CN115551512A

CN115551512A - 包含nlrp1炎性体激活抑制剂的化合物或组合物用于治疗人气道炎症的用途

Info

Publication number: CN115551512A
Application number: CN202180034911.4A
Authority: CN
Inventors: 钟雷; B·勒韦萨德; K·S·罗宾森
Original assignee: Agency for Science Technology and Research Singapore; Nanyang Technological University
Current assignee: Agency for Science Technology and Research Singapore; Nanyang Technological University
Priority date: 2020-03-19
Filing date: 2021-03-18
Publication date: 2022-12-30
Also published as: WO2021188052A1; US20230172933A1

Abstract

本发明涉及一种通过使用包含NLRP1炎性体激活抑制剂的化合物或组合物来预防或治疗由肠道病毒3C蛋白酶激活的NLRP1触发的气道炎症和/或相关并发症的方法。在一个实施方案中，所述肠道病毒3C蛋白酶来自选自以下的病毒物种：人肠道病毒A(HEV‑A)、人肠道病毒B(HEV‑B)、人肠道病毒C(HEV‑C)、人肠道病毒D(HEV‑D)、人鼻病毒A(HRV‑A)、人鼻病毒B(HRV‑B)和人鼻病毒C(HRV‑C)。在一些实施方案中，所述化合物选自MLN4924、TAS4464、ZM223、MG132和硼替佐米。

Description

包含NLRP1炎性体激活抑制剂的化合物或组合物用于治疗人气道炎症的用途

技术领域

本发明提供了一种预防或治疗由肠道病毒3C蛋白酶激活的NLRP1触发的气道炎症和/或相关并发症的方法、用于所述方法的化合物或包含所述化合物的组合物、以及所述化合物在用于预防或治疗由肠道病毒3C蛋白酶激活的NLRP1触发的人气道炎症和/或相关并发症的药剂制备中的用途。

背景技术

人先天免疫系统采用大量种系编码的传感器蛋白来检测微生物感染并且启动一线免疫应答(Jones等人,Science 354(2016))。Nod样受体(NLR)蛋白是能够检测胞质溶胶中病原体相关分子模式(PAMP)的先天免疫传感器家族[Jones等人,Science 354(2016)；Shaw等人,Curr.Opin.Immunol.20:377-382(2008)；Kanneganti等人,Immunity 27:549-559(2007)]。激活后，NLR蛋白使炎性体复合物的组装体成核，导致焦亡性(pyroptotic)细胞死亡和促炎性细胞因子(如IL-1β和IL-18)的分泌[Latz,Current Opinion inImmunology 22:28-33(2010)]。在所有人NLR传感器中，NLRP1仍然是其同源PAMP配体尚未被鉴定的少数几个之一。NLRP1中的种系激活突变引起孟德尔综合征(Mendeliansyndrome)，其特征在于皮肤的多发性自愈性角化棘皮瘤以及喉和角膜上皮角化过度[Grandemange等人,Annals of the Rheumatic Diseases 76:1191-1198(2017)；Zhong等人,Cell 67:187-202(2016)；Mamai等人,J.Invest.Dermatol.135:304-308(2015)]。某些常见的NLRP1单核苷酸多态性(SNP)的携带者会增加自身免疫性疾病(如哮喘和白癜风)的风险[Sui等人,Arthritis Rheum.64:647-654(2012)；Levandowski等人,PNAS 110:2952-2956(2013)]。人NLRP1在结构域组织、配体特异性和组织分布方面与其啮齿动物同源物不同[Sand等人,Cell Death Dis 9:24(2018)]，并且在体内人免疫应答中的确切作用仍不清楚。

最近的研究描述了一种新型途径，啮齿动物NLRP1同源物Nlrp1b的某些等位基因通过所述新型途径被细菌毒素(如炭疽致死因子(LF))激活[Boyden和Dietrich,Nat.Genet.38:240-244(2006)；Newman等人,PLoS Pathog.6:e1000906(2010)；Hellmich等人,PLoS One 7:e49741(2012)；Levinsohn等人PLoS Pathog.8:e1002638(2012)；Chavarria-Smith等人,PLoS Pathog.9:e1003452(2013)]。炭疽LF直接在靠近Nlrp1b的N末端切割[Levinsohn等人PLoS Pathog.8:e1002638(2012)；Chavarria-Smith等人,PLoSPathog.9:e1003452(2013)]。这种切割导致自抑制性N末端片段的N-降解决定子(N-degron)介导的降解，从而释放非共价结合的FIIND^UPA-CARD(a.a.1213-1474)片段以激活半胱天冬酶-1[Chui等人,Science 364:82-85(2019)；Sandstrom等人,Science 364(2019)；Xu等人EMBO J.(2019)](图1A)。在人NLRP1(含有啮齿动物中未发现的N末端PYRIN结构域)中明显不存在共有LF切割位点(图1A)。因此LF不切割或激活人NLRP1。尽管它们存在差异，但是人NLRP1和啮齿动物同源物两者均可以被二肽酶DPP8和DPP9的化学抑制剂激活(但潜在的机制仍有待充分阐明)[Zhong等人,J.Biol.Chem.293:18864-18878(2018)；Okondo等人,Cell Chem Biol.25:262-267(2018)；de Vasconcelos等人,Life Sci Alliance 2(2019)]。啮齿动物Nlrp1也可以在确实显现涉及蛋白酶介导的切割的过程中由刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)感染激活[Cirelli等人,PLoS Pathog.10:e1003927(2014)；Ewald等人,Infect.Immun.82:460-468(2014)]。关于任何天然存在的病原体或危险相关信号(DAMP)是否可以激活人NLRP1，以及它们是否经由如在小鼠中记录的类似的“功能性降解”途径来激活所述人NLRP1，这仍然是一个悬而未决的问题。需要鉴定可能的一种或多种触发人NLRP1炎性体的同源PAMP配体，并且评估它们激活NLRP1以改善人气道炎症的机制。

发明内容

本发明源于可以触发人气道中由NLRP1激活的炎性体的PAMP的鉴定。更具体地，诸位发明人已经鉴定出涉及cullin^ZER1/ZYG11B和NEDD8激活酶(NAE)的NLRP1激活的炎性体途径以及所述途径的潜在抑制剂。

在本发明的第一方面，提供了一种用于预防或治疗由肠道病毒3C蛋白酶切割的NLRP1触发的人气道炎症和/或相关并发症的化合物或包含所述化合物的组合物，其中所述化合物或组合物是NLRP1炎性体激活的抑制剂。

肠道病毒属涵盖形成在世界范围内传播的以下7种物种的234种人病原体：人肠道病毒A至D(HEV-A、HEV-B、HEV-C和HEV-D)和人鼻病毒A至C(HRV-A、HRV-B和HRV-C)。埃可病毒和柯萨奇病毒B(CV-B)被分类在HEV-B物种内，并且脊髓灰质炎病毒(PV)被分类在HEV-C内。

在一些实施方案中，所述3C蛋白酶来自选自以下的病毒物种：人肠道病毒A(HEV-A)、人肠道病毒B(HEV-B)、人肠道病毒C(HEV-C)、人肠道病毒D(HEV-D)、人鼻病毒A(HRV-A)、人鼻病毒B(HRV-B)和人鼻病毒C(HRV-C)。

3C蛋白酶对NLRP1的切割产生具有N末端甘氨酸的NLRP1的多肽片段(对N-甘氨酸降解决定子途径敏感)。

在一些实施方案中，所述化合物抑制N-甘氨酸降解决定子途径泛素化和NLRP1切割产物的降解。

在一些实施方案中，所述化合物抑制cullin^ZER1/ZYG11B。

在一些实施方案中，所述化合物是NEDD8激活酶(NAE)的抑制剂。

在一些实施方案中，所述化合物或组合物包含所述抑制剂化合物的药学上可接受的盐或溶剂化物、或药学功能衍生物。

在一些实施方案中，所述化合物选自：

MLN4924，IUPAC名称((1S,2S,4R)-4-(4-(((S)-2,3-二氢-1H-茚-1-基)氨基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2-羟基环戊基)甲基氨基磺酸酯或其盐酸盐；

TAS4464，IUPAC名称7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-胺,7-[5-[(氨基磺酰基)氨基]-5-脱氧-β-D-呋喃核糖基]-5-[2-(2-乙氧基-6-氟苯基)乙炔基]-或其盐酸盐；

ZM223，IUPAC名称N-[6-[[2-(4-氨基苯基)硫烷基乙酰基]氨基]-1,3-苯并噻唑-2-基]-4-(三氟甲基)苯甲酰胺；

MG132，IUPAC名称：N-[(2S)-4-甲基-1-[[(2S)-4-甲基-1-[[(2S)-4-甲基-1-氧代戊-2-基]氨基]-1-氧代戊-2-基]氨基]-1-氧代戊-2-基]氨基甲酸苄酯，和

硼替佐米，IUPAC名称：[(1R)-3-甲基-1-[[(2S)-3-苯基-2-(吡嗪-2-羰基氨基)丙酰基]氨基]丁基]硼酸。

在一些实施方案中，所述3C蛋白酶来自人鼻病毒。

在一些实施方案中，所述组合物包含抑制剂化合物与药学上可接受的佐剂、稀释剂或载体。

在本发明的第二方面，提供了根据本发明任一方面的化合物或组合物用于制造用于预防或治疗由肠道病毒3C蛋白酶激活的NLRP1触发的人气道炎症和/或相关并发症的药剂的用途。

在一些实施方案中，所述药剂减少了IL-1β和IL-18分泌、ASC寡聚化和/或溶解性细胞死亡。

在一些实施方案中，所述化合物抑制cullin^ZER1/ZYG11B。

在一些实施方案中，所述化合物是NEDD8激活酶(NAE)的抑制剂。

在一些实施方案中，所述化合物选自：

确定用于向需要预防或治疗由肠道病毒3C蛋白酶激活的NLRP1触发的人气道炎症和/或相关并发症的受试者施用的有效剂量范围在本领域技术人员的能力范围内。在一些实施方案中，有效剂量范围可以在约0.1μM至1μM之间。

在本发明的第三方面，提供了一种预防或治疗受试者的由肠道病毒3C蛋白酶激活的NLRP1触发的气道炎症和/或相关并发症的方法，所述方法包括施用治疗有效量的根据本发明的任一方面的化合物或组合物。

在一些实施方案中，所述化合物抑制cullin^ZER1/ZYG11B。

在一些实施方案中，所述化合物是NEDD8激活酶(NAE)的抑制剂。

在一些实施方案中，所述化合物选自：

在一些实施方案中，与未经治疗的受试者相比，被施用所述预防或治疗的受试者将在气道中具有减少的IL-1分泌、ASC寡聚化和/或溶解性细胞死亡。

在一些实施方案中，所述化合物是MLN4924，IUPAC名称((1S,2S,4R)-4-(4-(((S)-2,3-二氢-1H-茚-1-基)氨基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2-羟基环戊基)甲基氨基磺酸酯或其盐酸盐。

