JP3422491B2 - 方法およびアッセイ - Google Patents
方法およびアッセイInfo
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、血漿など液状検体中の血小板由来マイクロ
ベジクルの検出および／または測定、およびこの測定の
止血障害診断への使用に関する。
ベジクルの検出および／または測定、およびこの測定の
止血障害診断への使用に関する。
血小板は血液の正常成分であり、また止血過程に活発
に関与していることが知られている。例えば障害を受け
た血管の内皮下層との相互作用を通して、血小板が凝集
して原発性止血栓を形成することがある。この過程に
は、更に、通常、血小板による止血に関与する様々な因
子の生成が伴う。
に関与していることが知られている。例えば障害を受け
た血管の内皮下層との相互作用を通して、血小板が凝集
して原発性止血栓を形成することがある。この過程に
は、更に、通常、血小板による止血に関与する様々な因
子の生成が伴う。
血小板の活性化はそれらの止血反応触媒作用を大きく
高め、そして特に活性化血小板はV a因子の濃度および
活性の増加を示す（V a因子は、その前駆体であるプロ
トロンビンからトロンビンを生成するいわゆるプロトロ
ンビナーゼ複合体の一成分である）。更に、血小板は活
性化されるとそれらの原形質膜からマイクロベジクル
（マイクロパーティクルとも呼ばれる）を発することが
見出されている。この現象はSandbergら（Biochem.,J.2
03:303−311（1982））により最初に記述された。
高め、そして特に活性化血小板はV a因子の濃度および
活性の増加を示す（V a因子は、その前駆体であるプロ
トロンビンからトロンビンを生成するいわゆるプロトロ
ンビナーゼ複合体の一成分である）。更に、血小板は活
性化されるとそれらの原形質膜からマイクロベジクル
（マイクロパーティクルとも呼ばれる）を発することが
見出されている。この現象はSandbergら（Biochem.,J.2
03:303−311（1982））により最初に記述された。
更なる研究の後、現在では血小板マイクロベジクルは
原形質膜の切り取り（pinching off）または出芽により
形成されるものと信じられている。マイクロベジクルは
血小板糖タンパク質I b、II bおよびIII aおよび細胞骨
格タンパク質フィラミン、タリンおよびミオシンを含有
している。形成されたマイクロベジクルは50〜800nmの
直径を有する。
原形質膜の切り取り（pinching off）または出芽により
形成されるものと信じられている。マイクロベジクルは
血小板糖タンパク質I b、II bおよびIII aおよび細胞骨
格タンパク質フィラミン、タリンおよびミオシンを含有
している。形成されたマイクロベジクルは50〜800nmの
直径を有する。
マイクロベジクルおよび血小板はいずれも止血反応を
触媒でき、そしてそれぞれが凝血促進活性と抗凝血活性
の両方を示す。マイクロベジクルの形成はプロトロンビ
ナーゼ複合体の生成と連関しているものと仮定されてい
るが（Sims et al.,J.Biol.Chem.264:17049−17057（19
89））、比活性が血小板由来のマイクロベジクルまたは
血小板のいずれかに制限されているということは実証さ
れていない。
触媒でき、そしてそれぞれが凝血促進活性と抗凝血活性
の両方を示す。マイクロベジクルの形成はプロトロンビ
ナーゼ複合体の生成と連関しているものと仮定されてい
るが（Sims et al.,J.Biol.Chem.264:17049−17057（19
89））、比活性が血小板由来のマイクロベジクルまたは
血小板のいずれかに制限されているということは実証さ
れていない。
血小板の活性化およびマイクロベジクルの形成は、多
くの様々な因子、例えばトロンビン、コラーゲン、イオ
ノホア、カルパインおよび補体タンパク質複合体、例え
ばC5b〜９、により誘導され得る。血小板の弱い活性化
剤、例えばADP、エピネフリンおよび血小板活性化因子
はほんの低レベルのマイクロベジクル形成を生起するに
過ぎない。血小板濃縮液の貯蔵に伴ってマイクロベジク
ルの濃度増加が実証されている（Bode et al.,Blood 7
7:887〜895（1991）;Solberg et al.,Thromb.Res.48:55
9−565（1987））。更に、コラーゲンおよび／またはト
ロンビンにより活性化された血小板より成るサンプルの
撹拌がマイクロベジクル形成を高めることも示されてい
る。血管の病気または障害の発現を引き起こすまたは反
映する上での止血形成は広く認められていて、いくつか
の止血因子がかかる病気および障害のマーカーとしての
適合性について調べられている。すなわち、トロンボプ
ラスチンが関与するプロトロンビン時間試験または内因
性血漿凝固に対する活性化剤が関与する活性化部分トロ
ンビン時間試験を病気の監視または検出に用いることが
できる。またフィブリノーゲン、抗トロンビンIII、プ
ロティンＣ、プロティンＳ、VIII因子、組織プラスミノ
ーゲン活性化因子、フィブリンモノマーおよびフィブリ
ノーゲン分解生成物の試験も用いられる。
くの様々な因子、例えばトロンビン、コラーゲン、イオ
ノホア、カルパインおよび補体タンパク質複合体、例え
ばC5b〜９、により誘導され得る。血小板の弱い活性化
剤、例えばADP、エピネフリンおよび血小板活性化因子
