KR102582417B1 - 인플라마솜 어댑터 단백질(asc)의 중합체화 도메인에 결합하는 신규한 폴리펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인플라마솜(Inflammasome, 염증조절복합체) 형성에 관여하는 어댑터 단백질인 ASC (Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD) 단백질 Pyrin 도메인에 결합하는 신규한 폴리펩타이드에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 사람의 인플라마솜 형성에 필수적으로 필요한 어댑터 단백질인 ASC에 결합하여 인플라마솜 형성을 효과적으로 저해함으로써 항 염증효능을 갖는 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터가 도입된 재조합 미생물, 상기 재조합 미생물을 이용한 상기 폴리펩타이드의 제조방법 및 상기 폴리펩타이드를 포함하는 치료용 의약 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 인플라마솜 어댑터 단백질 ASC의 pyrin 도메인에 결합하는 리피바디는 ASC단백질에 결합하여 인플라마솜의 형성을 효과적으로 저해함으로써 과도한 염증반응을 조절할 수 있기 때문에 다양한 자가면역 또는 염증성질환 치료제 개발에 널리 활용될 수 있어 유용하다.

Description

인플라마솜 어댑터 단백질(ASC)의 중합체화 도메인에 결합하는 신규한 폴리펩타이드 및 이의 용도 {Novel polypeptide binding with oligomerization domain of Inflammasome Adaptor protein Apoptosis-Associated Speck-like protein containing a CARD(ASC) and Uses thereof}

본 발명은 인플라마솜(Inflammasome, 염증조절복합체) 형성에 관여하는 어댑터 단백질인 ASC (Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD) 단백질 Pyrin 도메인에 결합하는 신규한 폴리펩타이드에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 사람의 인플라마솜 형성에 필수적으로 필요한 어댑터 단백질인 ASC에 결합하여 인플라마솜 형성을 효과적으로 저해함으로써 항 염증효능을 갖는 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터가 도입된 재조합 미생물, 상기 재조합 미생물을 이용한 상기 폴리펩타이드의 제조방법 및 상기 폴리펩타이드를 포함하는 치료용 의약 조성물에 관한 것이다.

인플라마솜은 생체 내의 면역반응 중 병원균, 바이러스, 화학물질 등에 대한 선천성 면역반응을 진행하는 거대한 단백질 복합체로 사이토카인 분비, 세포자살 등을 일으키는 일련의 단백질 군을 일컫는다. 이들은 외부물질에 대한 다양한 분자적 패턴(pathogen associated molecular pattern(PAMP), damage-associated molecular pattern(DAMP))을 인식하는 수용체 단백질에 의해 조절되며, 수용체 단백질은 인플라마솜을 구성하는 단백질들의 중합체화(oligomerization)을 촉진시킨다. 이는 사이토카인 분비와 염증성 반응으로 이어지게 된다.

인플라마솜은 카스파제-1-활성화 복합 단백질 복합체로, 1) 센서 단백질(sensor protein)인 NLRP3(NOD-like receptor family, pyrin domain-containing 3), 2) 어댑터 단백질(adaptor protein)인 ASC(adaptor protein apoptosis-associated spec-like protein containing a caspase-recruitment domain) 및 3) 이펙터 단백질인 프로카스파제-1로 구성된다. 상기한 인플라마솜 구성 성분들은 미생물의 감염이나 조직의 상해가 발생한 경우에 조립되는데, 시토졸에서 조립에 의해 활성화된 인플라마솜은 카스파제-1을 활성화시켜 인터루킨(IL)-1β 또는 인터루킨-18을 분비하여 숙주의 선천면역 방어기능을 수행한다(Schroder K, Tschopp J, Cell, Vol. 140, pp. 821-832, 2010; Franchi L et al., Nat Immunol, Vol. 13, pp. 325-332, 2012).

인플라마솜의 과도한 활성화는 염증성 질환의 병리기전에 핵심적으로 작용하며 최근 치매, 파킨슨병과 같은 퇴행성뇌질환에도 중추적인 역할을 하는 것으로 밝혀졌다(Voet, Sofie, et al., EMBO Molecular Medicine, Vol. 11, e1024, 2019). 인플라마솜의 형성 및 관련 신호전달을 차단할 경우 자가면역 뇌척수염, 류마티스성 관절염, 다발성 경화증, 염증성 장질환, 통풍, 복막염, 크리오피린 관련 주기적 증후군(CAPS), 알츠하이머 등의 질병에 효과적인 치료법이 될 수 있음이 동물실험과 임상실험을 통해 증명되었다(Swanson, K. V. et al., Nature Reviews Immunology, Vol. 19, pp. 477-489, 2019; Guo, H. et al., Nature medicine, Vol. 21, pp. 677-687, 2015). 따라서, 인플라마솜을 저해하는 전략은 폭넓은 적용병증과 높은 효능을 가질 수 있다는 점에서 자가면역 및 염증성질환 치료제 개발에 효과적인 전략으로 알려져 있다.

인플라마솜에 의한 신호전달을 저해할 수 있는 약물로는 본래 관절염 치료제로 개발된 아나킨라(Anakinra)가 있으나, 이 약물은 인플라마솜이 이미 형성된 후 분비된 사이토카인에 대한 길항제이기 때문에 인플라마솜 형성을 차단할 수 없으며 치료비용이 1년에 3천만원정도로 매우 고가이다. 따라서 환자부담을 경감시킬 수 있고, 근본적으로 인플라마솜 형성을 막아줄 수 있는 치료제가 절실히 요구되고 있는 실정이다.

본 발명자들은 기존의 항체를 대체할 수 있는 비 항체 단백질 골격 (non-antibody protein scaffold)인 리피바디 (repebody)를 성공적으로 개발하였다. 리피바디는 크기가 항체의 1/5 수준이고 대장균에서 대량생산 되며 동물 실험결과 면역원성 또한 매우 낮았다. 해당 단백질 골격은 열 및 pH 안정성이 매우 우수하고 타겟에 대한 결합력을 pico-mole 수준까지 매우 용이하게 증대시킬 수 있으며 타겟에 대한 특이성이 매우 탁월함을 입증한 바가 있다.

본 발명자들은 다양한 단백질에 대해 특이적으로 결합가능한 리피바디(Repebody)라는 폴리펩타이드를 개발한 바 있으며 (대한민국 특허 제10-1356075호, 제10-1654890호, 제10-1587622호, 제10-1624702호, 제10-1624703호, 제10-1713944호, 제10-1751501호, 제10-1818152호 및 제10-1875809호), 상기 리피바디 골격을 이용하여 다양한 질환 관련 표적 단백질들에 대한 특이적인 결합 단백질 (Specific protein binder)을 성공적으로 제조하고, 세포 기반의 방법으로 생물학적인 저해효과가 있음을 검증하였고, 추가적인 연구를 활발히 진행하고 있다.

