場合、それぞれ7 E3によって有意には影響されないか、またはコントロール群と同様であることが見出された報告とは対照的である（Makkar，R.R．ら、「ステント血栓症の微視的機構」要約番号1519（1996）；およびMickelson，J.K.ら、「キメラ7E3 Fab（ ReoPro^R）は冠状血管の血管形成術を受けた患者に由来する好中球について検出可能なCD11bを減少させる」要約番号0233（1996）、米国心臓学会、第69回科学会議、1996年11月）。他の抗血小板剤（ヒト化抗体を含む他の抗GPIIb／IIIa抗体（ここで、用語「抗体」は本明細書中で定義される）のような他のGPIIb／IIIaアンタゴニストを含む）、ならびにヘビの毒液蛋白質およびそれらの誘導体（例えば、ジスインテグリン、インテグレリン）、ならびに非ペプチド化合物またはペプチド模倣物（例えば、Ro44−9883（Hoffman−LaRoche）、MK−383（Merck）、SC54684（Searl e））、あるいは他の抗血小板剤（例えば、Coller，B.S.ら、「新規の抗血小板試薬：血小板GPIIb／IIIaアンタゴニスト」Thrombosis and Haemostasis、74(1) ：302−308（1995）；Cook，J.S.ら、「血小板糖蛋白質IIb／IIIaアンタゴニスト」、Drugs of Future、19：135−139（1994）；およびCox，D．ら「インテグリンの薬理学」、Medicinal Research Reviews、14：195−228（1994）を参照のこと）は、本明細書中に記載されるように、または他の適切な方法を使用して本質的にＰ−セレクチンのレベルに対するそれらの影響について評価されうる。例えば、c7E3 Fabまたは7E3抗体によって結合された場合にGPIIb／IIIaおよびビトロネクチンレセプター上の同じまたは機能的に同等のエピトープと反応する抗体を含む、GPIIb／IIIaおよび／またはビトロネクチンレセプターに対する7E3もしくはc7E3 Fabのエピトープ特異性と同様のエピトープ特異性を有する他の抗体が、この方法で評価されうる。c7E3 Fabまたは7E3モノクローナル抗体のエピトープ特異性と同様のエピトープ特異性を有する抗体は、GP IIb／IIIaおよび／またはビトロネクチンレセプターに対するc7E3 Fabまたは7E3 モノクローナル抗体の結合をブロックすることができる抗体を含む。EP 0,205,2 07号、EP 0,206,532号、およびEP 0,206,533 B1号もまた参照のこと、これらの教示は本明細書中に参照として組み込まれる。（ネズミのハイブリドーマ7E3は、1985年５月30日にアメリカンタイプカルチャーコレクション、12301 Perklawn Drive、Rockville、MD 20852に寄託され、そして登録番号HB 8832のもとで入手可能である。）従って、血小板の活性化状態を変化させ、その影響が内因性の膜結合Ｐ−セレクチンおよび／または可溶性Ｐ−セレクチンのレベルに反映される、抗血小板療法の効果が、本方法に従って評価されうる。本明細書中でさらに示すように、経皮的冠動脈形成術（PTCA）は、可溶性Ｐ− セレクチンのレベルの上昇を誘導した。従って、別の局面において、本発明は、（すなわち、１つ以上の）血管介入手順（例えば、心臓血管の介入、冠動脈の介入）の影響、および冠動脈介入手順の影響を、特に試料中の可溶性Ｐ−セレクチンのレベルを決定することを含む血小板活性化状態に関して評価する方法に関する。例えば、可溶性Ｐ−セレクチンのレベルによって示される、血管造影法、血管形成術（例えば、バルーン、冠動脈粥腫切除、レーザー血管形成術、または他の適切な方法（ロータブレーション(rotablation)および／またはステントの配置を伴うかまたは伴わない）、冠動脈のバイパス手術、ステントの配置（例えば、冠状血管のステント）、ならびに／あるいは他の血管介入手順（例えば、血管手術、血管の移植、末梢ステントの配備、補綴バルブまたは補綴血管の挿入（例えば、自己、非自己、または人工的な血管移植））の血小板活性化状態に対する影響が評価され得、そして抗血小板療法が、基底の活性化状態または他の所望の血小板活性化状態を達成するために維持または調節されうる。従って、本方法は、抗血小板療法の必要性が示されるかまたは抗血小板療法が変更されるべき場合に、評価するために使用されうる。得られる結果に基づいて、治療は、調節（開始または中止を含む、増加または減少）または維持されうる。例えば、血小板活性化状態を、可溶性Ｐ−セレクチンレベルをモニターすることによって評価した場合に、適切な対照と比較して（例えば、前処理した対照レベル、正常な対照レベルと比較して）上昇している患者は、可溶性Ｐ−セレクチンレベルを低下させるためにReoPro^Rのような抗血小板剤で治療されうる。本明細書中で示すように、深部静脈血栓症（DVT）を有すると診断された患者は、血管の介入に先立って上昇したレベルの可溶性Ｐ−セレクチンを示す（実施例８）。従って、静脈血栓症障害（特に、深部静脈血栓症）を有する患者において、可溶性Ｐ−セレクチンのレベルによって示される血小板活性化状態が評価され得、そして抗血小板療法か、血小板活性化を打ち消すように開始されうるかまたは調節されうる。上記のように、Ｐ−セレクチンプロフィールは、血小板活性化に対して特に敏感なマーカーであり、そしてその結果は、抗血小板療法の必要性および有効性を決定することができる。以下の表２は、抗血小板療法の１つの形態である、ReoP ro^TMを受容する患者をモニターするためのＰ−セレクチンプロフィールの使用を具体的に説明する。血小板高含有血漿（PRP）および血小板低含有血漿（PPP）を、冠動脈の疾患についてステントの移植を用いる高リスクのPTCAを受けた３人の患者の全血から調製した。これらの患者には、高リスクの性質のPTCAに対する抗血小板剤の標準的な用量を受容させた。より詳細には、患者は、介入の間に、０．２５mg／kgの量でReoPro^TMの１０μg／分の点滴を受けた。本明細書中に記載するように、フローサイトメトリー分析によって膜Ｐ−セレクチンについて陽性の血小板の割合を測定した。（図７および実施例９を参照のこと）。対数スケールで血小板の順方向散乱と副散乱により、患者の試料中の血小板を同定した。収集口(Collection gate)を血小板の周囲に移動させた。Cell Quest 40^TMで、血小板に結合したＰ−セレクチンの発現について血小板領域の分析を行った。分析方法には、陰性のイソ型対照マウスIgG−FITCの対数FL1ヒストグラムと、Ｐ−セレクチン特異的抗体S12−FITCの対数FL1ヒストグラムとを重ねあわせることを含んだ。技術者は、統計学的マーカーを配置して陽性と考えられるマウスの対照抗体で染色された１％の細胞で結果を得た。同じ位置にマーカーを維持しながら、技術者は、Ｐ−セレクチン特異的抗体であるS12−FITCについて陽性に染色した血小板の割合を決定した。本明細書中に記載するように、サンドイッチELISA法によって、患者の全血から生成した血小板低含有血漿（PPP）中の可溶性Ｐ−セレクチンのレベルを測定した。（図２および実施例２を参照のこと）。好ましい実施態様において、本方法は、試料中の可溶性Ｐ−セレクチンの検出に基づき、ここでＰ−セレクチンに特異的な２つのモノクローナル抗体はそれぞれ、Ｐ−セレクチン分子上の異なるエピトープに結合する。このアッセイの別の実施態様としてサンドイッチイムノアッセイが挙げられ、これは、モノクローナルおよびポリクローナルＰ−セレクチン抗体を利用する。いずれの形式においても、既知の量の可溶性Ｐ−セレクチン部分を有する試料から得られた値の標準曲線が、可溶性Ｐ−セレクチンレベルの決定を補助する。連続的な試料についてのＰ−セレクチンプロフィールを、PTCAが評価される前および後の種々の時点で得た。膜結合Ｐ−セレクチンまたは可溶性Ｐ−セレクチンのいずれかについての陽性の値は、明らかに健常なドナーに由来する試料中のＰ−セレクチンの平均値より２標準偏差より大きいかまたはそれに等しい値である。表２に示すデータについて、４．４％の血小板より大きい％陽性血小板値および３０ng／mlより大きい可溶性Ｐ−セレクチン値は、血小板活性化に対して陽性の結果を示すカットオフの陽性値である。表は、抗血小板療法の有効性のモニターと同様に、抗血小板療法の必要性を決定するためのＰ−セレクチンプロフィールの能力を具体的に説明する。PTCAの前および後の種々の時点でモニターすることによって、抗血小板療法の有効性の決定が可能となり、それに応じて投与量の調節が行われ得る。例えば、患者＃１は、PTCAの前に上昇したレベルの血小板活性化を示した。介入の間にReoPro^TMを受けた後、患者＃１の血小板活性化レベルは、介入後２時間以内に低下した。しかし、血小板活性化は、PTCA後２４時間上昇した。このことは、患者＃１が受容しているReoPro^TMの量に対して調節が行われ得ることを示す。可溶性Ｐ−セレクチンレベルおよび膜結合Ｐ−セレクチンレベルの両方を測定することによって、いずれか一方のレベルの上昇が陽性の診断を示すため、血小板活性化について特に敏感なマーカーが提供される。例えば、患者＃１についての２４時間の時点での測定は、Ｐ−セレクチンの膜結合レベルが正常の範囲内であるにもかかわらず、可溶性Ｐ−セレクチンレベルは上昇したことを示す。PTCA の２４時間後の患者＃１についての血小板に結合したＰ−セレクチンレベルのみの測定は、膜結合Ｐ−セレクチンのレベルもまた、正常の範囲内であったため、抗血小板療法が適切であったこと、および患者の血小板活性化状態が正常の範囲内であったという決定を導いた。両方のレベルの測定は、膜結合Ｐ−セレクチンのレベルが正常の範囲内にある場合でもなお、上昇したレベルの可溶性Ｐ−セレクチンが存在するため、血小板活性化について陽性の診断を示す。この患者の集団について、表は、１５個のうちの１３個または８７％の時点が、１つのＰ−セレクチンレベルのみの上昇を示したことを示す。両方のレベルの測定によって、抗血小板療法を受けている患者について血小板活性化を診断する能力に関する精度が有意に増大する。従って、両方のＰ−セレクチンレベルの測定によって、増大した感度を有する抗血小板療法の調節が可能になる。この表はまた、膜結合Ｐ−セレクチンおよび可溶性Ｐ−セレクチンのレベルが、同様の手順および抗血小板療法を受けている患者間で異なることを具体的に説明する。