BR112019013463A2

BR112019013463A2 - Método para a modulação da atividade de inflamassoma e da inflamação nos pulmões

Info

Publication number: BR112019013463A2
Application number: BR112019013463-8A
Authority: BR
Inventors: Keane Robert; Dietrich Dalton; Kerr Nadine; Wu Shu; Pablo De Rivero Vaccari Juan
Original assignee: University Of Miami
Priority date: 2016-12-29
Filing date: 2017-12-28
Publication date: 2020-01-07
Also published as: PH12019501549A1; AU2017386550A1; US10961306B2; US20200347124A1; US10703811B2; CA3176518A1; EP3562506A4; US20210324065A1; US11174307B2; CA3048864A1; SG10202106385XA; WO2021217004A2; JP2023016835A; JP2023515271A; CO2019008087A2; EP4139348A2; WO2021217004A3; KR20200013630A; US20190002550A1; IL267685A

Abstract

a presente invenção fornece composições e métodos para a redução da inflamação nos pulmões de um mamífero que está atormentado por uma condição que leva à inflamação dos pulmões. as composições e métodos aqui descritos incluem agentes que inibem a sinalização de inflamassoma no mamífero tais como anticorpos direcionados contra os componentes de inflamassoma utilizados isolada-mente ou em combinação com inibidores de absorção da vesícula extracelular.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para ’’MÉTODO PARA A MODULAÇÃO DA ATIVIDADE DE INFLAMASSOMA E DA INFLAMAÇÃO NOS PULMÕES”.

[001] Este pedido reivindica a prioridade do Pedido Provisório U.S. n° de Série 62/440.180, depositado em 29 de dezembro de 2016, o qual é aqui incorporado por referência na sua totalidade para todos os propósitos.

DECLARAÇÃO QUANTO À PESQUISA PATROCINADA PELO GOVERNO FEDERAL [002] Esta invenção foi criada com o suporte do governo U.S. sob o número de concessão 4R42BS086274-02 concedido pelo National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS). O governo U.S. possuí certos direitos na invenção.

DESCRIÇÃO DO ARQUIVO DE TEXTO SUBMETIDO ELETRONICAMENTE [003] Os conteúdos do arquivo de texto submetidos eletronicamente com o presente são aqui incorporados por referência na sua totalidade: uma cópia em formato legível por computador da Listagem de Sequências (nome de arquivo: UNML010_01WO_SeqList_ST25.txt, data registrada: 28 de dezembro de 2017, tamanho de arquivo 2 kilobytes).

CAMPO [004] A invenção refere-se de uma forma geral aos campos da imunologia e medicina. Mais particularmente, a invenção refere-se às composições e métodos para a modulação da atividade de ASC (proteína semelhante a Speck associada com a apoptose contendo um Domínio de Recrutamento de Ativação da Caspase (CARD)) e Ausente na atividade de inflamassoma de Melanoma 2 (AlM2) nos pulmões de um mamífero como tratamentos para reduzir a inflamação em resposta às condições que produzem inflamação nos pulmões.

Petição 870190068968, de 22/07/2019, pág. 4/96

2/58

ANTECEDENTES [005] Lesão Cerebral Traumática (TBI) severa é uma grande preocupação com a saúde pública e é uma causa principal de mortalidade e morbidez por todo o mundo (3). Além da lesão direta ao cérebro, a TBI pode levar a complicações em outros órgãos, tais como os pulmões. A Lesão Pulmonar Aguda (ALI; 2) é um problema cardiopulmonar comum após o trauma e está associada com uma taxa de mortalidade hospitalar de até 40% (4). Os pacientes com TBI, em particular, são suscetíveis de desenvolver ALL com alguns estudos relatando uma incidência tão elevada quanto 30% (5). Estudos recentes demonstraram que fatores inflamatórios sistêmicos podem levar à disfunção pulmonar e lesões pulmonares após a TBI (6), mas o mecanismo molecular preciso subjacente à lesão pulmonar induzida por TBI permanece fracamente definido.

[006] Uma inundação de mediadores inflamatórios secretados, incluindo citocinas, quimiocinas e padrões moleculares associados aos danos (DAMPs) liberados pelas células lesionadas contribuem para a inflamação do cérebro e afetam os órgãos distais, tais como os pulmões (5). Uma dos DAMPs mais amplamente estudados é o grupo de alta mobilidade caixa 1 (HMGB1) que pode servir como um mediador precoce de inflamação em vários estados patogênicos, incluindo a TBI (7). Um estudo mais recente mostrou que o HMGB1 pode estar envolvido no mecanismo de disfunção pulmonar induzida por TBI (8). A liberação de HMGB1 pode ser regulada pelo inflamassoma (9), um complexo de múltiplas proteínas envolvido na ativação de caspase 1 e o processamento de IL-1 β e IL-18 após a TBI (10).

[007] Uma variedade de explicações tem sido apresentada para explicar os patomecanismos das complicações pulmonares após a TBI, incluindo permeabilidade vascular aumentada levando ao vazamento capilar e infiltração de resíduos proteináceos (11). Vesículas

Petição 870190068968, de 22/07/2019, pág. 5/96

3/58 extracelulares (EV) são vesículas contendo membranas que desempenham um papel na comunicação célula a célula (12) e foram implicadas de desempenhar um papel no desenvolvimento de AU em um modelo de murino induzido por LPS. Além disso, mostrou-se que a EV pode transportar citocinas bioativas tais como proteínas IL-1 β e inflamassoma (13) (14), e pode desencadear uma resposta imune e amplificar a inflamação através de sua carga para células vizinhas e circundantes. No entanto, é desconhecida que a sinalização de inflamassoma mediada por EV pode contribuir com o patomecanlsmo de ALI induzida por TBI. Além disso, também se desconhece se os patomecanismos de ALI induzida por TBI são compartilhados por outras condições que produzem Inflamação pulmonar. Além disso, há uma escassez de fármacos aprovados pela Federal Drug Administration (FDA) para tratar a inflamação pulmonar.

[008] Consequentemente, existe uma necessidade urgente não apenas para elucidar os patomecanísmos da Inflamação pulmonar provocadas por TBI assim como outras condições, mas também o desenvolvimento de composições terapêuticas e suas utilizações para o tratamento e/ou prevenção da Inflamação pulmonar.

SUMÁRIO [009] Em um aspecto, é aqui fornecido um método de tratamento de inflamação nos pulmões de um paciente com sua necessidade, o método compreendendo: a administração ao paciente de uma composição que compreende um agente que Inibe a sinalização de inflamassoma, por meio do qual a inflamação nos pulmões do paciente é tratada. Em alguns casos, a inflamação nos pulmões é provocada por uma condição selecionada a partir de uma lesão do sistema nervoso central (CNS), uma doença neurodegenerativa, uma doença autoimune, asma, doença pulmonar obstrutlva crônica, fibrose cística, doença pulmonar intersticial e síndrome da angústia respiratória aguda. Em al

Petição 870190068968, de 22/07/2019, pág. 6/96

4/58 guns casos, a tesão do CNS é selecionada do grupo que consiste em lesão cerebral traumática (TBI), acidente vascular cerebral e tesão da medula espinhal (SCI). Em alguns casos, a doença neurodegenerativa é selecionada do grupo que consiste em escterose lateral amiotrófica (ALS), escterose múltipla (MS) e doença de Parkinson (PD). Em alguns casos, a administração da composição resulta na inibição da ativação de inflamassoma nas células pulmonares do paciente. Em alguns casos, a administração da composição resulta em uma redução de caspase 1, proteína contendo o domínio de pirina de repetição rica em leucina de ligação a nucteotídeo 1 (NLRP1), proteína contendo o domínio de pirina de repetição rica em leucina de ligação a nucteotídeo 2 (NLRP2), proteína contendo o domínio de pirina de repetição rica em leucina de ligação a nucteotídeo 3 (NLRP3), proteína contendo o domínio CARD da família NLR 4 (NLRC4), caspase 11, inibidor ligado a X da proteína de apoptose (XIAP), panexina-1, proteína semelhante a Spec associada com apoptose contendo um Domínio de Recrutamento de Ativação da Caspase (ASC), interteucina-18 (IL-18), grupo de alta mobilidade caixa 1 (HMGB1) ou ausente em níveis de melanoma 2 (AIM2) nas células pulmonares do paciente em comparação com um controle, em que o controle é um paciente não tratado. Em alguns casos, as células pulmonares são células alveolares do tipo II. Em alguns casos, a administração da composição resulta em uma redução na tesão pulmonar aguda (ALI) em comparação com um controle, em que o controle é um paciente não tratado. Em alguns casos, a redução na ALI é evidenciada por uma redução na infiltração de neutrófilo no espaço alveolar e/ou intersticial, espessamento séptico alveolar reduzido ou ausente ou uma combinação destes. Em algumas situações, o agente é um inibidor de absorção da vesícula extracelular (EV), um anticorpo que se liga a um componente de inflamassoma ou uma combinação destes. Em alguns casos, o inibidor de absorção da EV é

Petição 870190068968, de 22/07/2019, pág. 7/96

5/58 um composto ou um anticorpo, em que o anticorpo é selecionado da Tabela 1. Em algumas situações, o agente é um inibidor de absorção da EV em combinação com um anticorpo que se liga a um componente de inflamassoma. Em algumas situações, o inibidor de absorção da EV é uma heparina. Em alguns casos, a heparina é Enoxaparin. Em alguns casos, o anticorpo que se liga a um componente de inflamassoma é um anticorpo que se liga especificamente a um componente de um inflamassoma AIM2, NLRP1, NLRP2, NLRP3 ou NLRP4 de mamífero. Em algumas situações, o componente de inflamassoma é caspase 1, ASC ou AIM2. Em algumas situações, o componente de inflamassoma é ASC. Em alguns casos, o anticorpo se liga a um domínio de PYRIN-PAAD-DAPIN N~terminal (PYD), domínio de recrutamento da caspase C-terminal (CARD) ou um epítopo derivado do domínio de PYD ou CARD da proteína ASC. Em algumas situações, o anticorpo se liga a uma proteína que possui pelo menos 85% de identidade de sequência com uma sequência de amínoácido selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2. Em alguns casos, o anticorpo inibe a atividade de ASC nos pulmões do paciente. Em alguns casos, a composição é formulada com um veículo ou díluente farmaceuticamente aceitável. Em alguns casos, a composição é administrada por via intracerebroventricular, intraperitoneal, intravenosa ou por inalação.

[0010] Em outro aspecto, é aqui fornecido um método de tratamento de inflamação nos pulmões de um paciente que foi submetido a uma lesão do sistema nervoso central (CNS), o método compreendendo: administrar ao paciente uma composição que compreende um agente que inibe a sinalização de inflamassoma, por meio do qual a inflamação nos pulmões do paciente é tratada. Em alguns casos, a lesão do CNS é selecionada do grupo que consiste em lesões traumáticas do cérebro (TBI), acidente vascular cerebral e lesão da medula

Petição 870190068968, de 22/07/2019, pág. 8/96

6/58 espinhal (SCI). Em alguns casos, a administração da composição resulta na inibição da ativação de inflamassoma nas células pulmonares do paciente. Em algumas situações, a administração da composição resulta em uma redução de caspase 1, NLRP1, NLRP2, NLRP3, NLRC4, caspase 11, XIAP, panexina-1, proteína semelhante a Spec associada com Apoptose contendo um Domínio de Recrutamento de Ativação da Caspase (ASC), interleucína-18 (IL-18), grupo de alta mobilidade caixa 1 (HMGB1) ou ausente em níveis de melanoma 2 (AIM2) nas células pulmonares do paciente em comparação com um controle, em que o controle é um paciente não tratado. Em alguns casos, as células pulmonares são células alveolares do tipo II. Em alguns casos, a administração da composição resulta em uma redução na lesão pulmonar aguda (ALI) em comparação com um controle, em que o controle é um paciente não tratado. Em alguns casos, a redução na ALI é evidenciada por uma redução na infiltração de neutrófilo no espaço alveolar e/ou intersticial, espessamento séptico alveolar reduzido ou ausente ou uma combinação destes. Em alguns casos, o agente é um inibidor de absorção da vesícula extracelular (EV), um anticorpo que se liga a um componente de inflamassoma ou uma combinação destes. Em algumas situações, o inibidor de absorção da EV é um composto ou um anticorpo, em que o anticorpo é selecionado da Tabela 1. Em alguns casos, o agente é um inibidor de absorção da EV em combinação com um anticorpo que se liga a um componente de inflamassoma. Em alguns casos, o inibidor de absorção da EV é uma heparina. Em alguns casos, a heparina é Enoxaparin. Em algumas situações, o anticorpo que se liga a um componente de inflamassoma é um anticorpo que especificamente se liga a um componente de um inflamassoma AIM2, NLRP1, NLRP2, NLRP3 ou NLRC4 de mamífero. Em alguns casos, o componente de inflamassoma é caspase 1, ASC ou AIM2. Em algumas situações, o componente de inflamassoma é

Petição 870190068968, de 22/07/2019, pág. 9/96

7/58

ASC. Em algumas situações, o anticorpo se liga ao domínio de PYD, CARD ou um epítopo derivado do domínio de PYD ou CARD da proteína ASC. Em alguns casos, o anticorpo se liga a uma proteína que possui pelo menos 85% de identidade de sequência com uma sequência de aminoãcido selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2. Em alguns casos, o anticorpo inibe a atividade de ASC nos pulmões do paciente. Em alguns casos, a composição é formulada com um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável. Em algumas situações, a composição é administrada por via intracerebroventrícular, intraperitoneal, intravenosa ou por inalação.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0011] As FIGURAS 1A a 1N Ilustram a ativação de inflamassoma no tecido cortical e pulmonar de camundongo C57/BL6 pós-TBI. A FIG. 1A mostra um immunoblot representativo de caspase 1 ativa, ASC, IL-18, IL-β, HMGB1 e AIM2 após TBI. Caspase 1 ativa (FIG. 1B), ASC (FIG. 1C), IL-18 (FIG. 1D), HMGB1 (FIG. 1E), AIM 2 (FIG. 1F) e IL-β (FIG. 1G), são significativamente elevadas no tecido cortical em 4 e 24 h pós-TBI. Dados apresentados como média +/- SEM; ****p < 00,001, ***p < 00,01, p < 00,05 em comparação com simulação. N ~ 4 a 5 por grupo. A FIG. 1H mostra um immunoblot representativo de caspase 1 ativa, ASC, IL-18, IL-β, HMGB1 e AIIVI2 no tecido pulmonar. I, J, K, L, Μ, N) Caspase 1 ativa (FIG. 11), ASC (FIG. 1J), IL-18 (FIG. 1K), HMGB1 (FIG. 1L), AIM 2 (FIG. 1M) e IL-β (FIG. 1N) são signiflcativamente elevadas no tecido pulmonar 4 e 24 h após a TBI. Dados apresentados como média +/- SEM. N = 4 a 5 por grupo, ** p < 00,01. * p < 00,05 em comparação com a simulação.

[0012] As FIGURAS 2A a 2C ilustram a expressão das proteínas inflamadas em células epiteliais alveolares do tipo II. A FIG. 2A AIM2, a FIG. 2B mostra a caspase 1 ativa e a FIG. 2C mostra aumentos na imunorreatividade de ASC no tecido pulmonar após CCI (4, 24 h)

Petição 870190068968, de 22/07/2019, pág. 10/96

8/58 quando comparado com camundongos. Imagens confocaís de AIM2, caspase 1 e ASC (verde) e células epiteliais do tipo II (proteína C surfactante, vermelho).

