JP7285957B2 - ｉＲｈｏｍ２のタンパク質バインダー - Google Patents

Description

本願は、ｉＲｈｏｍ２のためのタンパク質バインダーに関する。

ＡＤＡＭメタロペプチダーゼドメイン１７（ＡＤＡＭ１７）（ヒトＡＤＡＭ１７のＮＣＢＩ参照：ＮＰ＿００３１７４）は、ＴＡＣＥ（腫瘍壊死因子‐α変換酵素）とも呼ばれ、ジスインテグリンおよびメタロプロテアーゼのＡＤＡＭタンパク質ファミリーに属する７０ｋＤａの酵素である。８２４アミノ酸のポリペプチドである。

ＡＤＡＭ１７は、細胞表面の腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ‐α）のプロセシング、およびトランスゴルジ網の細胞内膜内からのプロセシングに関与すると理解されている。このプロセスは「シェディング（ｓｈｅｄｄｉｎｇ）」としても知られており、膜結合型したプロタンパク質（プロＴＮＦ－αなど）からの可溶性エクトドメインの切断と放出が関与しており、生理学的に重要であることが知られている。ＡＤＡＭ１７は、同定された最初の「シェダーゼ」であり、また、多様な膜アンカー型サイトカイン、細胞接着分子、受容体、リガンド、および酵素の放出において役割を果たすと理解されている。

ＴＮＦ－α遺伝子のクローニングにより、小胞体内での移行時に細胞膜に挿入されるようになる２６ｋＤａのＩＩ型膜貫通プロポリペプチドをコードすることが明らかになった。細胞表面では、プロＴＮＦ－αは生物学的に活性であり、接触分泌細胞間シグナル伝達を介して免疫応答を誘導することができる。しかし、プロＴＮＦ－αはそのＡｌａ７６－Ｖａｌ７７アミド結合でタンパク質分解的切断を受けることができ、これによりプロＴＮＦ－α分子から可溶性の１７ｋＤａの細胞外ドメイン（エクトドメイン）が放出される。この可溶性エクトドメインは一般にＴＮＦ－αとして知られるサイトカインであり、この分子のパラ分泌シグナル伝達において極めて重要である。この可溶性ＴＮＦ－αのタンパク質分解による遊離はＡＤＡＭ１７によって触媒される。

ＡＤＡＭ１７はまた、乳腺におけるＥＧＦＲリガンドアンフィレグリンの切断を調節することによって、ＭＡＰキナーゼシグナル伝達経路を調節する。さらに、ＡＤＡＭ１７は、細胞接着分子であるＬ－セレクチンのシェディングに関与している。

最近、ＡＤＡＭ１７が放射線療法に対する抵抗性形成の決定的メディエーターとして発見された。放射線療法は、ＡＤＡＭ１７プロフォームの活性ＡＤＡＭ１７へのフーリン媒介切断の用量依存的増大を誘導することができ、これは、ＡＤＡＭ１７活性のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ増強をもたらす。また、非小細胞肺がんでは放射線療法によりＡＤＡＭ１７が活性化され、複数の生存因子のシェディング、増殖因子経路活性化、放射線療法による治療抵抗性が生じることが示された。

ＡＤＡＭ１７は、ＴＮＦαを含む異なる病原性および非病原性因子の放出にとって極めて重要な因子であると思われることから、治療標的分子として注目されるようになった。そのため、ＡＤＡＭ１７の阻害剤の開発には様々な試みがなされている。

しかし、これまでのところ、臨床的に成功していることが証明されたこのような阻害剤はない。

従って、ＡＤＡＭ１７活性の制御、調節、減少または阻害を可能にする新たな手法を提供することが本発明の１つの目的である。

炎症性疾患の治療を可能にする新たな手法を提供することは、本発明の別の目的である。

これらおよび他の目的は、独立したクレームの特徴によって解決される。従属クレームは、特定の状況において好ましいことがある本発明の実施形態を開示する。同様に、明細書は、特定の状況において好ましいことがある本発明のさらなる実施形態を開示する。

本発明は、とりわけ、ヒトｉＲｈｏｍ２に結合するタンパク質バインダーであって、ヒトｉＲｈｏｍ２に結合するとＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７活性を阻害および／または減少させるタンパク質バインダーを提供する。

図１は、免疫化およびペプチド結合ＥＬＩＳＡ分析のために本明細書で使用されるペプチドの配列を示す。これらのペプチドは、ｉＲｈｏｍ２またはｉＲｈｏｍ１配列全体のサブ配列である。免疫原性を高めるために、いくつかのペプチドがシステインのＳＨ基を介してＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）と結合されている。ペプチド結合分析のために、これらのペプチドは代わりにビオチンに結合されている。そのために、それぞれのペプチドのＮ末端かＣ末端のどちらかに自然に生じたシステインを用いたか、あるいはＮ末端かＣ末端のどちらかにシステインを付加した（図１では「－Ｃ－」と表示）。ＫＬＨおよび／またはビオチンの鎖内ジスルフィド結合の非特異的形成または鎖内結合を避けるために、鎖内システインをアミノ酪酸に置き換えた（図１では「Ａｂｕ」と表示）。

図２は、ハイブリドーマ上清の機能性スクリーニングのためのＴＮＦα放出アッセイ（シェディングアッセイ）の結果を示し、ハイブリドーマクローン４Ｈ８の上清がＴＨＰ－１細胞におけるＬＰＳ誘導性ＴＮＦαのシェディングを効果的に妨害することを実証する。

図３は、本発明の抗体４Ｈ８－Ｅ３がマウスＩｇＭイソタイプであることを示す抗体イソタイプ決定のためのＥＬＩＳＡ分析の結果を示す。

図４は、第１の「膜貫通ドメイン」（ＴＭＤ１）に近接するヒトｉＲｈｏｍ２の大きな細胞外ループ１の部分（「膜近傍ドメイン」、ＪＭＤ）内のエピトープを認識する本発明の抗体４Ｈ８－Ｅ３を明らかにしたペプチド結合ＥＬＩＳＡ分析の成績を示す。

本発明の抗体４Ｈ８－Ｅ３は、ＴＭＤ１に隣接するヒトｉＲｈｏｍ２の大きな細胞外ループ１のＪＭＤ部分（「膜近傍ドメイン」）であるヒトｉＲｈｏｍ２のアミノ酸４３１から４５９に相当するペプチド３を認識する。

図５は、本発明の抗体４Ｈ８－Ｅ３が、ヒトｉＲｈｏｍ２のＴＭＤ１に隣接する細胞外膜近傍領域内のエピトープを認識するが、ヒトｉＲｈｏｍ１の相同領域内では認識しないことを明らかにしたペプチド結合ＥＬＩＳＡ分析の結果を示す。本発明の抗体４Ｈ８－Ｅ３はペプチド３を認識するが、ペプチド３ｂは認識せず、これはヒトｉＲｈｏｍ１のそれぞれの相同部分に相当する。

図６は、本発明の抗体４Ｈ８－Ｅ３がＴＨＰ－１細胞におけるＴＮＦαのＬＰＳ誘導性シェディングを阻害することを実証するＴＮＦα放出アッセイの結果を示す。

図７は、ＴＨＰ－１細胞における本発明の抗体４Ｈ８－Ｅ３によるＬＰＳ誘導性ＴＮＦαシェディングの濃度依存的阻害を実証するＴＮＦα放出アッセイの結果を示す。

図８は、ＴＭＤ１（Ａ）、ループ１（Ｂ）およびＣ末端（Ｃ）に隣り合った膜近傍ドメインの位置を図示したｉＲｈｏｍ２の模式図である。

図９は、配列番号１６に記載のヒトｉＲｈｏｍ２のアミノ酸配列を、本発明で使用される免疫化ペプチドに対応する配列とともに示す。

図１０は、配列番号１６に記載のヒトｉＲｈｏｍ２および配列番号１７に記載のヒトｉＲｈｏｍ１のアラインメントを示す。灰色の領域は、本発明で使用される免疫化ペプチド３に相当する配列を示す。

(詳細な説明)
本発明の一態様によれば、ヒトｉＲｈｏｍ２に結合するタンパク質バインダーであって、ヒトｉＲｈｏｍ２に結合するとＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７活性を阻害および／または減少させるタンパク質バインダーが提供される。

ロンボイドファミリーメンバー２（ｉＲｈｏｍ２）は、ヒトではＲＨＢＤＦ２遺伝子によりコードされるタンパク質である。約８５０個のアミノ酸からなる膜貫通タンパク質で、７個の膜貫通ドメインをもつ。本発明の発明者らは、ｉＲｈｏｍ２が、ＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７活性を阻害するためのタンパク質バインダーの標的として働くことを初めて実証した。

ｉＲｈｏｍ２には異なるアイソフォームがある。ここでなされた実験は、ＮＣＢＩ参照ＮＰ＿０７８８７５．４として定義されるアイソフォームを用いて確立されている。しかしながら、限定されるわけではないが、以下の表に示すように、教示は、ｉＲｈｏｍ２の他のアイソフォームに伝達可能である：

本明細書中で使用される、用語「ＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７活性を阻害および／または減少させる」は、例えば、それぞれのシェディングアッセイにおいて測定されるようなＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７の活性を阻止または減少させるタンパク質バインダーによって引き起こされる作用を記述することを意味する（例えば、図２および実施例５参照）。

１以上の実施形態によると、タンパク質バインダーは、モノクローナル抗体、または標的結合能を保持するその標的結合断片もしくは誘導体、または抗体ミメティックである。

本明細書中で用いる「モノクローナル抗体（ｍＡｂ）」という用語は、均一な抗体集団、すなわち、全免疫グロブリンまたは標的結合能を保持するその断片もしくは誘導体からなる均質な集団を有する抗体組成物を指す。特に好ましい、そのような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡおよび／またはＩｇＭ、または標的結合能を保持するその断片もしくは誘導体からなる群より選択される。

本明細書中で使用される場合、用語「断片」は、標的結合能を保持するそのような抗体の断片を指す。例えば、
● ＣＤＲ（相補性決定領域）
● 超可変領域、
● 可変ドメイン（Ｆｖ）
● ＩｇＧまたはＩｇＭ重鎖（ＶＨ、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域からなる）
● ＩｇＧまたはＩｇＭ軽鎖（ＶＬおよびＣＬ領域からなる）、および／または
● Ｆａｂおよび／またはＦ（ａｂ）_２である。

本明細書中で使用される用語「誘導体」は、構造的には異なるが、依然としていくつかの構造的関連性を有するタンパク質構築物、例えばｓｃＦｖ、Ｆａｂおよび／またはＦ（ａｂ）_２、ならびに二重、三重またはより高い特異性抗体構築物、およびさらに標的結合能を保持する共通抗体概念を指す。これらの項目はすべて以下に説明する。

当業者に知られている他の抗体誘導体は、ダイアボディ、ラクダ抗体、ナノボディ、ドメイン抗体、ｓｃＦｖｓからなる２つの鎖を有する二価ホモ二量体、ＩｇＡｓ（Ｊ鎖と分泌成分によって連結された２つのＩｇＧ構造）、サメ抗体、新世界霊長類フレームワークと非新世界霊長類ＣＤＲからなる抗体、ＣＨ３＋ＶＬ＋ＶＨを含む二量体化構築物、および抗体コンジュゲート（例えば、毒素、サイトカイン、放射性同位体または標識に連結された抗体または断片または誘導体）である。これらのタイプは文献によく記載されており、さらなる発明活動を加えることなく、本開示に基づいて当業者が使用することができる。

ハイブリドーマ細胞の製造方法は、ケーラー＆ミルシュタイン（１９７５）に開示されている。

キメラｍＡｂ又はヒト化ｍＡｂの製造及び／又は選択のための方法は、当技術分野で公知である。例えば、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社によるＵＳ６３３１４１５はキメラ抗体の産生を記載し、一方、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＣｏｕｎｃｉｌによるＵＳ６５４８６４０はＣＤＲ移植技術を記載し、Ｃｅｌｌｔｅｃｈ社によるＵＳ５８５９２０５はヒト化抗体の産生を記載している。

完全ヒトｍＡｂの製造および／または選択のための方法は、当技術分野で公知である。これらは、それぞれのタンパク質またはペプチドで免疫化されたトランスジェニック動物の使用、または、酵母ディスプレイ、ファージディスプレイ、Ｂ細胞ディスプレイまたはリボソームディスプレイのような適切なディスプレイ技術の使用を含み、ここで、ライブラリーからの抗体が定常期においてヒトｉＲｈｏｍ２に対してスクリーニングされる。

