FI113206B - Tiettyjen hemostaattisten häiriöiden diagnoosimenetelmä ja testipakkaus - Google Patents

Description

113206

Tiettyjen hemostaattisten häiriöiden diagnoosimenetelmä ja testipakkaus Tämä keksintö koskee verihiutaleista peräisin ole-5 vien mikrovesikkeleiden osoittamista ja/tai määrittämistä nestemäisestä näytteestä, kuten plasmasta, ja tämän määritysmenetelmän käyttämistä tiettyjen hemostaattisten (verenvuodon tyrehdyttämisen) häiriöiden diagnoosissa. Tarkemmin keksintö koskee menetelmää synnynnäisen verenvuotosairau-10 den, hajapesäkkeisen verisuonten sisäisen hyytymän (DIC) -tautimuodon, ateroskleroottisen sairauden, tromboembolisen ja/tai sydän- ja verisuonitaudin diagnoosia varten ihmis-tai ei-ihmisyksilössä sekä testipakkausta menetelmän toteuttamiseksi .

15 Verihiutaleet ovat veren normaali ainesosa ja nii den tiedetään osallistuvan aktiivisesti hemostaattisiin prosesseihin. Esimerkiksi vuorovaikutuksellaan vaurioituneiden verisuonten subendoteelin kanssa verihiutaleet voivat kasautua muodostamaan primaarisen hemostaattisen hyyty-20 män. Tähän prosessiin liittyy myös yleensä erilaisten he-mostasikseen liittyvien tekijöiden tuotanto verihiutaleis-: sa.

Verihiutaleiden aktivointi edistää suuresti niiden . 1. suorittamaa hemostaattisten reaktioiden katalysointia, ja 25 erityisesti aktivoidut verihiutaleet osoittavat lisäänty-; nyttä tekijän Va konsentraatiota ja aktiivisuutta. (Tekijä

• t I

Va on komponentti niin sanotussa protrombinaasikompleksis-‘ sa, joka tuottaa trombiinia sen prekursorista protrom- biinista.) Lisäksi on havaittu, että verihiutaleet levittä- * » · • *' 30 vät mikrovesikkeleitä (joita kutsutaan myös mikropartikke- * i * leiksi) plasmamembraaniltaan aktivaation jälkeen. Tätä il-miötä kuvasi ensimmäisenä Sandberg et ai. [Biochem. J. 203: 303 - 311 (1982) ] .

Lisätutkimusten jälkeen uskotaan nykyisin, että ve-**··’ 35 rihiutaleiden mikrovesikkelit muodostuvat kuroutumalla tai '' · silmikoitumalla plasmamembraanista. Mikrovesikkelit sisäl- 2 113206 tavat verihiutaleiden glykoproteiineja Ib, Hb ja lila ja sytoskeletonin proteiineja filamiini, taliini ja myosiini. Muodostuneiden mikrovesikkeleiden läpimitta on 50 - 800 nm.

Sekä mikrovesikkelit että verihiutaleet kykenevät 5 katalysoimaan hemostaattisia reaktioita, ja kukin osoittaa sekä hyytymistä edistäviä että hyytymistä vastustavia aktiivisuuksia. Vaikka on oletettu, että mikrovesikkelien muodostus liittyy protrombinaasikompleksin tuotantoon [katso Sims et ai., J. Biol. Chem. 264: 17049 - 17057 (1989)], 10 nyt on kuitenkin osoitettu, että kaikki spesifinen aktiivisuus rajoittuu joko verihiutaleista peräisin oleviin mikro-vesikkeleihin tai verihiutaleisiin itseensä.

Joukko eri tekijöitä voi indusoida verihiutaleiden aktivaatiota ja mikrovesikkelien muodostusta, esimerkiksi 15 trombiini, kollageeni, ionoforit, kalpaiini ja komplement-tiproteiinikompleksit, esim. C5b-9. Verihiutaleiden heikot aktivaattorit, esimerkiksi ADP, epinefriini ja verihiutaleita aktivoiva tekijä, saavat aikaan ainoastaan pienten määrien mikrovesikkeleitä muodostumisen. Mikrovesikkelien 20 konsentraation nousu on osoitettu verihiutalekonsentraatti-en varastoinnin jälkeen [Bode et ai., Blood 77: 887 - 985 Ϊ: (1991); Solberg et ai., Thromb. Res. 48: 559 - 565 (1987)].

Lisäksi on osoitettu, että sellaisten verihiutaleita käsit-,tävien näytteiden sekoitus, jossa verihiutaleita on akti-25 voitu kollageenilla ja/tai trombiinilla, edistää mikro- . vesikkelien muodostusta.