例えば、患者＃１は、２４時間の時点および１４日の時点で増大した量の血小板活性化を有した。患者＃２は、PTCAの前、および２時間、３日、および１４日の時点で増大したレベルの血小板活性を有した。患者＃３は、PTCAの前、２時間、３日、７日、および１４日の時点で増大したレベルの血小板活性を有した。これらの結果は、各患者では、示された抗血小板療法の間に、異なる時点で血小板活性化が増大されることを示している。従って、患者のＰ−セレクチンレベル間の変化は、Ｐ−セレクチンをアッセイすることによって血小板活性化を効率よくモニターすることの重要性に寄与する。表２．ReoProで処理した後のＰ−セレクチンプロフィールの測定による血小板活性化の決定実施例本発明は、ここで、以下の実施例によって具体的に説明され、これらは、いかなる方法によっても制限されることは意図されない。実施例１．血小板に結合したＰ−セレクチンの検出および血小板活性化の検出のためのラジオイムノアッセイ（RIA）これらインビトロおよびインビボでの研究に使用されるラジオイムノアッセイ法を、図１に模式的に示す。本明細書中に示すように、本方法は、血小板に結合したＰ−セレクチンの発現を測定することによって、血小板活性化のレベルに対する抗血小板療法の効果を決定するために使用されうる。実施例に記載する、血小板に結合したＰ−セレクチンのインビトロおよびインビボでの全ての決定を、以下のプロトコールに従って行った。インビトロでの研究およびいくつかのインビボでの研究のために、全血（８．５cc）を、抗凝血剤としてACD−A（１．５cc）を含有する２つの１０mlのバキュテイナー管中に１９ゲージ針を使用して、静脈穿刺によって採集した。患者が適切な動脈カテーテルを有する場合、内在する動脈系から１．５ccのACD−A抗凝血剤を含有する２つのプラスチック注射器中に血液を採集した。この後者の場合、各注射器を１０ｃｃの標線まで満たした（８．５ｃｃを採取した）。１つのバキュテイナーおよび注射器からの抗凝血剤を有する血液を、直ちに、アピラーゼ（最終濃度1U／mL）（Sigma、St．Louis、MO、カタログ番号A 9149）およびプロスタグランジンE₁（PGE₁、最終濃度１μM）（Sigma、St．Louis、MO 、カタログ番号P 5515）のアリコートの予め測定したものを含有するポリプロピレン遠心管（１５ml）に移した。アピラーゼおよびPGE₁は、インビトロでの血小板活性化を妨げ、そして血小板上で発現されるＰ−セレクチンを安定化させ、その結果、この血液試料中の血小板上で発現されるＰ−セレクチンは血小板活性化の実際のインビボでのレベルを示す。第２のバキュテイナーまたは注射器に由来する血液を、直ちに、空のポリプロピレン遠心管（１５ml）に移し、続いてドナーについて最大のＰ−セレクチン発現を確立するために、血小板アゴニストで処理した。血小板高含有血漿（PRP）を、６００×ｇで６分間の、両方のポリプロピレン管の遠心分離によって全血から調製した。黄色の上清のPRPを、プラスチックピペットを用いて各管（アピラーゼおよびPGE₁を含むか、またはそれらを含まない）から取り出し、そして空のポリプロピレン管に入れた。血小板低含有血漿（PPP）を、PRPの調製後にポリプロピレン遠心管中に残存している赤血球ペレットを遠心分離（１９００×ｇで１０分間）することによって調製した。PRP中の血小板数を、コールター計数機を使用して決定し、そして適切なPPP（すなわち、アピラーゼおよびPGE₁を含むか、またはアピラーゼおよびP GE₁を含まない）を使用して、最終的な血小板濃度を１．０×１０⁸血小板／mLに調節した。血小板に結合したＰ−セレクチンの発現を、S12と称される、¹²⁵I標識したネズミ抗ヒトＰ−セレクチンモノクローナル抗体(MAb)を使用する、ラジオイムノアッセイ(RIA)において測定した。S12モノクローナル抗体（Ｐ−セレクチンに特異的である）は、未刺激のヒト血小板と最小に反応するが、トロンビンで活性化した後は血小板に大量に結合する（McEver，R.PおよびM.N．Martin、「膜糖蛋白質に対するモノクローナル抗体は活性化された血小板にのみ結合する」、J．Blo l．Chem．259（15）：9799−9804（1984）、この教示は全て本明細書中に参照として組み込まれる）。RIAにおいて、¹²⁵I標識した抗Ｐ−セレクチンモノクローナル抗体S12の、（１）未刺激の血小板表面で発現されるＰ−セレクチン分子（インビボでのＰ−セレクチンの発現を維持するためにアピラーゼおよびPGE₁で処理した）に対する結合、ならびに（２）血小板上での最大のＰ−セレクチンの発現を生じる、最終濃度０．５μMのホルボールミリステートアセテート（PMA）（ Sigma、St．Louis、MO、カタログ番号P 8139）（アピラーゼまたはPGE₁を含まない）を用いた刺激後の同じドナーの血小板上で発現されるＰ−セレクチン分子に対する結合を決定した。 RIAを実施するために、Mab S12を、以前に記載されているように放射性ヨウ素標識した（Wagner，C.ら、Blood、88：907（1996）、この教示は、全て本明細書中に参照として組み込まれる）。アピラーゼおよびPGE₁を含有する、１．０×１０⁸血小板／mlに調整したPRPの１つの０．５mlのアリコートを、２０μlの改変タイロード緩衝液を含むポリプロピレン微量遠心管（５００μl容量）に移し、一方、PRPの第２の０．５mlのアリコート（アピラーゼまたはPGE₁を含まない）を、２０μlのPMA（０．５μMのPRP中の最終濃度）を含む同様の微量遠心管に移した。両方の管を穏かに反転させ、そして室温で１５分間インキュベートした。 ¹²⁵I標識した抗Ｐ−セレクチンMab S12（PRP中で最終濃度２μg／ml）を各微量遠心管に添加し、そして管を３０分間室温でインキュベートした。比活性は、一般的に２〜４μCi／μgの範囲であった。PRPのアリコート（１００μl）を各微量遠心管から取り出し、細長い（４００μl）ポリプロピレン微量遠心管に予め入れておいた３０％スクロース（２００μl）（J.T．Baker、Phillipsburg、N J、カタログ番号4097−04）上に重層した。試料を、４分間１１、０００×ｇで遠心分離して、ペレットに対してそれらが結合した¹²⁵I−S12を有する血小板を生じ、そしてこれはスクロースの隔壁によって遊離の¹²⁵I−S12から分離された。遊離の¹²⁵Ｉ標識した抗Ｐ−セレクチンMab S12を含有する血小板のペレットを、微量遠心管の底を切り取り、そしてガンマカウンターで１分あたりの結合カウントを決定することによって上清から分離した。活性化指標（AI）を、各ドナー／患者について計算した。活性化指標は、エキソビボの試料中で血小板によって発現される（内因性の血小板活性化）全Ｐ−セレクチンの割合である（PMA活性化試料中で決定される）。活性化指標＝（エキソビボでのPRPのペレット中のcpm）／（PMA活性化PRPのペレット中のcpm）×１００８人（ｎ＝８）の健常なドナーについて計算した活性化指標（AI）は、２．７± １．５であった。実施例２．ELISAによる可溶性Ｐ−セレクチンの測定これらのインビトロおよびインビボでの研究で使用したELISA法を図２に模式的に記載する。本明細書中に示すように、本方法は、抗血小板治療剤および／またはPTCAを用いた治療の前、間および／または後の、ヒトの血漿中の可溶性Ｐ− セレクチンの量を決定することによって、血小板活性化のレベルに対する抗血小板療法またはPTCAの効果を決定するために使用されうる。実施例に記載する可溶性Ｐ−セレクチンの全てのインビトロおよびインビボでの決定を、以下に記載するELISAプロトコールに従って行った。 ELISAのための抗体の選択サンドイッチELISAのためにモノクローナル抗体を選択するために、３つの抗Ｐ−セレクチンネズミモノクローナル抗体（W40、S12、およびG1）の抗原結合動力学を、BIAcore機器（Pharmacia Biosensor、Uppsala Sweden）、表面プラスモン共鳴検出システム（これは、動力学的分析、結合部位の分析、および濃度分析に適用される）で試験した。各モノクローナル抗体を、ウサギ抗マウスFc特異的抗体でBIAcoreチップ上に捕捉した。チップ上に可溶性Ｐ−セレクチンを通過させ、質量の増大（抗体の結合速度を示す）を測定した。抗原の飽和が達成された後、チップ上に緩衝液を通過させ、抗原の解離速度を質量の減少として観察した。各モノクローナル抗Ｐ−セレクチン抗体についての会合速度は等しいが、一方、解離速度は有意に異なった。S12およびG1抗体の両方が、ただちに抗原の速い解離（解離速度）を示した。対照的に、W40は、抗原の供給を緩衝液のみと置き換えた場合、Ｐ−セレクチンの減少を示さなかった。従って、BIAcoreの結果は、W40からの可溶性Ｐ−セレクチンの解離速度がS12またはG1モノクローナル抗体のいずれよりもはるかに遅いことを実証した。 BIAcore実験はまた、Sl2からの可溶性Ｐ−セレクチンの解離速度が、Ｐ−セレクチンがW40抗体と結合している場合に予想外に変化したことを明らかにした。S 12がBIAcoreチップ上に被覆され、そして可溶性Ｐ−セレクチンが飽和状態まで結合している場合、可溶性Ｐ−セレクチンは、抗原の供給が停止されるとすぐに放出された。しかし、W40がチップ上に可溶性Ｐ−セレクチンを捕捉するために使用され、そしてS12が捕捉した可溶性Ｐ−セレクチンに結合できる場合、S12は、緩衝液がチップ上を通過する時に付着したままであった。可溶性Ｐ−セレクチンからのS12の解離速度は、Ｐ−セレクチンがW40によって捕捉される場合に低下した。従って、捕捉抗体としてW40を、そして検出抗体としてS12を使用する同時形式を、感度を最大にするために選択した。材料以下の材料を、可溶性Ｐ−セレクチンアッセイで使用した： Nunc MaxiSorp^TM96ウェルマイクロタイタープレート（VWR Scientific、カタログ番号62409−004）； PBSの１０×ストック（JRH Bioscience、カタログ番号59331−79P）；ウシ血清アルブミン（BSA、Intergen）； Tween 20、ポリオキシエチレン−ソルビタンモノラウレート（Sigma Chemical Co．、カタログ番号P 7949）；可溶性短型Ｐ−セレクチン（tPS）を、以下に記載するように生成した。西洋ワサビペルオキシダーゼ共役ストレプトアビジン（HRP−ストレプトアビジン；Jackson Immunoresearch Labs、カタログ番号016−030−084）；ビオチン化したネズミS12 IgG（bmS12 IgG）を以下に記載のように生成した。