附图说明

图1示出了肠道病毒3Cpro激活人NLRP1炎性体。(A)人NLRP1和啮齿动物Nlrp1b的结构域结构。鼠Nlrp1b通过炭疽致死因子(LF)毒素切割、然后蛋白酶体降解自抑制性N末端片段而被激活。(B)过表达带Myc标签的病毒蛋白酶后，具有ASC-GFP斑点的293T-ASC-GFP-NLRP1-FLAG细胞的百分比。转染指示的蛋白酶或空载体对照后，将细胞固定24小时。将他柏司他(Talabostat)(2μM，24h)处理用作阳性对照。用20x放大倍率的宽视场落射荧光显微镜对具有ASC-GFP斑点的细胞数量进行视觉评分。按每个条件对多于100个细胞的ASC-GFP斑点形成进行评分。n＝3个生物重复试样。*P<0.05；**P<0.01(双因素方差分析)；n.s.，不显著。(C)NLRP1自身寡聚化的蓝色非变性PAGE(BN-PAGE)分析。将293T-NLRP1-FLAG细胞用指示的质粒转染。转染后一天，将细胞用模拟物处理或用2.5μM MG132处理24h。转染后48小时将细胞裂解。将20μg的总裂解物用于蓝色非变性PAGE或SDS-PAGE，然后进行蛋白质印迹。(D)MG132对NLRP1依赖性ASC-GFP斑点形成的影响。将293T-ASC-GFP或293T-ASC-GFP-NLRP1-FLAG细胞用HRV14-3Cpro转染并在转染后6小时用2.5μM MG132处理。***P<0.001(双因素方差分析)。(E)HRV14-3Cpro诱导了永生化人角质形成细胞的成熟IL-1B分泌和ASC寡聚化。1μg/mL多西环素(DOX)后24小时收获Tet-ON HRV-3Cpro或3Cpro^C146A N/TERT角质形成细胞和条件培养基。将条件培养基浓缩10次，然后进行SDS-PAGE和IL-1β蛋白质印迹。将1％NP40不溶性沉淀物与在PBS中的1mM DSS共价交联后，通过1％SDS提取内源性ASC寡聚物。(F)HRV14-3Cpro转染后的ASC-GFP N/TERT细胞的活细胞成像。白色箭头指示具有ASC-GFP斑点和PI包含的焦亡细胞。(G)将Cas9对照和NLRP1 KO角质形成细胞用Tet-ON HRV14-3Cpro稳定转导。诱导细胞并且收获细胞，如图1E中所示。*＝ASC蛋白质印迹观察到的非特异性条带。(H)DOX诱导后24小时，来自NLRP1 KO和Cas9对照Tet-ON HRV14-3Cpro N/TERT角质形成细胞的条件培养基的IL-1βELISA。***P<0.001；****P<0.0001(双因素方差分析)。n＝3次独立的细胞接种和诱导。(I)DOX诱导后24小时，NLRP1 KO和Cas9对照Tet-ON HRV14-3Cpro N/TERT角质形成细胞的台盼蓝包含测定。**P<0.01(双因素方差分析),n＝3次独立细胞接种和诱导，如图1H中所示。

图2示出HRV-3Cpro可以充当永生化人角质形成细胞中焦亡性细胞死亡的有效触发物。(A)带Myc标签的病毒蛋白酶在293T-ASC-GFP-NLRP1-FLAG细胞中的表达。示出了两种曝光时间。注意：Myc-HRV16-3Cpro表达较低但是可以激活ASC-GFP斑点。(B)ASC-GFP斑点、NLRP1-HA和带Myc标签的蛋白酶的代表性宽视场荧光图像。将293T-ASC-GFP细胞用NLRP1-HA和带Myc标签的gZiPro、HRV14-3Cpro或HRV14-3Cpro^C146A共转染，并在转染后24小时固定。(C)N/TERT细胞中的ASC KO的验证。选择ASC KO#2用于进一步实验。(D)N/TERT细胞中的CASP1 KO的验证。选择#1用于图2E中所示的进一步实验。(E)将N/TERT KO细胞用指示的3Cpro变体转染并在转染后24小时收获。通过IL-1βELISA分析条件培养基。**P<0.01(双因素方差分析)。n＝3次独立转染。(F)通过膜联蛋白VI和PI包含测定了他柏司他处理的或多西环素诱导的Tet-ON HRV14-3Cpro N/TERT细胞的细胞死亡模式。数据表示两个独立实验中的一个。

图3示出3CPro通过在p.Gln130与Gly131之间的单一位点处的直接切割来激活NLRP1。(A)HRV14-3Cpro在靠近NLRP1的N末端切割。上部小图：用于检测NLRP1自蛋白水解片段的抗体。N末端NLRP1抗体的表位是在NLRP1 a.a.130与a.a.230之间。下部小图：将293T细胞用C末端带HA标签的NLRP1和带Myc标签的HRV14-3Pro转染。将全长NLRP1及其切割产物用N末端片段特异性NLRP1抗体和针对C末端HA标签的抗体可视化。黑色箭头指示提出的在所观察到的NLRP1片段之间的蛋白水解关系。注意催化活性的3Cpro的存在降低了所有转染的质粒的表达(例如，还参见图2B、图2D)。(B)HRV14-3Cpro在单一位点处切割NLRP1^F1212A。将293T细胞用带FLAG标签的NLRP1^F1212A与渐增量的HRV14-3Cpro转染。转染后48小时收获细胞裂解物。(C)重组HRV14-3Cpro切割人NLRP1。在33℃下将来自NLRP1-HA转染的293T细胞的无细胞裂解物(20μg)与重组HRV14-3Cpro(0.1、0.3、1μg)一起孵育90min并且通过SDS-PAGE分析。(D)3Cpro切割位点的映射。上部：PYRIN结构域(PYD)后紧接NLRP1接头区。谷氨酰胺(Q)残基加下划线。下部：将293T细胞用指示的NLRP1 Q>A突变体和HRV14-3Cpro共转染。3Cpro^C146A用作阴性对照。转染后48小时收获总细胞裂解物。(E)Q130A消除了HRV14-3Cpro切割。将293T-ASC-GFP-NLRP1^WT-FLAG和293T-ASC-GFP-NLRP1^Q130A-FLAG细胞用Myc-HRV14-3Cpro转染或用他柏司他处理48小时。通过SDS-PAGE分析总细胞裂解物。*，可能是非特异性NLRP1降解产物。黑色箭头，3Cpro依赖性切割产物(a.a.131-1213)。(F)Q130A消除了293T细胞中的3CPro依赖性(而不是他柏司他依赖性)NLRP1激活。将细胞如图1E所示转染或用他柏司他处理，并且在转染后24小时固定。用20x放大倍率的宽视场落射荧光显微镜对具有ASC-GFP斑点的细胞数量进行视觉评分。*P<0.01；****P<0.0001(双因素方差分析)。n＝3次独立转染/药物处理。(G)野生型(而不是NLRP1^Q130A)恢复了NLRP1敲除人角质形成细胞中的3Cpro依赖性IL-1β分泌。首先将NLRP1 KO角质形成细胞用NLRP1^WT-FLAG或NLRP1^Q130A-FLAG的稳定慢病毒表达拯救，并进一步用Tet-ON HRV14-3Cpro转导。将NLRP1 KO或拯救的细胞用多西环素(1μg/mL)或他柏司他(2μM)处理。药物处理后24小时收获条件培养基并且将其通过IL-1B ELISA分析。****P<0.0001(双因素方差分析)。n＝3次细胞接种和药物处理。(H)和(I)。野生型(而不是NLRP1^Q130A)恢复了焦亡NLRP1敲除人角质形成细胞中的3Cpro依赖性。将从图1G收获的细胞通过蛋白质印迹(H)和台盼蓝排除(I)分析。

图4示出HRV14-3CPro不能激活鼠Nlrp1b。(A)将293T-ASC-GFP用NLRP1^WT-HA或NLRP1^Q130A-HA连同指示的蛋白酶共转染。转染后48小时收获细胞裂解物。(B)将在S2A中处理的细胞固定并且通过宽视场GFP荧光针对ASC-GFP斑点形成进行成像。*P<0.05，**P<0.01(双因素方差分析)。n＝3次独立转染。(C)表达HRV14-3Cpro或用他柏司他处理的N/TERT细胞的代表性形态。小图：具有“膜鼓胀”(溶解性细胞死亡的典型特征)的细胞。(D)他柏司他(20μM)的多西环素诱导后，Tet-ON-HRV14-3Cpro RAW264.7细胞中台盼蓝阳性细胞的百分比。(E)炭疽LF处理后，台盼蓝阳性细胞的百分比。

图5示出3Cpro触发的人NLRP1激活需要cullin^ZER1/ZYG11B介导的N末端甘氨酸降解决定子途径。(A)过表达的NLRP1(a.a.131-1474)没有引起自发性ASC-GFP斑点形成。将293T-ASC-GFP细胞用野生型NLRP1或突变体转染并在转染后48小时固定。(B)调节人NLRP1和鼠Nlrp1b中的切割后N末端片段降解的不同途径的总结。N-降解决定子途径的两种类型需要不同的识别受体，并且对小分子抑制剂表现出不同的敏感性。(C)MLN4924(NEDD8/cullin抑制剂)和蛋白酶体抑制剂消除了3Cpro诱导的ASC-GFP斑点。将293T-ASC-GFP-NLRP1-FLAG细胞用HRV14-3Cpro转染并且用如下的指示的药物处理24小时：MLN4924，1μM；MG132，2.5μM；和硼替佐米0.5μM；苯丙氨酸，1mM。(D)MLN4924抑制NLRP1自身寡聚化。将293T-NLRP1-FLAG细胞用HRV14-3Cpro转染并在转染后16小时用指示的药物再处理24小时。将全细胞裂解物通过BN-PAGE或SDS-PAGE分析然后通过蛋白质印迹分析。右侧箭头指示HRV14-3Cpro切割产物(a.a.131-1213)。(E)MLN4924抑制内源性3Cpro诱导的NLRP1炎性体和焦亡。将Tet-ONHRV14-3Cpro N/TERT角质形成细胞用多西环素与指示的药物组合处理24小时。将细胞裂解物、条件培养基和1％NP40不溶性复合物通过蛋白质印迹分析。(F)图3E中的条件培养基的IL-1βELISA。****P<0.0001。n＝3次独立的多西环素诱导/药物处理。(G)对于3Cpro诱导的NLRP1激活，在遗传上需要Cullin^ZER1/ZYG11B(而不是UBR2)。将指示的CRISPR KO293T-ASC-GFP细胞用野生型NLRP1与HRV14-3Cpro或用NLRP1^M77T转染。转染后24小时将细胞固定。使用以20x的宽视场显微术对ASC-GFP斑点进行评分。****P<0.0001，n＝3次转染，>100个细胞。(H)Cullin^ZER1/ZYG11B(而不是UBR2)负责3Cpro切割产物的降解。将稳定表达NLRP1-FLAG的CRISPRKO 293T-ASC-GFP细胞用HRV14-3Cpro转染。转染后48小时收获细胞裂解物。

图6示出功能获得性MLRP1突变M77T可以使整个N末端片段不稳定以破坏NLRP1折叠。(A)野生型或NLRP1突变体在293T-ASC-GFP细胞中的表达。将细胞用指示的构建体转染并在转染后48小时裂解。(B)将Tet-ON HRV14-3Cpro N/TERT细胞用指示的抑制剂预处理并且用多西环素(1μg/mL)诱导24小时。通过IL-1βELISA分析条件培养基。****P<0.0001(双因素方差分析)。n＝3次独立处理。(C)用野生型NLRP1或NLRP1^M77T转染后的ZZ-dKO 293T-ASC-GFP细胞中的ASC-GFP斑点的代表性图像。注意ZZ-dKO克隆8具有降低的ASC-GFP表达。未对ASC-GFP阴性细胞的斑点形成进行评分。(D)将Cas9对照和UBR2 KO 293T-ASC-GFP-NLRP1-FLAG细胞用HRV14-3Cpro转染并在转染后48小时裂解。