» ·

Hemostasiksen muodostus verisuonisairauden tai » · f » · ’ -häiriöiden kehittymisen aiheuttajana tai heijastajana on laajalti tunnettu, ja monien hemostaattisten tekijöiden so- > 30 veltuvuutta tällaisen sairauden ja häiriöiden merkiksi on » » · ·...· tutkittu. Näin ollen voidaan käyttää protrombiini- = : aikatestejä, joihin liittyy tromboplastiini, tai aktivoidun trombiinin osa-aikatestejä, joihin liittyy luontaisia plas-• man hyytymisen aktivaattoreita, mittaamaan tai osoittamaan 35 sairautta. Käytössä on myös testejä fibrinogeenille, antit-rombiini Ulille, proteiini C:lle, proteiini Sille, tekijä 3 113206 VIII:lie, kudosplasminogeeniaktivaattorille, fibriinimono-meereille ja fibrinogeenin pilkkoutumistuotteille.

Vaihtoehtona plasman hemostaattisten tekijöiden määritykselle on tehty myös yrityksiä mitata hemostasiksen 5 aikana tapahtuvan soluaktivaation määrää. Verihiutaleiden aktivaatiota on tutkittu tässä mielessä, koska (kuten edellä on esitetty), verihiutaleet ovat tärkeä osallistuja he-mostasiksessa, ja niillä uskotaan myös olevan päärooli valtimotukoksen kehittymisessä ja ateroskleroottisissa proses-10 seissa.

Aikaisemmissa tutkimuksissa on pyritty mittaamaan verihiutaleiden aktivaatiota määrittämällä eritettyjen proteiinien määriä. Näin ollen on tutkittu analyysejä veri-hiutaletekijä 4:n (PF-4), β-tromboglobuliinin (β-TG) ja 15 trombospondiinin määrittämiseksi [katso Lane et ai., Tromb. Haemostas. (Stuttgart) 52 (2) s. 183 - 187 (1984)].

Minkään näistä proteiineista ei kuitenkaan havaittu olevan sopiva rutiinimittauksiin. Trombospondiinin havaittiin olevan epäspesifinen verihiutaleille, ja tutkimukset β-TG.-llä 20 ja PF-4:llä osoittivat, että niiden puoliintumisajat veressä olivat liian lyhyitä, aiheuttaen ongelmia näytekonsent-: raation erottamisessa taustatasosta. Lisäksi β-TG-tasojen havaittiin nousevan potilailla, joilla oli munuaisten va-jaatoimintaa, ja PF-4-tasoihin vaikutti hepariinin läsnäolo ,;t 25 (hepariinia käytetään laajalti verihiutaleperäisten häiri- !"! öiden hoidossa).

• · t (Il ’II.* Nyt on havaittu, että verihiutaleiden muodostamat • i · '·’ ’ mikrovesikkelit ovat tarkka indikaatio verihiutaleiden ak tivaatiosta, ja näin ollen heijastavat hemostaattisen jär-: .’* 30 jestelmän aktiivisuutta kokonaisuudessaan. George et ai., [J. Clin. Invest., 78: 340 - 348 (1986)] mittasivat veri- ,*. : hiutaleiden pinnalle ja verihiutaleista peräisin oleville • · mikrovesikkeleille ilmaantuvien glykoproteiinien muutosta

I I

. kardiopulmonaarisen ohitusleikkauksen jälkeen. Pantiin mer- '...· 35 kille, että mikrovesikkelien lukumäärä lisääntyi, ja ole- * tettiin, että tämä johtui viiltostresseistä, joita tällai- 4 113206 nen operaatio aiheuttaa. Ei kuitenkaan esitetty, että mik-rovesikkelien konsentraation mittaus voisi olla hyvä indikaattori hemostaattisille häiriöille, ja voisi tarjota perustan menetelmälle tällaisten tilojen diagnoosia varten.

5 Nyt on havaittu, että verihiutaleista peräisin ole vien mikrovesikkelien läsnäolon ja/tai konsentraation arviointia voidaan käyttää synnynnäisen verenvuotosairauden, hajapesäkkeisen verisuonten sisäisen hyytymän (DIC) -tautimuodon, ateroskleroottisen sairauden, tromboembolisen 10 ja/tai sydän- ja verisuonitaudin diagnoosimenetelmänä.

Määritelmä "hemostaattiset häiriöt" viittaa minkä tahansa poikkeamaan tai epänormaaliuteen veren hyytymiskas-kadimekanismissa, erityisesti häiriöihin, jotka johtavat lisääntyneeseen veritulpan muodostumisen todennäköisyyteen, 15 tai vähentyneeseen veren hyytyrniskykyyn vaurion jälkeen, esimerkiksi synnynnäisiin verenvuotosairauksiin, kaikkiin DIC: n muotoihin (Disseminated Intravascular Coagulation, hajapesäkkeinen verisuontensisäinen hyytymä) ja ateroskle-roottiseen sairauteen. Hemostaattisten häiriöiden diagnoosi 20 mahdollistaa siten tromboembolisten (veritukkotulppauma) ja/tai kardiovaskulaaristen (sydän ja verisuoni-) -sairauk-sien osoittamisen ja/tai määrittämisen. Tämä määritelmä kä-sittää myös hemostaattiset häiriöt, jotka ovat sekundaarinen ilmiö, kuten esimerkiksi syövän seurauksena syntyneet.