はほんの低レベルのマイクロベジクル形成を生起するに
過ぎない。血小板濃縮液の貯蔵に伴ってマイクロベジク
ルの濃度増加が実証されている（Bode et al.,Blood 7
7:887〜895（1991）;Solberg et al.,Thromb.Res.48:55
9−565（1987））。更に、コラーゲンおよび／またはト
ロンビンにより活性化された血小板より成るサンプルの
撹拌がマイクロベジクル形成を高めることも示されてい
る。血管の病気または障害の発現を引き起こすまたは反
映する上での止血形成は広く認められていて、いくつか
の止血因子がかかる病気および障害のマーカーとしての
適合性について調べられている。すなわち、トロンボプ
ラスチンが関与するプロトロンビン時間試験または内因
性血漿凝固に対する活性化剤が関与する活性化部分トロ
ンビン時間試験を病気の監視または検出に用いることが
できる。またフィブリノーゲン、抗トロンビンIII、プ
ロティンＣ、プロティンＳ、VIII因子、組織プラスミノ
ーゲン活性化因子、フィブリンモノマーおよびフィブリ
ノーゲン分解生成物の試験も用いられる。
血漿止血因子の測定に代る選択肢として止血中に生じ
る細胞活性化の度合を監視する試みもなされている。こ
の点に関し血小板の活性化が研究されている。何故なら
ば、（前述の如く）血小板は止血における重要な関与物
質であり、また動脈血栓の発現およびアテローム性硬化
症の過程において主たる役割を演じていると考えられる
からである。
る細胞活性化の度合を監視する試みもなされている。こ
の点に関し血小板の活性化が研究されている。何故なら
ば、（前述の如く）血小板は止血における重要な関与物
質であり、また動脈血栓の発現およびアテローム性硬化
症の過程において主たる役割を演じていると考えられる
からである。
従来の研究は、分泌されたタンパク質の量を測定する
ことにより血小板活性化を監視することに傾倒してき
た。すなわち、血小板４因子（PF−４）、β−トロンボ
グロブリン（β−TG）およびトロンボスポンジンを測定
するためのアッセイが研究されている（Lane et al.,Th
romb.Haemostas.（シュツットガルト）52（２）pp.183
−187（1984））。しかしながら、これらのタンパク質
はいずれもルーチン監視に適さないものであった。トロ
ンボスポンジンは血小板に対し非特異的であることがわ
かり、またβ−TGおよびPF−４についての研究からそれ
らの血中半減期が短すぎて、バックグラウンドレベルに
対して検体濃度を区別する上で問題となることが分っ
た。更に、β−TGレベルは腎不全患者では上昇すること
がわかり、またPF−４レベルはヘパリン（これは血栓性
障害の患者の治療に広く用いられている）の存在により
影響された。
ことにより血小板活性化を監視することに傾倒してき
た。すなわち、血小板４因子（PF−４）、β−トロンボ
グロブリン（β−TG）およびトロンボスポンジンを測定
するためのアッセイが研究されている（Lane et al.,Th
romb.Haemostas.（シュツットガルト）52（２）pp.183
−187（1984））。しかしながら、これらのタンパク質
はいずれもルーチン監視に適さないものであった。トロ
ンボスポンジンは血小板に対し非特異的であることがわ
かり、またβ−TGおよびPF−４についての研究からそれ
らの血中半減期が短すぎて、バックグラウンドレベルに
対して検体濃度を区別する上で問題となることが分っ
た。更に、β−TGレベルは腎不全患者では上昇すること
がわかり、またPF−４レベルはヘパリン（これは血栓性
障害の患者の治療に広く用いられている）の存在により
影響された。
現在、血小板により形成されるマイクロベジクルは血
小板活性化を正確に指示し従って止血系全体の活性を反
映することは認められている。Georgら（J.Clin.Inves
t.78:340−348（1986））は、心肺バイパス手術後に血
小板表面および血小板由来マイクロベジクル上に現われ
る糖タンパク質の変化を監視した。マイクロベジクル数
の増加が認められ、そしてこれはかかる手術中に経験さ
れるせん断応力によるものであると仮定された。しかし
ながら、マイクロベジクル濃度の監視が止血障害の良好
なインジケーターであるとの、またかかる状態の診断方
法のベースとなり得るとの示唆はなかった。
小板活性化を正確に指示し従って止血系全体の活性を反
映することは認められている。Georgら（J.Clin.Inves
t.78:340−348（1986））は、心肺バイパス手術後に血
小板表面および血小板由来マイクロベジクル上に現われ
る糖タンパク質の変化を監視した。マイクロベジクル数
の増加が認められ、そしてこれはかかる手術中に経験さ
れるせん断応力によるものであると仮定された。しかし
ながら、マイクロベジクル濃度の監視が止血障害の良好
なインジケーターであるとの、またかかる状態の診断方
法のベースとなり得るとの示唆はなかった。
今般、血小板由来マイクロベジクルの存在または濃度
の評価を止血障害診断法として使用できることを見出し
た。
の評価を止血障害診断法として使用できることを見出し
た。
「止血障害」という用語は血液凝固カスケードメカニ
ズムのいかなる異常をも包含し、特に血栓形成の可能性
を高めるまたは損傷後の血液凝固能を低下させる障害、
例えばすべての形のDIC（播種性血管内血液凝固）およ