[0013] As FIGURAS 3A a 3E ilustram que a TBI aumenta a expressão de HMGB1 nuclear e citoplásmíca em pulmão de camundongos. A FIG. 3A mostra immunoblot representativo de HMGB1 nuclear após a TBI. A FIG. 3B mostra que o HMGB1 nuclear é significativamente elevado em animais lesionados 4 horas em comparação com a simulação. A FIG. 3C mostra immunoblot representativo de HMGB1 citoplásmico após a TBI. A FIG. 3D mostra que o HMGB1 citoplásmico é significativamente elevado em animais lesionados de 4 horas em comparação com a simulação. Dados apresentados como média +/SEM; ****p < 00,001, ***p < 00,01, *p < 00,05 em comparação com a simulação. N = 4 a 5 por grupo. A FIG. 3E mostra a imunorreatividade de HMGB1 aumentada no tecido pulmonar após a CCI quando comparado com camundongos simulados. Imagens confocais de HMGB1 e células epiteliais do tipo H (proteína de surfactante C, vermelho).

[0014] As FIGURAS 4A a 4G ilustram a formação de piroptossoma em pulmões de camundongos 4 horas pós-TBI. A FIG. 4A mostra que a TBI induz a variação crescente de ASC no tecido pulmonar, indicando a formação da piroptossoma, uma oligomerização de dímeros de ASC que leva à ativação da caspase 1 e píroptose. A FIG. 4B mostra immunoblot representativo e a FIG. 4C mostra a quantificação de gasdermina. A Gasdermina D é significativamente elevada no tecido pulmonar pós-TBI. Dados apresentados como média +/- SEM. N = 4 a 5 por grupo, **p < 00,01. *p < 00,05 em comparação a simulação.

[0015] As FIGURAS 5A a 5B ilustram a TBI que induz alterações morfológicas alveolares e lesões pulmonares agudas em camundongos. A FIG. 5A mostra a coloração de H&E de seções pulmonares de animais simulados e lesados em 4 h e 24 h. As seções mostram evi

Petição 870190068968, de 22/07/2019, pág. 11/96

9/58 dência de infiltração de neutrófilo (setas), alterações na morfologia das membranas capilares alveolares (asterisco, *), edema intersticial (setas curtas) e evidência de espessamento do interstício e do septo alveolar (libra, #), A FIG. 5B mostra que a pontuação de lesões pulmonares agudas é significativamente aumentada em animais lesionados quando se compara com a simulação em 4 h e 24 h. Dados apresentados como média +/- SEM. N ™ 4 a 5 por grupo, **p < 00,01, *p < 00,05 em comparação com a simulação.

[0016] A FIG. 6 ilustra a expressão de CD81 em EV derivada do soro de camundongos de controle e lesionados por TBI. Immunoblot representativo de CD81 na EV derivada de soro de camundongos de controle simulado e lesionados por TBI.

[0017] As FIGURAS 7A a 7H ilustram que a transferência adotiva de EV de animais com TBI induz a caspase 1 e ASC nos pulmões de camundongos não lesados. A FIG. 7A ilustra um immunoblot representativo que mostra que a caspase 1 (FIG. 7B), ASC (FIG. 7C), IL-18 (FIG. 7D), AIM2 (FIG. 7E), HMGB1 (FIG. 7F) são elevadas nos pulmões de animais que receberam a EV isolados de camundongos com TBI quando comparados com a EV de animais simulados. Os dados apresentados como média +/- SEM; *p < 00,05 em comparação com a simulação. N ™ 3 por grupo. EV de camundongos com TBI induzidos por alterações morfológícas alveolares (menor tamanho alveolar) e infiltração de células inflamatórias conforme determinado pela coloração de H&E (FIG. 7G). A pontuação ALI é significativamente aumentada em EV liberada de camundongos lesionados em comparação com camundongos não lesionados (FIG. 7H). Dados apresentados como média +/- SEM: *p < 00,05 em comparação com o grupo não lesionado.

[0018] As FIGURAS 8A a 8F ilustram o tratamento com Enoxaparin (3 mg/kg) e IC 100 (5 mg/kg) reduz a expressão de inflamassoma

Petição 870190068968, de 22/07/2019, pág. 12/96

10/58 nos pulmões de animais liberados de EV de camundongos lesionados. A FIG. 8A ilustra um immunoblot representativo que mostra que caspase 1 (FIG. 8B), ASC (FIG. 8C), IL-Ιβ (FIG. 8D), AIM2 (FIG. 8E), HMGB1 (FIG. 8F) são reduzidas nos pulmões de animais que foram tratados com Enoxaparin e IC 100 quando comparados com animais de controle positivo não tratados. Dados apresentados como média +/SEM; *p < 00,05 em comparação com a simulação. N = 4 por grupo. [0019] As FIGURAS 9A a 9E ilustram que o tratamento com Enoxaparin (3 mg/kg) e IC 100 (5 mg/kg) reduz a pontuação de ALI nos pulmões de animais liberados de EV de camundongos lesionados. As FIGs. 9A a 9D ilustram a coloração H&E de seções pulmonares de pulmões de camundongos tratados com solução salina (FIG. 9A), não tratada (FIG. 9B), Enoxaparin (FIG. C) e IC 100 (Anti-ASC; FIG. 9D) liberados de EV de animais lesionados. As seções mostram evidência de infiltração de neutrófilo, alterações na morfologia das membranas capilares alveolares, edema intersticial e evidência de espessamento do interstício e do septo alveolar. A FIG. 9E ilustra que a pontuação de lesões pulmonares agudas é significativamente diminuída em animais tratados com Enoxaparin, IC 100 quando comparado com animais não tratados. Dados apresentados como média +/- SEM. N - 4 por grupo, **p < 00,01, *p < 00,05.

[0020] As FIGURAS 10A a 10F ilustra que a liberação de EV derivada de soro de pacientes com TBI aumenta a expressão de proteína de inflamassoma nas células endotelials pulmonares. A FIG. 10A mostra a representação de western blot de caspase 1, ASC, AIM2, HMGB1 em PMVEC após incubação com TBI-EV e controle-EV durante 4 horas. As FIGs. 10B a 10E mostram a quantificação de western blots, n = 3 filtros por grupo, n - 6 pacientes, teste t, p < 00,05. A FIG. 10F mostra os resultados de imunoensaío de um aumento significativo na expressão de IL-Ιβ utilizando um ensaio Ella simple plex n = 3 filtros por

Petição 870190068968, de 22/07/2019, pág. 13/96

11/58 grupo, η ™ 6 pacientes, teste t, p < 00,05.

[0021] As FIGURAS 11A a 110 ilustram que a liberação de TBI-EV nas células endoteliais pulmonares aumenta a imunorreatividade da caspase 1 ativa e morte celular. A FIG. 11A mostra a co-localização de coloração FLICA a PI de caspase 1 e PMVEC incubada com TBI-EV durante 4 horas. A FIG. 11B mostra a coloração FLICA e PI de caspsae-1 em PMVEC incubada com controle-EV durante 4 horas. A FIG. 11C mostra a análise da leitura de placa fluorescente de PMVEC incubada com TBI e controle-EV durante 4 horas, n - 6, p < 00,05.

DESCRIÇÃO DETALHADA

DEFINIÇÕES [0022] A menos que de outra forma definida, todos os termos técnicos utilizados nesta invenção possuem o mesmo significado que o comumente entendido por uma pessoa de habilidade prática na técnica à qual esta invenção pertence.

[0023] Como aqui utilizado, proteína e polipeptídeo são utilizados de forma sinônima para significar qualquer cadeia ligada a peptídeo de aminoácidos, independente do comprimento ou modificação pós-translacional, por exemplo, glicosiiação ou fosforilação.

[0024] Como utilizado nesta invenção, o termo anticorpo referese de uma forma geral e amplamente a imunoglobuiinas, anticorpos monoclonaís e anticorpos policionais, assim como seus fragmentos ativos. O fragmento pode ser ativo pelo fato de que se liga ao antígeno cognato (por exemplo, ASC, NLRP1, AIM2, etc.), ou pode ser ativo pelo fato de que ele é biologicamente funcional. Os anticorpos para uso nesta invenção podem ser quiméricos, humanizados ou humanos, utilizando técnicas conhecidas na especialidade.

[0025] Como aqui utilizado, o termo anticorpo humanizado refere-se a um anticorpo em que partes mínimas de um anticorpo não humano são introduzidas em um anticorpo humano de outro modo.

Petição 870190068968, de 22/07/2019, pág. 14/96

12/58 [0026] Como aqui utilizado, o termo anticorpo humano refere-se a um anticorpo em que substancialmente cada parte da proteína é substancialmente nâo imunogênica em seres humanos, com somente pequenas alterações ou variações de sequência, [0027] Um sítio de ligação ao antígeno pode ser formado de uma forma geral pelos domínios de imunoglobulina da região variável de cadeia pesada (VH) e da região variável de cadeia leve (VL), com a interface de ligação ao antígeno formada por seis alças calibradas de polipeptídeo de superfície, denominadas regiões determinantes de complementaridade (CDRs). Existem três CDRs cada uma na VH (HCDR1, HCDR2, HCDR3) e VL (LCDR1, LCDR2, LCDR3), juntamente com as regiões de estrutura (FRs).

[0028] O termo região CDR ou CDR pode significar a região hipervariável das cadeias pesadas ou leves da imunoglobulina conforme definido por Kabat et al., 1991 (Kabat, E, A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition. US Department of Health and Human Services, Public Service, NIH, Washington), e edições posteriores. Um anticorpo tipicamente contém 3 CDRs de cadeia pesada e 3 CDRs de cadeia leve.

[0029] Foi mostrado que fragmentos de um anticorpo inteiro também podem ligar antígenos. Exemplos de fragmentos de ligação incluem: (i) fragmento Fab que consiste em domínios VL, VH, CL e CH1 (Ward, E. S. et al., (1989) Nature 341, 544-546); (li) um fragmento Fd que consiste dos domínios VH e CHI (McCafferty et al., (1990) Nature, 348, 552-554); (iii) um fragmento Fv que consiste dos domínios VL e VH de um anticorpo isolado (Holt et al., (2003) Trends in Biotechnology 21, 484-490); (iv) um fragmento dAb (Ward, E. S. et al., Nature 341, 544-546 (1989), McCafferty et al., (1990) Nature, 348, 552-554, Holt et al., (2003) Trends in Biotechnology 21, 484-490], que consiste de um domínio VH ou VL; (v) regiões CDR isoladas; (vi) fragmentos F(ab')2,

Petição 870190068968, de 22/07/2019, pág. 15/96

13/58 um fragmento bívalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados (vii) moléculas Fv de cadeia única (scFv), em que um domínio VH e um domínio VL são ligados por um conector de peptídeo que permite que os dois domínios se associem para formar um sítio de ligação ao antígeno (Bird et al., (1988) Science, 242, 423-426, Huston et ai., (1988) PNAS USA, 85, 5879-5883); (viii) dímeros de Fv de cadeia única biespecíficos (PCT/US92109965) e (ix) diacorpos, fragmentos multivalentes ou multiespecíficos construídos através da fusão genética (WO94/13804; Holliger, P. (1993) et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90 6444-6448).

[0030] Moléculas Fv, scFv ou diacorpo podem ser estabilizadas através da incorporação de pontes de dissulfeto que ligam os domínios VH e VL (Reiter, Y. et al., Nature Biotech, 14, 1239-1245, 1996). Os minicorpos compreendendo um scFv unido a um domínio CH3 também podem ser produzidos (Hu, S. et al., (1996) Cancer Res., 56, 3055-3061). Outros exemplos de fragmentos de ligação podem ser Fab’, que difere dos fragmentos Fab pela adição de alguns resíduos no terminal carboxila do domínio CH1 de cadeia pesada, incluindo uma ou mais cisteínas da região de dobradiça do anticorpo, e Fab'-SH, que é um fragmento Fab’ no qual os resíduos de cisteína dos domínios constantes carregam um grupo de tiol livre.

[0031] Fv quando aqui utilizado, refere-se ao fragmento mínimo de um anticorpo que retém os sítios tanto de reconhecimento do antígeno quanto de ligação do antígeno. Fab quando aqui utilizado pode se referir a um fragmento de um anticorpo que compreende o domínio constante da cadeia leve e o domínio de CH1 da cadeia pesada. O termo mAb refere-se ao anticorpo monoclonal.

[0032] Pelos termos “proteína semelhante a Spec associada com Apoptose contendo um Domínio de Recrutamento de Ativação da Caspase (CARD)” e “ASC significa um produto de expressão de um

Petição 870190068968, de 22/07/2019, pág. 16/96

14/58 gene ASC ou sues isoformas, ou uma proteína que compartilha pelo menos 65% (mas preferivelmente 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99%) de identidade de sequência de aminoácido com ASC (por exemplo, NPJ337390 (Q9ULZ3-1), NP_660183 (Q9ULZ3-2) ou Q9ULZ3-3 em ser humano, NPJ375747 em camundongo ou NP_758825 (BAC43754) em rato) e apresenta uma atividade funcional de ASC. Uma atividade funcional de uma proteína é qualquer atividade associada com a função fisiológica da proteína. Atividades funcionais de ASC incluem, por exemplo, recrutamento de proteínas para ativação de caspase 1 e iniciação da morte celular.

[0033] Pelo termo gene ASC ou ácido nucleico ASC entendese uma sequência de ácido nucleico que codifica ASC nativa, sequências genômicas a partir das quais o cDNA de ASC pode ser transcrito, e/ou variantes alélicas e homólogos do precedente. Os termos abrangem DNA de fita dupla, DNA de fita simples e RNA.

[0034] Como utilizado nesta invenção, o termo inflamassoma significa um complexo de múltiplas proteínas (por exemplo, pelo menos duas proteínas) que ativa a caspase 1. Além disso, o termo inflamassoma pode se referir a um complexo de múltiplas proteínas que ativa a atividade de caspase 1, que, por sua vez, regula o processamento e a ativação de IL-1 β, IL-18 e 11-33. Ver Arend et al. 2008; Li et al. 2008; e Martinon et al. 2002, cada um dos quais é incorporado por referência em suas totalidades. Os termos inflamassoma NLRP1, Inflamassoma NALPT', inflamassoma NLRP2 inflamassoma NALP2, inflamassoma NLRP3, inflamassoma NALP3, inflamassoma NLRC4, inflamassoma IPAF ou Inflamassoma AIM2 significam um complexo de proteína de pelo menos caspase 1 e uma proteína adaptativa, por exemplo, ASC. Por exemplo, os termos inflamassoma NLRP1 e inflamassoma NALP1 podem significar um complexo de múltiplas proteínas contendo NLRP1, ASC, caspase 1, caspase 11,

Petição 870190068968, de 22/07/2019, pág. 17/96

15/58

XIAP, e panexina-1 para a ativação de caspase 1 e processamento de interleucina-ΐβ, interleucina-18 e interleucina-33. Os termos inflamassoma NLRP2” e inflamassoma NALP2 podem significar um complexo de múltiplas proteínas contendo NLRP2 (aka NALP2), ASC e caspase 1, enquanto que os termos “inflamassoma NLRP3” e “inflamassoma NALP3” podem significar um complexo de múltiplas proteínas contendo NLRP3 (aka NAALP3), ASC e os termos inflamassoma NLRC4 e inflamassoma IPAF podem significar um complexo de múltiplas proteínas contendo NLRC4 (aka IPAF), ASC e caspase 1. Adicionalmente, o termo inflamassoma AIM2 pode significar um complexo de múltiplas proteínas compreendendo AIM2, ASC e caspase 1.

[0035] Como usado aqui, a expressão identidade de sequência significa a porcentagem de subunidades idênticas em posições correspondentes nas duas sequências (por exemplo, sequências de ácido nucleico, sequências de aminoácido) quando as duas sequências são alinhadas para maximizar a correspondência da subunidade, isto é, levando em conta os espaços e inserções. A identidade de sequência pode ser medida utilizando o software de análise de sequência (por exemplo, Sequence Analysis Software Package da Accelrys CGC, San Diego, CA).

