KR101948048B1 - 톡소포자충 ｇｒａ７ 항원 유래 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 결핵 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 톡소포자충 GRA7(Toxoplasma gondii dense granule antigen 7) 항원 유래 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 결핵 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 톡소포자충(Toxoplasma gondii) 유래 재조합 GRA7 단백질을 항원으로 이용할 경우, 결핵균(Mycobacterium tuberculosis, MTB) 감염에 대한 항균 반응을 현저하게 증가시킬 수 있으므로, 결핵의 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

톡소포자충 ＧＲＡ７ 항원 유래 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 결핵 예방 또는 치료용 약학 조성물{Pharmaceutical composition for preventing or treating tuberculosis comprising Toxoplasma gondii-GRA7 recombinant protein as an active ingredient}

본 발명은 톡소포자충 GRA7(Toxoplasma gondii dense granule antigen 7) 항원 유래 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 결핵 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

결핵(tuberculosis)은 마이코박테리움 튜버큘로시스(Mycobacerium tuberculosis)에 유발되며, WHO에서 정한 3대 감염질환 중 하나로, 높은 발병률과 사망률을 나타내고 있다. 전 세계적으로 약 6천만명 환자가 활동성 결핵에 감염되어 있으며, 매년 약 5천만에서 1억여명이 새로 결핵에 감염되는 것으로 추정되고 있고, 적어도 매년 900만명 이상의 새로운 결핵 환자가 발생하며, 연간 150만 명 이상이 결핵으로 사망한다고 알려졌다. 결핵 발병률(incidence rate)은 인구 10만명 당 146명, 결핵 사망률은 인구 10만명 당 49명으로 단일 감염병 중에서 가장 많은 사망 원인을 차지하고 있어, 세계적으로 심각한 보건 문제로 남아 있다.

최근 결핵 치료를 위한 약물 개발 전략으로 치료 기간을 단축시키고, 내성(resistance) 예방, 자가소화작용(autophagy) 촉진, 항균 펩타이드 생산 및 대식세포 효과 기작(macrophage effector mechanism) 뿐만 아니라, 폐 염증 및 기질 파괴(matrix destruction) 기전 억제에 의한 폐 손상 감소와 같은 결핵 치료 결과를 개선한 새로운 치료법이 개발되어지고 있다(Yang CS et.al., Autophagy, 10: 785-802, 2014; Wallis RS et.al., Nat Rev Immunol ., 15: 255-263, 2015; Wallis RS et.al., Lancet Infect Dis ., 16: e34-46, 2016). 감염(infection)의 박멸(eradication)을 가속화하고 현재 치료 요법과 관련된 문제를 극복하기 위해 새로운 용도의 약물, 생물학적 제제 및 세포 치료법을 비롯한 광범위한 후보 호스트 직접 요법(host-directed therapy, HDTs)이 개발되고 있다.

최근 연구들은 마이코박테리아(mycobacteria) 감염과 항균 방어에 대한 선천 면역 반응의 결과를 좌우하는 세포내 신호전달 경로(intracellular signaling pathway)를 밝혀냈다(Auricchio G et.al., Cell Microbiol ., 5: 913-920, 2003; Chaurasiya SK et.al., BMC Microbiol ., 9: 271, 2009; Garg SK et.al., J Infect Dis., 189: 2129-2138, 2004; Greco E et.al., Immunology, 129: 125-132, 2010; Jayaraman P et.al., J Immunol ., 190: 4196-4204, 2013; Verway M et.al., PLoS Pathog, 9: e1003407, 2013). 첫째로, 센서(sensor) NLRP3, 어댑터(adaptor) ASC 및 프로-카스파제-1(pro-caspase-1)로 구성된 세포내 단백질 복합체인 NLRP3 염증조절복합체(inflammasome complex)가 IL-1β 및 IL-18 과정(processing)을 조절한다(Jayaraman P et.al., J Immunol ., 190: 4196-4204, 2013; Verway M et.al., PLoS Pathog, 9: e1003407, 2013; Yang CS et.al., Nat Commun ., 6: 6115, 2015). IL-1β는 MTB 감염에 대한 TNFR 신호 조절(signalling)과 카스파제-3(caspase-3) 활성화를 조절함으로써 쥐 및 인간 대식세포에서 항균 면역(antimicrobial immunity)을 직접적으로 촉진한다(Jayaraman P et.al., J Immunol ., 190: 4196-4204, 2013). 1,25-다이하이드록시비타민 D3(1-25-Dihydroxyvitamin D; 1,25D)는 MTB를 제어하는 데 도움을 주는 원시(primary) 폐 상피 세포에서 항균 펩타이드 DEFB4/HBD2를 유도하는 MTB-감염 대식세포(MTB-infected macrophage)의 IL-1β 신호 전달을 증가시킨다(Verway M et.al., PLoS Pathog, 9: e1003407, 2013). 두 번째로, 숙주(host)의 인지질(phospholipid)은 항균성 선천 면역 반응의 활성화에 중요한 역할을 한다(Steinberg BE et. al., J Clin Invest., 118: 2002-2011, 2008). 2개의 동형질체(isoform; PLD1 및 PLD2)를 가진 PLD(Phospholipase D)는 대사작용으로 활성형 포스파티딘산(phosphatidic acid, PA)을 생성하기 위해 막 인지질인 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine)의 가수분해를 촉진시킨다(Greco E et.al., Proc Natl Acad Sci USA, 109: E1360-1368, 2012). PLD1은 ARF-, Ral- 및 Rho- 계열 GTPase 및 PKCα에 의해 활성화되는 반면, PLD2 활성은 지방산에 의해 증가된다(Kim JH et.al., Cell Immunol ., 298: 9-17, 2015). 흥미롭게도, MTB는 비병원성 마이코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis)와는 달리, 병원균의 세포내 생존과 관련된 과정인 식세포작용(phagocytosis) 동안 PLD 활성화를 억제한다(Auricchio G et.al., Cell Microbiol ., 5: 913-920, 2003). 자연적인 리소인지질(lysophospholipid)은 인간 대식세포와 제2형 폐포 상피 세포주 A549에서 시험관 내(in vitro) MTB에 의해 유도된 PLD-의존적 파고라이소솜(phagolysosome) 성숙 및 MTB의 PLD-의존적 세포내 사멸을 촉진한다(Garg SK et.al., J Infect Dis ., 189: 2129-2138, 2004; Greco E et.al., Immunology, 129: 125-132, 2010). 셋째로, 최근 연구들은 마이코박테리아의 생명 작용(biology)과 발병 과정(pathogenesis)에서 단백질 키나아제(protein kinase)의 역할에 대해 강조하였다. 단백질의 PKC 계열 구성원은 서로 다른 자극에 반응하여 활성화가 조절되는 메커니즘에 따라 세 그룹으로 분류된다(Chaurasiya SK et.al., BMC Microbiol ., 9: 271, 2009; Holm A et.al., Biochem Biophys Res Commun ., 302: 653-658, 2003). PKCα는 후기 엔도 솜(endosome) 및 리소좀(lysosome)과의 파고솜(phagosome)의 상호작용(interaction)을 촉진하여 파고라이소솜(phagolysosomes)의 생물발생(biogenesis) 및 식세포작용(phagocytosis)을 조절한다(Holm A et.al., Biochem Biophys Res Commun ., 302: 653-658, 2003). PKCα는 또한 인간 대식세포에서 MTB를 죽이는 데 중요한 역할을 한다(Chaurasiya SK et.al., BMC Microbiol ., 9: 271, 2009). 종합적으로, 이러한 감염 유도성 신호전달 경로는 이 극악한 병원균의 복제를 가능하게 하는 세포내 신호전달 경로를 표적으로 하는 결핵에 대한 새로운 치료 개발 양상의 가능성을 제시한다. 그러나 숙주의 선천 면역 반응과 그 조절 기작에 대한 MTB 감염 신호에 의존적인 HDT(host-directed therapy, HDT)의 역할은 아직 완전히 밝혀지지 않은 상태이다.

한편, 톡소포자충(Toxoplasma gondii)은 대식세포에 침투하여 중추신경계를 감염시키는 기회감염성 원충기생충이다. 톡소포자충은 고양이를 종숙주로 하여 고양이 분변에 나온 우씨스트(oocyst)를 통해 사람을 비롯한 각종 온혈 동물에 감염되며, 감염된 동물의 조직에 씨스트(cyst)로 존재하다가 사람이 섭식할 때 감염된다. 또한, 산모가 톡소포자충에 감염된 경우 이의 영양형(trophozoite)이 태반을 거쳐 태아에게 감염된다. 선천성 감염의 경우 초기 태아는 유사산이 일어나며, 중후기 태아의 경우에는 정상적 분만이 이루어지더라도 이후 시력손상, 수두증, 정신박약 등의 증상이 나타난다. 후천적 감염의 경우 대부분의 개체에서 무증상이지만, 면역성이 손상된 환자, 예컨대 HIV 감염에 따른 AIDS 환자 또는 의학적 처치에 의하여 면역부전이 일어난 환자에서는 망막맥락막, 뇌수막염 등의 심각한 증상이 나타난다.

본 발명자들은 이러한 심각한 증상을 유발하는 톡소포자충으로부터 유래된 항원 단백질인 GRA7(Toxoplasma gondii dense granule antigen 7)이 MyD88을 통해 TRAF6와 상호작용하고, 대식세포(macrophage)에서 선천 면역 반응(innate immune response)이 일어나게 하며, 체내(in vivo)에서 톡소포자충 감염에 대해 효과적인 방어를 할 수 있게 해주는 것으로 보고한 바 있다(Yang CS et.al., Infect Immun ., 84: 339-350, 2016).

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 결핵을 보다 효과적으로 치료할 수 있는 치료제를 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 결핵에 대한 새로운 치료 개발 양상으로서 톡소포자충 유래 GRA7에 의해 유도된 ASC, PLD1 및 PKCα의 신호전달 경로의 세포내 조절 네트워크를 규명하고, 체외(in vitro) 및 체내(in vivo) 상에서 MTB에 대한 항균성 방어작용에 있어서, PKCα에 의해 매개된 GRA7의 인산화(phosphorylation)가 GRA7과 ASC 또는 PLD1 사이의 상호 작용에 필수적임을 밝히고, 세포 내 감염된 결핵균(Mycobacterium tuberculosis, MTB)이 톡소포자충 유래 GRA7 항원 단백질에 의해 생존률이 현저하게 감소함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

Yang CS et.al., Autophagy, 10: 785-802, 2014 Wallis RS et.al., Nat Rev Immunol., 15: 255-263, 2015 Wallis RS et.al., Lancet Infect Dis., 16: e34-46, 2016 Auricchio G et.al., Cell Microbiol., 5: 913-920, 2003 Chaurasiya SK et.al., BMC Microbiol., 9: 271, 2009 Garg SK et.al., J Infect Dis., 189: 2129-2138, 2004 Greco E et.al., Immunology, 129: 125-132, 2010 Jayaraman P et.al., J Immunol., 190: 4196-4204, 2013 Verway M et.al., PLoS Pathog, 9: e1003407, 2013 Yang CS et.al., Nat Commun., 6: 6115, 2015 Steinberg BE et.al., J Clin Invest., 118: 2002-2011, 2008 Greco E et.al., Proc Natl Acad Sci USA, 109: E1360-1368, 2012 Kim JH et.al., Cell Immunol., 298: 9-17, 2015 Holm A et.al., Biochem Biophys Res Commun., 302: 653-658, 2003 Yang CS et.al., Infect Immun., 84: 339-350, 2016

본 발명의 목적은 톡소포자충(Toxoplasma gondii) 유래의 재조합 GRA7 단백질(recombinant dense granule antigen 7 protein, rGRA7 protein)을 유효성분으로 포함하는, 결핵 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 약학적 조성물을 이용하여 결핵을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 톡소포자충(Toxoplasma gondii) 유래의 재조합 GRA7 단백질(recombinant dense granule antigen 7 protein, rGRA7 protein)을 이용한 항결핵제 스크리닝 방법을 제공하기 위한 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 톡소포자충 GRA7(Toxoplasma gondii dense granule antigen 7) 항원 유래 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물, 상기 약학적 조성물의 결핵 예방 또는 치료용도, 및 상기 약학적 조성물을 이용하여 결핵을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.