,25 Tämä keksintö tarjoaa siten käyttöön menetelmän > diagnoosia varten ihmis- tai ei-ihmisyksilössä, jolle on /!/ tunnusomaista, että arvioidaan verihiutaleperäisten mikro- • * vesikkelien läsnäolo ja/tai konsentraatio mainitun yksilön ruumi i nne s t enäyt teestä.

i · » 3 0 Keksinnön mukainen diagnostinen menetelmä toteute- taan in vitro käyttäen näytettä ruumiinnesteestä, esim. ve-: restä, joka on saatu potilaalta tavanomaisilla tavoilla.

On myös olemassa tarve yksinkertaiselle analyysille, » * • jolla määritetään verihiutaleperäisten mikrovesikkelien 3 5 läsnäolo tai konsentraatio. On havaittu olevan erityisen 5 113206 hyödyllistä vangita mikrovesikkelit suodattimelle, mikä mahdollistaa helpon ja tarkoituksenmukaisen määrityksen.

Tämä keksintö tarjoaa siten käyttöön myös määritysmenetelmän verihiutalemikrovesikkelien määrittämiseksi kva-5 litatiivisesti ja/tai kvantitatiivisesti nestemäisestä näytteestä, jolloin mainittu määritysmenetelmä käsittää seuraavat vaiheet: a) i. näyte suodatetaan ensin, jolloin mikrovesikkelit pidättyvät retentaatissa, ja lisätään sitten mainit- 10 tuun retentaattiin merkki, joka on spesifinen maini tuille mikrovesikkeleille; tai ii. lisätään valinnaisesti ensin merkki, joka on spesifinen mainituille mikrovesikkeleille, ja suodatetaan sitten mainittu näyte, jolloin leimatut mik-15 rovesikkelit pidättyvät retentaatissa; b) pestään haluttaessa mainittu suodatin ja c) määritetään pidättyneen merkin läsnäolo tai määrä.

Nestenäytteen tulisi olla puhdas verihiutaleista ja mielellään muista soluista, jotka kykenevät tuottamaan he-20 mostaattisia proteiineja, esim. epiteelisoluista tai mono-syyteistä. Sen vuoksi on otettu huomioon, että ennen vai-hetta (a) nestenäyte suodatetaan tai sentrifugoidaan, jotta ; . tuotetaan olennaisesti soluton näyte. Suodatin, jonka huo- koskoko on suurempi tai yhtä suuri kuin 100 nm, esimerkiksi 25 suurempi tai yhtä suuri kuin 1 μπι, on sopiva poistamaan ! *! pääosan soluista nestenäytteestä, samalla kun se sallii paljon pienempien mikrovesikkelien pysyä suspendoituneina.

* t · * ’ Kun näytteessä olevat solut on määrä poistaa sentrifugoi- malla, g-voima 2 000 - 20 000 x g 10 - 30 minuuttia, esi- I .· 30 merkiksi 11 000 x g 15 minuuttia, on sopiva, ja sitä voi- daan käyttää tuotettaessa olennaisesti soluton näyte, jota : vaaditaan edellä kuvatun määritysmenetelmän vaiheessa (a) .

> ·

Muita vastaavia tekniikoita solujen poistamiseksi voidaan * » • käyttää, ja saada vaadittava olennaisesti soluton nestemäi- 35 nen näyte.

6 113206

Vaiheessa (a) käytetyn suodattimen huokoskoon tulisi olla kyllin pieni pidättämään verihiutaleiden mikro-vesikkelit, ja huokoskoon tulisi olla pienempi tai yhtä pieni kuin 800 nm, edullisesti pienempi tai yhtä suuri kuin 5 200 nm on sopiva. Suodattamalla mikrovesikkelit immobili- soidaan suodattimelle, joka voidaan sitten saattaa yhteyteen merkin kanssa, tai analysoida suoraan, jos mikrovesikkelit on jo leimattu.

Sopiva merkki sisältää minkä tahansa vasta-aineen, 10 joka on spesifinen verihiutaleperäisten mikrovesikkelien pintaepitoopeille. Keksinnön mukainen edullinen vasta-ainemerkki tunnistaa glykoproteiineja, mukaanluettuna kompleksi GPIIb-IIIa ja/tai erilliset proteiinit GPIIb ja GPII-Ia. Muihin verihiutaleille spesifisiin glykoproteiineihin, 15 joita esiintyy mikrovesikkeleissä, kuuluvat GPIb-GPIX, GPIa-IIa ja GPIIIb. Mikrovesikkeliin sitoutuva vasta-aine voi itse olla leimattu, tai vaihtoehtoisesti voidaan käyttää toista vasta-ainetta, esim. anti-hiiri immunoglobulii-nia, joka on leimattu, ja joka sitoutuu spesifisesti ensim-20 mäiseen käytettyyn vasta-aineeseen, joka on esim. hiiren monoklonaalinen vasta-aine. Monoklonaaliset vasta-aineet ovat edullisia. Merkin lisääminen nestemäiseen näytteeseen, kuten vaiheessa (a) (ii) on tehty, on edullista. Merkki voidaan saattaa yhteyteen suodattimeen immobilisoitujen, 25 vaiheen (a) (i) mukaisten mikrovesikkelien kanssa joko li- "! säämällä merkkiä suoraan suodattimelle tai upottamalla suo- ;/ datin merkkiliuokseen. Käytetty leima voi olla mitä tahansa *’ yhdistettä, joka kykenee tuottamaan signaalin, esimerkiksi entsyymejä, kromoforeja, fluoroforeja, radioaktiivisia ιξοί ’,· 30 tooppeja, värillisiä partikkeleja, väriaineita, kolloidisia metalleja, jne.