图7示出对于活HRV感染期间的炎性体组装激活，需要NLRP1。(A)NLRP1相比于NLRP3(RNAseq FKPM)在NHBE中的表达水平。n＝21，来自健康供体的汇集的NHBE的独立培养物。(B)在健康人鼻活检物中NLRP1相比于NLRP3的表达。点纹：通过RNAscope的阳性染色。核染色：苏木精(C)HRV16感染的和他柏司他处理的NHBE的细胞因子特征分析的概况。(D)将细胞用MOI＝5的HRV16接种并且在33℃下孵育48小时。去除细胞碎片后，在条件培养基上进行Luminex阵列。n＝3次独立的感染和处理。以至少5倍诱导的细胞因子/趋化因子(p<0.05，学生t检验，对数正态值)用方形框表示。(E)MCC950不影响NHBE中HRV16触发的IL-1β分泌。将NHBE用MCC950(5μM)或卢平曲韦(10nM)预处理，然后进行HRV16接种或他柏司他(2μM)处理。(F)MCC950不影响NHBE中HRV16触发的IL-1β分泌。(G)3D人支气管上皮培养物的顶端HRV感染的概况。(H)HRV16感染的(MOI＝3)和他柏司他(2μM)处理的3D人支气管上皮培养物的阿尔新蓝(AB)/过碘酸-希夫(periodic acid-Schiff，PAS)染色。(I)感染或他柏司他处理后48小时，顶端或基底培养基中的IL-18水平。**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001(双因素方差分析)。n＝3次独立感染的/处理的培养物。(J)HRV16感染的原代NHBE中的经切割的IL-1β和IL-18的分泌以及ASC寡聚化。在33℃下将细胞用HRV16(MOI＝5)接种或用他柏司他(2μM)处理48小时。

图8示出HRV16感染导致3Cpro依赖性NLRP1切割并且激活重构的人NLRP1炎性体。(A)HRV16感染导致了HeLa-Ohio-NLRP1-HA细胞中的NLRP1切割。MOI＝1。(B)Q130A消除了HRV16诱导的NLRP1切割和ASC-GFP寡聚化。在33℃下将HeLa-Ohio-ASC-GFP-NLRP1^WT或NLRP1^Q130A细胞用MOI＝1的HRV16感染。感染后48小时收获细胞沉淀物。(C)HRV16感染对表达野生型NLRP1或NLRP1^Q130A的HeLa-Ohio-ASC-GFP细胞中的ASC-GFP斑点形成的影响。***P<0.001(双因素方差分析)。n＝来自两次独立感染中的一次的3个重复试样，每种情况>100个细胞。(D)表达野生型NLRP1或NLRP1^Q130A的HeLa-Ohio-ASC-GFP细胞中的ASC-GFP斑点的代表性图像。箭头：ASC-GFP斑点。注意，在这种细胞系中，ASC-GFP斑点显得不太紧凑，即使是在他柏司他处理的阳性对照细胞中也如此。(E)在正常人气道上皮细胞提取的在已公开数据集(鼻#1-GSE107898；鼻#2-GSE55458；支气管#1-GSE107971；支气管#2-GSE107897；肺泡#1：GSE61220)中的选定炎性体组分和抗病毒基因的表达水平。在报道了多种处理条件的数据集中，仅选择基础/模拟条件。将RPM值鼻#2-GSE55458、支气管#1-GSE107971对数化以用于热图生成。使用Graphpad Prism 8中的“双梯度”方法完成颜色映射(以灰色标度示出)。(F)感染(MOI＝5)后48小时，HRV16感染的原代人鼻上皮细胞中的IL-18分泌。

图9示出HRV16感染导致经由直接切割的NLRP1激活，并且需要cul^ZER1/ZYG11B介导的N-甘氨酸降解决定子途径。(A)内源性NLRP1、ASC和半胱天冬酶-1对于NHBE中HRV16诱导的IL-18的分泌是必不可少的。与先前一样，将Cas9对照、NLRP1、ASC和CASP1 KO NHBE用HRV16感染。感染后48小时收获条件培养基。(B)对于HRV16诱导的IL-18切割和ASC寡聚化，在遗传上需要NLRP1。与先前一样，将Cas9对照，NLRP1和ASC KO NHBE用HRV16感染。将切割的IL-18用箭头标记。(C)使NLRP1切割位点突变消除了NHBE中HRV16触发的IL-18分泌。将NLRP1 KONHBE用表达带FLAG标签的NLRP1^WT或NLRP1^Q130A(在PAM位点处携带沉默突变)的慢病毒构建体拯救。将拯救的细胞用HRV16感染或用他柏司他处理。通过IL-18ELISA分析条件培养基。**P<0.01，***P<0.001，n＝来自两次独立感染中的一次的3个重复试样。(D)Q130A消除了NHBE中的NLRP1切割、IL-18成熟和ASC寡聚化。将NLRP1 KO细胞或NLRP1^WT拯救的细胞或NLRP1^Q130A拯救的细胞用HRV16感染或用他柏司他处理。感染后48小时收获细胞。箭头：泳道8HRV16中的NLRP1切割产物。*：就在a.a.131-1213切割片段下方出现的非特异性NLRP1降解产物。还参见图3E、图5E、图5D。(E)MLN4924和硼替佐米阻断了HRV16诱导的IL-18分泌。将NHBE用MLN4924(1μM)或硼替佐米(1μM)预处理，然后进行HRV16感染或他柏司他处理。用ELISA测量IL-18水平。****，p<0.0001(双因素方差分析)，n＝3次独立感染/处理。(F)MLN4924和硼替佐米阻断了HRV16诱导的IL-1β分泌。(G)在HRV16感染的历程中，MLN4924不影响3Cpro依赖性VP2成熟。HRV16接种后48小时通过蛋白质印迹分析图9E-图9F中的来自HRV16感染的NHBE的裂解物。

图10进一步示出了NLRP1是HRV感染的主要炎性体传感器的结果。(A)HRV16感染的或他柏司他处理的NHBE的条件培养基中的半胱天冬酶-1活性。****P<0.0001(双因素方差分析)，n＝2次独立感染中的一次的4个重复试样。(B)HRV16感染的或他柏司他处理的NHBE的条件培养基中的半胱天冬酶-1活性。****P<0.0001，**P<0.01(双因素方差分析)。n＝3次感染。(C)HRV16感染的或他柏司他处理的NHBE的代表性形态。黑色箭头指示溶解性细胞死亡典型的膜鼓胀。下部小图有意聚焦在浮动细胞上；因此，附着的单层看起来模糊。(D)NHBE中的ASC和CASP1 KO的蛋白质印迹验证。(E)NHBE中的NLRP1 KO的基因组测序验证。(F)和(G)。HRV16感染的或他柏司他处理的KO NHBE中的LDH释放和IL-8分泌。**P<0.01，***P<0.001(双因素方差分析)。n＝3次感染/处理。****P<0.0001(双因素方差分析)。

图11示出NLRP1与其他免疫传感器(如TLR和RLR)平行地起作用。(A)提出的人气道上皮中的HRV触发的NLRP1激活的模型。(B)灵长类动物物种中的3Cpro切割位点的序列保守性。将最小切割位点(Q-G)加阴影。

具体实施方式

为了方便起见，在本说明书中提到的书目参考文献以参考文献列表的形式列出并且添加在实施例的末尾。将此类书目参考文献的全部内容通过引用并入本文。关于现有技术的任何讨论都不承认现有技术是本发明领域中的公知常识的一部分。本发明涉及可以触发人气道中由NLRP1激活的炎性体的PAMP的鉴定。更具体地，诸位发明人已经鉴定出涉及cullin^ZER1/ZYG11B和NEDD8激活酶(NAE)的NLRP1激活的炎性体途径以及所述途径的潜在抑制剂。

定义

为了方便起见，这里收集了说明书、实施例和所附权利要求中采用的某些术语。

必须注意，除非上下文另外明确规定，否则如本文和所附权利要求中所用，单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述”包括复数指示物。

如本文所用，术语“包含”或“包括”应解释为具体说明所提及的所陈述特征、整数、步骤或组分的存在，但是不排除一个或多个特征、整数、步骤或组分或其组的存在或添加。然而，在本公开文本的上下文中，术语“包含”或“包括”也包括“由……组成”。单词“包含(comprising)”的变型(如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)以及“包括(including)”的变型(如“包括(include)”和“包括(includes)”)具有相应变化的含义。

如本文所用，术语“核苷酸”、“核酸”或“核酸序列”是指寡核苷酸、多核苷酸或其任何片段；基因组或合成起源的DNA或RNA(其可以是单链或双链的并且可以表示正义链或反义链)；肽核酸(PNA)；或任何DNA样或RNA样材料。

如本文所用，术语“氨基酸”或“氨基酸序列”是指寡肽、肽、多肽或蛋白质序列，或这些中任一项的片段，以及天然存在的或合成的分子。在“氨基酸序列”在本文中叙述为是指天然存在的蛋白质分子的氨基酸序列的情况下，“氨基酸序列”和类似术语并不意为将氨基酸序列限制为与所叙述的蛋白质分子相关的完整天然氨基酸序列。

可提及的盐包括酸加成盐和碱加成盐。此类盐可以通过常规手段形成，例如通过使游离酸或游离碱形式的式I的化合物与一个或多个当量的适当的酸或碱任选地在溶剂或介质(所述盐在其中不可溶)中反应，然后使用标准技术(例如在真空中，通过冷冻干燥或通过过滤)除去所述溶剂或所述介质。盐也可以通过将盐形式的式I的化合物的反离子与另一种反离子交换来制备，例如使用合适的离子交换树脂。

盐的例子包括衍生自无机酸和有机酸的酸加成盐，和衍生自金属(例如钠、镁或优选钾和钙)的盐。

酸加成盐的例子包括与以下形成的酸加成盐：乙酸、2,2-二氯乙酸、己二酸、海藻酸、芳基磺酸(例如苯磺酸、萘-2-磺酸、萘-1,5-二磺酸和对甲苯磺酸)、抗坏血酸(例如L-抗坏血酸)、L-天冬氨酸、苯甲酸、4-乙酰氨基苯甲酸、丁酸、(+)樟脑酸、樟脑磺酸、(+)-(1S)-樟脑-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、肉桂酸、柠檬酸、环拉酸、十二烷基硫酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙磺酸、2-羟基乙磺酸、甲酸、富马酸、半乳糖二酸、龙胆酸、葡庚糖酸、葡糖酸(例如D-葡糖酸)、葡糖醛酸(例如D-葡糖醛酸)、谷氨酸(例如L-谷氨酸)、α-氧代戊二酸、乙醇酸、马尿酸、氢溴酸、盐酸、氢碘酸、羟乙磺酸、乳酸(例如(+)-L-乳酸和(±)-DL-乳酸)、乳糖酸、马来酸、苹果酸(例如(-)-L-苹果酸)、丙二酸，(±)-DL-扁桃酸、偏磷酸、甲磺酸、1-羟基-2-萘甲酸、烟酸、硝酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、帕莫酸、磷酸、丙酸、L-焦谷氨酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、硫酸、鞣酸、酒石酸(例如(+)-L-酒石酸)、硫氰酸、十一碳烯酸和戊酸。

