JPH10512951A - 血小板活性化の直接蛍光−結合免疫測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 最大活性化血小板試料を参照標準として用いて、全血試料におけるＰ−セレクチンの発現度をインビトロで蛍光測定することによって、血小板活性化度を測定する方法が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 血小板活性化の直接蛍光−結合免疫測定法 発明の背景 Ｐ−セレクチンは顆粒膜蛋白質−１４０（ＧＭＰ−１４０）または ＰＡＤＧＥＭ蛋白質としても知られており、血小板および内皮細胞の両方の分泌 顆粒に見出される膜内在性糖蛋白質（ｉｎｔｅｇｒａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｇ ｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）である。Ｅ．Ｉ．Ｂ．ＰｅｅｒｓｃｈｋｅによるＡｍ ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ． ，９８，４５５（１９９２）参照。これらの細 胞はトロンビンなどのアゴニストによって活性化された後に、脱顆粒反応中に細 胞表面に急速に再分布する。Ｐ−セレクチンは脱顆粒反応中、細胞表面に属して いる。Ｐ−セレクチンは配列類似性および総合ドメイン形成性を分け合う血管細 胞表面レセプターのセレクチン一族に属する。Ｇ．Ｉ．Ｊｏｈｎｓｔｏｎ等によ るＣｅｌｌ，５６，１０３３（１９８９）参照。その他の既知のセレクチン類に は、ＥＬＡＭ−１、好中球に対するサイトカイン−誘発性内皮細胞レセプターお よび細静脈の多い末梢リンパ節に対するリンパ球の帰巣指向で役割を演じる白血 球表面構造体がある。近年、Ｊ．−Ｇ．Ｇｅｎｇ等によるＢｌｏｏｄ，７４，６ ５ａ（１９８９）によって指摘されたように、ヒト好中球はプラスティック上に 不動化された精製Ｐ−セレクチンにＣａ²⁺−依存様相で結合する。さらにまた、 ヒスタミンなどの迅速活性化因子により刺激された内皮への好中球の接着は、少 なくとも部分的に、Ｐ−セレクチンにより媒介される。Ｐ−セレクチンはまた、 活性化した血小板の単球および好中球への結合に包含される。Ｓ．Ａ．Ｈａｍｂ ｕｒｇｅｒ等によるＢｌｏｏｄ，７５，５５０（１９９０）およびＥ．Ｌａｒｓ ｅｎによるＣｅｌｌ，５９，３０５（１９８９）参照。 血小板活性化は、多くの血管障害、例えば不規則性狭心症、末梢血管疾患、卒 中および血管形成および冠状血管血栓崩壊などの進行を付随することから、過去 ２０年の間に、活性化した循環血小板を検出するためのより敏感で、かつまた特 異的な方法の開発に多大の努力がなされてきた。例えば、Ｃ．Ｗ．Ｈａｍｍ等に よるＪ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．，１０，９９８（１９８７）；Ｄ． Ｊ．Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ等によるＣｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，７７，１４２（１ ９８８）およびＡ．Ｈ．ＧｅｒｓｈｌｉｃｋによるＣｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，８ １ ，１２８（１９９１）参照。インビボ血小板活性化の最も信頼できるマーカー は、活性化後に血小板から放出され、血漿または尿から測定することができる物 質、血小板因子４（ＰＦ４）、β−トロンボグロブリン（β−ＴＧ）およびトロ ンボキサンＡ₂の代謝産物であった。しかしながら、これらのマーカーは試料採 取、処理および分析に関連する技術的制限から、広汎な臨床上の許諾を得ていな かった。 膜表面糖蛋白質発現における数種の変化は、特異性ネズミモノクローナル抗体 を用いて、血小板活性化中に検出することができる。例えばＳ．Ｊ．Ｓｈａｔｔ ｉｌによりＢｌｏｏｄ，７０，３０７（１９８７）に、およびＣ．Ｓ．Ａｂｒａ ｍｓ等によりＢｌｏｏｄ，７５，１２８（１９９０）に報告されているように、 ＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａ複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）の機能性フィブリノーゲンレセ プターへの変換における変化は検出することができる。Ｊ．Ｎ．Ｇｅｏｒｇｅ等 によるＪ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，７８，３４０（１９８６）には、アルフ ァ顆粒放出を伴う血小板活性化がＰ−セレクチン発現の検出によって確認できる ことが報告されている。従って、フローサイトメトリー（流動細胞計測法）を活 性化−特異性モノクローナル抗体の使用と組合わせる検出法が計画された。例え ば、Ｒ．Ｅ．Ｓｃｈａｒｆ等によるＡｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ，１２，１４７５（１９９２）参照。これらの検出法は 全血で行うことができ、それらの活性化状態に関して異種である血小板付属集団 の検出を促進することができる。しかしながら、フローサイトメトリーは、高価 な装置を必要とし、データ処理が複雑であり、かつまた多数の試料を処理するた めには経済的に実用的ではなく、あるいは上記した場合のように、緊急の状況で 臨床上の結果を得るために必要な時間枠内に結果を得るためには実用的ではない 。 従って、血小板の活性化度を検出するための、敏感で、簡単で、かつまた迅速 なインビトロ測定法の必要性が存在している。 発明の要旨 本発明は、哺乳動物の血小板活性化度の測定方法を提供する。一般に譲渡され ている１９９３年１０月２６日付け出願の米国特許出願Ｓｅｒｉａｌ Ｎｏ．０ ８／１４２，７６６には、血小板のインビトロ予備分離を包含する血小板活性化 測定法、すなわち血小板に富んだ血漿における血小板活性化測定法が開示されて いる。