クエン酸（J.T．Baker、カタログ番号0118−01）；二塩基性リン酸ナトリウム（Sigma Chemical Co．、カタログ番号S 9763）；３０％H₂O₂（Sigma Chemical Co．、カタログ番号H 1009）； O-フェニレンジアミンジヒドロクロライド（OPD）（Sigma Chemical Co．、カタログ番号P 8287）； B2TTである無関係のネズミ抗体は、Centocor，Inc．で調製された。 4Nの硫酸（H₂SO₄）を濃酸（J.T．Baker、カタログ番号968102）から調製した。以下の緩衝液を、アッセイを実施する前に調製した：１×PBS 脱イオン水で１：１０に１０×PBSを希釈する PBS／１％BSA ５００mlのPBSに５ｇのBSAを溶解し、濾過（０．２μm)する PBS／１％ BSA／０．０５％５００mlのPBSに５gのBSAを溶解する Tween 20/２５μg／ml B2TT ；０．２５０mlのTween 20を添加する（アジ化物を含まない）；１．２５mlのB2TT ０．１０mg／ml を添加する；そして濾過（０．２μm ）する PBS／０．０５％ Tween 20 １リットルのPBSあたり０．５mlのTw een 20を添加し、そして完全に混合するクエン酸／リン酸緩衝液４．２gのクエン酸（２０mM）；７．（１リットル）１gの二塩基性リン酸ナトリウム（無水物）（５０mM）：９００mlの水を添加し、pHを５．０に調整する：１．０リットルまで水を加え、そして濾過（０．２μm）する。 OPD基質溶液２５mlのクエン酸／リン酸緩衝液に３（２５ml）つの１０mgのOPDの錠剤を溶解し、そして４０μlの３０％ H₂O₂を添加する。使用の直前に調製する。 4N硫酸１６０mlの脱イオン水に２０mlの濃硫酸を添加するネズミW40 IgG₁の精製ネズミW40 IgG₁（ヒトＰ−セレクチンに特異的なネズミモノクローナル抗体（ Johnston，G.I.ら、J．Biol．Chem．、264：1816−1823（1989）、この教示は本明細書中に参照として組み込まれる）を、腹水液として調製し、そして「高塩」プロテインＡクロマトグラフィーによって精製した。腹水液を-７０℃から解凍させ、そしていくつかのガラス製の前置フィルターおよび０．２μmのメンブレン注射器フィルターを使用して濾過した。次いで、腹水液を、顆粒の塩化ナトリウムで３MのNaClに調節し、そしてpHを、１Ｍのグリシン（pH９．６）の添加によって８．９に上昇させた。プロテインＡハイトラップカラムをMAPS緩衝液中（３MのNaCl、１．５Mのグリシン（pH８．９））でPharmacia FPLC上で平衡化した。腹水液（塩濃度およびpHを調節した）をプロテインＡカラムに充填し、そしてOD₂₈₀がベースラインを超えた時にフロースルーを回収した。一旦試料の充填が完了すると、カラムを、0D₂₈₀がベースラインに戻るまでさらにMAPS緩衝液で洗浄した。結合した抗体を最初に、０．１Mのクエン酸（pH５．５）で溶出した。溶出物の回収を、OD₂₈₀がベースラインを超えた時に開始し、ベースラインに戻った時に停止した。溶出した抗体のプールを、１／３の最終容量の1MのTris（ pH８．０）の添加によって直ちに中和した。カラムに結合した他のW40 IgG以外の蛋白質を、０．１Mのクエン酸（pH３．５）での洗浄によって除去した。次いで、pH５．５および３．５の溶出物を、centriplus^TM濃縮機を使用して濃縮し、そしてSlide−A−Lyzer^TM装置（Pierce）を使用してPBS中で透析した。最後に、試料を０．２μmのフィルターで濾過し、そしてOD₂₈₀によって濃度を決定した。ネズミS12 IgG₁のビオチン化ネズミS12 IgG₁抗体を、プロテインＡセファロースカラムクロマトグラフィーを使用してハイブリドーマ組織培養上清から精製し、そしてビオチン化のために２００mMのNaHCO₃、１５０mMのKCl（pH８．５）中に透析し、３．９５mg／mlに濃縮した。ビオチン化を、ネズミS12 IgGに対して３０：１のモル過剰のN.S.−L C−ビオチン（Pierce）を用いて行った。簡潔には、mS12 IgGを５mlのポリプロピレン管に移し；N.S.−LC−ビオチンを秤量し、そして迅速にDI水中で４mg／ml に再構成した。適量のN.S.−LC−ビオチンを、S12 IgGを含有する反応試験管に移し、そして室温で1時間混合した。 PBS中での透析のためにSlide−A−Lyzer^TMに移すことによって、ビオチン化したネズミS12 IgG抗体から遊離のビオチンを除去した。最後に、抗体を、０．２ μm濾過し、そしてOD₂₈₀によって濃度を決定した。短型Ｐ−セレクチンの生成および精製トランスフェクトした293組織培養方法ヒト293腎臓細胞（ATCC CRL 1573）を、アメリカンタイプカルチャーコレクション、12301 Parklawn Drive、Rockville、MD 20852から入手し、そしてpRC／RS V（Invitrogen）（Ushiyama，S．ら、J．Biol．Chem．、268：15229（1993）、この教示は全て本明細書中に参照として組み込まれる）からの可溶性短型Ｐ−セレクチン（tPS）の発現を導く構築物でトランスフェクトした。トランスフェクタントを、T-150フラスコ中の、１０％FBSを含有し、そしてL-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、NEAA、およびジェネテシン（G-418）を補充したαMEM中で培養した。細胞がコンフルエントに到達したら、上清を廃棄し、精製のために遠心分離して細胞および壊死組織片を除去し、４℃で保存した。短型のＰ−セレクチンの親和的精製短型のＰ−セレクチン（tPS）を含有する293細胞由来の組織培養上清を採集し、処理のためにプールした。２５mlのネズミG1アフィニティーカラムを、抗Ｐ− セレクチンネズミモノクローナル抗体G1（Geng，J.-G．ら、Nature、343：757− 760（1990））を使用して調製し、そしてカラムを、５倍のカラム容量の２０mM のTris、１００mMのNaCl（pH８．３）で４℃にて平衡化した。組織培養上清をカラムに充填し、そしてフロースルーを回収した。試料の充填が完了したら、カラムを、OD₂₈₀がベースラインに戻るまで平衡緩衝液で洗浄した。次いで、アフィニティーカラムを、５倍のカラム容量の２０mMのTris、1MのNaCl（pH８．３）で洗浄した。再度、カラムを、５倍のカラム容量の２０mMのTris、１００ mMのNaCl（pH８．３）で平衡化した。結合したtPSを、９倍のカラム容量の１００mMの酢酸ナトリウム、１００mMのNaCl（pH４．１）で溶出した。カラムを、０．１％のNaN₃を含有する、２０mMのTris、１００mMのNaCl（pH８．３）中で再度平衡化し、そしてその後の使用のために保存した。溶出画分をただちに1MのMOPS（pH７．９）で中和し、そしてCentriplus^TM濃縮機を使用して濃縮した。次いで、精製したtPSを、Slide−A−lyzer^TM装置を使用して２０mMのMOPS、１００mMのNaCl（pH７．５）に緩衝液交換した。最後に、試料を、０．２μm濾過し、そしてOD₂₈₀の吸光係数１２．３で濃度を決定した。可溶性Ｐ−セレクチンを検出するためのサンドイッチELISA 可溶性Ｐ−セレクチンレベルを、以下の手順を使用してアッセイした。表３．ＥＬＩＳＡで用いる試薬の終濃度ｔＰｓを３２０ｎｇ／ｍｌから３．２ｎｇ／ｍｌまで連続して希釈することにより、６点標準曲線を作成した。１００μｌの緩衝液を含有するウェル中に６６ μｌの標準品を移し、混合し、再び移すことより連続希釈を行った。全血（８．５cc）を、抗凝血剤として、ACD−A（１．５cc）、ヘパリン、またはEDTAを含む２つの１０mlのバキュテイナー管中に１９ゲージ針を使用して静脈穿刺によって採集した。患者が適切な動脈カテーテルを有する場合、血液を内在する動脈系から抗凝血剤として１．５ccのACD−A、ヘパリンまたはEDTAを含有するプラスチック注射器中に回収した。注射器を、１０ccの標線まで満たした（８．５cc採取した）。バキュテイナーまたは注射器から抗凝血剤を含有する血液を、直ちに、ポリプロピレン遠心管に移した。血小板低含有血漿（PPP）を、１９００×ｇで２０分間全血を遠心分離することによって生成した。PPPを、プラスチックの移動ピペットによって細胞ペレットから採取し、以下に記載するELISA形式でアッセイしたか、または後の分析のために等分して−７０℃で凍結した。可溶性Ｐ−セレクチンを、96ウェルMaxiSorp^TM（Nunc）マイクロタイタープレートをネズミ抗Ｐ−セレクチンMab W40 IgGで被覆し、各ウェルに１００μlの抗体を（PBS中５μg／mlの濃度で）添加することによって酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）で測定した。プレートを4℃にて約1８時間インキュベートした。被覆したマイクロタイタープレートを、２００μl／ウェルのPBSで３回洗浄し、そして１％のウシ血清アルブミン（BSA、Fraction V、Sigma、St．Louis、MO）を含有する２００μl／ウェルのPBSの添加によって３７℃にて１時間ブロックした。ブロックしたプレートを、以下の同時に添加した成分とともに、３７℃にて２時間インキュベートした：可溶性Ｐ−セレクチン標準品またはドナー血漿試料である西洋ワサビペルオキシダーゼ共役ストレプトアビジンおよびビオチン共役抗Ｐ−セレクチン抗体S12 IgG（これは、W40 IgGによって認識される点で異なるＰ −セレクチンエピトープに結合する）。１％のBSA、０．０５％のTween 20、および２５μｇ／mlのB2TT（非Ｐ−セレクチン特異的ヒト抗ネズミ反応性を排除するためのネズミIg；Centocor、Malvern、PA）を含有するPBSを、全てのアッセイ成分の希釈剤として使用した。血漿試料を、アッセイ希釈物中で１：４の最終濃度で評価した。試料および標準品のインキュベーション後、プレートを、０．０５％のTween 20を含有する２００μl／ウェルのPBSで４回洗浄した。色素を、１００μl／ウェルのHRP基質であるO-フェニレンジアミンジヒドロクロライド（OPD）の添加によって発色させた。