Ｉｎ ｖｉｔｒｏ抗体ライブラリーは、とりわけ、ＭｏｒｐｈｏＳｙｓによりＵＳ６３０００６４およびＭＲＣ／Ｓｃｒｉｐｐｓ／ＳｔｒａｔａｇｅｎｅによりＵＳ６２４８５１６で開示される。ファージディスプレイ技術は、例えば、ＤｙａｘによりＵＳ５２２３４０９に開示されている。トランスジェニック型の哺乳動物プラットフォームは、例えばＴａｃｏｎｉｃＡｒｔｅｍｉｓ社によるＥＰ１４８０５１５Ａ２に説明されている。

ＩｇＧ、ＩｇＭ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂおよび／またはＦ（ａｂ）_２は、当業者によく知られた抗体フォーマットである。関連する有効化技術は、それぞれの教科書から入手することができる。

本明細書中で使用される場合、用語「Ｆａｂ」は、抗原結合領域を含むＩｇＧ／ＩｇＭ断片に関するものであり、前記断片は、抗体の各々の重鎖および軽鎖からの１つの定常および１つの可変ドメインから構成される

本明細書中で使用される、用語「Ｆ（ａｂ）_２」は、ジスルフィド結合によって互いに結合した２つのＦａｂ断片からなるＩｇＧ／ＩｇＭ断片に関する。

本明細書中で使用される、用語「ｓｃＦｖ」は、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変領域の融合物である単鎖可変領域断片であり、短いリンカー、通常セリン（Ｓ）またはグリシン（Ｇ）により結合される。このキメラ分子は、定常領域を除去し、リンカーペプチドを導入するにもかかわらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持している。

改変された抗体フォーマットは、例えば、二重または三重特異性抗体構築物、抗体ベースの融合タンパク質、免疫コンジュゲートなどである。これらのタイプは文献によく記載されており、本開示に基づいて当業者が使用することができ、さらに発明の活性を加える。

本明細書中で使用される、用語「抗体ミメティック」は、抗体と同様に、標的タンパク質に特異的に結合するが、抗体とは構造的に関係しない、有機分子、最もしばしばタンパク質に関する。抗体ミメティックは通常、約３～２０ｋＤａのモル質量を有する人工ペプチドまたはタンパク質である。定義は、とりわけ、アフィボディ分子、アフィリン、アフィマ、アフィチン、アルファボディ、アンチカリン、アビマー、ＤＡＲＰｉｎｓ、フィノマー、クニッツドメインペプチド、モノボディ、およびナノＣＬＡＭＰを包含する。

１以上の実施形態において、タンパク質バインダーは、単離された抗体、または標的結合能を保持するその標的結合断片もしくは誘導体、または単離された抗体ミメティックである。

１つ以上の実施形態において、抗体は、改変されたもしくは組換え抗体、または標的結合能を保持するその標的結合断片もしくは誘導体、または改変されたもしくは組換え抗体ミメティックである。

本発明の１以上の実施形態によると、ＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７活性の阻害または減少は、ｉＲｈｏｍ２媒介ＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７活性化の干渉によって引き起こされる。

本発明の１以上の実施形態によると、抗体はＴＮＦαシェディングを阻害するか、または減少させる。

本明細書中で使用される「ＴＮＦαシェディング」とは、膜アンカー型腫瘍壊死因子α（ｍＴＮＦα／プロＴＮＦα）が環境中に放出されて可溶性ＴＮＦα（ｓＴＮＦαまたは単にＴＮＦα）になるプロセスを意味する。このプロセスは、特にＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７によって誘発される。

本発明の１以上の実施形態によると、タンパク質バインダーが結合するヒトｉＲｈｏｍ２は、以下を含む。
ａ） 配列番号１６に示すアミノ酸配列、または
ｂ） 配列番号１６と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、但しｉＲｈｏｍ２活性を維持するアミノ酸配列。

いくつかの実施形態において、ヒトｉＲｈｏｍ２は、配列番号１６と≧８１％、好ましくは≧８２％、より好ましくは≧８３％、≧８４％、≧８５％、≧８６％、≧８７％、≧８８％、≧８９％、≧９０％、≧９１％、≧９２％、≧９３％、≧９４％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８または最も好ましくは≧９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

配列番号１６は、ＮＣＢＩ参照ＮＰ＿０７８８７５．４のもとでアクセス可能な不活性ロンボイドタンパク質２（ｉＲｈｏｍ２）アイソフォーム１［Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ］のアミノ酸配列を表す。一般に、ｉＲｈｏｍ２には異なったバリアントとアイソフォームが存在する。同様に、完全なまたは少なくとも実質的なｉＲｈｏｍ２活性を維持する、保存的またはサイレントアミノ酸置換を含む変異体が存在するか、または存在し得る。これらのアイソフォーム、バリアントおよび変異体は、上記に規定された同一性範囲に包含されるが、機能不全の非活性バリアントおよび変異体は除外される。

これに関連して、「保存的アミノ酸置換」は、非保存的置換よりも抗体機能に対する効果が小さい。アミノ酸の分類にはいろいろな方法があるが、それらの構造とＲ基の全般的な化学的性質に基づいて、しばしば６つの主要な群に分類される。

いくつかの実施形態において、「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されたものである。例えば、類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが当技術分野で定義されている。これらのファミリーには以下の側鎖を有するアミノ酸が含まれる。
● 塩基性側鎖（例：リジン、アルギニン、ヒスチジン）、
● 酸性側鎖（アスパラギン酸、グルタミン酸など）、
● 非荷電極性側鎖（グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システインなど）、
● 非極性側鎖（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンなど）、
● β分岐側鎖（スレオニン、バリン、イソロイシンなど）
● 芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）

他の保存されたアミノ酸置換は、ペプチドの電荷を修飾するためにアスパラギンをアスパラギン酸に置換する場合のように、アミノ酸側鎖ファミリーを横切って起こることもできる。保存的変化には、さらに、化学的に相同な非天然アミノ酸（すなわち、ロイシンの代わりに合成非天然疎水性アミノ酸、トリプトファンの代わりに合成非天然芳香族アミノ酸）の置換を含むことができる。

「配列同一性のパーセンテージ」は、比較窓上で２つの最適に並べられた配列を比較することによって決定され、ここで、比較窓におけるポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適なアラインメントのために、付加または欠失を含まない参照配列（例えば、ポリペプチド）と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。パーセンテージは、両配列において同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が生じる位置の数を決定して一致位置の数を得、一致位置の数を比較窓における位置の総数で除し、結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。

「同一」または「同一性」という用語は、２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈において、同一の配列である２つ以上の配列または部分配列を意味する。以下の配列比較アルゴリズムの１つを使用して測定されるかまたは手動アラインメントおよび目視検査によって、比較窓または指定の領域にわたって、最大の一致のために比較およびアラインメントされる場合、２つの配列が、同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドの特定の割合（すなわち、特定の領域にわたって、または特定されていない場合には、参照配列の全配列にわたって、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性）を有するならば、２つの配列は「実質的に同一」である。

開示は、本明細書に例示される、それぞれポリペプチドまたはポリヌクレオチドと実質的に同一であるポリペプチドまたはポリヌクレオチドを提供する。任意に、同一性は、長さが少なくとも約１５、２５または５０ヌクレオチドである領域にわたって、またはより好ましくは長さが１００～５００または１０００またはそれ以上のヌクレオチドである領域にわたって、または参照配列の完全長にわたって存在する。

アミノ酸配列に関して、同一性または実質的同一性は、長さが少なくとも５、１０、１５または２０アミノ酸、場合によっては長さが少なくとも約２５、３０、３５、４０、５０、７５または１００アミノ酸、場合によっては長さが少なくとも約１５０、２００または２５０アミノ酸、または参照配列の全長にわたる領域にわたって存在することができる。より短いアミノ酸配列、例えば２０アミノ酸以下のアミノ酸配列に関しては、本明細書で定義される保存的置換に従って、１または２個のアミノ酸残基が保存的に置換された場合、実質的な同一性が存在する。

本発明の１以上の実施形態によると、タンパク質バインダーは、ヒトｉＲｈｏｍ２の膜貫通ドメイン１（ＴＭＤ１）に隣接する細胞外膜近傍ドメインに結合する。

膜貫通ドメイン１（ＴＭＤ１）に隣り合った膜近傍ドメインは、第１膜貫通ドメイン（ＴＭＤ１）のＣ末端側のアミノ酸の一連の領域を包含する領域である。説明図は図８と図９を参照。

一実施形態において、膜貫通ドメイン１（ＴＭＤ１）に隣り合う膜近傍ドメインは、配列番号１６に記載のアミノ酸配列、または配列番号１６と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸４３１～４５９を含む。

別の実施形態では、膜貫通ドメイン１（ＴＭＤ１）に隣り合う膜近傍ドメインは、配列番号１６に記載のアミノ酸配列、または配列番号１６と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸４３１～４４７を含む。

本発明の一実施形態によれば、タンパク質バインダーは、含むヒトｉＲｈｏｍ２のアミノ酸配列に結合する
ａ） 少なくとも配列番号３に示したアミノ酸配列
ｂ） 配列番号３と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列。

いくつかの実施形態において、配列番号３と≧９１％、好ましくは≧９２％、より好ましくは≧９３％、≧９４％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８または最も好ましくは≧９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列。

一実施形態では、抗体は上記のようにアミノ酸配列全体に結合する。別の実施形態では、抗体はまた、配列番号３の外側、または配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列の外側のヒトｉＲｈｏｍ２のさらなるアミノ酸配列に結合する。

さらにアミノ酸がどこにあるかによって、抗体が結合するエピトープは線状か立体配置である。

本発明の一以上の実施形態によれば、タンパク質バインダーは、配列番号３に記載のアミノ酸配列内の１つ以上のアミノ酸をそれぞれ含むヒトｉＲｈｏｍ２の１つ以上のアミノ酸配列に結合する。

一実施形態において、該抗体は、１つ以上のアミノ酸を含む配列番号３内の１つの別個のサブ配列と結合する。

一実施形態において、抗体は、配列番号３内の２つ以上の別個のサブ配列に結合し、これらのサブ配列の各々は、１つ以上のアミノ酸を含む

本発明の一以上の実施形態によれば、タンパク質バインダーは、Ａ４３１、Ｑ４３２、Ｈ４３３、Ｖ４３４、Ｔ４３５、Ｔ４３６、Ｑ４３７、Ｌ４３８、Ｖ４３９、Ｌ４４０、Ｒ４４１、Ｎ４４２、Ｋ４４３、Ｇ４４４、Ｖ４４５、Ｙ４４６、Ｅ４４７、Ｓ４４８、Ｖ４４９、Ｋ４５０、Ｙ４５１、Ｉ４５２、Ｑ４５３、Ｑ４５４、Ｅ４５５、Ｎ４５６、Ｆ４５７、Ｗ４５８、Ｖ４５９からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基に結合し、ここで、アミノ酸残基の番号付けは、配列番号１６（ヒトｉＲｈｏｍ２）に記載されるアミノ酸配列に対するものである。

１つ以上の実施形態において、タンパク質バインダーは、上記の表から、≧２、≧３、≧４、≧５、≧６、≧７、≧８、≧９、≧１０、≧１１、≧１２、≧１３、≧１４、≧１５、≧１６、≧１７、≧１８、≧１９、≧２０、≧２１、≧２２、≧２３、≧２４、≧２５、≧２６、≧２７、≧２８、または≧２９個のアミノ酸残基に結合する。それぞれのアミノ酸残基は、別個の連続した配列中に、または配列番号３内の２つ以上のクラスター中に存在し得る。

別の実施形態において、タンパク質バインダーは、配列番号４に示されたアミノ酸配列を少なくとも含むか、または配列番号４と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むヒトｉＲｈｏｍ２のアミノ酸配列に結合する。配列同一性に関する同じフォールバック位置が適用される。

一実施形態では、抗体は上記のようにアミノ酸配列全体に結合する。別の実施形態では、抗体はまた、配列番号４の外、または配列番号４と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列の外で、ヒトｉＲｈｏｍ２のさらなるアミノ酸配列に結合する。

さらにアミノ酸がどこにあるかによって、抗体が結合するエピトープは線状か立体配置である。

本発明の１つ以上の実施形態によると、タンパク質バインダーは、配列番号４に記載のアミノ酸配列内の１つ以上のアミノ酸をそれぞれ含むヒトｉＲｈｏｍ２の１つ以上のアミノ酸配列に結合する