盐的具体例子是衍生自矿物酸(如盐酸、氢溴酸、磷酸、偏磷酸，硝酸和硫酸)的盐；和衍生自有机酸(如酒石酸、乙酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、富马酸、苯甲酸、乙醇酸、葡糖酸、琥珀酸和芳基磺酸)的盐；以及衍生自金属(如钠、镁或优选钾和钙)的盐。

溶剂化物可以是化学计量的或非化学计量的溶剂化物。特别优选的溶剂化物是水合物，并且水合物的例子包括半水合物、一水合物和二水合物。

关于溶剂化物和用于制备和表征它们的方法的更详细的讨论参见Bryn等人,Solid-State Chemistry of Drugs,第二版,SSCI,Inc of West Lafayette出版,美国印第安纳州,1999,ISBN 0-967-06710-3。

如在本发明的上下文中使用的术语“治疗”是指预防性、改善性、治疗性或治愈性治疗。

术语“受试者”在本文中被定义为脊椎动物，特别是哺乳动物，更特别是人。出于研究的目的，所述受试者可以特别是至少一种动物模型，例如小鼠、大鼠等。例如，对于气道炎症和相关障碍的治疗，受试者可以是患有肠道病毒感染的人。

为了方便起见，在本说明书中提到的书目参考文献以参考文献列表的形式列出并且添加在实施例的末尾。将此类书目参考文献的全部内容通过引用并入本文。

本领域技术人员将理解，可以根据本文中给出的方法在不进行过度实验的情况下实施本发明。所述方法、技术和化学品正如在给出的参考文献中或在标准生物技术和分子生物学教科书中的方案中所述。

现在已经大体上描述了本发明，通过参考以下实施例将更容易地理解本发明，所述实施例是通过说明的方式来提供的，并不旨在限制本发明。

实施例

实施例1

材料和方法

细胞培养

293T(ATCC#CRL-3216)、HeLa-Ohio(ECACC General Cell Collection#84121901)和正常支气管上皮细胞(Lonza#CC-2541)获自商购来源并且将它们根据供应商的方案培养。永生化的人角质形成细胞(本文为N/TERT-1或N/TERT)是来自H.Reinwald的馈赠(MTA)[Mihaylova等人,Cell Rep.24:3000-3007.e3(2018)]。使所有细胞系均经历用LonzaMycoAlert(Lonza#LT07-118)的常规支原体测试。

使用慢病毒的质粒转染和稳定细胞系生成

先前描述了293T-ASC-GFP、N/TERT-ASC-GFP、N/TERT NLRP1 KO细胞[Zell等人,Arch.Virol.163:299-317(2018)]。将所有瞬时表达质粒使用ClaI和XhoI使用标准限制性克隆克隆到pCS2+载体中。用lentiCRISPR-v2(Addgene#52961)生成多克隆Cas9/CRISPR敲除细胞系，并且将所述细胞系用嘌呤霉素筛选。嘌呤霉素筛选7-10天后，用蛋白质印迹测试敲除效率。用QuickChangeXL II(Agilent#200522)进行定点诱变。使用pCDH载体(SystemBio)进行组成型慢病毒表达。多西环素诱导的Tet-ON慢病毒构建体是基于pTRIPZ骨架(ThermoFisher)。

抗体和细胞因子分析

此研究使用了以下抗体：c-Myc(Santa Cruz Biotechnology#sc-40)、HA标签(Santa Cruz Biotechnology，#sc-805)、GAPDH(Santa Cruz Biotechnology，#sc-47724)、ASC(Adipogen，#AL-177)、CASP1(Santa Cruz Biotechnology，#sc-622)、IL1B(R&Dsystems，#AF-201)、FLAG(SigmaAldrich，#F3165)、GFP(Abcam，#ab290)、NLRP1(R&Dsystems，#AF6788)、IL18(Abcam ab207324)和VP2(QED Bioscience，#18758)。HRV16-3Cpro通过兔血清(来自Ann Palmenberg博士和James Gern博士(威斯康星大学)的馈赠)检测。细胞因子和趋化因子测量是用人IL-1B ELISA试剂盒(BD,#557953)、人IL-18ELISA试剂盒(MBL Bioscience，#7620)和Immune Monitoring 65-Plex Human ProcartaPlex^TM组套(ThermoFisher EPX650-10065-901)进行的。

HRV16病毒繁殖

研究中使用的HRV是HRV-A16(毒株11757；ATCC VR-283，美国弗吉尼亚州马纳萨斯)，并且在HeLa细胞系(HeLa Ohio，ECACC 84121901，英国威尔特郡索尔兹伯里市波顿当)中繁殖。使HeLa细胞在伊格尔极限必需培养基(EMEM)

30-2003^TM(补充有10％胎牛血清(FBS)(BioWest，美国密苏里州堪萨斯城)、2％HEPES和1％抗生素-抗真菌剂(Anti-Anti)(Gibco))中生长并且在37℃下5％CO₂加湿培养箱中孵育。为了繁殖HRV16，首先将HeLa细胞接种在24孔板中过夜以达到约80％-90％的汇合度(图3A)。将细胞用1X杜氏磷酸盐缓冲盐水(dPBS)冲洗并且用HRV16感染，然后添加具有2％FBS、2％HEPES和1％Anti-Anti的EMEM。将感染的HeLa细胞在33℃下孵育两至三天。当观察到约80％致细胞病变效应(CPE)时，从感染的HeLa细胞上清液中收获病毒(图3B)。将HRV病毒储液在4℃下以3500rpm离心10min以去除细胞碎片，并且等分至冷冻管中以便在-80℃下储存。

人鼻病毒的接种

将HRV使用相应的细胞培养基稀释并且分别以5.0(NHBE)和1.0(HeLa)的感染复数(MOI)接种。将感染的细胞在33℃下孵育1h。添加来自病毒繁殖的条件非感染细胞培养基作为未感染对照。然后将HRV感染细胞和对照细胞在33℃下孵育长达感染后48小时(hpi)。在24-72hpi之间收集细胞培养上清液和细胞裂解物以进行相关测定。

使用鼻病毒噬斑测定进行病毒量化

将24孔板中的HeLa细胞(85％-95％汇合度)与100μL的来自感染的hNEC的从10^-1至10^-6连续稀释的样品在33℃下一起孵育1h。将板每15min摇动一次以确保病毒等量分布。去除接种物并且在每个孔用1mL Avicel(FMC Biopolymer)覆盖物替代，并且在33℃下孵育65-72h。对覆盖物组分进行优化以获得适于计数的HRV噬斑。将Avicel粉末添加到双强度的MEM中以配制1.2％Avicel溶液，并且最终浓度包含3％FBS、2％HEPES、1.5％NaHCO₃、3％MgCl₂和1％Anti-Anti。孵育时间段后去除Avicel覆盖物，并且将细胞用在1×PBS中的20％福尔马林固定1h。去除福尔马林，并且将细胞用1×PBS洗涤。将固定的细胞用1％结晶紫染色15min，并且洗涤。如下计算噬斑形成单位(PFU)：噬斑数×稀释因子＝每100μL的PFU数，然后将其表示为PFU/mL。

3D重建人支气管上皮的HRV16感染

支气管上皮的3D培养物购自Mattek(AIR-1484AIR-100EpiAirway，3DRespiratory Epithelial Human MicroTissues)，并且根据供应商的建议使用扩展培养方案进行培养。

CRISPR/Cas9敲除

根据Doyon组报道的方法在293T细胞中进行CRISPR/Cas9编辑[Agudelo等人,NatMethods.14:615-620(2017)](通过引用并入本文)，不同之处在于将指导RNA(sgRNA)克隆到pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)V2.0(Addgene 62988)中。使用LentiCRISPR-V2(Addgene52961)和稳定慢病毒转导进行N/TERT和NHBE KO。使用的sgRNA示于表1中。

表1：sgRNA的列表

实施例2

肠道病毒3Cpro激活人NLRP1炎性体

在常见的人病原体调查中，我们考虑了人鼻病毒(HRV)，即普通感冒的致病物。HRV是肠道病毒属(科：微小RNA病毒科(Picornaviridae)(引起多种人疾病(包括手足口病、心包/心肌炎和脊髓灰质炎)的单链RNA病毒家族)的成员[Zell,Arch.Virol.163:299-317(2018)]。重要的是，据报道原代人支气管上皮细胞的HRV感染可诱导半胱天冬酶-1激活和IL-1分泌[Zell,Arch.Virol.163:299-317(2018)；Piper等人,PLoS One 8:e63365(2013)]，尽管上游传感机制尚不清楚。值得注意的是，所有小RNA病毒(包括HRV)编码两种定义明确的蛋白酶，称为2Apro和3Cpro，这两种酶是将病毒基因组前体蛋白切割成单独的功能组分所必需的[Palmenberg,Annu.Rev.Microbiol.44:603-623(1990)]。还报道了这两种蛋白酶切割宿主蛋白以促进病毒复制或免疫逃逸[Walker等人,PLoS One 8:e71316(2013)；Croft等人,Sci.Rep.8:1569(2018)；de Breyne等人,Virology 378:118-122(2008)；Mukherjee等人,PLoS Pathogens 7:e1001311(2011)]。

为了测试HRV-3Cpro是否可以激活人NLRP1，我们在稳定表达ASC-GFP和NLRP1-FLAG的293T报告细胞系(称为293T-ASC-GFP-NLRP1-FLAG)中表达带Myc-标签的HRV-3Cpro。与载体转染的细胞相比，源自两种HRV毒株(HRV-14血清型B和HRV16血清型A)和密切相关的肠道病毒(柯萨奇B3)的3Cpro导致形成ASC-GFP斑点的细胞百分比显著增加(图1B，图2A-图2B)，与DPP8/9抑制剂他柏司他相似。相比之下，所测试的其他病毒蛋白酶(包括Zika NS2B-3(gZiPro)、诺如病毒(NV)3CLpro、SARS-3CLpro和天花(Variola)I7pro)均没有这样的效果(图1B，图2A-图2B)，尽管表达水平相似或甚至更高。HRV14-3Cpro激活人NLRP1的能力完全取决于其酶活性，因为使它的催化半胱氨酸残基突变(p.C146A)消除了ASC-GFP斑点形成(图1B，图2B)。在NLRP1激活的正交测定中，通过非变性PAGE(Native-PAGE)得出，HRV14-和HRV16-3Cpro在以单体NLRP1为代价的情况下直接诱导高分子量NLRP1寡聚物的形成(图1C，泳道2、3相比于泳道1)。我们无法可靠地测定HRV-2Apro对人NLRP1的影响，因为带Myc标签的2Apro不能在293T细胞中积累(图1C，泳道5)。这些发现将肠道病毒3Cpro(如由HRV编码的那些)确立为作为体外重构的人NLRP1炎性体的稳健病毒激活剂。此外，3Cpro的作用需要连续的蛋白酶体活性，因为蛋白酶体抑制剂MG132显著阻断了293T-ASC-GFP-NLRP1细胞中HRV-3Cpro诱导的ASC-GFP斑点形成(图1D)和NLRP1自身寡聚化(图1C，泳道1-3相比于8-10)。因此，尽管病原体起源和底物特异性非常不同，但是3Cpro和炭疽LT可能经由涉及切割然后“功能性降解”的共同机制分别触发人NLRP1和啮齿动物Nlrp1b。