하나의 양태로서, 본 발명은 하기 [식 1]의 아미노산 서열을 포함하는 15 내지 236개의 아미노산 길이로 이루어진 재조합 GRA7 단백질(recombinant dense granule antigen 7 protein, rGRA7 protein) 및/또는 하기 [식 2]의 아미노산 서열을 포함하는 15 내지 236개의 아미노산 길이로 이루어진 재조합 GRA7 단백질(recombinant dense granule antigen 7 protein, rGRA7 protein)을 유효성분으로 포함하는, 결핵 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

[식 1] PVDX₁LRPTNAGVDSK

[식 2] TDRKVVPRKSEGKRX₂

상기 [식 1]에서 X₁= S(serin), D(aspartic acid) 또는 E(glutamic acid)이며, 상기 [식 2]에서 X₂= S(serin), D(aspartic acid) 또는 E(glutamic acid)이다. 단, X₁ 또는 X₂가 S인 경우, S는 인산화되어 있다.

본 발명에서 용어 "GRA7(dense granule antigen 7; GenBank accession no. DQ459443.2)"이란, 톡소포자충(Toxoplasma gondii) 유래 항원 단백질로, 236개의 아미노산 서열로 구성되어 있다. GRA7은 MyD88을 통해 TRAF6와 상호작용하고, 대식세포(macrophage)에서 선천 면역 반응(innate immune response)이 일어나게 하며, 체내(in vivo)에서 톡소포자충 감염에 대해 효과적인 방어를 할 수 있게 해주는 것으로 보고된 바 있다(Yang CS et.al., Infect Immun., 84: 339-350, 2016).

상기 톡소포자충은 대식세포에 침투하여 중추신경계를 감염시키는 기회감염성 원충기생충이며, 고양이를 종숙주로 하여 고양이 분변에 나온 우씨스트(oocyst)를 통해 사람을 비롯한 각종 온혈 동물에 감염된다. 감염된 동물의 조직에 씨스트(cyst)로 존재하다가 사람이 섭식할 때 감염되며, 산모가 톡소포자충에 감염된 경우 이의 영양형(trophozoite)이 태반을 거쳐 태아에게 감염된다. 선천성 감염의 경우 초기 태아는 유사산이 일어나며, 중후기 태아의 경우에는 정상적 분만이 이루어지더라도 이후 시력손상, 수두증, 정신박약 등의 증상이 나타난다. 후천적 감염의 경우 대부분의 개체에서 무증상이지만, 면역성이 손상된 환자, 예컨대 HIV 감염에 따른 AIDS 환자 또는 의학적 처치에 의하여 면역부전이 일어난 환자에서는 망막맥락막, 뇌수막염 등의 심각한 증상이 나타난다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 [식 1]에서 X₁은 S(serin), D(aspartic acid) 또는 E(glutamic acid)일 수 있으며, 또한 D(aspartic acid) 또는 E(glutamic acid)일 수 있으며, 또한 D(aspartic acid)일 수 있다. 단, X₁이 S(serin)인 경우, PKC-α 매개에 의해 인산화된 형태일 수 있다.

상기 [식 1]에서 X₁은 톡소포자충 GRA7(Toxoplasma gondii dense granule antigen 7) 항원 유래 단백질의 아미노산 서열 중 GRA7-Ⅰ 도메인 내의 52번째 S(serin) 위치로서, 특정 인산화 부위(site)일 수 있다. 상기 S52를 포스포미메틱 잔기(phosphomimetic residue)인 아스파르트산(aspartic acid. D) 또는 글루탐산(glutamic acid, E)으로 단일 치환한 S52D 또는 S52E 돌연변이체(mutant)는 인산화된 단백질을 모방하여 상기 단백질을 활성화 시킬 수 있다. 인산화되어 활성화된 상기 GRA7 항원 유래 단백질은 선천면역(innate immunity)과 관련되어 있는 분자(molecule)인 ASC와 LPD1과 상호작용하여 항균성 방어(antimicrobial defense)에 기여할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 [식 2]에서 X₂는 S(serin), D(aspartic acid) 또는 E(glutamic acid)일 수 있으며, 또한 D(aspartic acid) 또는 E(glutamic acid)일 수 있으며, 또한 D(aspartic acid)일 수 있다. 단, X₂가 S(serin)인 경우, PKC-α 매개에 의해 인산화된 형태일 수 있다.

상기 [식 2]에서 X₂는 톡소포자충 GRA7(Toxoplasma gondii dense granule antigen 7) 항원 유래 단백질의 아미노산 서열 중 GRA7-Ⅲ 도메인 내의 135번째 S(serin) 위치로서, 특정 인산화 부위(site)일 수 있다. 상기 S135를 포스포미메틱 잔기(phosphomimetic residue)인 아스파르트산(aspartic acid. D) 또는 글루탐산(glutamic acid, E)으로 단일 치환한 S135D 또는 S135E 돌연변이체(mutant)는 인산화된 단백질을 모방하여 상기 단백질을 활성화 시킬 수 있다. 인산화되어 활성화된 상기 GRA7 항원 유래 단백질은 선천면역(innate immunity)과 관련되어 있는 분자(molecule)인 ASC와 LPD1과 상호작용하여 항균성 방어(antimicrobial defense)에 기여할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, PKC-α 매개에 의해 인산화(phosphorylation) 된 GRA7 단백질은 항균성 방어(antimicrobial defense)에 기여하는 ASC(Apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain) 또는 PLD1(Phospholipase D1)과의 상호작용이 필수적임을 확인하였다(도 1 내지 도 10).

본 발명에 있어서, 상기 [식 1]의 아미노산 서열을 포함하는 15 내지 236개의 아미노산 길이로 이루어진 재조합 GRA7 단백질은 서열번호 1, 서열번호 3 및 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있다.

또한, 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 상기 재조합 GRA7 단백질은 서열번호 1, 서열번호 3 또는 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 단백질일 수 있으며, 보다 바람직하게는 서열번호 3 또는 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 단백질일 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.

또한, 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 상기 재조합 GRA7 단백질은 15 내지 236개의 아미노산 길이로 이루어진 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 15개 내지 55개의 아미노산 길이로 이루어진 것일 수 있으며, 가장 바람직하게는 15개의 아미노산 길이로 이루어진 것일 수 있다.

또한, 상기 단백질의 변형체(mutant)가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 상기 단백질의 변형체란 GRA7 단백질의 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 단편에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다 (H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979).

본 발명에 있어서, 상기 [식 2]의 아미노산 서열을 포함하는 15 내지 236개의 아미노산 길이로 이루어진 재조합 GRA7 단백질은 서열번호 1, 서열번호 5 및 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있다.

또한, 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 상기 재조합 GRA7 단백질은 서열번호 1, 서열번호 5 또는 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어진 단백질일 수 있으며, 보다 바람직하게는 서열번호 5 또는 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어진 단백질일 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.

또한, 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 상기 재조합 GRA7 단백질은 15 내지 236개의 아미노산 길이로 이루어진 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 15개 내지 31개의 아미노산 길이로 이루어진 것일 수 있으며, 가장 바람직하게는 15개의 아미노산 길이로 이루어진 것일 수 있다.

또한, 상기 단백질의 변형체(mutant)가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 상기 단백질의 변형체란 GRA7 단백질의 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 단편에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다 (H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979).

본 발명의 GRA7 단백질은 톡소포자충으로부터 유래한 것으로서, DNA 서열을 기초로 하여 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다. 유전자 재조합 기술을 이용할 경우 단백질을 코딩하는 핵산을 적절한 발현 벡터에 삽입하고, 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체에서 목적으로 하는 단백질이 발현되도록 숙주 세포를 배양한 후 형질전환체로부터 목적으로 하는 단백질을 회수함으로써 수득될 수 있다.

본 발명에서 용어 "결핵(tuberculosis)"이란, 마이코박테리아(mycobacteria) 감염증 가운데 가장 많은 질병으로, 강한 병원성을 갖는 결핵균군(M.tuberculosis complex: TB complex)으로 구분되는 M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. microti의 4종이 원인균이며, 이 중 결핵균(M. tuberculosis)이 가장 흔하고 중요한 원인균으로 알려져 있다. 또한, 결핵은 사람은 물론, 개, 고양이, 토끼 등 작은 포유류 외에도 소 등의 가축 동물, 사슴 등의 야생 동물도 감염되는 인수 공통 감염병으로 알려져 있다.

본 발명의 결핵은 안결핵, 피부 결핵, 부신 결핵, 신장결핵, 부고환 결핵, 림프선 결핵, 후두 결핵, 중이 결핵, 장결핵, 다제내성 결핵, 폐결핵, 담결핵, 골결핵, 인후결핵, 임파선 결핵, 폐허증, 유방 결핵 또는 척추 결핵을 포함하며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어 "예방"이란, 본 발명의 약학적 조성물의 투여로 결핵의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"란, 본 발명의 약학적 조성물의 투여로 인해 이미 유발된 결핵의 증세가 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 톡소포자충(Toxoplasma gondii)으로부터 GRA7 유전자를 수득하고, 이를 벡터에 삽입하여 발현벡터를 수득한 다음, 이를 대장균에 도입하여 GRA7을 생산하는 형질전환체를 수득하였으며, 상기 형질전환체를 배양하여 재조합 GRA7 단백질을 대량생산하고 정제하였다. 또한, 상기 정제된 재조합 GRA7 단백질을 대상으로 면역 블롯(immunoblotting, IB) 분석을 수행한 결과, 상기 재조합 GRA7 단백질이 PKC-α 매개에 의해 인산화되며, 인산화된 GRA7 단백질은 항균성 방어(antimicrobial defense)에 기여하는 ASC 또는 PLD1과의 상호작용함을 확인하였다(도 1 내지 도 10). 상기 재조합 GRA7 단백질이 결핵균(Mycobacterium tuberculosis, MTB)의 감염으로 인한 결핵(tuberculosis)을 예방 또는 치료할 수 있는 약학적 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있는지를 확인하기 위하여, 상기 재조합 GRA7 단백질을 PKCα^+/+ 마우스로부터 분리한 DMEM(Bone-marrow-derived macrophage)에 처리하고 결핵균 감염에 대한 항균 활성(antimicrobial activity)을 확인하였다. 그 결과, 처리량 의존적으로 재조합 GRA7 단백질이 결핵균에 대한 항균 반응을 현저하게 증가시킴을 확인하였다(도 18 및 도 26). 또한, MTB에 감염된 마우스에 상기 재조합 GRA7 단백질을 투여하고 결핵균 감염에 대한 항균 활성을 확인한 결과, 마우스의 폐(lung), 간(liver) 및 비장(spleen)에서의 세균 적재(bacillary load)가 현저하게 감소되었으며, 병소(foci)의 크기와 수에 있어 폐 육아종 병변(lung granulomatous lesion) 형성이 감소된 것을 확인하였다(도 27 및 도 28).

