JP3713716B2 - 血小板GPIIb/IIIa受容体の新規分析方法 - Google Patents

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Description

本発明は、抗血小板凝集化合物により、あるいはフィブリノーゲンにより占められた血小板GPIIb/IIIa受容体、及び遊離状態で存在する受容体を分析する方法に関する。
血小板は、恒常性バランスの平衡において重要な役割を果している。活性化シグナルは、そのレベルにおいて、形態学的及び生化学的変化の両者を、表面糖タンパク質の発現のレベルにおける変化と共に引き起こすことができる。これらの糖タンパク質は、ほとんどのリガンド受容体で、接着(例えば、フオンビルブランド(Von Willebrand)因子の受容体:GPIb分子)、凝集(例えば、フィブリノーゲンの受容体:GPIIb/IIIa分子)に関与し、一方、その他のものは血小板の活性化状態(例えば:GMP140分子又はP−セレクチン)を示す。
血小板の活性化及びそれに起因する凝集は、いき値を超えると動脈の血栓性症状のような種々の病状に関与する生理学的現象である。これは、医薬品工業界が新規な抗凝集治療用分子の開発に興味をもつ理由を説明している。
開発された新しい治療法における好ましい標的は、血小板上に特異的に発現するGpIIb/IIIa受容体である。血小板の活性化が生じると、この受容体は非常に高い親和性でフィブリノーゲン及びその他の接着タンパク質に結合し、これにより血小板が互いに凝集する。
GPIIb/IIIa受容体は、細胞接着の現象に関与する様々の分子から構成されるインテグリンからなるグループに属する。インテグリンは、α/βヘテロ二量体であり、そのβ−サブユニットにより7つのファミリーに分類される。約20個のインテグリンが現在知られており、その中の9つがアミノ酸配列R−G−Dを介してそのリガンドに結合する。
GPIIb/IIIa(αIIβ3)はβ3インデグリンファミリーの一員である。これは、特に血小板上に、そして、多量に内皮細胞上に存在するビトロネクチン受容体(αVβ3)と同じβサブユニット(しかし、αサブユニットは異なる)を有する。IIb及びIIIaサブユニットは国際命名法によれば、それぞれCD 41及びCD 61グループに分類される。
抗血小板GPIIb/IIIa抗凝集剤は次の2つの異なるクラスに属する:a)フィブリノーゲンのアンタゴニスト(拮抗薬)であるモノクローナル抗体(ReoProとして市販されている、CD 61のエピトープに対するヒト型7E3モノクローナル抗体のC7E3Fabを含む)、b)血小板受容体リガンドに共通のRGD配列(Arg-Gly-Asp)またはそれに近いKGD配列を有する、インデグレリン(integrelin)型の環状ペプチド、及びラミフィバン(lamifiban)又はチロフィバン(tirofiban)型のペプチドミメティックス(peptidomimetics)。現在開発されているこれらの物質は非経口経路による場合のみ活性である。経口経路で投与しうる別の分子は開発中である。しかし、これらの新規な分子は副作用を引起し、治療される患者において、注入部や内部の部位で出血を生じさせる結果となる。長期間循環系に残る性質をもつこれらの新しい分子に対して、現在解毒剤はない。従って、抗血小板治療においては、投与する薬剤の治療用量を適用できるだけでなく、治療の監視中、拮抗薬により占められるGPIIb/IIIa受容体の数に関する情報を直ちに利用でき、抗凝集効果を得るために十分な量の結合拮抗薬を維持しながら出血性の合併症を制御しうることが重要である。
従って、本発明は、試験試料において、フィブリノーゲンの拮抗薬によるGPIIb/IIIa受容体の占拠率を測定する方法に関し、該拮抗薬の競合剤である抗体(MAb1)を用いて占拠された受容体の数を測定し、かつ占拠又は非占拠受容体の総数を占拠または非占拠受容体に特異的ないわゆる非競合抗体(MAb2)を用いて測定し、それにより試料中のGPIIb/IIIa受容体の占拠率を推定することを特徴とする。