: Ylimääräinen väri poistetaan edullisesti pesemällä suodatin ennen kuin tehdään mitään määritystä merkin läsnä-. olosta tai määrästä. Lisäksi vaiheessa (a) (i) suodatin ...· 35 voidaan pestä näytteen lisäämisen jälkeen ja ennen merkin lisäämistä. Vesi tai puskuri ovat sopivia pesuvaiheisiin.

7 113206

Kun käytetty merkki on entsyymi, vaihe (c) voi käsittää substraatin lisäämisen katalysoitavaan reaktioon. Merkki tai leima on kuitenkin edullisesti näkyvä välittömästi, mahdollistaen välittömän arvioinnin tekemisen.

5 Mikrovesikkelien konsentraatio näyteessä voidaan laskea sen jälkeen suodattimeen pidättyneen merkin tasosta. Kliinikko voi käyttää tätä arvoa sitten potilaan synnynnäisen verenvuotosairauden, hajapesäkkeisen verisuonten sisäisen hyytymän (DIC) -tautimuodon, ateroskleroottisen sairau-10 den, tromboembolisen ja/tai sydän- ja verisuonitaudin diagnoosissa. Määritysmenetelmä, joka sallii kvantitatiivisen määrityksen, on edullinen.

Antikoagulantilla, kuten sitraatilla, EDTA:lla tai hepariinilla käsitelty plasma, josta puuttuvat verihiuta-15 leet, on sopiva käytettäväksi näytteenä keksinnön mukaisessa määritysmenetelmässä. Sitraatilla käsitelty plasma voidaan vaadittaessa tietysti laimentaa ennen käyttöä.

Lisäksi mikrovesikkelit sisältävästä suodattimesta voidaan analysoida proteiinipitoisuus tai, edullisemmin 20 fosfolipidimäärä.

Keksinnön mukaisessa edullisessa suoritusmuodossa käytetään suodattimena nitroselluloosamembraania tai nylon-membraania, esim. Hybond NR (jota myy Amersham Interna- i t tional) tai Magna NylonR (jota myy MSI) . 100 nm:n huokosko-25 ko on sopiva. Absorbenttituppo, kuten selluloosasta tehty "imupaperi, asetetaan edullisesti membraanin toiselle puo-; * lelle edistämään nestemäisen näytteen kulkua kalvon läpi, < » t ’·' ja nestettä läpäisemätön levy tai alusta asetetaan membraa nin toiselle puolelle. Läpäisemättömässä levyssä tai alus- V 30 tässä on pyöreitä reikiä, läpimitaltaan esim. 5 mm, jotta nestemäisen näytteen ja määritysnesteiden lisääminen mem-; braaniin tapahtuu oikealla tavalla. Tietty määrä solutonta vesiliuosta, joka sisältää mikrovesikkelit (ja joka on ha-. luttaessa ennalta laimennettu puskurilla), esim. 10 - 35 500 μΐ, annostellaan membraanille ja sen annetaan kulkea absorboivaan tuppoon alla. Lisätään vesiliuoksena, esim.

8 113206 10 - 500 μΐ anti-GPIIb-IIIa-vasta-ainetta, joka on konju- goitu merkkinä olevaan kultasoolikolloidiin, ja annetaan sen kulkea membraanin läpi. Membraani pestään sitten 2 x 200 μ1:1ΐ3 sopivaa pesunestettä, esimerkiksi Tris-HCl-5 puskurilla (pH 7,0), ennen kuin membraaniin immobilisoidun kultasoolin määrä analysoidaan, yleensä paljain silmin vertaamalla väriasteikkoon tai reflektometrillä.

Tämä keksintö tarjoaa käyttöön myös testipakkauksen keksinnön mukaisen määritysmenetelmän toteuttamiseksi, jol-10 le pakkaukselle on tunnusomaista, että se käsittää vähintään suodattimen mikrovesikkelien pidättämiseksi verihiutaleita sisältämättömästä nestemäisestä näytteestä, ja rea-genssin, joka käsittää merkin, joka leimaa selektiivisesti verihiutaleperäiset mikrovesikkelit, valinnaisesti yhdessä 15 puskuroidun vesiliuoksen kanssa.