이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 상기 리피바디 골격을 이용하여 다양한 염증질환 치료의 중요한 표적인 인플라마솜 형성을 저해할 수 있는 단백질을 성공적으로 확보하기 위해 예의 노력한 결과, 리피바디의 구조적 특징인 모듈성과 전체구조분석을 통해 구축한 무작위한 돌연변이 라이브러리를 바탕으로 인플라마솜 형성의 매개체 역할을 하는 ASC에 대해 특이적으로 결합하는 신규 폴리펩타이드를 선별하고 생산하였으며, 상기 리피바디가 ASC에 특이적으로 결합하여 인플라마솜 복합체 형성을 저해함으로써 효과적으로 항염증반응을 나타내는 것을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 인플라마솜 어댑터 단백질에 특이적으로 결합하는 리피바디(Repebody); 상기 리피바디를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터; 상기 재조합 벡터가 도입된 재조합 미생물; 및 상기 재조합 미생물을 이용해 상기 리피바디를 생산하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 리피바디를 함유하는 자가면역질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물 및 상기 리피바디를 함유하는 자가면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 자가면역 질환 또는 염증성 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2 또는 3의 아미노산 서열로 표시되고, 인플라마솜 어댑터 단백질(Inflammasome Adaptor protein Apoptosis-Associated Speck-like protein containing a CARD, ASC)에 특이적으로 결합하는 리피바디(Repebody)를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 리피바디를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 재조합 벡터가 포함되어 있는 재조합 미생물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 재조합 미생물을 배양하여 상기 리피바디를 생성시키는 단계 및 상기 생성된 리피바디를 회수하는 단계를 포함하는 리피바디의 제조방법을 제공한다

본 발명은 또한, 상기 인플라마솜 어댑터 단백질에 특이적으로 결합하는 리피바디를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환 또는 염증성 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 인플라마솜 어댑터 단백질 ASC의 pyrin 도메인에 결합하는 리피바디는 ASC단백질에 결합하여 인플라마솜의 형성을 효과적으로 저해함으로써 과도한 염증반응을 조절할 수 있기 때문에 다양한 자가면역 또는 염증성질환 치료제 개발에 널리 활용될 수 있어 유용하다.

도 1은 인플라마솜 형성에 필수적인 ASC단백질 Pyrin 도메인에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드를 선별하기 위해 무작위적인 라이브러리를 구축한 아미노산 잔기들을 표시한 리피바디(repebody)의 전체 구조를 나타내는 개략도이다.
도 2는 본 발명에서 구축한 파지 라이브러리를 이용하여, ASC에 대한 파지디스플레이를 통한 바이오 패닝 수행 후 일차적으로 선별한 리피바디 클론의 결합력을 등온 열량 적정계 (Isothermal titration calorimetry; ITC)를 이용하여 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 3은 일차적으로 선별한 리피바디 클론으로부터 결합력 증대를 위해 구축한 파지 라이브러리를 이용하여, ASC에 대한 바이오 패닝을 수행한 후 선별한 클론들에 대해 효소면역측정법 (ELISA) 결과를 나타내는 도면이다. 일차 선별 클론에 대한 결합력 향상 정도를 비교하기 위해 BSA 대비 ASC단백질에 대한 결합신호를 평균화 (Normalization) 하였으며, 이때 가장 결합력 향상이 높게 관찰된 클론 B7을 최종 선별하였다.
도 4는 ASC와 특이적으로 결합하는 최종 리피바디 클론(B7)의 결합력을 등온 적정열량계를 통해 측정한 결과를 나타내는 도면으로, 왼쪽 패널은 적정결과이며, 오른쪽 패널은 피팅을 통해 도출된 결합력(해리상수 약 4nM)을 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명에서 선별한 B7 리피바디가 ASC와 안정되게 결합할 수 있음을 확인한 크기 배제 크로마토그래피 (Size Exclusion Chromatography) 결과를 나타내는 도면이다.
도 6은 본 발명에서 선별한 B7 리피바디가 ASC와의 결합을 통하여 인플라마솜 형성에 필수적인 ASC의 중합체화 (Oligomerization)를 효과적으로 저해하는 것을 형광 공명에너지전달(Fluorescence Resonance Energy Transfer) 기법을 이용하여 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 7은 본 발명에서 선별한 B7 리피바디가 ASC의 Pyrin 도메인과의 결합을 통해 인플라마솜 형성에 필수적인 ASC중합체를 해리시키는 것을 시간대별 가교반응(Cross-linking) 및 웨스턴 블랏(western blot)을 통해 확인한 실험 결과로서, 위쪽 패널은 가교반응 처리한 ASC중합체, 아래쪽 패널은 B7 리피바디 처리시 ASC중합체가 시간에 따라 빠르게 낮은 분자량으로 해리되는 것을 나타내는 도면이다.
도 8은 본 발명에서 선별한 B7 리피바디를 면역세포에 처리한 후 ASC 중합체 가교반응 및 웨스턴 블랏을 통해 인플라마솜의 해리(dissociation)를 촉진하고 염증반응을 효과적으로 저해한다는 실험 결과를 나타내는 도면이다.
도 9는 본 발명에서 선별한 B7 리피바디를 처리한 면역세포에서 염증반응을 일으키는 주요한 단백질 분해효소인 카스파아제-1(Caspase-1)의 활성이 감소하는 것을 웨스턴 블랏을 통해 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 10은 본 발명에서 선별한 B7 리피바디를 처리한 면역세포에서 염증반응을 일으키는 주요한 단백질 분해효소인 카스파아제-1(caspase-1)의 효소 활성이 감소하는 것을 형광 신호를 통해 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 11은 본 발명에서 선별한 B7 리피바디를 농도별로 면역세포에 처리할 경우 염증반응 활성화의 지표로 사용되는 사이토카인인 인터류킨-1b(Interleukin-1b, IL-1b)가 효과적으로 감소하는 것을 나타낸 도면이다.
도 12는 본 발명에서 선별한 B7 리피바디를 면역세포에 처리할 경우 염증 반응에 의한 세포 죽음인 파이롭토시스(Pyroptosis)의 지표로 사용되는 젖산탈수소효소의 세포외 방출(LDH release)을 방지하는 것을 확인한 실험 결과를 나타내는 도면이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명에서는, 인플라마솜 어댑터 단백질의 pyrin 도메인에 특이적으로 결합하는 리피바디를 선별하고, 상기 리피바디의 항염증 효과를 확인하고자 하였다.

