JPWO2010071114A1 - 血液試料中の癌細胞の検出方法 - Google Patents
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Abstract
Description
GFP遺伝子を有する腫瘍溶解性ウイルスは、テロメスキャン(登録商標) (OBP-401)として市販されている。テロメスキャン(登録商標)は、癌細胞内で特異的に増殖し、GFPを産生することにより、癌細胞を特異的に蛍光発光させることができる。
− 赤血球の除去:血液中に存在する癌細胞の数は、極めて少ない。よって、血液中に多量に存在する赤血球により癌細胞が遮蔽され、癌細胞の検出を妨げる可能性がある。
− 偽陽性のシグナルの抑制:正常な血球系細胞であるにもかかわらず、腫瘍溶解性ウイルスが増殖できる細胞、例えば白血球(一部の単球及びリンパ球)が希に存在する。このような正常細胞内で腫瘍溶解性ウイルスが増殖すると、癌細胞の検出に偽陽性のシグナルを与える可能性がある。
癌細胞の存在が疑われる血液試料を、腫瘍溶解性ウイルスとインキュベートすることにより、少なくとも前記癌細胞内で腫瘍溶解性ウイルスを増殖させる工程、
増殖工程で処理された血液試料と、固定化剤と、非イオン性界面活性剤とを混合する工程、及び
混合工程で得られた血液試料に含まれる、腫瘍溶解性ウイルスが増殖した癌細胞を検出する工程
を含む、血液試料中の癌細胞の検出方法を提供する。
本明細書において、「腫瘍溶解性ウイルス」とは、正常細胞内では通常増殖できず、生存している癌細胞内で特異的に増殖可能な制限増殖型ウイルスのことをいう。
しかし、制限増殖型とするための機構によっては、腫瘍溶解性ウイルスが正常細胞内でも増殖する可能性が否定されないことは、当業者に明確に認識される。
すなわち、腫瘍溶解性ウイルスは、癌細胞内で特異的に増殖可能とする機構、例えば癌細胞で特異的にプロモーター活性を示すプロモーターを有することにより、癌細胞内で特異的に増殖できるが、正常細胞の中にもこのプロモーターを機能させ得る細胞が存在し得る(例えば白血球)。このような正常細胞は、腫瘍溶解性ウイルスが増殖した細胞を癌細胞として検出する癌細胞の検出方法においては、癌細胞として検出され得るので、偽陽性の結果を導く可能性がある。
さらに、本発明の方法では、上記の処理により、血液試料中の赤血球も溶血できるので、血液試料中に微量しか存在しない可能性がある癌細胞を、より高い感度で検出できる。
また、本明細書において、「赤血球が溶血する」とは、赤血球の細胞膜が可溶化されることをいう。
標識タンパク質は、緑色蛍光タンパク質が好ましい。
標識タンパク質遺伝子の発現を制御し得るプロモーターとしては、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、SV40後期プロモーター、MMTV LTRプロモーター、RSV LTRプロモーター、SRαプロモーターなどが挙げられる。なかでも、標識タンパク質の遺伝子は、CMVプロモーター又はhTERTプロモーターの制御下におくことが好ましい。これらのプロモーターの核酸配列は、公知である。
本発明の方法は、癌細胞の存在が疑われる血液試料を、上記の腫瘍溶解性ウイルスとインキュベートして、血液試料中の少なくとも癌細胞内で腫瘍溶解性ウイルスを増殖させる工程(以下、「増殖工程」ともいう)を含む。
上記の血液試料は、通常、癌の罹患が疑われる患者、癌患者などの癌細胞の存在を検出しようとする被験者から採取され得る。血液試料は、全血、及び全血を前処理して得られた処理血液のいずれであってもよいが、検出効率がより向上される点で、全血、特に末梢血から血清を除去したものが好ましい。