発色を、１００μl／ウェルの４ＮのH₂SO₄の添加によって２０分後に停止させた。プレートを、Molecular Deviceプレート読み取り機で４９０nMで読み取った。データを分析するためにSoftmaxソフトウェアを使用した。標準曲線（図３）を、分子の膜貫通部分を含まないＰ−セレクチンの短型を生じる遺伝子（Ushiyama ，S．ら、J．Biol．Chem．、268：15229（1993）、この教示は、全て本明細書中で参照として組み込まれる）でトランスフェクトした、ヒト腎臓細胞株（293細胞）によって産生される、既知の量の可溶性Ｐ−セレクチンについての平均の吸光度をプロットすることによって作成した。図３は、３．２〜３２０ng／mlまでの可溶性Ｐ−セレクチンの濃度についての、可溶性Ｐ−セレクチンのELISAを実行して得られる典型的な標準曲線を示す。図３に見られるように、各標準値について平均の吸光度を、Ｙ軸にプロットし、Ｐ−セレクチンの濃度をＸ軸にプロットした。点を、対数−対数曲線適合プログラムを使用して適合させた。試料中の可溶性Ｐ−セレクチンの濃度を、適当な希釈率で掛け算した標準曲線から決定した。内因性の可溶性Ｐ−セレクチンの正常なレベルを、抗血小板療法を受けていないかまたは冠動脈疾患を罹患していないボランティアのドナー（ｎ＝１２）で評価した。表４は、凝固促進ゲルを含むまたは含まないバキュテイナー中に採集した血清中、および以下の抗凝血剤中に採取した血漿中の可溶性Ｐ−セレクチンの正常範囲を示す：ACD−A、ヘパリン、およびEDTA。表４．正常（ｎ＝１２）血漿中および血清中の可溶性Ｐ−セレクチンレベル表４は、回収された全血から単離された血漿について、あるいは凝血誘導ゲルを用いてまたは用いないで回収した血清について、抗凝血剤であるＡＣＤ−Ａ、ヘパリン、またはＥＤＴＡ中で可溶性Ｐ−セレクチンＥＬＩＳＡを行う場合の正常なドナー（ｎ＝１２）に見られる可溶性Ｐ−セレクチンの平均±標準偏差を提供する。可溶性Ｐ−セレクチンは、その値が特定のタイプの血漿試料または血清試料についての正常な平均値より３標準偏差超えれば、有意に高いと考えられる。性能特性可溶性Ｐ−セレクチンのELISA形式についてのアッセイ中の変化（アッセイ内の精度）を、ACD−A抗凝血剤中に採集したヒト血漿に対して、既知の量の可溶性Ｐ−セレクチンを添加することによって決定した。詳細には、４つの血漿試料を、高量（６００ng／ml）、中程度の量（３００ng／ml）、低量（４０ng／ml）の tPS、またはtPSなし（０ng／ml）で強化した。（血漿中の可溶性Ｐ−セレクチンの内因的レベルを、このアッセイの目的のためにゼロ添加したＰ−セレクチンとみなした。）アッセイ中の変化を導くために、各値について２１連で、同じマイクロタイタープレート上で決定した（すなわち、各４つの試料を、２１連で一つのプレート上でアッセイした）。表５に示すように、低量、中程度の量、高量のＰ−セレクチンを、アッセイで決定した。表５に示すように、１０％未満の変化率（CV）が、全ての可溶性のセレクチンレベルについて達成された。表５．ヒト血漿用可溶性Ｐ−セレクチンＥＬＩＳＡのアッセイ中の変化性可溶性Ｐ−セレクチンのELISA形式のアッセイ間の変化（アッセイ間の精度）を、１０個の異なるアッセイで決定した。ここで、４つの血漿試料（抗凝血剤としてACD−A）の６連の測定を、ゼロ（内因性の可溶性Ｐ−セレクチンのみ）、低量（２０ng／ml）、中程度の量（２５０ng／ml）、および高量（６００ng／ml）の可溶性Ｐ−セレクチン（tPS）で強化した。観察されうるように、全てのCVは１５％以下であった（表６）。表６．ヒト血漿用可溶性Ｐ−セレクチンＥＬＩＳＡのアッセイ間の変化性実施例３．PMAに応答した血小板Ｐ−セレクチン発現の誘導を測定するためのラジオイムノアッセイ（RIA）の使用健常なドナー由来の血漿中の血小板を、実施例１に記載のように全血から単離し、そして５〜５００nMの範囲の種々の最終濃度での血小板活性化アゴニストPM Aによって活性化した。活性化した血小板中のＰ−セレクチンを、容量に依存した方法でPMAに応じて膜に移し、これを、ヨウ素化抗Ｐ−セレクチン抗体である¹ ²⁵ I−S12の結合によって測定した。１分あたりのより高いカウントで示されるより多量の抗体が、濃度を増加させたPMAと結合した。図４Ａおよび図５Ｂは、この滴定の結果を示す。図４Ａにおいて、このデータを結合したカウントとして示し、図４Ｂにおいては、PMAの各滴定についての活性化指標（AI）を、実施例１に示す式に従って計算する。実施例４．PMAによって誘導された血小板に結合したＰ−セレクチンの発現はReo Pro^Rの存在下で減少し、RIAによって測定されうる血小板高含有血漿（PRP）を、実施例１に記載するように２人の正常なドナーの全血から調製し、各ドナーに由来するPRPを２つの等量のアリコートに分けた。ReoPro^R（abciximabまたはc7E3 Fabとも呼ばれる；Centocor，Inc．、Malvern 、PA）は、血小板上の糖蛋白質IIb／IIIa（GPIIb／IIIa）レセプターに対して特異性を有するキメラFab抗体フラグメントである（国際公開第95／12412号パンフレット、1995年５月11日；国際公開第89／11538号パンフレット、1989年11月30 日；EPIC研究員、N．Engl．J．Med．、330：956−961（1994）；およびTopol，E .J.ら、The Lancet、343：881−886（1994）を参照のこと、これらの教示は、全て本明細書中に参照として組み込まれる）。ReoPro^R（５μg／mlの最終濃度で）を各ドナーのPRPの半分に添加し、そして２０分間インキュベートした。次いで、ReoProを含むおよび含まないPRPを０．５mlのアリコートに分け、そして種々の濃度のPMAで１５分間刺激した。全ての種々の条件に供した血小板の表面上で発現されたＰ−セレクチンを、実施例１に記載したRI Aプロトコールを使用して、¹²⁵I−S12の結合によって測定した。各条件下（すなわち、種々の濃度のPMAで刺激されたReoPro^Rを含むまたは含まない）での各ドナーの活性化指標を、実施例１の式に従って計算した。予想外に、ReoPro^Rは、血小板に結合したＰ−セレクチンの発現を低下させ、従って、両方のドナーについての活性化指標（AI）を低下させ、そしてこの低下を、実施例１に記載のRIAプロトコールを使用して測定することができた（図５）。５μg／mLのReoProの存在下で１つのドナーについて、１０nMのPMAで、AIの３３％の低下（８．２２に対して５．４８）を観察した。実施例５．PTCAを受けた患者における血小板に結合したＰ−セレクチンの発現を RIAで測定することができ、この発現はReoPro^Rの存在下で低下する血小板高含有血漿（PRP）を、不安定な扁桃炎および心筋梗塞を含む冠動脈疾患についてPTCAを受けた６人の患者の全血から調製した。２人の患者はReoPro^R を受け、１人の患者は、回転式粥腫切除（ロータブレーション）を受けた。正常なドナーについて計算した活性化指標は、２．７±１．５である。４．２の活性化指標は、平均よりも１標準偏差より大きい。５．７以上の活性化指標は、平均よりも２標準偏差大きい。表７は、患者＃４および＃６（両者とも、製造業者の説明書に従って、比較的多量にReoPro^Rの１２時間の点滴を受けさせた）において、活性化指標が、PTCA前や直後に有意に上昇したが、手順後２４時間までに正常な範囲に戻ったことを示す。ReoPro^Rを含む抗血小板療法の効果を、Ｐ−セレクチンの発現を通じて血小板活性化状態を測定するため、実施例１に記載のRIA を使用して決定することができる。表７．ＰＴＣＡを受けた患者から得られるＲＩＡおよび可溶性Ｐ−セレクチンＥＬＩＳＡの結果表７は、PTCA前後の６人の患者における血小板Ｐ−セレクチン発現を示す。血小板Ｐ−セレクチンを、FITC標識したS12 Mabを使用してPRPのフローサイトメトリーでの評価によって（R.E．Scharfら、Arteriosclerosis and Thrombosis、12： 1475（1992）を参照のこと）、および実施例１に詳述する¹²⁵I標識したS12を使用するRIAによって、陽性細胞の割合として測定した。PTCAの前および後での可溶性Ｐ−セレクチンの発現を、実施例２に記載のELISAプロトコールを使用して決定した。実施例６．可溶性Ｐ−セレクチンの発現は時間および用量に依存した方法でPMA 活性化によってインビトロで誘導され、そしてReoPro^Rの存在下で減少する GPIIb／IIIaアンタゴニストReoPro^Rの効力を測定するための実施例２に記載の可溶性Ｐ−セレクチンアッセイの予測外の有用性を、全血が３人の正常なドナー由来のACD−A抗凝血剤中で得られる活性化インビトロの研究において観察した。全血を、２mlのアリコートに分け、そして種々の量の血小板活性化アゴニストPM Aとともに種々の時間の間、別々のポリプロピレン管中で室温でインキュベートした。アッセイした時点は、１、５、および２４時間であり、そしてPMAの量は、０、２０、１００、および５００nMであった。各ドナーについて、二連の管を、各時点および各PMA濃度について作製した。二連の管のうちの一方は、ReoPro^R （abciximab、c7E3）を最終濃度５μg／mlで含み、別の管には、等量のReoPro^R 希釈物を添加した。血小板低含有血漿を、１〜２４時間の種々の時点で全血から調製し、そして可溶性Ｐ−セレクチンを、実施例２に記載のELISAプロトコールを使用して決定した。図６は、５時間までに、ReoPro^Rの存在下での２０、１００、および５００nMのPMAによって刺激された血液中で観察される可溶性Ｐ−セレクチンの減少を示す（９６．８±４ng／mLに対して６６．１±５ng／mL（５００nMのPMA処理））。５００nMのPMAの存在下では、可溶性Ｐ−セレクチンが３１％減少し、これは、ReoProの存在下で検出することができる。２４時間までのRe oProに起因する可溶性Ｐ−セレクチンの減少は、４１％であった（１７９．５± １２．５ng／mLに対して１０５．７±１１．１ng／mL（５００nMのPMA処理））。実施例７．可溶性Ｐ−セレクチンはそれらの血小板に結合したＰ−セレクチンにおける増大に比例してPTCAを受けた患者において増大され、PTCAによって生じた活性化のモニターにおける有用な手段である予想外に、可溶性Ｐ−セレクチンのレベルは、PTCA手順が有意な血小板活性化を誘導した患者においてPTCA後に上昇した。