一実施形態において、該抗体は、１以上のアミノ酸を含む配列番号４内の１つの別個のサブ配列と結合する。

一実施形態において、抗体は、配列番号４内の２つ以上の別個のサブ配列に結合し、これらのサブ配列の各々は、１つ以上のアミノ酸を含む。

本発明の１つ以上の実施形態によれば、タンパク質バインダーは、Ａ４２６、Ｐ４２７、Ｖ４２８、Ｇ４２９、Ｆ４３０、Ａ４３１、Ｑ４３２、Ｈ４３３、Ｖ４３４、Ｔ４３５、Ｔ４３６、Ｑ４３７、Ｌ４３８、Ｖ４３９、Ｌ４４０、Ｒ４４１、Ｎ４４２、Ｋ４４３、Ｇ４４４、Ｖ４４５、Ｙ４４６、Ｅ４４７、Ｓ４４８、Ｖ４４９、Ｋ４５０、Ｙ４５１、Ｉ４５２、Ｑ４５３、Ｑ４５４、Ｅ４５５、Ｎ４５６、Ｆ４５７、Ｗ４５８、Ｖ４５９からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基に結合し、ここで、アミノ酸残基の番号付けは、配列番号１６（ヒトｉＲｈｏｍ２）に記載されるアミノ酸配列に対するものである。

１つ以上の実施形態において、タンパク質バインダーは、上記の表から、≧２、≧３、≧４、≧５、≧６、≧７、≧８、≧９、≧１０、≧１１、≧１２、≧１３、≧１４、≧１５、≧１６、≧１７、≧１８、≧１９、≧２０、≧２１、≧２２、≧２３、≧２４、≧２５、≧２６、≧２７、≧２８、≧２９、≧３０、≧３１、≧３２、≧３３または≧３４アミノ酸残基に結合する。それぞれのアミノ酸残基は、別個の連続した配列中に、または配列番号３内の２つ以上のクラスター中に存在し得る。

本発明の１以上の実施形態によると、タンパク質バインダーは、ヒトｉＲｈｏｍ１、またはその膜貫通ドメイン１（ＴＭＤ１）に隣接する膜近傍ドメインと交差反応性ではない。

本発明の１以上の実施形態によると、タンパク質バインダーは、マウスｉＲｈｏｍ２、またはその膜貫通ドメイン１（ＴＭＤ１）に隣接する膜近傍ドメインと交差反応性である。

本発明の１以上の実施形態によると、タンパク質バインダーは、ＩｇＧ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ）２からなる群より選択されるフォーマットの少なくとも１つにおける抗体である。

本発明の１以上の実施形態によると、タンパク質バインダーは、ＩｇＧ、ＩｇＭからなる群から選択されるイソタイプを有する抗体である。

本発明の１以上の実施形態によると、タンパク質バインダーは、マウス、キメラ化、ヒト化、またはヒト抗体である。

本発明の一実施形態によると、タンパク質バインダーは抗体４Ｈ８－Ｅ３である。一実施形態において、タンパク質バインダーは、可変ドメインまたは４Ｈ８－Ｅ３のＣＤＲを含む抗体である。

本発明の一実施形態によると、タンパク質バインダーは、以下を含む：
ａ） 配列番号３３および４０に記載の重鎖／軽鎖可変領域配列対に含まれる一組の重鎖／軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）、
ｂ） 以下の配列を含む一組の重鎖／軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む
● ＨＣ ＣＤＲ１（配列番号３４または３７）
● ＨＣ ＣＤＲ２（配列番号３５または３８）
● ＨＣ ＣＤＲ３（配列番号３６または３９）
● ＬＣ ＣＤＲ１（配列番号４１または４４）
● ＬＣ ＣＤＲ２（配列番号４２または４５）、および
● ＬＣ ＣＤＲ３（配列番号４３または４６）、
ｃ） ｂ）の重鎖／軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、ただし、ＣＤＲの少なくとも１つは、それぞれの配列番号３４～３９または４１～４６に対して最大３個のアミノ酸置換を有する、
ｄ） ｂ）またはｃ）の重鎖／軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、その結果、ＣＤＲの少なくとも１つが、それぞれの配列番号３４－３９または４１－４６に対して６６％以上の配列同一性を有し、
ＣＤＲが、十分な結合親和性でヒトｉＲｈｏｍ２に結合し、ＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７活性を阻害または減少させることができるように、適当なタンパク質フレームワークに包埋される。

これらのＣＤＲは抗体４Ｈ８－Ｅ３のＣＤＲセットであり、異なるアプローチで決定される（配列番号３４－３９はパラトームＣＤＲ同定手法で決定される（ｈｔｔｐ：／／ｏｆｒａｎｓｅｒｖｉｃｅｓ．ｂｉｕ．ａｃ．ｉｌ／ｓｉｔｅ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ｐａｒａｔｏｍｅ），および配列番号４１－４６は社内の方法で決定される）。

本明細書中で使用される、用語「ＣＤＲ」または「相補性決定領域」は、両方の重鎖および軽鎖ポリペプチドの可変領域内に見出される非隣接抗原結合部位を意味することを意図している。これらの特定の領域は、Ｋａｂａｔら（１９７７）、Ｋａｂａｔら（１９９１）、Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８７）およびＭａｃＣａｌｌｕｍら（１９９６）によって記載されており、ここで定義は、互いに比較した場合に、アミノ酸残基の重複またはサブセットを含む。

それにもかかわらず、抗体または移植された抗体のＣＤＲまたはそのバリアントを参照するいずれかの定義の適用は、本明細書中で定義され使用される用語の範囲内であることが意図されている。上記参照の各々によって定義されるＣＤＲを包含するアミノ酸残基は、比較として以下の表１に示す。ＣＤＲの定義はケースごとに異なるため、この番号付けは同封の配列表に実際に開示されたＣＤＲとは異なる可能性があることに注意すること。

本明細書中で使用する場合、抗体可変領域に関連して使用する場合の用語「フレームワーク」は、抗体の可変領域内のＣＤＲ領域外の全てのアミノ酸残基を意味するように入力する。したがって、可変領域のフレームワークは約１００～１２０アミノ酸の長さであるが、ＣＤＲ以外のアミノ酸のみを参照することを意図している。

本明細書中で使用されるように、用語「十分な結合親和性で標的Ｘに結合することができる」は、それぞれの結合ドメインが１０^－４以下のＫ_Ｄで標的に結合することを意味するものとして理解されなければならない。Ｋ_Ｄは平衡解離定数で、タンパク質バインダーとその抗原の間のｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎの比率である。Ｋ_Ｄと親和性は逆に関連している。Ｋ_Ｄ値はタンパク質バインダーの濃度（特定の実験に必要なタンパク質バインダーの量）に関係するので、Ｋ_Ｄ値が低いほど（濃度が低いほど）、したがって結合ドメインの高い親和性なる。以下の表は、典型的なＫ_Ｄの範囲のモノクローナル・アイディーを示している。

好ましくは、タンパク質バインダーは、２個までのアミノ酸置換を有し、より好ましくは１個までのアミノ酸置換を有する

好ましくは、ＣＤＲの少なくとも１つはそれぞれの配列番号に対して≧６７％；≧６８％；≧６９％；≧７０％；≧７１％；≧７２％；≧７３％；≧７４％；≧７５％；≧７６％；≧７７％；≧７８％；≧７９％；≧８０％；≧８１％；≧８２％；≧８３％；≧８４％；≧８５％；≧８６％；≧８７％；≧８８％；≧８９％；≧９０％；≧９１％；≧９２％；≧９３％；≧９４％；≧９５％；≧９６％；≧９７％；≧９８％；≧９９％の配列同一性を有し、最も好ましくは、≧１００％である。

本明細書中で使用される「％配列同一性」という用語は、以下のように理解されなければならない：比較される２つの配列が配列間に最大の相関を与えるようにアラインメントされる。これは、アラインメントの程度を増強するために、１つまたは両方の配列中に「ギャップ」を挿入することを含み得る。次に、比較される各配列の全長にわたって％の同一性を決定することができ（いわゆる全体的アラインメント）、これは、特に、長さが同じか類似しているか、または長さが短く規定されている配列（いわゆる局所的アラインメント）に適している。

上記文脈において、少なくとも、例えば、照会アミノ酸配列に対して９５％の「配列同一性」を有するアミノ酸配列は、対象アミノ酸配列の配列が、照会アミノ酸配列の各々１００アミノ酸当たり最大５個のアミノ酸変化を含み得ることを除いて、対象アミノ酸配列の配列が照会配列と同一であることを意味するよう意図されている。言い換えると、照会アミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性の配列を有するアミノ酸配列を得るためには、対象アミノ配列中のアミノ酸残基の５％（１００個中５個）までを別のアミノ酸で挿入または置換するか、欠失させてもよい。２つ以上の配列の同一性および相同性を比較する方法は、当該技術分野において周知である。

２つの配列が同一であるパーセンテージは、例えば数学的アルゴリズムを用いて決定することができる。数学的アルゴリズムの好ましい例は、ＢＬＡＳＴまたはＮＢＬＡＳＴプログラムおよびＦＡＳＴＡなどのプログラムのＢＬＡＳＴファミリーに統合されているが、限定するものではない。他の配列とある程度同一である配列は、これらのプログラムによって同定することができる。

さらに、ウィスコンシン配列分析パッケージ、例えばプログラムＢＥＳＴＦＩＴおよびＧＡＰにおいて利用可能なプログラム９．１が、２つのポリペプチド配列間の％同一性を決定するために使用され得る。ここで言及されているのが、参照配列に対して特定の程度の配列同一性を共有するアミノ酸配列である場合、配列の相違は、好ましくは保存的アミノ酸置換によるものである。好ましくは、そのような配列は、例えば、より遅い速度であり得るが、参照配列の活性を保持する。

好ましくは、ＣＤＲの少なくとも１つは、以下を含むＣＤＲ配列修飾に供された：
● 親和性成熟
● 免疫原性の減少

所定の抗体の親和性がｉｎ ｖｉｔｒｏ増加する過程における親和性成熟天然の対応物と同様に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ親和性の成熟も変異と選択の原理に基づいている。これは、抗体、抗体断片または抗体ミメティックのような他のペプチド分子を最適化するために首尾よく使用されている。ＣＤＲ内部のランダム変異は、放射線、化学的変異原またはエラープローンＰＣＲを用いて導入される。さらに、連鎖シャフリングによって遺伝的多様性を増加させることができる。ファージディスプレイ法のようなディスプレイ法を用いて２、３ラウンドの変異と選択を行うと、通常、低ナノモル域で親和性をもつ抗体断片が生じる。原理については、Ｅｙｌｅｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１６）を参照のこと。その内容は、参照により本明細書に援用される。

ヒト化抗体は、マウス配列由来のＣＤＲ領域を、必要なフレームワーク復帰変異とともに、ヒト配列由来のＶ領域に含む。したがって、ヒト化抗体を患者に投与すると、ＣＤＲ自体が免疫原性の反応を引き起こすことができる。ＣＤＲによって引き起こされる免疫原性を減少させる方法は、Ｈａｒｄｉｎｇら（２０１０）に開示されており、その内容は、参照により本明細書に援用される。

本発明の一実施形態によれば、フレームワークはヒトＶＨ／ＶＬフレームワークである。ＶＨはＩｇＧ形抗体の重鎖可変ドメインの略であり、ＶＬは軽鎖可変ドメイン（カッパまたはラムダ）の略である。

本発明の一実施形態によると、タンパク質バインダーは、以下を含む
ａ） 重鎖／軽鎖可変ドメイン（ＶＤ）
● ＨＣ ＶＤ（配列番号３３）、および
● ＬＣ ＶＤ（配列番号４０）
ｂ） ａ）の重鎖／軽鎖可変ドメイン（ＶＤ）、但し
● ＨＣ ＶＤは、それぞれの配列番号３３と配列同一性が８０％以上である、および／または
●ＬＣ ＶＤはそれぞれの配列番号４０と≧８０％の配列同一性を有している
ｃ） ａ）またはｂ）の重鎖／軽鎖可変ドメイン（ＶＤ）であって、但しＨＣ ＶＤまたはＬＣ ＶＤの少なくとも１つが、それぞれの配列番号３３および／または４０に対して最大１０個のアミノ酸置換を有する重鎖／軽鎖可変ドメイン（ＶＤ）。
前記タンパク質バインダーは、十分な結合親和性でヒトｉＲｈｏｍ２に結合し、ＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７活性を阻害または減少させることが依然として可能である。