따라서, 본 발명에서 제공하는 재조합 GRA7 단백질은 결핵의 예방 또는 치료 효과를 갖는 약학적 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

본 발명의 재조합 GRA7 단백질을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 결핵에 대한 면역성을 유도할 수 있는데, 상기 재조합 GRA7 단백질은 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 적절하게 제제화될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구 투여시에는 결합제, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 및 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 주사제는 생리식염액 및 링겔액 등의 수성용제, 식물유, 고급 지방산 에스텔(예, 올레인산에칠 등) 및 알코올류(예, 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜, 글리세린 등) 등의 비수성 용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제 및 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있다. 분사제의 경우에는 적합한 분사제, 예컨대, 압축공기, 질소, 이산화탄소, 또는 탄화수소 기반 낮은 끓는점 용매 등을 사용하여 가압팩 또는 분무기로부터 에어로졸 스프레이 제시체의 형태로 편리하게 전달될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릴시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다.

상기 약학적 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다.

본 발명의 용어 "투여"란, 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 인체 또는 수의용으로 제형화되어 다양한 경로로 투여된다. 본 발명의 재조합 GRA7 단백질은 비경구 경로, 예컨대 혈관내, 정맥내, 동맥내, 근육내 또는 피하 등의 경로로 투여될 수 있고, 경구, 비강, 직장, 경피 또는 에어로졸을 통한 흡입 경로로 투여될 수도 있으며, 볼루스(bolus)로 투여하거나 또는 서서히 주입할 수도 있으나, 바람직하게는 근육내 또는 피하 주사로 투여되는 것이 바람직하다.

본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명의 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란, 결핵균에 대한 항균 효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용이나 심각한 또는 과도한 면역반응을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 치료될 장애, 장애의 중증도, 특정 화합물의 활성, 투여 경로, 재조합 GRA7 단백질의 제거 속도, 치료 지속 기간, 재조합 GRA7 단백질과 조합되거나 또는 동시에 사용되는 약물, 대상체의 연령, 체중, 성별, 식습관, 일반적인 건강 상태, 및 의약 업계 및 의학 분야에 공지된 인자를 비롯한 다양한 인자들에 따라 달라질 것이다. "치료상 유효량" 결정시 고려되는 다양한 일반적인 사항들은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [Gilman et al., eds., Goodman And Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th ed., Pergamon Press, 1990] 및 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990]에 기재되어 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

상기 종래의 치료제는 결핵 치료를 위한 항마이코박테리아제(antimycobacterial agent)로, 이에 제한되지는 않으나, 이소니아지드(isoniazid), 리팜피신(rifampicin), 에탐부톨(ethambutol), 피라지나마이드(pyrazinamide), 스트렙토마이신(streptomycin), 아미카신(amikacin), 카프레오마이신(capreomycin), 카나마이신(kanamycin), 시프로플록사신(ciprofloxacin), 오플록사신(ofloxacin), 목시플록사신(moxifloxacin), 리파부틴(rifabutin), 프로티오나마이드(protionamide), 에티오나마이드(ethionamide), 사이클로세린(cycloserine), 티오아세타존(thioacetazone), 리네졸리드(linezolid), 클로파지마인(clofazimine), 아목실린/클라불라네이트(amoxicillin/clavulanate) 및 다이아미노다이페닐설폰의 유도체(derivative of dianomidiphenylsulphone)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 그 이상일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 GRA7 단백질과 함께 결핵의 예방 및 치료 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 것을 사용하는 것이 바람직하다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 결핵의 발병이 예상되거나 또는 상기 결핵이 발병된 인간을 제외한 개체에게 상기 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 결핵을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 용어 "개체"란, 결핵이 발병할 수 있는 살아있는 유기체를 의미하는데, 바람직하게는 결핵의 증상이 나타날 수 있는 고등 척추동물이 될 수 있고, 보다 바람직하게는 결핵이 발병될 수 있는 소, 토끼, 고양이, 개 등의 가축 및 이로부터 감염될 수 있는 사람이 될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물을 상기 개체에 투여하면, 결핵을 유발시키는 균주에 대하여 개체의 면역성을 증진시켜서, 결핵을 예방 또는 치료하는 효과를 나타낼 수 있다. 이러한 약학적 조성물의 투여 대상은 일차적으로는 소, 토끼, 고양이, 개 등의 가축이 될 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 상기 가축에 의하여 결핵이 전염될 수 있는 인간의 예방 또는 치료에도 사용될 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 후보물질과 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 GRA7 단백질을 접촉시키는 단계; 상기 재조합 GRA7 단백질의 S52 및/또는 S135 위치에서의 인산화 여부를 조사하는 단계; 및 상기 후보물질이 인산화를 촉진하는지를 판단하는 단계;를 포함하는 항결핵제의 스크리닝 방법을 제공한다.

상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 GRA7 단백질의 S52 및/또는 S135 위치에서의 인산화 여부에 따라 상기 단백질을 활성화 시킬 수 있고, 상기 단백질은 선천면역(innate immunity)과 관련된 ASC와 PLD1과 상호작용하므로 감염성 질환인 결핵을 억제하는 항결핵제로 판단할 수 있다.

상기 재조합 GRA7 단백질의 S52 및/또는 S137에서의 인산화 여부는 GRA7의 S52 및 S135의 인산기를 특이적으로 인식하는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체를 사용하여 판단할 수 있으며, 상기 항체는 당업계에 통상적인 항체 제작 방법을 통해 제작하여 사용할 수 있다.

상기 모노클로날 항체에 마커가 표지된 2차 항체를 처리하거나 상기 모노클로날 항체에 직접 마커를 컨쥬게이션시키면 마커에 의해 쉽게 GRA7의 S52 및 S135의 인산기 존재 여부를 조사할 수 있게 된다. 이러한 마커로는 방사선 동위원소, 발광 물질, 발색 반응 효소 등을 이용할 수 있을 것이다. 예를 들어, GFP, YFP, RFP, BFP 등과 같은 형광 단백질을 마커로 사용하여 표지하는 경우 다양한 형광측정법을 통해 상기 모노클로날 항체의 양을 측정함으로써 GRA7의 S52 및 S135에서의 인산화 여부를 판단할 수 있다. 다르게는, GRA7의 S52 및 S135의 인산기를 특이적으로 인식하는 모노클로날 항체를 GRA7에 처리하고 ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent assay) 방법을 사용하여 발색반응시킴으로써 정량분석하여 수행할 수 있다. 이 경우 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase, AP) 또는 호올스래디쉬 퍼록시다제(horseradish peroxidase, HRP) 등의 효소가 컨쥬게이션된 2차 항체 및 이들의 기질을 사용하여 발색반응시킴으로써 정량분석하거나, 아니면 직접 GRA7의 S52 및 S135의 인산기를 특이적으로 인식하는 모노클로날 항체에 AP 또는 HRP 효소 등이 컨쥬게이션된 것을 사용하여 정량분석할 수도 있다.

마찬가지의 원리에 의해 본 발명은 후보물질을 세포 또는 인간을 제외한 동물에 처리하고, GRA7의 S52 및 S135 위치에서의 인산화 여부를 조사하고, 상기 후보물질이 인산화를 저해하는지 또는 촉진하는지를 판단하는 것을 포함하는 항결핵제의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 스크리닝 방법에서, 후보물질은 통상적인 선정방식에 따라 항결핵제로서의 가능성을 지닌 것으로 추정되거나 또는 무작위적으로 선정된 개별적인 핵산, 단백질, 기타 추출물 또는 천연물, 화합물 등이 될 수 있다.