最近，已经证明原代和永生化的人角质形成细胞内源性地表达NLRP1炎性体复合物的组分，并且因此在他柏司他处理后经历快速的焦亡[Zhong等人,Cell 167:187-202.e17(2016)；Zhong等人,J.Biol.Chem.293:18864-18878(2018)]。这提供了一个稳健的细胞系统来确定3Cpro是否可以激活内源性NLRP1炎性体。将永生化人角质形成细胞用多西环素诱导的(Tet-ON)慢病毒构建体稳定转导，所述构建体编码dsRed(载体对照)、HRV14-3Cpro或其无催化活性突变体C146A(图1E)。多西环素处理后，仅表达活性HRV14-3Cpro的细胞表现出焦亡的基本特征，包括切割的成熟IL-1β的分泌和去污剂不溶性ASC寡聚物的形成(图1E，泳道5相比于泳道1-4和泳道6)。尽管野生型3Cpro的表达低于其无活性突变体(p.C146A)，但是仍发生这种情况(图1E，泳道5相比于6)。用MG132预处理完全消除了IL-1β分泌和ASC寡聚化(图1E，泳道5相比于泳道8)。表达带GFP标签的ASC的人角质形成细胞的活细胞成像进一步证实了HRV14-3Cpro可以诱导ASC-GFP斑点形成(图1F)。HRV14-3Cpro诱导的焦亡完全取决于NLRP1，因为它通过CRISPR/Cas9的基因切除(NLRP1 KO Tet-ON HRV14-3Cpro)消除了多西环素诱导后的IL-1分泌、ASC寡聚化(图1G，泳道2-3相比于泳道5-6，图1H)和溶解性细胞死亡(图1I)。在瞬时转染的HRV14-和HRV16-3Cpro的实验中，NLRP1、ASC和CASP1缺失都具有相似的抑制作用(图2C-图2E)。因此，HRV-3Cpro可以通过激活内源性NLRP1炎性体，在永生化人角质形成细胞中充当焦亡性细胞死亡的有效触发物。类似于在293T细胞中重构的NLRP1(图1C-图1D)，这种效应还需要完整的蛋白酶体活性(图1E，泳道7相比于泳道8)，表明“功能性降解”机制可能在起作用。我们还观察到，表达3Cpro的角质形成细胞的子集用膜联蛋白V染色(而不是PI包含)的情况下经历了凋亡性细胞死亡(图2F)。这一观察结果与报道的3Cpro在其他细胞类型中的促凋亡作用[Buenz和Howe,Trends inMicrobiology 14:28-36(2006)；Croft等人,mBio 8(2017)]一致。相比之下，他柏司他仅导致了通过PI包含标记的溶解性细胞死亡(图2F)。

实施例3

3Cpro通过在Gln130与Gly131之间的单一位点处的直接切割来激活NLRp1

小RNA病毒3Cpro(包括HRV14-3Cpro)是具有明确定义的催化活性和广泛底物偏好的半胱氨酸蛋白酶[Palmberg,Annu.Rev.Microbiol.44:603-623(1990)；Matthews等人,Cell77:761-771(1994)]。就像炭疽LF直接切割啮齿动物Nlrp1b(Chavarria-Smith和Vance,PLoS Pathog.9:e1003452(2013)；Chavarria-Smith等人,PLoS Pathog.12:e1006052(2016))一样，我们假设3Cpro可经由直接切割来激活人NLRP1。过表达的NLRP1在其FIIND内经历了自切割并且因此当用N末端特异性抗体可视化时，以相差约20kDa的两条条带出现[Finger等人,J Biol.Chem.287:25030-25037(2012)；D’Osualdo等人,PLoS One6:e27396(2011)](图3A，泳道2)。在存在HRV14-3Cpro的情况下，使用相同的抗体两个另外的条带变得明显(图3A，泳道4)，而C末端FIIND^UPA-CARD片段保持完整，表明HRV14-3Cpro在靠近N末端的单个位点处(而不是在FIIND^UPA-CARD片段内)切割NLRP1。为了更精确地可视化3Cpro特异性切割，使用NLRP1^F1212A突变体进行相同的实验，所述突变体不能经历在FIIND内的自切割，因此通过SDS-PAGE得出仍为单一条带(图3B，泳道2)。随着HRV14-3Cpro量的渐增，NLRP1^F1212A被切割成比全长NLRP1小大约20kDa的单个蛋白水解产物(图3B)。在两个实验中，蛋白水解条带图案可以通过距NLRP1 N末端大约20kDa的单个切割位点来解释。当将无NLRP1表达细胞的裂解物与重组HRV14-3Cpro在33℃(HRV感染的优选温度)下一起孵育时，可以观察到相同的切割，表明观察到的切割最可能是直接的(图3C)。

基于切割的与全长NLRP1之间的尺寸差异，将3Cpro切割位点映射到紧接在PYRIN结构域(PYD)之后的接头区域(图3D，上部小图)，所述接头区域是在啮齿动物中不保守的区域。由于3Cpro需要在P'-1底物位点处的谷氨酰胺残基[Matthews等人,Cell 77:761-771(1994)]，存在于此接头区中的11个谷氨酰胺残基中的每一个均通过定点诱变改变为丙氨酸。在所有测试的丙氨酸突变体中，只有Q130A错义突变消除了通过HRV14-3Cpro(图3D，泳道5相比于其他泳道)和其他3CPro(图4A，泳道1-5相比于泳道6-10)的NLRP1切割。接下来，我们生成了稳定表达野生型NLRP1或不可切割的Q130A突变体(NLRP1^Q130A)的293T-ASC-GFP报告细胞(图3E，泳道2相比于泳道5)。3Cpro依赖性切割条带仅在表达野生型NLRP1的细胞中观察到(图3E，泳道2，黑色箭头)，并且因此可能源自a.a.131-1213。与野生型NLRP1相比，表达NLRP1^Q130A的细胞不再响应于HRV14-3Cpro表达而使ASC-GFP斑点成核；然而，所述细胞对他柏司他的响应相对于野生型NLRP1仍保持完整(图3F)。使用转染的NLRP1^Q130A和HRV16-3Cpro获得类似的结果(图4B)。

为了研究内源性炎性体反应，我们用野生型NLRP1或切割位点突变体NLRP1^Q130A拯救了NLRP1 KO人角质形成细胞。将“拯救的”细胞用Tet-ON HRV14-3Cpro慢病毒进一步转导。只有野生型NLRP1(而不是NLRP1^Q130A)恢复了HRV14-3Cpro触发的IL-1β分泌、ASC寡聚化(图3G，图3H，泳道5相比于泳道8)和溶解性细胞死亡(图3I，图4C)，而野生型NLRP1和NLRP1^Q130A两者均重新使得NLRP1 KO细胞能够响应于他柏司他(图3G，图3H，泳道6相比于泳道9；图3I，图4C)。这些结果表明，3Cpro触发的NLRP1激活是与人特异性PYRIN结构域相邻的在a.a.Q130与a.a.G131之间的离散切割位点的直接结果。由于此位点在啮齿动物中不保守，因此预期HRV-3Cpro不会激活鼠Nlrp1b。这与HRV(与大多数致病性人肠道病毒相似)不会自然感染啮齿动物的这一事实是一致的。为了用实验测试这一点，生成了表达Tet-ONHRV14-3Cpro的野生型和Nlrp1b KO鼠RAW264.7细胞。多西环素诱导在野生型或Nlrp1b KORAW264.7细胞中均未能诱导焦亡性细胞死亡。这些结果证实了HRV14-3Cpro不能激活鼠Nlrp1b(图4D-图4E)。

实施例4

3Cpro触发的人NLRP1激活需要cullin^ZER1/ZYG11B介导的N末端甘氨酸降解决定子途径

我们试图进一步剖析3Cpro对人NLRP1的切割是如何触发蛋白酶体依赖性炎性体激活的。与炭疽LF介导的鼠Nlrp1b的切割相比，HRV-3Cpro去除了大部分致病的功能获得性种系突变所在的整个人特异性NLRP1 PYRIN结构域(PYD)(Grandmange等人Annals of theRheumatic Diseases 76:1191-1198(2017)；Zhong等人,Cell 167:187-202.e17(2016)；Drutman等人,PNAS USA 116:19055-19063(2019)；Herlin等人,Rheumatology(2019),doi:10.1093/rheumatology/kez612)。几种可能的机制可以解释3Cpro切割是如何激活NLRP1的。例如，它可以减轻PYD结构域固有的自抑制性作用，或者2)所述切割可以触发切割后最大片段(在3Cpro切割位点与FIIND自蛋白水解位点之间，a.a.131-1213)的不稳定性。为了区分这两种可能性，我们检查了NLRP1的截短突变体(a.a.131-1474)，所述突变体模拟了由HRV14-3Cpro切割产生的主要产物(不同之处在于起始甲硫氨酸)。出乎意料的是，当在293T-ASC-GFP报告细胞中表达时，相对于野生型NLRP1，此突变体并未导致ASC-GFP斑点形成增加。此外，它仍然对他柏司他介导的激活完全敏感(图5A，图6A，泳道1相比于泳道2)。这些结果可以反驳第一种情况，并且表明去除NLRP1 PYD本身不足以解释HRV-3Cpro触发的NLRP1激活。

最近，许多报道表征了炭疽LF切割触发Nlrp1b激活的机制[Chui等人,Science364:82-85(2019)；Sandstrom等人,Science 364(2019),doi:10.1126/sciencedotaau1330；Xu等人,EMBO J.38:e101996(2019)]。LF切割产生了被II型N-降解决定子受体(如UBR2)识别的N末端降解决定子，所述降解决定子经由蛋白酶体降解抑制性Nlrp1b N末端片段(图5B)。这些发现解决了所述领域长期存在的问题，即为什么Nlrp1b激活可以被某些作为UBR蛋白的竞争性抑制剂的游离氨基酸(如苯丙氨酸和亮氨酸)阻断[Wickliffe等人,Cell Microbiol.10:1352-1362(2008)]。受这些发现的启发，我们假设类似的途径可能解释了HRV-3Cpro激活人NLRP1的能力。然而，人NLRP1的HRV-3Cpro切割产生带有N末端甘氨酸的片段(a.a.131-1273)，所述片段不是由相关UBR蛋白识别的规范II型N末端降解决定子[Wickliffe等人,Cell Microbiol.10:1352-1362(2008)；Varshavsky,PNAS USA 116:358-366(2019)]。虽然此手稿正在审查中，但是描述了甘氨酸特异性N-降解决定子途径[Timms等人,Science 365(2019)]。N末端甘氨酸残基被受体ZER1和ZYG11B及其配偶体cullin(CUL2和CUL5)(称为cullin^ZER1/ZYG11B)识别。cullin^ZER1/ZYG11B的机制使具有N末端甘氨酸残基的底物蛋白质泛素化，并且经由蛋白酶体引起所述底物蛋白质的降解。与UBR系统相比，N-甘氨酸降解决定子途径对II型游离氨基酸不敏感，但是可以被NEDD8/cullin抑制剂MLN4924抑制[Timms等人,Science 365(2019)](图5B)。使用一系列化学抑制剂，我们测试了新描述的N-甘氨酸降解决定子途径是否促成HRV-3Cpro触发的人NLRP1激活。在293T-ASC-GFP-NLRP1报告细胞中，MLN4924阻断了HRV14-3Cpro诱导的ASC-GFP斑点形成(图5C)，这类似于蛋白酶体抑制剂MG132和硼替佐米。MLN4924类似地阻断了293T-NLRP1-FLAG细胞中的HRV14-3Cpro NLRP1自身寡聚化(图5D，泳道5相比于泳道3)。最值得注意的是，它导致切割后NLRP1片段(对应于a.a.131-1213，考虑到FIIND自蛋白水解)的稳定，其程度与MG132和硼替佐米相似(图5D，泳道4-6相比于泳道3，黑色箭头)。II型N-降解决定子抑制剂苯丙氨酸对ASC-GFP斑点形成或NLRP1自身寡聚化没有影响(图5C，图5D，泳道7)。对于角质形成细胞中的内源性NLRP1炎性体观察到了类似的作用：MLN4924和硼替佐米在HRV14-3Cpro诱导时完全阻断了成熟IL-1β分泌和ASC寡聚化(图5E，泳道5、6相比于泳道4，图5F)。它还稳定了切割后的NLRP1片段，所述片段在未处理的细胞中低于检测限(图5E，泳道5、6相比于泳道4，黑色箭头)。MLN4924对角质形成细胞中他柏司他诱导的IL-1β分泌的影响小得多(图6B)，表明cullin^ZER1/ZYG11B系统不能完全解释DPP8/9抑制剂介导的NLRP1激活。