この方法は活性化血小板の検出の精度および迅速性を格別に増大させたが 、本発明の方法は、この方法に優る改良を包含しており、本発明の方法は予備分 離工程を使用することなく、全血において行うことができ、従って操作時間をさ らに短縮することができる。さらにまた、予備洗浄および遠心分離による結果で あることがある細胞損失を排除することができる。 本発明の方法では、その血小板活性化レベルを測定しようとする患者から全血 試料を採取し、次いで２部分に分ける。一方の対照試料は、活性化アゴニストで 処理して、そこに含有されている血小板を最大限活性化させる。この場合に使用 するのに適するアゴニストは、例えばＡＤＰである。もう一方の試料は、外因性 活性化アゴニストでは処理しない。次いで、両試料を、予備固定溶液、例えばパ ラホルムアルデヒドで処理し、次いで血小板を部分的に固定するのに充分な時間 をかけてインキュベートする。本明細書で使用されるものとして、「部分的に固 定」の用語は、この試料中に含有されている血小板が引続く工程中に渦巻き状撹 拌によってはさらに活性化されず、あるいは損傷されない状態にあるが、試料中 の赤血球細胞は引続いて使用される細胞溶解剤とのそれらの反応性を保持してい る状態にあることを意味する。渦巻き状撹拌処理に付しながら、この試料に赤血 球細胞溶解剤を添加する。赤血球細胞溶解が生じるのに充分な時間放置した後に 、白血球安定剤を添加して、この溶解反応を停止させる。引続いて、或る量の細 胞膜固定剤を添加して、充分に固定し、試料を安定化する。本明細書で使用され るものとして、「安定化」の用語は、分析完了前の少なくとも約７２時間までの 間、試料を保存することができることを意味する。 次いで各試料に、各試料中の活性化血小板に結合させるのに有効な量で抗−Ｐ −セレクチン抗体を添加する。各試料中の、この抗体−活性化血小板複合体を、 抗−Ｐ−セレクチン抗体に結合させた蛍光標識を用いて、あるいは結合した抗体 上の結合部位に結合する蛍光標識をこの複合体に付加することによって、蛍光測 定により測定する。試料中の複合体を形成していて、外部からは活性化されない 活性化血小板の蛍光と最大活性化した血小板の蛍光との比は、哺乳動物血小板提 供者における血小板活性化度の尺度を提供する。 従って、本発明は、内在性血小板活性化を測定するための蛍光物質−結合免疫 結合測定法（ＦＣＩＢＡ、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｏｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙ）を提供し、この方法は、 （ａ）その血小板活性化を測定しようとする患者から全血試料を採取し、次い でこの試料を第一試料と第二試料とに分割し； （ｂ）上記第一試料に、この第一試料中の活性化可能な血小板を最大限活性化 させるのに有効な時間、量で活性化アゴニスト、例えばアデノシン５´−ジホス フェート（ＡＤＰ）を、添加し；他方第二試料は、等しい時間の間保持し； （ｃ）上記第一試料には、この第一試料中の活性化血小板を部分的に固定する のに有効な時間、血小板活性化反応を停止させるのに有効な量の溶液、例えばパ ラホルムアルデヒドを添加し、他方第二試料は等しい時間の間保持し； （ｄ）これらの試料を渦巻き状撹拌に付し、 （ｉ）試料中の赤血球細胞を溶解させるのに有効な量の赤血球細胞溶解剤： （ｉｉ）当該溶解剤の作用を停止させるのに有効な量の白血球安定剤；およ び （ｉｉｉ）血小板を完全に固定安定化するのに有効な量の細胞膜固定剤； を続けて添加し； （ｅ）各試料に、或る量の （ｉ）蛍光標識に結合させた抗−Ｐ−セレクチン抗体；または （ｉｉ）検出可能な蛍光標識のための結合部位に結合させた抗−Ｐ−セレク チン抗体、次いでこの結合部位に特異的に結合する検出可能な蛍光標識； を添加して、各試料中の活性化血小板と二重標識複合体を形成させ；そして （ｆ）各試料中のこの二重標識複合体の蛍光を測定し、上記第一試料の蛍光に 対する上記第二試料の蛍光の比によって、この第二試料の血小板活性化度の尺度 を得る； ことからなる。 本明細書で使用されるものとして、「内因性血小板活性化」の用語は、測定さ れた活性化がインビボ活性化によるものであって、試料に外部から活性化剤がイ ンビトロ添加されたことによるものではないことを意味するものと定義する。本 発明の好適態様において、工程（ｄ）は、試料をＱ−Ｐｒｅｐ装置［コールター （Ｃｏｕｌｔｅｒ）（登録商品名）；Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ，Ｈｉａｌｅａｈ，ＦＬ］に入れ、３０秒サイクルで操作することによって行う 。このＱ−Ｐｒｅｐ装置は、白血球形態および細胞表面完全性を保持する穏やか な、非洗浄式赤血球溶解、固定システムを備えており、組合せ３試薬システムか らなる。この測定法の開発以前には、このＱ−Ｐｒｅｐ装置は、フローサイトメ トリー用の白血球細胞の調製に主として使用されていた。驚くべきことに、Ｑ− Ｐｒｅｐ装置における血小板の処理は、血小板が延長された期間にわたり安定で あるような状態で血小板を固定させるが、この血小板は抗体と依然として反応す ることができる。この方法で処理する血液として全血を使用できることは、ＰＲ Ｐの使用に代わる別法を提供することになる。すなわち、Ｑ−Ｐｒｅｐ装置で処 理した全血から得られた結果は、ＰＲＰを使用して得られた結果と相関関係を有 する。例７および８参照。 この分析方法を発展させるために、血小板試料を種々の用量のＡＤＰで活性化 させ、固定した血小板を微量滴定プレートの凹部で、蛍光物質−結合抗−Ｐ−セ レクチン抗体とともにインキュベートした。その蛍光強度を蛍光濃度分析器で測 定した。血小板試料は一度固定されると、データ採取／分析操作は、２時間より も短い時間で完了することができる。分析内変動係数（ＣＶ）は６．９７％であ り、時間基準分析間ＣＶは６．１７％であった。本発明の分析法は、２０人の正 常献血者の血小板で発現されたＰ−セレクチンの測定においてフローサイトメト リーと優れた相関関係を示す。 予想外に、ＡＤＰ用量の増加に応答する血小板中のＰ−セレクチンの転移が、 用量依存様相で生起し、ＡＤＰ刺激用量ベース（ｒ＝０．９９）および時間間隔 ベース（ｒ＝０．