본 발명의 톡소포자충(Toxoplasma gondii) 유래 재조합 GRA7 단백질을 항원으로 이용할 경우, 결핵균(Mycobacterium tuberculosis, MTB) 감염에 대한 항균 반응을 현저하게 증가시킬 수 있으므로, 결핵의 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따라 THP-1 세포의 용해물(lysate)과 His 표지된 재조합 GRA7 단백질(rGRA7 protein)의 공면역침강법(co-immunoprecipitation; co-IP)을 통해 수득한 GRA7 복합체(GRA7 complex)의 쿠마씨 블루(Coomassie blue) 염색 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 5 ㎍/㎖의 재조합 GRA7 단백질(rGRA7)을 THP-1 세포에 처리하여 일정 시간(0, 5, 15, 30, 60, 및 120분) 동안 자극한 후, 공면역침강법(co-immunoprecipitation; co-IP)을 수행하고, 내재적 단백질 PLD1, TRAF6, ASC, PLD2, NLRP3, NLRC4에 대한 면역 블롯(immunoblotting, IB) 분석 결과를 나타낸 도이다. 여기에서, 대조군으로 WCL(whole cell lysate)을 사용하였다.
도 3은 본 발명의 신호 시퀀스(signal sequence), N-말단 도메인(Ⅰ-Ⅳ), 막관통(transmembrane) 및 C-말단 도메인(Ⅴ)을 가지고 있는 야생형(wild type, WT) GRA7과 상기 구성을 일부만 가지고 있는 GRA7 변형체의 맵핑, 그리고 이의 ASC, PLD1 및 TRAF6과의 상호작용을 개략적으로 요약하여 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따라 HEK293T 세포에 GST가 표지된 GRA7(GST-GRA7) 또는 이의 절단된(truncated) 변형체(mutant)(GST-GRA7-Ⅰ-Ⅳ; GST-GRA7-Ⅰ; GST-GRA7-Ⅱ; GST-GRA7-Ⅲ; GST-GRA7-Ⅳ; GST-GRA7-Ⅴ) 및 Ⅴ5가 표지된 ASC(5-ASC) 융합체(fusion)를 도입하여 GST-pulldown assay를 수행하고, Ⅴ5에 대한 면역 블롯(immunoblotting, IB)을 수행한 결과를 나타낸 도이다. 여기에서, 분석 결과를 기반으로 도출된 ASC의 구조를 간략하게 모식화하여 상단에 나타내었다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따라 HEK293T 세포에 GST가 표지된 GRA7(GST-GRA7) 또는 이의 절단된(truncated) 변형체(mutant)(GST-GRA7-Ⅰ-Ⅳ; GST-GRA7-Ⅰ; GST-GRA7-Ⅱ; GST-GRA7-Ⅲ; GST-GRA7-Ⅳ; GST-GRA7-Ⅴ) 및 AU1이 표지된(tagged) PLD1(AU1-PLD1) 융합체(fusion)를 도입하여 GST-pulldown assay를 수행하고, AU1에 대한 면역 블롯(immunoblotting, IB)을 수행한 결과를 나타낸 도이다. 여기에서, 분석 결과를 기반으로 도출된 PLD1의 구조를 간략하게 모식화하여 상단에 나타내었다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따라 5 ㎍/㎖의 재조합 GRA7 단백질(rGRA7)을 THP-1 세포에 처리하여 일정 시간(0, 5, 15, 30, 60, 및 120분) 동안 자극한 후, 공면역침강법(co-immunoprecipitation; co-IP)을 수행하고, 내재적 단백질 PKCα, PKCβ1, PKCγ에 대한 면역 블롯(immunoblotting, IB) 분석 결과를 나타낸 도이다. 여기에서, 대조군으로 WCL(whole cell lysate)을 사용하였다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따라 (A) HEK293T 세포에 플래그-표지된(Flag-tagged) PKCα와 공발현(co-expression) 시킨 GRA7^WT, GRA7-I^WT, GRA7-I^S52A, GRA7-Ⅲ^WT, GRA7-Ⅲ^T121A 또는 GRA7-Ⅲ^S135A의 Phos-tag^ⓡ 겔 전기영동 결과를 나타낸 도이다. (B) HEK293T 세포에 플래그-표지된(Flag-tagged) PKCα, PKCδ 또는 PKCξ와 공발현(co-expression) 시킨 GST-GRA7^WT의 Phos-tag^ⓡ 겔 전기영동 결과를 나타낸 도이다. 여기에서, 대조군으로 WCL(whole cell lysate)을 사용하였으며, 탈인산가수분해효소로서, CIP(calf intestinal alkaline phosphatase)를 사용하였다.
도 8은 본 발명의 일실시예에 따라 정제된 재조합 PKCα(recombinant PKCα)를 사용하여, 체내(in vitro) 인산화 어세이(phosphorylation assay)와 전체 GRA7 시퀀스(sequence)를 포함하는 비편향 중복 펩티드 어레이(non-biased overlapping peptide array)를 수행하고 얻은, 인산화 신호를 나타내는 GRA7 유래 펩티드, ⁴⁹PVDSLRPTNAGVDSK⁶³ 및 ¹²¹TDRKVVPRKSEGKRS ¹³⁵의 광 유도 발광 값(photo-stimulated luminescence value)을 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명의 일실시예에 따라 (A) HEK293T 세포에 GST가 표지된 GRA7-Ⅰ(GST-GRA7-Ⅰ) 또는 점 돌연변이(point mutation) 형태의 이의 절단된(truncated) 변형체(mutant)(GST-GRA7-Ⅰ-S52A; S52D; S52E) 및 Ⅴ5가 표지된 ASC(Ⅴ5-ASC)를 도입하여 GST-pulldown assay를 수행하고, Ⅴ5에 대한 면역 블롯(immunoblotting, IB)을 수행한 결과를 나타낸 도이다. (B) HEK293T 세포에 GST가 표지된 GRA7(GST-GRA7) 또는 점 돌연변이(point mutation) 형태의 이의 절단된(truncated) 변형체(mutant)(GST-GRA7-Ⅰ-S52A; S52D; S52E) 및 AU1이 표지된(tagged) PLD1(AU1-PLD1)을 도입하여 GST-pulldown assay를 수행하고, AU1에 대한 면역 블롯(immunoblotting, IB)을 수행한 결과를 나타낸 도이다. 여기에서, 3개의 잠재적인 인산화 위치를 포함하고 있는 GRA7의 구조를 간략하게 모식화하여 상단에 나타내었다.
도 10은 본 발명의 일실시예에 따라 (A) 재조합 GRA7 단백질(rGRA7)을 PKCα^+/+ 또는 PKCα^-/- 마우스로부터 수득한 BMDM에 처리하여 30분 동안 자극한 후, 공면역침강법(co-immunoprecipitation; co-IP)을 수행하고, 내재적 단백질 ASC, PLD1, PKCα에 대한 면역 블롯(immunoblotting, IB) 분석 결과를 나타낸 도이다. 여기에서, 대조군으로 WCL(whole cell lysate)을 사용하였다. (B) 재조합 GRA7 단백질(rGRA7)을 PKCα에 특이적인 shRNA를 사용하여 넉다운(knock down) 시킨 THP-1 세포에 처리하여 30분 동안 자극한 후, 공면역침강법(co-immunoprecipitation; co-IP)을 수행하고, 내재적 단백질 ASC, PLD1, PKCα에 대한 면역 블롯(immunoblotting, IB) 분석 결과를 나타낸 도이다. 여기에서, PKCα 비특이적인 shRNA로 non-silencing(scrambled) shRNA(shNS)를 사용하였다.
도 11은 본 발명의 일실시예에 따라 정제된 His 표지된(His-tagged) GRA7-Ⅰ과 이의 점 돌연변이(point mutation) 형태의 변형체(mutant)의 쿠마씨 블루(Coomassie blue) 염색 결과(A)와, His에 대한 면역 블롯(immunoblotting, IB) 분석 결과(B)를 나타낸 도이다. 여기에서, 대조군으로 His 표지된 재조합 GRA7 단백질(rGRA7 protein)을 사용하였다.
도 12는 본 발명의 일실시예에 따라 (A) PKCα^+/+와 PKCα^-/- 마우스로부터 분리한 BMDM에 rGRA7-Ⅰ^WT 또는 이의 점 돌연변이(point mutation) 형태의 변형체(mutant) 단백질로 자극을 주고, 배양 상층액(supernatant)에 존재하는 사이토카인, IL-1β 및 IL-18의 분비량을 ELISA assay를 수행하여 측정한 결과를 나타낸 도이다. (B) ASC에 특이적인 shRNA를 도입한 BMDM에 rGRA7-Ⅰ^WT 또는 이의 점 돌연변이(point mutation) 형태의 변형체(mutant) 단백질을 처리하여 자극을 주고, 배양 상층액(supernatant)에 존재하는 사이토카인, IL-1β 및 IL-18의 분비량을 ELISA assay를 수행하여 측정한 결과를 나타낸 도이다. 여기에서, ASC 비특이적인 shRNA로 non-silencing(scrambled) shRNA(shNS)를 사용하였다.
도 13은 본 발명의 일실시예에 따라 rGRA7-Ⅰ^WT 또는 이의 점 돌연변이(point mutation) 형태의 변형체(mutant) 단백질을 일정 시간(0, 6, 18, 및 48시간) 동안 처리하여 자극을 준, PKCα^+/+와 PKCα^-/- 마우스로부터 분리한 BMDM의 배양 상층액(supernatant)에서 IL-1β p17, IL-18 p18 및 카스파제-1 p10(caspase-1 p10)에 대한 면역 블롯(immunoblotting, IB) 분석 결과를 나타낸 도이다. 여기에서, 대조군으로 WCL(whole cell lysate)을 사용하였다.
도 14는 본 발명의 일실시예에 따라 (A) PKCα^+/+와 PKCα^-/- 마우스로부터 분리한 BMDM에 rGRA7, rGRA7-Ⅰ^WT 또는 이의 점 돌연변이(point mutation) 형태의 변형체(mutant) 단백질로 자극을 주고, 면역 블롯(immunoblotting, IB)을 수행하여 BMDM 용해물(lysate)에서 ASC 올리고머화(oligomerization) 분석 결과를 나타낸 도이다. 여기에서, 대조군으로 WCL(whole cell lysate)을 사용하으며, UN은 아무것도 처리하지 않은 BMDM을, SN은 배양한 BMDM으로부터 수거한 상층액(supernatant)을 의미한다. (B) rGRA7, rGRA7-Ⅰ^WT 또는 이의 점 돌연변이(point mutation) 형태의 변형체(mutant) 단백질로 자극을 준, PKCα^+/+와 PKCα^-/- 마우스로부터 분리한 BMDM을 면역염색(immunostaining)하고, ASC 염증조절복합체(pyroptosome)의 스펙(speck) 형성을 촬영한 공초점 레이저 주사현미경 사진이다. (C) 상기 (B)의 공초점 레이저 주사현미경 사진으로부터 ASC 염증조절복합체를 포함하는 세포를 계수하고 그 비율을 그래프화하여 나타낸 도이다.
도 15는 본 발명의 일실시예에 따라 rGRA7-Ⅰ^WT 또는 이의 점 돌연변이(point mutation) 형태의 변형체(mutant) 단백질을 처리하여 자극을 준, PKCα^+/+와 PKCα^-/- 마우스로부터 분리한 BMDM을 이용하여 초원심세포분획법(subcellular fractionation)과 공면역침강법(co-immunoprecipitation; co-IP)을 수행하고, 내재적 단백질 ASC 및 PKCα에 대한 면역 블롯(immunoblotting, IB) 분석 결과를 나타낸 도이다. 여기에서, 대조군으로 WCL(whole cell lysate)을 사용하였다.
도 16은 본 발명의 일실시예에 따라 PKCα^+/+와 PKCα^-/- 마우스로부터 분리한 BMDM에 결핵균(Mycobacterium tuberculosis, MTB)을 감염시킨 후, rGRA7-Ⅰ^WT 또는 이의 점 돌연변이(point mutation) 형태의 변형체(mutant) 단백질을 처리하고, 이에 따른 BMDM의 배양 상층액(supernatant)에서 IL-1β p17, IL-18 p18 및 카스파제-1 p10(caspase-1 p10)에 대한 면역 블롯(immunoblotting, IB) 분석 결과를 나타낸 도이다. 여기에서, 대조군으로 WCL(whole cell lysate)을 사용하였다.
도 17은 본 발명의 일실시예에 따라 ASC에 특이적인 shRNA를 도입하고, 결핵균(MTB)을 감염시킨 BMDM에 rGRA7-Ⅰ^WT 단백질을 처리하여 자극을 주고, 상기 BMDM의 배양 상층액(supernatant)에서 IL-1β p17, IL-18 p18 및 카스파제-1 p10(caspase-1 p10)에 대한 면역 블롯(immunoblotting, IB) 분석 결과를 나타낸 도이다. 여기에서, 대조군으로 WCL(whole cell lysate)을 사용하였으며, ASC 비특이적인 shRNA로 non-silencing(scrambled) shRNA(shNS)를 사용하였다.
도 18은 본 발명의 일실시예에 따라 (A) PKCα^+/+와 PKCα^-/- 마우스로부터 분리한 BMDM에 결핵균(MTB)을 감염시킨 후, rGRA7, rGRA7-Ⅰ^WT 또는 이의 점 돌연변이(point mutation) 형태의 변형체(mutant) 단백질을 처리하여, 이에 따른 항균 활성 효과를 CFU assay를 수행하여 분석한 결과와, (B) ASC에 특이적인 shRNA를 도입하고, 결핵균(MTB)을 감염시킨 BMDM에 rGRA7, rGRA7-Ⅰ^WT 또는 이의 점 돌연변이(point mutation) 형태의 변형체(mutant) 단백질을 처리하여, 이에 따른 항균 활성 효과를 CFU assay를 수행하여 분석한 결과를 나타낸 도이다. 여기에서, 대조군으로 재조합 벡터(rVector)를 사용하였으며, ASC 비특이적인 shRNA로 non-silencing(scrambled) shRNA(shNS)를 사용하였다.
도 19는 본 발명의 일실시예에 따라 rGRA7, rGRA7-Ⅰ^WT 또는 rGRA7-Ⅲ^WT 단백질 처리에 따른, 배양 기간별 결핵균(MTB)의 성장 정도를 OD₆₀₀ 값으로 나타낸 도이다. 여기에서, 대조군으로 재조합 벡터(rVector)를 사용하였다.
도 20은 본 발명의 일실시예에 따라 정제된 His 표지된(His-tagged) GRA7-Ⅲ과 이의 점 돌연변이(point mutation) 형태의 변형체(mutant)의 쿠마씨 블루(Coomassie blue) 염색 결과(A)와, His에 대한 면역 블롯(immunoblotting, IB) 분석 결과(B)를 나타낸 도이다. 여기에서, 대조군으로 His 표지된 재조합 GRA7 단백질(rGRA7 protein)을 사용하였다.
도 21은 본 발명의 일실시예에 따라 5 ㎍/㎖의 rGRA7-Ⅲ^WT 또는 이의 점 돌연변이(point mutation) 형태의 변형체(mutant) 단백질을 PKCα^+/+와 PKCα^-/- 마우스로부터 분리한 BMDM에 일정 시간(0, 15, 30, 및 60분) 동안 자극한 후, 인산화된 형태(phosphorylated form)이거나 전체 형태(total form)의 PLD1 및 PLD2에 대한 면역 블롯(immunoblotting, IB) 분석 결과를 나타낸 도이다. 여기에서, 대조군(loading control)으로 액틴(actin)을 사용하였다.
도 22는 본 발명의 일실시예에 따라 rGRA7, rGRA7-Ⅲ^WT 또는 이의 점 돌연변이(point mutation) 형태의 변형체(mutant) 단백질을 (A) PKCα^+/+와 PKCα^-/- 마우스로부터 분리한 BMDM, 또는 (B) PLD1^+/+와 PLD1^-/- 마우스로부터 분리한 BMDM에 처리하고, 이에 따른 PLD 활성(phospholipase D activity) 정도를 PLD activity assay를 수행하여 측정한 결과를 나타낸 도이다. 여기에서, 대조군으로 재조합 벡터(rVector)를 사용하였다.
도 23은 본 발명의 일실시예에 따라 His 표지된(His-tagged) GRA7-Ⅲ^WT 단백질을 C57BL/6(정상 마우스)로부터 수득한 BMDM에 처리하여 30분 동안 자극한 후, His 및 PLD1에 대한 면역염색(immunostaining)을 수행하고, 이를 촬영한 형광 공초점 현미경(confocal fluorescence microscopy) 사진을 나타낸 도이다.
도 24는 본 발명의 일실시예에 따라 (A) PKCα^+/+와 PKCα^-/- 마우스로부터 분리한 BMDM, 또는 (B) PLD1^+/+와 PLD1^-/- 마우스로부터 분리한 BMDM에 각각 결핵균(MTB)을 감염시킨 후, rGRA7, rGRA7-Ⅲ^WT 또는 이의 점 돌연변이(point mutation) 형태의 변형체(mutant) 단백질을 처리하고, 이에 따른 결핵균(MTB)이 포함된 파고솜(phagosome) 분획물을 분리하여 파고솜 성숙 조절자인 Rab5, Rab7, LAMP1 및 LAMP2와, PLD1 및 PKCα에 대한 면역 블롯(immunoblotting, IB) 분석 결과를 나타낸 도이다. 여기에서, 대조군(loading control)으로 액틴(actin)을 사용하였다.
도 25는 본 발명의 일실시예에 따라 PKCα^+/+와 PKCα^-/- 마우스로부터 분리한 BMDM에 결핵균(MTB)을 감염시킨 후, His 표지된(His-tagged) 각각의 rGRA7, rGRA7-Ⅲ^WT 또는 이의 점 돌연변이(point mutation) 형태의 변형체(mutant) 단백질을 처리하고, 이에 따른 결핵균(MTB)이 포함된 파고솜(phagosome) 분획물을 분리하여 PLD1에 대한 면역침강법(immunoprecipitation; IP)을 수행하고, His 및 PLD1에 대한 면역 블롯(immunoblotting, IB) 분석 결과를 나타낸 도이다. 여기에서, 대조군(loading control)으로 액틴(actin)을 사용하였다.
도 26은 본 발명의 일실시예에 따라 (A) PKCα^+/+와 PKCα^-/- 마우스로부터 분리한 BMDM에 결핵균(MTB)을 감염시킨 후, rGRA7-Ⅲ^WT 또는 이의 점 돌연변이(point mutation) 형태의 변형체(mutant) 단백질을 처리하여, 이에 따른 항균 활성 효과를 CFU assay를 수행하여 분석한 결과와, (B) PLD1^+/+와 PLD1^-/- 마우스로부터 분리한 BMDM에 결핵균(MTB)을 감염시킨 후, rGRA7, rGRA7-Ⅲ^WT 또는 이의 점 돌연변이(point mutation) 형태의 변형체(mutant) 단백질을 처리하여, 이에 따른 항균 활성 효과를 CFU assay를 수행하여 분석한 결과를 나타낸 도이다. 여기에서, 대조군으로 재조합 벡터(rVector)를 사용하였다.
도 27은 본 발명의 일실시예에 따라 (A) 결핵균(MTB)에 감염된 PKCα^+/+와 PKCα^-/- 마우스에 rGRA7, 야생형(wild-type)의 GRA7-Ⅰ^WT 및 Ⅲ^WT(Ⅰ^WT + Ⅲ^WT), PKCα 비-인산화 변형체(non-phosphorylatable mutant)인 rGRA7-I^S52A 및 Ⅲ^S135A(I^S52A + Ⅲ^S135A) 또는 GRA7의 포스포미메틱(phosphomimetic) 변형체(mutant)인 Ⅰ^S52D 및 Ⅲ^S135D(Ⅰ^S52D + Ⅲ^S135D)를 처리하고, 이에 따른 폐(lung), 간(liver) 및 비장(spleen)에서의 세균 적재(bacillary load) 정도를 분석하여 나타낸 도이다. (B) 결핵균(MTB)에 감염된 PKCα^+/+와 PKCα^-/- 마우스에 rGRA7, 야생형(wild-type)의 GRA7-Ⅰ^WT 및 Ⅲ^WT(Ⅰ^WT + Ⅲ^WT), PKCα 비-인산화 변형체(non-phosphorylatable mutant)인 rGRA7-I^S52A 및 Ⅲ^S135A(I^S52A + Ⅲ^S135A) 또는 GRA7의 포스포미메틱(phosphomimetic) 변형체(mutant)인 Ⅰ^S52D 및 Ⅲ^S135D(Ⅰ^S52D + Ⅲ^S135D)를 처리하고, 이에 따른 폐(lung) 절편의 H&E(hematoxylin & eosin) 염색 결과를 나타낸 현미경 사진이다. (C) 상기 (B)의 H&E 염색 결과를 토대로, 조직병리 상의 지수(histopathology score)로서 폐 절편에서 관찰된 육아종 병소(granulomatous foci)의 수를 나타낸 도이다. 여기에서, 대조군으로 재조합 벡터(rVector)를 사용하였다.
도 28은 본 발명의 일실시예에 따라 결핵균(MTB)에 감염된 PLD1^+/+와 PLD1^-/- 마우스에 rGRA7, 야생형(wild-type)의 GRA7-Ⅲ^WT, PKCα 비-인산화 변형체(non-phosphorylatable mutant)인 rGRA7-Ⅲ^S135A 또는 GRA7의 포스포미메틱(phosphomimetic) 변형체(mutant)인 rGRA7-Ⅲ^S135D를 처리하고, 이에 따른 폐(lung), 간(liver) 및 비장(spleen)에서의 세균 적재(bacillary load) 정도를 분석하여 나타낸 도이다. (B) 결핵균(MTB)에 감염된 PLD1^+/+와 PLD1^-/- 마우스에 rGRA7, 야생형(wild-type)의 GRA7-Ⅲ^WT, PKCα 비-인산화 변형체(non-phosphorylatable mutant)인 rGRA7-Ⅲ^S135A 또는 GRA7의 포스포미메틱(phosphomimetic) 변형체(mutant)인 rGRA7-Ⅲ^S135D를 처리하고, 이에 따른 폐(lung) 절편의 H&E(hematoxylin & eosin) 염색 결과를 토대로, 조직병리 상의 지수(histopathology score)로서 폐 절편에서 관찰된 육아종 병소(granulomatous foci)의 수를 나타낸 도이다. 여기에서, 대조군으로 재조합 벡터(rVector)를 사용하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 실험 재료 준비 및 실험 방법