好ましくは、ＨＣ ＶＤおよび／またはＬＣ ＶＤは、それぞれの配列番号に対して≧８１％；≧８２％；≧８３％；≧８４％；≧８５％；≧８６％；≧８７％；≧８８％；≧８９％；≧９０％；≧９１％；≧９２％；≧９３％；≧９４％；≧９５％；≧９６％；≧９７％；≧９８％；≧９９％；または最も好ましくは≧１００％の配列同一性を有する。

抗体またはその重鎖または軽鎖に関連して使用される「可変ドメイン」は、分子上に抗原結合を付与し、かつ定常領域ではない抗体の一部を意味することを意図している。この用語は、可変領域全体の結合機能の一部を維持するその機能性断片を含むことを意図している。可変領域結合断片には、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）_２、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃｆｖ）などの機能性断片が含まれる。このような機能性断片は当業者には周知である。したがって、ヘテロマー可変領域の機能性断片を記述する際のこれらの用語の使用は、当業者に周知の定義に対応することを意図している。そのような用語は、例えば、Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）またはＰｌｕｃｋｔｈｕｎ ａｎｄ Ｓｋｅｒｒａ（１９９０）に記載されている。

本発明の一実施形態によれば、上記で議論された少なくとも１つのアミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。

「保存的アミノ酸置換」は、非保存的置換よりもタンパク質バインダー機能に対する効果が小さい。アミノ酸の分類にはいろいろな方法があるが、それらの構造とＲ基の全般的な化学的性質に基づいて、しばしば６つの主要な群に分類される。

一実施形態では、「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されたものである。例えば、類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが当技術分野で定義されている。これらのファミリーには以下の側鎖を有するアミノ酸が含まれる。
●塩基性側鎖（例：リジン、アルギニン、ヒスチジン）
●酸性側鎖（アスパラギン酸、グルタミン酸など）
●非荷電極性側鎖（グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システインなど）
●非極性側鎖（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンなど）
●β分岐側鎖（スレオニン、バリン、イソロイシンなど）
●芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）

他の保存されたアミノ酸置換は、ペプチドの電荷を修飾するためにアスパラギンをアスパラギン酸に置換する場合のように、アミノ酸側鎖ファミリーを横切って起こることもできる。したがって、例えば、ＨＲドメインポリペプチド中の予測される非必須アミノ酸残基は、ファミリーを越えて同じ側鎖ファミリーまたはホモログ由来の別のアミノ酸残基（例えば、アスパラギン酸についてはアスパラギン、グルタミン酸についてはグルタミン）と置換されることが好ましい。保存的変化には、さらに、化学的に相同な非天然アミノ酸（すなわち、ロイシンの代わりに合成非天然疎水性アミノ酸、トリプトファンの代わりに合成非天然芳香族アミノ酸）の置換を含むことができる。

本発明の一実施形態によると、タンパク質バインダーは以下の少なくとも１つを有する。
●上記記載のタンパク質バインダーと比較した場合のｉＲｈｏｍ２に対する≧５０％のＳＰＲにより測定された標的結合親和性、および／または
●上記記載のタンパク質バインダーのＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７活性に対する阻害または減少効果の≧５０％。

本明細書中で使用される場合、用語「結合親和性」は、結合相互作用の強度を意味することが意図され、したがって、実際の結合親和性ならびに見かけの結合親和性の両方を含む。実際の結合親和性は、解離速度に対する会合速度の比である。したがって、結合親和性を付与または最適化するには、結合親和性の所望のレベルを達成するためにこれらの成分のいずれかまたは両方を変更することが含まれる。見かけの親和性には、例えば、相互作用のアビディティを含むことができる。例えば、二価のヘテロマー可変領域結合断片は、その価数のために改変された、または最適化された結合親和性を示すことができる。

結合剤の親和性を測定するのに適した方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を通してである。この方法は、表面プラズモン波が金属／液体界面で励起されたときに生じる現象に基づいている。光は試料に接していない表面の側表面に照射され、反射され、ＳＰＲは角度と波長の特定の組合せで反射光強度の低下を引き起こす。生体分子結合事象は表層での屈折率の変化を引き起こし、これはＳＰＲシグナルの変化として検出される。

結合事象は、受容体－リガンド対間の結合会合または解離のいずれかであり得る。屈折率の変化は、基本的に瞬時に測定することができ、したがって、親和性定数の個々の構成要素の決定を可能にする。具体的には、会合速度（ｋ_ｏｎ）と解離速度（ｋ_ｏｆｆ）の正確な計測を可能にする。

ｋ_ｏｎおよびｋ_ｏｆｆを測定すると、変更された可変領域または最適化された可変領域を特定できるため、効果的である。例えば、改変された可変領域、またはそのヘテロマー結合断片は、例えば、類似の結合親和性を示す可変領域およびヘテロマー結合断片と比較して、より高いｋ_ｏｎを有するため、より有効であり得る。ｋ_ｏｎが高い分子ほど、より速い速度でその標的に特異的に結合して阻害することができるので、効果の増大がもたらされる。同様に、本発明の分子は、類似の結合親和性を有する分子と比較して、より低いｋ_ｏｆｆ値を示すため、より効果的であり得る。ｋ_ｏｆｆ速度が低い分子ほど効力が高くなるのは、いったん結合すると、分子の標的からの解離が遅くなるからである。そのヘテロマー可変領域結合断片を含む本発明の改変された可変領域および最適化された可変領域に言及されているが、会合および解離速度を測定するための上述の方法は、治療または診断のためのより効果的な結合剤を同定するために、本質的に任意のタンパク質バインダーまたはその断片に適用可能である。

表面プラズモン共鳴を用いた会合および解離速度を含む親和性を測定する方法は、当業者においてよく知られており、例えば、ＪｏｎｓｓｏｎおよびＭａｌｍｑｕｉｓｔ、（１９９２）およびＷｕら（１９９８）に記載することができる。さらに、結合相互作用を測定するために当技術分野でよく知られている１つの装置は、ファルマシアバイオセンサ（ウプサラ、スウェーデン）を介して市販されているＢＩＡｃｏｒｅ２０００装置である。

好ましくは、標的結合親和性は参照結合剤の≧５１％，≧５２％，≧５３％，≧５４％，≧５５％，≧５６％，≧５７％，≧５８％，≧５９％，≧６０％，≧６１％，≧６２％，≧６３％，≧６４％，≧６５％，≧６６％，≧６７％，≧６８％，≧６９％，≧７０％，≧７１％，≧７２％，≧７３％，≧７４％，≧７５％，≧７６％，≧７７％，≧７８％，≧７９％，≧８０％，≧８１％，≧８２％，≧８３％，≧８４％，≧８５％，≧８６％，≧８７％，≧８８％，≧８９％，≧９０％，≧９１％，≧９２％，≧９３％，≧９４％，≧９５％，≧９６％，≧９７％，≧９８％，最も好ましくは≧９９％である。

本明細書中で使用されるように、ＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７活性に対する阻害または減少効果の定量化は、ベンチマーク結合剤と比較して、例えば、それぞれのＴＮＦシェディングアッセイで行うことができる（例えば、図２および実施例５参照）。

本発明の別の態様によると、上記のタンパク質バインダーのいずれかとヒトｉＲｈｏｍ２との結合を競合するタンパク質結合剤が提供される。

このようなタンパク質バインダーのフォーマットまたは構造に関しては、上記と同様の好ましい実施形態が適用される。一実施形態において、前記タンパク質バインダーは、モノクローナル抗体、または標的結合能を保持するその標的結合断片もしくは誘導体、または抗体ミメティックである。

本明細書中で使用される、用語「結合について競合する」は、前記配列によって定義される抗体の１つを参照して使用され、これは、前記配列定義されたタンパク質バインダーと同様に、実際のタンパク質バインダーが、同じ標的、または標的エピトープもしくはドメインもしくはサブドメインに結合する活性であることを意味し、かつ後者のバリアントである。結合の効率（例えば、動力学または熱力学）は、後者の効率と同じか、またはそれより大きいか、またはそれより小さいことができる。例えば、基質への結合のための平衡結合定数は、２つの抗体について異なり得る。

結合に対するこのような競合は、競合結合アッセイで適切に測定することができる。そのようなアッセイはＦｉｎｃｏ ｅｔ ａｌ．２０１１に開示されており、その含有量はここに引用して組み込まれており、特許請求の解釈に対するそれらの意味はＤｅｎｇ ｅｔ ａｌ２０１８に開示されており、その内容は、参照により本明細書に援用される。

本発明の別の態様によれば、上記記載のタンパク質バインダーと本質的に同じ、またはｉＲｈｏｍ２上の同じエピトープに結合するタンパク質バインダーが提供される。

この特性を試験するために、とりわけ、以下を含む適当なエピトープ地図作成技術が利用可能である。
●Ｘ線共結晶解析と低温電子顕微鏡（ｃｒｙｏ－ＥＭ）
●アレイ－ベースのオリゴ－ペプチドスキャニング
●部位特異的突然変異誘発マッピング
●ハイスループットショットガン突然変異誘発エピトープマッピング
●水素－重水素交換
●架橋結合質量分析

これらの方法は、特に、Ｂａｎｉｋら（２０１０）、およびＤｅＬｉｓｓｅｒ（１９９９）において開示され、議論されており、その内容は、参照により本明細書に援用される。

本発明の別の態様によると、前記請求項のいずれか１項に記載の結合剤をコードする核酸分子。

コードされた結合剤の所定の配列は、そのような核酸分子が、遺伝コードの縮重のために異なる配列を有することができる。

このような核酸分子は、薬学的目的に使用することができる。そのような場合、患者に投与されるのはＲＮＡ由来の分子であり、ここで、患者のタンパク質発現装置はそれぞれの結合剤を発現する。ｍＲＮＡは、例えば、適当なリポソーム中で送達され得、免疫応答を回避し、および／または折りたたみおよび翻訳効率を改善するための特異的配列または修飾ウリジンヌクレオシド類のいずれかを含み、時には、それらを特定の細胞型に標的化するための５'および／または３'末端でのキャップ修飾を含む。

このような核酸分子は、発現宿主をトランスフェクトし、次いで実際の結合剤を発現させるために用いることができる。このような場合、その分子は、任意に適当なベクターに組み込まれるｃＤＮＡであり得る。

本発明の別の態様によれば、上記記載のタンパク質バインダーの使用は、
■ 炎症性疾患と診断されている
■ 炎症性疾患を罹患している、または
■ 炎症性疾患を発症するリスクがある、またはそのような疾患の予防のリスクがある
ヒトまたは動物対象の治療のために（医薬の製造のための）提供される。

本発明の別の態様によれば、上記記載のタンパク質バインダー、および任意に１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物が提供される。

本発明の別の態様によれば、組合せは、（ｉ）上記記載のタンパク質バインダー、または上記記載の医薬組成物、および（ｉｉ）１以上の治療的活性化合物を含む。

本発明の別の態様によると、炎症状態を治療または予防するための方法が提供され、 その方法は（ｉ）上記記載のタンパク質バインダー、（ｉｉ）上記記載の医薬組成物、または（ｉｉｉ）上記記載の組合せ物の、治療上十分な量での、ヒトまたは動物対象への投与を含む。

本発明の別の態様によれば、部分の治療用キットが提供され、それは以下を含む：
ａ） 上記記載の組成物、上記記載の医薬組成物、または上記記載の組合せ、
ｂ） 組成物、組成物または組合せを投与するための装置、および
ｃ） 取扱説明書。

本発明は図面および前記の説明において詳細に図示および説明されてきたが、そのような図示および説明は例示または例示的であり、限定的ではないと考えられるべきであり、本発明は開示された実施形態に限定されない。開示される実施形態に対する他の変形形態は、図面、開示、及び添付の特許請求の範囲の研究から、請求される発明を実施する際に当業者によって理解され、実施され得る。特許請求の範囲において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は、他の要素又はステップを排除するものではなく、不定冠詞「ａ（１つの）」又は「ａｎ（１つの）」は複数形を除外するものではない。特定の手段が相互に異なる従属請求項に列挙されているという単なる事実は、これらの手段の組み合わせを使用して利益を得ることができないことを示すものではない。特許請求の範囲のどの引用符号も、範囲を限定すると解釈するべきではない。

本明細書に開示される全てのアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端まで示される；本明細書に開示される全ての核酸配列は、５’－＞３’で示される。

実施例１：免疫化およびペプチド結合ＥＬＩＳＡ分析のためのペプチドの生成

ペプチドは、パラレルペプチドシンセサイザー（ペプチド１－５、７－９および１ｂ－３ｂ； ＭｕｌｔｉＰｅｐ ＲＳｉ、Ｉｎｔａｖｉｓ ＡＧ、ドイツ）、マイクロ波ペプチドシンセサイザー（ペプチド６；リバーティブルー、ＣＥＭ、米国）、またはフルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）ベース固相ペプチド合成を用いたオーダーメード連続フローペプチドシンセサイザー（ペプチド１０、１１および４ｂ）上で合成した。[Chan, W.C., White, P.D. Solid Phase Peptide Synthesis, A Practical Approach (Oxford University Press Inc., New York, 2000].