본 발명에서는, 리피바디 개발을 위한 라이브러리에 포함된 폴리펩타이드에서 바이오패닝을 통해 ASC의 pyrin 도메인에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드의 선별을 수행하고, 이들의 결합력을 개선하는 작업을 수행하였다. 그 결과 ASC 단백질의 pyrin 도메인에 특이적인 리피바디를 제조하였다.

즉, 본 발명의 일 실시예에서는 인플라마솜 어댑터 단백질(ASC)의 pyrin 도메인에 특이적으로 결합할 수 있는 신규한 리피바디를 개발하기 위하여, 인터날린 B (Internalin B) 단백질의 Ｎ-말단, 가변 림프구 수용체(Variable Lymphocyte Receptor, VLR) 의 LRR (Leucine-rich repeat) 단백질 부분이 융합된, 폴리펩타이드의 반복 모듈을 무작위적으로 포함하는 라이브러리를 구축하였다(도 1). 상기 라이브러리에 포함된 폴리펩타이드는 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드 서열에 의하여 코딩되거나 또는 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드 서열과 75%, 바람직하게는 85%, 보다 바람직하게는 90%, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의하여 코딩될 수 있다.

또한, 상기 라이브러리는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 파지미드의 형태가 될 수 있다. 본 발명의 용어 "파지미드"란, 대장균을 숙주로 하는 바이러스인 파지로부터 유래된 원형의 폴리뉴클레오타이드 분자를 의미하는데, 번식과 증식에 필요한 단백질 및 표면 단백질들의 서열이 포함되어 있다. 재조합 파지미드는 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용하여 수행될 수 있다. 상기 파지미드는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 인핸서 같은 발현 조절 요소 외에도 분비를 위한 신호 서열 또는 리더 서열을 포함할 수 있고, 주로 원하는 단백질을 파지의 표면 단백질과 융합하여 파지 표면에 표지하기 위한 방법에 사용될 수 있다. 파지미드의 프로모터는 주로 유도성이며, 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함할 수도 있다. 본 발명의 목적상 상기 파지미드는 상기 라이브러리를 구성하는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 발현 및 분비하기 위한 신호 서열 또는 리더 서열인 MalEss, DsbAss 또는 PelBss를 포함하고, 파지의 표면에 재조합 단백질의 발현을 확인하기 위한 히스티딘-태그와 파지 표면으로의 발현을 위한 M13 파지의 표면 단백질의 일종인 gp3 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 본 발명자의 선행 특허 (제10-2012-0019927호)에 기술된 서열번호 2의 폴리뉴클레오타이드가 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 용어 “ 단백질의 Pyrin 도메인”은 인플라마솜의 형성에 필수적인 ASC 단백질의 중합체화를 일으키기 위해 필요한 아미노 말단(N-terminal)의 도메인을 의미한다. ASC (Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD)는 PYCARD라고도 명명되며 주로 대식세포나 단핵구에서 매개되는 선천성 면역반응, 특히나 염증반응을 조절해주는 단백질이다. 병원균의 침입, 바이러스 및 외부물질 등 위해가 될 수 있는 인자들을 세포가 인식할 경우, 수용체 단백질에 의해 어댑터 단백질인 ASC가 중합체를 형성하고 이를 축으로 인플라마솜 (Inflammasome)이 조립되게 된다.

이러한 염증반응 신호전달의 과도한 활성은 자가면역질환 및 제2형 당뇨, 다발성 경화증, 알츠하이머, 죽상경화증 등의 다양한 염증질환을 유발한다. 따라서, ASC 단백질의 중합체 형성에 핵심 역할을 하는 Pyrin 도메인의 작용을 조절하면 이러한 과도한 염증을 효과적으로 해결할 수 있다.

본 발명자들은 상기 파지미드를 포함하는 라이브러리를 이용한 파지 디스플레이 방법을 사용하여 ASC 단백질의 pyrin 도메인에 대한 결합력이 우수한 리피바디 형태의 신규한 폴리펩타이드(서열번호 2)를 선별하였다(도 1, 도 2). 그러나, 선별된 폴리펩타이드는 결합력이 낮은 수준이어서(도 2), 상기 선별된 폴리펩타이드에 돌연변이를 가하여 ASC 단백질의 pyrin 도메인에 대한 결합력이 향상된 변이 폴리펩타이드를 제작하고자 하였다. 이를 위하여, 상기 선별된 서열번호 2를 대상으로 LRRV1 모듈에 위치한 아미노산 잔기 4개를 돌연변이 시킨 두 번째 라이브러리를 구축하고, 상기 두 번째 라이브러리를 이용한 파지 디스플레이 방법을 사용하여 ASC 단백질의 pyrin 도메인에 대한 결합력이 증대된 신규한 폴리펩타이드(서열번호 3)를 최종 선별하였다(도 3).

따라서, 본 발명은 일 관점에서,

서열번호 2 또는 3의 아미노산 서열로 표시되고, 인플라마솜 어댑터 단백질(Inflammasome Adaptor protein Apoptosis-Associated Speck-like protein containing a CARD, ASC)에 특이적으로 결합하는 리피바디(Repebody)에 관한 것이다.

본 발명의 용어 "리피바디 (Repebody)"란, LRR 구조를 갖는 인터날린의 N-말단과 VLR의 구조의 유사성을 바탕으로 융합하여 컨센서스 디자인으로 최적화시킨 폴리펩타이드이다. 리피바디 단백질은 구조상 오목한 지역(Concave)과 볼록한 지역(Convex)으로 나누어 질 수 있다. 여기서 오목한 지역은 서열의 다양성이 높으며 단백질 상호작용에 중요한 부위로 알려져 있다. 이와 반대로 볼록한 지역은 보존성이 높은 서열을 바탕으로 단백질의 전체구조를 안정하게 유지하는 역할을 수행한다. 리피바디 단백질은 반복 모듈을 갖는 LRR 패밀리에 속하는 모든 단백질을 상기 방법으로 수용성 발현 및 단백질의 생물리화학적 성질을 향상 시킨 모든 융합 LRR 패밀리 단백질을 모두 포함할 수 있다.