びアテローム硬化症を包含する。従って止血障害の診断
は、血栓塞栓症および／または心血管系疾病の検出およ
び／または監視を可能にする。この用語は二次現象（例
えば癌の結果としての）である止血障害をも包含する。
ズムのいかなる異常をも包含し、特に血栓形成の可能性
を高めるまたは損傷後の血液凝固能を低下させる障害、
例えばすべての形のDIC（播種性血管内血液凝固）およ
びアテローム硬化症を包含する。従って止血障害の診断
は、血栓塞栓症および／または心血管系疾病の検出およ
び／または監視を可能にする。この用語は二次現象（例
えば癌の結果としての）である止血障害をも包含する。
従って本発明は、人間または人間以外の対象の体液検
体中の血小板由来マイクロベジクルの存在および／また
は濃度を評価することより成る前記対象の止血障害の診
断方法を提供する。
体中の血小板由来マイクロベジクルの存在および／また
は濃度を評価することより成る前記対象の止血障害の診
断方法を提供する。
本発明の診断方法は、慣用手段により患者から採取さ
れた体液（例えば血液）検体を用いて試験管内で行われ
る。
れた体液（例えば血液）検体を用いて試験管内で行われ
る。
更に、血小板由来マイクロベジクルの存在または濃度
を評価するための簡単なアッセイも必要とされている。
マイクロベジクルをフィルター上に捕捉して簡便な測定
を可能にするのが特に有利であることがわかった。
を評価するための簡単なアッセイも必要とされている。
マイクロベジクルをフィルター上に捕捉して簡便な測定
を可能にするのが特に有利であることがわかった。
すなわち、本発明は、液体検体中の血小板マイクロベ
ジクルの定性的および／または定量的測定のためのアッ
セイであって、 （ａ）（ｉ）まず検体を濾過してマイクロベジクルを保
持残留物として保持し、次いで該マイクロベジクルに対
し特異的なマーカーを前記保持残留物に適用し、あるい
は （ii）所望によりまず前記マイクロベジクルに対し特
異的なマーカーを添加し次いでその検体を濾過し、そし
て標識されたマイクロベジクルを保持残留物として保持
し； （ｂ）所望によりそのフィルターを洗浄し；そして （ｃ）保持されたマーカーの存在または量を測定する ことより成るアッセイも提供する。
ジクルの定性的および／または定量的測定のためのアッ
セイであって、 （ａ）（ｉ）まず検体を濾過してマイクロベジクルを保
持残留物として保持し、次いで該マイクロベジクルに対
し特異的なマーカーを前記保持残留物に適用し、あるい
は （ii）所望によりまず前記マイクロベジクルに対し特
異的なマーカーを添加し次いでその検体を濾過し、そし
て標識されたマイクロベジクルを保持残留物として保持
し； （ｂ）所望によりそのフィルターを洗浄し；そして （ｃ）保持されたマーカーの存在または量を測定する ことより成るアッセイも提供する。
液状検体は血小板を含むべきでなく、また好ましくは
止血タンパク質を生産できる他の細胞、例えば内皮細胞
または単球を含むべきでない。従って段階（ａ）に先立
って液状検体を濾過しまたは遠心分離して本質的に無細
胞の検体を生成させることが考えられる。液状検体中の
大部分の細胞を除去する一方はるかに小さいマイクロベ
ジクルを懸濁状態のまま維持させるには、100nm以上、
例えば１μｍ以上の細孔径を有するフィルターが適して
いる。検体中の細胞を遠心分離により除去する場合、2,
000〜20,000×ｇで15〜30分、例えば11,000×ｇで15分
のｇ−力が適しており、また既に概説したアッセイ手順
の段階（ａ）に必要な本質的に細胞不含の検体を生成さ
せるのに用いることができる。他の等価の方法を用いて
細胞を除去しそして必要な本質的に細胞不含の液状検体
を得ることもできる。
止血タンパク質を生産できる他の細胞、例えば内皮細胞
または単球を含むべきでない。従って段階（ａ）に先立
って液状検体を濾過しまたは遠心分離して本質的に無細
胞の検体を生成させることが考えられる。液状検体中の
大部分の細胞を除去する一方はるかに小さいマイクロベ
ジクルを懸濁状態のまま維持させるには、100nm以上、
例えば１μｍ以上の細孔径を有するフィルターが適して
いる。検体中の細胞を遠心分離により除去する場合、2,
000〜20,000×ｇで15〜30分、例えば11,000×ｇで15分
のｇ−力が適しており、また既に概説したアッセイ手順
の段階（ａ）に必要な本質的に細胞不含の検体を生成さ
せるのに用いることができる。他の等価の方法を用いて
細胞を除去しそして必要な本質的に細胞不含の液状検体
を得ることもできる。
段階（ａ）において、使用されるフィルターは血小板
マイクロベジクルを保持するのに十分小さい細孔径を有
するべきであり、そして800nm以下、好ましくは200nm以
下の細孔径が適している。濾過の作用により、マイクロ
ベジクルはフィルター上に不動化されるが、それらは次
いでマーカーと接触させてもよく、あるいは該マイクロ
ベジクルが既に標識されている場合には直接評価するこ
とができる。
マイクロベジクルを保持するのに十分小さい細孔径を有
するべきであり、そして800nm以下、好ましくは200nm以
下の細孔径が適している。濾過の作用により、マイクロ
ベジクルはフィルター上に不動化されるが、それらは次
いでマーカーと接触させてもよく、あるいは該マイクロ
ベジクルが既に標識されている場合には直接評価するこ
とができる。
適切なマーカーには、血小板由来マイクロベジクルの