配列は、側鎖保護基を有するＦｍｏｃ保護Ｌ‐アミノ酸を用いてＣからＮ‐末端まで段階的に組み立てた。連鎖集合ペプチドを完了すると、９５％ ＴＦＡ、４％トリエチルシランおよび１％水で樹脂から切り離した。粗生成物を０．１％ ａｑ ＴＦＡに１５％アセトニトリルに溶解し、Ｏｒｂｉｔ Ｃ１８、１０μｍ、１００ビティカラム（ＭＺ Ａｎａｌｙｓｅｎｔｅｃｈｎｉｋ社、ドイツ）を用いて逆相ＨＰＬＣにより精製した。得られた精製画分は、Ｋｉｎｅｔｅｘ ＥＶＯ Ｃ１８、５μｍ、１００旭カラム（米国フェノメネックス社）を用いた分析ＨＰＬＣと、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ質量分析法（米国ブルッカー社、Ｕｌｔｒａｆｌｅｘ ＩＩＩ）により分析した。分画を凍結乾燥し、対応するＴＦＡ塩を得た。

ペプチド１０および１１については、質量分析によって同定された線状ペプチドをＤＭＳＯ媒介酸化によって対応する環状ジスルフィドに酸化した。この目的のために、直鎖状ペプチドを５％酢酸に１ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。ｐＨは（ＮＨ４）２ＣＯ３で６に調整し、ＤＭＳＯを１０～２０％の最終濃度に加えた。酸化は室温で２４時間進行させた。その後、反応混合物を溶媒Ａで希釈し、生成物を逆相Ｃ１８カラムで精製し、上記のように分析した。ジスルフィド環化ペプチドを含む画分をプールし、凍結乾燥した。[Chan, W.C. and White, P.D., Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, A Practical Approach (Oxford University Press Inc., New York, 2000, Chapter 3.3, page 97]

ＫＬＨコンジュゲーションは、予め活性化されたＫＬＨ （Ｉｍｃｅｊｔ（商標）Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｍｃＫＬＨ， Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ＵＳＡ）を用いて行った。簡単に述べると、ｍｃＫＬＨを１０ｍｇ／ｍｌの濃度の超純水で溶解した。ペプチドを溶解するために必要な８Ｍの尿素 （ｐＨ７．２）を加えた場合は、所望のペプチドをＩｍｊｅｃｔ^ＴＭマレイミドコンジュげーション緩衝液（サーモサイエンティフィック社、米国）に５ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した。ペプチド溶液をｍｃＫＬＨ溶液と混合し、室温で２～６時間インキュベートした。混合物を、４００ｍＬのＰＢＳに対して３５００ＭＷカットオフ（ＭＷＣＯ）透析チューブで一晩透析した。透析後、混合物をＰＢＳで希釈し、所望の濃度を得た。

α‐ビオチン‐ω‐マレイミドウンデカ（エチレングリコール）（ビオチン‐ＰＥＧ（１１）‐ｍａｌ）でビオチン化を行った。ペプチドをＰＢＳ ｐＨ７，４に溶解した。必要であれば、アセトニトリルを加えてペプチドを溶解した。ビオチン‐ＰＥＧ（１１）‐ｍａｌをＤＭＦに溶解し、ペプチド溶液に加えた（重み量＝１：１）。反応を一晩行い、続いて逆相Ｃ１８カラムで精製し、上記のように分析した。

図１は、免疫化及び／又はペプチド結合ＥＬＩＳＡ分析のために使用されるペプチドを示しており、ヒトｉＲｈｏｍ２についてはＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０２４５９９．５、ＮＰ＿０７８８７５．４、ヒトｉＲｈｏｍ１についてはＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０２２４５０．３、ＮＰ＿０７１８９５．３．であり、その名称、位置およびアミノ酸を示す。ＫＬＨ（免疫用）および／またはビオチン（ペプチド結合ＥＬＩＳＡ分析用）にカップリングするためにペプチド６および７を除く全てのペプチドに付加された末端システイン残基を「－Ｃ－」によって例示する。内部のシステイン残基は、示されている場合にはアルファ－アミノ酪酸（Ａｂｕ）で置き換えられる。ペプチド１～４はＴＭＤ１のアミノ酸（イタリック体で強調）とヒトｉＲｈｏｍ２の隣接する細胞外膜近傍領域に相当する（図１Ａ）。ペプチド５～７は、ＴＭＤ１とＴＭＤ２を連結するヒトｉＲｈｏｍ２の大きな細胞外ループ１内の切片に似ている（図１Ｂ）。ペプチド８～１１は、ＴＭＤ７のアミノ酸（イタリック体で強調）およびヒトｉＲｈｏｍ２の隣接するＣ末端尾部を意味する（図１Ｃ）。ペプチド１ｂ～４ｂは、ペプチド１～４のヒトｉＲｈｏｍ１ホモログであり、したがって、ＴＭＤ１のアミノ酸（イタリック体で強調される）およびヒトｉＲｈｏｍ１の隣接する細胞外膜近傍領域に対応する（図１Ｄ）。

実施例２：免疫化のためのｉＲｈｏｍ２ノックアウトマウスの交配

ヒト対マウスｉＲｈｏｍ２タンパク質の配列相同性が高く（ヒトｉＲｈｏｍ２についてはＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０７８８７５．４、およびマウスｉＲｈｏｍ２についてはＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿７６６１６０．２を参照のこと）、ヒト対ｉＲｈｏｍ２の細胞外ループ１、２、３およびＣ末端尾部のアミノ酸配列同一性は、それぞれ８９．９６％、１００．００％、１００．００％および９６．９７％と計算される）、野生型マウスではなくｉＲｈｏｍ２ノックアウトを免疫化のために繁殖させた。

要約すると、Ｒｈｂｄｆ２ｔｍ１ｂ（ＫＯＭＰ）Ｗｔｓｉマウス株（Ｒｈｂｄｆ２はｉＲｈｏｍ２の代替名である）は、デービスのカリフォルニア大学のＫＯＭＰマウスバイオロジープログラムからの蘇生のために指示され、３つのヘテロ接合雄マウスが利用できるようになった。Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ背景（Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ‐Ｒｈｂｄｆ２ｔｍ１ｂ（ＫＯＭＰ）Ｗｔｓｉ）にあるこれら３頭を、１２９Ｓｖ／Ｊ遺伝的背景の野生型雌マウスと交配し、ヘテロ接合子孫を作製した。これらのヘテロ接合体マウスを互いに交配させ、Ｒｈｂｄｆ２遺伝子を接合性ノックアウトした雌雄マウスを作製した。得られた接合性Ｒｈｂｄｆ２ノックアウトマウスコロニーを、免疫化のためにさらに拡大した。

実施例３：マウスの免疫化と血清中力価解析

８～１０週齢の雌雄ｉＲｈｏｍ２ノックアウトマウスの３つのコホート（実施例２に記載）を、それぞれペプチド混合物Ａ、ＢおよびＣで免疫化した。混合物Ａは、４つのキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）結合ペプチド１，２，３および４の等しい量から成っていた。混合物Ｂは、３つのＫＬＨ結合ペプチド５、６および７の等しい量から構成され、混合物Ｃは、４つのＫＬＨ結合ペプチド８、９、１０および１１の等しい量によって構成された。ペプチド混合物５０μｇをＧＥＲＢＵアジュバントＭＭ^TM（ＧＥＲＢＵバイオテクニク、ドイツ）２０μｌで乳化し、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ＰＨ７，６）で調整し、マウス１頭、１回の注入当たり１００μｌの最終容量で腹腔内（ＩＰ）投与した。１群１０匹のマウスに１０日間ごとに５回注射した。５回目の注射から１０日後に血液（血清）を採取し、抗体価を検査した。

免疫応答の評価は、ＥＬＩＳＡ法およびＦＡＣＳ法を適用した血清抗体価分析により行った。ＦＡＣＳ分析に関して、３％ ＦＢＳを含むＰＢＳで１：５０に希釈した血清を、二次抗体としてヤギＦ（ａｂ'）２抗マウスＩｇＧ （Ｈ＋Ｌ）‐Ｒ‐フィコエリトリン（ＲＰＥ）抱合体（ジアノバ、ドイツ）を用いて、ヒトｉＲｈｏｍ２を安定発現するマウスＬ９２９細胞で試験した。陰性対照として、親Ｌ９２９細胞を用いた。Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６ Ｐｌｕｓ （ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、米国）フローサイトメーターで試験を実施した。免疫化プロトコルの０日目に採取した免疫前血清（「ＰＩＳ」）を陰性対照とした。

相補的に、全頭の免疫血清を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）で検査した：血清を１％ ＢＳＡを含むＰＢＳ中で１：５００、１：２５００および１：１２，５００に希釈し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体（米国サザンバイオテック社）を用いた検出により、それぞれのビオチン化ペプチド混合物１μｇ／ｍｌでコーティングしたプレートとの結合を検査した。無関係なタンパク質（ＢＳＡ）および免疫プロトコルの０日目に採取した免疫前血清を陰性対照とした。

免疫応答のさらなる追加免疫のために、ペプチド混合物による免疫化を、２週間ごとに別の２回の注入による血清採取の４日後に延長し、その後１０日間追加免疫した。選択した動物の脾臓を最終ブーストの４日後に採取し、リンパ球を分離し、その後の融合のために凍結保存した。

実施例４：ハイブリドーマの生成のためのリンパ球の回収および融合

免疫化コホート当たり３匹の選択した動物からの凍結保存脾臓リンパ球を解凍し、ハイブリドーマ細胞の生成のためにＡｇ８マウスミエローマ細胞と群特異的に融合した。融合細胞を平板培養し、ヒポキサンチン‐アミノプテリン‐チミジン（ＨＡＴ）培地の存在下で９６‐ウェルプレート上で増殖させた。群特異的融合により、新たに出現したハイブリドーマのそれぞれの免疫化群へのレトロスペクティブな帰属が可能となった。

実施例５：候補選択のためのハイブリドーマ上清のスクリーニング

１４日間の培養後、ハイブリドーマ細胞の上清を採取し、ｉＲｈｏｍ２結合抗体について選択される代わりに、ｉＲｈｏｍ２活性－中和抗体についてのＥＬＩＳＡベースの機能性スクリーニングに付した。マクロファージからの腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）のＴＡＣＥ媒介放出におけるｉＲｈｏｍ２の重要な役割は非常によく確立されている（ＭｃＩｌｗｅｉｎら、２０１２、Ａｄｒａｉｎら、２０１２、Ｓｉｇｇｓら、２０１２）ため、ヒトＴＮＦ－αＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ （Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、米国）を採用し、全５２８０のペプチド免疫由来ハイブリドーマ上清の存在下および非存在下で、ヒトＴＨＰ－１マクロファージ細胞からの内因性ＴＮＦαのリポ多糖類（ＬＰＳ）誘導放出を比較した。

要約すると、１日目に、Ｎｕｎｃ ｂｌａｃｋ Ｍａｘｉｓｏｒｐ（登録商標）９６－ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）を、４μｇ／ｍｌのＴＢＳで、マウス抗ヒトＴＮＦα捕捉抗体（ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキットの一部として提供される）１００μｌ／ウェルにより４℃で一晩コーティングした。２日目に、捕捉抗体溶液を除去し、そしてＭａｘｉｓｏｒｐ（登録商標）プレートを、３００μｌ／ウェルのＴＢＳ、１％ＢＳＡで４℃で一晩ブロックした。３日目に、８０μｌの正常増殖培地中の２０，０００ＴＨＰ－１（米国型培養収集）細胞を、Ｇｒｅｉｎｅｒ ＣＥＬＬＳＴＡＲ Ｖ－ｂｏｔｔｏｍ ９６－ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）の各ウェルに播種し、そして２０μｌのハイブリドーマ上清と共に３７℃、５％ＣＯ_２で３０分間プレインキュベートした。対照群では、ハイブリドーマ上清の代わりに２０μｌの標準増殖培地を添加した。その後、細胞（非刺激対照を除く）を、ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）を３００ｎｇ／ｍｌの増殖培地で最終濃度５０ｎｇ／ｍｌになるように１ウェルあたり２０μｌで３７℃、５％ＣＯ_２で２時間刺激した。その後、９６－ウェルプレートを細胞を沈殿させるために遠心分離した。並行して、ブロッキング緩衝液をＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）プレートから除去し、９６ヘッドプレート洗浄器（スイス、テカングループ）上で１ウェルあたり３５０μｌのＴＢＳ－Ｔ（ドイツ、カール・ロス）でプレートを４回洗浄した。乾燥を避けるため、直ちにＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）プレートの各ウェルにＴＢＳ ３０μｌを添加した後、試料あたり無細胞上清７０μｌを移した。