９２）で、凝集検出計におけるＡＤＰ誘発血小板凝集と明確な 相関関係を有していた。 血小板の表面で検出されたフィブリノーゲンの量は、ＡＤＰに応答してまた増 加するが、ＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａ複合体に結合した抗体の強度は僅かな変化を受 けたのみであった。活性化した血小板では、フィブリノーゲン抗体結合の強度は Ｐ−セレクチン抗体結合の強度と相関関係を有していた（ｒ＝０．８５）。従っ て、本発明のもう一つの態様において、血小板上のフィブリノーゲン結合に利用 できる部位の測定は、哺乳動物の血小板活性化度の測定に使用することができる 。この分析は組織または生理学的液体、例えばヒト血液などから分離した血小板 で行うことができる。例えば、第一および第二試料は全血または血小板に富んだ 血漿からなることができる。 これらの結果は、本発明が存在する表面抗体または活性化したヒト血小板を測 定することによって、血小板活性化を迅速にかつまた簡単に分析する方法を提供 すること、およびまたＰ−セレクチンがＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａ複合体よりも、あ るいはフィブリノーゲンよりも、血小板活性化に関してより敏感で、特異的なマ ーカーであることを証明している。 従って、本発明による分析法は、急性冠状血管症候群を付随する血小板活性化 関連症状の評価、追跡および進行段階確認に、およびまた経皮トランスフェモラ ルコロナリイ血管形成（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｔｒａｎｓｆｅｍｏｒａｌ ｃｏｒｏｎａｒｙ ａｎｇｉｏｐｌａｓｔｙ）（ＰＴＣＡ）に使用することが できる。これらの症状における循環活性化血小板の役割に関しては、例えばＩ． Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ等によるＡｍ．Ｊ．Ｃａｒｄ．，７０，９８１（１９９２ ）；Ｅ．Ｍｉｎａｒ等によるＣａｒｄ．，１７０，７６７（１９８９）；Ｒ．Ｓ ．Ｓｃｈｗａｒｔｚ等によるＡｍ．Ｊ．Ｃｏｌ．Ｃａｒｄ．，１９，２６７（１ ９９２）およびＤ．Ｔｓｈｏｅｐｅ等によるＣｉｒｃ．，８８，３７（１９９３ ）を参照することができる。 図面の簡単な説明 図１は、本発明による分析法の一態様を示す構成図である。 図２は、種々の希釈度の抗−Ｐ−セレクチン抗体（ＣＤ６２）およびＩｇＧｌ 調製物を使用して、本発明による分析法で検出された休止状態血小板におけるＰ −セレクチンの蛍光強度を示すグラフである（ｎ＝２）。２人の正常献血者から 血小板を試料として採取し、この分析法で指示されているような種々の希釈度の ＣＤ６２を使用して試験した。中白丸印は非特異的結合を表わし、他方中黒丸印 は特異的結合（ＣＤ６２）を表わす。蛍光強度は、対数−変換した。 図３は、抗−Ｐ−セレクチン抗体を使用して、本発明による分析法で検出され た希釈された休止状態血小板における蛍光強度を示すグラフである（ｎ＝２）。 この場合に、２人の正常献血者からの血小板を、１：２０（容積）希釈したＣＤ ６２を用いて試験した。蛍光強度は対数−変換し、そして係数ｒは線形回帰を用 いて計算した。 図４は、種々の希釈度のＣＤ６２を使用して、本発明による分析法で検出され た休止状態血小板における蛍光強度を示すグラフである（ｎ＝２）。２人の正常 献血者からの血小板を試料として採取し、本発明による分析法で試験した。線形 回帰を使用する係数ｒの計算において、対数−変換した蛍光強度を使用した。 図５は、本発明による分析法を使用して検出された血漿中のＡＤＰ−刺激した 血小板における蛍光強度を示すグラフである（ｎ＝２）。２人の正常献血者から の血小板を試料として採取し、本発明による分析法により試験した。フィコエリ トリン（ＰＥ）結合ＣＤ６２および未結合ＣＤ６２は両方ともに、同一濃度に希 釈した。中黒丸印はＰＥ結合ＣＤ６２を使用して検出された蛍光強度を示し、他 方三角形印は未結合ＣＤ６２を使用して検出された数値を示し、そして中白丸印 は未結合ＣＤ６２およびＰＥ結合ＣＤ６２を使用して検出された蛍光強度のレベ ルを表わす。 図６は、血小板濃縮物中の血小板のＰ−セレクチンの測定におけるフローサイ トメトリー分析法と本発明による分析法との相関関係を示すグラフである（ｎ＝ ２０）。２０人の正常献血者の血小板濃縮物から血小板試料を採取し、本発明に よる分析法およびフローサイトメトリー分析法を同時的に行った。線形回帰から ｒ＝０．９３６の数値が得られた。この数値はこれら２種の分析法間の明確な関 連性を示唆している（ｐ＜０．００１）。 図７は、凝集検出計で測定した刺激用量のＡＤＰによる血小板凝集勾配を示す グラフである（ｎ＝３）。血漿中の血小板凝集は、凝集検出計により３重試験法 で行った。勾配は、ＡＤＰの各用量に応答する凝集追跡曲線の最急峻勾配の平均 値である。 図８は、本発明による分析法で分析した、Ｐ−セレクチン発現とＡＤＰの刺激 濃度との間の関係を示すグラフである（ｎ＝３）。血漿中血小板におけるＡＤＰ 最終濃度を使用した。 図９は、凝集検出計における凝集により測定した、および本発明による分析法 により検出されたＰ−セレクチンの発現により測定したＡＤＰに対する血小板の 反応性の変化を経過時間に対して示すグラフである（ｎ＝３）。３人の正常献血 者からの血小板試料を採取し、凝集検出計による分析および本発明の分析法によ り試験した。示されている時間は、採血後の血小板保存時間である。凝集追跡曲 線の最急峻勾配および対数−変換蛍光強度を使用した。 図１０は、血漿中のＡＤＰ刺激した血小板において、本発明の分析法で測定さ れたＰ−セレクチン発現と凝集検出計における血小板凝集との相関関係を示すグ ラフである（ｎ＝３）。３人の正常献血者からの血小板を凝集検出計法により、 およびまた本発明の分析法により、３重試験法で分析した。ＡＤＰ用量は、示さ れているとおりである。係数ｒは線形回帰を用いて計算した。 図１１は、血漿中のＡＤＰ刺激した血小板において、凝集検出計による凝集と 本発明の分析法によるＰ−セレクチン発現との間の相関関係を、一定時間間隔で 示すグラフである（ｎ＝３）。