全血から血清を除去する方法は、公知であり、例えば抗凝固剤(例えばエチレンジアミン四酢酸、クエン酸ナトリウム、ヘパリンなど)を加えた全血を、遠心分離する方法が挙げられる。遠心分離は、500〜3500rpm、3〜30分間行うことが好ましい。
上記の血液試料を、腫瘍溶解性ウイルスとインキュベートする時間及び温度は、腫瘍溶解性ウイルスが血液試料中の少なくとも癌細胞内で増殖できる条件であればよく、腫瘍溶解性ウイルスの種類により適宜調節できる。そのようなインキュベートの条件は、好ましくは25〜40℃の温度で、1〜36時間、より好ましくは30〜37℃にて12〜24時間行われる。
しかし、血液試料中に存在する白血球(単球、リンパ球など)も、テロメラーゼのような癌細胞が特異的に発現する酵素を希に発現する。したがって、上記のインキュベーションにより、このような正常な(癌細胞でない)白血球においても、腫瘍溶解性ウイルスが増殖する可能性がある。
本発明の方法は、上記の増殖工程で処理された血液試料を、固定化剤及び非イオン性界面活性剤と混合する工程(以下、「混合工程」ともいう)を含む。
混合工程においては、血液試料と非イオン性界面活性剤とを混合した後に、固定化剤を混合してもよいし、血液試料と固定化剤とを混合した後に、非イオン性界面活性剤を混合してもよいし、血液試料、固定化剤及び非イオン性界面活性剤を同時に混合してもよい。より好ましい混合の順序としては、血液試料と固定化剤とを混合した後に、非イオン性界面活性剤を混合する順序である。
なお、本明細書において、「血液試料と混合したときの非イオン性界面活性剤の濃度」とは、「血液試料と非イオン性界面活性剤とを直接混合した場合の濃度」に加えて、「非イオン性界面活性剤を、血液試料及び固定化剤の混合物に混合した場合の濃度」も含むことを意図する。すなわち、混合工程において、血液試料と固定化剤とを混合した後に、非イオン性界面活性剤を混合する場合、上記の濃度は、血液試料、固定化剤及び非イオン性界面活性剤の混合液における非イオン性界面活性剤の濃度を示す。
より具体的な高級アルコールのアルキル基が分岐鎖である高級アルコール・エチレンオキシド付加物を、以下の式(I)に示す。
式(I)
なお、本明細書において、「血液試料と混合したときの固定化剤の濃度」とは、「血液試料と固定化剤とを直接混合した場合の濃度」に加えて、「固定化剤を、血液試料及び非イオン性界面活性剤の混合物に混合した場合の濃度」も含むことを意図する。すなわち、混合工程において、血液試料と非イオン性界面活性剤とを混合した後に、固定化剤を混合する場合、上記の濃度は、血液試料、固定化剤及び非イオン性界面活性剤の混合液における固定化剤の濃度を示す。
本発明の方法は、混合工程から得られた血液試料に含まれる、腫瘍溶解性ウイルスが増殖した癌細胞を検出する工程(以下、「検出工程」ともいう)を含む。
検出工程は、腫瘍溶解性ウイルスが増殖することにより発現される上記の標識タンパク質を検出する工程であることが好ましい。
本発明の方法は、さらに、死細胞の染色工程を含むことができる。このような工程を含むことにより、「生存している」癌細胞と「死んでいる」癌細胞とを検出することができ、血液試料中の癌細胞の生存率を算出することができる。この工程は、血液試料を、固定化剤及び非イオン性界面活性剤と混合する工程の前に行うことが好ましい。
死細胞を染色する工程は、死細胞を特異的に染色する試薬と血液試料とを接触させることにより行うことができる。「死細胞を特異的に染色する試薬」とは、生存細胞とは区別可能に死細胞を染色する試薬のことである。死細胞を特異的に染色する試薬としては、市販のキットを用いることができ、例えばLive/Dead Fixable Red Dead Cell Stain Kit (Invitrogen社)が好ましい。