さらに、ＴＢＳで規定濃度に希釈した組換えヒトＴＮＦαタンパク質（ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキットの一部として提供）１００μｌを標準参照としてプレートに添加した。その後、５０ｎｇ／ｍｌのＴＢＳでビオチン化ヤギ抗ヒトＴＮＦα検出抗体（ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキットの一部として提供）を１ウェルあたり１００μｌ添加し、直接光から保護し、プレートを室温で２時間インキュベートした。９６－ｈｅａｄ ｐｌａｔｅ ｗａｓｈｅｒ （Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ）上でＴＢＳ－Ｔ （Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ、ドイツ）１ウェルあたり３５０μｌで４回洗浄し、４サイクル目以降は緩衝液の痕跡をすべて注意深く除去した後、ＴＢＳ中で１：１０，０００に希釈したストレプトアビジン－ＡＰ （Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）１００μｌを各ウェルに添加し、再び直接光から保護し、プレートを室温で３０分間インキュベートした。９６－ｈｅａｄ ｐｌａｔｅ ｗａｓｈｅｒ （Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）上でＴＢＳ－Ｔ （Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ、ドイツ）１ウェルあたり３５０μｌで４回再洗浄し、４サイクル目以降は緩衝液の痕跡をすべて注意深く除去した後、室温暗所で１時間インキュベートするため、ＡｔｔｏＰｈｏｓ基質溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）１００μｌを添加した。ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００ ＰＲＯ（Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ、スイス）マイクロプレートリーダーを用いて、各ウェルの蛍光を励起波長４３５ｎｍ、発光波長５５５ｎｍで収集した。

図２は、ＴＨＰ－１細胞からのＴＮＦαのＬＰＳ誘導放出に対するペプチド免疫化由来ハイブリドーマ上清の効果を示す１つの９６－ウェルプレートについてのこれらの実験の代表的な結果を示す。試験された全部で５２８０のハイブリドーマ上清のうち、プレート番号４、Ｈ列、８行（４Ｈ８）のハイブリドーマ細胞集団から採取された上清は、ＴＨＰ－１細胞におけるＬＰＳ誘導ＴＮＦαシェディングを明らかに妨害する唯一のものである。

実施例６：ハイブリドーマ細胞集団４Ｈ８のサブクローニング

ハイブリドーマ細胞集団４Ｈ８はオリゴクローナル由来のようであったので、古典的液体希釈法を適用したサブクローニングを行い、モノクローナルハイブリドーマ細胞プールを単離した。

簡単に言うと、ハイブリドーマ集団４Ｈ８の細胞を計数し、そして、９６－ウェルプレートのウェルあたり平均２個の細胞で終わるまでの希釈係数を計算した。それに応じて細胞を希釈し、単一細胞集団の増殖を伴うウェルを顕微鏡を通して同定した。これらのモノクローナルハイブリドーマ集団を約３週間拡大した後、上清を収集し、実施例５に記載されているようにＴＨＰ－１細胞からのＴＮＦαのＬＰＳ誘導放出に対する阻害効果について比較した。４Ｈ８－Ｄ４、４Ｈ８－Ｅ３および４Ｈ８－Ｇ８と名付けられた３つの４Ｈ８サブクローンは、ＴＮＦαシェディングを有意に阻害することが判明したため、拡大して保存した。

実施例７：ハイブリドーマサブクローン４Ｈ８－Ｅ３からの抗体の精製

本実施例では、アフィニティークロマトグラフィーを応用したハイブリドーマサブクローン４Ｈ８－Ｅ３の上清からの抗体の精製について述べる。

要約すると、タンパク質Ｇセファロースは、主にＩｇＧ抗体の固定化に推奨され、ＩｇＭ抗体の結合にはあまり適さないと記載されているが、タンパク質Ｇセファロースカラムは、両方の抗体イソタイプの良好な収率をもたらすことが経験的に見出された。したがって、ハイブリドーマサブクローン４Ｈ８－Ｅ３から収集した上清をプールし、抗体捕獲のために平衡化タンパク質Ｇセファロースプレパック重力流カラム（タンパク質Ｇ ＧｒａｖｉＴｒａｐ^TM、ＧＥヘルスケア、英国）にロードした。その後、カラムを結合緩衝液で１回洗浄し、捕捉された抗体を溶出緩衝液で溶出した（両方の緩衝液は、Ａｂ Ｂｕｆｆｅｒ Ｋｉｔ； ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ， ＵＫの一部として提供される）。次に、ＰＤ Ｍｉｄｉｔｒａｐ Ｇ－２５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、英国）を用いて溶出液分画を脱塩し、３０ｋＤａをカットオフとしたＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－４ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔｓ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国）を介して精製サンプルを濃縮した。最後に、ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００／ｃ分光光度計（サーモフィッシャーサイエンティフィック科学、米国）を用いて、精製タンパク質の濃度を測定した。

実施例８：本発明の抗体４Ｈ８－Ｅ３のイソタイプ決定

次回の工程として、マウスＩｇＧ／ＩｇＭ ＥＬＩＳＡを行い、本発明の精製抗体４Ｈ８－Ｅ３のイソタイプを決定した。要するに、１日目に、Ｎｕｎｃ ｂｌａｃｋ ＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）９６－ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ＵＳＡ）を、１μｇ／ｍｌ ＴＢＳ、ヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）捕捉抗体（米国科学－アルドリッチ）１００μｌ／ウェルで、４℃で一晩コーティングした。２日目に捕捉抗体液を除去し、マキシソルプ（登録商標）プレートをピアスタンパク質フリー（ＴＢＳ）ブロッキング緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国）１ウェルあたり３００μｌで室温で１時間ブロックした。次いで、ブロッキング緩衝液を除去し、プレートを９６－ヘッドプレート洗浄器（スイス、テカングループ）上でＴＢＳ－Ｔ（ドイツ、カール・ロス）のウェルあたり３５０μｌで３回洗浄した。その後、ブランクおよび陰性対照としてのウェルあたり１００μｌのＴＢＳ中、マウスＩｇＧ（サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国）およびマウスＩｇＭ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）抗体（いずれも１μｇ／ｍｌ ＴＢＳで開始）、標準参照としてのマウスＩｇＧ（サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国）およびマウスＩｇＭ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）抗体（それぞれ陽性および特異性対照として３μｇ／ｍｌ ＴＢＳのウェル当たり１００μｌ、ならびに３μｇ／ｍｌ ＴＢＳでの本発明の精製抗体４Ｈ８－Ｅ３をウェルに添加し、室温で２時間インキュベートした。その後、ＴＢＳ－Ｔ（ドイツ、カール・ロス）１ウェルあたり３５０μｌで、９６ヘッドプレート洗浄器（スイス、テカングループ）上でプレートを再び３回洗浄した。

イソタイプ検出のため、試料の半分を、直接光から保護し、ＡＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＭ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）またはＡＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ'）２断片（ジアノバ、ドイツ）検出抗体をＴＢＳ中で１：５０００に希釈した１００μｌ／ウェルと室温で１．５時間インキュベートした。ＴＢＳ－Ｔ（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ社、ドイツ）を１ウェルあたり３５０μｌで別に３回洗浄し、９６ヘッドプレート洗浄器（スイス、テカン群）を用い、３サイクル目以降は緩衝液の痕跡をすべて注意深く除去した後、ＡｔｔｏＰｈｏｓ基質溶液（米国、プロメガ社）１００μｌを加え、暗所及び室温で１０分間インキュベートした。ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００ ＰＲＯ（Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ、スイス）マイクロプレートリーダーを用いて、各ウェルの蛍光を励起波長４３５ｎｍ、発光波長５５５ｎｍで収集した。

図３は、本発明の抗体４Ｈ８－Ｅ３がマウスＩｇＭイソタイプであることを明確に示している。

実施例９：本発明の抗体４Ｈ８－Ｅ３によって認識される標的領域の決定

次に、ペプチド結合ＥＬＩＳＡ分析を行って、本発明の精製抗体４Ｈ８－Ｅ３が、ハイブリドーマクローン４Ｈ８が誘導されたこれらの動物に投与されたペプチドのいずれかを認識し、それによって、本発明の抗体４Ｈ８－Ｅ３によって認識される標的領域上の光を放出するかどうかを検証した。

すなわち、１日目に、Ｎｕｎｃ ｂｌａｃｋ Ｍａｘｉｓｏｒｐ（登録商標）９６－ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（米国））を、４℃で、ペプチド１～１１のウェル当たり１００μｌ、ペプチド１～４（混合物Ａ）、５～７（混合物Ｂ）、および８～１１（混合物Ｃ）の混合物をそれぞれ１０μｇ／ｍｌのＴＢＳで一晩コーティングした（したがって、混合物１～４および８～１１中の各ペプチドの最終濃度は、混合物５～７中で２．５μｇ／ｍｌ対３．３μｇ／ｍｌであった）。２日目に、ペプチド溶液を除去し、Ｍａｘｉｓｏｒｐ（登録商標）プレートをＰｉｅｒｃｅタンパク質フリー（ＴＢＳ）遮断緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（米国））のウェル当たり３００μｌで１．５時間ブロックした。次いで、ブロッキング緩衝液を除去し、プレートを９６－ヘッドプレート洗浄器（スイス、テカングループ）上でＴＢＳ－Ｔ（ドイツ、カール・ロス）１ウェルあたり３５０μｌで４回洗浄した。

その後、ブランクコントロールとしてＴＢＳのウェルあたり１００μｌ、塗布コントロールとして０．３μｇ／ｍｌのＴＢＳでマウス抗ビオチン免疫（クローンＢＮ－３４、シグマ－アルドリッチ、米国）、３μｇ／ｍｌのＴＢＳで本発明の精製抗体４Ｈ８－Ｅ３、および３μｇ／ｍｌのＴＢＳで本発明の精製抗体４Ｈ８－Ｅ３へのイソタイプ対照マウスＩｇＭ免疫（クローンＭＯＰＣ １０４Ｅ、シグマ－アルドリッチ、米国）を単一ペプチド１から１１またはそれぞれの混合物で予め塗布したウェルに添加し、室温で４時間インキュベーションした。その後、ＴＢＳ－Ｔ （ドイツ、カール・ロス）１ウェルあたり３５０μｌでプレートを再度９６ヘッドプレート洗浄器（スイス、テカングループ）上で４回洗浄し、直射光を避けて、ＴＢＳ中で１：２０００に希釈したＡＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ／ＩｇＧ／ＩｇＭ Ｆ（ａｂ'）２断片（シグマ－アルドリッチ、米国）１００μｌ／ウェルと室温で１時間インキュベートした。ＴＢＳ－Ｔ（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ社、ドイツ）１ウェルあたり３５０μｌで洗浄工程４回を９６ヘッドプレート洗浄器（スイス、テカングループ）に別、４サイクル目以降は緩衝液の痕跡をすべて注意深く取り除いた後、ＡｔｔｏＰｈｏｓ基質溶液（米国、プロメガ社）１００μｌを加え、暗所及び室温で１時間インキュベートした。ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００ ＰＲＯ（Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ、スイス）マイクロプレートリーダーを用いて、各ウェルの蛍光を励起波長４３５ｎｍ、発光波長５５５ｎｍで収集した。

図４にこの実験の代表的な結果を示す。塗布制御により、個々に、あるいはペプチド混合物として固定されたビオチン化ペプチドの存在量が確認される（図４Ａ、Ｃ、Ｅ）。ペプチド１～４の混合物（混合物Ａ）で免疫化されたマウスに由来するクローン４Ｈ８と一致して、本発明の抗体４Ｈ８－Ｅ３は、これらのペプチドが個別にコーティングされているか混合物としてコーティングされているかにかかわらず、大きな細胞外ループ（図４Ｄ）の様々な切片に似たペプチド５、６および７、またはヒトｉＲｈｏｍ２のＣ末端尾部を反映するペプチド８、９、１０および１１（図４Ｆ）への結合を示さない。対照的に、ペプチド１、２、３、および４からなる混合Ａならびに単一ペプチド３に対する本発明の抗体４Ｈ８－Ｅ３の強い結合が示され（図４Ｂ）、本発明の抗体４Ｈ８－Ｅ３によって認識されるエピトープが、ヒトｉＲｈｏｍ２の細胞外膜近傍ドメインのアミノ酸４３１～４５９内に局在することが明らかになった。本発明の抗体４Ｈ８－Ｅ３に関するデータは、ＩｇＭイソタイプ対照へのノーマライゼーション後に示される。