３人の正常献血者から採取した血漿中血小板試料 を、凝集検出計法による凝集の測定と本発明の分析法による測定において、２． ５μＭ用量のＡＤＰを使用した。数値は、３つの試料の３重試験法による結果の 平均値±標準誤差（ＳＤ）である。係数ｒは線形回帰を用いて計算した。 図１２は、血漿中のＡＤＰ刺激した血小板の表面におけるＧＰＩＩｂ−ＩＩＩ ａ複合体およびフィブリノーゲンの発現を示すグラフである（ｎ＝３）。３人の 正常献血者からの血漿中のＡＤＰ刺激した血小板を試料として採取し、本発明の 分析法で分析した。数値は、これら３つの試料の３重試験法による結果の平均値 ±標準誤差（ＳＤ）である。 発明の詳細な説明 蛍光標識または蛍光標識を含むリガンド用の結合部位を備えたモノクローナル 抗体およびポリクローナル抗体調製物は市販されているか、当業者が入手できる か、または当業者に認識されている方法によって調製することができる。代表的 なネズミ抗−Ｐ−セレクチン抗体を下記表１に挙げる。 未標識抗体は、標準技術により蛍光標識、例えばフルオレセインイソシアネー ト（ＦＩＴＣ）に結合させることができる。例えば、Ｓ．Ｊ．Ｓｈａｔｔｉｌ等 によるＢｌｏｏｄ，７０，３０７（１９８７）およびＪ．Ｗ．Ｇｏｄｉｎｇ等に よるＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａ ｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ−Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉ ｏｎ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ（１９８ ６），２５５〜２８０頁参照。別法として、この抗体はビオチニル化結合体（ｂ ｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）として調製し、Ｇｏｄｉｎｇ 等による上記刊行物、ＭｃＥｖｅｒ等による上記刊行物およびＳ．Ｊ．Ｓｈａｔ ｔｉｌ等によるＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０，１１１０７（１９８５）に 教示されているように、フィコエリトリン−ストレプトアビジンと反応させるこ とができる。ポリクローナル抗−Ｐ−セレクチン抗体調製物は、Ｐ．Ｅ．Ｓｔｅ ｎｂｅｒｇによるＪ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１０１，８８０（１９８５）に教 示されているように調製し、検出することができる。 ＡＤＰは、好適な血小板活性化−凝集アゴニストであるが、その他の血小板活 性化に有用な試薬には、トロンビン、セロトニン、コラーゲンおよびトロンボキ サン、ならびにその生体活性サブユニットポリペプチドが包含される。 本発明の工程ｄ（ｉ）の赤血球溶解剤は好ましくは、ギ酸である。この細胞溶 解剤はまた、当該試薬の貯蔵期間を増大させる安定剤を含有していてもよい。 本発明の好適態様において、白血球安定剤は、炭酸ナトリウム、硫酸ナトリウ ムおよび塩化ナトリウムの組合わせである。好ましくは、これら３種の成分を水 性溶液として使用する。この白血球安定剤は、当該溶液の保存寿命を延長させる 安定剤をさらに含有することができる。 好ましくは、工程ｄ（ｉｉｉ）で使用する細胞膜固定剤は、パラホルムアルデ ヒドである。パラホルムアルデヒドは好適固定剤であるが、数種のその他の膜固 定剤も当業者に公知である。細胞膜固定剤はまた、緩衝溶液を含有することがで きる。 好ましくは、本発明による分析法の工程（ｄ）は、自動式装置で行う。この装 置は、試料を渦巻き状撹拌し、指定試薬を迅速に添加するものである。このよう な自動式装置を使用することによって、試料調製期間を短縮することができ、こ れにより緊急の臨床上の場合に、より迅速な応答を得ることができる。このよう な装置の一例に、コールター（登録商品名）社（Ｈｉａｌｅａｈ，ＦＬ）により 製造されているＱ−Ｐｒｏｐ装置がある。このＱ−Ｐｒｏｐ装置は、白血球形態 および細胞表面完全性を保持させる穏やかな、非洗浄式赤血球溶解、固定システ ムを備えた、組合せ３試薬システムからなる。この方法で調製された血小板はＰ ＲＰの代りに使用することができる。これは、Ｑ−Ｐｒｅｐ装置で処理された全 血を使用して得られた結果が、ＰＲＰを使用して得られた結果と相関関係を有す ることに基づいている。例７および８参照。 以下の詳細な例に従い、本発明をさらに説明する。これらの例において、アデ ノシンジホスフェート（ＡＤＰ，カタログ番号８８５−３）、パラホルムアルデ ヒド（カタログ番号６２Ｈ０１７４）およびその他の化学物質は、シグマ（Ｓｉ ｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。 フィコエリトリン（ＰＥ）−結合した（カタログ番号３４８１０７）および純粋 な（カタログ番号３４８１００）ネズミモノクローナル抗ヒト血小板Ｐ−セレク チン抗体（ＣＤ６２）およびＰＥ−結合したイソタイプ特異性マウスＩｇＧｌ（ カタログ番号３４００１３）は、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｍｏｕｎ ｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）から入手した。ＦＩＴＣ−結合したネズミモノクロ −ナル抗ヒト血小板ＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａ抗体（ＣＤ４１ａ）（カタログ番号０ ６４９）は、ＡＭＡＣ（Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ，ＭＥ）から入手した。ＦＩＴＣ− 結合したヒツジ抗ヒトフィブリノーゲン抗体（カタログ番号Ｋ９００５６Ｆ）は 、ＢＩＯ−ＤＥＳＩＧＮＥ（Ｋｅｎｎｅｂｕｎｋｐｏｒｔ，ＭＥ）から入手した 。抗体は、１％ウシ胎児血清リン酸塩−緩衝溶液（ＰＢＳ）を用いて希釈した。 １０人のアスピリンを服用していない正常な献血者（年齢：２４〜４１歳、男 性：５人、女性：５人）の血液を、Ｍａｙｏ診療所で健康血液センターを介して 調達した。血液は、２１ゲージ蝶型針およびプラスティック製シリンジで採取し 、１：６（血小板活性化用）および１：９（血小板凝集用）容量の酸性クエン酸 塩デキストロース（ＡＣＤ）を含有する１５ｍｌポリエチレン製遠心分離管（Ｃ ｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．）を用いて収集した。血液試料は、それぞれ５回の停止 および加速設定を備えたミストラル（Ｍｉｓｔｒａｌ）３０００−ｉ遠心分離器 で１５℃において１０分間、２５０ｘｇで遠心分離し、血小板に富んだ血漿（Ｐ ＲＰ）を得た。残りの血液を１０分間、１５００ｘｇでさらに遠心分離すること によって、血小板が貧弱な血漿（ＰＰＰ）を得た。血小板数の測定は、コー ルター計量器（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．）で行い、 ＰＲＰおよびＰＰＰを用いて、３．０×１０ｅ−８／ｍｌの一定値に調整した。 血小板凝集試験は、二重チャンネル型凝集検出計（Ｄａｙｔｏｎ Ｄｕａｌ Ｃｈａｎｎｅｌ Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ）において、９００ｒ ｐｍの撹拌速度で３７℃において行った。ＰＲＰおよびＰＰＰの光学濃度は、そ れぞれ１０％および９０％に設定した。ＰＲＰの撹拌懸濁液０．４５ｍｌに、示 されている最終濃度までアデノシンジホスフェート（ＡＤＰ）（０．０５ｍｌ） を添加した。この凝集追跡曲線の最大値または最高急峻勾配を測定した。 この血小板凝集追跡曲線の最高勾配を、次の方程式を用いて計算した： Ｄｆｉ＝ｆ（ｔｉ）−ｆ（ｔｉ−１）／ｔｉ−ｔ（ｉ−１）＝ ｈｍａｘ（ｃｍ）／ｔ（分） この方程式において、ｈｍａｘは曲線の最急峻勾配の最高高さをセンチメート ル単位で表わすものであり、そしてｔは曲線の最急峻勾配までの時間を分単位で 示すものである。係数（ｒ）の数値は線形回帰を用いて計算した。若干の計算に おいては、対数−変換データを使用した。 蛍光測定値は、ＩＤＥＸＸ蛍光濃度分析器（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｃｏ ｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｚｅｒ＝ＦＣＡ）（ＩＤＥＸＸ Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ，ＭＥ）を用いて得た。この 装置は、抗体結合した細胞が、膜下からの減圧（０〜２５ｍｍＨｇ）によって、 溶液中の未結合抗体から分離されるように特別に設計された（９６−２３１１） ２ｍｍ径のフィルター膜を底部に有するプレートを使用した装置である。総細胞 ／抗体結合蛍光は、前面（ｆｒｏｎｔ−ｓｕｒｆａｃｅ）蛍光測定器により測定 した。この装置は、数種の波長で励起させることができ、読み取ることができる 蛍光測定計を備えている（４００／４５０ｎｍ〜５９０／６２０ｎｍ）。 例１ 血小板活性化に関する蛍光物質−結合免疫結合分析 一連の濃度（１０μＭ、２５μＭ、５０μＭ、１００μＭおよび１５０μＭ） のＡＤＰまたはリン酸塩緩衝塩類溶液（ＰＢＳ、０．０１Ｍ、ｐＨ７．４、これ はベースラインとして使用する）の１０μｌを、丸底ポリスチレン管内のＰＲＰ 試料９０μｌに添加し、室温で５分間インキュベートした。この混合試料８０μ ｌを直ちに、１５ｍｌバイアル内の最終濃度１％のパラホルムアルデヒドＰＢＳ 溶液１ｍｌに添加し、この試料を４℃で４時間インキュベートした。この固定し た試料を、ＰＢＳ溶液を使用する微量遠心分離器で遠心分離することによって、 ２回洗浄した。この洗浄した血小板を、ＰＢＳ溶液により８．５×１０ｅ−７／ ｍｌに希釈した。 この希釈試料の各２０μｌを、９６個の凹部を有するプレートに入れた。各２ ０μｌの１：２０希釈ＣＤ６２または１：４０希釈ＣＤ４１ａまたは１：５０希 釈抗フィブリノーゲンＡｂを添加し、これらの試料を暗所で室温において３０分 間インキュベートした。フルオリコン（Ｆｌｕｏｒｉｃｏｎ）分析プレートで細 胞を濃縮し、次いでパンデックス（Ｐａｎｄｅｘ）ＦＣＡ装置において、２５ｍ ｍＨｇのプレートの下から、減圧膜を適用することによって、洗浄緩衝溶液（１ ％ツイーンＰＢＳ）中で３回洗浄した。この工程によって、未結合抗体および遊 離の蛍光マーカーがいずれも、複合体から分離される。抗体結合した蛍光物質を 、ＦＣＡ装置において相応する波長を用いて、ＣＤ４１ａおよび抗フィブリノー ゲンＡｂについては１の増加（ｇａｉｎ）で、そしてＣＤ６２については１０の 増加で、プレートを読むことによって測定した。データは、ブランク値を控除し た後に、相対蛍光単位（ＦＵ）として記録した。 ＰＲＰおよび蛍光物質結合抗体の最適希釈度を決定するために計画された実験 において、ＰＲＰおよび上記抗体を種々の希釈度で含有するが、同一総容積で使 用した。凝集によりおよびＰ−セレクチン発現により測定されるＡＤＰに対する 血小板反応性の経過時間に従う変化を測定するために、ＰＲＰについて一定濃度 に希釈した後に、ＰＲＰを遠心分離管内で室温において保存した。各時点で、Ｐ ＲＰを保存管から取り出し、試験管に入れ、活性化分析および凝集分析を、上記 のとおりに行った。本発明による分析法をフローサイトメトリー分析法と比較す るために、フローサイトメトリー分析例に記載の通りにして試料を調製し、この 試料１００μｌをフルオリコンプレートに入れ、ＦＣＡ装置で読み取った。 各種希釈度の抗体および抗原（血小板）を本発明による分析法で試験して、こ の分析法に最適の条件を選択した。この最適条件の選択は、希釈曲線の最急峻勾 配が見出された抗体濃度を選択することに基づいており、そこから最も特異的な 反応と少なくとも非特異的反応とが得られた。最適条件は、容積による２０倍希 釈で、または０．０４μｇ／１．５×１０ｅ−６細胞の抗体／血小板比で、抗Ｐ −セレクチン抗体を使用して得られた。この希釈度で、特異的反応が最大であっ て、他方非特異的反応が最低であることが証明され（図２）、また広範囲の濃度 のＰ−セレクチンを用量−依存様相で検出することができた（図３）。