본 발명에서, 상기 인터날린 단백질은 바람직하게는 인터날린 A, 인터날린 B, 인터날린 C, 인터날린 H 및 인터날린 J로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 인터날린 B 단백질인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 용어 "인터날린 B 단백질"이란, 리스테리아 (Listeria) 균주에서 발현되는 LRR 패밀리 단백질의 일종을 의미하는데, 다른 소수성 코어가 전 분자에 걸쳐서 일정하게 분포되어 있는 다른 LRR 패밀리 단백질들과는 다른 유형의 N-말단 구조 때문에 미생물에서도 안정적으로 발현되는 것으로 알려져 있다. 이러한 인터날린 단백질의 N-말단은 반복 모듈의 접힘 (Folding)에 가장 중요한 N-말단 부위가 미생물 유래일 뿐 아니라 그 형태가 알파 나선을 포함하는 더욱 안정적인 구조를 포함하므로, 미생물에서 LRR 패밀리 단백질들의 안정적인 발현을 위하여 효과적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 용어, "인터날린 단백질의 N-말단"은 단백질의 수용성 발현 및 접힘에 있어서 필요한 인터날린 단백질의 N-말단을 의미하며 알파 나선형 캡핑 모티프 (capping motif) 및 인터날린 단백질의 반복 모듈을 의미한다. 인터날린 단백질의 N-말단은 단백질의 수용성 발현 및 접힘에 있어서 필요한 인터날린 단백질의 N-말단은 제한 없이 포함되나, 그 예로 알파 나선형 캡핑 모티프인 "ETITVSTPIKQIFPDDAFAETIKANLKKKSVTDAVTQNE"(서열번호 4) 및 반복 모듈을 포함할 수 있다. 바람직하게 반복 모듈 패턴은 "LxxLxxLxLxxN" (서열번호 5)을 포함할 수 있다. 상기 반복 모듈 패턴 중 L은 알라닌, 글리신, 페닐알라닌, 티로신, 루이신, 이소루이신, 발린 또는 트립토판; N은 아스파라진, 글루타민, 세린, 시스테인 또는 트레오닌, x는 친수성 아미노산을 의미한다. 인터날린 단백질의 N-말단은 융합될 수 있는 LRR 패밀리 단백질의 종류에 따라 높은 구조 유사도를 갖는 N-말단이 선택될 수 있으며 결합 에너지 등의 계산을 통해 가장 안정적인 아미노산을 선택하여 해당 모듈의 아미노산의 변이가 가능하다.

본 발명의 용어 "가변 림프구 수용체 (Variable Lymphocyte Receptor, VLR)"란, 먹장어와 칠성 장어에서 발현되는 LRR 패밀리 단백질의 일종을 의미하는데, 먹장어와 칠성 장어에서 면역 기능을 수행하는 단백질로서 다양한 항원 물질에 결합할 수 있는 골격으로 유용하게 사용될 수 있다. 상기 인터날린 B 단백질의 N-말단 및 VLR 단백질이 융합된 폴리펩타이드는 인터날린 B 단백질이 융합되지 않은 VLR 단백질보다 수용성 및 발현양이 증가하므로, 이를 기반으로 한 신규한 단백질 치료제의 제조에 사용될 수 있다.

본 발명의 용어 "LRR (Leucine rich repeat) 단백질"이란, 루이신이 일정한 위치에 반복되는 모듈의 조합으로 이루어진 단백질을 의미하는 것으로, (i) 하나 이상의 LRR 반복 모듈을 갖고 있고, (ii) 상기 LRR 반복 모듈은 20 내지 30개의 아미노산으로 이루어져 있고, (iii) LRR 반복 모듈은 보존 패턴으로 "LxxLxxLxLxxN"을 갖고 있으며, 여기서 L은 알라닌, 글리신, 페닐알라닌, 티로신, 루이신, 이소루이신, 발린 및 트립토판과 같은 소수성 아미노산을, N은 아스파라진, 글루타민, 세린, 시스테인 또는 쓰레오닌을, x는 모든 종류의 20가지의 아미노산을 의미하며, (iv) LRR 패밀리 단백질은 말발굽과 같은 삼차원 구조를 갖는 구조를 갖고 있는 단백질을 의미한다. 본 발명의 LRR 패밀리 단백질은 이미 그 서열이 알려져 있거나, 생체에서 새로 유도된 mRNA나 cDNA를 이용하여 찾아낸 것뿐 아니라, 컨센서스 디자인 (Consensus design) 등의 설계를 통하여 자연계에 알려지지 않은 서열을 가지면서 반복모듈의 골격 구조가 있는 변이체를 모두 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 리피바디는 ASC의 pyrin 도메인에 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서, 상기 리피바디는 ASC의 pyrin 도메인에 결합하여 인플라마솜 형성을 저해하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, 상기 리피바디를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다.

본 발명에서 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 서열번호 2 또는 3의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 될 수 있고, 상기 폴리뉴클레오타이드와 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 가지는 염기 서열을 가지는 폴리뉴클레오타이드일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.

본 발명의 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 벡터는 적당한 숙주 내로 형질 전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 벡터는 숙주 중에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며 당 업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, λλλλλλλCharon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다. 바람직하게는 pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC, pET-21a, pET-32a 벡터 등을 사용할 수 있다. 가장 바람직하게는 pET-21a, pET-32a 벡터를 사용할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물에 관한 것이다.

본 발명의 용어 "재조합 미생물"이란, 하나 이상의 목적 단백질을 암호화하는 유전자를 갖는 벡터가 숙주세포에 도입되어 목적 단백질을 발현시키도록 형질이 감염된 세포를 의미하며, 진핵세포, 원핵세포 등의 모든 세포가 될 수 있는데, 특별히 이에 제한되지 않으나, 대장균, 스트렙토미세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 효모 세포; 피치아 파스토리스 등의 균류 세포; 드로조필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO, COS, NSO, 293, 보우 멜라노마 세포 등의 동물 세포; 또는 식물 세포가 될 수 있다. 본 발명에서 사용 가능한 숙주세포는 특별히 제한되는 것이 아니나, 바람직하게는 대장균을 숙주 세포로 사용할 수 있다. 가장 바람직하게는 대장균 BL21(DE3), OrigamiB(DE3)를 숙주 세포로 사용할 수 있다.

본 발명에서 용어 "형질전환"이란, 표적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 숙주 세포 내에 도입하여 숙주 세포 내에서 상기 폴리뉴클레오타이드가 암호화하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질 전환된 폴리뉴클레오타이드는 숙주 세포 내에 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하든지 상관없이 이들 모두를 포함한다. 또한, 상기 폴리뉴클레오타이드는 표적 단백질을 암호화하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오타이드는, 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트 (Expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결 신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함한다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오타이드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어, 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, (i) 상기 재조합 미생물을 배양하여 리피바디를 생성시키는 단계; 및 (ii) 상기 생성된 리피바디를 회수하는 단계를 포함하는 상기 리피바디의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 미생물을 배양하는 단계는 특별히 이에 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행됨이 바람직하고, 배양조건은 특별히 이에 제한되지 않으나, 염기성 화합물(예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물(예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH(pH 5 내지 9, 바람직하게는 pH 6 내지 8, 가장 바람직하게는 pH 6.8)를 조절할 수 있고, 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물을 배양물에 도입시켜 호기성 조건을 유지할 수 있으며, 배양온도는 20 내지 45℃바람직하게는 25 내지 40℃를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160 시간동안 배양함이 바람직하다. 상기 배양에 의하여 생산된 상기 폴리펩타이드는 배지중으로 분비되거나 세포내에 잔류할 수 있다.