占拠率(occupation)とは、血液試料中における、受容体総数と比べた、抗凝集剤に占拠されたフィブリノーゲンに対する血小板受容体GPIIb/IIIaの、絶対値での定量と、割合の両方を意味し、割合については経時的にその変動を調べる。
また、治療の監視においてはこの測定をくり返す必要がなく投薬の前に受容体の総数を測定することができる。
また、受容体の数を測定すると具体的に述べた場合、これは単に半定量的測定であってもよい。
もちろん、受容体の数を正確に測定することが望ましい場合は、検量線を伴う検量系を供給することが必要である。
本発明に関して用いられる抗GPIIb/IIIa抗体は好ましくはGPIIIa(CD 61)サブユニットのエピトープに対する。
これらは、より詳しくは、Immunotech社から市販されている抗体SZ 21及びP2;及びCymbus社から市販されている抗体PM 6/13である。
これは、1997年6月5日にLMBP 1662CBの番号でBelgian Coordinated Collection of Microorganisms(BCCM)に寄託されたモノクローナル抗体P18(この寄託は条文により当業者が利用しうるだけである)であってもよい。
抗体PM 6/13はCymbus Bioservices社(英国)から市販されており、Immunotech社(フランス)から市販されているIgG1 SZ 21型の抗CD 61、及びIgG1型の抗CD 61である。同社から市販されているP2については、これは抗CD 41 IgG1である。
使用する抗体の対は、主として、用いる抗凝集剤の型による。実際、ReoPro及びRGD型のペプチドはGPIIIaの異なる部位に結合する抗凝集剤である。
ReoProはフィブリノーゲンに対する部位に近似した部位を有し、立体障害によりその結合を阻害する。一方、RGDペプチドはフィブリノーゲンと同じ部位を有し、RGD配列に対して直接結合する。
このため、ReoProにより占められる受容体の測定に最も適した製品はImmunotech社の競合抗体P2及び、Cymbus社の非競合抗体PM 6/13からなる対であり、一方、RGDペプチドの場合には、競合抗体はCymbus社の抗体PM 6/13であり、非競合抗体はImmunotech社の抗体SZ 21である。実際、抗体PM 6/13は、抗凝集剤がReoProである場合は非競合抗体であるが、抗凝集剤がPGDペプチドである場合は競合抗体となる。
前述のモノクロナール抗体を用いる測定は、好ましくは定量的サイトメトリ(cytometry)によるものであるが、特にElisaにより示唆されるの他の方法又は別の種類の方法を考えてもよい。
好ましくは測定を、特に、定量的方法と組み合わせてもよい間接的免疫蛍光法を用いて蛍光色素(fluorochrome)で標識した抗体の助けにより特異的抗体を出現させることにより行う。
いわゆるサイトメトリ、または間接定量的免疫蛍光法(いわゆるIQIF法)は既知であり、詳細については再度記述しない(P.Poncelet et al.,1985,J.Imunol.Methods 85,65-74)。
用いる試料は好ましくは生物学的試料であり、殊に血液試料、クエン酸ナトリウム又はサイトレート・テオフィリン・アデノシン・ジピリダゾール(citrate theophilline adenosine dipyrridanol)(CTAD)(血小板機能の阻害剤)で集めた全血の試料であるか、あるいは血小板に富んだ画分、血小板に富んだ血漿(PRP)もしくは結合血小板等である。