本発明は、血液試料中の癌細胞を検出するための試薬キットも提供する。本発明の試薬キットは、上記の腫瘍溶解性ウイルスを含有する第1試薬と、上記の固定化剤を含有する第2試薬と、上記の非イオン性界面活性剤を含む第3試薬とを含む。
1. 単核球画分への腫瘍溶解性ウイルスの増殖による影響
腫瘍溶解性ウイルスを用いる血液試料中の癌細胞の検出においては、試料中の単核球内で腫瘍溶解性ウイルスが増殖すると、単核球が癌細胞として検出されてしまう。
そこで、ヒト対象から採取した血液から単核球画分を回収し、この画分に本発明の方法による処理(固定化剤及び非イオン性界面活性剤による処理)を行うことにより、単核球による検出への影響を低減できるか否かを検討した。なお、単核球とは、単球及びリンパ球の総称である。
<単核球画分の調製>
真空採血管(ベノジェクト(登録商標)II真空採血管(4.5 ml)、3.8%クエン酸ナトリウム含有、テルモ株式会社)を用いて、2人の健常女性から血液を採取した。採取から2時間以内の血液5.0 mlを、単核球を分離するための試薬であるPolymorphprep (商標)(第一化学薬品株式会社)5.0 mlを予め入れた15 mlの遠心チューブに注意深く重層した。次いで、遠心チューブを、スウィングローターを用いて、室温で500×g、30分間遠心分離した。そして、パスツールピペットを用いて単核球浮遊液を別の遠心チューブに移し、これに等量のPBS(-)を加えて混和した。この液を室温で400×g、10分間遠心分離した後、上清を除去して、沈殿した単核球を得た。そして、得られた単核球をPBS(-)で懸濁し、これを400×g、10分間遠心分離した後、上清を除去して、単核球画分を得た。
得られた単核球画分にRPMI-1640を加えて、10 mlにメスアップした。これに腫瘍溶解性ウイルス(テロメスキャン(登録商標) (OBP-401)、オンコリスバイオファーマ株式会社)を、最終濃度6×106 PFU/mlとなるように加え、37℃にてローテーションしながら24時間培養した。得られた培養液を、1500 rpmで5分間、弱ブレーキで遠心分離した後、上清を除去して、腫瘍溶解性ウイルスが増殖した細胞(以下、増殖細胞ともいう)を得た。
得られた増殖細胞に、これと同体積の4%パラホルムアルデヒド(PFA)を加え、室温にて20分間静置した。ここに、増殖細胞及びPFAの合計体積の2倍の体積の非イオン性界面活性剤(エマルゲン2025G、花王株式会社)のPBS(-)溶液(濃度0.05重量%)を加えて懸濁し、撹拌しながら40℃にて5分間インキュベートして、処理試料を得た。なお、エマルゲン2025Gの構造式を、以下の式(II)に示す。
式(II)
得られた処理試料を1500 rpmで5分間、弱ブレーキで遠心分離した後、上清を除去し、沈殿物を得た。次いで、得られた沈殿物を1 mlのPBSに懸濁した。そして、得られた懸濁液を1500 rpmで5分間、弱ブレーキで遠心分離した後、上清を除去し、サイトスピンを用いて(1000 rpm、4分)、スライドを作製した。該スライドにマウンティングメディウム(Fluorescent Mounting Medium、S3032、Dako社)を載せ、次いでカバーガラスを載せた後、倒立型リサーチ顕微鏡(Power IX 71、オリンパス株式会社製)を用いて、露光時間20 ms、50 ms、100 ms、200 ms及び400 msの条件下で、蛍光強度を測定した。
なお、上記と同様の条件下で、それぞれが異なる既知の蛍光強度を有する7種のビーズ(7 Peaks Beads(Cyto-Cal Multifluor Fluorescence Intensity Calibrator、FC3M、Thermo Scientific社))を撮像して、それぞれの露光時間における検量線を作成した。得られた検量線に基づいて、上記の処理試料からの蛍光シグナルを数値化した。得られた結果を、図1(No.4及び5)に示す。