Saattamalla haluttaessa laimennettu, olennaisesti soluton plasmanäyte, joka on otettu ihmisen tai eläimen, joka ei ole ihminen, edullisesti nisäkkään, kehosta edellä kuvattuun määritysmenetelmään verenkierrossa kulkevien ve-20 rihiutaleperäisten mikrovesikkelien läsnäolo tai konsent-raatio voidaan määrittää.

: : Seuraavat esimerkit tarjotaan ainoastaan kuvaamaan , keksintöä:

Kaikki esitetyt mitat ovat tilavuusmittoja, jollei 25 toisin ilmoiteta. Esimerkeissä käytetään seuraavia lyhen-teitä viittaamaan eri puskuriliuoksiin: ; * TS-puskuri: 0,01 mol/1 Tris-HCl-puskuri (pH 7,4)/0,154 < % * mol/1 NaCl TTG-puskuri:TS-puskuri, johon on lisätty 1 % Triton X-100:a » * · ί ’.· 30 TBS-puskuri: 0,02 mol/1 Tris-HCl-puskuria (pH 7,5)/0,5 mol/1 NaCl : TTBS-puskuri: TBS-puskuri, johon on lisätty 0,05 % Tween 20 : ta.

> * » 9 113206

Esimerkki 1

Verihiutaleiden mikrovesikkelien valmistus ja kerääminen

Veri kerättiin puskuroituun vesipitoiseen natrium-5 sitraattiin (1:9) ja sentrifugoitiin 320 x g 15 minuuttia. Verihiutaleita runsaasti sisältävä supernatantti (PRP) siirrettiin muoviputkiin ja sentrifugoitiin vielä 10 minuuttia 11 000 x g. Saadusta supernatantista puuttuvat verihiutaleet, ja se sisältää mikrovesikkelit. Mikrovesikke-10 lien keräämiseksi 2,8 ml supernatanttia suodatettiin Mil-lex-WR 0,10 μτα suodattimen läpi (Millipore Products Division, Bedford, MA, USA), joka oli kiinnitetty ruiskuun. Suodatin pestiin huolellisesti TS-puskurissa. Suodattimelle jääneitä mikrovesikkeleitä voitiin analysoida jatkossa joko 15 viemällä koko suodatin reaktiovaiheiden läpi, tai ne liuotettiin 150 /xl:aan TTG-puskuria.

Esimerkki 2 Näytteitä TTG-puskuriin liuotetuista mikrovesikke-leistä peräisin olevasta materiaalista määritettiin 20 "Phospholipid enzymatique" -pakkauksella (BioMerieux, Ranska) fosfolipidien kvantitoimiseksi. Menetelmä perustuu Ta-kayaman et ai. menetelmään, Clin. Chim. Acta., 1977, 79, s.

. . . 93 - 98.

Esimerkki 3 25 Kokonaisproteiinimääritys ; Näytteitä esimerkissä 1 kuvatulla tavalla suodatet tujen ja TTG-puskuriin liuotettujen mikrovesikkelien mate-'*’ riaalista mitattiin BioRadin värinsitoutumisanalyysillä (BioRad, Richmond, USA), joka perustuu Bradfordin menetel-• ’.· 30 mään, Anal. Biochem. 1976, 72, 248 - 54.

:((>·' Esimerkki 4 ,·. : Nopea testi mikrovesikkelien määrittämiseksi immu- ‘ '· nokemiallisesti . Sitratoituja verinäytteitä sentrifugoitiin 320 x g 1 * t 35 15 minuuttia, mitä seurasi supernatanttien sentrifugointi 11 000 x g 10 minuuttia. Verihiutaleiden mikrovesikkelit 10 113206 sisältäviin supernatantteihin lisättiin monoklonaalista vasta-ainetta SC22, joka on suunnattu verihiutaleiden pin-tamembraanien GPIIb-IIIa-kompleksin Cd41b:ssä (GPIIb) olevaa epitooppia vastaan. Vasta-aine saatiin Immunotech 5 S.A.rsta, Luminy, Marseille, France. Vasta-aine lisättiin laimennoksena 1:1500. Kun oli inkuboitu 1 minuutti 20 °C:ssa, 2,8 ml seoksia suodatettiin, kuten esimerkissä 1 on kuvattu. Mikrovesikkelit olivat nyt vangitut suodattimille hiiren monoklonaalisen vasta-aineen kanssa. Suodatti-10 met pestiin perusteellisesti TTBS-puskurissa ja sen jälkeen TBS-puskurissa. Vuohen anti-hiiri-IgG F(ab), joka oli kon-jugoitu alkaliseen fosfataasiin (Jackson Immuno Research Laboratories, USA), laimennettuna 1:3 000 TBS- puskurilla, huuhdottiin kunkin suodattimen läpi. Konjugaatti oli nyt 15 sitoutunut vasta-aineeseen, joka oli kiinnittynyt GPIIb-Illa-komplekseihin mikrovesikkeleissä. Suodattimet upotettiin liuokseen, joka sisälsi 0,5 mg/ml Nitroblue tetrazo-liumia, 0,25 mg/ml 5-bromo-4-kloori-3-indolyyli-fosfaatti-p-toluidiinia, 0,1 mol/1 NaHC03-puskuria (pH 9,8) ajanjak-20 soksi, joka oli riittävä johtamaan määritettävään värinmuo-dostukseen suodattimen pinnoille.