特異的抗体の対について上に述べたが、その他の抗体を用いることも可能であり、特に、「白血球タイピングV、白血球識別抗原;米国ボストンで1993年11月3−7月に開催された第5回国際研究集会及び会議の会報、Vol.2、オックスフォード大学出版、1995」において挙げられた一覧から選択してもよい。というのは、抗GPIIb/IIIa競合抗体については、GPIIb/IIIa複合体のエピトープに対する抗体であり、GPIIb/IIIaへの結合率が飽和濃度で用いる抗血小板凝集剤の存在下で少なくとも50%、好ましくは75%減少するが、その結合が血小板に対する抗凝集剤の結合を阻害すべきでない抗体が選択されるからである。
非競合抗GPIIb/IIIa抗体については、結合率が抗血小板凝集剤の存在下及び不在下で15%以上は変化しないGPIIb/IIIaの対のエピトープに対する抗体であろう。
本発明はまた、上述の方法を行うための分析キットに関し、このキットは以下のものを含むことを特徴とする:
−フィブリノーゲン拮抗薬に対する競合剤であるGPIIb/IIIa受容体のモノクローナル抗体の少なくとも1種
−占拠されたまたはされないGPIIb/IIIa受容体に対して特異的なモノクローナル抗体の少なくとも1種。
GPIIb/IIIa受容体などの表面抗原の定量法の原理をここに簡単に述べる。
定量すべき細胞性抗原部位を、間接免疫蛍光において、調査すべき抗原に特異的なmAb、好ましくはIgG型で、特にマウス起源のものの結合により標識し、これは蛍光色素と結合した抗−マウスIgGポリクローナルによって現れる。フローサイトメトリにおいて得られる蛍光の強度は不定の単位であるが、これは抗原の発現の細胞性レベルに密接に関連している。サイトメトリのデータの標準化は、各免疫標識中の、試料試験管と平行して処理された検量用物質の導入により行われる。この検量用物質は、増加および限定範囲量のIgG型mAbで被覆したラテックスビーズからなる。この検量用物質の分析により細胞当たりの抗原の絶対数に蛍光強度を関係づける検量系の調製が可能となる。
以下の実施例は本発明の特徴及び利点を実証することを可能にする。
示された試験は、クエン酸ナトリウム(又はCTAD)で集めた全血の試料において行う。CYTOQUANT Gpモデルにおいて、標識は全血において直接行われ、洗浄工程は必要ない。この試験では、1試料につき3つのパラメーターが調べられた(3個の試験管):血液を陰性対照mAb(非特異的標識)、mAb Mab1及びmAB MAb2と接触させて置く。検量系を蛍光を発するAbの存在下で、第2の標識工程中、1つの試験管に加える。次いで、免疫標識による蛍光強度をサイトメーターで読む。この蛍光強度は血小板に結合した特異的mAbの数に比例する。検量線の作成後に、蛍光強度を血小板当たりの結合mABの絶対値(数)に変換する。
結果を以下のようにして表わす:
−血小板当たりのGPIIb/IIIa分子の総数(MAb2値)
−抗凝集分子により占められたGPIIb/IIIa分子の数(MAb2−MAb1差)
このように、同時に2つのパラメーターを調べればよい。
実施例1
フィーシビリティ(feasibility)位相の間、GPIIb/IIIaに特異的な各種mAbをReoProの存在下及び不在下で血小板上において試験した。
基底状態及びADPでの活性化後の血小板におけるReoProの飽和濃度の測定
プロトコール1
特異的mAbを種々の希釈のReoProで置換することにする間接免疫蛍光試験
1−材料
−ReoPro 2mg/ml、0.1%PBS BSA中で50μg/ml→0.75μg/ml希釈
−ADP Stago 0.2μM
−DDAF
2−方法
−混合 vol/vol PRP/ReoProの希釈物(混合物1)
PRP/PBS緩衝液(混合物2)
室温で15分間インキュベーション
−混合 vol/vol 混合物1/PBS
混合物1/ADP 0.2μM
混合物2/PBS
混合物2/ADP 0.2μM
室温で5分間インキュベーション
−各混合物に4mlのPBS BAを添加
3000rpmで10分間遠心分離
上清の除去
−ペレット+100μl DDAF(ヒツジ抗マウスFITC試薬)
室温で15分間インキュベーション
Figure 0003713716
注意、ReoPro希釈物と同数の混合物1試験管がある。