有する表面エピトープに特異的な抗体が包含される。本
発明による好ましい抗体マーカーは、GP II b−III a複
合体および／または個々の糖タンパク質GP II bおよびG
P III aを含む糖タンパク質を認識する。マイクロベジ
クル上にみられる他の血小板特異的糖タンパク質にはGP
I b−GP IX、GP I a−II aおよびGP III bが含まれ
る。マイクロベジクルに結合する抗体をそれ自体標識し
てもよく、あるいはまた、第２抗体、例えば、適用され
た第１抗体、例えばマウスモノクローナル抗体に特異的
に結合する標識された抗−マウス免疫グロブリンを用い
てもよい。モノクローナル抗体が好ましい。段階（ａ）
（ii）におけるように、液状検体にマーカーを添加する
のが好ましい。マーカーは、段階（ａ）（ｉ）に従っ
て、マーカーをフィルターに直接適用するかまたはフィ
ルターをマーカーの溶液中に浸漬することにより、フィ
ルターに不動化されたマイクロベジクルと接触させるこ
とができる。使用される標識は、信号を発することので
きる任意の成分、例えば酵素、発色団、発蛍光団、放射
性同位元素、着色粒子、色素、コロイド状金属などであ
ってよい。
有する表面エピトープに特異的な抗体が包含される。本
発明による好ましい抗体マーカーは、GP II b−III a複
合体および／または個々の糖タンパク質GP II bおよびG
P III aを含む糖タンパク質を認識する。マイクロベジ
クル上にみられる他の血小板特異的糖タンパク質にはGP
I b−GP IX、GP I a−II aおよびGP III bが含まれ
る。マイクロベジクルに結合する抗体をそれ自体標識し
てもよく、あるいはまた、第２抗体、例えば、適用され
た第１抗体、例えばマウスモノクローナル抗体に特異的
に結合する標識された抗−マウス免疫グロブリンを用い
てもよい。モノクローナル抗体が好ましい。段階（ａ）
（ii）におけるように、液状検体にマーカーを添加する
のが好ましい。マーカーは、段階（ａ）（ｉ）に従っ
て、マーカーをフィルターに直接適用するかまたはフィ
ルターをマーカーの溶液中に浸漬することにより、フィ
ルターに不動化されたマイクロベジクルと接触させるこ
とができる。使用される標識は、信号を発することので
きる任意の成分、例えば酵素、発色団、発蛍光団、放射
性同位元素、着色粒子、色素、コロイド状金属などであ
ってよい。
好ましくは、過剰マーカーをフィルター洗浄により除
去してから、マーカーの存在または量の測定を行う。付
加的に、段階（ａ）（ｉ）において、検体の適用後に、
そしてマーカーの添加前にフィルターを洗浄してもよ
い。それら洗浄段階には水または緩衝液が適している。
去してから、マーカーの存在または量の測定を行う。付
加的に、段階（ａ）（ｉ）において、検体の適用後に、
そしてマーカーの添加前にフィルターを洗浄してもよ
い。それら洗浄段階には水または緩衝液が適している。
使用されるマーカーが酵素である場合には、段階
（ｃ）は、触媒されるべき反応への基質転化を含んでよ
い。しかしながら、使用されるマーカーまたは標識は、
直ちに評価を行えるように、直ちに視認できるのが好ま
しい。
（ｃ）は、触媒されるべき反応への基質転化を含んでよ
い。しかしながら、使用されるマーカーまたは標識は、
直ちに評価を行えるように、直ちに視認できるのが好ま
しい。
検体中のマイクロベジクル濃度は、次いでフィルター
上に保持されたマーカーレベルから算出できる。この値
は次いで臨床医により患者の止血障害の診断に用いるこ
とができる。定量的測定を可能にするアッセイが好まし
い。
上に保持されたマーカーレベルから算出できる。この値
は次いで臨床医により患者の止血障害の診断に用いるこ
とができる。定量的測定を可能にするアッセイが好まし
い。
クエン酸塩、EDTAまたはヘパリンなどの血液凝固防止
剤で処理された血小板不含血漿が本発明によるアッセイ
の検体として用いるのに適している。もちろん、クエン
酸加血漿は必要に応じて使用前に希釈してもよい。
剤で処理された血小板不含血漿が本発明によるアッセイ
の検体として用いるのに適している。もちろん、クエン
酸加血漿は必要に応じて使用前に希釈してもよい。
更に、マイクロベジクル含有フィルターはタンパク含
量または、より好ましくは、燐脂質含量について分析す
ることもできる。
量または、より好ましくは、燐脂質含量について分析す
ることもできる。
本発明の好ましい一態様においては、ニトロセルロー
ス膜またはナイロン膜、例えばHybond N （Amersham I
nternationalから販売されている）またはMagna Nylon
（MSIから販売されている）がフィルターとして用い
られる。100nmの細孔径が便利である。吸収剤パッド例
えばセルロースブロッティング紙、はフィルムを通して
の液状検体通過を高めるために膜の片側に置き、そして
液体非透性のシートまたはフレームを膜の他方の側に置
くのが有利である。液状検体およびアッセイ液を膜に正
確に適用できるように、非透過性のシートまたはフレー
ムに、例えば直径5mmの丸穴を設ける。（所望により緩
衝液で予め希釈された）マイクロベジクル含有細胞不含
水性溶液の既知量、例えば10〜500μを膜に適用して
その下の吸収剤パッド中に通す。マーカーとしての金ゾ
ルコロイドに接合させた抗GP II b−III a抗体の、例え
ば10〜500μの水性溶液を適用しそして膜を通過させ