鉴于MLN4924对其他细胞途径的已知的多效性作用，我们使用CRISPR/Cas9缺失了293T-ASC-GFP报告细胞中的ZER1和ZYG11B(称为ZZ-dKO)。克隆ZZ-dKO293T-ASC-GFP细胞在野生型NLRP1和HRV14-3Cpro共表达后显示出ASC-GFP斑点的百分比显著降低，而UBR2 KO细胞与Cas9对照293T-ASC-GFP细胞没有差异(图5G，图6C)。作为另外的对照，检查了源自患者的功能获得性NLRP1突变p.M77T。这种突变本身足以引起整个N末端片段的不稳定(图6A，泳道3相比于泳道1)，这很可能是由于破坏了NLRP1折叠[Zhong等人Cell 167:187-202.e17(2016)]，并且与UBR或cullin^ZER1/ZYG11B介导的N-降解决定子途径无关。实际上，由NLRP1^M77T导致的ASC-GFP斑点形成细胞的百分比在ZZ-dKO或UBR2 KO中相对于对照细胞没有差异(图5G和图6C)。因此，对于HRV14-3Cpro触发的人NLRP1激活，特别需要cullin^ZER1/ZYG11B。3Cpro切割的NLRP1片段(a.a.131-1213)在ZZ-dKO细胞中相对于对照细胞显著稳定(图5H，泳道6-8相比于泳道5)，但是在UBR2KO细胞中不稳定(图6D，泳道5-6相比于泳道4)。这些结果进一步表明，3Cpro切割的NLRP1自蛋白水解片段(对应于a.a.131-a.a.1212)是cullin^ZER1/ZYG11B介导的N末端甘氨酸降解决定子途径的底物。

综上所述，这些发现为3Cpro触发的人NLRP1激活建立了详细的模型，所述模型与鼠模型有所相似，但又显著不同。在Q130与G131之间的3Cpro切割后，尽管PYD结构域丢失，但是切割的NLRP1片段(a.a.131-1213)仍保留了它的自抑制性活性。随后，它暴露的N末端甘氨酸被cullin^ZER1/ZYG11B依赖性N-甘氨酸降解决定子系统识别。这构成了NLRP1激活的必不可少的中间步骤，因为它将切割的自抑制性NLRP1 N末端片段传递到蛋白酶体进行“功能性降解”，同时释放FIIND^UPA-CARD以自身寡聚化并接合ASC。此模型与我们最初的观察结果一致，即过表达截短突变体NLRP1 a.a.131-1474不会导致炎性体激活(图5A)。最可能的解释是，从我们的过表达构建体中的Kozak序列衍生的必不可少的起始甲硫氨酸掩盖了第二个甘氨酸残基，使其不被cullin^ZER1/ZYG11B复合物完全识别。

实施例5

对于HRV感染期间的炎性体组装激活，需要NLRP1。

然后检查了活HRV感染在疾病相关的人上皮细胞类型中的作用。在过表达NLRP1-HA的HeLa-Ohio细胞中，如通过病毒衣壳蛋白VP2的积累检测的，接种(MOI＝1)后16小时实现了稳健的HRV16病毒复制(图8A，泳道4、5、10和11)。这伴随着在被感染细胞中出现约120kDa NLRP1切割产物(图8A，泳道10和11)。小分子泛HRV-3Cpro抑制剂卢平曲韦完全消除了NLRP1切割(图8A，泳道12相比于泳道10和11)。使用另外表达ASC-GFP的HeLa-Ohio细胞，我们接下来测试了HRV16感染是否会导致NLRP1炎性体复合物组装。即使HeLa-Ohio细胞显示出比角质形成细胞或HEK293T细胞更少的NLRP1炎性体激活(即使对于阳性对照他柏司他来说)，HRV16也导致了显著的ASC-GFP寡聚化(图8B，泳道2相比于泳道1)和斑点形成(图8C-图8D)。这些作用仅在表达野生型NLRP1的HeLa-Ohio-ASC-GFP细胞中观察到，但是在表达抗切割的NLRP1^Q130A突变体的细胞中没有观察到(图8B，泳道2相比于泳道5，图8C-图8D)。因此，活HRV16感染导致3Cpro依赖性NLRP1切割，并且激活重构的人NLRP1炎性体。

HRV是引起呼吸道感染的最常见的人病毒病原体之一。已知人气道上皮细胞内源性地表达多个dsRNA传感器(如TLR3、MDA5和RIG-I)，这些传感器均参与抗病毒防御。然而，在人气道上皮细胞中表达的内源性炎性体组分的种类尚未完全表征。通过检查已公开的RNAseq数据集，我们发现原代人类气道上皮细胞[Landry等人,J.Infect.Dis.217:897-905(2018)；Mihaylova等人,Cell Rep.24:3000-3007.e3(2018)；Clark等人,PLoS One 10:e0115486(2015)；Hedstrom等人,Sci.Rep.8:3502(2018)；Tian等人,BMC Genomics 16:529(2015)]表达非常有限的NLR传感器种类(图8E)。值得注意的是，其他已知的炎性体传感器(MEFV、NLRP3、NLRC5和AIM2)表达低或完全不存在(图8E)。在21个重复试样中，我们证实了NLRP3在原代人支气管上皮细胞中不表达(TPM<1)(图7A)。通过RNA原位染色，NLRP3在原代人鼻上皮中也是无法检测的(图7B)。最近，一项独立研究证实了NHBE中NLRP3炎性体的缺乏[Lee等人,Sci Immunol.4(2019),doi:10.1126/sciimmunoldotaau4643]。尽管我们不能排除NLRP3 mRNA可能在特定条件下在转录方面被诱导，但是这些结果表明NLRP1(而不是NLRP3)是在人气道上皮细胞中组成型表达的主要炎性体传感器。除NLRP1之外，所有气道上皮细胞类型均内源性地表达PYCARD(ASC)、CASP1和IL-1细胞因子(IL1B和IL18)(图8E，图7A)，表明它们被“引发”经历了NLRP1介导的炎性体激活。

我们分析了原代人支气管上皮细胞(NHBE)的内源性细胞因子和趋化因子对活HRV16感染的反应(图7C)。明显的是，IL-18(其分泌严格依赖于炎性体激活)在HRV16感染和他柏司他处理的NHBE两者中均是被最高度诱导的细胞因子(图7D)。随后的ELISA实验证实了IL-1β也从HRV16感染和他柏司他处理的NHBE中显著分泌，但是其水平低于IL-18的水平并且更多变(图7E-图7F)，可能是因为IL1B mRNA经受转录调节。通过原代鼻上皮细胞也获得了类似的结果(图8F)。与NHBE中缺乏内源性NLRP3一致，在HRV16感染或他柏司他处理后，IL-1β和IL-18分泌均不受NLRP3抑制剂MCC950的影响，而3Cpro抑制剂卢平曲韦完全消除了HRV16诱导的(而不是他柏司他诱导的)IL-1β和IL-18分泌(图7E-图7F)。我们进行了人支气管上皮的3D气升培养物的顶端HRV16感染，以更接近地反映体内人气道的早期普通感冒感染(图7G)。HRV16感染和他柏司他两者均导致上皮细胞的显著破坏、粘蛋白产生增加和杯状细胞充胀(图7H)。在HRV16感染的情况下，这伴随着IL-18的分泌，特别是在发生病毒接种的顶端培养上清液中(图7I)。相比之下，他柏司他导致在顶端和基底培养基中的IL-18分泌，这可能是由于其通过培养物快速扩散(图7I)。

HRV16感染的NHBE表现出炎性体激活的基本特征，包括1)IL-18和IL-1β蛋白水解加工成其p17成熟形式(图7J，中间小图)，2)内源性ASC寡聚化(图7J，下部小图)，3)半胱天冬酶-1激活(图10A)，4)完整的LDH活性的释放(图10B)以及5)特征性膜“鼓胀”(图10C，黑色箭头)。综上所述，这些结果表明HRV16感染激活了原代人支气管上皮细胞中的NLRP1(而不是NLRP3)炎性体途径。

实施例6

HRV16感染经由直接切割导致NLRP1激活，并且需要cul^ZER1/ZYG11B介导的N-甘氨酸降解决定子途径

我们试图进一步验证内源性NLRP1是否是HRV触发的炎性体激活的专性传感器。原代NHBE中CRISPR/Cas9介导的NLRP1、其下游衔接子ASC和半胱天冬酶-1前体的缺失完全消除了由HRV16感染或他柏司他处理导致的IL-18切割(图9A，图10D-图10E)。注意，NHBE中的内源性NLRP1低于蛋白质印迹检测限。此外，HRV16感染的NLRP1敲除NHBE无法将IL-18切割成其成熟的p17形式(图9B，泳道1-3相比于泳道7-12)或将ASC组装成高分子量寡聚物(图9B，泳道1-3相比于泳道7-12)。这不是由病毒生物发生的一般缺陷引起的，因为衣壳蛋白VP2的成熟本身取决于3Cpro活性[Cordingley等人,J.Biol.Chem.265:9062-9065(1990)]，而不受NLRP1或ASC KO的影响(图9B，上部小图)。这些结果进一步支持了NLRP1是人NHBE中HRV感染的主要炎性体传感器。HRV触发的炎性体激活可能与其他免疫传感途径平行发生，因为NLRP1、ASC和CASP1 KO NHBE仍然能够产生其他细胞因子(如IL-8)并且在HRV16感染后经历细胞死亡(图10F-图10G)。