ReoProは、一定のヒトIgG部分と結合した免疫反応性マウスFv部分を有するキメラF(ab)型Abである。第2の試薬、FITC結合抗マウスIgビツジポリクローナルは、弱いが分析可能なシグナルを得るのに十分な程度にReoPro分子に結合する。飽和濃度は1μg/mlからである。
ADPによる血小板活性化ReoProの結合を変化させない。
試験の結果を図1に示す。
ReoProの結合に対して一方では相補的であり、他方では競合剤であるmAbの同定
プロトコール2
1−材料
−ReoPro 2mg/ml、0.1%PBS BSA中で10μg/mlに希釈
−10μg/mlのMAb CD 41及びCD 61(抗GPIIb/IIIa及び抗GPIIIa)
−DDAF(ヒツジ抗マウスIg−FITC)
2−方法
−混合 vol/vol PRP/ReoPro 10μg/ml
PRP/PBS BSA 0.1%
室温で5分間インキュベーション
−2つの混合物の洗浄(+4ml PBS BSA 0.1%、3000rpmで10分間遠心分離、上清の除去)
ペレット+PBS BSA(vol=PRPの最初の容量)
−各混合物20μl+試験すべき各MAb20μl
室温で10分間インキュベーション
−+100μl DDAF 1/100
室温で10分間インキュベーション
Figure 0003713716
GPIIb/IIIa(CD 41及びCD 61)に対して驚異的な9種のmAbを試験した(表1参照)。
【表1】
Figure 0003713716
試験は薬剤の不在下(100%)、及びフィブリノーゲンの結合を阻害する抗凝集剤の飽和濃度の存在下で全血において行った。
ReoPro(10μg/ml、最終)又はPBSの存在下で予備インキュベーションした血小板で得られた定量値を比較した。ReoProの存在下及び不在下でその出現が10%を以上は変動しないmAb PM 6/13、及び飽和濃度で用いたReoProの存在下でその出現が95%以上減少するmAb P18を選択した。
表1は全血で試験した同じ抗体で得られた結果を示す。
PM16/13−P18の対を用いる利点は、抗凝集剤の不在下で、2つのmAbに対して匹敵しうる反応が血小板でみられることにある。
ReoProの予備インキュベーション濃度を変動させると、プロトコール3による用量/応答実験において、図2に示されるように、P18の結合は抗凝集剤の結合に反比例する。
結論
特異性:Mab1クローンP18(CD 61、抗GPIIIa)
Mab2クローンPM 6/13(CD 61、抗GPIIIa)
供給源:クローンP18(mAb IgG2a) INSERM
クローンPM6/13(Mab IgG1) Cymbus
ヒツジ(Fab)'2抗マウス全Ig−FITC試薬、DDAF、が最も適当なポリクローナル試薬である。
図3は精製mAb CD 61 P18及びPM 6/13についての血小板における飽和の検討である。
プロトコール3
1−材料
−ReoPro 2mg/ml、PBS BSA 0.1%中の200μg/mlから0.09μg/mlまでの3倍希釈物
−mAb P18:Ascite 1/800
−mAb PM 6/13:10μg/ml
−DDAF
−PRP
2−方法
−PRP中のReoProの各調製物の1/10希釈
室温で5分間インキュベーション
−洗浄(PBS BSA 0.1%中、3000rpm 10分間)
−ペレット+PBS BSA 0.1%(PRPの最初の容量と同容量)
−20μl血小板調製物+20μl mAb P18、PM 6/13及びIgG、陰性対照
室温で10分間インキュベーション
−各免疫標識及びCYTOQUANT GP型の検量系40μlで+100μl D DAF 1/100
室温で10分間インキュベーション
Figure 0003713716
実施例2
同様の測定を以下を用いて行った:
Mab2としてPM 6/13、及び
Mab1としてP18、
抗凝集剤として各種濃度のReoProを有する全血でのインビトロモデルにおいて。
結果を図4にまとめた。