る。次にその膜を２×200μアリコートの適当な洗
液、例えばTris HCl緩衝液（pH7.0）で洗浄してから、
その膜上に不動化された金ゾルの量を、通常は肉眼でカ
ラースケールと比較することにより、あるいはレフレク
トメーター（reflectometer）により評価する。
ス膜またはナイロン膜、例えばHybond N （Amersham I
nternationalから販売されている）またはMagna Nylon
（MSIから販売されている）がフィルターとして用い
られる。100nmの細孔径が便利である。吸収剤パッド例
えばセルロースブロッティング紙、はフィルムを通して
の液状検体通過を高めるために膜の片側に置き、そして
液体非透性のシートまたはフレームを膜の他方の側に置
くのが有利である。液状検体およびアッセイ液を膜に正
確に適用できるように、非透過性のシートまたはフレー
ムに、例えば直径5mmの丸穴を設ける。（所望により緩
衝液で予め希釈された）マイクロベジクル含有細胞不含
水性溶液の既知量、例えば10〜500μを膜に適用して
その下の吸収剤パッド中に通す。マーカーとしての金ゾ
ルコロイドに接合させた抗GP II b−III a抗体の、例え
ば10〜500μの水性溶液を適用しそして膜を通過させ
る。次にその膜を２×200μアリコートの適当な洗
液、例えばTris HCl緩衝液（pH7.0）で洗浄してから、
その膜上に不動化された金ゾルの量を、通常は肉眼でカ
ラースケールと比較することにより、あるいはレフレク
トメーター（reflectometer）により評価する。
本発明はまた、マイクロベジクルを血小板不含液状検
体から保持するためのフィルターおよび血小板由来マイ
クロベジクルを選択的に標識するマーカーより成る試
薬、および所望により緩衝洗浄溶液より成る、本発明の
アッセイを行うためのキットも提供する。
体から保持するためのフィルターおよび血小板由来マイ
クロベジクルを選択的に標識するマーカーより成る試
薬、および所望により緩衝洗浄溶液より成る、本発明の
アッセイを行うためのキットも提供する。
本発明は更に、人間または人間以外の、好ましくは哺
乳類の、動物の体から採取された所望により希釈された
本質的に細胞不含の血漿検体を前述のアッセイに付すこ
とにより、血中を循環する血小板由来マイクロベジクル
の存在または濃度の評価方法を提供する。
乳類の、動物の体から採取された所望により希釈された
本質的に細胞不含の血漿検体を前述のアッセイに付すこ
とにより、血中を循環する血小板由来マイクロベジクル
の存在または濃度の評価方法を提供する。
以下の実施例は、例示のためだけに示したものであ
る： 特に断らない限り、すべての割合は容量基準である。
実施例では様々な緩衝溶液を言及するのに次の略号を用
いる： TS−緩衝液:0.01モル／ Tris−HCl−緩衝液（pH7.4）
/0.154mol/ NaCl TTG−緩衝液:TS−緩衝液添加１％Triton X−100 TBS−緩衝液0.02モル／ Tris−HCl−緩衝液（pH7.5）
/0.5モル／ NaCl TTBS−緩衝液:TBS−緩衝液添加0.05％Tween20 実施例１ 血小板マイクロベジクルの調製および収集 血液を緩衝クエン酸ナトリウム水溶液に集め（1:9）
そして320×ｇで15分間遠心分離した。高血小板血漿（P
RP）含有上清をプラスチック管に移しそして更に10分間
11,000×ｇで遠心分離した。得られた上清は血小板不含
であり、そしてマイクロベジクルを含有する。それらマ
イクロベジクルを集めるために、2.8mの上清をシリン
ジに取りつけたMillex−VV 0.10μｍフィルター（Mill
ipore Products Division,ベッドフォード（Bedfor
d），マサチューセッツ州，米国）を通して濾過した。
そのフィルターをTS−緩衝液中で十分に洗浄した。フィ
ルター上に残留するマイクロベジクルはフィルター全体
を反応段階を通して処理することによって更に分析する
ことができた。あるいは前記ベジクルは150μのTTG−
緩衝液に可溶化した。
る： 特に断らない限り、すべての割合は容量基準である。
実施例では様々な緩衝溶液を言及するのに次の略号を用
いる： TS−緩衝液:0.01モル／ Tris−HCl−緩衝液（pH7.4）
/0.154mol/ NaCl TTG−緩衝液:TS−緩衝液添加１％Triton X−100 TBS−緩衝液0.02モル／ Tris−HCl−緩衝液（pH7.5）
/0.5モル／ NaCl TTBS−緩衝液:TBS−緩衝液添加0.05％Tween20 実施例１ 血小板マイクロベジクルの調製および収集 血液を緩衝クエン酸ナトリウム水溶液に集め（1:9）
そして320×ｇで15分間遠心分離した。高血小板血漿（P
RP）含有上清をプラスチック管に移しそして更に10分間
11,000×ｇで遠心分離した。得られた上清は血小板不含
であり、そしてマイクロベジクルを含有する。それらマ
イクロベジクルを集めるために、2.8mの上清をシリン
ジに取りつけたMillex−VV 0.10μｍフィルター（Mill
ipore Products Division,ベッドフォード（Bedfor
d），マサチューセッツ州，米国）を通して濾過した。
そのフィルターをTS−緩衝液中で十分に洗浄した。フィ
ルター上に残留するマイクロベジクルはフィルター全体
を反応段階を通して処理することによって更に分析する
ことができた。あるいは前記ベジクルは150μのTTG−