아울러, 사용되는 배양용 배지는 탄소 공급원으로는 당 및 탄수화물(예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방(예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산(예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알콜(예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산(예: 아세트산) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있고; 질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물(예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물(예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으며; 인 공급원으로서 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유 염 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있고; 기타 금속염(예: 황산마그네슘 또는 황산철), 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 배양 단계에서 생산된 리피바디를 회수하는 방법은 배양방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 폴리펩타이드를 수집할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 인플라마솜 어댑터 단백질에 특이적으로 결합하는 리피바디를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환 또는 염증성 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 자가면역질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료는 상기 리피바디가 ASC 단백질의 pyrin 도메인에 결합하여 이루어지는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 자가면역질환은 그레이브스병, 류마티스 관절염, 하시모토 갑상선염, 제1형 당뇨병, 전신성 홍반루푸스(루푸스), 혈관염, 애디슨병, 다발근육염, 쇼그렌 증후군, 진행성 전신성 경화증, IgA 신병증, 피부근염, 경피증, 베체트병, 강직성 척추염, 궤양성 대장염, 백반증, 섬유근육통 증후군, 크론병, 중증근무력증, 염증성 콜라겐 혈관 질환, 결절성 다발동맥염, 기쿠치병, 건선, 척-스트라우스 증후군, 헤노흐-쉔라인 자반증, 굿파스처 증후군, 셀리악병, 베게너육아종증, 아토피성 피부염, 근육성 이영양증, 포도막염, 타카야수 동맥염, 아프타구내염, 천포창 및 길랑 바레 증후군으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 염증성 질환은 사구체신염, 염증성 피부 질환, 유육종증, 위염, 간염, 장염, 관절염, 편도선염, 인후염, 기관지염, 폐렴, 췌장염, 패혈증, 방광염, 신장염, 신경염, 동맥경화증, 비만, 염증성 장질환(inflammatory bowel disease; IBD), 알츠하이머 병 (Alzheimer's disease), 다발성경화증(multiple sclerosis), 결핵, 유육종증 (sarcoidosis), 담낭염, 진균성 감염증, 위궤양, 천식, 스티븐스-존슨 증후군 및 건염 으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어 "치료"란 조성물의 투여로 자가면역질환 또는 염증성 질환이나 그로부터 야기된 하나 또는 그 이상의 증상을 억제하거나 완화하는 것뿐만 아니라 질환의 증상을 반전시키는 질환의 치료 또는 질환의 진행을 방지하는 것을 의미한다. 본 발명에서 용어 "예방"이란 조성물의 투여로 자가면역질환 또는 염증성 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 본 발명에서 자가면역질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료는 본 발명에서 확보한 리피바디가 ASC 단백질의 pyrin 도메인과 결합하여 이루어지는 것으로, ASC 단백질의 pyrin 도메인에 결합하여 그의 활성을 유의하게 억제하여 자가면역질환 또는 염증성 질환을 예방 또는 치료하는 것이다.

본 발명의 상기 리피바디를 유효성분으로 함유하는 자가면역질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 담체와 함께 제제화될 수 있다.

본 발명에서 용어, "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

본 발명의 상기 리피바디 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 자가면역질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 이를 유효성분으로 포함하는 어떠한 제형으로도 적용가능하며, 경구용 또는 비경구용 제형으로 제조할 수 있다. 본 발명의 약학적 제형은 구강(oral), 직장(rectal), 비강(nasal), 국소(topical; 볼 및 혀 밑을 포함), 피하, 질(vaginal) 또는 비경구(parenteral; 근육내, 피하 및 정맥내를 포함) 투여에 적당한 것 또는 흡입 (inhalation) 또는 주입(insufflation)에 의한 투여에 적당한 형태를 포함한다.

본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 경구 투여용 제형으로는, 예를 들어 정제, 트로키제, 로렌지, 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제로 제제화할 수 있다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제, 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제, 스테아르산 마스네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유를 포함할 수 있으며, 캡슐제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를 더 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 비경구 투여용 제형으로는, 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사 등의 주사용 형태, 좌제 주입방식 또는 호흡기를 통하여 흡입이 가능하도록 하는 에어로졸제 등 스프레이용으로 제제화할 수 있다. 주사용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다. 좌제로 주입하기 위해서는, 코코아버터 또는 다른 글리세라이드 등 통상의 좌약 베이스를 포함하는 좌약 또는 관장제와 같은 직장투여용 조성물로 제제화할 수 있다. 에어로졸제 등의 스프레이용으로 제형화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합될 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 리피바디를 유효성분으로 함유하는 자가면역질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 자가면역질환 또는 염증성 질환을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 약제학적 조성물을 도입하는 것을 의미한다. 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 구체적으로, 구강, 직장, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 경피, 비측내, 흡입, 안구 내 또는 피내경로를 통해 통상적인 방식으로 투여될 수 있다.

본 발명의 치료방법은 본 발명의 자가면역질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다. 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다. 따라서 본 발명의 목적에 적합한 자가면역질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물의 유효량은 전술한 사항을 고려하여 결정하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 치료 방법은 인플라마솜의 과도한 활성으로 인하여 질병이 발생할 수 있는 임의의 동물에 적용가능하며, 동물은 인간 및 영장류뿐만 아니라, 소, 돼지, 양, 말, 개 및 고양이 등의 가축을 포함한다.

실시예

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: ASC의 Pyrin도메인에 특이적으로 결합하는 리피바디 선별을 위한 라이브러리 구축

인플라마솜 어댑터단백질 ASC의 Pyrin도메인에 특이적으로 결합하는 리피바디 선별을 위해 선행특허(제10-2012-0019927호)에서 이미 구축한 라이브러리 파지를 이용하여 파지 디스플레이를 수행하였다(도 1). 도 1은 무작위적인 라이브러리를 구축하고자 하는 아미노산 잔기들을 표시한 전체 구조를 나타내는 개략도이다.

상기 선택한 아미노산을 NNK 동의코돈 (degenerate codon)으로 치환하도록, 라이브러리 구축을 위한 돌연변이 유발 프라이머 (mutagenic primer)를 합성하였다.

이어, 상기 프라이머들을 이용하여 두 모듈에 대한 겹침 중합효소 연쇄 반응 (overlap PCR)을 수행하며 라이브러리 DNA를 수득하고, 본 발명자의 선행 특허(제10-2012-0019927호)에 기술된 서열번호 2의 파지미드 pBEL118N에 삽입하여 최종적인 라이브러리 파지미드를 확보하였다.