実施例3
同様の分析を以下を用いて行った:
Mab2としてP18、
Mab1としてPM 6/13、
抗凝集剤として各種濃度のRGDペプチドを用いるインビトロモデルにおいて。
結果を図5にまとめた。
実施例2及び3においては、使用した薬剤(ReoProもしくはRGDペプチド)は、1〜50μg/mlの希釈系を得るためにリン酸緩衝液中で希釈する。5μlを全血45μlと混合する(1/10希釈)。インキュベーションは室温で30'間行い、緩衝液150μlを加える。
希釈した全血20μlずつに、10または20μg/mlで試験されるmAb 20μlを加える。
インキュベーション及びFITC結合抗マウスIgAbの添加の後に、サイトメトリ分析を行う。
血小板に結合されたmAb分子の数をIQIF法に従い、ラテックスビーズを用いてプロットされた検量線を用いて算出する。
実施例4
ReoProで治療した患者でインビボ試験を行った。
この場合はReoProを添加しない。全血を集める(生理的緩衝液中1/4希釈した20μl)。
10μg/mlのmAb(P18又はPM 6/13)20μlを加える。インキュベーションを室温(RT)で10分間行う。次いで試薬20μlを加え、インキュベーション(10分間、室温)および適宜希釈後にサイトメーターを読む。
図6は受容体の総数に対する注射後の遊離受容体の数を示す。48時間後、遊離受容体の数は依然50%より少ない。
用いるmAbは全受容体の測定についてはPM 6/13、遊離受容体の測定についてはP18である。

Claims (12)

  1. 試験試料において、フィブリノーゲンの拮抗薬による細胞性GPIIb/IIIa受容体の占拠率を測定する方法であり、該拮抗薬の競合剤である抗体MAb1を用いて試料中の占拠された受容体の数を測定し、かつ占拠又は非占拠受容体の総数を占拠または非占拠受容体に特異的ないわゆる非競合抗体MAb2を用いて測定し、それにより試料中のGPIIb/IIIa受容体の占拠率を推定することを特徴とする、前記方法。
  2. 受容体の数を検量線と比較して測定することを特徴とする請求の範囲第1項記載の方法。
  3. 抗体がGPIIIaに対するものであることを特徴とする請求の範囲第1項または第2項記載の方法。
  4. 標識抗体を用いて抗体を標識することにより測定することを特徴とする請求の範囲第1項〜第3項のいずれかの項記載の方法。
  5. 抗体を蛍光色素で標識することを特徴とする請求の範囲第4項記載の方法。
  6. 測定を定量的サイトメトリにより行うことを特徴とする請求の範囲第1項〜第5項のいずれかの項記載の方法。
  7. 測定を間接定量的免疫蛍光法により行うことを特徴とする請求の範囲第1項〜第6項のいずれかの項記載の方法。
  8. 拮抗薬:RGDペプチドの測定のために、Mab1にモノクローナル抗体PM 6/13を、Mab2にモノクローナル抗体SZ 21を用いることを特徴とする請求の範囲第1項〜第7項のいずれかの項記載の方法。
  9. 抗凝集剤:抗体7E3又はその断片の測定のために、Mab1にモノクローナル抗体P2を、Mab2にモノクローナル抗体PM 6/13を用いることを特徴とする請求の範囲第1項〜第7項のいずれかの項記載の方法。
  10. 試験すべき試料が血液試料であることを特徴とする請求の範囲第1項〜第9項のいずれかの項記載の方法。
  11. 試験すべき試料が血小板に富んだ試料であることを特徴とする請求の範囲第10項記載の方法。
  12. 請求の範囲第1項〜第11項のいずれかの項記載の方法を実施するための分析用キットであり、
    −フィブリノーゲン拮抗薬の競合剤であるGPIIb/IIIa受容体に対するモノクローナル抗体の少なくとも1種、及び
    −占拠または非占拠GPIIb/IIIa受容体に特異的なモノクローナル抗体の少なくとも1種を含むことを特徴とするキット。
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