さらにま た、線状希釈曲線に中央部が存在した（図４）。この存在は当該分析法が特異的 で、かつまた敏感なものであることを示している。同量のＰ−セレクチンに対す る未結合モノクローナル抗体を血漿中血小板に添加し、次いで蛍光物質結合Ｐ− セレクチン抗体を添加すると、血小板の蛍光強度は５０％減少した。この事実は 、結合の充分に競合性の抑制を示唆している（図５）。 同一の健康な人からの四つの一定量の固定した血小板におけるＰ−セレクチン 発現（平均レベル：５６．００〜６０．００ＦＵ／１．５×１０ｅ−ｇ細胞）を 、１０重試験法［分析内変動の場合］および３重試験法［分析間変動の場合］に より、多回の別々の分析を行うことによって測定した。１０重試験の平均値によ る分析内ＣＶ値は、３．４５％〜１０．７８％の範囲にあった（平均：６．９７ ％）。３重試験の平均値による時間ベース分析間ＣＶ値は、５．９３％〜１２． ３９％の範囲にあった（平均：８．１１％）。３重試験の平均値による試料ベー ス分析間ＣＶ値は、２．８２％〜１３．９９％の範囲にあった（平均：６．１７ ％）。 ＣＤ６２とともに３０分間インキュベートした後に、血漿中血小板の滴をスラ イドに移した。この血小板を顕微鏡により評価した。ＡＤＰ−活性化した血小板 は、光顕微鏡の下で、大きくなり、突出部を発生し、そして球形状に変化した。 これらの活性化した血小板は、蛍光顕微鏡の下で、赤色蛍光を示した。 例２ フローサイトメトリー分析 Ｍａｙｏ診療所血液銀行から、献血者から採血して２４時間以内の血小板濃縮 物を入手した。ＡＤＳＯＬ溶液１００ｍｌを含有する取付け付属袋を備えた発熱 性物質を含有していない四ッ組（ｑｕａｄ）血液採取パック（Ｆｅｎｗａｌ Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍｏｒｔｏｎ Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ）内のＣＤＰ６３ｍ ｌ中に、無作為の献血者から血液（４５０±４５ｍｌ）を採取することによって 、血小板濃縮物（ＰＣ）を調製した。採血後に、全血を２０〜２４℃において１ ４００ｇで、５．２分間遠心分離した。血小板に富んだ血漿を、空の付属袋中に 押し込み、ＰＣ約５０ｍｌを得た。このＰＣを１時間、かき混ぜることなく放置 し、血小板回転機で再懸濁し、次いで水平平坦シェーカー上で保存した。２４時 間の保存後に、２０の各ＰＣ単位を試料として得た。 冷たい１％パラホルムアルデヒド１ｍｌにより４℃で１時間、血小板１００μ ｌを固定することによって分析用試料を調製した。この血小板をリン酸塩緩衝塩 類溶液／ＥＤＴＡ（ＰＢＳ／ＥＤＴＡ）で洗浄し（２回）、このペレットをＰＢ Ｓ／ＥＤＴＡ１ｍｌ中に再懸濁し、暗所で４℃において保存した。翌日（２４時 間以内）に、この再懸濁血小板５０μｌを、モノクローナル抗体ＣＤ４１（ＡＭ ＡＣ Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ，ＭＥ）１０μｌにより標識付けした。暗 所で室温（ＲＴ）において１０分間インキュベートした後に、ＭｏＡ６（Ｂｅｃ ｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）２０μｌを添加し、次 いで暗所で２５℃においてさらに２０分間インキュベートした。この試料を次い で、ＰＢＳ／ＥＤＴＡで洗浄し（１回）、このペレットを冷たい１％パラホルム アルデヒド１ｍｌ中に再懸濁し、暗所で４℃において保存して、フローサイトメ トリー分析用試料を得た。これらの試料の全部を、標識付けして６時間以内に分 析した。試料は、標識付けして６時間以内にフローサイトメーター（ＦＡＣＳｃ ａｎ，Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ ）で分析した。血小板発現するＰ−セレクチンのパーセンテージ（活性化した血 小板のパーセンテージ）は、Ｒ．Ｆｕｎｂｅｅｒ等よりＴｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ，３０，２０（１９９０）に記載されたとおりにして測定した。平均ＧＰＩＩｂ −ＩＩＩａ表面濃度は、Ｐ−セレクチン陰性血小板およびＰ−セレクチン陽性血 小板のサブセットについて測定した。Ｈ．Ｍ．Ｒｉｎｄｅｒ等によるＴｒａｎｓ ｆｕｓｉｏｎ ，３１，４０９（１９９１）；Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ，７ ５ ，９６３（１９９１）参照。 ２０人の正常献血者からの血小板濃縮物中の１日保存血小板のうちのＰ−セレ クチン陽性に着色した血小板の比率として、または蛍光強度として、Ｐ−セレク チンの発現量を、それぞれ本発明による分析法およびフローサイトメトリー分析 法によって、同時的に測定した。データの線形回帰解析は、ＦＣＩＢＡで測定さ れたＰ−セレクチンの対数-変換蛍光強度は、フローサイトメトリー分析法によ って測定された対数−変換比と同様の発現されたＰ−セレクチン陽性着色血小板 の比と相関関係を有していた（ｒ＝０．９３６、ｐ＜０．００１）（図６）。 例３ Ｐ−セレクチン発現の誘発およびＡＤＰによる血小板の凝集 ３人の健康な人からの血漿中血小板は、用量依存様相でＡＤＰに応答して、凝 集検出計で凝集し（図７）、この凝集追跡曲線の最急峻勾配は、刺激用量のＡＤ Ｐの増加と相関関係を有していた（図７）。同一の３人の健康な対象からの血漿 中血小板中のＰ−セレクチンはまた、例２に従い刺激用量のＡＤＰの量の増加に 従うフィコエリトリン−蛍光により測定して、用量依存様相でＡＤＰに応答して 血小板の血漿膜に転移した（図８）。 例４ ＡＤＰに対する血小板反応性の経時変化 ３人の健康な献血者からの凝集およびＰ−セレクチン発現による測定によって 血漿中血小板のＡＤＰに対する反応性を測定した。この測定は凝集検出計による 方法および例１の方法の両方によって、採血後の１．５〜１０時間にわたる時間 間隔で行った。血漿中血小板は時間毎に、刺激用量のＡＤＰの量の増加に応答し て凝集し、平行してＰ−セレクチン発現が生じた（図９）。