PTCAを受けた６人の患者からACD−A 抗凝血剤中に全血を採集し、そして実施例２に記載のように血小板低含有血漿を単離した。それらの血小板低含有血漿中で可溶性Ｐ−セレクチンのレベルを、実施例２に記載のELISAプロトコールによって決定した。表７に示すこの観察の一例は、不安定なプラークの構築により２９．９５のPTCA後の活性化指標（２．７ ±１．５が正常）を生じた患者＃３である。患者＃３の可溶性Ｐ−セレクチンレベルは続いて、手順後２４時間で上昇した（PTCA前の２４．５ng／mlからPTCAの２４時間後で３４．１４ng／ml）。 PTCAによって生じる活性化の程度をモニターするための可溶性Ｐ−セレクチンの使用の他の例は、ロータブレーションにより活性化指標が増加し、また手順直後に観察される可溶性Ｐ−セレクチンが増大する患者＃５において観察される（４４．８５ng／ml〜５１．５４ng／ml）。対照的に、ReoProを与えた２人の患者は、PTCA後の彼らの可溶性Ｐ−セレクチンレベルにおいて減少を示した。この結果は、図６に記載する研究において観察された可溶性Ｐ−セレクチンの減少と同様である。 AMIについてPTCAを受けた１人の代表的な患者は、PTCA前のAIが６．６であった。この患者に、ReoPro^Rを与え、そしてPTCAの直後のこの患者のAIは５．１であり、そして手順後２４時間で２．４に低下した。同じ期間の間に、この患者の血漿のＰ−セレクチンレベルは、ReoPro^Rが可溶性Ｐ−セレクチンレベルを低下させ得るという観察とは対照的に、４５％低下した。実施例８．可溶性Ｐ−セレクチンは深部静脈血栓症の病歴を有する患者において正常なレベルより増大する予想外に、可溶性Ｐ−セレクチンのレベルは、その病歴が深部静脈血栓症（DV T）を含む２人の患者について、正常な平均値（ACD血漿中での正常な平均値＝２５．６±７．５ng／ml）よりも３標準偏差より大きかった。動脈血栓症は血小板媒介性であると一般に考えられているが、静脈の血栓症は主に血小板に媒介されるとは考えられていない。DVT患者に存在する有意に高いレベルの可溶性Ｐ−セレクチンは、活性化された血小板が深部静脈血栓症において役割を果たすことを示す。表８に示すように、患者＃２および＃１３の両方はDVTと診断され、そして有意に高レベルの可溶性Ｐ−セレクチンを有した（患者＃２は６５．０３ng／ ml；および患者＃１３は５５．３ng／ml）。対照的に、可溶性Ｐ−セレクチンおよび血小板に結合したＰ−セレクチンは、冠状血管の疾患の非存在下での血管の外科手術（腹部の大動脈瘤（AAA）の修復を含む）において有意に上昇しなかった（患者＃４および＃７）。患者＃１（RIAにおいて有意に上昇した血小板Ｐ−セレクチンを示し、そして非イオン性の対照培地（NCM）を使用する外科手術後に有意に上昇した可溶性Ｐ −セレクチンを示した）にもまた、関心がある。この対照培地は、フローサイトメトリーでの評価によって評価した場合に、血小板活性化を生じたことが報告されているが（M.J．Kozaら、Investigative Radiol．、30：90（1995）を参照のこと）、この決定は、これまでは、本研究におけるようには可溶性Ｐ−セレクチンの増大とは関連付けられていなかった。患者＃１では、可溶性Ｐ−セレクチンのレベルは、非イオン性の対照培地が使用される血管造影手順の後までは有意に増大しなかった。次いで、対照培地による血小板活性化の効果を、手順後の可溶性Ｐ−セレクチンの決定で観察した。これは、対照培地によって誘導された血小板活性化の決定のための独特の方法である。この患者のRIAは、可溶性Ｐ−セレクチンの結果と一致した。RIAによって測定した血小板活性化は、非イオン性の対照培地の使用の結果と同様に有意に上昇した。この効果をまた、Kozaおよび他の研究者らによって使用されているフローサイトメトリー対照法において観察した。表８は、血管の外科手術またはPTCA以外の項目を受けた１３人の患者の血小板Ｐ−セレクチンの発現を示す。血小板Ｐ−セレクチンを、フローサイトメトリープロトコールにおいて陽性細胞の割合として（表７を参照のこと）、そして実施例１のプロトコールに従ってRIAによって測定した。外科手術前および後の可溶性Ｐ−セレクチンの発現を、実施例２のELISAプロトコールを使用して決定した。表８において、AAAは、腹部の大動脈瘤の修復であり；NCMは、非イオン性対照培地であり；AMIは、急性心筋梗塞であり；DVTは、深部静脈血栓症である。表８．血管手術（非−ＰＴＣＡ）を受けた患者についてのＲＩＡおよび可溶性Ｐ −セレクチンＥＬＩＳＡの結果実施例９：膜結合Ｐ−セレクチンを測定するためのフローサイトメトリーの使用フローサイトメトリーは、血小板Ｐ−セレクチンレベルを決定する一つの方法であり、その結果は、Ｐ−セレクチンのプロフィールの測定に寄与する。サブパートａ）フローサイトメトリーの準備用全血由来の血小板高含有血漿（ＰＲＰ）の調製：フローサイトメトリーは、本明細書で述べるように患者試料中の血小板Ｐ−セレクチンを決定する方法である。酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）プロトコールを用いて可溶性Ｐ−セレクチンを決定した。膜結合Ｐ−セレクチンで測定される血小板活性化の正常値と循環可溶性Ｐ−セレクチンの正常レベルを明らかに健常なボランティアのドナーについて決定した。インビトロ研究のため、１９ゲージ針を用い、抗凝血剤としてＡＣＤ溶液Ａ（ Becton Dickinson、カタログ番号364606）またはＡＣＤ溶液Ｂ（Becton-Dickins on、カタログ番号364816）のいずれかを含んだバキュテイナー(vacutainer)管内に静脈穿刺で全血を集めた。抜き取る３０分内に、一つのバキュテイナーから抗凝血剤を含有した血液を、改変タイロード緩衝液（ＭＴＢ）（２０ｍＭＨＥＰＥＳ、１８７ｍＭＮａＣｌ、４ｍＭＫＣｌ、５０ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄、１ｍＭＭｇＣｌ６Ｈ₂Ｏ、５．５ｍＭグルコース、１％ウシアルブミン）中アピラーゼ（終濃度１Ｕ／ｍＬ（Sigma、St．LouiS、MO、カタログ番号A 9149）とプロスタグランジンＥ₁（ＰＧＥ₁、終濃度１μＭ）（Sigma、St．Louis、MO、カタログ番号P 5515）のアリコートの予め測定したものを含有する１５ｍＬのポリプロピレン製遠心管(ＶＷＲ、カタログ番号21008-102)に移した。血液試料中の血小板上で発現されるＰ−セレクチンが実際のインビボレベルの血小板活性化を示すように、ポリプロピレンの使用と、アピラーゼおよびＰＧＥ₁の添加が、インビトロの血小板の活性化を防ぎ、血小板上でのＰ−セレクチン発現を安定化させた。また、試料を穏やかに混合し、取扱い、かつ室温で全ての工程を実行することは、インビトロ活性化を防ぐのに重要なことであった。全血を６００×ｇでベックマンＧＳ−６ＫＲ遠心分離機中またはスイッチングバケットを有するローターを配設した均等物中で、３分間（３〜６ｍＬの血液量）または６分間（１０ｍＬの血液量）室温で停止せずに血小板高含有血漿を遠心分離することにより調製した。上清血小板高含有血漿を各遠心管からプラスチック製トランスファーピペット（Sarstedt、番号86.1174または均等物）を用いて取り除き、５ｍＬのポリプロピレンスナップキャップ管（ＶＷＲ、カタログ番号60819-728または均等物）に移し、蓋をしてＣＯ₂放出を最小にした。サブパートｂ）フローサイトメトリー分析用血小板高含有血漿の処理：血小板高含有血漿中の血小板をフローサイトメトリー分析用Ｐ−セレクチン特異的モノクローナル抗体で染色した。正常なドナーは、活性化した血小板又はＰ−セレクチンを発現している血小板の割合が低い。これらの正常なドナーは、有意な血小板活性化のレベルを決定するのに用いられる試料を提供した。患者の試料は、Ｐ− セレクチンに対して陽性な全血小板の割合が明らかに健常なボランティアのドナーに見られる陽性な血小板の割合の平均より２標準偏差以上である場合に、有意な血小板活性化を示した。フローサイトメトリー分析用血小板高含有血漿を改変タイロード緩衝液（ＭＴＢ）中で１：６に希釈し、逆さにして穏やかに混合した。これらの染色した試料を、４５μＬの希釈した血小板高含有血漿を５μＬの改変タイロード緩衝液を含有する２つの試験管と５μＬのホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）（Sigma、P-8139または均等物）を含有する１つの試験管にそれぞれ等分し、終濃度２０ｎＭＰＭＡを製造することにより調製した。２０ｎＭＰＭＡは、室温での１５分間のインキュベーションの間に血小板高含有血漿を最大に活性化し、この試料は、Ｐ−セレクチン特異的抗体が、この系中のそのリガンドに結合したことを示すための対照として役割を果たす。３０μＬのマウスＩｇＧＦＩＴＣ（５０μｇ／ｍＬ、Becton Dickinson、カタログ番号349041または均等物）をＰＲＰと緩衝液を含有する１本の非活性化試験管に添加した。この試料は、陰性のアイソタイプ適合対照試験管であった。３０μＬのフルオレセイン共役Ｐ−セレクチン特異的抗体Ｓ１２−ＦＩＴＣを１つの非活性化試料（試験試料）と、希釈したＰＲＰの最大に活性化した（陽性対照）試料とに添加した。室温で２０分間インキュベーションした後、試料を８０μＬの２％パラホルムアルデヒド（Electron Microscopy Sciencesカタログ番号15712-Sまたは均等物）を室温で３０分間添加して固定した。試料をフローサイトメトリー分析前の７２時間まで２〜８℃で保存した。サブパートｃ）ＰＲＰでの血小板のフローサイトメトリー分析：調製した試料をＦＡＣＳａｎフローサイトメーター（Becton Dickinson、San Jose、CA）を用いて血小板Ｐ−セレクチン発現について分析した。該装置には波長が４８８ｎｍの１５ｍＷアルゴン−イオンレーザーが配設されていた。ＦＩＴＣ蛍光を５３０ｎｍバンド通過フィルターを用いて検出した。血小板を対数スケールでそれらの順方向散乱と副散乱により同定した。１０Ｅ５−ＦＩＴＣ抗体を用いて、全ての血小板上に見られるＧＰＩＩＢ／ＩＩＩａレセプターを染色することで指標の血小板光散乱を確認した。収集口を血小板群の周囲に移動させ、それを用いて、１秒当たり４００〜１０００事象の速度で１０，０００個の血小板を集めた。