확보된 라이브러리를 전기천공법 (electroporation)으로 대장균 TG-1에 도입하여 형질전환체를 수득함으로써, 1.0x108 수준의 다양성을 갖는 라이브러리를 구축하였다.

실시예 2: 리피바디 라이브러리의 파지 디스플레이를 통한 ASC의 Pyrin 도메인과 결합하는 폴리펩타이드 선별

실시예 1에서 구축한 라이브러리를 파지 디스플레이하고 패닝을 통해 인플라마솜 어댑터단백질 ASC의 Pyrin 도메인에 결합하는 폴리펩타이드를 선별하여 정제하였다.

인플라마솜 어댑터단백질 ASC의 Pyrin 도메인에 결합할 수 있는 후보를 선별하기 위하여, 안정성 개선을 위해 말토스 결합 단백질(MBP)과 결합된 형태의 ASC단백질 Pyrin도메인을 면역튜브 (Immuno-tube)에 50 ㎍/㎖의 농도로 가하고, 4 ℃에서 16시간동안 코팅하였다.

상기 코팅된 면역튜브를 2% BSA와 0.05 % Tween 20을 포함하는 PBS 용액 (TPBSA)으로 4 ℃에서 2시간동안 블로킹 (Blocking) 하였다. 그런 다음, 상기 정제된 파지를 1012 cfu/ml의 농도로 음성 선택 (negative selection)용 말토스 결합 단백질과 같이 상기 코팅된 면역튜브에 가하고, 상온에서 2시간 반응시켰다. 반응이 종료된 후, 0.05% Tween 20을 포함하는 PBS 용액 (TPBS)으로 총 30초간 4번, PBS용액으로 30초간 1번씩 세척하였다.

마지막으로, 1 ml 0.2 M Glycine-HCl (pH 2.2)를 상기 면역튜브에 가하고, 상온에서 12분간 반응시킴으로써, ASC단백질의 Pyrin도메인과 결합할 수 있는 리피바디 후보를 표면에 발현시킨 파지를 용출시켰다.

상기 용출액에 70 ㎕의 1.0 M Tris-HCl (pH 9.0)를 가하여 중화시키고, 숙주세포인 10 ml 대장균 TG1 용액 (OD600 = 0.5)에 가한 다음, 2xYT 플레이트에 도말하는 바이오패닝 (Bio-panning) 과정을 동일하게 5회 반복하여 수행하였다.

그 결과, 각 패닝 과정을 통해 ASC단백질의 Pyrin도메인과 특이적으로 결합하는 파지가 농축됨을 확인하였다. 상기 결과는 ASC단백질의 Pyrin도메인과 결합하는 라이브러리 파지가 특이적으로 증가하는 것을 의미한다.

실시예 3: 선별된 리피바디의 Pyrin 도메인에 대한 특이적 결합여부 및 서열 분석

실시예 2의 방법을 통하여 선별한 파지를 ASC단백질 Pyrin도메인과 Bovine serum albumin (BSA)가 코팅된 96-웰 플레이트를 이용하여 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)를 수행하였다.

BSA 대비 ASC단백질 Pyrin 도메인을 코팅한 웰의 흡광도(OD450)가 가장 높은 20개의 리피바디 후보들을 선별하고, 이들 각각의 아미노산 서열을 확인한 결과, 시스테인이 삽입된 파지를 제외한 후 한 종류의 리피바디 파지를 선별하였다(서열번호 2).

서열번호 2: Repebody-5H

ETITVSTPIKQIFPDDAFAETIKANLKKKSVTDAVTQNELNSIDQIIANNSDIKSVQGIQYLPNVRYLALGGNKLHDISALKELTNLTYLKLHNNQLQSLPNGVFDKLTNLKELSLLFNQLQSLPDGVFDKLTNLTYLNLAHNQLQSLPDGVFDKLTNLTYLNLAHNQLQSLPEGVFDKLTQLKDLRLYQNQLKSVPDGVFDRLTSLQYIWLHDNPWDCTCPGIRYLSEWINKHSGVVRNSAGSVAPDSAKCSGSGKPVRSIICPT

실시예 4: 모듈 기반 방법을 이용한 Pyrin 도메인에 대한 리피바디의 결합력 증대

어댑터 단백질 ASC의 Pyrin도메인에 결합하여 염증조절복합체의 형성을 억제하기 위해서는 이들의 중합체화를 막아줄 수 있는 높은 결합력의 리피바디가 필요하다. 따라서 결합력이 증대된 리피바디를 확보하기 위해 선행특허(제10-2012-0019927호)에서 구축한 모듈 기반 친화력 증대 기술을 사용하였다.

우선, 실시예 3에서 선별한 ASC단백질의 Pyrin도메인에 결합하는 리피바디의 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 기반으로 첫 번째 라이브러리와 인접한 모듈 (LRRV1)을 선택하여 상기 선행특허 실시예 2와 동일한 방식으로 오목한 지역의 4개 잔기를 돌연변이 시켰다. 다시 총 다섯 번의 패닝 과정을 거쳐 결합력이 증대된 총 4가지 리피바디 클론들을 확보하였고, 효소면역측정법을 통하여 가장 결합력 향상이 높은 B7 (서열번호 3)을 선정하였다(도3).

B7 클론을 등온열량측정기를 통해 해리상수를 측정한 결과 4 nM 수준의 가장 높은 결합력을 가지는 것을 확인하였으며(도 4), ASC의 Pyrin도메인과 안정된 결합을 이룸을 크기 배제 크로마토그래피를 통해 다시 한번 확인하였다(도 5).

이러한 결과를 통해 본 발명자들은, 염증조절복합체 형성에 필수적인 어댑터 단백질 ASC의 Pyrin도메인에 높은 결합력을 갖는 리피바디를 성공적으로 확보하였으며, 이는 ASC 단백질 Pyrin 도메인에 특이적인 결합력을 갖는 폴리펩타이드임을 확인하였다.

서열번호 3: Repebody-B7

ETITVSTPIKQIFPDDAFAETIKANLKKKSVTDAVTQNELNSIDQIIANNSDIKSVQGIQYLPNVRKLMLPRNKLHDISALKELTNLTYLKLHNNQLQSLPNGVFDKLTNLKELSLLFNQLQSLPDGVFDKLTNLTYLNLAHNQLQSLPDGVFDKLTNLTYLNLAHNQLQSLPEGVFDKLTQLKDLRLYQNQLKSVPDGVFDRLTSLQYIWLHDNPWDCTCPGIRNLSEWINKHSGVVRNSAGSVAPDSAKCSGSGKPVRSIICPT

실시예 5: 개발된 리피바디의 ASC의 중합체화 저해 및 해리 능력 확인

인플라마솜은 어댑터 단백질인 ASC가 수용체 단백질 아래 긴 기둥형태의 중합체(Oligomer)를 형성해야만 완전히 조립되어 신호전달을 할 수 있다. 이에, 선별된 리피바디 B7이 ASC단백질와의 결합을 통해 중합체화를 막을 수 있는지 확인하는 실험을 수행하였다.