ＡＤＰに対する血小 板の反応性は、時間毎に増大し、７時間目に同様のピークレベルに達した（図９ ）。 例５ 血小板におけるＰ−セレクチン発現とＡＤＰ誘発凝集との関係 例３〜４からのデータを線形回帰を使用して分析した。この分析は、本発明に よる分析法により測定した血漿中血小板におけるＰ−セレクチン発現が、ＡＤＰ 刺戟用量（図１０）および時間（図１１）の両方に基づいて、凝集検出計により 測定したＡＤＰに応答する血漿中血小板の血小板凝集と明確な相関関係を有する ことを示した。 例６ ＡＤＰに応答する血小板におけるＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａおよびフィブリノー ゲンの露呈とＰ−セレクチン発現との関係 血小板表面上に発現したＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａ複合体およびＰ−セレクチンの 量と血小板に結合したフィブリノーゲンレベルまたはＡＤＰの刺激に応答して血 小板上に露呈されたフィブリノーゲンレベルにおける変化を測定するために、２ 人の健康な献血者からの血漿中血小板を試料として採取し、例１の分析法に従い 、ＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａに対するモノクローナル抗体およびＰ−セレクチンに対 するモノクローナル抗体およびまたフィブリノーゲンに対するポリクローナル抗 体を使用して同時に試験した。血小板上で検出できるＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａ複合 体は、ＡＤＰによる刺激に応答して僅かな変化を示した（図１２）。これに対し て、血小板に結合したフィブリノーゲンレベルまたは血小板上に露呈されたフィ ブリノーゲンレベルは、ＡＤＰ用量の増加に応答して増大し、５．０μＭのＡＤ Ｐ用量でピークに達した（図１２）。血漿中血小板において、検出できるＧＰＩ Ｉｂ−ＩＩＩａ複合体の量の変化は、０．０〜１０．０μＭの範囲にわたるＡＤ Ｐ刺激用量に応答して、フィブリノーゲンの結合または露呈のレベルに関する変 化と弱い相関関係を有しており（ｙ＝３５５．６４＋３．２９Ｘ、ｒ＝０．４５ 、ｐ＞０．０５）、およびまた発現したＰ−セレクチンレベルにおける変化と極 僅かな相関関係を有していた（ｙ＝２６９．４７＋１７０．４４^*ｌｏｇ（Ｘ） 、ｒ＝０．６６３、ｐ＞０．０５）。血小板に結合したフィブリノーゲンレベル または血小板表面上に露呈されたフィブリノーゲンレベルに対する変化は、刺戟 用量のＡＤＰの量の０．０１〜１０．０μＭの範囲にわたる増加に応答して発現 されるＰ−セレクチンレベルと、より強力な相関関係を有していた（ｙ＝１６７ ．３＋０．４４Ｘ、ｒ＝０．８５８、ｐ＞０．０５）。この事実は、ＡＤＰ刺戟 した血小板におけるフィブリノーゲンの結合または露呈とＰ−セレクチンとの間 の関連性を示唆している。 本発明による方法により測定された血小板表面へのＰ−セレクチン転移の検出 は、血小板活性化の敏感で特異的な尺度であり、この検出はこの現象にかかわる より複雑な伝統的尺度と良好な相関関係を有する。蛍光測定により単純な細胞を 使用できるにもかかわらず、この転移を測定するための前−表面蛍光測定用測定 器およびフィルターを備えている微量滴定プレートを使用する方法は、微量滴定 プレートを簡単な準自動式方法として９６個の凹部を備えた形状に形成すること によって可能にされる。分析能力をさらに拡大させるために、さらに自動化され ている方法として１０個のプレート（９６０個の凹部）を読み取ることができる 蛍光分析器を利用することもできる（スクリーン装置、ＩＤＥＸＸ、Ｐｏｒｔｌ ａｎｄ，ＭＥ）。これらの特性は、前記の臨床上の疾患症状における血小板活性 化の動態の研究に対して、本発明による方法を非常に実用的なものとする。 例７ 全血およびＰＲＰを使用し、かつまた血小板活性化マーカーとしてＣＤ６２ を使用した結果の比較 全血試料６ｍｌを分離し、１００μｌづつの２０の試料に分け、次いで丸底ポ リスチレン管に入れた。各試料に、リン酸塩緩衝塩類溶液（ＰＢＳ、０．０１Ｍ 、ｐＨ７．４、ベースラインとして使用）またはＡＤＰ（２．５μＭ）３０μｌ を添加し、これら全部を５分間室温でインキュベートした。各管に、１％パラホ ルムアルデヒドＰＢＳ溶液１００μｌを添加し、これらの試料を室温で１５分間 インキュベートした。このインキュベートの後に、各試料を、３０秒サイクルの Ｑ−Ｐｒｅｐ装置［コールター（登録商品名）（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒ ａｔｉｏｎ、Ｈｉａｌｅａｈ、ＦＬ）］に入れた。このサイクルの間に、試料に 一連の３種の試薬を添加しながら、試料を渦巻き撹拌した。添加する最初の試薬 は、１．２ｍｌ／リットルの濃度のギ酸であった。次いで、炭酸ナトリウム（６ ．０ｇ／リットル）、塩化ナトリウム（１４．５ｇ／リットル）および硫酸ナト リウム（３１．３ｇ／リットル）の溶液を添加した。最後に、パラホルムアルデ ヒド溶液を添加した（１０．０ｇ／リットル）。この固定した試料を次いで、Ｐ ＢＳ溶液を使用して、微量遠心分離器における遠心分離により２回洗浄した。こ の洗浄した血小板を、ＰＢＳ溶液で８．５×１０ｅ−７／ｍｌに希 釈した。全部の試料は、固定後の７２時間以内に分析した。 この希釈試料各２０μｌを、９６凹部のプレートに入れた。各２０μｌの１： ２０希釈したＣＤ６２Ａｂを添加し、次いでこれらの試料を暗所で室温において 、３０分間インキュベートした。フルオリコン分析プレート中の細胞を濃縮し、 次いでパンデックス（Ｐａｎｄｅｘ）ＦＣＡ装置において、プレートの下から２ ５ｍｍＨｇの減圧膜を適用することによって、洗浄緩衝液（１％ツィーンＰＢＳ ）中で３回洗浄した。この工程によって、未結合抗体および遊離の蛍光マーカー が複合体から除去された。抗体結合した蛍光物質を、ＦＣＡ装置において相当す る波長で、ＣＤ６２について１０の増加（ｇａｉｎ）で、プレートを読み取った 。データは相対蛍光単位（ＦＵ）として記録し、次いでブランク値を控除した。 このデータを、例２の方法に従い分析されたＰＲＰの２０の試料で得られた結果 とともに表ＩＩに示す。 