緩衝液に可溶化した。
実施例２
TTG−緩衝液に可溶化したマイクロベジクルからの物
質試料を「ホスホリピッドエンザイマティック（Phosph
olipid enzymatique）」キット（BioMorieux,フラン
ス）を用いて燐脂質について定量測定した。その方法
は、Takayama et al.,Clin.Chim.Acta.79,p.93−98に基
づいている。
質試料を「ホスホリピッドエンザイマティック（Phosph
olipid enzymatique）」キット（BioMorieux,フラン
ス）を用いて燐脂質について定量測定した。その方法
は、Takayama et al.,Clin.Chim.Acta.79,p.93−98に基
づいている。
実施例３
総タンパク質の測定
実施例１に記載の如く濾過されそしてTTG−緩衝液中
に可溶化されたマイクロベジクルからの物質サンプル
を、Bradford,Anal.Biochem.1976,72,248−54の方法に
基づいて、BioRad Dye−結合アッセイ（BioRad,リッチ
モンド，米国）により測定した。
に可溶化されたマイクロベジクルからの物質サンプル
を、Bradford,Anal.Biochem.1976,72,248−54の方法に
基づいて、BioRad Dye−結合アッセイ（BioRad,リッチ
モンド，米国）により測定した。
実施例４
マイクロベジクルの免疫化学的特性のための高速テスト
クエン酸加血液検体を320×ｇで15分間遠心分離した
後その上清を11,000×ｇで10分間遠心分離した。それら
血小板マイクロベジクルを含有する上清に、血小板表面
膜のGP II b−III a−複合体のCd41b（GP II b）中のエ
ピトープに対するモノクローナル抗体SC22を添加した。
その抗体はImmunotech S.A.,ルミニー（Luminy）、マル
セーユ、フランスから入手した。その抗体は1:1500の希
釈比で添加した。20℃で１分間インキュベーション後、
2.8mの混合物を実施例１に記載の如く濾過した。その
時点でマウスモノクローナル抗体を有するマイクロベジ
クルがフィルター上に捕捉された。それらフィルターを
TTBS−緩衝液中で、次いでTBS−緩衝液中で十分洗浄し
た。TBS−緩衝液中で1:3000希釈されたアルカリ性ホス
ファターゼに接合されたヤギ−抗−マウスTgG F（ab）
（Jackson Immuno Research Laboratories,米国）を各
フィルターを通して流した。この時点でその接合体はマ
イクロベジクル中のGP II b−III a−複合体に結合され
た抗体に結合された。それらフィルターを0.5mg/m Ni
troblueテトラゾリウム、0.25mg/m５−ブロモ−４−
クロロ−３−インドリル−ホスフェート−ｐ−トルイジ
ンおよび0.1mol/ NaHCO3−緩衝液（pH9.8）を含む溶
液に、フィルター表面に測定可能な色形成が生じるのに
十分な時間浸漬した。
後その上清を11,000×ｇで10分間遠心分離した。それら
血小板マイクロベジクルを含有する上清に、血小板表面
膜のGP II b−III a−複合体のCd41b（GP II b）中のエ
ピトープに対するモノクローナル抗体SC22を添加した。
その抗体はImmunotech S.A.,ルミニー（Luminy）、マル
セーユ、フランスから入手した。その抗体は1:1500の希
釈比で添加した。20℃で１分間インキュベーション後、
2.8mの混合物を実施例１に記載の如く濾過した。その
時点でマウスモノクローナル抗体を有するマイクロベジ
クルがフィルター上に捕捉された。それらフィルターを
TTBS−緩衝液中で、次いでTBS−緩衝液中で十分洗浄し
た。TBS−緩衝液中で1:3000希釈されたアルカリ性ホス
ファターゼに接合されたヤギ−抗−マウスTgG F（ab）
（Jackson Immuno Research Laboratories,米国）を各
フィルターを通して流した。この時点でその接合体はマ
イクロベジクル中のGP II b−III a−複合体に結合され
た抗体に結合された。それらフィルターを0.5mg/m Ni
troblueテトラゾリウム、0.25mg/m５−ブロモ−４−
クロロ−３−インドリル−ホスフェート−ｐ−トルイジ
ンおよび0.1mol/ NaHCO3−緩衝液（pH9.8）を含む溶
液に、フィルター表面に測定可能な色形成が生じるのに
十分な時間浸漬した。
Ｄ−ダイマーおよび／または可溶性フィブリン試験
（エタノールゲル化試験）陽性の患者を前記方法を用い
て検査した。コントロールとして病気の臨床的徴候がな
く、かつＤ−ダイマーおよび可溶性フィブリン試験陰性
の明らかに健常な人を選定した。
（エタノールゲル化試験）陽性の患者を前記方法を用い
て検査した。コントロールとして病気の臨床的徴候がな
く、かつＤ−ダイマーおよび可溶性フィブリン試験陰性
の明らかに健常な人を選定した。
フィルター上に得られた色はレフレクドメーター（例
えば英国特許第9213733.0および9213737.1に開示されて
いるような、NycoCard Reader ）により測定した。反
射率値は次の通りであった： 患者検体は正常血漿検体およびコントロール緩衝液よ
りも実質的に高い値を示すことがわかる。
えば英国特許第9213733.0および9213737.1に開示されて