[0036] Pelas frases quantidade terapeuticamente eficaz e dosagem eficaz significam uma quantidade suficiente para produzir um resultado terapeuticamente (por exemplo, clinicamente) desejável; a natureza exata do resultado variará dependendo da natureza do distúrbio que está sendo tratado. Por exemplo, onde o distúrbio a ser tratado é a SCI, o resultado pode ser uma melhora nas habilidades motoras e função locomotora, uma lesão de medula espinhal diminuída, etc. As composições descritas nesta invenção podem ser administradas a partir de uma ou mais vezes por dia a uma ou mais vezes por semana. O especialista versado irá reconhecer que certos fatores podem influen

Petição 870190068968, de 22/07/2019, pág. 18/96

16/58 dar a dosagem e o tempo requeridos para tratar eficazmente um indivíduo, incluindo, mas não limitado à gravidade da doença ou distúrbio, tratamentos anteriores, a saúde geral e/ou idade do indivíduo, e outras doenças presentes. Além disso, o tratamento de um indivíduo com uma quantidade terapeuticamente eficaz das composições da invenção pode incluir um único tratamento ou uma série de tratamentos. [0037] Como aqui utilizado, o termo tratamento é definido como a aplicação ou administração de um agente terapêutico descrito nesta invenção, ou identificado por um método aqui descrito, a um paciente, ou aplicação ou administração do agente terapêutico a um tecido isolado ou linhagem celular de um paciente, que possui uma doença, um sintoma de doença ou uma predisposição para uma doença, com o propósito de curar, cicatrizar, aliviar, abrandar, alterar, remediar, melhorar, concertar ou afetar a doença, os sintomas da doença ou a predisposição para a doença.

[0038] Os termos paciente pessoa e indivíduo são utilizados nesta invenção de modo trocável, e significa um indivíduo mamífero a ser tratado, com pacientes humanos sendo preferidos. Em alguns casos, os métodos da invenção encontram uso em animais experimentais, em aplicações veterinárias, e no desenvolvimento de modelos animais para doença, incluindo, mas não limitados a estes, roedores incluindo camundongos, ratos e hamsters, assim como primatas [0039] Como aqui utilizado de modo trocável, Ausente em Melanoma 2 e AIM2 pode significar um produto de expressão de um gene ou isoformas AIM2; ou uma proteína que compartilha pelo menos 65% (mas preferivelmente 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99%) de identidade de sequência de amínoácido com AIM2 (por exemplo, números de acesso NXJ314862, NP004824, XP016858337,

XP005245673, AAB81613, BAF84731, AAH10940) e apresenta uma atividade funcional de AIM2.

Petição 870190068968, de 22/07/2019, pág. 19/96

17/58 [0040] Como aqui utilizado de modo trocável, NALP1 e NLRP1 significam um produto de expressão de um gene NALP1 ou NLRP1 ou isoformas; ou uma proteína que compartilha pelo menos 65% (mas preferivelmente 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99%) de identidade de sequência de aminoácido com NALP1 (por exemplo, números de acesso AAH51787, NPJJ01028225, NP J 27500, NPJ 27499, NP_J 27497, NP055737) e apresenta uma atividade funcional de NALP1.

[0041] Como aqui utilizado de modo trocável, NALP2 e NLRP2 significam um produto de expressão de um gene NALP2 ou NLRP2 ou isoformas; ou uma proteína que compartilha pelo menos 65% (mas preferivelmente 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99%) de identidade de sequência de aminoácido com NALP2 (por exemplo, números de acesso NP... 001167552, NP... 001167553, NP... 001167554 ou NPJ360322) e apresenta uma atividade funcional de NALP2.

[0042] Como aqui utilizado de modo trocável, NALP3 e NLRP3 significam um produto de expressão de um gene NALP3 ou NLRP3 ou isoformas; ou uma proteína que compartilha pelo menos 65% (mas preferivelmente 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99%) de identidade de sequência de aminoácido com NALP3 (por exemplo, números de acesso NPJD01073289, NPJj01 120933, NPJ301120934, NP_001230062, NPJ304886, NP_899632, XPJ)11542350, XP_P 16855670, XP...016855671, XP..016855672 ou XP... 016855673) e apresenta uma atividade funcional de NALP3, [0043] Como aqui utilizado de modo trocável, NLRC4 e IPAF significam um produto de expressão de um gene NLRC4 ou IPAF ou Isoformas; ou uma proteína que compartilha pelo menos 65% (mas preferivelmente 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99%) de identidade de sequência de aminoácido com NLRC4 (por exemplo, números de acesso Npy01186067, NP001186068, NPJ301289433 ou

Petição 870190068968, de 22/07/2019, pág. 20/96

18/58

NPJ367032) e apresenta uma atividade funcional de NLRC4.

[0044] Pelos termos acidente vascular cerebral e derrame isquêmico significam quando a corrente sanguínea é interrompida em parte do cérebro ou medula espinhal, [0045] Por lesão traumática ao CNS entenda-se qualquer insulto ao CNS a partir de uma força mecânica externa, possivelmente levando à deficiência permanente ou temporária da função do CNS.

[0046] O termo anticorpo destina-se a incluir anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais (mAbs), anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos anti-idíotípicos (anti-ld) para anticorpos que podem ser marcados na forma solúvel ou ligada, assim como fragmentos, regiões ou seus derivados, fornecidos por qualquer técnica conhecida, tal como, mas não limitada a divagem enzimática, síntese de peptídeo ou técnicas recombinantes. Tais anticorpos anti-ASC e anti-NLRP1 da presente invenção são capazes de ligar porções de ASC e NLRP1, respectivamente, que interferem com a ativação da caspase 1.

[0047] Métodos que envolvem técnicas de biologia molecular convencionais são aqui descritos. Tais técnicas são geralmente conhecidas na especialidade e são descritas com detalhes nas pesquisas de metodologia tais como Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., vol. 1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001; e Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Greene Publishing and WileyInterscience, New York, 1992 (com atualizações periódicas). As técnicas de imunologia são geralmente conhecidas na especialidade e sâo descritas com detalhes nas pesquisas de metodologia tais como Advances in Immunology, volume 93, ed. Frederick W. Alt, Academic Press, Burlington, MA, 2007; Making and Using Antibodies: A Practical Handbook, eds. Gary C. Howard and Matthew R. Kaser, CRC Press,

Petição 870190068968, de 22/07/2019, pág. 21/96

19/58

Boca Raton, FL, 2006; Medical Immunology, 6^th ed., edited by Gabriel Virella, Informa Healthcare Press, London, England, 2007; e Harlow and Lane ANTIBODIES: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988.

[0048] Embora as composições e os métodos similares ou equivalentes àqueles aqui descritos possam ser utilizados na prática ou teste da presente Invenção, composições e métodos adequados são descritos abaixo. Todas as publicações, pedidos de patente e patentes aqui mencionadas são incorporadas por referência na sua totalidade. No caso de conflito, o presente relatório descritivo, incluindo as definições, irá controlar. As modalidades particulares debatidas abaixo são apenas ilustrativas e não se destinam a serem limitatlvas.

VISÃO GERAL [0049] São aqui fornecidas composições e métodos para a redução da inflamação nos pulmões de um mamífero que foi submetido ou está atormentado por uma condição que resulta ou provoca inflamação pulmonar. As composições e métodos aqui descritos podem incluir anticorpos ou seus fragmentos ativos como fornecidos nesta invenção que se ligam especificamente a pelo menos um componente (por exemplo, ASC) de um inflamassoma de mamífero e/ou compostos que modulam (por exemplo, inibem ou reduzem) a absorção de vesícula extracelular (EV) e são utilizados como tratamentos para a inflamação pulmonar em um mamífero.

[0050] Aqui descritos são métodos para reduzir a inflamação nos pulmões de um mamífero que possui uma condição que resulta e/ou provoca uma resposta inflamatória nos pulmões. Em uma modalidade, o método de tratamento de inflamação nos pulmões de um mamífero compreende a administração ao mamífero de uma composição que compreende um agente que inibe a sinalização de inflamassoma. O mamífero pode ser um paciente ou indivíduo como fornecido nesta in

Petição 870190068968, de 22/07/2019, pág. 22/96

20/58 venção. Exemplos de condições que podem levar à inflamação nos pulmões incluem uma lesão no sistema nervoso central (CNS) (por exemplo, lesão da medula espinhal (SCI), lesão cerebral traumática (TBI) ou acidente vascular cerebral), uma doença neurodegenerativa, uma doença autoimune, asma, doença pulmonar obsírutiva crônica (CORD), fibrose cística, doença pulmonar intersticial ou síndrome de angústia respiratória aguda. A composição pode ser administrada em uma quantidade terapeuticamente eficaz. A quantidade terapeuticamente eficaz pode ser uma dose como aqui concedida. O agente pode ser um inibidor de absorção da vesícula extracelular (EV), um anticorpo ou um fragmento ativo deste como fornecido nesta invenção, que se liga a um componente de um inflamassoma ou uma combinação destes. A composição pode ser administrada por qualquer via adequada, por exemplo, através da inalação, por via intravenosa, intraperitoneal ou intracerebroventricular. A composição pode ainda incluir pelo menos um veículo ou díluente farmaceuticamente aceitável.

[0051] Em uma modalidade, a administração do agente pode resultar em uma redução no nível de atividade e/ou expressão de um componente de um inflamassoma de mamífero nos pulmões do indivíduo. A redução pode ser nas células do pulmão tais como, por exemplo, células alveolares do tipo II. A redução pode ser em comparação com um controle. O controle pode ser o indivíduo antes da administração do agente. O controle pode ser o nível de atividade e/ou expressão dos componentes de inflamassoma em um indivíduo não administrado com o agente. Em uma modalidade, a administração do agente resulta na redução da ativação de caspase 1 pelo menos nos pulmões ou células pulmonares do indivíduo. Em uma modalidade, a administração do agente resulta na redução do nível de expressão de um ou mais componentes de inflamassoma (por exemplo, ASC, AIM2, NALP1, NALP2, NALP2, NALP3 ou NLRC4) pelo menos nos pulmões

Petição 870190068968, de 22/07/2019, pág. 23/96

21/58 ou células pulmonares do indivíduo.

[0052] Em outra modalidade, a administração do agente pode resultar em uma redução ou eliminação da lesão pulmonar aguda (ALI). Em uma modalidade, a redução da ALI é evidenciada por uma redução na infiltração de neutrófilo no espaço alveolar e/ou intersticial, espessamento séptico alveolar reduzido ou ausente ou uma combinação destes. A redução pode ser em comparação com um controle. O controle pode ser a ALI no indivíduo antes da administração do agente. O controle pode ser a ALI em um indivíduo que sofre de ALI sem o agente administrado.

[0053] Em mais outra modalidade, a administração do agente pode resultar em uma redução ou a eliminação da piroptose nos pulmões do indivíduo. A piroptose é uma forma pró-inflamatória de morte celular que envolve a ativação de caspase 1. A piroptose pode ser ativada pela divagem mediada por caspase 1 de gasdermina D (GSDMD). Em uma modalidade, a redução na piroptose é evidenciada por uma redução ou falta de divagem de GSDMD nos pulmões ou células pulmonares (por exemplo, células alveolares do tipo II do indivíduo. A redução ou eliminação de piroptose pode ser em comparação com um controle. A redução ou falta de divagem de GSDMD pode ser em comparação com um controle. O controle pode ser o nível de piroptose no indivíduo antes da administração do agente. O controle pode ser o nível de piroptose em um indivíduo que sofre de piroptose sem o agente administrado.

[0054] Em uma modalidade, o agente a ser administrado é um inibidor de absorção da EV. O inibidor de absorção da EV pode ser um composto, RNA antissenso, siRNA, peptídeo, anticorpo ou um fragmento ativo deste como fornecido nesta invenção ou uma combinação destes. O composto ou peptídeo pode ser um ou mais compostos selecionados de heparina, a-difluoroetilornitina (DFMO), Enoxaparin,

Petição 870190068968, de 22/07/2019, pág. 24/96

22/58

Asíalofetuin, proteína associada ao receptor humano (RAP), peptídeo RGD (Arg-Gly-Asp), citocalasina D, citocalasina B, ácido etilenodiaminotetra acético (EDTA), Latrunculin A, Latrunculin B, NSC23766, Dynasore, clorpromazina, 5-(N-etil-N-isopropil)amilorida (EIPA), amilorida, bafílomicina A monensina e cloroquinina, Anexina-V, Wortmannin, LY294002, metil-p-cidodextrina (MpCD), Filipin, sinvastatina, Fumonisin B1 e cloridreto de N-butildeoxinojirimícina, U0126 ou um inibidor da bomba de prótons. Anticorpo inibidor de absorção da EV ou um fragmento ativo deste como aqui fornecido, pode ser um ou mais anticorpos ou seus fragmentos ativos direcionados contra alvos de proteína listados na Tabela 1. Uma composição para tratamento e/ou redução de inflamação nos pulmões de um mamífero que utiliza um inibidor de absorção da EV pode ainda incluir pelo menos um veículo ou díluente farmaceuticamente aceitável.

Tabela 1. Alvos exemplares e anticorpos correspondentes para uso no bloqueio de absorção de EV

Símbolo do Gene	Nome do Gene	Anticorpos Exemplares
ICAM-1	Molécula de Aderência Intercelular 1	Anticorpo Invitrogen ICAM-1 (Life Technologies, 07-5403); CD54 (ICAM-1) Monoclonal Antibody (R6.5), eBioscience™
LFA-1	Antígeno associado com a função do linfócito 1	Anticorpo Abbiotec LFA-1 (Abbiotec, 250944); anticorpo Developmental Studies Hybridoma Bank LFA-1 (Developmental Studies Hybridoma Bank, MHM24)
TIM-4	Proteína da membrana de células T 4	Anticorpo BioLegend TIMD4 (BioLegend, 354004); anticorpo LifeSpan Biosciences TIMD4 (Lifespan Biosciences, LS-B1413)
MFG-E8	Glóbulo de gordura do leiteProteína do Fator 8 EGF	Anticorpo MBL International MFGE8 (MBL, D199-3); Santa Cruz Biotechnology MFGE8 antibody (Santa Cruz, sc-8029); anticorpo MBL International MFGE8 (MBL, 18A2-G10)

Petição 870190068968, de 22/07/2019, pág. 25/96

23/58

Símbolo do Gene	Nome do Gene	Anticorpos Exemplares
DC-SIGN	Molécula de aderência intercelular específica da célula dendrítica-3-Sequestrante não integrina	Anticorpo Invitrogen DC SIGN (eBioscience, eB-h209, 17-2099-41); anticorpo BD Biosciences DC SIGN (BD, DCN46, 551186)
DEC205	Aglomerado de átomos de diferenciação 205	Anticorpo EMD Millipore LY75 (Millipore, HD30); anticorpo BioLegend LY75 (BioLegend, 342203)
H-2Kb	MHC Classe 1 (H-2Kd)	Anticorpo BioLegend H2-K1 (BioLegend, 28-8-6, 114603): anticorpo BioLegend H2K1 (BioLegend, 28-14-8, 14-5999-85)
Tspan8	Tetraspanin-8	Anticorpo R and D Systems TSPAN8 (R&D Systems, MAB4734)
Tspan29	Tetraspanin-29	Anticorpo Santa Cruz Biotechnology CD9 (Santa Cruz, sc-59140); anticorpo Invitrogen CD9 (eBioscience, eBioSN4; anticorpo BD Biosciences CD9 (BD Pharmingen, 555370)
ITGAL	Subunidade alfa L da integrina	TS1/22.1.1.13.3; M17/4.4.11.9
ITGAM	Subunidade alfa M da integrina	Anticorpo Monoclonal CD11b (VIM12)( CD11B00); anticorpo BD Biosciences CD11b (BD Pharmingen, ICRF44; 555385)
ITGAX	Subunidade alfa X da integrina	Anticorpo Anti-lntegrina aX, clone N418 (MAB1399Z); anticorpo BD Biosciences CD11c (BD Bioscience, B-ly6; 560369)
CD44	Aglomerados de átomos de diferenciação 44	Anticorpo Invitrogen CD44 (eBioscience, VFF-7; MA1-82392); anticorpo Invitrogen CD44 (eBioscience, IM7; MA1-10225); anticorpo Invitrogen CD44 (eBioscience, 5F12; MA5-12394); anticorpo BD Biosciences CD44 (BD Biosciences, 515; 550990 OR 550988)