実施例1において、非イオン性界面活性剤として、エマルゲン2025Gに代えて、ニッコールBO−20V(日本ケミカルズ販売株式会社)を用いた以外、上記と同様にして、処理試料を調製した。そして、実施例1と同様にして該処理試料からスライドを作製し、該スライドについて実施例1と同じ条件で蛍光強度を測定して、蛍光シグナルを数値化した。得られた結果を、図1(No.6)に示す。
実施例1において、非イオン性界面活性剤として、エマルゲン2025Gに代えて、エマルゲン2020G(花王株式会社)を用いた以外、上記と同様にして、処理試料を調製した。そして、実施例1と同様にして該処理試料からスライドを作製し、該スライドについて実施例1と同じ条件で蛍光強度を測定して、蛍光シグナルを数値化した。得られた結果を、図1(No.7)に示す。なお、エマルゲン2020Gの構造式を、以下の式(III)に示す。
式(III)
実施例1において、固定化剤及び非イオン性界面活性剤での処理に代えて、溶血のために従来用いられる塩化アンモニウム及び固定化剤での処理を行って、単核球による検出への影響を調べた。
上記の<単核球の調製>及び<ウイルス増殖>と同様にして得られた増殖細胞に、これの30倍の体積の1%塩化アンモニウム溶液を加えて懸濁し、室温にて20分間静置した。次いで、ここに2% PFAを加え、室温にて20分間静置して、処理試料を得た。
得られた処理試料を、1500 rpmで5分間、弱ブレーキで遠心分離した後、上清を除去し、沈殿物を得た。次いで、得られた沈殿物を1 mlのPBS(-)に懸濁した。そして、得られた懸濁液を1500 rpmで5分間、弱ブレーキで遠心分離した後、上清を除去し、サイトスピンを用いて(1000 rpm、4分)、スライドを作製した。該スライドにマウンティングメディウム(Fluorescent Mounting Medium、S3032、Dako社)を載せ、次いでカバーガラスを載せた後、実施例1の条件で蛍光強度を測定し、蛍光シグナルを数値化した。
結果を、図1に示す。図1では、陽性対照(No.1)、比較例1(No.2及び3)、実施例1(No.4及び5)、実施例2(No.6)並びに実施例3(No.7)の結果を示す。
種々の界面活性剤を用いて、実際の血液試料中での癌細胞の検出について検討した。
健常なヒトから採取した末梢血液7.5 mlに、血液抗凝固保存液(CPD液;100 mlの滅菌水中にクエン酸3Na・2H2O 2.63 g、クエン酸・2H2O 0.327 g、D(+)-グルコース2.32 g、リン酸2水素ナトリウム・2H2O 0.251 gを含有)1120 μlを加え、充分に転倒混和した。次いで、この混合液を1500 rpmで5分間、弱ブレーキで遠心分離した後、ピペットを用いて上清(血清)をできるだけ取り除いた。ここにPBS(-)を加えて14 mlにメスアップし、懸濁した。そして、上記と同様の遠心分離及び血清の除去を4回繰り返した。その後、ここに乳癌細胞株(MB468)を、3×105個/mlとなるように添加して、癌細胞含有血液試料を得た。
界面活性剤としてニッコールBL−9EX、ニッコールBO−20V、ニッコールBT−12、エマルゲン2020G、ニッサンカチオンAB600及びニッサンカチオンBBを用いた場合の写真を、それぞれ図2(B)〜(G)に示す。
実施例4と同様にして得られた癌細胞含有血液試料に、実施例1の<ウイルス増殖>と同様にしてウイルスを増殖させ、増殖細胞を得た。これと同体積の4% PFAを加えて懸濁し、室温にて20分間静置した。次いで、増殖細胞及びPFAの合計体積の2倍の体積の1%塩化アンモニウム溶液を加えて懸濁し、撹拌しながら40℃にて5分間インキュベートして、処理試料を得た。