実施例１０：本発明の抗体４Ｈ８－Ｅ３の結合特異性の評価

本発明の精製抗体４Ｈ８－Ｅ３の特異性に対処するために、すなわち、この抗体が、ヒトｉＲｈｏｍ２のＴＭＤ１に隣接する細胞外膜近傍領域に類似する特定ペプチドペプチド３を特異的に認識するかどうか、または本発明の抗体４Ｈ８－Ｅ３が、密接に関連するファミリーメンバーであるヒトｉＲｈｏｍ１の相同領域を反映するペプチドにも結合するかどうかを疑問視するために、別の一連のペプチド結合ＥＬＩＳＡ実験が実施された。

簡単に述べると、１日目に、Ｎｕｎｃ ｂｌａｃｋ ＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）９６－ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）を、単一ビオチン化ペプチド１～４のウェル当たり１００μｌで一晩コーティングし、ペプチド１～４からなる混合物Ａ、単一ビオチン化ペプチド１ｂ～４ｂ、およびペプチド１ｂ～４ｂからなる混合物Ｄを、それぞれ１０μｇ／ｍｌのＰＢＳ（したがって、両方の混合物中の各ペプチドの最終濃度は、２．５μｇ／ｍｌであった）で４℃で一晩コーティングし、２日目に、ペプチド溶液を除去し、ＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）プレートを、室温で、Ｐｉｅｒｃｅタンパク質フリー（ＴＢＳ）ブロッキング緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）のウェル当たり３００μｌで１．５時間ブロックした。

次いで、遮断緩衝液を除去し、プレートを９６－ヘッドプレート洗浄器（スイス、テカングループ）上でＰＢＳ－Ｔ（ドイツ、カール・ロス）の１ウェルあたり３５０μｌで４回洗浄した。その後、ブランク対照としてＰＢＳ１ウェルあたり１００μｌ、塗布対照としてＰＢＳ０．３μｇ／ｍｌのマウス抗ビオチン抗体（クローンＢＮ－３４、シグマ）、塗布対照として本発明の精製抗体４Ｈ８－Ｅ３ ３μｇ／ｍｌのＰＢＳ、および本発明の精製抗体４Ｈ８－Ｅ３に対するイソタイプ対照としてＰＢＳ３μｇ／ｍｌのマウスＩｇＭ抗体（クローンＰＦＲ－０３、シグマ）を、単一ペプチド１～４、１ｂ～４ｂまたはそれぞれの混合であらかじめ塗布したウェルに加え、室温で４時間インキュベートした。その後、ＰＢＳ－Ｔ （ドイツ、カルロス）１ウェルあたり３５０μｌでプレートを再度９６ヘッドプレート洗浄器（スイス、テカングループ）上で４回洗浄し、直射光を避けて、ＰＢＳで１：２０００に希釈したＡＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ／ＩｇＧ／ＩｇＭ Ｆ（ａｂ’）２断片（シグマ－アルドリッチ社、米国）１００μｌ／ウェルと室温で１時間インキュベートした。

ＰＢＳ－Ｔ（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ社、ドイツ）１ウェルあたり３５０μｌの洗浄工程４回を９６ヘッドプレート洗浄器（スイス、テカングループ）に再度回し、４サイクル目以降、緩衝液の痕跡をすべて注意深く除去した後、ＡｔｔｏＰｈｏｓ基質溶液（米国、プロメガ社）１００μｌを加え、暗所及び室温で１時間インキュベートした。ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００ ＰＲＯ（Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ、スイス）マイクロプレートリーダーを用いて、各ウェルの蛍光を励起波長４３５ｎｍ、発光波長５５５ｎｍで収集した。

図５にこの実験の代表的な結果を示す。塗布制御により、個別に又はペプチド混合物として固定化されたビオチン化ペプチドの存在量が再度確認され（図５Ａ、Ｃ）、本発明の抗体４Ｈ８－Ｅ３の、ペプチド１、２、３、及び４からなるミックスＡ、特に、ヒトｉＲｈｏｍ２の細胞外膜近傍ドメインのアミノ酸４３１～４５９に似た単一ペプチド３への結合が確認された（図５Ｂ）。対照的に、本発明の抗体４Ｈ８－Ｅ３は、関連ファミリーメンバーであるヒトｉＲｈｏｍ１（図５Ｄ）内の相同アミノ酸配列を反映するペプチド１ｂ、２ｂ、３ｂおよび４ｂからなる、または個別にコーティングされた混合物Ｄに全く結合せず、本発明の抗体４Ｈ８－Ｅ３がヒトｉＲｈｏｍ２に特異的に結合し、したがって、ヒトｉＲｈｏｍ１における相同部分を認識しないというエビデンスを提供する。本発明の抗体４Ｈ８－Ｅ３に関するデータは、ＩｇＭイソタイプ対照へのノーマライゼーション後に示される。

実施例１１：ＬＰＳ誘導ＴＮＦαシェディングｉｎ ｖｉｔｒｏに対する本発明の抗体４Ｈ８－Ｅ３の阻害効果の分析。

以下の研究では、ＥＬＩＳＡベースのＴＮＦα放出アッセイを実施して、ヒトＴＨＰ－１マクロファージ細胞からの内因性ＴＮＦαのＬＰＳ誘導放出に対する本発明の精製抗体４Ｈ８－Ｅ３の阻害効果を検証した。

簡単に説明すると、１日目に、Ｎｕｎｃ ｂｌａｃｋ ＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）９６－ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）を、４μｇ／ｍｌのＴＢＳでマウス抗ヒトＴＮＦα捕捉抗体（ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキットの一部として提供される）のウェルあたり１００μｌでオーバーナイトコーティングした。２日目に、捕捉抗体溶液を除去し、ＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）プレートをウェルあたりＴＢＳ３００μｌ中１％のＢＳＡで室温で３時間ブロックした。一方、Ｇｒｅｉｎｅｒ ＣＥＬＬＳＴＡＲ Ｖ－ｂｏｔｔｏｍ ９６－ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ＵＳＡ）の各ウェルに正常増殖培地８０μｌ中の２０，０００個のＴＨＰ－１（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＵＳＡ）細胞をそれぞれのウェルに播種し、陽性対照としてバチマスタット（ＢＢ９４、Ａｂｃａｍ、ＵＫ）を５０μＭ添加した標準増殖培地（最終濃度１０μＭで試料体積）、イソタイプ対照としてマウスＩｇＭ抗体（クローンＰＦＲ－０３、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）を５０μｇ／ｍｌ（最終濃度１０μｇ／ｍｌで試料体積１００μｌ）または本発明の精製抗体４Ｈ８－Ｅ３を５０μｇ／ｍｌ（最終濃度１０μｇ／ｍｌで試料体積１００μｌ）で３７^ｏＣ、５％ＣＯ_２、３０分間プレインキュベーションした。

刺激対照の場合は、被験物質を含まない標準増殖培地２０μｌを加えた。その後、細胞（非刺激対照を除く）を、ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）を３００ｎｇ／ｍｌの増殖培地で最終濃度５０ｎｇ／ｍｌになるように１ウェルあたり２０μｌで３７℃、５％ＣＯ_２で２時間刺激した。その後、９６－ウェルプレートを細胞を沈殿させるために遠心分離した。並行して、ブロッキング緩衝液をＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）プレートから除去し、９６ヘッドプレート洗浄器（スイス、テカングループ）上で１ウェルあたり３５０μｌのＴＢＳ－Ｔ（ドイツ、カール・ロス）でプレートを４回洗浄した。乾燥を避けるため、直ちにＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）プレートの各ウェルにＴＢＳ ３０μｌを添加した後、試料あたり無細胞上清７０μｌを移した。さらに、ＴＢＳで規定濃度に希釈した組換えヒトＴＮＦαタンパク質（ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキットの一部として提供）１００μｌを標準参照としてプレートに添加した。

その後、５０ｎｇ／ｍｌのＴＢＳでビオチン化ヤギ抗ヒトＴＮＦα検出抗体（ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキットの一部として提供）を１ウェルあたり１００μｌ添加し、直接光から保護し、プレートを室温で２時間インキュベートした。９６－ｈｅａｄ ｐｌａｔｅ ｗａｓｈｅｒ（Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ）上でＴＢＳ－Ｔ （Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ、ドイツ）１ウェルあたり３５０μｌで４回洗浄し、４サイクル目以降は緩衝液の痕跡をすべて注意深く除去した後、ＴＢＳ中で１：１０，０００に希釈したストレプトアビジン－ＡＰ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）１００μｌを各ウェルに添加し、再び直接光から保護し、プレートを室温で３０分間インキュベートした。９６－ｈｅａｄ ｐｌａｔｅ ｗａｓｈｅｒ（Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）上でＴＢＳ－Ｔ（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ、ドイツ）１ウェルあたり３５０μｌで４回再洗浄し、４サイクル目以降は緩衝液の痕跡をすべて注意深く除去した後、室温暗所で１時間インキュベートするため、ＡｔｔｏＰｈｏｓ基質溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）１００μｌを添加した。ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００ ＰＲＯ（Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ、スイス）マイクロプレートリーダーを用いて、各ウェルの蛍光を励起波長４３５ｎｍ、発光波長５５５ｎｍで収集した。

図６は、絶対数（図６Ａ）およびパーセント阻害（図６Ｂ）でのＴＨＰ－１細胞からのＬＰＳ誘導性ＴＮＦα放出に対する被験物質の効果を示すこの実験の代表的な結果を示す。メタロプロテアーゼの小分子阻害剤としてのバチマスタット（ＢＢ９４）は陽性対照として働き、ＬＰＳの９２．５％の阻害がＴＮＦαの放出を誘発するが、ＩｇＭイソタイプ対照の存在はＴＮＦαのシェディングに有意な影響を及ぼさない。対照的に、本発明の精製抗体４Ｈ８－Ｅ３の等濃度は、ＴＨＰ－１細胞からのＬＰＳ誘導性ＴＮＦαの放出を６２．６％阻害する。

実施例１２：ＬＰＳ誘導ＴＮＦαシェディングｉｎ ｖｉｔｒｏに対する本発明の抗体４Ｈ８－Ｅ３のＩＣ５０の測定

機能性分析を拡大し、ＥＬＩＳＡベースのＴＮＦα放出アッセイを実施して、ヒトＴＨＰ－１マクロファージ細胞からの内因性ＴＮＦαのＬＰＳ誘導放出に対する本発明の精製抗体４Ｈ８－Ｅ３の半減最大阻害濃度（ＩＣ５０）を決定した。