Petição 870190068968, de 22/07/2019, pág. 26/96

24/58

Símbolo do Gene	Nome do Gene	Anticorpos Exemplares
ITGA3	Subunidade alfa 3 da integrina	Anticorpo alfa 3 da integrina EMD Millipore (Millipore, P1B5; MAB1952Z OR MAB1952P)
ITGA4	Subunidade alfa 4 da integrina	Anticorpo Bio X Cell ITGA4 (BioXcell, PS/2) (BE0071-5MG); anticorpo BD Biosciences ITGA4 (BD Biosciences, 561892); anticorpo BD Biosciences ITGA4 (BD, 340976); anticorpo EMD Millipore ITGA4 (Millipore, P4C2; MAB1955)
ITGAV	Subunidade alfa V da íntegrina	Anticorpo alfa v da integrina Abeam (Abeam, ab77906); Anticorpo alfa v da integrina Abeam (Abeam, ab78289); Anticorpo alfa v da integrina Abeam (Abeam, ab16821); Anticorpo alfa v da integrina Abeam (Thermo Fisher Scientific, 27217E6, MA1-91669); Anticorpo alfa v da integrina R & D Systems (R&D Systems, MAB2528)
ITGB3	Subunidade beta 3 da integrina	Anticorpo beta 3 da integrina Abeam (Abeam, ab78289); Anticorpo beta 3 da integrina Abnova (Abnova, MHF4, MAB7098)
SELL	Selectina L	Anticorpo BioLegend CD62L antibody (Biolegend, 304804); anticorpo BioLegend CD62L (Biolegend, 304810)
CD81	Molécula CD81	Anticorpo BD Biosciences CD81 (BD Pharmingen, 555675); anticorpo R and D Systems CD81 (R&D Systems, MAB4615)
LRP1	Proteína relacionado ao receptor LDL 1	Anticorpo Invitrogen LRP1 (Life Technologies, 37-7600); anticorpo Invitrogen LRP1 (Thermo Fisher, MA1-27198)
VCAM1	Molécula de aderência da célula vascular 1	Anticorpo Invitrogen VCAM-1 (Caltag, IG11B1; MA5-16429); anticorpo Immunotech anti-VCAM-1
CD151	Molécula CD151 (grupo sanguíneo Raph)	Anticorpo BD Biosciences CD151 (Becton Dickinson, 556056); anticorpo Epitomics CD151 (Epitomics, 5901-1)

Petição 870190068968, de 22/07/2019, pág. 27/96

25/58 [0055] Em uma modalidade, o agente a ser administrado é um anticorpo ou um fragmento ativo deste como aqui fornecido, direcionado contra um componente de um inflamassoma de mamífero ou um antígeno ou epítopo derivado do mesmo. Em outra modalidade, o agente a ser administrado é um RNA ou siRNA antissenso direcionado contra um componente de um inflamassoma de mamífero. O componente de inflamassoma pode ser um componente de qualquer inflamassoma conhecido na técnica, tal como, por exemplo, o inflamassoma NAPL1, NALP2, NALP3, NLRC4 ou AIM2. Em uma modalidade típica, o anticorpo se liga especificamente a ASC ou um antígeno ou epítopo derivado deste. No entanto, um anticorpo contra qualquer outro componente de um inflamassoma de mamífero (por exemplo, o inflamassoma NALP1, NALP2, NALP3, NLRC4 ou AIM2) pode ser utilizado.

[0056] Um anticorpo como descrito nesta invenção pode ser um anticorpo monoclonal ou policlonal ou seus fragmentos ativos. Ditos anticorpos ou fragmentos ativos podem ser quiméricos, humanos ou humanizados conforme aqui descrito.

[0057] Qualquer anticorpo adequado ou um fragmento ativo deste conforme aqui fornecido que se liga especificamente a ASC pode ser utilizado, por exemplo, um anticorpo que inibe a atividade de ASC nas células pulmonares (por exemplo, células alveolares do tipo II) do indivíduo. Em uma modalidade típica, o anticorpo especificamente se liga a uma sequência de aminoácido que possui pelo menos 85% de identidade de sequência com a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2. Similarmente, em outra modalidade, o inflamassoma é o inflamassoma NALP1, e pelo menos um componente é NALP1 (isto é, NLRP1). Nesta modalidade, o anticorpo ou um fragmento ativo deste como fornecido nesta invenção se liga especificamente a uma sequência de aminoácidos que possui pelo menos 85% de identidade de sequência com a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID

Petição 870190068968, de 22/07/2019, pág. 28/96

26/58

NO: 4.

[0058] Em ainda outra modalidade, o agente é um ou mais inibidores de absorção da EV em combinação com um ou mais anticorpos ou seus fragmentos ativos conforme aqui fornecido, que se liga a um componente de um inflamassoma. O inibidor de absorção da EV pode ser qualquer inibidor de absorção da EV como fornecido nesta invenção. O anticorpo que se liga a um componente de um inflamassoma pode ser qualquer anticorpo que se liga a qualquer componente de inflamassoma como aqui concedido. Em uma modalidade, o agente administrado a um indivíduo que sofre de inflamação pulmonar compreende uma heparina (por exemplo, Enoxaparin) em combinação com um anticorpo que se liga a um componente do inflamassoma AIM2 (por exemplo, ASC).

[0059] Em uma modalidade, o método compreende: fornecer uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição que inclui um anticorpo ou um fragmento ativo do mesmo conforme fornecido nesta invenção que se liga específicamente a pelo menos um componente (por exemplo, ASC) de um inflamassoma de mamífero (por exemplo, inflamassoma AIM2); e administrar a composição ao mamífero que sofre de inflamação pulmonar, em que a administração da composição ao mamífero resulta em uma redução da ativação de caspase 1 nos pulmões do mamífero. Em outra modalidade, o método compreende: fornecer uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição que inclui um anticorpo que especificamente se liga a pelo menos um componente (por exemplo, ASC) de um inflamassoma de mamífero (por exemplo, inflamassoma AIM2); e administrar a composição ao mamífero que sofre de inflamação pulmonar, em que a administração da composição ao mamífero resulta em uma redução dos níveis de um ou mais componentes de inflamassoma (por exemplo, ASC). Em mais outra modalidade, o método compreende: fornecer uma quantidade

Petição 870190068968, de 22/07/2019, pág. 29/96

27/58 terapeuticamente eficaz de uma composição que inclui um anticorpo que se liga específicamente a pelo menos um componente (por exemplo, ASC) de um inflamassoma de mamífero (por exemplo, inflamassoma AIM2); e administrar a composição ao mamífero que sofre de inflamação pulmonar, em que a administração da composição ao mamífero resulta em uma redução da ALL A inflamação do pulmão pode ser pode ser o resultado de uma lesão do CNS (por exemplo, SCI ou TBI), asma, distúrbio pulmonar obstrutivo crônico (COPD), uma doença neurodegenerativa ou uma doença autolmune com um componente inflamatório. Em uma modalidade, a inflamação pulmonar é provocada por uma lesão ao CNS tal como TBI ou SCI.

[0060] Em uma modalidade, os métodos aqui fornecidos incluem ainda a detecção de um nível ou atividade de um ou mais componentes de um inflamassoma de mamífero em uma amostra de um indivíduo suspeito de sofrer de inflamação pulmonar. O método de detecção do nível ou atividade exige a medição do nível de pelo menos uma proteína de inflamassoma (por exemplo, ASC ou AIM2) na amostra obtida do indivíduo; a determinação da presença ou ausência de um nível ou atividade elevado de pelo menos uma proteína de inflamassoma (por exemplo, ASC ou AIM2). O nível ou atividade de dita pelo menos uma proteína de inflamassoma pode ser aumentado em relação ao nível da referida pelo menos uma proteína de inflamassoma em uma amostra de controlo. O nível ou atividade de dita pelo menos uma proteína de inflamassoma na assinatura da proteína pode ser aumentado em reiação a um valor de referência pré-determinado ou faixa de valores de referência. A pelo menos uma proteína de inflamassoma pode ser proteína contendo o domínio de pirina de repetição rica em leucina de ligação a nucleotídeo 1 (NLRP1), NLRP2, NLRP3, NLRC4, AIM2, proteína semelhante a spec associada com apoptose contendo um domínio de recrutamento de ativação da caspase (ASC), caspase

Petição 870190068968, de 22/07/2019, pág. 30/96

28/58

1, ou suas combinações, A amostra pode ser fluido cerebroespinhal (CSF), saliva, sangue, soro, plasma, urina ou um aspirado pulmonar. Anticorpos que se Hgam especificamente a pelo menos um componente de um inflamassoma de mamífero [0061] Os métodos aqui descritos para a redução da inflamação nos pulmões de um mamífero incluem composições que incluem um anticorpo ou um fragmento ativo do mesmo conforme aqui fornecido, que se liga especificamente a pelo menos um componente (por exemplo, ASC, AIM2) de um inflamassoma de mamífero (por exemplo, o inflamassoma AIM2). Uma composição para o tratamento e/ou a redução da inflamação nos pulmões de um mamífero pode ainda incluir pelo menos um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável. Anticorpos exemplares direcionados contra componentes de um inflamassoma de mamífero para uso nos métodos desta invenção podem ser aqueles encontrados na US 8685400, cujos conteúdos são aqui incorporados por referência na sua totalidade.

[0062] Em uma modalidade, uma composição para o tratamento e/ou redução da inflamação nos pulmões de um mamífero inclui um anticorpo ou um fragmento ativo deste conforme fornecido nesta invenção que se liga especificamente a um domínio ou sua parte de uma proteína ASC de mamífero tal como, por exemplo, uma proteína ASC humana, de camundongo ou rato. Qualquer anticorpo anti-ASC adequado pode ser utilizado, e vários são comercialmente disponíveis. Exemplos de anticorpos anti-ASC para uso nos métodos aqui descritos podem ser aqueles encontrados na US8685400, cujos conteúdos são aqui incorporados por referência em sua totalidade. Exemplos de anticorpos anti-ASC comercialmente disponíveis para uso nos métodos aqui providos incluem, mas não são limitados a estes, 4-147 Anti-ASC, anticorpo monoclonal de camundongo clone 2EI-7 da MilliporeSigma, AB3607 - Anti-ASC Antibody da Millipore Sigma, orb194021 Anti-ASC

Petição 870190068968, de 22/07/2019, pág. 31/96

29/58 da Biorbyt, LS-C331318-50 Anti-ASC da LifeSpan Biosciences, AF3805 Anti-ASC da R & D Systems, NBP1-78977 Anti-ASC da Novus Biologicals, 600-401-Y67 Anti-ASC da Rockland Immunochemicals, D086-3 Anti-ASC da MBL International, AL177 anti-ASC da Adipogen, anticorpo anti-ASC monoclonal (clone o93E9), anticorpo anti-ASC (F9) da Santa Cruz Biotechnology, anticorpo anti-ASC (B-3) da Santa Cruz Biotechnology, anticorpo policlonal ASC - ADI-905-173 da Enzo Life Sciences, ou A161 Anti-Human ASC - Leinco Technologies. A proteína ASC humana pode ser o número de acesso NPJ337390.2 (Q9ULZ3-1), NP_660183 (Q9ULZ3-2) ou Q9ULZ3-3. A proteína ASC de rato pode ser o número de acesso NP___758825 (BAC43754). A proteína ASC de camundongo pode ser o número de acesso NPJ375747.3. Em uma modalidade, o anticorpo se liga a um domínio PYRIN-PAAD-DAPIN (PYD) ou uma parte ou fragmento deste de uma proteína ASC de mamífero (por exemplo, ASC de ser humano, camundongo ou rato). Nesta modalidade, um anticorpo como descrito nesta invenção se liga especificamente a uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 65% (por exemplo, 65, 70, 75, 80, 85%) de identidade de sequência com um domínio PYD ou seu fragmento de ASC de ser humano, camundongo ou rato. Em uma modalidade, o anticorpo se liga a um domínio de recrutamento de caspase C-terminal (CARD) ou uma parte ou fragmento deste de uma proteína ASC de mamífero (por exemplo, ASC de ser humano, camundongo ou rato). Nesta modalidade, um anticorpo como aqui descrito especificamente se liga a uma sequência de aminoácidos que possui pelo menos 65% (por exemplo, 65, 70, 75, 80, 85%) de identidade de sequência com um domínio de CARD ou seu fragmento de ASC de ser humano, camundongo ou rato. Em ainda outra modalidade, o anticorpo se liga a uma parte ou fragmento deste de uma sequência de proteína ASC de mamífero (por exemplo, ASC de ser humano, camundongo ou rato)

Petição 870190068968, de 22/07/2019, pág. 32/96

30/58 localizado entre os domínios PYD e CARD. Em outra modalidade, uma composição para tratamento e/ou redução de inflamação nos pulmões de um mamífero inclui um anticorpo que se liga especificamente a uma região de ASC de rato, por exemplo, sequência de aminoácido ALRQTQPYLVTDLEQS (SEQ ID NO: 1) (isto é, resíduos 178-193 de ASC de rato, número de acesso BAC43754). Nesta modalidade, um anticorpo como descrito aqui se liga especificamente a uma sequência de aminoácido que possui pelo menos 65% (por exemplo, 65, 70, 75, 80, 85%) de identidade de sequência com a sequência de aminoácido ALRQTQPYLVTDLEQS (SEQ ID NO: 1) de ASC de rato. Em outra modalidade, uma composição para o tratamento e/ou redução da inflamação no CNS de um mamífero inclui um anticorpo que especificamente se liga a uma região de ASC de ser humano, por exemplo, a sequência de aminoácido RESQSYLVEDLERS (SEQ ID NO: 2). Em uma modalidade, um anticorpo que se liga a um dominio de ASC ou seu fragmento como aqui descrito inibe a atividade de ASC nas células pulmonares, por exemplo, células alveolares do Tipo II de um mamífero.