表ＩＩから見ることができるように、全血を使用して得られた血小板活性化度 は、血小板に富んだ血漿を使用した場合に達成された活性化度と良好な相関関係 を有している。さらにまた、全血またはＰＲＰのどちらの対照試料でも、活性化 は見出されなかった。 例８ 全血およびＰＲＰを使用し、かつまた血小板活性化マーカーとしてＦＩＴＣ 標識付けしたフィブリノーゲンを使用した結果の比較 全血試料６ｍｌを分離し、１００μｌづつの１２の試料に分け、次いで丸底ポ リスチレン管に入れた。各試料に、ＦＩＴＣ（１：１００希釈）で標識付けした フィブリノーゲン３０μｌを添加した。引続いて、ＡＤＰ（２．５μＭ）３０μ ｌまたはリン酸塩緩衝塩類溶液（ＰＢＳ、０．０１Ｍ、ｐＨ７．４、ベースライ ンとして使用）３０μｌのどちらかを各管に添加し、これらの試料を室温で５分 間インキュベートした。１％パラホルムアルデヒドＰＢＳ溶液１００μｌを各管 に添加し、これらの試料を室温で１５分間インキュベートした。このインキュベ ート後に、３０秒サイクルのＱ−Ｐｒｅｐ装置［コールター（登録商品名）（Ｃ ｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｈｉａｌｅａｈ、ＦＬ）］に各試料を 入れた。このサイクルの間に、試料に一連の３種の試薬を添加しながら、試料を 渦巻き撹拌した。添加する最初の試薬は、１．２ｍｌ／リットル濃度のギ酸溶液 であった。次いで、炭酸ナトリウム（６．０ｇ／リットル）、塩化ナトリウム（ １４．５ｇ／リットル）および硫酸ナトリウム（３１．３ｇ／リットル）の溶液 を添加した。最後に、パラホルムアルデヒドの溶液を添加した（１０．０ｇ／リ ットル）。この固定した試料を次いで、ＰＢＳ溶液を使用して微量遠心分離器に おける遠心分離により２回洗浄した。この洗浄した血小板を、ＰＢＳ溶液で８． ５×１０ｅ−７／ｍｌに希釈した。全部の試料を、固定後の７２時間以内に分析 した。 この希釈試料各２０μｌを、９６凹部を有するプレートに入れた。各２０μｌ の１：２０希釈したＣＤ６２Ａｂを添加し、次いでこれらの試料を暗所で室温に おいて３０分間インキュベートした。フルオリコン分析プレート中の細胞を濃縮 し、次いでパンデックスＦＣＡ装置において、プレートの下から２５ｍｍＨｇの 減圧膜を適用することによって、洗浄緩衝液（１％ツィーンＰＢＳ）中で３回洗 浄した。この工程によって、未結合抗体および遊離の蛍光マーカーが複合体から 除去された。抗体結合した蛍光物質を、ＦＣＡ装置において相当する波長で、Ｃ Ｄ６２について１０の増加で、プレートを読み取ることによって測定した。デー タは相対蛍光単位（ＦＵ）として記録し、次いでブランク値を控除した。このデ ータを、例６の方法に従いＰＲＰを用いて得られたデータとともに表ＩＩＩに示 す。表ＩＶには、１：５０希釈液としてＦＩＴＣ標識付けしたフィブリノーゲン を使用して、上記方法に従い得られたデータを示す。 表ＩＩＩのデータにより証明されているように、フィブリノーゲン結合は完全 に明白であり、容易に検出することができる。血小板に富んだ血漿（ＰＲＰ）に かかわる数値は、全血を使用して得られた数値よりも幾分高いが、全血の使用も 、血小板活性化の示唆として均等に適している。表ＩＩＩおよび表ＩＶ（下記） に含まれているデータを比較することによって見ることができるように、ＦＩＴ Ｃ標識付けしたフィブリノーゲンは、高濃度で使用する必要はなく、全血試料ま たは血小板に富んだ血漿試料のどちらかから、検出可能な応答を励起させること が できる。 それぞれ引用してここに組入れたけれども、全部の刊行物、特許および特許刊 行物をここに引用して組入れる。本発明を、種々の特定の、好適態様および技術 を引用して説明した。しかしながら、本発明の精神および範囲内に残留しながら 、多くの変更および修正をなすことができるものと理解されるべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．血小板の試料中の内在性血小板活性化を測定するための蛍光測定法であっ て、 （ａ）その血小板活性化を測定しようとする患者から生理学的液体の試料を採 取し、次いでこの試料を第一試料と第二試料とに分割し； （ｂ）上記第一試料には、この第一試料中の活性化可能な血小板を最大限活性 化させるのに有効な時間、量で活性化アゴニストを添加し；他方第二試料は、等 しい時間の間保持し； （ｃ）上記第一試料には、血小板活性化反応を停止させ、この第一試料中の活 性化血小板を部分的に固定するのに有効な量の試薬を添加し、他方第二試料は等 しい時間の間保持し； （ｄ）これらの試料を渦巻き状撹拌しながら、各試料に、 （ｉ）試料中の赤血球細胞を溶解させるのに有効な量の赤血球細胞溶解剤： （ｉｉ）当該溶解剤の作用を停止させるのに有効な量の白血球安定剤；およ び （ｉｉｉ）血小板を完全に固定し、試料を安定化するのに有効な量の細胞膜 固定剤； を続けて添加し； （ｅ）各試料に、或る量の （ｉ）蛍光標識に結合させた抗−Ｐ−セレクチン抗体；または （ｉｉ）検出可能な蛍光標識のための結合部位に結合させた抗−Ｐ−セレク チン抗体、次いでこの結合部位に特異的に結合する検出可能な蛍光標識； を添加して、各試料中の活性化血小板と二重標識複合体を形成させ； （ｆ）各試料中のこの二重標識複合体の蛍光を測定し、第一試料の蛍光に対す る第二試料の蛍光の比によって、この第二試料の血小板活性化度の尺度を得る； ことからなる蛍光測定法。 ２．哺乳動物がヒトである、請求項１の方法。 ３．上記第一試料および第二試料が全血からなる、請求項２の方法。 ４．活性化アゴニストがアデノシン５´−ジホスフェートである、請求項３の 方法。 ５．抗−Ｐ−セレクチン抗体がモノクローナル抗体ＣＤ６２である、請求項１ の方法。 ６．上記モノクローナル抗体ＣＤ６２が蛍光発光性にされている、請求項５の 方法。 ７．工程（ｃ）における試薬がパラホルムアルデヒドである、請求項１の方法 。 ８．赤血球溶解剤がギ酸である、請求項１の方法。 ９．白血球安定剤が炭酸ナトリウム、硫酸ナトリウムおよび硫酸ナトリウムか らなる水性溶液である、請求項１の方法。 １０．細胞膜固定剤がホルムアルデヒドである、請求項１の方法。