为了确认HRV诱导的NLRP1激活需要在a.a.Q130-G131处切割，我们对用带FLAG标签的野生型NLRP1或NLRP1^Q130A慢病毒构建体拯救的NLRP1 KO NHBE进行感染。如先前用角质形成细胞观察到的(图3E-图3I)，在NLRP1 KO NHBE中，野生型NLRP1和NLRP1^Q130A两者均拯救了他柏司他依赖性IL-18分泌和ASC寡聚化(图9C，图9D，泳道9和12相比于泳道3和6)。然而，尽管VP2成熟水平相似，但是只有野生型NLRP1(而不是不可切割的突变体Q130A)拯救了HRV16诱导的IL-18分泌和ASC寡聚化(图9C，图9D，泳道8相比于泳道11)。此外，3Cpro切割片段只能在表达野生型NLRP1的细胞(而不是表达NLRP1^Q130A的细胞)中检测到(图9D，泳道8相比于泳道11，上部小图，黑色箭头。注意，这条条带在所有样品中接近降解条带处出现，星号)。总之，这些发现证实了3Cpro的直接切割是NHBE中HRV诱导的NLRP1激活所必要且充分的步骤。据我们所知，这些发现鉴定了3Cpro是由人NLRP1传感的第一个PAMP激活剂。

研究了HRV依赖性NLRP1激活是否需要N末端甘氨酸降解决定子途径。MLN4924对cullin^ZER1/ZYG11B的抑制和硼替佐米对蛋白酶体的抑制完全阻断了NHBE中的HRV16依赖性IL-1β和IL-18分泌。(图9E-F)。然而，MLN4924不影响他柏司他依赖性IL-18分泌，并且对他柏司他依赖性IL-1β分泌仅有适度影响(图9E-图9F)。这些发现证实了cullin^ZER1/ZYG11B和蛋白酶体两者对于NHBE中HRV触发的NLRP1炎性体激活都是必需的。作为重要的对照，MLN4924(与卢平曲韦和硼替佐米不同)不影响本身依赖于3Cpro切割的成熟衣壳蛋白VP2的积累(图9G)。因此，对于HRV诱导的NLRP1激活，特别需要cullin^ZER1/ZYG11B，而不影响病毒复制或3Cpro活性。

总结

肠道病毒3C蛋白酶(如HRV-3Cpro)经由a.a.Q130与G131之间的单个位点处的直接切割来激活人炎性体传感器NLRP1(图11A)。这一发现不仅为人和啮齿动物的NLRP1炎性体提供了统一的机制[Chui等人,Science 364:82-85(2019)；Sandstrom等人,Science 364(2019)10.1126/sciencedotaau1330；Xu等人,EMBO J.38:(2019)]，它还揭示了最近描述的“N末端甘氨酸降解决定子”途径在人先天免疫中的出乎意料的作用。机械性地，3Cpro切割在NLRP1片段上留下甘氨酸残基(p.G131)，所述片段成为cullin^ZER1/ZYG11B“N-甘氨酸降解决定子”机构的底物并且随后被蛋白酶体降解(图11A)。这构成了释放NLRP1FIIND^UPA-CARD卡片段以完全组装由ASC和半胱天冬酶-1组成的炎性体复合物的关键步骤。值得注意的是，即使单个切割位点突变(Q130A)可以完全阻断3Cpro激活NLRP1炎性体，但是此突变也不会影响DPP8/9抑制剂他柏司他触发的NLRP1激活。

肠道病毒3Cpro被鉴定为人NLRP1的PAMP触发物挑战了人们普遍认为的病毒蛋白酶在很大程度上使宿主免疫传感失效的观点。它还揭示了NLRP1的进化轨迹。3Cpro切割位点出现在猿猴灵长类动物(即猿，新世界和旧世界猴)的共同祖先中，而在诸如眼镜猴和狐猴的原猴类动物中不存在(图11B)。可以想象，最近进化的3Cpro响应性NLRP1等位基因在猿猴灵长类动物(包括人)的进化过程中提供了选择性的存活优势，推断可以传感并且发起针对某些猿猴-热带肠道病毒病原体的适当免疫应答。这并不排除人NLRP1可以检测除3Cpro之外的其他病原体或危险衍生的信号的可能性。

本文的发现还将人NLRP1确立为气道上皮中的突出病毒传感器，其可能与其他免疫传感器(如TLR和RLR)平行地发挥功能(图11B)。由于炎性体途径不需要从头的蛋白质合成，因此当宿主转录和翻译已经被病毒毒力因子关闭并且不再能够制造其他抗病毒分子时，它特别适合作为“失效保护(fail-safe)”防御机制[Carrasco和Smith,Nature 264:807-809(1976)]。使用HRV作为模式肠道病毒，我们证明了NLRP1及其辅因子对于原发性人支气管上皮细胞中HRV触发的炎性体激活是必不可少的。基于这些结果，我们提出了NLRP1炎性体在人气道上皮的抗病毒防御和病理性炎症两者中起关键作用。呼吸道病毒感染(包括HRV)是哮喘和慢性阻塞性肺疾病(COPD)恶化的熟知风险因素[Jacobs等人,Clin.Microbiol.Rev.26:135-162(2013)]。因此，NLRP1炎性体途径是治疗这些疾病及其并发症的潜在治疗靶标。

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序列表

<110> 南洋理工大学

新加坡科技研究局

<120> 肠道病毒3C蛋白酶直接切割人NLRP1触发气道上皮中N-甘氨酸降解决定子介导的炎性体激活

<130> SP102476WO

<150> SG10202002526P

<151> 2020-03-19

<160> 41

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> NLRP1#1

<400> 1

gatagcccga gtgacatcgg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> NLRP1#2

<400> 2

agcccgagtg acatcggtgg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CASP1#1

<400> 3

acagacaagg gtgctgaaca 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CASP1#2

<400> 4

attgactccg ttattccgaa 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CASP1#3

<400> 5

tgactccgtt attccgaaag 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ASC#2

<400> 6

gctaacgtgc tgcgcgacat 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ASC#3

<400> 7

catgtcgcgc agcacgttag 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> UBR2#1

<400> 8

tgcataactt gaactttgag 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> UBR2#2

<400> 9

tccatgcaca aaacacaagt 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> UBR2#3

<400> 10

actgtggtga tactgaagcc 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> UBR2#4

<400> 11

tgatactgaa gcctggaaag 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> UBR2#5

<400> 12

ttgcatgctg tttaatgatg 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ZER1#5

<400> 13

cagggaccca atcaatcatg 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ZER1#6

<400> 14

ggcaggacga gtctatccag 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ZER1#7

<400> 15

aggctgaaga agctctcgtg 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ZYG11B#5

<400> 16

agcgctcgta aggatcctcg 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ZYG11B#6

<400> 17

gcagtggctt tgcaaccatg 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ZYG11B#7