Potilaat, joilla oli positiivinen D-dimeeri ja/tai > » · positiivinen liukoisen fibriinin testi (etanolin geelinmuo- i i * ' , dostustesti) tutkittiin käyttämällä edellä mainittua mene- ► s * 25 telmää. Kontrolliksi valittiin ilmeisen terve yksilö, jolla - ei ollut kliinistä sairauden merkkiä, ja jonka D-dimeeri- ; S ja liukoisen fibriinin testit olivat negatiivisia.

> · I · » * > i · »

( I

» « i < > I » 11 113206

Suodattimille muodostuva väri määritettiin reflek-tometrillä (NycoCardR Reader, esim. kuten UK-patenteissa numerot 9 213 733,0 ja 9 213 737,1 on kuvattu). Heijastus-kykyarvot olivat: 5 Heijastuskykyarvot Nävte 1. Päivä 2. päivä 3. Päivä potilas 0,076 0,128 0,135 potilas 0,081 0,126 0,115 normaali 0,034 0,073 0,070 10 puskuri 0,025 0,074 0,042

Voidaan nähdä, että potilasnäytteet antavat olennaisesti korkeampia arvoja kuin normaali plasmanäyte ja kontrollipuskuri.

15 Esimerkki 5

Tutkimus materiaalilla potilaista, joilla on trom-boembolinen sairaus (veritukkotulppauma)

Potilaat, joilla oli D-dimeerin ja/tai liukoisen fibriinin läsnäololla rutiininomaisissa analyyttisissä 20 laboratoriotesteissä varmistettu tromboembolinen sairaus, ja ilmeisesti terveet yksilöt jaettiin ryhmiin iän mukaan.

. Otettiin verta ja se sentrifugoitiin, ja verihiutaleiden , . mikrovesikkelit kerättiin suodattimille, kuten esimerkissä f i 1 on kuvattu. Tehtiin analyysit kokonaisfosfolipidistä, 25 kokonaisproteiinista ja GPIIb-IIIa:sta käyttäen nopeaa immunoanalyysiä spesifisten vasta-aineiden kanssa (kuvattu : vastaavasti esimerkeissä 2 - 4). Immunokemiallisessa ana-

1 I

' lyysissä käytettiin kontrollina väriä, joka saatiin yksin omaan puskurin korvatessa näytteen, ja se vähennettiin > 30 arvoista. Mikrovesikkelien sisäiselle standardille annet- : tiin mielivaltainen arvo 1,0 ja kaikki immunokemiallisella ; menetelmällä saadut tulokset suhteutettiin tuloksiin, jot- ! ka saatiin tällä standardilla, kun suoritettiin yksittäi- , siä kokeita.

» * » · 12 113206

Tulokset on esitetty taulukossa 1, ja ne osoittavat, että kokonaisproteiinin määrä oli huomattavan limit-täinen potilaiden ja terveiden yksilöiden välillä. GPIIb-IIIa:n määrä osoitti kuitenkin selvää eroa potilaiden ja 5 terveiden yksilöiden välillä. Näin ollen tämä analyyttinen menetelmä soveltuu parhaiten diagnostisen välineen rakentamiseksi verihiutaleiden mikrovesikkelien osoittamiseksi verinäytteistä.

Vaihtelevuus kokonaisproteiinin tasossa saattaa 10 johtua proteiinin vaihtelevasta määrästä mikrovesikkeleis-sä. Voi olla vaikeaa kontrolloida, missä määrin vesikkelit repeävät valmisteluvaiheen aikana, ja niin muodoin vaihte-leva liukoisten proteiinien vuoto vesikkeleistä saattaa aiheuttaa tuloksissa havaittua vaihtelua.

' t t i tr » 1 1 « t

I I

1 » • » * 1 · 1 » \ t 1

Tiili • I

13 11320£

o s (Μ τ- CM

n τ- o cm o

« I' H H II II

C c c c c C

<ϋθ'$σ> o rt CO h- S

O* " S rt O - 5* ΙΟ ί:- «D o“ 0) V 0) +1 V to ^ 41 5· 41 iV 41 9 £ ^

Hl i! o |A jo J cd Ί co <V to a> £ ^ (rt .j rC ^ O O O tO lO tO r— TfO o o +j T3 ^ o o o" σ T-- o' o' o" o' o' σ' ό d -h •h a £ -H $ tn