いるような、NycoCard Reader ）により測定した。反
射率値は次の通りであった： 患者検体は正常血漿検体およびコントロール緩衝液よ
りも実質的に高い値を示すことがわかる。
実施例５
血栓塞栓症患者からの物質の検査
ルーチンの検査室分析試験においてＤ−ダイマーおよ
び／または可溶性フィブリンにより確認された血栓塞栓
症患者、および明らかに健常の人を年令に従ってグルー
プ分けした。採血し遠心分離し、そして実施例１に記載
の如くフィルター上に血小板マイクロベジクルを集めた
（それぞれ実施例２〜４に記載された）特異的抗体を用
いた高速免疫アッセイを用いて総燐脂質、総タンパク質
およびGP II b−III aの分析を行った。免疫化学的検査
において、検体を置換する緩衝液だけを用いて得られた
色をコントロールとして用い数値から差引いた。マイク
ロベジクルの内標準に1.0という任意値を与え、そして
個々の実験を行った際に、免疫化学的方法を用いて得ら
れたすべての結果をこの標準を用いて得られた結果に関
係づけた。
び／または可溶性フィブリンにより確認された血栓塞栓
症患者、および明らかに健常の人を年令に従ってグルー
プ分けした。採血し遠心分離し、そして実施例１に記載
の如くフィルター上に血小板マイクロベジクルを集めた
（それぞれ実施例２〜４に記載された）特異的抗体を用
いた高速免疫アッセイを用いて総燐脂質、総タンパク質
およびGP II b−III aの分析を行った。免疫化学的検査
において、検体を置換する緩衝液だけを用いて得られた
色をコントロールとして用い数値から差引いた。マイク
ロベジクルの内標準に1.0という任意値を与え、そして
個々の実験を行った際に、免疫化学的方法を用いて得ら
れたすべての結果をこの標準を用いて得られた結果に関
係づけた。
結果は表１に示され、そして総タンパク質は患者と健
常人との間で相当に重なりあうことを示している。しか
しながら、GP II b−III aの量は、患者と健常人との間
に明確な差のあることを実証した。すなわち、この分析
方法は血液検体中の血小板マイクロベジクルを検出する
ための診断ツールの構築に最も適している。
常人との間で相当に重なりあうことを示している。しか
しながら、GP II b−III aの量は、患者と健常人との間
に明確な差のあることを実証した。すなわち、この分析
方法は血液検体中の血小板マイクロベジクルを検出する
ための診断ツールの構築に最も適している。
総タンパク質レベルの変動性は、マイクロベジクル中
のタンパク質含量の変動性による可能性がある。調製過
程を通してベジクルが破砕される程度をコントロールす
ることは困難かもしれず、従ってベジクルからの可溶性
タンパク質のもれの変動性が結果に見られる変動性の原
因となっている可能性がある。
のタンパク質含量の変動性による可能性がある。調製過
程を通してベジクルが破砕される程度をコントロールす
ることは困難かもしれず、従ってベジクルからの可溶性
タンパク質のもれの変動性が結果に見られる変動性の原
因となっている可能性がある。
実施例６
DIC患者からの物質の検査
フィブリン分解生成物（FDP）および可溶性フィブリ
ン（陽性エタノールゲル化試験）での試験が陽性である
ことから判定された播種性血管内血液凝固（DIC）患者
を前記実施例に記載の方法を用いて検査した。患者の年
令は24〜72才であった。DIC患者のうち10人は大手術を
受けており、６人の子癇前症を有し、３人は敗血症を有
し、そして３人は前骨髄性白血病を有した。コントロー
ル（ｎ＝30）は年令および性別をマッチさせた健常給血
者から構成した。DIC患者は採血時に抗凝血剤療法を受
けなかった。
ン（陽性エタノールゲル化試験）での試験が陽性である
ことから判定された播種性血管内血液凝固（DIC）患者
を前記実施例に記載の方法を用いて検査した。患者の年
令は24〜72才であった。DIC患者のうち10人は大手術を
受けており、６人の子癇前症を有し、３人は敗血症を有
し、そして３人は前骨髄性白血病を有した。コントロー
ル（ｎ＝30）は年令および性別をマッチさせた健常給血
者から構成した。DIC患者は採血時に抗凝血剤療法を受
けなかった。
前述の実施例に記載の方法を用いてGP II b−III a
（例えばGP II b抗原）、燐脂質および総タンパク質を
試験したところ次の結果が得られた： これらの結果は、GP II b−III aおよび燐脂質の測定
は患者をコントロールの間に高有意差があるのに対し、
総タンパク質については有意差は相当に低いことを示し
ている。
（例えばGP II b抗原）、燐脂質および総タンパク質を
試験したところ次の結果が得られた： これらの結果は、GP II b−III aおよび燐脂質の測定
は患者をコントロールの間に高有意差があるのに対し、
総タンパク質については有意差は相当に低いことを示し
ている。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 ホーム，ポール・アンドレ
ノールウエー国 0456 オスロ．ローヴ
イセンベルグガーテン ４アー
(72)発明者 ゴツグスター，ゲアイル・オーラヴ
ノールウエー国 0491 オスロ．アーリ
ルツヴインゲン16
(56)参考文献 日本臨牀 第50巻、第２号（1992）第
342−348頁
Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏ
ｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．65
（1987）ｐ．447−450
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
G01N 33/48 - 33/98
Claims (17)
- 【請求項１】人間または人間以外の対象の体液検体中の
血小板由来マイクロベジクルの存在および／または濃度
を評価することより成る前記対象の先天性出血障害、播
種性血管内凝固の形、アテローム硬化症、血栓塞栓症お
よび／または心血管系疾病の検出方法。 - 【請求項２】完全な細胞からマイクロベジクルを分離
し、該マイクロベジクルを固体支持体上に不動化し、そ
して不動化されたマイクロベジクルの存在または濃度を
評価する段階を含む請求項１記載の方法。 - 【請求項３】マイクロベジクルが遠心分離または濾過に
より完全な細胞から分離される請求項２記載の方法。 - 【請求項４】マイクロベジクルが200nm以上の細孔径の
フィルターを通して濾過することにより完全な細胞から
分離される請求項２記載の方法。 - 【請求項５】フィルターが１μｍ以上の細孔径を有する
請求項４記載の方法。 - 【請求項６】マイクロベジクルが800nm以下の細孔径の
フィルター上に不動化される請求項１〜５のいずれかに
記載の方法。 - 【請求項７】フィルターが200nm以下の細孔径を有する
請求項６記載の方法。 - 【請求項８】マイクロベジクルの存在および／または濃
度が、抗体を特異的マイクロベジクル表面エピトープに
結合させそしてこのようにして結合した抗体のレベルを
評価することにより評価される請求項１〜７のいずれか
に記載の方法。 - 【請求項９】表面エピトープが糖タンパク質上にある請
求項８記載の方法。 - 【請求項１０】表面糖タンパク質がGP II b−III aであ
る請求項９記載の方法。 - 【請求項１１】抗体が直接的または間接的に検出され得
る標識を有する請求項８〜10のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１２】標識がその抗体に直接的または間接的に
検出され得る付加的な標識された成分を結合させること
により、または酵素を担持する抗体に基質を添加するこ
とにより、間接的に検出される請求項11記載の方法。 - 【請求項１３】特異的マイクロベジクル表面エピトープ
に対する抗体を不動化に先立ち結合させる請求項１〜12
のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１４】マイクロベジクルの存在および／または
濃度がそれらの燐脂質分析により評価される請求項１〜
７のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１５】固体支持体が所望により段階間で洗浄さ
れる請求項２〜14のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１６】少くとも次の構成分、すなわち ａ）マイクロベジクルを血小板不含液状検体から保持す
るためのフィルター、 ｂ）血小板由来マイクロベジクルを選択的に標識するマ
ーカーより成る試薬 を含んで成る請求項１〜15のいずれかに記載の方法を行
うためのキット。 - 【請求項１７】キットが付加的に緩衝洗浄溶液を含む請
求項16記載のキット。
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|---|---|---|---|
| GB939306053A GB9306053D0 (en) | 1993-03-24 | 1993-03-24 | Method and assay |
| GB9306053.1 | 1993-03-24 | ||
| PCT/GB1994/000592 WO1994022018A1 (en) | 1993-03-24 | 1994-03-23 | Method and assay |
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| CA (1) | CA2158363C (ja) |
| DE (1) | DE69403961T3 (ja) |
| DK (1) | DK0694168T4 (ja) |
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| GB (1) | GB9306053D0 (ja) |
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| US8563328B2 (en) * | 2004-07-26 | 2013-10-22 | University Of Louisville Research Foundation, Inc. | Fiber-optic biosensor and biosensing methods |
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| CN102084000B (zh) * | 2008-02-01 | 2016-03-16 | 总医院有限公司 | 微泡在医学疾病和病况的诊断、预后以及治疗中的用途 |
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