실시예 1-1: 결핵균( M. tuberculosis ) 배양

결핵균(Mycobacterium tuberculosis) 균주 MTB H37Rv는 0.5% 글리세롤(glycerol), 0.5% 트윈-80(Tween-80; Sigma, P1754), 10% 올레산(oleic acid), 알부민(albumin), 덱스트로오스(dextrose), 카탈라아제(catalase, OADC; BD Biosciences, 212240)가 첨가된 Middlebrook 7H9(Difco, 271310) 배지를 이용하여 배양하였다. 한편, 세포에 결핵균을 감염(infection) 시킬 때, 실험에 사용한 결핵균과 세포의 비율(bacterium-to-cell ratio)은 10:1로 하였으며, LPS(lipopolysaccharide)의 적정 농도는 50 pg/㎖ 미만(< 50 pg/㎖)으로 처리하여 실험을 수행하였다. 모든 실험(assay)에서, 흡광도(absorbance)가 0.4인 미드 로그 페이즈(mid-log-phase)의 결핵균을 사용하였다. 배양하여 수득한 결핵균 균주는 1 ㎖씩 분주하여 -70℃에 보관하여 사용하였다.

실시예 1-2: 마우스(mouse) 및 세포 준비

야생형(wild-type)의 C57BL/6 마우스는 오리엔트 바이오(Orient Bio; 대한민국 경기도)에서 구입하여 사용하였다. PKCα 넉아웃(PKCα^-/-) 마우스(B6;129-Prkca^tm1Jmk/J, 009068)와 PLD1 넉아웃(PLD1^-/-) 마우스(B6.Cg-Pld1^{tm1 . 1Gbp}/J, 028665)는 Jackson Laboratory에서 구입하여 사용하였다. 모든 실험동물은 SPF(specific pathogen free; 특정 병원체 부재시설) 환경하에서 유지하였다. 또한, 모든 실험동물의 실험 절차는 한양대학교 실험동물센터(protocol 2014-0207)와 바이오리더 코퍼레이션(bioleader Corporation; 대한민국, 대전, protocol BLS-ABSL3-13-11)의 관리와 허가를 받아 진행되었으며, 모든 동물 실험은 한국 식품의약품안전관리본부 (KFDA; Korean Food and Drug Administration)의 가이드라인(guideline)을 따라 수행하였다.

한편, HEK293T(human embryonic kidney cell line) 세포(ATCC-11268; American Type Culture Collection)는 10% FBS(fetal bovine serum; Invitrogen), 소디움 피루베이트(sodium pyruvate), 비필수 아미노산(non-essential amino acid), 페니실린 G(penicillin G; 100 IU/㎖), 스트렙토마이신(streptomycin; 100 ㎍/㎖)이 포함된 DMEM 배지(Invitrogen)를 이용하여 배양하였다.

인간 단핵세포주(human monocytic cell line)인 THP-1 세포(ATCC TIB-202)는 10% FBS가 포함된 RPMI 1640-GlutaMAX^TM 배지를 사용하여 배양하였으며, 20nM의 PMA(Sigma Aldrich)를 24시간 동안 처리하여 대식세포 유사 세포(macrophage-like cells)로 분화를 유도하고 인산완충용액(PBS; phosphatebuffered saline)으로 3회 세척하였다.

일차 골수 유래 대식세포(primary bone marrow-derived macrophages; BMDMs)는 C57BL/6 마우스로부터 분리하였으며, M-CSF(Macrophage colony-stimulating factor; R&D Systems, 416-ML)가 포함된 DMEM 배지를 이용하여 3~5일 동안 배양하였다.

실시예 1-3: 체외( in vitro ) 및 체내( in vivo )에서의 결핵균( M. tuberculosis ) 감염(infection)

체외(in vitro) 실험을 위해서는, 세포에 결핵균(MTB)을 2~4 시간 동안 감염시켰으며, 이후, 세포 내로 들어가지 못한 결핵균을 제거하기 위해 인산완충용액(PBS; phosphatebuffered saline)으로 세포를 세척하였다. 상기 세척된 세포에 새로운 배지(fresh medium)를 넣어 주었으며, 사용하는 시점까지 37℃에서 배양하였다.

체내(in vivo) 실험을 위해서는, C57BL/6 마우스에 결핵균(MTB)을 마우스 당 1×10⁶ CFU로 정맥주사(intravenous injection, i.v.) 하였다. 3주(3 weeks) 후, 폐(lung), 비장(spleen) 및 간(liver)을 수득하기 위해 마우스를 희생시켰다. 결핵균을 감염시킨 마우스는 생물안정성(biosafety) 레벨 3(level 3)의 실험 시설에서 유지하였다.

실시예 1-4: 시약, 플라스미드 및 항체 준비

송아지 장 알카리성 포스파타제(calf intestinal alkaline phosphatase, CIP)(P4978)와 DMSO(Dimethyl sulfoxide)는 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)에서 구입하였다.