血小板領域の分析をＣｅｌｌＱｕｅｓｔ^TM４０を用いて行った。使用した分析方法において、対照マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣとＳ１２−ＦＩＴＣの対数ＦＬＩヒストグラムを重ねた。統計学的なマーカーは、陽性と思われるマウス対照で染色された１％の細胞に帰する場所に置かれた。同じ位置にマーカーを維持して、Ｐ−セレクチン発現について陽性であったＳ−１２−ＦＩＴＣ染色された細胞の割合を決定した。最大に活性化された試料中の陽性の細胞の割合も評価して、Ｓ１２−ＦＩＴＣ抗体がＰ−セレクチンに最適に結合したことを保証した。図１に示すフローサイトメトリーアッセイから診断的な感度を説明する一連のカラーヒストグラムを作成した。ヒストグラムには色がつけられているので、ヒストグラムをアプリケーションに含めなかった。ヒストグラムの目的は、非活性化血小板を含む全血に対する完全に活性化された血小板の増加割合の追加の直線性を示すことにあった。血液をドナーから取り出し、２つの部分に分け、そのうちの１つを活性化させず、もう１つをＰＭＡで活性化した。活性化した血小板を非活性化試料に対する全体の増加割合に加えた。活性化した血小板の添加効果を、得られた割合の陽性の血小板のフローサイトメトリー測定により決定した。この詳細な実験において、非活性化試料の基底の活性は５．０６％である。非活性化血液試料に対する総数の１％を数える最大に活性化した血小板を添加することで、６．４１％の活性化した血小板を検出した。５．０６％の基準に５％の活性化血小板の添加は、この方法により決定される９．３９％の活性化に帰した。この実験は、全血の試料中に存在する活性化した血小板の割合がこれらを活性化した血小板決定するための実行可能な方法にするのに必要な感度で正確に評価されうることを示す。実施例１０：膜結合Ｐ−セレクチンを測定するための容積測定キャピラリーサイトメトリーシステムの使用：膜結合Ｐ−セレクチンを測定するのに利用する容積測定キャピラリーサイトメトリーシステムは、Biometric Imaging、Mountain View、CA製のＩＭＡＧＮ２０００^TMであった。（図８を参照）。サブパートａ）容積測定キャピラリーサイトメトリーシステムを用いた膜結合Ｐ −セレクチンを測定するのに好適な試料の獲得と調製：全血を１９ゲージ針を用い、抗凝血剤としてＡＣＤ溶液Ａ（Becton Dickinson 、カタログ番号364606）またはＡＣＤ溶液Ｂ（Becton-Dickinson、カタログ番号 364816）のいずれかを含んだバキュテイナー管内に静脈穿刺で全血を集めた。抜き取る３０分以内に、１つのバキュテイナーから抗凝血剤を含有した血液を、改変タイロード緩衝液（ＭＴＢ）（２０ｍＭＨＥＰＥＳ、１８７ｍＭＮａＣｌ、４ｍＭＫＣｌ、５０ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄、１ｍＭＭｇＣｌ６Ｈ₂Ｏ、５．５ｍＭグルコース、１％ウシアルブミン）中アピラーゼ（終濃度１Ｕ／ｍＬ（Sigma、St．Louis、MO、カタログ番号A 9149）とプロスタグランジンＥ₁（ＰＧＥ₁、終濃度１μＭ）（Sigma、St．Louis、MO、カタログ番号P 5515）のアリコートの予め測定したものを含有する１５ｍＬのポリプロピレン製遠心管(ＶＷＲ、カタログ番号21008-102)に移した。血液試料中の血小板上で発現したＰ−セレクチンが実際のインビボレベルの血小板活性化を示すように、ポリプロピレンの使用と、アピラーゼおよびＰＧＥ₁の添加により、インビトロにおける血小板の活性化を防ぎ、血小板上でのＰ−セレクチン発現を安定化させた。また、試料を穏やかに混合し、取扱い、室温で全ての工程を実行することは、インビトロ活性化を防ぐのに重要なことであった。サブパートｂ）容積測定キャピラリーサイトメトリーシステムを用いた使用に好適な試料の染色：アピラーゼとＰＧＥ₁とを含有する全血を、フルオロフォアＣｙ５で標識したＰ−セレクチン特異的抗体Ｓ１２とＷ４０のカクテル(Amersham-Searle)で染色した。改変タイロード緩衝液中のＣｙ５標識したＳ１２／Ｗ４０カクテル５μｇ／ｍＬ（１０×濃度）を５０μＬアリコートで−２０℃で凍結保存した。必要な時や廃棄する時に新鮮なアリコートを解凍した。Ｐ−セレクチンについて血小板を染色するために、４５μＬの全血を５μＬのＳ１２−Ｃｙ５／Ｗ４０−Ｃｙ５カクテルを終濃度がそれぞれ０．５μｇ／ｍＬで含有した琥珀色の試験管（Sars tedtカタログ番号72.694.034または均等物）内に等分し、室温で２０分間インキュベートした。染色インキュベーションの終了時に、血小板を、１２００μＬの２％パラホルムアルデヒド（Electron Microscopy Sciencesカタログ番号1571 2-Sまたは均等物）の添加により、希釈し固定した。染色し、固定し、希釈した全血試料（４０μＬ）をプラスチック製キャピラリーのウェル（カタログ番号VC120、Biometric Imaging、Mountain View、CA）に入れ、蛍光強度と血小板サイズゲート内の事象の数をＩＭＡＧＮ２０００装置（ Biometric Imaging、Mountain View、CA）において測定した。サブパートｃ）容積測定キャピラリーサイトメトリーシステムを用いた全血小板カウント：各試料における全血小板カウントをその両者が全ての血小板に本質的に結合するＣｙ５標識したＣＤ６１抗体（Becton Dickinson）または１０Ｅ５−Ｃｙ５抗体(Centocor社、Malvern PA)を用い、ＩＭＡＧＮ２０００バイオメトリックイメージング装置において決定した。Ｃｙ５標識したＣＤ６１と１０Ｅ５を５μ ｇ／ｍＬ（１０×）で２００μＬアリコート中に凍結保存（−２０℃）した。使用中、試薬を４℃に保持する。未使用の冷凍試薬を毎月廃棄した。全血小板カウントを５μＬの血液を５ｍＬの改変タイロード緩衝液を含有する１２×７５ｍｍのポリプロピレン製試験管(Falcon 2063または均等物)に移し、ピペットで２回上げ下げして、１：１０００希釈を完了することにより行った。次いで、４５μ Ｌの希釈血液を５μＬのＣＤ６１−Ｃｙ５または１０Ｅ５−Ｃｙ５（５μｇ／ｍＬ）を含有する琥珀色の試験管（Sarstedtカタログ番号72.694.034または均等物）に添加し、室温で２０分間インキュベートした。全−血小板(pan-platelete) マーカーで染色した４０μＬの希釈した血液をプラスチック製のキャピラリーのウェル（カタログ番号VC120、Biometric Imaging、Mountain View、CA）中に入れ、蛍光強度と血小板サイズゲート内の事象の数をＩＭＡＧＮ２０００^TM装置（ Biometric、Imaging、Mountain View、CA）において測定した。実施例１１：可溶性Ｐ−セレクチンを測定するための容積測定キャピラリーサイトメトリーシステムの使用：ＩＭＡＧＮ２０００^TM容積測定キャピラリーサイトメトリーシステムを用いて、可溶性Ｐ−セレクチンを測定した。好ましい態様は、ビーズベースの形式を使用することである。（図９を参照）。この実施例のための試料を、可溶性Ｐ−セレクチンを決定するＥＬＩＳＡ法を述べている実施例２で調製した試料と同様の方法で調製した。本技術者は、実施例２のようにマイクロタイタープレート被覆するよりむしろ、抗Ｐ−セレクチン抗体であるＷ４０でポリスチレンビーズを被覆した。ポリスチレンサルフェート化微小粒子とも呼ぶ、該ビーズ（９．７μｍ）を０．５×有用な粒子表面領域をＰ−セレクチン特異的抗体であるＷ４０で受動的に被覆した。ビーズを３０ｍＭリン酸緩衝化食塩水、１％ＢＳＡ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０中に固体が０．０１％のアッセイ容量を含有するように希釈した。トランスフェクトしたヒト腎臓細胞株（２９３細胞）で産生した可溶性Ｐ− セレクチンをある範囲の濃度の希釈液中のビーズに添加した。蛍光標識した抗Ｐ −セレクチン抗体であるＳ１２−Ｃｙ５をアッセイにおいて終濃度２．５μｇ／ｍＬで添加し、室温で２時間浸透しながらインキュベートした。本技術者は、実施例２でのようにプレートリーダー中にマイクロタイタープレートを置くよりむしろ、ビーズを含有するアッセイ混合物をＩＭＡＧＮ２０００^TM装置のキャピラリー中に入れた。４０μＬのアッセイ混合物をプラスチック製のキャプラリー（カタログ番号VC120、Biometric Imaging、Mountain View、CA）のウェル中に入れ、蛍光強度と血小板サイズゲート内の事象の数をＩＭＡＧＮ２０００装置（Bi ometric、Imaging、Mountain View、CA）において測定した。実施例１２：容積測定キャピラリーサイトメトリーシステムを用いた血小板アゴニストの存在下でのＰ−セレクチンの測定および感度：製造品であるＩＭＡＧＮ２０００^TMは、全血の試料中における活性化され、従ってその表面（膜）上でＰ−セレクチンを発現している血小板数を検出する性能を提供する。標識したＰ−セレクチン特異的Ｍａｂ（本態様ではＳ１２−Ｃｙ５とＷ４０−Ｃｙ５のカクテル）の添加により、活性化した血小板を検出した。最後に固定剤を全血に添加し、インビトロの血小板の活性化が生じないこと保証した。１または複数の標識したＰ−セレクチンＭａｂとインキュベートし、固定した血液を、次いでキャピラリー内に入れ、予め決定した容量の血液を装置の光学（レーザー）機構でスキャンした。サイズに基づいて異なる細胞型の識別が可能なサイズ範囲は、装置に予めプログラムすることができる。予め決定したサイズ範囲内では、バックグラウンドの蛍光より十分に大きな蛍光事象はいずれも１つの事象として記録された。増加させた濃度の血小板活性化アゴニストに全血を供した場合、血小板の増加数をそれらの蛍光強度（シグナル）がバックグラウンド（ノイズ）より十分大きな程度にまで活性化して、ノイズに対するシグナルの割合が事象として装置によりカウントされうるようにした。該装置を用いて行った一連の実験において、血小板活性化アゴニストＰＭＡ（ホルボールミリステートアセテート）を量を増加しながら全血に添加した。その結果により、全血試料中に存在する活性化した血小板の数の評価における装置の有効性を確認した。アゴニストの非存在下で、４つの陽性な事象（血小板）が、レーザーでスキャンされた１：２５に希釈された約５μＬの血液であることが決定された。５ｎＭのＰＭＡで、８個の活性化した血小板を検出した。