[0063] Em outra modalidade, uma composição para reduzir a inflamação nos pulmões de um mamífero inclui um anticorpo ou um anticorpo um fragmento ativo deste conforme fornecido nesta invenção que se liga especificamente a NLRP1 (por exemplo, anticorpo de galinha anti-NLRP1) ou seu domínio. Qualquer anticorpo anti-NRP1 adequado pode ser utilizado, e vários são comercialmente disponíveis. Exemplos de anticorpos anti-NLRP1 para uso nos métodos da presente invenção podem ser aqueles encontrados na US 8685400, cujos conteúdos são aqui incorporados por referência na sua totalidade. Exemplos de anticorpos anti-NLRP1 comercialmente disponíveis para uso nos métodos aqui fornecidos incluem, mas não são limitados a estes, anticorpo policlonal de NLRP1 humano AF6788 da R&D Sys

Petição 870190068968, de 22/07/2019, pág. 33/96

31/58 fems, anti-NLRP1 policlonal de coelho da EMD Millipore ABF22, antiNLRP1 policlonal de coelho Novus Biologicals NB100-56148, antiNLRP1 policlonal de camundongos Sigma-Aldrich SAB1407151, antiNLRP1 policlonal de coelho Abeam ab3683, anti-NLRP1 policlonal de coelho Biorbyt anti-NLRP1 orb325922, anti-NLRP1 policlonal de coelho mybiosource MBS7001225, anti~NLRP1 policlonal de ovelha R&D Systems AF6788, anti-NLRP1 monoclonal de camundongo Aviva Systems oaed00344, anti-NLRP1 policlonal de coelho Aviva Systems ARO54478_P050, anti-NLRP1 policlonal de coelho Origene APO7775PU-N, anti-NLRP1 policlonal de coelho Antibodies online ABIN768983, anti-NLRP1 policlonal de coelho Prosei 3037, antiNLRP1 policlonal de coelho Proteintech 12256-1-AP, anti-NLRP1 monoclonal de camundongo Enzo ALX-804-803-C100, anti-NLRPI monoclonal de camundongo Invitrogen MA1-25842, anti-NLRP1 monoclonal de camundongo GeneTex GTX16091, anti-NLRP1 policlonal de coelho Rockland 200-401-CX5, ou anti-NLRP1 policlonal de coelho Cell Signaling Technology 4990. A proteína NRLP1 humana pode ser o número de acesso AAH51787, NPjOOl028225, NPJ155737, NP J 27497, NP_127499 ou NP J 27500. Em uma modalidade, o anticorpo se liga a um domínio Pyrin, NACHT, LRR1-6, FUND ou CARD ou uma parte ou fragmento deste de uma proteína de NLRP1 de mamífero (por exemplo, NLRP1 de ser humano). Nesta modalidade, um anticorpo como descrito nesta invenção se liga especificamente a uma sequência de aminoácido que possui pelo menos 65% (por exemplo, 65, 70, 75, 80, 85%) de identidade de sequência com um domínio específico (por exemplo, Pyrin, NACHT, LRR1-6, FUND ou CARD) ou seu fragmento de NLRP1 Humano. Em uma modalidade, um anticorpo policlonal anti-NLRPI de galinha que foi de concebido sob medida e produzido por Ayes Laboratories, é utilizado para a redução da inflamação pulmonar. Este anticorpo pode ser direcionado contra a seguin

Petição 870190068968, de 22/07/2019, pág. 34/96

32/58 te sequência de aminoácido em NLRP1 de ser humano: CEYYTEIREREREKSEKGR (SEQ ID NO:3). Em uma modalidade, um anticorpo que se liga a um domínio de NLRP1 ou seu fragmento conforme descrito nesta invenção inibe a atividade de NLRP1 nas células pulmonares, células alveolares do Tipo II de um mamífero.

[0064] Em mais outra modalidade, uma composição para a redução da inflamação nos pulmões de um mamífero inclui um anticorpo ou um fragmento ativo do mesmo conforme aqui fornecido que se liga especificamente a AIM2 ou seu domínio. Qualquer anticorpo anti-AIM2 adequado pode ser utilizado, e vários são comercialmente disponíveis. Exemplos de anticorpos anti-AIM2 comercialmente disponíveis para uso nos métodos aqui fornecidos incluem, mas não são limitados a estes, anti-AIM2 policlonal de coelho cat. Number 20590-1-AP da Proteintech,, anticorpo anti-AIMS Abeam (ab119791), anti-AIM2 policlonal de coelho (região N-terminal) Cat. Number AP3851 da ECM biosciences, anti-ASC policlonal de coelho Cat. Number E-AB-30449 da Elabsciences,, anticorpo monoclonal de camundongos Anti-AIM2 denominado AIM2 Antibody (3C4G11) com número de catálogo sc-293174 da Santa Cruz Biotechnology, anticorpo AIM2 monoclonal de camundongos com número de catálogo TA324972 da Origene, anticorpo monoclonal AIM2 (10M2B3) da Thermofisher Scientific, anticorpo policlonal de coelho AIM2 ABIN928372 ou ABIN760766 da Antibodies-online, anticorpo policlonal anti-AIM2 Biomatix coat com cat. Number CAE02153. Anticorpo policlonal anti-AIM2 (OABF01632) da Aviva Systems Biology, anticorpo anti-AIM2 policlonal de coelho LS-C354127 da LSBÍO-C354127, anticorpo anti-AIM2 monoclonal de coelho da Cell Signaling Technology, com cat number MA5-16259. Anticorpo monoclonal anti-AIM2 policlonal de coelho da Fab Gennix International Incorporated, Cat. Number AIM2 201AP, anti-AIM2 policlonal de coelho MyBiosource cat number MBS855320, anti AIM2 policlonal de coelho

Petição 870190068968, de 22/07/2019, pág. 35/96

33/58

Signalway cat number 36253, anti-AIM2 policlonal de coelho Novus Biological número de catálogo 43900002, anti-AIM2 policlonal de coelho GeneTex GTX54910, anti-AIM2 policlonal de coelho Prosei 26-540, anti-AIM2 monoclonal de camundongo Biorbyt orb333902, anti-AIM2 policlonal de coelho Abeam ab93015), anti-AIM2 policlonal de coelho Abeam ab76423, anti~AIM2 policlonal de camundongo Signma Aldrich SAB1406827 ou anti-AIM2 Biolegend 3B10. A proteína AIM2 de ser humano pode ser o número de acesso NXj014862, NP004824, XP016858337, XP005245673, AAB81613, BAF84731 ou AAH10940. Em uma modalidade, o anticorpo se liga a um domínio Pyrin ou HIN200 ou uma parte ou fragmento deste de uma proteína AIM2 de mamífero (por exemplo, AIM2 de ser humano). Nesta modalidade, um anticorpo como descrito aqui se liga específicamente a uma sequência de aminoácído que possui pelo menos 65% (por exemplo, 65, 70, 75, 80, 85%) de identidade de sequência com um domínio específico (por exemplo, Pyrin ou HIN-200) ou seu fragmento de AIM2 de ser humano. Em uma modalidade, anticorpo que se liga a um domínio de AIM2 ou seu fragmento como descrito nesta invenção inibe a atividade de AIM2 nas células pulmonares, por exemplo, células alveolares do Tipo II de um mamífero.

[0065] Anticorpos anti-inflamassoma (por exemplo, Anti-ASC, antiNLRP1 ou anti-AIM2) como aqui descritos incluem anticorpos de roedores policlonais e monoclonais, anticorpos humanos policlonais e monoclonais, ou qualquer uma de suas partes, tendo pelo menos uma região de ligação ao antígeno de uma região variável de imunoglobulina, cujo anticorpo especificamente se liga a um componente de um inflamassoma de mamífero (por exemplo, inflamassoma de AIM2) tal como, por exemplo, ASC ou AIM2. Em alguns casos, o anticorpo é específico para ASC de tal modo que um anticorpo é específico para ASC se este for produzido contra um epítopo do polipeptídeo e se liga

Petição 870190068968, de 22/07/2019, pág. 36/96

34/58 a pelo menos parte da proteína natural ou recombinante.

[0066] Métodos para determinar a especificidade e a afinidade de anticorpos monoclonais através da Inibição competitiva podem ser encontrados em Harlow, et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988, Colligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc, and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993), e Muller, Meth. Enzymol. 92:589-601, 1983, cujas referências são inteiramente aqui incorporadas por referência.

[0067] Anticorpos anti-inflamassoma (por exemplo, anti-ASC e anti-AIM2) da presente invenção podem ser produzidos rotineiramente de acordo com métodos tais como, mas não limitado à inoculação de um animal apropriado com o polipeptídeo ou um fragmento antigênico, estimulação in vitro de populações de linfócitos, métodos sintéticos, hibridomas e/ou células recombinantes que expressam ácido nucleico que codifica tais anticorpos anti-ASC ou anti-NLR1. A imunização de um animal utilizando ASC recombinante purificado ou seus fragmentos peptídicos, por exemplo, resíduos 178-193 (SEQ ID NO: 1) de ASC de rato (por exemplo, número de acesso BAC43754) ou SEQ ID NO: 2 de ASC de ser humano, é um exemplo de um método de preparação de anticorpos anti-ASC. De forma similar, a imunização de um animal usando NLRP1 recombinante purificado ou seus fragmentos de peptídeo, por exemplo, resíduos MEE SQS KEE SNT EG-cys (SEQ ID NO:4) de NALP1 de rato ou SEQ ID NO: 3 de NALP1 de ser humano, é um exemplo de um método de preparação de anticorpos antiNLRP1.

[0068] Anticorpos monoclonais que se ligam especificamente ASC ou NLRP1 podem ser obtidos por métodos conhecidos por aqueles versados na técnica. Ver, por exemplo, Kohler and Milstein, Nature 256:495-497, 1975; U.S. Pat. No. 4,376,110; Ausubel et al., eds., Cur

Petição 870190068968, de 22/07/2019, pág. 37/96

35/58 rent Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc, and Wiley Interscience, N.Y., (1987, 1992); Harlow and Lane ANTIBODIES: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988; Colligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc, and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993), cujos conteúdos são aqui inteiramente incorporados por referência. Tais anticorpos podem ser de qualquer classe de imunoglobulina incluindo IgG, IgM, IgE, IgA, GALD e qualquer subclasse destes. Um hibridoma que produz um anticorpo monoclonal da presente invenção pode ser cultivado in vitro, in situ ou in vivo.

Administração de Composições [0069] As composições da invenção podem ser administradas a mamíferos (por exemplo, roedores, seres humanos) em qualquer formulação adequada. Por exemplo, anticorpos anti-ASC podem ser formulados em veículos ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis como soro fisiológico ou uma solução salina tamponada. Veículos e diluentes adequados podem ser selecionados com base no modo e via de administração e prática farmacêutica padrão. Uma descrição de veículos e diluentes farmaceuticamente aceitáveis exemplares, assim como formulações farmacêuticas, pode ser encontrada em Remington’s Pharmaceutical Sciences, um texto padrão neste campo, e em USP/NF. Outras substâncias podem ser adicionadas às composições para estabilizar e/ou conservar as composições.

[0070] As composições da invenção podem ser administradas aos mamíferos por qualquer técnica convencional. Tipicamente, tal administração será por inalação ou parenteral (por exemplo, introdução intravenosa, subcutânea, intratumoral, intramuscular, intraperitoneal ou intratecal). As composições também podem ser administradas diretamente a um sítio alvo, por exemplo, através de liberação cirúrgica a um sítio alvo interno ou externo, ou por cateter a um sítio acessível por

Petição 870190068968, de 22/07/2019, pág. 38/96

36/58 um vaso sanguíneo. As composições podem ser administradas em um único bolo, múltiplas injeções, ou por Infusão contínua (por exemplo, por via intravenosa, por diálise peritoneal, infusão de bomba). Para administração parenteral, as composições são preferivelmente formuladas em uma forma livre de pirógeno esterilizada.

Doses Eficazes [0071] As composições descritas acima são preferivelmente administradas a um mamífero (por exemplo, um rato, ser humano) em uma quantidade eficaz, isto é, uma quantidade capaz de produzir um resultado desejável em um mamífero tratado (por exemplo, redução da inflamação no CNS de um mamífero submetido a uma lesão traumática ao CNS ou acidente vascular cerebral ou tendo uma doença autoimune ou do CNS). Uma tal quantidade terapeuticamente eficaz pode ser determinada como descrito abaixo.

[0072] Toxicidade e eficácia terapêutica das composições utilizadas nos métodos da invenção podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos padrão, utilizando células em cultura ou animais experimentais para determinar a LDso (a dose letal para 50% da população). A relação de dose entre efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico e pode ser expressa como a relação de LD50/ED50. Aquelas composições que apresentam grandes índices terapêuticos são preferíveis. Embora aquelas que apresentam efeitos colaterais tóxicos possam ser utilizadas, cuidado deve ser tomado para projetar um sistema de liberação que minimize 0 dano potencial de tais efeitos colaterais. A dosagem das composições preferidas situa-se de preferência dentro de uma faixa que inclui uma ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro desta faixa dependendo da forma de dosagem empregada e da via de administração utilizada.

[0073] Como é bem conhecido nas técnicas médicas e veterinárias, a dosagem para qualquer indivíduo depende de muitos fatores,

Petição 870190068968, de 22/07/2019, pág. 39/96

37/58 incluindo o tamanho do indivíduo, área de superfície corporal, idade, a composição particular a ser administrada, tempo e via de administração, saúde geral e outros fármacos sendo administrados simultaneamente.

EXEMPLOS [0074] A presente invenção é ainda ilustrada pelos seguintes exemplos específicos. Os exemplos são fornecidos apenas para ilustração e não devem ser interpretados como limitative do escopo da invenção de qualquer maneira.

Exemplo 1: Papel da sinalização de inflamassoma mediada por EV na ALI após a TBI e efeitos de sua neutralização [0075] A disfunção pulmonar frequentemente se apresenta como uma complicação de lesões traumáticas severas do cérebro (1). Aproximadamente 20 a 25 por cento de indivíduos com TBI desenvolvem lesões pulmonares agudas (ALI) (2), mas os mecanismos que servem como mediador da patologia de ALI induzida por TBI permanecem fracamente definidos. A literatura anterior tem sustentado a idéia de que a disfunção pulmonar após a TBI é devido à resposta simpática à pressão intracraniana aumentada que leva à disfunção cardiopulmonar (42). Estudos mais recentes, no entanto, demonstraram que uma resposta inflamatória sistêmica também desempenha um papel chave na lesão pulmonar induzida por TBI (43). Especificamente, a via receptora de ligante HMGB1-RAGE serve como mecanismo de transdução central para a disfunção pulmonar após a TBI (8). Além disso, o HMGB1 induz a ativação de inflamassoma AIMS (37). Além disso, a literatura anterior revela que patógenos secretam a EV que carregam DAM Ps, tal como HMGB1, e inflamação acionadora (Buzas et al., 2014). Vários estudos demonstraram que a barreira hematoencefáiica (BBB) é permeável após a TBI o mais cedo de 3 a 6 horas após a lesão, resultando em danos à barreira protetora entre o cérebro e o compartimento

Petição 870190068968, de 22/07/2019, pág. 40/96

38/58 intravascular e leva a vazamento de proteínas e fluidos (44). O rompimento da BBB após a lesão resulta na secreção de mediadores inflamatórios, tais como DAMPs, que podem ainda tratar a inflamação do cérebro e danificar órgãos distais (5). Vários mediadores inflamatórios podem atuar como marcadores bem delineados para a lesão do cérebro, no entanto, sua validade não é amplamente aceita (45). Além disso, não existe atualmente nenhum tratamento ou biomarcador clinicamente aprovado para a ALI induzida por TBI. Recentemente, a EV tornou~se uma área de interesse em pesquisa de biomarcador para diversos tipos diferentes de doenças, incluindo lesões pulmonares (46) e TBI (47). Foi anteriormente mostrado que na EV isolada do fluido cerebroespinhal de paciente com TBI, existe um aumento de proteínas de inflamassoma quando comparado com amostras de controle (14). Neste exemplo, a contribuição da sinalização de inflamassoma mediada por EV na etiologia de ALI induzida por TBI foi examinada.