簡単に説明すると、１日目に、Ｎｕｎｃ ｂｌａｃｋ ＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）９６－ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ＵＳＡ）を、４μｇ／ｍｌのＴＢＳでマウス抗ヒトＴＮＦα捕捉抗体（ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキットの一部として提供される）をウェルあたり１００μｌで４℃でオーバーナイトコーティングした。２日目に、捕捉抗体溶液を除去し、ＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）プレートをウェルあたり３００μｌ ＴＢＳ中１％のＢＳＡで室温で３時間ブロックした。一方、正常増殖培地の８０μｌのＧｒｅｉｎｅｒ ＣＥＬＬＳＴＡＲ Ｖ－ｂｏｔｔｏｍ ９６ウェルプレート（米国サーモフィッシャーサイエンティフィック社）の各ウェルに２０，０００ ＴＨＰ－１（米国タイプカルチャーコレクション）細胞を播種し、本発明の精製抗体４Ｈ８－Ｅ３、４００．００μｇ／ｍｌ，３０７．６９μｇ／ｍｌ，２３６．６８μｇ／ｍｌ，１８２．０６μｇ／ｍｌ，１４０．０５μｇ／ｍｌ，１０７．７３μｇ／ｍｌ，８２．８７μｇ／ｍｌ，６３．７４μｇ／ｍｌ，４９．０３μｇ／ｍｌ，３７．７１μｇ／ｍｌ，２９．０１μｇ／ｍｌ，２２．３１μｇ／ｍｌ，１７．１６μｇ／ｍｌ，１３．２０μｇ／ｍｌ，１０．１５μｇ／ｍｌ，７．８１μｇ／ｍｌ，６．０１μｇ／ｍｌ，４．６２μｇ／ｍｌ，３．５５μｇ／ｍｌ，２．７３μｇ／ｍｌ，２．１０μｇ／ｍｌ，１．６１μｇ／ｍｌ，１．２４μｇ／ｍｌ，０．９５μｇ／ｍｌ，０．７３μｇ／ｍｌ，０．５６μｇ／ｍｌ，ａｎｄ０．４３μｇ／ｍｌ（１００μｌの試料体積ではそれぞれ最終濃度約８０．００μｇ／ｍｌ，６１．５３μｇ／ｍｌ，４７．３３μｇ／ｍｌ，３６．４１μｇ／ｍｌ，２８．０１μｇ／ｍｌ，２１．５４μｇ／ｍｌ，１６．５７μｇ／ｍｌ，１２．７４μｇ／ｍｌ，９．８０μｇ／ｍｌ，７．５４μｇ／ｍｌ，５．８０μｇ／ｍｌ，４．４６μｇ／ｍｌ，３．４３μｇ／ｍｌ，２．６４μｇ／ｍｌ，２．０３μｇ／ｍｌ，１．５６μｇ／ｍｌ，１．２０μｇ／ｍｌ，０．９２μｇ／ｍｌ，０．７１μｇ／ｍｌ，０．５４μｇ／ｍｌ，０．４２μｇ／ｍｌ，０．３２μｇ／ｍｌ，０．２４μｇ／ｍｌ，０．１９μｇ／ｍｌ，０．１４μｇ／ｍｌ，０．１１μｇ／ｍｌ，および０．０８μｇ／ｍｌ）をあたり２０μｌ補充した標準的な増殖培地ウェルを３７℃、５％ＣＯ_２で３０分間、プレインキュベートした。

その後、細胞（非刺激対照を除く）を、ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）を３００ｎｇ／ｍｌ増殖培地で最終濃度５０ｎｇ／ｍｌになるように１ウェルあたり２０μｌで、３７℃、５％ＣＯ_２で３時間刺激した。その後、９６－ウェルプレートを細胞を沈殿させるために遠心分離した。並行して、ブロッキング緩衝液をＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）プレートから除去し、９６ヘッドプレート洗浄器（スイス、テカングループ）上で１ウェルあたり３５０μｌのＴＢＳ－Ｔ（ドイツ、カール・ロス）でプレートを４回洗浄した。乾燥を避けるため、直ちにＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）プレートの各ウェルにＴＢＳ３０μｌを添加した後、試料あたり無細胞上清７０μｌを移した。さらに、ＴＢＳで規定濃度に希釈した組換えヒトＴＮＦαタンパク質（ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキットの一部として提供）１００μｌを標準参照としてプレートに添加した。その後、５０ｎｇ／ｍｌのＴＢＳでビオチン化ヤギ抗ヒトＴＮＦα検出抗体（ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキットの一部として提供）を１ウェルあたり１００μｌ添加し、直接光から保護し、プレートを室温で２時間インキュベートした。

９６－ｈｅａｄ ｐｌａｔｅ ｗａｓｈｅｒ （Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ）上でＴＢＳ－Ｔ （Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ、ドイツ）１ウェルあたり３５０μｌで４回洗浄し、４サイクル目以降は緩衝液の痕跡をすべて注意深く除去した後、ＴＢＳ中で１：１０，０００に希釈したストレプトアビジン－ＡＰ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）１００μｌを各ウェルに添加し、再び直接光から保護し、プレートを室温で３０分間インキュベートした。９６－ｈｅａｄ ｐｌａｔｅ ｗａｓｈｅｒ（Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）上でＴＢＳ－Ｔ（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ、ドイツ）１ウェルあたり３５０μｌで４回再洗浄し、４サイクル目以降は緩衝液の痕跡をすべて注意深く除去した後、室温暗所で１時間インキュベートするため、ＡｔｔｏＰｈｏｓ基質溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）１００μｌを添加した。ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００ ＰＲＯ（Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ、スイス）マイクロプレートリーダーを用いて、各ウェルの蛍光を励起波長４３５ｎｍ、発光波長５５５ｎｍで収集した。

図７にこの実験の代表的な結果を示す。本発明の精製抗体４Ｈ８－Ｅ３の力価は、ＴＨＰ－１細胞からのＴＮＦα放出の濃度依存的阻害をもたらす。Ｐｒｉｓｍ８ソフトウェア（米国ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア）を適用すると、本発明の抗体４Ｈ８－Ｅ３に対するそれぞれのＩＣ５０値は６．４８ｎＭと計算される。

文献

配列

下記の配列は、本出願の開示の一部を形成する。ＷＩＰＯ ＳＴ ２５互換性のある電子化配列表もまた、この出願と共に提供される。疑義を避けるため、以下の表中の配列と電子化配列表中の配列との間に齟齬が存在する場合、この表中の配列は正しいものとみなされるものとする。

Claims (23)

1. ヒトｉＲｈｏｍ２に結合し且つヒトｉＲｈｏｍ２に結合するとＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７活性を阻害および／または減少させるタンパク質バインダーであって、さらにＴＮＦαシェディングを阻害または減少させ、且つヒトｉＲｈｏｍ２の膜貫通ドメイン１（ＴＭＤ１）に隣接する膜近傍ドメインに結合し、膜近傍ドメインが配列番号１６のアミノ酸残基４３１～４５９を含む、タンパク質バインダー。
2. モノクローナル抗体、または標的結合能を保持するその標的結合断片もしくは誘導体、または抗体ミメティックである、請求項１に記載のタンパク質バインダー。
3. ＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７活性の阻害または減少が、ｉＲｈｏｍ２媒介ＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７活性化の干渉によって引き起こされる、請求項１または２に記載のタンパク質バインダー。
4. タンパク質バインダーが結合するヒトｉＲｈｏｍ２が、
   ａ）配列番号１６に記載のアミノ酸配列、または
   ｂ）配列番号１６と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、但し前記アミノ酸配列がｉＲｈｏｍ２活性を維持する、アミノ酸配列
   を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のタンパク質バインダー。
5. ａ）少なくとも配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むか、または
   ｂ）配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
   ヒトｉＲｈｏｍ２のアミノ酸配列に結合する、請求項１から４のいずれか一項に記載のタンパク質バインダー。
6. Ａ４３１、Ｑ４３２、Ｈ４３３、Ｖ４３４、Ｔ４３５、Ｔ４３６、Ｑ４３７、Ｌ４３８、Ｖ４３９、Ｌ４４０、Ｒ４４１、Ｎ４４２、Ｋ４４３、Ｇ４４４、Ｖ４４５、Ｙ４４６、Ｅ４４７、Ｓ４４８、Ｖ４４９、Ｋ４５０、Ｙ４５１、Ｉ４５２、Ｑ４５３、Ｑ４５４、Ｅ４５５、Ｎ４５６、Ｆ４５７、Ｗ４５８、Ｖ４５９からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基に結合し、前記アミノ酸残基の番号付けが配列番号１６（ヒトｉＲｈｏｍ２）に記載のアミノ酸配列を参照する、請求項１から５のいずれか一項に記載のタンパク質バインダー。
7. ヒトｉＲｈｏｍ１、又はその膜貫通ドメイン１（ＴＭＤ１）に隣接した膜近傍ドメインと交差反応性がない、請求項１から６のいずれか一項に記載のタンパク質バインダー。
8. ＩｇＧ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ）２からなる群より選択されるフォーマットの少なくとも１つにおける抗体である、請求項１から７のいずれか一項に記載のタンパク質バインダー。
9. ＩｇＧ、ＩｇＭからなる群より選択されるイソタイプを有する抗体である、請求項１から８のいずれか一項に記載のタンパク質バインダー。
10. マウス抗体、キメラ化抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である、請求項１から９のいずれか一項に記載のタンパク質バインダー。
11. 請求項１から１０のいずれか一項に記載のタンパク質バインダーであって、タンパク質バインダーが、
    ａ） 配列番号３３および４０に記載の重鎖／軽鎖可変領域配列対に含まれる一組の重鎖／軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むか；
    ｂ） 以下の配列
    ＨＣ ＣＤＲ１（配列番号３４）、
    ＨＣ ＣＤＲ２（配列番号３５）、
    ＨＣ ＣＤＲ３（配列番号３６）、
    ＬＣ ＣＤＲ１（配列番号４１）、
    ＬＣ ＣＤＲ２（配列番号４２）、および
    ＬＣ ＣＤＲ３（配列番号４３）、または、
    ＨＣ ＣＤＲ１（配列番号３７）、
    ＨＣ ＣＤＲ２（配列番号３８）、
    ＨＣ ＣＤＲ３（配列番号３９）、
    ＬＣ ＣＤＲ１（配列番号４４）、
    ＬＣ ＣＤＲ２（配列番号４５）、および
    ＬＣ ＣＤＲ３（配列番号４６）
    を含む一組の重鎖／軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むものであって、
    前記ＣＤＲが十分な結合親和性でヒトｉＲｈｏｍ２に結合し、ＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７活性を阻害または減少させることができるように、適当なタンパク質フレームワークに埋め込まれている、タンパク質バインダー。
12. フレームワークがヒトＶＨ／ＶＬフレームワークである、請求項１から１１のいずれか一項に記載のタンパク質バインダー。
13. 以下のａ）、ｂ）またはｃ）を含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載のタンパク質バインダー：
    ａ） 重鎖／軽鎖可変ドメイン（ＶＤ）
    ＨＣ ＶＤ（配列番号３３）、および
    ＬＣ ＶＤ（配列番号４０）、
    ｂ） ａ）の重鎖／軽鎖可変ドメイン（ＶＤ）であって、但しＨＣ ＶＤがそれぞれの配列番号３３に対して≧９０％の配列同一性を有し、かつ／またはＬＣ ＶＤがそれぞれの配列番号４０に対して≧９０％の配列同一性を有するものであって、ａ）の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（ＶＤ）のＣＤＲ内にアミノ酸変異は存在しないものであり、または
    ｃ） ａ）の重鎖／軽鎖可変ドメイン（ＶＤ）を有し、但し少なくともＨＣ ＶＤまたはＬＣ ＶＤの１つが、それぞれの配列番号３３および／または４０に対して最大１０アミノ酸置換を有するものであって、前記アミノ酸置換は、ａ）の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（ＶＤ）のＣＤＲ内に位置しないものであり、
    前記タンパク質バインダーは、十分な結合親和性でヒトｉＲｈｏｍ２に結合し、ＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７活性を阻害または減少させることが依然として可能であるタンパク質バインダー。
14. 少なくとも１つのアミノ酸置換が保存的アミノ酸置換である、請求項１３に記載のタンパク質バインダー。
15. タンパク質バインダーが、
    請求項１から１４のいずれか一項に記載のタンパク質バインダーの標的結合親和性と比較して、ＳＰＲにより測定される、ｉＲｈｏｍ２に対する≧５０％の標的結合親和性、および／または
    請求項１から１４のいずれか１つに記載のタンパク質バインダーのＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７活性に対する阻害または減少効果の≧５０％
    の少なくとも１つを有する、
    請求項１から１４のいずれか１項に記載のタンパク質バインダー。
16. 請求項１から１５のいずれか一項に記載のタンパク質バインダーと同じｉＲｈｏｍ２上のエピトープに結合するタンパク質バインダー。
17. モノクローナル抗体、または標的結合能を保持するその標的結合断片もしくは誘導体、または抗体ミメティックである、請求項８～１６のいずれか一項に記載のタンパク質バインダー。
18. 請求項１から１７のいずれか一項に記載のタンパク質バインダーをコードする核酸分子。
19. 炎症状態と診断されているか、炎症状態に罹患しているか、または炎症状態を発症するリスクがあると診断されているヒトまたは動物対象の治療、またはそのような状態の予防のための医薬の製造のための、請求項１～１６のいずれか一項のタンパク質バインダーの使用。
20. 請求項１～１６のいずれか一項に記載のタンパク質バインダー、および任意に１種以上の薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物。
21. １以上の治療的活性化合物と併用投与される、請求項２０に記載の医薬組成物。
22. 炎症状態を治療または予防するための医薬であって、（ｉ）請求項１～１６のいずれか一項に記載のタンパク質バインダー、または（ｉｉ）請求項２０または２１に記載の医薬組成物を含む医薬。
23. ａ）請求項１～１６のいずれか１項に記載のタンパク質バインダー、請求項２０または２１に記載の医薬組成物、
    ｂ）前記タンパク質バインダー、または前記医薬組成物を投与するための装置、および
    ｃ）使用説明書を含む、治療キット。

Images