Flag-PKCα(Flag-Protein Kinase C α), Flag-PKCβ(Flag-Protein Kinase C β), Flag-PKCδ(Flag-Protein Kinase C δ) 및 Flag-PKCξ(Flag-Protein Kinase C δ) 플라스미드(plasmid)는 Dr. D. Zhou(Xiamen University, China)로부터 제공받아 사용하였다. 글루타티온 S-전달효소(GST; Glutathione S-transferase)가 표지된(tagged) GRA7(dense granule antigen 7)과 절단된(truncated) 변이 유전자(mutant gene)는 N-말단(N-terminal)의 GST 에피토프(GST epitope) 표지(tag)가 암호화(encoding)되는 pEBG 유도체(derivative)의 BamHⅠ과 NotⅠ 위치(site) 사이에 삽입, 복제(clone)하여 사용하였다. V5가 표지된(tagged) AC 또는 AU1-PLD1(Phospholipase D1)과 절단된(truncated) 변이 유전자(mutant gene)는 pcDNA3.0의 XbaⅠ과 BamHⅠ 위치에 삽입, 복제(clone)하여 사용하였다. 상기 모든 구성물(construct)들은 ABI PRISM 377 automatic DNA sequencer를 이용하여 시퀀싱(sequencing)하였으며, 오리지널(original) 시퀀스(sequence)와 100% 일치함을 확인하였다.

Phospho-(Thr147)-PLD1(3831), phospho-(Ser561)-PLD2(3834), PLD1(3832), PLD2(13904), PKCα(2056), PKCγ(43806) 및 NLRP4(NLR family pyrin domain containing 4; 12421)에 대한 특이 항체(specific antibody)는 Cell Signaling Technology사로부터 구입하였다. 액틴(Actin; I-19), ASC(Apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain; N-15-R), IL-18(H-173-Y), TRAF6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6; H-274), 카스파제-1 p10(caspasee-1 p10; M-20), Rab5(D-11), Rab7(H-50), LAMP1(Lysosomal-associated membrane protein 1; E-5), LAMP2(Lysosomal-associated membrane protein 2; H4B4), 튜불린(Tubulin; B-5-1-2), 칼넥신(Calnexin; H-70), FACL4(Fatty acid-CoA ligase 4; N-18), VDAC(B-6), His(His17), V5(C-9), Flag(D-8) 및 GST(B-14)에 대한 특이 항체는 Santa Cruz Biotechnology사로부터 구입하여 사용하였다. AU1(GTX23402)과 PKCβI(A10-F)는 각각 GenenTex사와 Antibodies-online Inc.사에서 구입하였다. IL-1β(AF-401-NA)와 NLRP3(AG-20B-0014)는 각각 R&D Systems과 Adipogen에서 구입하여 사용하였다.

실시예 1-5: 면역 블롯 분석 및 면역침강법

상기 실시예 1-2에서 준비한 THP-1, HEK293T, BMDM을 이용하여 웨스턴 면역 블롯팅(western immunoblotting, IB), 면역침강법(immunoprecipitation), 및 GST(Glutathione S-transferase) pulldown assay를 수행하여 분석을 진행하였다(Yang CS et.al., Infect Immun ., 84: 339-350, 2016; Yang CS et.al., Cell Host Microbe, 11: 264-276, 2012).

구체적으로, 웨스턴 블롯 분석을 위해 1차 항체(primary Ab)를 1/1,000로 희석하여 사용하였다. 면역침강법을 위해 세포를 수확하고 컴플리트 프로테아제 저해제 칵테일(complete protease inhibitor cocktail; Roche)이 추가된 NP-40 버퍼(buffer)를 이용하여 용해시켰다. 용해물(lysate)을 혼합하고, 로테이터(rotator)에서 18시간 동안 4℃에서 인큐베이션(incubation)하여 항체와 단백질 A-세파로오스(protein A-sepharose)로 침전시켰다. GST(Glutathione S-transferase) pulldown assay를 위해, 사전-세척된 용해물(pre-cleared lysate)은 글루타티온이 결합된 세파로오스 비드(glutathione-conjugated Sepharose bead; Amersham Biosciences) 슬러리 50%와 혼합하였으며, 결합 반응(binding reaction)은 4시간 동안 4℃에서 인큐베이션(incubation)하여 수행하였다. 이후, 웨스턴 블롯 분석을 위해, 샘플을 SDS 샘플 버퍼에 용해시키고, SDS-PAGE를 통해 분리하였다. 항체 결합은 화학 발광계(chemiluminescence; ECL:Millipore)를 사용하여 가시화하고, Vilber사의 화학 발광 분석기(Vilber chemiluminescence analyzer, Fusion SL 3;Vilber Lourmat)로 검출하였다.

실시예 1-6: 펩티드 스팟 어레이(peptide spot array)

펩티드 어레이는 SPOT 합성 방법을 사용하여, [γ-³²P]ATP와 칼슘(calcium) 존재 하에서 Intavis사의 유도체화된 셀룰로오스 막(derivatized cellulose membrane)에 펩티드 배열을 합성하였다(Ashpole NM et al., J Biol Chem ., 287: 8495-8506, 2012; Gaji RY et al., PLoS Pathog., 11: e1005268, 2015). 펩티드 스팟 인산화(phosphorylation)는 포스포르이미징(phosphorimaging)을 이용하여 정량화하였다.

구체적으로, 펩티드 멤브레인(peptide membrane)은 5% BSA(bovine serum albumin)가 포함된 결합 버퍼(binding buffer)를 이용하여 실온(room temperature, RT)에서 30분 동안 블로킹(blocking) 시켰다. 5 nM의 재조합 PKCα를 50mM HEPES(pH 7.4), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, 100 mM ATP, 1 mM CaCl₂, 6 μCi/㎖ [γ-³²P]ATP에 첨가하고 실온에서 15분 동안 인큐베이션(incubation) 하였다. 상기 멤브레인(membrane)은 100mM 인산나트륨(sodium phosphate, pH 7.0), 1M NaCl, 10 mM EDTA로 3회 세척하고, 포스포르이미징(phosphorimaging; Fuji phosphor imager)을 사용하여 가시화하였다. 각 펩티드의 인산화(phosphorylation)는 Multi Gauge version 3.0(Fujifilm)을 사용하여 검출하고 정량화하였다.

실시예 1-7: 재조합 GRA7 단백질 제조

재조합 GRA7 단백질(recombinant dense granule antigen 7 protein, rGRA7 protein)은 Yang CS et.al., Infect Immun., 84, 339-350 (2016)에 기재되어 있는 방법에 따라 수행하여 수득하였다. GRA7의 아미노산 잔기(amino acid residue) 26-80, 26-80^S52A, 26-80^S52D, 120-150^S135A 및 120-150^S135D은 Novagen사의 N-말단(N-terminal)이 6×His 표지(tag)된 pRSFDuet-1 벡터(vector)에 삽입, 복제(clone)하여 사용하였다. 이때, 상기 벡터 제조사인 Novagen사가 추천한 표준 프로토콜(standard protocol)에 따라 단백질 발현 숙주로서 E. coli BL-21(DE-3)pLysS를 사용하였으며, 상기 E. coli 균주에서 단백질 발현을 유도하고, 수집(harvest)하여 정제하여 사용하였다(Yang CS et.al., Infect Immun ., 84: 339-350, 2016; Alaganan A et.al., Proc Natl Acad Sci USA., 111: 1126-1131, 2014).

rGRA7 돌연변이 단백질은 투과성 셀룰로오스 멤브레인(permeable cellulose membrance)을 사용하여 투석하고, LAL 분석(Limulus amebocyte lysate assay; BioWhittaker)에 의해 LPS(lipopolysaccharide) 오염(contamination) 정도를 확인하였으며, 실험에 사용된 rGRA7 단백질에 LPS가 20 pg/㎖ 미만의 농도 수준으로 포함되어 있었다.

제조한 재조합 GRA7 단백질(recombinant dense granule antigen 7 protein, rGRA7 protein)을 정리하면 하기 표 1과 같다.

위치	특성	재조합 GRA7 단백질(rGRA7)	아미노산 서열	서열번호
1-236	wild type (X1: S52, X2: S135)	GRA7 (GenBank accession no. DQ459443.2)	MARHAIFSALCVLGLVAAALPQFATAATASDDELMSRIRNSDFFDGQAPVDX 1 LRPTNAGVDSKGTDDHLTTSMDKASVESQLPRREPLETEPDEQEEVHFRKRGVRSDAEVTDDNIYEEHTDRKVVPRKSEGKRX 2 FKDLLKKLALPAVGMGASYFAADRLVPELTEEQQRGDEPLTTGQNVGTVLGFAALAAAAAFLGMGLTRTYRHFSPRKNRSRQPALEQEVPESGEDGEDARQ	1
26-181	wild type	GRA7-Ⅰ-Ⅳ	AATASDDELMSRIRNSDFFDGQAPVDSLRPTNAGVDSKGTDDHLTTSMDKASVESQLPRREPLETEPDEQEEVHFRKRGVRSDAEVTDDNIYEEHTDRKVVPRKSEGKRSFKDLLKKLALPAVGMGASYFAADRLVPELTEEQQRGDEPLTTGQNV	2
26-80	wild type (X1: S52)	GRA7-Ⅰ (GRA7-ⅠWT)	AATASDDELMSRIRNSDFFDGQAPVDX 1 LRPTNAGVDSKGTDDHLTTSMDKASVES	3
80-120	wild type	GRA7-Ⅱ	SQLPRREPLETEPDEQEEVHFRKRGVRSDAEVTDDNIYEEH	4
120-150	wild type (X2: S135)	GRA7-Ⅲ (GRA7-ⅢWT)	HTDRKVVPRKSEGKRX 2 FKDLLKKLALPAVGM	5
150-181	wild type	GRA7-Ⅳ	MGASYFAADRLVPELTEEQQRGDEPLTTGQNV	6
201-236	wild type	GRA7-Ⅴ	LTRTYRHFSPRKNRSRQPALEQEVPESGEDGEDARQ	7
49-63	point mutation (S52A)	GRA7-ⅠS52A	PVD A LRPTNAGVDSK	8
49-63	point mutation (X1: S52D) : 포스포미메틱 (phosphomimetic) 변형체	GRA7-ⅠS52D	PVD X 1 LRPTNAGVDSK	9
49-63	point mutation (S52E)	GRA7-ⅠS52E	PVD E LRPTNAGVDSK	10
120-150	point mutation (T121A)	GRA7-ⅢT121A	H A DRKVVPRKSEGKRSFKDLLKKLALPAVGM	11
120-150	point mutation (T121D)	GRA7-ⅢT121D	H D DRKVVPRKSEGKRSFKDLLKKLALPAVGM	12
120-150	point mutation (T121E)	GRA7-ⅢT121E	HEDRKVVPRKSEGKRSFKDLLKKLALPAVGM	13
121-135	point mutation (S135A)	GRA7-ⅢS135A	TDRKVVPRKSEGKR A	14
121-135	point mutation (X2: S135D) : 포스포미메틱 (phosphomimetic) 변형체	GRA7-ⅢS135D	TDRKVVPRKSEGKR X 2	15
121-135	point mutation (S135E)	GRA7-ⅢS135E	TDRKVVPRKSEGKR E	16

실시예 1-8: 단백질 정제 및 질량 분광 분석법(mass spectrometry)

침전물(precipitates)은 용해 버퍼(lysis buffer)로 광범위하게 세척하였다. 비드(bead)에 결합된 단백질을 용출(elution)시키고, NuPAGE 4~12% 비스-트리스 구배 겔(Bis-Tris gradient gel; Life Technologies)상에서 분리시켰다. 상기 겔은 은 염색(silver staining; Life Technologies) 후, 한국생명공학연구원 질량 분석 시설의 이온-트랩 질량 분석기(ion-trap mass spectrometry)를 이용하여 특정 단백질 밴드(band)를 잘라내어 분석하였으며, 아미노산 서열은 이중질량분석법(tandem mass spectrometry)과 데이터베이스 검색을 통해 밝혀냈다.