<400> 18

cttggttaag ttaaatacac 20

<210> 19

<211> 53

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人 3Cpro切割位点

<400> 19

Leu Met Pro Trp Ile His Glu Leu Pro Ala Gly Cys Thr Gln Gly Ser

1 5 10 15

Glu Arg Arg Val Leu Arg Gln Leu Pro Asp Thr Ser Gly Arg Arg Trp

20 25 30

Arg Glu Ile Ser Ala Ser Leu Leu Tyr Gln Ala Leu Pro Ser Ser Pro

35 40 45

Asp His Glu Ser Pro

50

<210> 20

<211> 53

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 黑猩猩3Cpro切割位点

<400> 20

Leu Met Pro Trp Ile His Glu Leu Pro Ala Gly Cys Thr Gln Gly Ser

1 5 10 15

Glu Arg Arg Val Leu Arg Gln Leu Pro Asp Thr Ser Gly Arg Arg Trp

20 25 30

Arg Glu Ile Ser Ala Ser Leu Leu Tyr Gln Ala Leu Pro Ser Ser Pro

35 40 45

Asp His Glu Ser Pro

50

<210> 21

<211> 53

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 倭黑猩猩 3Cpro切割位点

<400> 21

Leu Met Pro Trp Ile His Glu Leu Pro Ala Gly Cys Thr Gln Gly Ser

1 5 10 15

Glu Arg Arg Val Leu Arg Gln Leu Pro Asp Thr Ser Gly Arg Arg Trp

20 25 30

Arg Glu Ile Ser Ala Ser Leu Leu Tyr Gln Ala Leu Pro Ser Ser Pro

35 40 45

Asp His Glu Ser Pro

50

<210> 22

<211> 53

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 大猩猩3Cpro切割位点

<400> 22

Leu Met Pro Trp Ile His Glu Leu Pro Ala Gly Cys Thr Gln Gly Ser

1 5 10 15

Glu Arg Arg Val Leu Arg Gln Leu Pro Asp Thr Ser Gly Arg Arg Trp

20 25 30

Arg Glu Ile Ser Ala Ser Leu Leu Tyr Gln Ala Leu Pro Ser Ser Pro

35 40 45

Asp His Glu Ser Pro

50

<210> 23

<211> 53

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猩猩3Cpro切割位点

<400> 23

Leu Met Pro Trp Ile His Glu Leu Pro Ala Gly Cys Thr Gln Gly Ser

1 5 10 15

Glu Arg Arg Val Leu Arg Gln Leu Pro Asp Thr Ser Gly Arg Arg Trp

20 25 30

Arg Glu Ile Ser Ser Ser Leu Leu Tyr Gln Ala Leu Pro Ser Ser Pro

35 40 45

Asp Tyr Glu Ser Pro

50

<210> 24

<211> 53

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 长臂猿3Cpro切割位点

<400> 24

Leu Met Pro Trp Ile Cys Glu Leu Pro Ala Gly Cys Thr Gln Gly Ser

1 5 10 15

Glu Arg Arg Val Leu Arg Gln Leu Pro Asp Thr Ser Gly Arg Arg Trp

20 25 30

Arg Glu Ile Ser Ser Ser Leu Leu Tyr Gln Ala Leu Pro Ser Ser Pro

35 40 45

Asp His Glu Ser Pro

50

<210> 25

<211> 53

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 东非狒狒3Cpro切割位点

<400> 25

Leu Arg Pro Trp Asn Arg Glu Leu Pro Gly Glu Cys Thr Gln Gly Ser

1 5 10 15

Glu Arg Arg Val Leu Arg Gln Leu Pro Asp Thr Ser Gly Arg Arg Trp

20 25 30

Arg Glu Ile Ser Ser Ser Leu Leu Tyr Gln Ala Phe Pro Ser Ser Pro

35 40 45

Asp Phe Glu Ser Pro

50

<210> 26

<211> 53

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 狮尾狒3Cpro切割位点

<400> 26

Leu Arg Pro Trp Asn Arg Glu Leu Pro Ala Glu Cys Thr Gln Gly Ser

1 5 10 15

Glu Arg Arg Val Leu Arg Gln Leu Pro Asp Thr Ser Gly Arg Arg Trp

20 25 30

Arg Glu Ile Ser Ser Ser Leu Leu Tyr Gln Ala Leu Pro Ser Ser Pro

35 40 45

Asp Phe Glu Ser Pro

50

<210> 27

<211> 53

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 白颈白眉猴3Cpro切割位点

<400> 27

Leu Arg Pro Trp Asn Arg Glu Leu Pro Ala Glu Cys Thr Gln Gly Ser

1 5 10 15

Glu Arg Arg Val Leu Arg Gln Leu Pro Asp Thr Ser Gly His Arg Trp

20 25 30

Arg Glu Ile Ser Ser Ser Leu Leu Tyr Gln Ala Phe Pro Ser Ser Pro

35 40 45

Asp Phe Glu Ser Pro

50

<210> 28

<211> 53

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鬼狒 3Cpro切割位点

<400> 28

Leu Arg Pro Trp Asn Arg Glu Leu Pro Ala Glu Cys Thr Gln Gly Ser

1 5 10 15

Glu Arg Arg Val Leu Arg Gln Leu Pro Asp Thr Ser Gly Arg Arg Trp

20 25 30

Arg Glu Ile Ser Ser Ser Leu Leu Tyr Gln Ala Phe Pro Ser Ser Pro

35 40 45

Asp Phe Glu Ser Pro

50

<210> 29

<211> 53

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 猕猴3Cpro切割位点

<400> 29

Leu Arg Pro Trp Asn Arg Glu Leu Pro Ala Glu Cys Thr Gln Gly Ser

1 5 10 15

Glu Arg Arg Val Leu Arg Gln Leu Pro Asp Thr Ser Gly Arg Arg Trp

20 25 30

Arg Glu Ile Ser Ser Ser Leu Leu Tyr Gln Ala Leu Pro Ser Ser Pro

35 40 45

Asp Phe Glu Ser Pro

50

<210> 30

<211> 53

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豚尾猴3Cpro切割位点

<400> 30

Leu Arg Pro Trp Asn Arg Glu Leu Pro Ala Glu Cys Thr Gln Gly Ser

1 5 10 15

Glu Arg Arg Val Leu Arg Gln Leu Pro Asp Thr Ser Gly Arg Arg Trp

20 25 30

Arg Glu Ile Ser Ser Ser Leu Leu Tyr Gln Val Leu Pro Ser Ser Pro

35 40 45

Asp Phe Glu Ser Pro

50

<210> 31

<211> 53

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 长尾黑颚猴AGM 3Cpro切割位点

<400> 31

Leu Arg Pro Trp Asn Arg Glu Leu Pro Ala Glu Cys Thr Gln Gly Ser

1 5 10 15

Glu Arg Arg Val Leu Arg Gln Leu Pro Asp Thr Ser Gly Arg Arg Trp

20 25 30

Arg Glu Ile Ser Ser Ser Phe Leu Tyr Gln Ala Leu Pro Ser Ser Pro

35 40 45

Asp Leu Glu Ser Pro

50

<210> 32

<211> 53

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 黑仰鼻猴3Cpro切割位点

<400> 32

Leu Arg Pro Trp Asn Cys Asp Leu Pro Ala Glu Cys Thr Gln Gly Ser

1 5 10 15

Glu Arg Arg Val Leu Arg Gln Leu Pro Asp Thr Ser Gly His Arg Trp

20 25 30

Arg Glu Ile Ser Ser Ser Leu Leu Tyr Gln Ala Leu Pro Ser Ser Pro

35 40 45

Asp Phe Glu Ser Pro

50

<210> 33

<211> 53

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 川金丝猴3Cpro切割位点

<400> 33

Leu Arg Pro Trp Asn Arg Asp Leu Pro Ala Glu Cys Thr Gln Gly Ser

1 5 10 15

Glu Arg Arg Val Leu Arg Gln Leu Pro Asp Thr Ser Gly His Arg Trp

20 25 30

Arg Glu Ile Ser Ser Ser Leu Leu Tyr Gln Ala Leu Pro Ser Ser Pro

35 40 45

Asp Phe Glu Ser Pro

50

<210> 34

<211> 53

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 安哥拉疣猴3Cpro切割位点

<400> 34

Leu Arg Ser Trp Asn His Glu Leu Pro Ala Glu Cys Thr Gln Val Ser

1 5 10 15

Glu Arg Arg Val Leu Arg Gln Leu Pro Asp Thr Ser Gly His Arg Trp

20 25 30

Arg Glu Ile Ser Ser Ser Leu Leu Tyr Gln Ala Leu Pro Ser Ser Pro

35 40 45

Asp Phe Glu Ser Pro

50

<210> 35

<211> 52

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 卷尾猴3Cpro切割位点

<400> 35

Leu Arg Ser Trp Ile Pro Glu Leu Gln Gly Cys Thr Gln Gly Ser Glu

1 5 10 15

Arg Ser Ile Leu Arg His Leu Pro Asp Thr Ser Gly His His Trp Arg

20 25 30

Glu Ile Thr Ser Ser Leu Leu Tyr Gln Ala Pro Leu Ser Ser Pro Asp

35 40 45

Tyr Gly Ser Pro

50

<210> 36

<211> 52

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 玻利维亚松鼠猴3Cpro切割位点

<400> 36

Leu Arg Ser Trp Ile Pro Glu Leu Gln Gly Cys Thr Gln Gly Ser Glu

1 5 10 15

Arg Ser Val Leu Arg His Leu Pro Asp Met Ser Gly His Arg Trp Arg

20 25 30

Glu Ile Thr Ser Ser Leu Leu Tyr Gln Ala Pro Leu Ser Ser Pro Asp

35 40 45

Tyr Gly Ser Pro

50

<210> 37

<211> 52

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 狨猴3Cpro切割位点

<400> 37

Leu Arg Ser Gln Ile Pro Glu Leu His Gly Cys Thr Gln Arg Ser Glu

1 5 10 15

Arg Ser Val Ser Arg Arg Leu Pro Asp Thr Ser Gly His Gln Trp Arg

20 25 30

Glu Ile Thr Ser Ser Leu Leu Tyr Gln Ala Pro Leu Ser Ser Pro Asp

35 40 45

Tyr Gly Ser Pro

50

<210> 38

<211> 52

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 秘鲁夜猴(Ma's Night Monkey)3Cpro切割位点

<400> 38

Leu Arg Ser Ser Ile Pro Glu Leu Gln Gly Cys Thr Gln Gly Ser Lys

1 5 10 15

Arg Ser Ile Leu Arg His Leu Pro Asp Thr Ser Gly His Arg Trp Arg

20 25 30

Glu Ile Thr Ser Ser Leu Leu Tyr Gln Ala Pro Leu Ser Ser Pro Asp

35 40 45

Tyr Gly Ser Pro

50

<210> 39

<211> 53

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 眼镜猴3Cpro切割位点

<400> 39

Leu Gly Ile Leu Gly Pro Gly Ser Leu Glu Ser Pro Gln Asp Ser Glu

1 5 10 15

Lys Arg Arg Ile Leu Arg Trp Pro Pro Asp Thr Ser Gly Asn Asn Trp

20 25 30

Arg Glu Ile Lys Pro Leu Pro Leu Phe Glu Ala Leu Ser Ser Phe Pro

35 40 45

Val Tyr Gln Ser Pro

50

<210> 40

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鼠狐猴3Cpro切割位点

<400> 40

Ser Ser Pro Asp Phe Pro Cys Phe Gly Leu Cys His Pro Glu Ser Pro

1 5 10 15

Arg Leu Gln

<210> 41

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 克氏冕狐猴(Coquerel's Sifaka)3Cpro切割位点

<400> 41

Pro Pro Pro Leu Leu Pro Trp Gly Thr Pro Arg Ser Gln Lys Arg Glu

1 5 10 15

Gly Phe Gln

Claims

1.一种化合物或包含所述化合物的组合物，所述化合物或组合物用于预防或治疗由肠道病毒3C蛋白酶切割的NLRP1触发的人气道炎症和/或相关并发症，其中所述化合物或组合物是NLRP1炎性体激活的抑制剂。

2.根据权利要求1所述的化合物或包含所述化合物的组合物，其中所述3C蛋白酶来自选自以下的病毒物种：人肠道病毒A(HEV-A)、人肠道病毒B(HEV-B)、人肠道病毒C(HEV-C)、人肠道病毒D(HEV-D)、人鼻病毒A(HRV-A)、人鼻病毒B(HRV-B)和人鼻病毒C(HRV-C)。

3.根据权利要求1或2所述的化合物或包含所述化合物的组合物，其中所述化合物抑制N-甘氨酸降解决定子途径泛素化和NLRP1切割产物的降解。

4.根据权利要求3所述的化合物或包含所述化合物的组合物，其中所述化合物抑制cullin^ZER1/ZYG11B。

5.根据权利要求4所述的化合物或包含所述化合物的组合物，其中所述化合物是NEDD8激活酶(NAE)的抑制剂。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的化合物或包含所述化合物的组合物，其中所述化合物选自：

7.根据权利要求1至6中任一项所述的化合物或包含所述化合物的组合物，其中所述3C蛋白酶来自人鼻病毒。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，所述组合物包含所述抑制剂化合物的药学上可接受的盐或溶剂化物或药学功能衍生物。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的组合物，所述组合物包含抑制剂化合物与药学上可接受的佐剂、稀释剂或载体。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的化合物或组合物在制造用于预防或治疗由肠道病毒3C蛋白酶激活的NLRP1触发的人气道炎症和/或相关并发症的药剂中的用途。

11.根据权利要求10所述的用途，其中所述药剂减少了IL-1β和IL-18分泌、ASC寡聚化和/或溶解性细胞死亡。

12.根据权利要求10或11所述的用途，其中所述3C蛋白酶来自选自以下的病毒物种：人肠道病毒A(HEV-A)、人肠道病毒B(HEV-B)、人肠道病毒C(HEV-C)、人肠道病毒D(HEV-D)、人鼻病毒A(HRV-A)、人鼻病毒B(HRV-B)和人鼻病毒C(HRV-C)。

13.根据权利要求10至12中任一项所述的用途，其中所述化合物抑制N-甘氨酸降解决定子途径泛素化和NLRP1切割产物的降解。

14.根据权利要求10至13中任一项所述的用途，其中所述化合物抑制cullin^ZER1/ZYG11B。

15.根据权利要求10至14中任一项所述的用途，其中所述化合物是NEDD8激活酶(NAE)的抑制剂。

16.根据权利要求10至15中任一项所述的用途，其中所述化合物选自：

17.一种预防或治疗受试者的由肠道病毒3C蛋白酶激活的NLRP1触发的气道炎症和/或相关并发症的方法，所述方法包括施用治疗有效量的根据权利要求1至9中任一项所述的化合物或组合物。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述3C蛋白酶来自选自以下的病毒物种：人肠道病毒A(HEV-A)、人肠道病毒B(HEV-B)、人肠道病毒C(HEV-C)、人肠道病毒D(HEV-D)、人鼻病毒A(HRV-A)、人鼻病毒B(HRV-B)和人鼻病毒C(HRV-C)。

19.根据权利要求17或18所述的方法，其中所述化合物抑制N-甘氨酸降解决定子途径泛素化和NLRP1切割产物的降解。

20.根据权利要求17至19中任一项所述的方法，其中所述化合物抑制cullin^ZER1/ZYG11B。

21.根据权利要求17至20中任一项所述的方法，其中所述化合物是NEDD8激活酶(NAE)的抑制剂。

22.根据权利要求17至21中任一项所述的方法，其中所述化合物选自：

23.根据权利要求17至22中任一项所述的方法，其中与未经治疗的受试者相比，被施用所述预防或治疗的受试者将在气道中具有减少的IL-1分泌、ASC寡聚化和/或溶解性细胞死亡。

24.根据权利要求17至23中任一项所述的方法，其中所述化合物是MLN4924，IUPAC名称((1S,2S,4R)-4-(4-(((S)-2,3-二氢-1H-茚-1-基)氨基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2-羟基环戊基)甲基氨基磺酸酯或其盐酸盐。