•H h 9 ^ „ -r- CM

mo <? * 9 pj o 9 ® «H „ ♦ 9 o ” +1 9 > CO p cm in tl 7 k -4 ^ o ^ 9 9 9 «A v= 3

Cm A οσ .. oo ·. o o" ,, ® M 'O -h

•H A

a) S g +J O ^ ® q

k ^ f~\ tO m* 00 CO *** tn O

6 3 o +1 ° +1 9' ° Jj o 9. +, 9 i1 g

CÄ *ϊ 5 * σ> t~ Tl V “H T CD to 5r- O

O ^ ^ o «r-IO to ^ CO ▼- O o C 5 <° O σ' o" o' c\T r-' o' o' T-" o' d 6 a) '3 ?'-p w +J S :fl o" c d d 9 ·* _. O* ™ Q) o 41 9- 41 cd o ^ σ 9. 41 o £< w q σ 9 no +1 V +1 V «n cm O ‘2 >i o 9-7 oo cMt" on Te T- JC 4J in o o σ' σ' *-' o' o' o' o' o' o o

:<0 . -H

4-) Λ Li

H tO :(0 <° M

-rMto-rt r- tn o o cm n :0 -H e θ' 9. o' o' 9. 9. 0 o' 9 Η Ο ε o 41 9 41 ώ V. σ ° 41 9 •H -1-1 c 9 9 «n CM o 41 v 41-7 τ- ό w :(3 σ 9. 9 9 9 9 7 9. 9 9°

V » Il ^ oo o' Ο r- r-' o' o' o' o' OO O

>i <0 :(0 4-* :(0 ζ 2 W E N CM (O CM d -P-H n_ co o o in o 3 H W C o 9 o' 9 . 9 —. o' 9 o' ♦ * *H jk; ., o 41 o 4| σ> τ- 9. o 9 4i o il m

: ® 3 (0 7 n n cm 9 41 9 41 9 o n n 7. -H

H (0 h o 9 cm 9 9 9. 9 o *n cm cm oo ft ·, (0 4-> |_| n oo oo »-o oo' o' o' o' 6 6 • . ®pH ®

E -H I M

;· « E .Q in N CM 3 ... 0 H CM O O O rf O'3 C C H o' 9 o' o' 9 m 9. _ o' 9 O* w : * ^ :(0 Οι O 41 σ 41 m CM 9 Ο . II Τ- I, n " M O 9 N cm in o 41 'f 41 9 7 cm n 7. 9 : ,-. °no o n - 00 n n n r- 4m! 80 > :,; ; (0 =10 (0 cm do 0' 0' cm' 0' 0' 0' 0' 0' 0' o b 1J 6 T™» ro 7 o · O' or o: o · o,;

"' * -H CII Φ. Λ ·Η *2 Λ H *2 Λ H ϋ-H W Λ H w Jd -H

irt d) ή τ I .p-j I—I 4| *h γ-η tI -h h »I -ri pH 41 ·η ·—I 41 ·η ή ” J n C X fö :rd X rt3 1(¾ X d X (d «Ö χ <ti «Ö v fdifi) a >> >> >> >> > > >>>1 ' *. ’. +» 2 ·Μ I a) I a) I ώ ci : , · 0 >* ® Ή > -H > H > b 1-4 Ο.Λ 4-> MW M +)in M 4-) IQ M 2 -HO on! a) on) a) onJ ω (0 * 0 4-) tO M E-ι O-i ·—) Eh CM Ή Eh 4-) Λί a) a) ft ,* In r 2 • . Ji ¢1 > M g —^ H CO +-> I !5 3 ä ο ή λ I ·η -J ro =a)^— 0

. . Γ-4 O M <0 >1 Ο fl ^ c·^-!- ~ +) «Ö -H «D C

, -H _l Vi C Μ Μη -Η Ο Ο -P H til rt -n 111 n -r4 ..... WftE ϋ O a> = KÖ >1 lO < * * ® p -H O X o HC O M C CL Oi-p >1^ ^

Eh Eh Ε Λί H Cnr-4t_ M ft £ O'" ^ 14 11320(5

Esimerkki 6

Tutkimukset materiaalilla potilaista, joilla oli

DIC

Potilaat, joilla oli hajapesäkkeinen suonensisäinen 5 hyytymä (Disseminated Intravascular Coagulation, DIC) arvioituna positiivisilla fibriinin hajoamistuotteiden (FDP) ja liukoisen fibriinin (positiivinen etanolin geelinmuo-dostustesti) testeillä, tutkittiin käyttämällä edeltävissä esimerkeissä kuvattuja menetelmiä. Potilaiden ikä oli vä-10 Iillä 24 - 72 vuotta. Potilaista, joilla oli DIC, kymmenen oli läpikäynyt suuren leikkauksen, kuudella oli pre-ek-lampsia, kolmella oli sepsis, ja kolmella oli promyelo-syyttinen leukemia. Kontrollit (n = 30) olivat terveitä verenluovuttajia, jotka sopivat ikänsä ja sukupuolensa 15 perusteella. DIC-potilaat eivät saaneet mitään hyytymisen vastaista hoitoa verinäytteen ottamisen ajankohtana.