실시예 1-9: 렌티바이러스의 shRNA ( lentiviral short-hairpin RNA) 제작 및 형질도입

렌티바이러스의 shRNA 제작(production), 농축(concentration), 적정(titration), 및 형질도입(transduction)은 Open Biosystems사로부터 구입한 표적(traget) shRNA(short-hairpin RNA) 플라스미드(plasmid) DNA(인간 PKCα 및 마우스 ASC)를 사용하여 이전에 공지한 기술(Yang CS et.al., Cell Host Microbe., 11: 264-276, 2012; Yang CS et.al., Infect Immun ., 84: 339-350, 2016)에 따라 수행하였다. GFP-암호화(encoding) 렌티바이러스(pGIPZ 렌티바이러스 벡터; Open Biosystems)를 사용한 병행(parallel) 실험은 80%의 세포가 바이러스에 의해 성공적으로 형질도입된 것으로 나타났다.

실시예 1-10: 사이토카인( cytokine ) 측정

배양 상층액(supernatant)에 존재하는 마우스 사이토카인은, 이전에 공지한 기술(Yang CS et.al., Cell Host Microbe., 11: 264-276, 2012)에 따라 BD OptEIA ELISA set(BD Pharmingen)를 사용하여 측정하였다. 모든 분석(assay)은 제조사의 제품 메뉴얼에 따라 수행하였다.

실시예 1-11: ASC 올리고머화 분석(ASC oligomerization assay)

0.5% 트리톤 X-100(Triton X-100), EDTA가 포함되지 않은 프로테아제 저해제 칵테일(EDTA-free protease inhibitor cocktail), 및 포스파타아제 저해제 칵테일(phosphatase inhibitor cocktail)(Roche)을 포함한 TBS 버퍼(50mM Tris-HCl(pH 7.4) 및 150 mM NaCl)를 이용하여 대식세포를 용해시켰다. 용해물(lysate)을 4℃에서 15분 동안 6,000g로 원심분리하고, 침전물(pellet)과 상층액(supernatant)을 각각 트리톤-불용성 분획(Triton-insoluble fraction) 및 트리톤-가용성 분획(Triton-soluble fraction)으로 사용하였다. ASC 올리고머화(oligomerization) 검출을 위해, 트리톤-불용성 침전물(Triton-insoluble pellet)은 TBS 버퍼(buffer)로 2회 세척하고, 세척 후 300 ㎕의 TBS 버퍼로 재현탁(resuspension) 시켰다. 재현탁 시킨 침전물(pellet)에 2mM DSS(disuccinimidyl suberate; Pierce)를 처리하여 37℃에서 30분 동안 가교 결합(cross-linkage) 시킨 다음, 15분 동안 6,000g로 원심분리하였다. 침전물(pellet)은 SDS 샘플 버퍼로 용해시켰다.

실시예 1-12: ASC 염증조절복합체( inflammasome / pyroptosome )의 면역염색(immunostaining)

세포를 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde) 및 0.1% NP40으로 고정시키고, 세척한 뒤, Sigma사의 항-ASC(anti-ASC) 항체와, 2차 항체로서 FITC가 결합된 항-랫트 항체(FITC-conjugated anti-rat antibody)를 이용하여 염색하였다. 이미징 분석은 공초점 레이저 주사현미경(laser-scanning confocal microscopy; model LSM 800, Zeiss)을 이용하여 관찰하였으며, ASC 염증조절복합체(inflammasome은 pyroptosome으로도 알려져 있음)를 포함하는 세포의 비율(percentage)은 각 5개 구간에서 최소 100개의 세포를 계수함으로써 측정하였다.

실시예 1-13: 세포 분획법(cellular fractionation)

세포질(cytosol)과 미토콘드리아(mitochondria)는 미토콘드리아 분획 키트(Mitochondria Fractination kit; Active Motif, 40015)를 사용하거나, 이전에 공지한 기술(Yang CS et.al., Nat Commun ., 6: 6115, 2015)에 따라 세포로부터 분리하였다. 세포질(cytosol), 마이크로솜(소포체; endoplasmic reticulum, ER), 미토콘드리아와 결합된 막(mitochondria-associated membrane, MAM) 분획물과 순수(pure) 미토콘드리아는 소포체 분리 키트(Endoplasmic Reticulum Isolation Kit; Sigma, ER0100)를 사용하거나, 이전에 공지한 기술(Yang CS et.al., Nat Commun ., 6: 6115, 2015; Bozidis P et.al., Curr Protoc Cell Biol ., Chapter 3: Unit 3 27, 2007; Wieckowski MR et.al., Nat Protoc ., 4: 1582-1590, 2009)에 따라 세포로부터 분리하였다. SDS-PAGE를 하기 위해, 초원심세포분획된(subcellular fractionated) 단백질을 2% SDS를 함유하는 버퍼(buffer)로 용해시키고, 2× 환원 샘플 버퍼(2× reducing sample buffer)로 비등(boiling)시켰다.

실시예 1-14: CFU 분석(Colony-Forming Units Assay)

대식세포 내 박테리아 생존력(viability)를 분석하기 위해, 세포를 4시간 동안 결핵균(M. tuberculosis, MTB)에 감염시킨 다음, 세포 외(extracellular) 박테리아를 제거하기 위해 인산완충용액(PBS; phosphatebuffered saline)으로 세척하였다. 세척 후, 감염된 세포를 지정된 시간 동안 배양하였다. 지정된 시간 동안 배양한 후 세포를 수확하고, 세포 내(intracellular) 박테리아를 방출시키기 위해 0.3% 사포닌(saponin; Sigma-Aldrich)으로 용해시켰다. 세포 용해물(cell lysate)은 격렬하게 재현탁(resuspension) 시킨 뒤 스크류 캡(screw cap) 튜브(tube)로 옮기고, 37℃로 예열된(preheated) 항온 수조 초음파기(water bath sonicator; Elma)에서 5분 동안 초음파 처리(sonication) 하였다. 초음파 처리된 세포 용해물은 Middlebrook 7H9(Difco, 271310) 배지를 이용하여 10배 희석하였다. 각 시료의 4개의 희석액을 Middlebrook 7H10 아가 플레이트(agar plate)에 각각 도포한 뒤, 37℃에서 2~3주 동안 배양하였다.

실시예 1-15: 체외( in vitro ) PLD 활성 측정법

PLD 활성(Phospholipase D activity)은 제조사의 프로토콜(protocol)에 따라 Amplex Red PLD assay kit(Molecular Probes, A12219)를 사용하여 측정하였다. 형광(fluorescence) 결과는 형광 마이크로플레이트 리더(fluorescence microplate reader) 기기를 사용하여 측정하였다. 이때, 여기 파장(excitation wavelength)은 530 nm, 방출 파장(emission wavelength)은 590 nm로 설정하여 측정하였다.

실시예 1-16: 형광 공초점 현미경(confocal fluorescence microscopy) 분석

면역 형광 분석(immunofluorescence analysis)은 Yang CS et.al., Autophagy, 10(5), 785-802 (2014)에 기재되어 있는 방법과 동일한 방법으로 수행하였다. 인산완충용액(PBS; phosphatebuffered saline)에 4%(w/v)로 희석한 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)를 이용하여 커버슬립(coverslip) 상에서 세포를 고정시키고, 이후, PBS에 0.25%(v/v)로 희석한 Triton X-100을 처리하여 25℃의 온도 조건에서 10분 동안 투과(permeabilization) 시켰다. PLD1 또는 His는 1/100로 희석한 1차 항체(primary Ab)를 25℃의 온도 조건에서 1시간 동안 처리하여 검출(detection)하였다. 세척 후, 형광 표지된 2차 항체(secondary Ab)를 25℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 슬라이드는 공초점 레이저 주사현미경(laser-scanning confocal microscopy; model LSM 800, Zeiss)을 이용하여 관찰하였다.

실시예 1-17: 결핵균( M. tuberculosis , MTB)를 포함한 파고솜(phagosome)의 분리

각 조건에 대해, 8개의 15 cm² 크기의 플레이트(plate)에서 배양한 BMDM을 사용하였으며, MOI(muliplicity of infection)가 10인 결핵균을 대식세포에 감염시키고 세척한 다음, 상기 실시예 1-7에서 제조한 재조합 GRA7 단백질(rGRA7)을 처리하여 2시간 동안 자극(stimulation)시켰다. 감염된 세포룰 수집하고 용해시킨 뒤, 이전에 공지한 기술(Beatty WL et.al., Cell Microbiol ., 4: 167-176, 2002)에 따라 분획화(fractionation) 하였다. 25 mM Tris-HCl(pH 7.6), 150 mM NaCl, 1% NP-40(Nonidet P-40), 1% 소듐 디옥시콜레이트(sodium deoxycholate) 및 0.1% SDS가 포함되어 있는 세포 용해 버퍼(cell lysis buffer)를 사용하여 파고솜(phagosome) 분획을 추출하였다. 이전에 공지한 바와 같이, 마이코박테리아(mycobacteria)의 단백질은 세포 용해 버퍼에 의해 추출되지 않았음을 확인하였다(Lee BY et.al., Mol Cell Proteomics ., 9: 32-53, 2010). 면역블롯팅 분석을 위해, 6 ㎍의 파고솜(phagosome) 분획을 SDS-PAGE로 분리한 후, 면역블롯팅 분석을 수행하였다.

실시예 1-18: 조직학(histology)

조직 단편(tissue section)의 면역화학염색(immunohistochemisty)을 위해, 마우스 폐를 10% 포르말린(formalin)으로 고정시키고, 파라핀(paraffin) 포매(embedding)를 수행하였다. 파라핀 단편은 4 ㎛의 두께로 잘라 헤마토자일린-에오신(hematoxyline-eosin; H&E)으로 염색하였다(Buchweitz JP et al., J Pharmacol Exp Ther., 323: 675-683, 2007).

실시예 2: GRA7 단백질(dense granule antigen 7 protein)의 역할 규명

실시예 2-1: GRA7 단백질과 ASC 및 PLD1과의 연관성

대식세포(macrophage) 내에서 감염성 질환(infectious disease)에 대한 치료 전략으로서의 세포내 신호 기전(intracellular signaling pathway)에서 GRA7의 역할을 규명하기 위하여, GRA7이 선천면역(innate immunity)과 관련되어 있는 분자(molecule)와 상호작용하는지 조사하였다. GRA7 복합체(GRA7 complex)는 THP-1 세포의 용해물(lysate)과 재조합 GRA7 단백질(rGRA7 protein)의 공면역침강법(co-immunoprecipitation; co-IP)을 통해 수득하였다. 정제된 GRA7 복합체는, 질량 분광 분석법(mass spectrometry analysis)을 통해 확인된 PLD1(124 K), PKCα(76 K), ASC(21 K), TRAF6(60 K)을 포함한 여러 내재적 단백질(endogenous protein)을 선택적으로 회수하였다(도 1). THP-1 세포를 재조합 GRA7 단백질(rGRA7 protein)로 자극(stimulation)한 후, 내재적(endogeneous) 단백질에 대한 공면역침강법(co-immunoprecipitation; co-IP)을 수행해 본 결과, 비록 15분에서 60분 정도 수준으로 일시적일지라도 GRA7이 PLD1, TRAF6, ASC를 포함한 여러 내재적 단백질과 강하게 상호작용하는 것을 확인하였다(도 2의 A 및 B). 반면, PLD2, NLRP3, NLRC4와는 상호 작용하지 않음을 확인하였다(도 2의 C). 분자량(molecular weight)과 공면역침강법(co-immunoprecipitation; co-IP)을 토대로, GRA7은 이전에 보고(Yang CS et.al., Infect Immun ., 84: 339-350, 2016)된 바와 같이, TRAF6와 연관되어 있음을 알 수 있었다(도 1 내지 도 3).