Materiais e Métodos

Animais e Lesões Cerebrais Traumáticas [0076] Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee of the University of Miami Miller School of Medicine (Animal Welfare Assurance A3224-01) e foram realizados de acordo com ο NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. As diretrizes de ARRIVE foram seguidas na condução deste estudo. Todos os camundongos C57/BL6 estavam com 8 a 12 semanas e 24 a 32 gramas. Os camundongos foram prospectivamente escolhidos a esmo para grupos experimentais (simulados, 4h, 24) para TBI, grupos experimentais (passíveis, simulados-solução salina, não tratados, enoxaparina, anti-ASC) para transferência e tratamento de adotivo. Para grupo de experimentos de TBI, animais simulados sofreram procedimento de cirúrgico, mas não foram feridos. Para estudos de tratamento de transferência adotiva, o grupo de simulado

Petição 870190068968, de 22/07/2019, pág. 41/96

39/58 solução salina sofreu procedimentos cirúrgicos e recebeu solução salina como tratamento de veículo. Animais passíveis não sofreram nenhum procedimento cirúrgico. Um tamanho de amostra de 5 A 6 foi utilizado para cada grupo com base na análise de potência (utilizando análise de potência G*, com um tamanho de efeito F = 0,85, conjunto α 00,05) e dados históricos ⁴⁹·⁵⁰. Todos os camundongos foram alojados em instalações de animal livres de antígeno virai (VAF) no Lois Pope Life Center at the University of Miami em ciclos de luz/escuridâo de 12 horas e alimento e água foram fornecidos ad libitum. A instalação conduz procedimentos de pecuária duas vezes por semana e verifica as condições dos animais diariamente. Os animais foram observados pós-operatório, onde foram mantidos em uma almofada de aquecimento e a temperatura do corpo foi controlada com uma sonda retal onde foi mantida a 37Ό, em nossa sala de operação e depois transferidos para os alojamentos do animal.

[0077] Antes de cirurgia, os animais foram anestesiados com cetamina e xilazina (intraperitoneal, i.p.). Os animais anestesiados foram então colocados em uma almofada de aquecimento para assegurar uma temperatura corporal de 37 Ό. A TBI foi executada utilizando um modelo Controlled Cortical Impact (CCI). Uma craniotomia de 5 mm foi feita no córtex direito (-2,5 mm posterior, 20,0 mm lateral de Bregma). A lesão foi induzida utilizando o dispositivo ECCI-6.3 (Custom Design & Fabrication, Richmond, VA, USA) com urn impounder de 3 mm em velocidade de 6 m/s, 0,8 mm de profundidade e duração de impacto de 150 ms (15). Após estes procedimentos, os animais retornaram às suas gaiolas e receberam alimento e água. Os animais foram sacrificados em 4 horas e 24 horas após a TBI conforme descrito. Os animais simulados foram anestesiados e submetidos à mesma incisão précirúrgica como animais lesionados, mas não foram submetidos a uma craniotomia ou contusão.

Petição 870190068968, de 22/07/2019, pág. 42/96

40/58

Coleta de tecido [0078] Todos os animais foram anestesiados com cetamina e xilazina, antes da perfusão. Os animais depois foram submetidos a perfusão traqueal. Os pulmões foram infundidos com paraformaldeído a 4% (PFA) utilizando um cateter traqueal em 20 cm de H2O e depois fixados em PFA 4% durante a noite a 4 Ό. Os tecidos pu Imonares fixados foram incorporados em parafina embutidas e cortes de 5 pm foram processadas (16). Tecido pulmonar direito foi coletado para isolamento de proteína e análises moleculares. Os animais então sofreram decapitação e o tecido cortical direito foi coletado para isolamento de proteína e análises moleculares.

Ensaio de isolamento de piroptossoma [0079] Lisados de tecido pulmonar de camundongos foram filtrados através de uma membrana de difluoreto de polivinilideno de ligação baixa (PVDF) de 5 pm (Mlllipore). Após a filtragem, o sobrenadante foi centrifugado em 2700 xg durante 8 minutos. O grânulo foi colocado novamente em suspensão em 40 pl de tampão de ácido 3[3colamidopropil)dimetilamônio]-propanossulfônico (CHAPS) (20 mmol/L de HEPES-KOH, pH 7,5, 5 mmol/L de MgCI2, 0,5 mmol/L de EGTA, 0,1 mmol/L de fluoreto de fenilmetilsulfonila, coquetel de inibidor de protease, e 0,1% de CHAPS). A plroptossoma foi granulada por centrifugação em 2700 xg durante 8 minutos. O grânulo foi então colocado novamente em suspensão e incubado em 27,8 pl de tampão CHAPS com 2,2 μΙ de substrato de dissuccinimldila (9) durante 30 minutos na temperatura ambiente para reticular dímeros ASC. Finalmente, uma quantidade igual de tampão de Laemmli 2x foi adicionada e as proteínas foram analisadas por immunoblotting utilizando anticorpos comercialmente disponíveis para ASC e Gasdermina D (GSD).

Extração Nuclear e Cítoplásmlca [0080] Frações nucleares e citoplásmlcas foram extraídas utilizan

Petição 870190068968, de 22/07/2019, pág. 43/96

41/58 do os NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents (Thermo Scientific) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as amostras de tecido pulmonar de camundongos foram cortadas em pedaços de 20 a 100 mg e centrifugadas em 500 x g durante 5 minutos. Os pedaços de tecido foram homogeneizados com o Cytoplasmic Extraction Reagent e centrifugados em 16.000 x g durante 5 minutos. Depois o sobrenadante (extrato celular) foi removido e o grânulo foi centrifugada com Nuclear Extraction Reagent (Thermo Scientific) em 16.000 x g durante 10 minutes. Este sobrenadante correspondia à fração nuclear, que foi removida e armazenada a -80Ό.

Immunoblottmg [0081] Amostras de tecido pulmonar e cerebral foram congeladas Instantaneamente em nitrogênio líquido e armazenadas a -80Ό. Cortes de 2 mm de tecido de pulmão Inferior direito e cortical direito foram homogeneizados em tampão de extração contendo coquetel inibidor de protease e fosfatase (Sigma, St Louis, MO, USA) e decidido em géis pré-moldados 4 a 20% Tris-TGX Criterion (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) conforme descrito em de Rivero Vaccari et al. 2015 (13) utilizando anticorpos para caspase 1 (Nevus Biologicals), ASC (Santa Cruz), IL-1 β (Cell Signaling), IL-18 (Abeam) AIM2 (Santa Cruz) e HMGB1 (Millipore). A quantificação da densidade de faixa foi executada utilizando Image Lab e todos os dados foram normalizados para β-actina. Imuno-histoquimica [0082] Seções de tecido foram submetidas ao tratamento de remoção de parafina em xileno e depois reidratadas utilizando etanol e solução salina tamponada Tris. Procedimentos de imuno-histoquímica foram então realizados para coloração dupla conforme descrito anteriormente (16). As seções foram incubadas durante a noite a 4Ό com anticorpos contra Caspase~1 e ASC (Millipore), AIM2 (Santa Cruz), HMGB1 (Millipore) e SPC (Millipore). Seções pulmonares imunocolari

Petição 870190068968, de 22/07/2019, pág. 44/96

42/58 das de camundongos simulados, 4 horas e 24 horas foram examinadas com um microscópio confocal de varredura a laser Zeiss (Zeiss, Inc., Thornwood, NY, USA). As seções pulmonares foram analisadas por indivíduos que foram cegos aos grupos.

Isolamento de EV [0083] As EV foram isoladas a partir do soro de camundongos lesionados por TBI e camundongos com lesão utilizando a solução Total Exosome Isolation de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen). Resumidamente, 100 μΙ de cada amostra foram centrifugados em 2000 x g durante 30 minutos. O sobrenadante foi então incubado com 20 μΙ de reagente Total Exosome Isolation (TEI) durante 30 minutos a 4 Ό seguido por centrifugação em 10.000 x g durante 10 minutos na temperatura ambiente. Os sobrenadantes foram descartados e o grânulo foi colocado novamente em suspensão em 100 μΙ de PBS. As EV foram caracterizadas pela expressão de CD81 e através da análise de rastreamento Nanosight (FIG. 6).

Transferência Adotiva de EV [0084] EV derivadas de soro de camundongos C57BL-6 com TBI e simulados foram injetadas em camundongos C57BL-6 não experimentados através da veia jugular em uma dose de 10,0 x 10ⁱ⁰ partículas por grama/peso corporal ⁴⁸. A contagem de partícula foi medida por análise Nanosight Tracking e amostras foram diluídas consequentemente. Antes da cirurgia os animais foram anestesiados com cetamina e xileno. Uma incisão de 1 a 2 cm foi feita entre a mandíbula e a clavícula. A veia jugular foi elevada e amarrada, seguida por colocação de cateter. As EV derivadas de soro foram transferidas e os tecidos de pulmão e cérebro foram coletados 24 horas após a injeção para análise (n = 5).

Tratamento com Enoxaparín e Anti-ASC [0085] As EV derivadas de soro de camundongos com TBI foram

Petição 870190068968, de 22/07/2019, pág. 45/96

43/58 injetadas em camundongos C57-BL6 não experimentados através de uma injeção na veia jugular. Uma hora mais tarde, Enoxaparin (3 mg/kg) (n = 4) e Anti-ASC (5 mg/kg) (n = 4) foram administrados nos animais receptores. Os seguintes grupos foram utilizados: 1) o grupo não experimentado não recebeu nenhum tratamento, 2) o grupo de salina simulado foi utilizado como um controle negativo e sofreu injeção na veia jugular de apenas solução salina, 3) o grupo não tratado recebeu EV de camundongos com TBI sem qualquer tratamento e foi utilizado como um controle positivo, 4) o grupo ENOX recebeu EV de camundongos com TBI e Enoxaparin, e 5) o grupo Anti-ASC recebeu EV de camundongos com TBI e Anti-ASC. A ordem de tratamento foi aleatória. Tecidos pulmonares e cerebrais foram coletados 24 horas após a injeção para análise. Deve-se observar que o anticorpo antiASC utilizado nos experimentos de tratamento foi um anticorpo monoclonal humanizado contra ASC e reconhece ASC de murino, ser humano e suíno.

Histologia e Pontuação de Lesões Pulmonares [0086] Seções de tecido pulmonar foram coradas por um método de hematoxilina e eosina padrão para a histologia, morfometria e pontuação de ALL As seções pulmonares foram classificadas por um patologista cego utilizando o Lung Injury Scoring System from the American Thoracic Society Workshop Report (17). Vinte campos aleatórios de alta potência foram escolhidos para pontuação. Critérios para a pontuação de ALI basearam-se no número de neutrófilos no espaço alveolar, espaço intersticial, membranas de hialina, resíduos proteináceos que carregam os espaços de ar e espessamento séptico alveolar. Com base nestes critérios, uma pontuação entre 0 (nenhuma lesão) e 1 (lesão grave) foi dada.

AnáHse Estatística [0087] Os dados foram analisados utilizando um teste T de Stu

Petição 870190068968, de 22/07/2019, pág. 46/96

44/58 dent para dois grupos e uma ANOVA unidirecional seguido por testes de comparação múltipla de Tukey, (GraphPad Prism versão 7.0) para dois ou mais grupos. Teste de D’Agostino-Pearson foi utilizado para testar quanto a normalidade. Os dados são expressos como média +/SEM. Valores p de significância utilizados foram *p < 00,05.

Resultados

TBI grave aumenta as proteínas de inflamassoma AIM2 e a expressão de HMGB1 no cérebro de camundongos [0088] Níveis excessivos da citocina pró-inflamatória IL-1 β e 11.-18 e das proteínas de inflamassoma estão associados com o dano secundário após a lesão cerebral de percussão fluida (18). Para determinar se o processamento induzido por CCI severo de citocinas próínflamatórias e alterações nos níveis de proteínas de inflamassoma, os lísados corticais foram analisados, entretanto, há uma pesquisa limitada sobre a ativação de inflamassoma na TBI grave. Neste Exemplo, após a CCI grave, os lísados corticais foram examinados quanto aos níveis da caspase 1 (Fig 1A, Β) (p < 0,001), ASC (Fig. 1A, C) (p = 0,003), IL-18 (Fig 1 A, D) (p = 0,0042), AIM2 (Fig. 1A, F) (p = 00,0197) e IL-1 β (Fig 1 A, G) (p- 00,0141) em 4 e 24 horas após a lesão. Níveis de caspase 1, ASC, AIM2 e IL-1 β chegaram ao máximo em 4 horas após a CCI e diminuíram por 24 horas. O curso de tempo para a maturação de citocinas infiamatórias diferiu iigeiramente, mas chegou ao máximo por 24 horas após a TBI. Visto que outros têm mostrado um papel para a inflamassoma DAMP HMGB1 que ativa o inflamassoma AIM2, os níveis destas proteínas também foram determinados em Usados corticais. Conforme mostrado nas FIGs. 1A, 1E, a CCI Induziu um aumento significativo nos níveis de HMGB1 (FIG. 1A, 1E) (p = 00,0121) em 4 e 24 horas após a lesão. Estes dados indicam que após a CCI grave em camundongos, os níveis das proteínas de inflamassoma AIM2 foram significativamente elevados no córtex após a lesão.

Petição 870190068968, de 22/07/2019, pág. 47/96

45/58

TBI grave aumenta a proteína de inflamassoma AIM2 e a expressão de HMGB1 nos pulmões de camundongos [0089] Para determinar se a CCI induziu a ativação de inflamassoma nos pulmões, uma análise de immunoblot de lisados pulmonares foi executada para a caspase 1 (Fig 1 Η, I) (p ~ 0,0026), ASC (Fig. 1 H, J) (p = 0,0427), IL-18 (Fig. 1H, K) (p = 0,0025), IL-1 β (Fig. 1 H,N) (p = 0,0012) e AIM2 (Fig. 1 H,M) (p < 0,001), e NLRP3 (p = 0,0047) (Figura Suplementar 1). Níveis aumentados de caspase 1, ASC, IL-18 e AIM2 foram significativamente aumentados em 4 horas e 24 horas após a lesão, em comparação com o controle simulado. No entanto, o curso do tempo do aumento da expressão da proteína diferiu ligeiramente daquele observado no cérebro em que atingiu o máximo em 24 horas após a ICC. Visto que o eixo HMGBI-RAGE desempenha um papel no mecanismo pelo qual a TBI induz a disfunção do pulmão (8), os lisados pulmonares foram analisados quanto aos níveis de expressão da proteína HMGB1. FIGURAS 1H, 1L (p = 0,0158) mostra que a expressão de HMGB1 aumentou em 4 e 24 horas após a TBI, indicando que o inflamassoma AIM2 e HMGBI desempenham um papei na resposta inflamatória nos pulmões pós-TBI.

TBI Induz a piroptose nos pulmões de camundongos [0090] Como mostrado anteriormente, a ativação do inflamassoma AIM2 nos neurônios corticais leva à morte de células piroptóticas (19). Para investigar se os resultados de TBI ma piroptose no tecido pulmonar de camundongos, o piroptossoma no tecido pulmonar foi isolado após a TBI. Os animais com TBI, sacrificados em 4 horas após a lesão, mostraram evidências de oligomerização de ASC em comparação com os animais simulados (FIG. 4A). Dímeros e trímeros de ASC foram observados em animais com TBI (50, 75 kDA, respectivamente). Estes resultados foram indicativos da formação de piroptossoma, que pode ser caracterizado pela montagem supramolecular de oligômeros

Petição 870190068968, de 22/07/2019, pág. 48/96

46/58 de ASC. Além disso, a gasdermina D (GSDMD), que é clivada após a ativação da caspase 1 e desencadeia a piroptose e a liberação de IL1β (20), foi significativamente aumentada nos pulmões de animais com TBI em comparação com simulado (FIG. 4B e 4C) (p - 0,0001). Essas descobertas indicaram que a piroptose contribui para a morte celular no tecido pulmonar após a TBI.