이를 위해, 시간에 따른 ASC 중합체화 정도가 리피바디를 처리하였을 때 어떻게 달라지는지 형광공명에너지 전달 방법을 통해 분석하였다. 두 가지의 다른 흡수/방출 파장대를 갖는 형광단을 ASC단백질에 각각 컨쥬게이션한 뒤 혼합하여 중합체가 형성됨에 따라 증가하는 형광공명에너지 전달 신호를 측정하였다.

그 결과, ASC단백질 대비 리피바디를 1:5, 1:1 그리고 5:1로 처리하였을 때 모두 효과적으로 중합체화를 저해하였으며, 특히 ASC단백질 대비 1:1보다 적은 양의 리피바디가 들어갔음에도 매우 효과적으로 중합체화를 차단할 수 있다는 것을 확인하였다(도 6).

염증조절복합체의 기둥 역할을 해주는 어댑터 단백질 ASC는 높은 수준의 중합체로 빠르게 조립되는 특성을 가지고 있다. 따라서 리피바디가 ASC의 중합체화에 관여하는 Pyrin도메인에 경쟁적으로 결합하여 이미 형성된 중합체를 해리시킬 수 있다면 더욱 높은 항염증 효과를 가질 수 있다. 이를 확인하기 위해 동물세포인 HEK293T에서 사람의 ASC단백질을 형질주입하여 발현 및 정제한 뒤 중합체를 먼저 형성시켜 놓고 리피바디를 처리하여 시간대별로 중합체화 정도를 DSP (dithiobis(succinimidyl propionate))를 통한 화학가교 결합 및 웨스턴 블랏을 통해 확인하였다.

그 결과, 높은 수준의 중합체에 리피바디를 처리할 시 낮은 수준의 중합체로 빠르게 해리되는 것을 확인할 수 있었다(도 7). 현재까지 국내외에 이미 형성된 ASC중합체를 해리시킬 수 있는 단백질에 대한 보고가 없었기 때문에 ASC중합체 형성 저해에 높은 경쟁력을 지니는 단백질임을 확인하였다.

실시예 6: 면역세포에서 리피바디에 의한 인플라마솜 형성 저해 및 카스파아제 활성 저해 확인

인플라마솜에 의한 염증반응은 주로 면역세포, 특히 대식세포에서 일어나기 때문에 실제 면역 세포에 리피바디를 전달하여 인플라마솜 형성을 경감시킬 수 있는지 확인하기 위한 실험을 수행하였다.

사람에서 유래된 단핵구 세포주인 THP-1을 PMA (12-myristate 13-acetate)를 통해 대식세포로 분화시킨 뒤, 리피바디를 처리하여 화학가교결합을 통한 어댑터 단백질 ASC의 중합체화 정도를 파악하였다.

그 결과, 리피바디 처리 시 어댑터 단백질 ASC가 중합체로 조립되지 못한 채로 남아있다는 것을 확인하여, 중합체화가 효과적으로 저해되는 것을 확인할 수 있었다(도 8).

추가적으로, 인플라마솜의 형성으로 나타나는 가장 직접적인 결과는 카스파아제가 보다 작은 단백질 조각으로 분해되며 활성이 증가하는 것이기 때문에 이를 웨스턴블랏과 형광신호를 통한 효소활성 측정을 통하여 확인하였다.

그 결과, 리피바디를 처리한 대식세포에서 관찰되는 활성 카스파아제 (p20)의 양이 현저히 감소하하는 것을 확인하였으며(도 9), 형광 기질을 이용한 카스파아제의 활성측정에서도 형광신호가 현저히 감소한 것을 확인하여, 실제 활성이 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 10).

실시예 7: 면역세포에서 리피바디에 의한 염증반응 저해효과 확인

리피바디에 의한 인플라마솜 형성 저해에 의해 항염증효과를 효과적으로 이끌어 낼 수 있는지 확인하기 위하여 인플라마솜에 의한 염증반응의 결과로 분비되는 대표적인 염증성 사이토카인 인터류킨-1b (Interleukin-1beta)의 양 및 파이롭토시스(세포자살) 정도를 확인하였다.

이를 위해 대식세포에서 리피바디를 농도별로 처리하고 효소면역측정법을 통해 인터류킨-1b 사이토카인의 방출정도를 정량하였다.

그 결과, 처리한 리피바디의 농도에 따라 방출되는 염증성 사이토카인의 양이 현저히 감소되는 것을 확인하였다(도 11).

또한 파이롭토시스 정도는 세포가 죽은 뒤 세포밖으로 방출되는 효소인 젖산탈수소효소의 활성을 통해 정량하였다.