実施例1の<スライド作製及び顕微鏡観察>と同様にして、該処理試料の顕微鏡写真を撮影した。得られた写真を、図2(H)に示す。
一方、図2(A)〜(E)から、本発明の非イオン性界面活性剤を用いた方法により処理された血液試料では、赤血球がほとんど除去され、癌細胞がより鮮明に確認できることがわかる。
Claims (20)
- 癌細胞の存在が疑われる血液試料を、腫瘍溶解性ウイルスとインキュベートすることにより、少なくとも前記癌細胞内で腫瘍溶解性ウイルスを増殖させる工程、
増殖工程で処理された血液試料と、固定化剤と、非イオン性界面活性剤とを混合する工程、及び
混合工程で得られた血液試料に含まれる、腫瘍溶解性ウイルスが増殖した癌細胞を検出する工程
を含む、血液試料中の癌細胞の検出方法。 - 混合工程が、血液試料と固定化剤とを混合した後に、非イオン性界面活性剤を混合する工程である、請求項1に記載の方法。
- 混合工程において、血液試料と混合したときの非イオン性界面活性剤の濃度が、癌細胞に損傷を与えずに、赤血球および白血球に損傷を与える濃度である、請求項1に記載の方法。
- 非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレン系の非イオン性界面活性剤である、請求項1に記載の方法。
- ポリオキシエチレン系の非イオン性界面活性剤が、高級アルコール・エチレンオキシド付加物である、請求項4に記載の方法。
- 高級アルコール・エチレンオキシド付加物の高級アルコールのアルキル基が分岐鎖である、請求項5に記載の方法。
- 混合工程において、血液試料と混合したときの固定化剤の濃度が、赤血球を溶血する濃度である、請求項1に記載の方法。
- 固定化剤が、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド又はホルムアルデヒドである、請求項1に記載の方法。
- 腫瘍溶解性ウイルスが、標識タンパク質を発現する腫瘍溶解性ウイルスである、請求項1に記載の方法。
- 腫瘍溶解性ウイルスが、テロメラーゼプロモーターが組み込まれた腫瘍溶解性ウイルスである、請求項1に記載の方法。
- 検出工程が、標識タンパク質からのシグナルを検出する工程である、請求項9に記載の方法。
- 腫瘍溶解性ウイルスを含有する第1試薬、
固定化剤を含有する第2試薬、及び
非イオン性界面活性剤を含有する第3試薬
を含む、血液試料中の癌細胞の検出用試薬キット。 - 第3試薬が、血液試料と混合したときに、癌細胞に損傷を与えずに、赤血球および白血球に損傷を与える濃度となる量で非イオン性界面活性剤を含有する、請求項12に記載のキット。
- 非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレン系の非イオン性界面活性剤である、請求項12に記載のキット。
- ポリオキシエチレン系の非イオン性界面活性剤が、高級アルコール・エチレンオキシド付加物である、請求項14に記載のキット。
- 高級アルコール・エチレンオキシド付加物の高級アルコールのアルキル基が分岐鎖である、請求項15に記載のキット。
- 第2試薬が、血液試料と混合したときに、赤血球を溶血する濃度となる量で固定化剤を含有する、請求項12に記載のキット。
- 固定化剤が、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド又はホルムアルデヒドである、請求項12に記載のキット。
- 腫瘍溶解性ウイルスが、標識タンパク質を発現する腫瘍溶解性ウイルスである、請求項12に記載のキット。
- 腫瘍溶解性ウイルスが、テロメラーゼプロモーターが組み込まれた腫瘍溶解性ウイルスである、請求項12に記載のキット。
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