GP IIb-IIIa:n (esim. GPIIb-antigeeni), fosfolipidin ja kokonaisproteiinin testaus edellä olevissa esimerkeissä kuvatuilla menetelmillä antoivat seuraavat tulokset: 20 DIC-poti- kontrol- eron to- laat n=22 lit n=30 dennäk.

,,. pot · j a kontr.

,··. ______välillä GPIIb- keskiarvo 0,21 0,0 p< • Ula_±0069_0,000001 _vaiht._0,03-3,59 0-0,15_ ♦ · ; ; ; fosfoli- keskiarvo 0,43 0,015 p< :T: 25 pidi ±0,167 ±0,006 0,000001 (mmol/1)_ :v> vaiht._0,05-1,40 0-0,40_ kokonais- keskiarvo 1,45 0,6 p< prot. ±0,61 ±0,028 0,001 30 (mg/ml)_ _vaiht._0,5-9,98 0,10-2,34_ 15 113206

Tulokset osoittavat, että GPIIb-lIla:n ja fosfoli-pidin määritys antavat erittäin merkitsevät erot potilaiden ja kontrollien välille, kun taas merkitsevyys on huomattavasti alhaisempi kokonaisproteiinin suhteen.

Claims (17)

113206

1. Menetelmä synnynnäisen verenvuotosairauden, ha-japesäkkeisen verisuonten sisäisen hyytymän (DIC) -tauti- 5 muodon, ateroskleroottisen sairauden, tromboembolisen ja/tai sydän- ja verisuonitaudin diagnoosia varten ihmis-tai ei-ihmisyksilössä, tunnettu siitä, että arvioidaan verihiutaleperäisten mikrovesikkelien läsnäolo ja/tai konsentraatio mainitun yksilön ruumiinnestenäyttees- 10 tä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että menetelmään kuuluvat vaiheet, joissa erotellaan mikrovesikkelit kokonaisista soluista, immobilisoidaan mainitut mikrovesikkelit kiinteään kanta- 15 jaan ja arvioidaan immobilisoitujen mikrovesikkelien läsnäolo tai konsentraatio.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mikrovesikkelit erotellaan kokonaisista soluista sentrifugoimalla tai suodattamalla.

4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mikrovesikkelit erotellaan ko- , ·, konaisista soluista suodattamalla suodattimen läpi, jonka huokoskoko on > 200 nm.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, • i 25 tunnettu siitä, että suodattimen huokoskoko on - > 1 pm.

: : 6. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-5 mukai- v · nen menetelmä, tunnettu siitä, että mikrovesikke lit immobilisoidaan suodattimelle, jonka huokoskoko on 30 < 800 nm. 1 »

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, t I t ,· . tunnettu siitä, että suodattimen huokoskoko on ' Ί < 2 00 nm.

• ‘ 8. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-7 mukai- » 35 nen menetelmä, tunnettu siitä, että mikrovesikke- • · » lien läsnäolo ja/tai konsentraatio arvioidaan sitomalla 113206 vasta-aineita mikrovesikkelien spesifisiin pintaepitooppei-hin ja arvioimalla näin sitoutuneiden vasta-aineiden määrät .

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että pintaepitoopit sijaitsevat glykoproteiineissa.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että pintaglykoproteiini on GPIIb-Illa.

11. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 8-10 mu kainen menetelmä, tunnettu siitä, että vasta-aine sisältää leiman, joka voidaan osoittaa suoraan tai epäsuorasti .

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, 15 tunnettu siitä, että leima osoitetaan epäsuorasti sitomalla vasta-aineeseen leimattu lisäkomponentti, joka voidaan osoittaa suoraan tai epäsuorasti, tai lisäämällä substraattia entsyymin sisältävälle vasta-aineelle.

13. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-12 mu- 20 kainen menetelmä, tunnettu siitä, että vasta- aineet spesifisille mikrovesikkelen pintaepitoopeille sido-taan ennen immobilisaatiota.

14. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mikrovesik- » I " ; 25 kelien läsnäolon ja/tai konsentraation arviointi tehdään » · : fosfolipidianalyysillä. i ’ ί

15. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 2-14 mu- V · kainen menetelmä, tunnettu siitä, että kiinteä kantaja pestään haluttaessa vaiheiden välillä.

16. Testipakkaus minkä tahansa patenttivaatimuksis- ta 1 - 15 mukaisen menetelmän toteuttamiseksi, t u n - , n e t t u siitä, että testipakkaus käsittää vähintään seu- > · 1 * raavat komponentit: a) suodattimen mikrovesikkelien pidättämiseksi ve-35 rihiutaleita sisältämättömästä nestemäisestä näytteestä, I t t t 113206 b) reagenssin, joka käsittää merkin, joka leimaa selektiivisesti verihiutaleperäiset mikrovesikkelit.

17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen testipakkaus, tunnettu siitä, että testipakkaus sisältää lisäksi 5 puskuroidun pesuliuoksen. > · » » * 113206