TBI aumenta a imunorreatividade das proteínas de inflamassoma nas células epiteliais alveolares do tipo II [0091] A TBI pode levar a um vazamento capilar, resultando em aumento da permeabilidade vascular e dano às células epiteliais alveolares especializadas, denominadas pneumócitos tipo II (5). Para examinar os efeitos celulares da TBI na expressão do inflamassoma nos pulmões após a lesão, a análise de imunoistoquímica foi executada em seções pulmonares de animais lesionados simulados, 4 horas e 24 horas. As células epiteliais alveolares do tipo II são conhecidas de serem o principal tipo de células pulmonares lesionadas na ALI (17). As secções pulmonares foram coradas com anticorpos contra Al M2, caspase 1 e ASC (verde) e co-coradas com proteína Pro-surfactante C (Pro-SPC, vermelho), um marcador de células epiteliais do tipo II e coloração nuclear DAPI (azul). Como mostrado nas FIGURAS 2A a 2C, a caspase 1 ativa (FIG. 2A), ASC (FIG. 2B), assim como AIM2 (FIG. 2C) estão presentes em células positivas SPC (seta). A imunorreatividade dessas proteínas de inflamassoma aumentou após a TBI. Essas descobertas indicam que as proteínas de inflamassoma são expressas nas células epiteliais alveolares tipo II e que a TBI resulta em aumento da imunorreatividade nessas células.

TBI aumenta a expressão de HMGB1 nuclear e citopiásmica [0092] A fim de determinar a distribuição celular de HMGBI em células pulmonares após a TBI, frações nucleares e citoplásmicas de homogenatos de pulmão foram isoladas (FIG. 3A, 3C) (p - 0,0337). A

Petição 870190068968, de 22/07/2019, pág. 49/96

47/58 immunoblotting indicou que ambas as frações tinham aumentos significativos na expressão de HMGB1 em 4 horas pós-TBI (FIG. 3B, 3D) (p = 0,0345). A análise de imunoistoquímica de HMGB1 também foi executada de modo a determinar as mudanças na imunorreatividade em seções pulmonares após a TBi. As seções foram co-coradas para HMGB1 (verde) e SPC (vermelho) e coloração nuclear DAPI (azul). A imunorreatividade de HMGB1 foi aumentada em 4 horas e 24 horas quando comparada com a simulação. Imunorreatividade fraca de HMGB1 foi observada nas células SPC-positivas (seta) (FIG. 3); portanto, sugere-se que as alterações de HMGB1 no tecido pulmonar lesionado podem ser citoplásmicas.

TBI induz alterações na morfologia do pulmão e induz a ALI [0093] A ALI pode ser caracterizada por processos infiamatórios, que leva a edema alveolar e intersticial assim como infiltração de células inflamatórias no espaço alveolar (23). A análise h isto pato lógica de tecido pulmonar (FIG. 5A) indica que a TBI grave provoca alterações substanciais na arquitetura e morfologia do pulmão em 4 e 24 horas após a lesão. Animais simulados mostraram uma morfologia alveolar normal, enquanto que os animais lesionados apresentaram alterações agudas no edema alveolar, mas diminuíram ligeiramente por 24 horas após a lesão (setas longas). Além disso, houve evidência de infiltração de neutrófilo (pontas de seta) e alterações na morfologia das membranas capilares alveolares (*) em ambos os pontos de tempo. Animais lesionados apresentaram sinais de edema intersticial, que foi mais pronunciada em 4 horas após a lesão, mas foi ainda evidente em 24 horas após a lesão (setas curtas). Finalmente, os animais lesionados também mostraram evidência de espessamento da área intersticial e do septo alveolar (libra, #).

[0094] Para confirmar que a lesão grave induz a ALI, as seções histológicas foram analisadas utilizando o sistema de pontuação de

Petição 870190068968, de 22/07/2019, pág. 50/96

48/58

AU definido pela American Thoracic Society (17). Este sistema baseiase na evidência de infiltração de neutrófilo nos espaços alveolar e intersticial, formação de membrana de hialina, resíduos proteináceos que carregam os espaços de ar, e espessamento séptico alveolar. (17). Estas características foram significativamente elevadas em animais lesionados e pontuações de ALI foram mais elevadas no geral em animais com TBI em comparação com a simulação (FIG. 5B) (p = 0,0017).

Tratamento com Enoxaparm e anticorpo anti-ASC reduz significativamente a expressão de inflamassoma e ALI após a transferência adotiva de EV de camundongos com TBI [0095] A fim de fornecer evidência de que a EV e sua carga que pode ser liberada para a circulação após a TBI pode induzir a ativação de inflamassoma no pulmão, um experimento de transferência adotiva clássica foi executado utilizando EV derivada do soro de camundongos com CCI grave. As preparações de EV foram validadas utilizando Western Blot para o marcador de EV CD81 (FIG. 6). Os controles receberam EV isolada de animais simulados ou não experimentados. Como mostrado nas FIGURAS 7A a 7F, caspase 1 ativa (FIG. 7A, 7B), ASC (FIG. 7A, 7C), IL-18 (FIG. 7A, 7D), AIM2 (FIG. 7A, 7E) e HMGB1 (FIG. 7A, 7F) foram significativamente elevadas nos pulmões de animais que receberam a EV de animais lesionados por TBI quando comparados com os pulmões de animais que receberam EV de camundongos não lesionados ou não experimentados ou camundongos não experimentados. Além disso, a infiltração de células inflamatórias (setas) foi aparente nos pulmões tratados com EV de camundongos com TBI (FIG. 7G). Finalmente, a pontuação de ALI também foi significativamente maior em animais que receberam EV de camundongos lesionados (FIG. 7H). Estes estudos forneceram evidência de um eixo de inflamassoma neural-respiratória em que a EV liberada na circula

Petição 870190068968, de 22/07/2019, pág. 51/96

49/58 ção após a TBI ativar o infiamassoma nas células alvo do pulmão contribuindo para a patogênese da ALL [0096] A seguir, o bloqueio de absorção de exosoma foi tentado através do tratamento com Enoxaparin ou um anticorpo monoclonal contra ASC após a transferência adotiva de EV de camundongos lesionados a não experimentados. Animais de controle negativos receberam solução salina e animais de controle positivo não receberam nenhum tratamento. Como mostrado nas FIGURAS 8A a 8F, Caspase 1 (FIG. 8A, 8B), ASC (FIG. 8A, 8C), IL-Ιβ (FIG. 8A, 8D), AIM2 (FIG. 8A, 8E), e HMGB1 (FIG. 8A, 8F) foram signlficatlvamente reduzidos (p = < 0,000001) em comparação com o grupo não tratado (controle positivo) após o tratamento com Enoxaparin ou um anticorpo anti-ASC monoclonal humanizado (por exemplo, anticorpo IC 100). Além disso, as seções pulmonares coradas de H&E apresentaram infiltração de neutrófilo significativamente menor no espaço alveolar e intersticial, assim como nenhum sinal de espessamento septal (FIG. 9A-D). As pontuações de ALI para animais tratados com Enoxaparin e anticorpo antiASC (IC 100) foram significativamente menores em comparação com o grupo não tratado (FIG. 9E) (p = < 0,0001). Assim, a EV liberada na circulação após a TBI desempenha um papel na ativação de infiamassoma nas células pulmonares que levam à ALI.

Conclusões [0097] A TBI pode estar associada com taxas mais elevadas de certas complicações médicas, especialmente disfunção pulmonar e do sistema nervoso central. Neste exemplo, a TBI grave mostrou-se aumentar a expressão de HMGB1 e infiamassoma (por exemplo, expressão de AIM2, caspase 1 e ASC) no tecido cortical e pulmonar e induzir alterações na morfologia pulmonar consistentes com ALI (por exemplo, infiltração de neutrófilos no espaço alveolar e intersticial, espessamento septal alveolar, e edema alveolar e hemorragia) e introduz a

Petição 870190068968, de 22/07/2019, pág. 52/96

50/58 idéia de um eixo infiamatório respiratório neural. Com importância, a TBI resultou em piroptose no tecido pulmonar (por exemplo, presença de divagem de GSDMD) e expressão aumentada de proteínas de inflamassoma em células epiteliais alveolares do tipo II. Adicionalmente, a transferência adotiva de EV a partir de camundongos com TBI ativou o inflamassoma e induziu a ALI, indicando que a lesão do cérebro induz a liberação de EV contendo uma carga de proteínas de inflamassoma que são depois carregadas para o resultante na ALI. Além do mais, foi mostrado que tanto por inibição da absorção de EV (Enoxaparin) quanto por ativação de inflamassoma (tratamento de anticorpo anti-ASC (IC100)), há uma redução na expressão de proteína de inflamassoma e no desenvolvimento de ALL [0098] Em resumo, este Exemplo mostrou que a sinalização de inflamassoma AIM2 desempenha um papel central no patomecanismo de lesões pulmonares após a TBI e demonstra um mecanismo de ALI induzido por TBI que envolve a sinalização de inflamassoma mediada por EV. Estes dados forneceram evidência de que a sinalização de inflamassoma mediada por EV pode desempenhar um papel central que envolve um eixo infiamatório neuronal-respiratórío. Portanto, o direcionamento deste eixo com anticorpos contra proteínas ou fármacos de inflamassoma que bloqueiam a absorção de EV pode fornecer uma abordagem terapêutica na ALI induzida por Neurotrauma em todas as áreas de medicina intensiva. À luz destes resultados, as estratégias terapêuticas apresentadas podem ser úteis para o tratamento de doenças inflamatórias do pulmão em geral.

Incorporação por referência [0099] As seguintes referências são incorporadas por referência nas suas totalidades para todos os propósitos.

1. Pfeifer R, et a/. (2015) Development of a standardized trauma-related lung injury model. J Surg Res 196(2):388-394.

Petição 870190068968, de 22/07/2019, pág. 53/96

51/58

2. Summers CR, Ivins B, & Schwab KA (2009) Traumatic brain injury in the United States: an epidemiologic overview. The Mount Sinai journal of medicine, New York 76(2):105-110.

3. Erickson SE_; et al. (2009) Recent trends in acute lung injury mortality: 1996-2005. Crit Care Med 37(5):1574-1579.

4. Nicolls MR & Laubach VE (2014) Traumatic brain injury: lungs in a RAGE. Sci Transl Med 6(252):252fs234.

5. Rincon F, et al. (2012) Impact of acute lung injury and acute respiratory distress syndrome after traumatic brain injury in the United States. Neurosurgery 71(4):795-803.

6. Andersson U & Rauvala H (2011) Introduction: HIVIGB1 in inflammation and innate immunity. J Intern Med 270(4):296-300.

7. Weber DJ_; et al. (2014) The HMGB1-RAGE axis mediates traumatic brain injury-induced pulmonary dysfunction in lung transplantation. Sci Transl Med 6(252):252ra124.

8. Lu B, et al. (2012) Novel role of PKR in inflammasome activation and HMGB1 release. Nature 488(7413):670-674.

9. de Rivero Vaccari JP, Dietrich WD, & Keane RW (2014) Activation and regulation of cellular inflammasomes: gaps in our knowledge for central nervous system injury. Journal of cerebral blood flow and metabolism : official journal of the international Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism 34(3):369-375.

10. Ware LB & Matthay MA (2000) The Acute Respiratory Distress Syndrome. New England Journal of Medicine 342(18):13341349.

11. Yanez-Mo M, et al. (2015) Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles 4:27066.

12. Qu Y, Franchi L, Nunez G, & Dubyak GR (2007) Nonclassical IL-1 beta secretion stimulated by P2X7 receptors is

Petição 870190068968, de 22/07/2019, pág. 54/96

52/58 dependent on inflammasome activation and correlated with exosome release in murine macrophages. J Immunol 179(3):1913-1925.

13. de Rivero Vaccari JP, et al. (2015) Exosome-mediated inflammasome signaling after central nervous system injury. J Neurochem. Jan;136 Suppl 1:39-48. doi: 10.1111/jnc.13036.

14. Atkins CM, Cepero ML, Kang Y, Liebl DJ, & Dietrich WD (2013) Effects of early rolipram treatment on histopathological outcome after controlled cortical impact injury in mice. Neurosci Lett 532:1-6.

15. Wu S_; et al. (2010) Conditional overexpression of connective tissue growth factor disrupts postnatal lung development. American journal of respiratory cell and molecular biology 42(5):552563.

16. Matute-Bello G_; et al. (2011) An official American Thoracic Society workshop report: features and measurements of experimental acute lung injury in animals. American journal of respiratory cell and molecular biology 44(5):725-738.

17. de Rivero Vaccari JP_; et al. (2009) Therapeutic neutralization of the NLRP1 inflammasome reduces the innate immune response and improves histopathology after traumatic brain injury. Journal of cerebral blood flow and metabolism : official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism 29(7):1251-1261.

18. Adamczak SE, et al. (2014) Pyroptotic neuronal cell death mediated by the Al M2 inflammasome. Journal of cerebral blood flow and metabolism : official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism 34(4):621-629.

19. Liu X, et al. (2016) Inflammasome-activated gasdermin D causes pyroptosis by forming membrane pores. Nature 535(7610):153158.

Petição 870190068968, de 22/07/2019, pág. 55/96

53/58

20. Dolinay T, et al. (2012) Inflammasome-regulated cytokines are critical mediators of acute lung injury. Am J Respir Cut Care Med 185(11):1225-1234.

21. Muller MC, et al. (2014) Contribution of damage-associated molecular patterns to transfusion-related acute lung injury in cardiac surgery. Blood transfusion = Trasfusione del sangue 12(3):368-375.

22. Ragaller M & Richter T (2010) Acute lung injury and acute respiratory distress syndrome. Journal of emergencies, trauma, and shock 3(1 ):43-51.

23. Lee K & Rincon F (2012) Pulmonary complications in patients with severe brain injury. Critical care research and practice 2012:207247.

24. Yasui H, Donahue DL, Walsh M, Castellino FJ, & Ploplis VA (2016) Early coagulation events induce acute lung injury in a rat model of blunt traumatic brain injury. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology 311 (1): L74-86.

25. Hendrickson CM_; et al. (2016) The acute respiratory distress syndrome following isolated severe traumatic brain injury. J Trauma Acute Care Surg.

26. Cross LJ & Matthay MA (2011) Biomarkers in acute lung injury: insights into the pathogenesis of acute lung injury. Crit Care Clin 27(2):355-377.

27. Butt Y, Kurdowska A, & Allen TC (2016) Acute Lung Injury: A Clinical and Molecular Review. Archives of pathology & laboratory medicine 140(4):345-350.

28. Luh SP & Chiang CH (2007) Acute lung injury/acute respiratory distress syndrome (ALI/ARDS): the mechanism, present strategies and future perspectives of therapies. Journal of Zhejiang University. Science. 8 8(1):60-69.

Petição 870190068968, de 22/07/2019, pág. 56/96

54/58

29. Matute-Bello G & Martin TR (2003) Science review: apoptosis in acute lung injury. Critical care 7(5):355-358.

30. Miao EA, Rajan JV, & Aderem A (2011) Caspase-1-induced pyroptotic cell death. Immunological reviews 243(1):206-214.

31. Hornung V, et al. (2009) AIM2 recognizes cytosolic dsDNA and forms a caspase-1-activating inflammasome with ASC. Nature 458(7237):514-518.

32. Lam NY, Rainer TH, Chan LY, Joynt GM, & Lo YM (2003) Time course of early and late changes in plasma DNA in trauma patients. Clinical chemistry 49(8): 1286-1291.

33. Fernandes-Alnemri T & Alnemri ES (2008) Assembly, purification, and assay of the activity of the ASC pyroptosome. Methods Enzymol 442:251-270.

34. Man SM & Kanneganti TD (2016) Converging roles of caspases in inflammasome activation, cell death and innate immunity. Nature reviews. Immunology 16(1):7-21.