４０ｎＭのＰＭＡで１２０個の活性化した血小板を検出し、５００ｎＭのＰＭＡで９６５個の活性化した血小板をカウントした。この装置の最新モデルは、最大１０００事象をカウントする。活性化した血小板数の検出に加え、１または複数の標識したＰ−セレクチン特異的Ｍａｂを用いて、全ての血小板に共通した表面分子に特異的な二次Ｍａｂ（全血小板マーカー）も全血に添加した。この詳細な態様において、使用したマーカーはＣＤ６１−Ｃｙ５である。各血小板は、十分なＣＤ６１−Ｃｙ５をその膜上に有しており、事象として検出される（ノイズに対するシグナルの割合が十分に高い）。ＣＤ６１−Ｃｙ５に対して陽性である事象の数は、スキャンした容量や血液の希釈率に応じて、全血中の血小板数のカウントを提供した。Ｐ−セレクチンに対して陽性な事象（血小板）数を血小板の総数で割って陽性の血小板の割合を得た。正常な状態および活性化した血小板の状態の割合をフローサイトメトリーで確認した。最新の装置から得られる陽性の血小板の割合は、まず同じ試料でのフローサイトメトリー決定から得られる同様の計算と相関させて２つの方法の実質的に同値であることを確認した。実施例１３：容積測定キャピラリーサイトメトリーシステムにおけるビーズ形式を用いたＰ−セレクチンの測定：製造品であるＩＭＡＧＮ２０００は、血小板低含有血漿（ＰＰＰ）の試料中に存在する可溶性Ｐ−セレクチン量を検出し定量する性能を提供する。本態様のアッセイにおいて、９．７μＭのラテックスビーズをＰ−セレクチン特異的Ｍａｂで（共役的または受動的に）被覆した。均一な量のＰ−セレクチンＭａｂが各ビーズ上に存在するように、ビーズの被覆を慎重に制御した。明確な数のビーズを可溶性Ｐ−セレクチンを含有するＰＰＰ中でインキュベートした。ビーズの添加と同時に、ビーズを被覆するのに用いたＭａｂが結合する部位と異なる、可溶性Ｐ−セレクチン上の部位に結合しているＣｙ５標識したＰ−セレクチン特異的Ｍａｂ、またはＣｙ５標識したポリクローナル抗Ｐ−セレクチン抗体調製物をＰＰＰに添加した。インキュベーション期間の終わりに、ビーズを含有する血漿をキャピラリーに入れ、予め決定した容量の血漿を装置の光学（レーザー）機構でスキャンした。９．７μＭのビーズを含むサイズ決定を装置のプログラム内に予め設定した。サイズの一定領域で、十分な蛍光のある（バックグラウンドを超える）全ての事象の蛍光強度を計算した。ビーズの蛍光強度は、表面Ｍａｂが結合し、１または複数の標識されたＰ−セレクチン抗体で検出される可溶性Ｐ−セレクチンの量に正比例した。特異的な蛍光強度と相互に関連する可溶性Ｐ−セレクチンの量を定量するため、増加し、慎重に決定した量の単離した組換え可溶性Ｐ− セレクチンで一連のビーズを被覆し、次いでアッセイに用いたＣｙ５標識した抗Ｐ−セレクチン抗体でインキュベートした。この方法において、可溶性Ｐ−セレクチン濃度と一致する蛍光強度の標準曲線を確認した。次いで、ビーズの蛍光強度を決定することにより、試験血漿とインキュベートしたビーズに結合する可溶性Ｐ−セレクチンの量を標準曲線のみから決定した。この方法を用いる初期のアッセイは、公知の量の単離された組換え可溶性Ｐ−セレクチンをヒト血漿中に加えて強化し、Ｃｙ５標識したＳ１２の存在下で抗Ｐ−セレクチンＭａｂ（Ｗ４０）被覆したビーズとインキュベートした場合、ビーズの蛍光強度が可溶性Ｐ−セレクチンの濃度の増加と共に直線的に増加することを示す。この方法は、本明細書に記載のＥＬＩＳＡである参照方法に匹敵する結果を提供するような、可溶性Ｐ−セレクチンを測定する代替方法である。均等物本発明は、その好ましい態様への参照を具体的に示し、かつ述べているが、様々な形態の変化および詳細が、添付された請求の範囲により規定された本発明の思想および範囲から離れることなくなされることを、当業者により理解されるであろう。当業者は、本明細書に詳細に記載された発明の特定の態様に対して多くの均等物を、日常的な経験を用いるだけで認識し、あるいは確認することができるであろう。そのような均等物は、以下の請求の範囲に包含されることを意図する。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１０年１１月２３日（１９９８．１１．２３）【補正内容】ひとたび活性化された血小板は、膜糖蛋白質ＧＰＩＩｂ/ＩＩＩａ複合体上にフィブリノーゲン結合部位を露出し、フィブリノーゲン架橋を介して血小板凝集が起きる[マックイーバー（McEver，R.P.）、"血小板膜糖蛋白質の臨床的意義"Hem atol．Oncol．Clin．North Am.，4:87-103(1990)；ドゥーら（Du，X．et al．）、"リガンド「活性」インテグリンα_IIbβ₃（血小板ＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａ）""C ell，65:409-416(1991)]。血小板活性化の程度は、最大活性血小板試料を参照標準として用い、全血試料中のＰ−セレクチンのイン・ビトロでの発現の程度を決定することにより蛍光定量的に測定された。国際公開第９６／１２９５６号パンフレット。Ｐ−セレクチンはＣＤ６２、ＧＭＰ−１４０またはＰＡＤＧＥＭとして知られ、白血球輸送を調節する接着受容体のセレクチンファミリーの１つである[ローレンスとスプリンガー（Lawrence，M.B．and T.A．Springer）、Cell，65:859（ 1991）；ジョンストンら（Johnston，G.I．et al．）、Cell，56:1033-1044（19 89）；マックイーバー（McEver，R.P.）、米国特許第５，３７８，４６４号明細書]。Ｐ−セレクチンは、活性化されていない血小板のα顆粒、および内皮細胞のヴァイベル-パラーデ体に存在する内在性膜糖蛋白質である［ペールシュケ（P eerschke，E.I.B．）、Am．J．Clin．Pathol.，98:455（1992）；マックイーバー（McEver，R.P.）、1993，"Ｐ−セレクチンを介した白血球相互作用"Structur e，Function and Regulation of Molecules Involved in Leukocyte Adhesion中、リプスキーら（Lipsky，P.E．et al．）編、（Springer Verlag，New York）1 35-150頁］。血小板や内皮がトロンビン、ホルボールエステル、またはＡＤＰを含むアゴニストにより活性化されると、分泌粒子から細胞表面へのＰ−セレクチン転位が起き、その合成はサイトカイン類によっても増大する[ステルンベルグら（Sternberg，P.E．et al.）、1985，"血小板のα顆粒膜蛋白質（ＧＭＰ− １４０）は活性化後の血漿上で発現される"J．Cell Biol.，101:880-886(1985)] 。１７．血小板が該試料から予め除去されており、かつ該Ｐ−セレクチンが可溶性Ｐ−セレクチンである、請求項１５記載の方法。１８．該アンタゴニストが糖蛋白質ＩＩｂ／ＩＩＩａに対する特異性を有する抗体である、請求項１５記載の方法。１９．糖蛋白質ＩＩｂ／ＩＩＩａに対する特異性を有する抗体がキメラ７Ｅ３Ｆａｂ断片である、請求項１８記載の方法。２０．Ｐ−セレクチンレベルを評価する工程が可溶性Ｐ−セレクチン及び膜結合Ｐ−セレクチンのレベルを評価する工程を含む、請求項１５記載の方法。２１．可溶性Ｐ−セレクチンのレベル及び膜結合Ｐ−セレクチンのレベルを評価する工程が本質的に同時に起こる、請求項２０記載の方法。２２．試験対象の試料とＰ−セレクチンに対する特異性を有する抗体とを、該抗体とＰ−セレクチンの複合体の形成に適した条件下に合わせる工程、および該複合体の形成を検出または測定する工程をさらに含む、請求項１記載の方法。２３．該抗体が標識される、請求項２２記載の方法。２４．該標識が放射活性標識である、請求項２３記載の方法。２５．複合体の形成が検出可能な標識を含有する２次抗体を用いて検出または測定される、請求項２２記載の方法。２６．Ｐ−セレクチンレベルを評価する工程が可溶性Ｐ−セレクチン及び膜結合Ｐ−セレクチンのレベルを評価する工程を含む、請求項２２記載の方法。２７．可溶性Ｐ−セレクチンのレベル及び膜結合Ｐ−セレクチンのレベルを評価する工程が本質的に同時に起こる、請求項２６記載の方法。２８．（ａ）血小板を含有する第１試料および第２試料を得る工程；（ｂ）内因性血小板活性化レベルを維持するに適する条件下に該第２試料を維持しながら、該試料中の血小板の活性化に適する条件下に、該第１試料を血小板活性化アゴニストと接触させる工程；（ｃ）該試料と抗Ｐ−セレクチン抗体を含有する組成物とを、該抗Ｐ−セレクチン抗体と活性化血小板との標識複合体の形成に適する条件下に接触させる工程；ならびに（ｄ）該試料中における複合体の形成を決定する工程であって、該第１試料中に検出された複合体の量と比較した第２試料中に検出された複合体の量が、該第２試料中の血小板活性化の程度の指標である、を含む、個体における内因性血小板活性化を決定する工程をさらに含む、請求項１記載の方法。２９．該第１試料及び第２試料が全血および血小板高含有血漿からなる群より選択される、請求項２８記載の方法。３０．各試料が前もって選択された数の血小板を含む、請求項２８記載の方法。３１．該抗Ｐ−セレクチン抗体が放射活性標識を含有する、請求項２８記載の方法。３２．該抗Ｐ−セレクチン抗体が放射活性標識を含有する２次抗体の結合部位を含有する、請求項２８記載の方法。３３．（ａ）適当な試料と、ディテクターとして、抗Ｐ−セレクチン抗体を含有する組成物とそれに結合した抗Ｐ−セレクチン捕捉抗体を有する固相支持体とを接触させる工程であって、該抗Ｐ−セレクチン抗体と可溶性Ｐ−セレクチンとの複合体の形成に適する条件下に、ディテクター抗体が該捕捉抗体により認識されるものと異なるＰ−セレクチンエピトープに結合する；ならびに（ｂ）該試料中における３成分複合体の形成を決定する工程を含む、個体における内因性血小板活性化を決定する工程をさらに含む、請求項１記載の方法。３４．該ディテクター抗体がビオチン化抗Ｐ−セレクチン抗体およびＨＲＰ結合抗Ｐ−セレクチン抗体からなる群より選択される、請求項３３記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ガンブズ，シンディー，アイ. アメリカ合衆国ペンシルバニア 19380 ウェストチェスター，ウェストマーシャルストリート 524，アパートメントイー

Claims