그 결과, 리피바디를 처리할 경우 파이롭토시스에 의해 죽는 세포들이 감소되는 것을 관찰할 수 있었고(도 12), 이로부터 인플라마솜 형성 저해를 통해 사이토카인 분비와 세포 죽음 모두를 저해할 수 있음을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> KAIST <120> Novel polypeptide binding with oligomerization domain of Inflammasome Adaptor protein Apoptosis-Associated Speck-like protein containing a CARD(ASC) and Uses thereof <130> P20-B281 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 798 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Repebody-library <400> 1 gaaaccatta ccgtgagcac cccgatcaaa cagatttttc cggatgacgc gttcgccgaa 60 acgatcaaag caaacctgaa gaaaaagagc gttaccgatg ctgtcacgca aaatgaactg 120 aacagtattg accagatcnn kgcgnnknnk tccgatatca aatcagtgca aggcattcag 180 tatctgccga atgttcgtta cctgnnkctg nnknnkaaca aactgcatga catctcggca 240 ctgaaagaac tgaccaatct gacgtatctg attctgaccg gtaaccaact gcagagcctg 300 ccgaatggcg tctttgataa actgacgaac ctgaaagaac tggtgctggt tgaaaatcaa 360 ctgcagtctc tgccggacgg tgtcttcgat aaactgacca acctgacgta cctgaatctg 420 gctcacaacc aactgcagag tctgccgaaa ggcgtgtttg acaaactgac caatctgacg 480 gaactggatc tgtcctataa ccaactgcag tcactgccgg aaggtgtttt cgacaaactg 540 acccagctga aagatctgcg cctgtaccag aatcagctga aatcggtccc ggacggcgtg 600 tttgatcgtc tgaccagcct gcagtatatc tggctgcatg ataacccgtg ggattgcacc 660 tgtccgggta ttcgctacct gtctgaatgg atcaataaac acagtggcgt tgtccgtaac 720 tccgcgggtt cagttgcccc ggattcggcg aaatgctccg gcagcggtaa accggtgcgt 780 agcattattt gcccgacc 798 <210> 2 <211> 266 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Repebody-5H <400> 2 Glu Thr Ile Thr Val Ser Thr Pro Ile Lys Gln Ile Phe Pro Asp Asp 1 5 10 15 Ala Phe Ala Glu Thr Ile Lys Ala Asn Leu Lys Lys Lys Ser Val Thr 20 25 30 Asp Ala Val Thr Gln Asn Glu Leu Asn Ser Ile Asp Gln Ile Ile Ala 35 40 45 Asn Asn Ser Asp Ile Lys Ser Val Gln Gly Ile Gln Tyr Leu Pro Asn 50 55 60 Val Arg Tyr Leu Ala Leu Gly Gly Asn Lys Leu His Asp Ile Ser Ala 65 70 75 80 Leu Lys Glu Leu Thr Asn Leu Thr Tyr Leu Lys Leu His Asn Asn Gln 85 90 95 Leu Gln Ser Leu Pro Asn Gly Val Phe Asp Lys Leu Thr Asn Leu Lys 100 105 110 Glu Leu Ser Leu Leu Phe Asn Gln Leu Gln Ser Leu Pro Asp Gly Val 115 120 125 Phe Asp Lys Leu Thr Asn Leu Thr Tyr Leu Asn Leu Ala His Asn Gln 130 135 140 Leu Gln Ser Leu Pro Asp Gly Val Phe Asp Lys Leu Thr Asn Leu Thr 145 150 155 160 Tyr Leu Asn Leu Ala His Asn Gln Leu Gln Ser Leu Pro Glu Gly Val 165 170 175 Phe Asp Lys Leu Thr Gln Leu Lys Asp Leu Arg Leu Tyr Gln Asn Gln 180 185 190 Leu Lys Ser Val Pro Asp Gly Val Phe Asp Arg Leu Thr Ser Leu Gln 195 200 205 Tyr Ile Trp Leu His Asp Asn Pro Trp Asp Cys Thr Cys Pro Gly Ile 210 215 220 Arg Tyr Leu Ser Glu Trp Ile Asn Lys His Ser Gly Val Val Arg Asn 225 230 235 240 Ser Ala Gly Ser Val Ala Pro Asp Ser Ala Lys Cys Ser Gly Ser Gly 245 250 255 Lys Pro Val Arg Ser Ile Ile Cys Pro Thr 260 265 <210> 3 <211> 266 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Repebody-B7 <400> 3 Glu Thr Ile Thr Val Ser Thr Pro Ile Lys Gln Ile Phe Pro Asp Asp 1 5 10 15 Ala Phe Ala Glu Thr Ile Lys Ala Asn Leu Lys Lys Lys Ser Val Thr 20 25 30 Asp Ala Val Thr Gln Asn Glu Leu Asn Ser Ile Asp Gln Ile Ile Ala 35 40 45 Asn Asn Ser Asp Ile Lys Ser Val Gln Gly Ile Gln Tyr Leu Pro Asn 50 55 60 Val Arg Lys Leu Met Leu Pro Arg Asn Lys Leu His Asp Ile Ser Ala 65 70 75 80 Leu Lys Glu Leu Thr Asn Leu Thr Tyr Leu Lys Leu His Asn Asn Gln 85 90 95 Leu Gln Ser Leu Pro Asn Gly Val Phe Asp Lys Leu Thr Asn Leu Lys 100 105 110 Glu Leu Ser Leu Leu Phe Asn Gln Leu Gln Ser Leu Pro Asp Gly Val 115 120 125 Phe Asp Lys Leu Thr Asn Leu Thr Tyr Leu Asn Leu Ala His Asn Gln 130 135 140 Leu Gln Ser Leu Pro Asp Gly Val Phe Asp Lys Leu Thr Asn Leu Thr 145 150 155 160 Tyr Leu Asn Leu Ala His Asn Gln Leu Gln Ser Leu Pro Glu Gly Val 165 170 175 Phe Asp Lys Leu Thr Gln Leu Lys Asp Leu Arg Leu Tyr Gln Asn Gln 180 185 190 Leu Lys Ser Val Pro Asp Gly Val Phe Asp Arg Leu Thr Ser Leu Gln 195 200 205 Tyr Ile Trp Leu His Asp Asn Pro Trp Asp Cys Thr Cys Pro Gly Ile 210 215 220 Arg Asn Leu Ser Glu Trp Ile Asn Lys His Ser Gly Val Val Arg Asn 225 230 235 240 Ser Ala Gly Ser Val Ala Pro Asp Ser Ala Lys Cys Ser Gly Ser Gly 245 250 255 Lys Pro Val Arg Ser Ile Ile Cys Pro Thr 260 265 <210> 4 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> capping motif <400> 4 Glu Thr Ile Thr Val Ser Thr Pro Ile Lys Gln Ile Phe Pro Asp Asp 1 5 10 15 Ala Phe Ala Glu Thr Ile Lys Ala Asn Leu Lys Lys Lys Ser Val Thr 20 25 30 Asp Ala Val Thr Gln Asn Glu 35 <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> repeat module <400> 5 Leu Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Leu Xaa Leu Xaa Xaa Asn 1 5 10

Claims (9)

1. 서열번호 2 또는 3의 아미노산 서열로 표시되고, 인플라마솜 어댑터 단백질(Inflammasome Adaptor protein Apoptosis-Associated Speck-like protein containing a CARD, ASC)에 특이적으로 결합하는 리피바디(Repebody).
   
2. 제1항에 있어서, 상기 리피바디는 ASC의 pyrin 도메인에 결합하는 것을 특징으로 하는 리피바디.
   
3. 제1항의 리피바디를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
   
4. 제3항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터.
   
5. 제3항의 폴리뉴클레오타이드 또는 제4항의 재조합 벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물.
   
6. 다음 단계를 포함하는 서열번호 2 또는 3의 아미노산 서열로 표시되고, 인플라마솜 어댑터 단백질에 특이적으로 결합하는 리피바디의 제조방법:
   (i) 제5항의 재조합 미생물을 배양하여 리피바디를 생성시키는 단계; 및
   (ii) 상기 생성된 리피바디를 회수하는 단계.
   
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