35. Liu L, et al. (2014) HMGB1-DNA complex-induced autophagy limits AIM2 inflammasome activation through RAGE. Biochem Biophys Res Commun 450(1):851-856.

36. Hoesch RE, et al. (2012) Acute lung injury in critical neurological illness. Critical care medicine 40(2):587-593.

37. Kalsotra A, Zhao J, Anakk S, Dash PK, & Strobel HW (2007) Brain trauma leads to enhanced lung inflammation and injury: evidence for role of P4504Fs in resolution. Journal of cerebral blood flow and metabolism : official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism 27(5):963-974.

38. Hay (2015) Blood-Brain Barrier Disruption Is an Early Event That May Persist for Many Years After Traumatic Brain Injury in Humans. J Neuropathol Exp Neurol 74(12):1147-1157.

Petição 870190068968, de 22/07/2019, pág. 57/96

55/58

39. Zygun DA, Kortbeek JB, Fick GH, Laupland KB, & Doig CJ (2005) Non-neurologic organ dysfunction in severe traumatic brain injury. Critical care medicine 33(3):654-660.

40. Peltz ED ME, Eckels PC, Damle SS, Tsuruta Y, Johnson JL, Sauaia A, Silliman CC, Banerjee A, Abraham E. (209) HMGB1 is markedly elevated within 6 hours of mechanical trauma in humans. Shock 32(1):17-22.

41. Chi W, et al. (2015) HMGB1 promotes the activation of NLRP3 and caspase-8 inflammasomes via NF~kappaB pathway in acute glaucoma. Journal of neuroinflammation 12:137.

42. Woodcock T & Morganti-Kossmann MC (2013) The role of markers of inflammation in traumatic brain injury. Frontiers in neurology 4:18.

43. Monsel A, Zhu YG, Gudapati V, Lim H, & Lee JW (2016) Mesenchymal stem cell derived secretome and extracellular vesicles for acute lung injury and other inflammatory lung diseases. Expert opinion on biological therapy 16(7):859-871.

44. Taylor DD & Gercel-Taylor C (2014) Exosome platform for diagnosis and monitoring of traumatic brain injury. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences 369(1652).

45. Guo H, Callaway JB, & Ting JP (2015) Inflammasomes: mechanism of action, role in disease, and therapeutics. Nature medicine 21(7):677-687.

46. Silverman WR, et al. (2009) The pannexin 1 channel activates the inflammasome in neurons and astrocytes. The Journal of biological chemistry 284(27): 18143-18151.

47. Tomura S, de Rivero Vaccari JP, Keane RW, Bramlett HM, & Dietrich WD (2012) Effects of therapeutic hypothermia on inflammasome signaling after traumatic brain injury. Journal of cerebral

Petição 870190068968, de 22/07/2019, pág. 58/96

56/58 blood flow and metabolism : official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism 32(10): 1939-1947.

48. Wiklander, O.P., Nordin, J.Z., O'Loughlin, A., Gustafsson, Y., Corso, G., Mager, I., Vader, P., Lee, Y., Sork, H., Seow, Y., Heldring, N., Alvarez-Erviti, L., Smith, C.I., Le Blanc, K., Macchiarini, P., Jungebluth, P., Wood, M.J. and Andaioussi, S.E. (2015). Extracellular vesicle in vivo biodistribution is determined by cell source, route of administration and targeting. J Extracell Vesicles 4, 26316.

49. de Rivero Vaccari, J.P., Lotocki, G., Marcillo, A.E., Dietrich, W.D. and Keane, R.W. (2008). A molecular platform in neurons regulates inflammation after spinal cord injury. J Neurosci 28, 3404-3414.

50. Assis-Nascimento, P., Umland, O., Cepero, M.L. and Liebl, D.J. (2016). A flow cytometric approach to analyzing mature and progenitor endothelial cells following traumatic brain injury. J Neurosci Methods 263, 57-67.

Exemplo 2: Papel da sinalização de inflamassoma mediada por EV na ALT após a TBI em pacientes humanos [00100] Como um acompanhamento para os experimentos em camundongos no Exemplo 1, o papel da EV isolada de pacientes com TBI humanos sobre a sinalização de inflamassoma nas células endoteliais pulmonares humanas foi examinado.

[00101] Em um primeiro experimento, as EV derivadas de soro foram isoladas a partir da TBI e pacientes de controle utilizando kit Total Exosome Isolation (Thermofisher). Células endoteliais microvasculares humanas pulmonares (HMVEC-Lonza) foram cultivadas e colocadas em placa de 12 reservatórios. Após a confluência ter sido alcançada, as EV isoladas de TBI e de pacientes de controle foram distribuídas (1,94 x 108 partículas/ml) nas células durante um período de incubação de 4 horas. Após a incubação, as células foram colhidas com 200 μΙ de tampão de lise e os Usados de células foram utilizados para aná

Petição 870190068968, de 22/07/2019, pág. 59/96

57/58 lise de Western Blot, [00102] Em um segundo experimento, as EV derivadas de soro foram isoladas da TBI e dos pacientes de controle utilizando kit Total Exosome Isolation (Thermofisher). Células endotelials microvasculares humanas pulmonares (HMVEC-Lonza) foram cultivadas e colocadas em placa em uma placa de 96 reservatórios. Após a confluência ter sido alcançada, as EV Isoladas da TBI e dos pacientes de controle foram liberadas (1,94 x 108 partículas/ml) nas células durante um período de incubação de 3 horas e depois 1 hora adicional com caspase-1 FAM FLICA (Immunohistochemistry Technologies) com uma relação de volume para volume de 1:30. Após a incubação, o melo foi removido e as células foram lavadas 3 vezes com tampão de lavagem por apoptose (immunohistochemistry Technologies). As células foram então co-coloridas com Hoechst para coloração nuclear e iodeto de propídio para a morte celular. Imagens foram tiradas utilizando um microscópio EVOS e depois as células foram lidas sob uma leitora de placa fluorescente em um comprimento de onda de excitação de 492 nm e um comprimento de onda de emissão de 520 nm.

Resultados [00103] Como mostrado nas FIGURAS 10A a 10F, a liberação de EV derivada do soro de pacientes com TBI aumentou a expressão de proteína de inflamassoma nas células endoteliais pulmonares. As FIGURAS 10A a 10B mostraram que caspase 1, ASC, Al M2 e HMGB1 foram elevados em PMVEC incubada com TBI-E V durante 4 horas em comparação com PMVEC Incubada com controle-EV durante 4 horas. Os resultados de imunoensaio mostraram um aumento significativo na expressão de IL-1 beta utilizando o ensaio Elia simple plex (FIG. 10F).

[00104] Como mostrado nas FIGURAS 11A a 11C, a liberação de TBI-EV nas células endoteliais pulmonares aumentou a imunorreativl· dade de caspase 1 e morte celular.

Petição 870190068968, de 22/07/2019, pág. 60/96

58/58

Conclusão [00105] Estes estudos forneceram uma evidência adicional para um eixo de inflamassoma meural-resplratório em que a EV foi liberada na circulação após a TBI ativar a inflamassoma nas células alvo pulmonares contribuindo para a patogênese de ALI.

******* [00106] As várias modalidades descritas acima podem ser combinadas para fornecer outras modalidades. Todas as patentes U.S., publicações de pedido de patente U.S., pedido de patente U.S., patentes estrangeiras, pedidos de patente estrangeiros e publicações não patentes referidas neste relatório descritivo são aqui incorporadas por referência na sua totalidade. Os aspectos das modalidades podem ser modificados, se for necessário empregar os conceitos das várias patentes, pedidos e publicações para fornecer ainda outras modalidades. [00107] Estas e outras alterações podem ser feitas nas modalidades à luz da descrição detalhada acima. Em geral, nas reivindicações que se seguem, os termos utilizados não devem ser interpretados para limitar as reivindicações nas modalidades especificas divulgadas no relatório descritivo e nas reivindicações, mas devem ser interpretados como Incluindo todas as possíveis modalidades junto com o escopo completo dos equivalentes aos quais tais reivindicações são intituladas. Consequentemente, as reivindicações não são limitadas pela presente descrição.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método de tratamento de inflamação dos pulmões de um paciente com sua necessidade, o método caracterizado pelo fato de que compreende: a administração ao paciente de uma composição que compreende um agente que inibe a sinalização de inflamassoma, por meio do qual a inflamação nos pulmões do paciente é tratada.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a inflamação nos pulmões é provocada por uma condição selecionada a partir de uma lesão do sistema nervoso central (CNS), uma doença neurodegenerativa, doença autoimune, asma, doença pulmonar obstrutiva crônica, fibrose cística, doença pulmonar Intersticial e síndrome da angústia respiratória aguda.
3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a lesão do CNS é selecionada do grupo que consiste em lesões traumáticas do cérebro (TBI), acidente vascular cerebral e lesão de medula espinhal (SCI).
4. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a doença neurodegenerativa é selecionada do grupo que consiste em esclerose lateral amiotrófica (ALS), esclerose múltipla (MS) e doença de Parkinson (PD).
5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações acima, caracterizado pelo fato de que a administração da composição resulta na inibição da ativação do inflamassoma nas células pulmonares do paciente.
6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a administração da composição resulta em uma redução da caspase-1, proteína contendo o domínio de pirina de repetição rica em leucina de ligação a nucleotídeo 1 (NLRP1), proteína contendo o domínio de pirina de repetição rica em leucina de ligação a nucleotídeo 2 (NLRP2), proteína contendo o do

Petição 870190068968, de 22/07/2019, pág. 62/96

2/6 mínio de pirina de repetição rica em leucina de ligação a nucleotídeo 3 (NLRP3), proteína contendo o domínio CARD da família NLR 4 (NLRC4), caspase-11, inibidor ligado a X da proteína de apoptose (XIAP), panexina-1, proteína semelhante a Spec associada com apoptose contendo um Domínio de Recrutamento de Ativação da Caspase (ASC), interleucina-18 (IL-18), grupo de alta mobilidade caixa 1 (HMGB1) ou ausente em níveis de melanoma 2 (AIM2) nas células pulmonares do paciente em comparação com um controle, em que o controle é um paciente não tratado.
7. Método de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que as células pulmonares são células alveolares do tipo II.
8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a administração da composição resulta em uma redução na lesão pulmonar aguda (ALI) em comparação com um controle, em que o controle é um paciente não tratado.
9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a redução na ALI é evidenciada por uma redução na infiltração de neutrófilo no espaço alveolar e/ou intersticial, espessamento séptico alveolar reduzido ou ausente ou uma combinação destes.
10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações acima, caracterizado pelo fato de que o agente é um inibidor de absorção da vesícula extracelular (EV), um anticorpo que se liga a um componente de inflamassoma ou uma combinação destes.
11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o inibidor de absorção da EV é um composto ou um anticorpo, em que o anticorpo é selecionado da Tabela 1.
12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 11, caracterizado pelo fato de que o agente é um inibidor de

Petição 870190068968, de 22/07/2019, pág. 63/96

3/6 absorção da EV em combinação com um anticorpo que se liga a um componente de inflamassoma.
13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o inibidor de absorção da EV é uma heparina.
14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a heparina é Enoxaparin.
15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 14, caracterizado pelo fato de que o anticorpo que se liga a um componente de inflamassoma é um anticorpo que especificamente se liga a um componente de um inflamassoma AIM2, NLRP1, NLRP2, NLRP3 ou NLRP4 de mamífero.
16. Método de acordo com a reivindicação 10 ou 15, caracterizado pelo fato de que o componente de inflamassoma é caspase-1, ASC ou AIM2.
17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o componente de inflamassoma é ASC.
18. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga a um domínio de PYRIN-PAADDAPIN N-terminal (PYD), domínio de recrutamento da caspase Cterminal (CARD) ou um epítopo derivado do domínio de PYD ou CARD da proteína ASC.
19. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga a um aminoácido que possui pelo menos 85% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2.
20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 19, caracterizado pelo fato de que o anticorpo inibe a atividade de ASC nos pulmões do paciente.

Petição 870190068968, de 22/07/2019, pág. 64/96

4/6
21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações acima, caracterizado pelo fato de que a composição é formulada com um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.
22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações acima, caracterizado pelo fato de que a composição é administrada por via intracerebroventricular, intraperitoneal, intravenosa ou por inalação.
23. Método de tratamento de inflamação nos pulmões de um paciente que foi submetido a uma lesão do sistema nervoso central (CNS), o método caracterizado pelo fato de que compreende: administrar ao paciente uma composição que compreende um agente que inibe a sinalização de inflamassoma, por meio do qual a inflamação nos pulmões do paciente é tratada.
24. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a lesão do CNS é selecionada do grupo que consiste em lesões traumáticas do cérebro (TBI), acidente vascular cerebral e lesão da medula espinhal (SCI).
25. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 24, caracterizado pelo fato de que a administração da composição resulta na inibição da ativação de inflamassoma nas células pulmonares do paciente.
26. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 24, caracterizado pelo fato de que a administração da composição resulta em uma redução de caspase-1, NLRP1, NLRP2, NLRP3, NLRC4, caspase-11, XIAR, panexina-1, proteína semelhante a Spec associada com Apoptose contendo um Domínio de Recrutamento de Ativação da Caspase (ASC), interleucina-18 (IL-18), grupo de alta mobilidade caixa 1 (HMGB1) ou ausente em níveis de melanoma 2 (AIM2) nas células pulmonares do paciente em comparação com um controle, em que o controle é um paciente não tratado.

Petição 870190068968, de 22/07/2019, pág. 65/96

5/6
27. Método de acordo com a reivindicação 25 ou 26, caracterizado pelo fato de que as células pulmonares são células alveolares do tipo II.
28. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 27, caracterizado pelo fato de que a administração da composição resulta em uma redução na lesão pulmonar aguda (ALI) em comparação com um controle, em que o controle é um paciente não tratado.
29. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a redução na ALI é evidenciada por uma redução na infiltração de neutrófilo no espaço alveolar e/ou intersticial, espessamento séptico alveolar reduzido ou ausente ou uma combinação destes.
30. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 29, caracterizado pelo fato de que o agente é um inibidor de absorção da vesícula extracelular (EV), um anticorpo que se liga a um componente de infiamassoma ou uma combinação destes.
31. Método de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o inibidor de absorção da EV é um composto ou um anticorpo, em que o anticorpo é selecionado da Tabela 1.
32. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 31, caracterizado pelo fato de que o agente é um inibidor de absorção da EV em combinação com um anticorpo que se liga a um componente de infiamassoma.
33. Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o inibidor de absorção da EV é uma heparina.
34. Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que a heparina é Enoxaparin.
35. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 34, caracterizado pelo fato de que o anticorpo que se liga a

Petição 870190068968, de 22/07/2019, pág. 66/96

6/6 um componente de ínflamassoma é um anticorpo que especificamente se liga a um componente de um ínflamassoma AIM2, NLRP1, NLRP2, NLRP3 ou NLRP4 de mamífero.
36. Método de acordo oom a reivindicação 30 ou 35, caracterizado pelo fato de que o componente de ínflamassoma é caspase-1, ASC ou AIM2.
37. Método de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o componente de ínflamassoma é ASC.
38. Método de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga ao domínio de PYD, CARD ou um epítopo derivado do domínio de PYD ou CARD da proteína ASC.
39. Método de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga a um aminoácido que possui pelo menos 85% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2.
40. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 37 a 39, caracterizado pelo fato de que o anticorpo inibe a atividade de ASC nos pulmões do paciente.
41. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 40, caracterizado pelo fato de que a composição é formulada com um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.
42. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 41, caracterizado pelo fato de que a composição é administrada por via intracerebroventricular, intraperitoneal, intravenosa ou por inalação.