【特許請求の範囲】１．個体由来の試料におけるＰ−セレクチンレベルを評価する工程を含む、血小板活性化状態に対する抗血小板剤の効果を決定する方法。２．該試料が血小板を含有し、かつ該Ｐ−セレクチンが膜結合Ｐ−セレクチンである、請求項１記載の方法。３．該試料が全血および血小板高含有血漿からなる群より選択される、請求項２記載の方法。４．血小板が該試料から予め除去されており、かつ該Ｐ−セレクチンが可溶性Ｐ−セレクチンである、請求項１記載の方法。５．該試料が血小板低含有血漿および血清からなる群より選択される、請求項４記載の方法。６．Ｐ−セレクチンレベルを評価する工程が可溶性Ｐ−セレクチン及び膜結合Ｐ−セレクチンのレベルを評価する工程を含む、請求項１記載の方法。７．可溶性Ｐ−セレクチンのレベル及び膜結合Ｐ−セレクチンのレベルを評価する工程が本質的に同時に起こる、請求項６記載の方法。８．内因性血小板活性化状態の尺度として、抗血小板療法を受けた個体由来の試料中のＰ−セレクチンのレベルを決定する工程を含む、内因性血小板活性化状態を診断する方法。９．抗血小板療法の維持または調整が内因性血小板活性化の所望レベルの達成に必要かどうかを観察する工程をさらに含む、請求項８記載の方法。１０．該抗血小板剤が糖蛋白質ＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストである、請求項８記載の方法。１１．該糖蛋白質ＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストが糖蛋白質ＩＩｂ／ＩＩＩａに対する特異性を有する抗体である、請求項１０記載の方法。１２．該抗体がキメラ７Ｅ３Ｆａｂ断片である、請求項１１記載の方法。１３．Ｐ−セレクチンレベルを評価する工程が可溶性Ｐ−セレクチン及び膜結合Ｐ−セレクチンのレベルを評価する工程を含む、請求項８記載の方法。１４．可溶性Ｐ−セレクチンのレベル及び膜結合Ｐ−セレクチンのレベルを評価する工程が本質的に同時に起こる、請求項１３記載の方法。１５．個体由来の試料におけるＰ−セレクチンレベルを評価する工程を含む、血小板活性化状態に対する糖蛋白質ＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストの効果を決定する方法。１６．該試料が血小板を含有し、かつ該Ｐ−セレクチンが膜結合Ｐ−セレクチンである、請求項１５記載の方法。１７．血小板が該試料から予め除去されており、かつ該Ｐ−セレクチンが可溶性Ｐ−セレクチンである、請求項１５記載の方法。１８．該アンタゴニストが糖蛋白質ＩＩｂ／ＩＩＩａに対する特異性を有する抗体である、請求項１５記載の方法。１９．糖蛋白質ＩＩｂ／ＩＩＩａに対する特異性を有する抗体がキメラ７Ｅ３Ｆａｂ断片である、請求項１８記載の方法。２０．Ｐ−セレクチンレベルを評価する工程が可溶性Ｐ−セレクチン及び膜結合Ｐ−セレクチンのレベルを評価する工程を含む、請求項１５記載の方法。２１．可溶性Ｐ−セレクチンのレベル及び膜結合Ｐ−セレクチンのレベルを評価する工程が本質的に同時に起こる、請求項２０記載の方法。２２．試験対象の試料とＰ−セレクチンに対する特異性を有する抗体とを、該抗体とＰ−セレクチンとの複合体の形成に適した条件下に合わせる工程、および複合体の形成を検出または測定する工程を含む、試料中のＰ−セレクチンレベルを評価することにより、血小板活性化状態に対する抗血小板剤の効果を決定する方法。２３．該抗体が標識されている、請求項２２記載の方法。２４．該標識が放射活性標識である、請求項２３記載の方法。２５．複合体の形成が検出可能な標識を含有する２次抗体を用いて検出または測定される、請求項２２記載の方法。２６．Ｐ−セレクチンレベルを評価する工程が可溶性Ｐ−セレクチン及び膜結合Ｐ−セレクチンのレベルを評価する工程を含む、請求項２２記載の方法。２７．可溶性Ｐ−セレクチンのレベル及び膜結合Ｐ−セレクチンのレベルを評価する工程が本質的に同時に起こる、請求項２６記載の方法。２８．（ａ）血小板を含有する第１試料および第２試料を得る工程；（ｂ）内因性血小板活性化レベルを維持するに適する条件下に該第２試料を維持しながら、該試料中の血小板の活性化に適する条件下に該第１試料を血小板活性化アゴニストと接触させる工程；（ｃ）該試料と抗Ｐ−セレクチン抗体を含有する組成物とを、該抗Ｐ−セレクチン抗体と活性化血小板との標識複合体の形成に適する条件下に接触させる工程；ならびに（ｄ）該試料中における複合体の形成を決定する工程であって、該第１試料中に検出された複合体の量と比較した第２試料中に検出された複合体の量が、該第２試料中の血小板活性化の程度の指標である、を含む、個体における内因性血小板活性化を決定する工程を含む血小板活性化状態に対する抗血小板剤の効果を決定する方法。２９．該第１試料及び第２試料が全血および血小板高含有血漿からなる群より選択される、請求項２８記載の方法。３０．各試料が前もって選択された数の血小板を含む、請求項２８記載の方法。３１．該抗Ｐ−セレクチン抗体が放射活性標識を含有する、請求項２８記載の方法。３２．該抗Ｐ−セレクチン抗体が放射活性標識を含有する２次抗体の結合部位を含有する、請求項２８記載の方法。３３．（ａ）適当な試料と、ディテクターとして抗Ｐ−セレクチン抗体を含有する組成物と、それに結合した抗Ｐ−セレクチン捕捉抗体を有する固相支持体とを接触させる工程であって、該抗Ｐ−セレクチン抗体と可溶性Ｐ−セレクチンとの複合体の形成に適する条件下に、ディテクター抗体が該捕捉抗体により認識されるものと異なるＰ−セレクチンエピトープに結合する；ならびに（ｂ）該試料中における３成分複合体の形成を決定する工程を含む、個体における内因性血小板活性化を決定する工程を含む血小板活性化状態に対する抗血小板剤の効果を決定する方法。３４．該ディテクター抗体がビオチン化抗Ｐ−セレクチン抗体およびＨＲＰ結合抗Ｐ−セレクチン抗体からなる群より選択される、請求項３３記載の方法。３５．血管介入術を受けた個体由来の試料中の可溶性Ｐ−セレクチンのレベルを、内因性血小板活性化状態の尺度として決定する工程を含む、内因性血小板活性化状態を診断する方法。３６．抗血小板療法の維持または調整が内因性血小板活性化の所望レベルの達成に必要かどうかを観察する工程をさらに含む、請求項３５記載の方法。３７．血管介入が血管形成である、請求項３５記載の方法。３８．静脈血栓障害を有する個体由来の試料中の可溶性Ｐ−セレクチンのレベルを内因性血小板活性化状態の尺度として決定する工程を含む、内因性血小板活性化状態を診断する方法。３９．抗血小板療法の維持または調整が内因性血小板活性化の所望レベルの達成に必要かどうかを観察する工程をさらに含む、請求項３８記載の方法。４０．該静脈血栓障害が深部静脈血栓症である、請求項３９記載の方法。４１．患者試料の膜結合Ｐ−セレクチンおよび／または可溶性Ｐ−セレクチンのレベルを評価する工程を含み、ここで、膜結合Ｐ−セレクチンまたは可溶性Ｐ −セレクチンのいずれかのレベルが抗血小板療法の効果の指標である、血栓障害を有する患者における抗血小板療法の効果を決定する方法。４２．評価されたＰ−セレクチンのレベルが膜結合Ｐ−セレクチンのものである、請求項４１記載の方法。４３．膜結合Ｐ−セレクチンのレベルを評価するための試料が、さらに血小板を含有する、請求項４２記載の方法。４４．該試料が全血および血小板高含有血漿からなる群より選択される、請求項４３記載の方法。４５．評価されたＰ−セレクチンのレベルが可溶性Ｐ−セレクチンのものである、請求項４１記載の方法。４６．可溶性Ｐ−セレクチンのレベルを評価するための試料が、さらに水性血液成分を含有する、請求項４５記載の方法。４７．該試料が血小板低含有血漿および血清からなる群より選択される、請求項４６記載の方法。４８．抗血小板療法が、糖蛋白質ＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストである抗血小板剤を投与する工程をさらに含む、請求項４１記載の方法。４９．血栓障害が心筋梗塞、不安定狭心症、発作、肺塞栓症、一過性虚血性発作（ａｔｔａｃｈ）、深部静脈血栓症および冠状動脈介入術につづく血栓再閉塞からなる群より選択される、請求項41記載の方法。５０．ａ）該患者由来の血小板を含有する試料中の膜結合Ｐ−セレクチンのレベルを評価する工程；およびｂ）該患者由来の水性血液成分を含有する試料中の可溶性Ｐ−セレクチンのレベルを評価する工程を含み、ここで、工程（ａ）および／または工程（ｂ）で評価された上昇Ｐ−セレクチンレベルが抗血小板療法の必要の指標である、患者における抗血小板療法の必要を決定する方法。５１．工程（ａ）および工程（ｂ）が本質的に同時に行なわれる、請求項５０記載の方法。５２．ａ）該患者由来の血小板を含有する試料中の膜結合Ｐ−セレクチンのレベルを評価する工程；およびｂ）該患者由来の水性血液成分を含有する試料中の可溶性Ｐ−セレクチンのレベルを評価する工程を含み、ここで、工程（ａ）および／または工程（ｂ）で評価されたＰ−セレクチンレベルが抗血小板療法の有効性の指標である、抗血小板療法において、患者をモニターする方法。５３．工程（ａ）および工程（ｂ）が本質的に同時に行なわれる、請求項５２記載の方法。５４．ａ）該患者から血液試料を得る工程、ｂ）該患者由来の血小板を含有する試料中の膜結合Ｐ−セレクチンのレベルを評価する工程；およびｃ）該患者由来の水性血液成分を含有する試料中の可溶性Ｐ−セレクチンのレベルを評価する工程を含み、ここで、該Ｐ−セレクチンのレベルを評価する工程が、該試料とＰ−セレクチンに特異的な少なくとも１種の抗体またはその断片とを接触させる工程、ならびに工程（ｂ）および／または工程（ｃ）で評価されたＰ −セレクチンレベルが抗血小板療法の有効性の指標であるＰ−セレクチンレベルを検出する工程をさらに含む、患者における抗血小板療法の効果を決定する方法。５５．工程（ｂ）および工程（ｃ）が本質的に同時に行なわれる、請求項５４記載の方法。５６．ａ）該患者から血液試料を得る工程、ｂ）該試料と抗Ｐ−セレクチン抗体またはその断片と接触させて、Ｐ−セレクチンと抗Ｐ−セレクチン抗体との複合体の形成を十分に可能とする工程、ｃ）抗血小板療法の必要の指標である複合体レベルを検出する工程を含む、血栓障害を有する患者の抗血小板療法の必要を決定する方法。５７．該試料が全血、血小板高含有血漿、血小板低含有血漿および血清からなる群より選択される、請求項５６記載の方法。５８．Ｐ−セレクチンのレベルを評価する工程が可溶性Ｐ−セレクチン及び膜結合Ｐ−セレクチンのレベルを評価する工程を含む、請求項５７記載の方法。