구조적으로, GRA7은 신호 시퀀스(signal sequence), N-말단 도메인(Ⅰ-Ⅳ), 막관통(transmembrane, TM), C-말단 도메인(Ⅴ)을 가지고 있다(도 3). HEK293T 세포에 다양한 포유류(mammalian)의 글루타티온 S-전달효소(GST; Glutathione S-transferase)가 표지된(tagged) GRA7(dense granule antigen 7)(GST-GRA7) 또는 이의 절단된(truncated) 변형체(mutant)(GST-GRA7-Ⅰ-Ⅳ; GST-GRA7-Ⅰ; GST-GRA7-Ⅱ; GST-GRA7-Ⅲ; GST-GRA7-Ⅳ; GST-GRA7-Ⅴ) 및 V5가 표지된(tagged) ASC(V5-ASC) 융합체(fusion)를 사용하여 나타낸 상세 맵핑(mapping)은, GRA7의 N-말단 Ⅰ-도메인(domain)(aa26-80)이 오직 ASC와 최소한의 결합 친화도(binding affinity)를 보이고, N-말단 PYD 도메인(aa1-91)을 가진 ASC는 ASC WT(wild type)만큼 GRA7과 강하게 결합함을 나타내었다(도 3 및 도 4). GST가 표지된 GRA7(GST-GRA7) 또는 이의 절단된(truncated) 변형체(mutant)(GST-GRA7-Ⅰ-Ⅳ; GST-GRA7-Ⅰ; GST-GRA7-Ⅱ; GST-GRA7-Ⅲ; GST-GRA7-Ⅳ; GST-GRA7-Ⅴ) 및 AU1이 표지된(tagged) PLD1(AU1-PLD1) 융합체(fusion)를 사용하여 수행한 GST pulldown assay 결과는, GRA7의 N-말단 Ⅲ-도메인(aa120-150)이 PLD1의 PX(aa81-212)와 상호작용하는데 필요하다는 것을 보여주었으며(도 3 및 도 5), ASC, PLD1 및 TRAF6와 GRA7과의 상호작용은 유전적으로 분리될 수 있음을 나타내었다(도 1 내지 도 5).

이러한 결과는, 대식세포 내에서 N-말단 Ⅰ-도메인과 N-말단 Ⅲ 도메인을 통해 GRA7이 각각 ASC 및 PLD1과 독립적으로 그리고 직접적으로 상호작용한다는 것을 보여주었다.

실시예 2-2: PKCα를 통한 GRA7 단백질과 ASC 및 PLD1과의 상호작용

GRA7은 ASC와 PLD1과의 결합(binding) 뿐만 아니라, PKCα와도 상호작용(interaction) 한다. THP-1 세포를 재조합 GRA7 단백질(rGRA7 protein)로 자극(stimulation)한 후, 내재적(endogeneous) 단백질에 대한 공면역침강법(co-immunoprecipitation; co-IP)을 수행해 본 결과, GRA7과 PKCα 간에는 강한 상호작용을 나타낸 반면, PKCβⅠ과 PKCγ와는 상호작용하지 않음을 확인하였다(도 6).

인간 키놈(human kinome)의 광범한 프로테오믹스(proteomics) 분석(Oppermann FS et.al., Mol Cell Proteomics ., 8: 1751-1764, 2009)과 컴퓨터를 사용한 시퀀스(sequence) 분석(Finn RD et.al., Nucleic Acids Res., 44: D279-D285, 2016)은 GRA7의 N-말단 Ⅰ, Ⅲ 도메인 및 C-말단 Ⅴ 도메인에 존재하는 다섯 개의 PKC 인산화 잔기(S⁵²LR, T¹²¹DR, S¹³⁵FK, T²⁰⁴TR, S²⁰⁹PR)을 예측하였다. GRA7이 PKCα에 의해 인산화(phosphorylation) 되는지 확인하기 위하여, 여러 전략을 세웠다. 먼저, 인산화된 단백질과 특이적으로 결합하고 겔(gel)에서 이동(migration)을 지연시키는 Phos-tag^ⓡ 생체분자(biomolecule)를 사용한 Phos-tag^ⓡ 겔 전기영동을 수행하였다(Kinoshita E et.al., Nat Protoc ., 4: 1513-1521, 2009). 이때, 인산화(phosphorylation) 분석을 위해 SDS-PAGE를 수행하고, Phos-tag^ⓡ 라벨링 시스템(Phos-tag^ⓡ labeling system)으로 가시화 하였다. 분석 결과, PKCα와 공발현(co-expression) 되었을 때, 야생형(wild-type)의 GRA7(GRA7^WT), 야생형(wild-type)의 GRA7-Ⅰ 도메인(GRA7-I^WT), 및 야생형(wild-type)의 GRA7-Ⅲ 도메인(GRA7-Ⅲ^WT)은 더 천천히 이동하고, 업-시프트된 밴드(up-shifted band)가 나타나는 것을 확인하였다. 반면, PKCβ, PKCδ 또는 PKCξ과 공발현(co-expression) 되었을 때는 업-시프트된 밴드(up-shifted band)가 나타나지 않았다(도 7).

한편, 정제된 재조합 PKCα(recombinant PKCα)를 사용하여, 체외(in vitro) 인산화 어세이(phosphorylation assay)와 전체 GRA7 시퀀스(sequence)를 포함하는 비편향 중복 펩티드 어레이(non-biased overlapping peptide array)를 수행하였다(Ashpole NM et al., J Biol Chem ., 287: 8495-8506, 2012; Gaji RY et al., PLoS Pathog ., 11: e1005268, 2015). GRA7로부터 얻은 두 개의 펩티드, ⁴⁹PVDSLRPTNAGVDSK⁶³ 및 ¹²¹TDRKVVPRKSEGKRS ¹³⁵는 광 유도 발광 값(photo-stimulated luminescence value) 200(PSL/mm²) 이상의 인산화 신호를 나타내었다(도 8). 대조적으로, GRA7의 C-말단의 어떠한 펩티드도 두드러진 인산화 신호를 나타내지 않았다. GRA7은 세린(serine)/트레오닌(threonine) 잔기(residue)를 가지며, 인산화된 상기 두 개의 GRA7의 펩티드는 3개의 잠재적인 인산화 위치를 포함하고 있다(도 8 및 도 9). GRA7의 특이적인 점 돌연변이(point mutation) 형태, 즉 I^S52A 및 Ⅲ^S135A는 Phos-tag^ⓡ 겔 전기영동을 수행한 결과, 인산화가 현저하게 감소되는 것으로 확인된 반면, GRA7의 특이적인 점 돌연변이(point mutation) 형태, 즉 Ⅲ^T121A는 인산화 감소 현상을 나타내지 않았다(도 7의 A). 이러한 결과를 통해, PKCα가 GRA7의 S⁵²와 S¹³⁵ 잔기를 특이적으로 인산화시킬 수 있으며, 이에 GRA7이 PKCα의 기질(substrate)임을 알 수 있었다.

다음, GRA7의 S⁵²와 S¹³⁵의 인산화가 각각 ASC와 PLD1과의 결합(binding)에 필수적인지 알아보기 위하여, 연구를 수행하였다. GRA7의 점 돌연변이(point mutation) 형태, 즉 I^S52A 및 Ⅲ^S135A는 ASC와 PLD1과의 상호작용을 완벽하게 차단한 것으로 나타났는데, 이는 ASC와 PLD1과의 상호작용이 GRA7의 S⁵²와 S¹³⁵의 인산화에 의존적임을 유추할 수 있다(도 9). 더 나아가, ASC와 PLD1이 상호작용 하도록 포스포-세린(Phospho-serine), S⁵²와 S¹³⁵ 대신에 포스포미메틱(phosphomimetic) 잔기인 아스파르트 산(aspartic acid, D) 또는 글루탐산(glutamic acid, E)으로 단일 치환하여 S52D와 S135E로 아미노산(amino acid)을 변형(mutation)시켰다. GST(Glutathione S-transferase) pulldown assay를 수행하여 분석을 진행한 결과, GRA7의 포스포미메틱(phosphomimetic) 변형체(mutant)는 야생형(wild-type)의 GRA7과 비교하여 ASC 및 PLD1과 강하게 결합(binding)하는 것으로 나타났으며, 이는 본질적으로 GRA7을 인산화된 것처럼 모방(mimicking)하는 것이 선천성 면역 경로(innate immune pathway)에서 PKCα의 기능을 필요로 하는 것보다 더 중요함을 의미한다. 도 6 내지 도 9에서 나타낸 바와 일치하게, rGRA7의 자극(stimulation) 하에, PKCα^-/- 마우스의 BMDM에서 GRA7이 ASC와 PLD1과의 상호작용이 현저하게 감소하는 것으로 나타났으며, 마찬가지로 PKCα에 특이적인 shRNA를 사용하여 넉다운(knock down) 시킨 THP-1 세포에서도 GRA7이 ASC와 PLD1과의 상호작용이 현저하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 10). 또한, rGRA7의 자극(stimulation) 하에, PKCα의 약학적인 저해제를 BMDM에 처리한 경우에도 GRA7이 ASC와 PLD1과의 상호작용이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

종합하면, 상기 결과를 통해 GRA7의 S⁵²와 S¹³⁵의 PKCα-매개 인산화(PKCα-mediated phosphorylation)가 GRA7과 ASC 또는 PLD1과의 각각의 상호작용에 필수적인 것을 알 수 있었다.

실시예 2-3: GRA7 -Ⅰ도메인의 ASC 의존적 염증조절복합체( ASC -dependent inflammasome)의 활성 유도

대식세포(macrophage)의 선천면역반응(innate immune response)에 있어서, 톡소포자충(toxoplasma gondii, T. gondii) GRA7-Ⅰ 도메인의 역할을 규명하기 위하여, 이전에 공지된 실험 방법대로 박테리아를 이용하여 정제된 His 표지(His-tagged) GRA7-Ⅰ과 이의 변형체(mutant) 단백질을 만들었다(Yang CS et.al., Infect Immun ., 84: 339-350, 2016; Alaganan A et.al., Proc Natl Acad Sci USA, 111: 1126-1131, 2014). 정제된 rGRA7-Ⅰ(10 kDa)은 SDS-PAGE와 면역 블롯 분석을 통해 확인하였다(도 11). 벡터 대조군과 비교하여, 대식세포(macrophage)에 rGRA7에 의해 유도된 세포독성(cytotoxicity)에 있어 유의한 차이를 나타내지 않았다.

이전 연구 결과에서, rGRA7에 의해 대식세포에서 IL-1β을 포함한 전염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine) 유전자와 단백질의 발현이 유도됨을 확인하였으며(Yang CS et.al., Infect Immun ., 84: 339-350, 2016), NLRP3(nucleotide-binding domain, leucine-rich repeats containing family, pyrin domain-containing-3) 염증조절복합체(inflammasome)가 IL-1β 및 IL-18의 성숙(maturation)을 유도하는 어댑터(adaptor) ASC와 카스파제-1(caspase-1)과 상호작용하는 NLRP3을 함유하는 다량체 단백질 복합체(multimeric protein complex)와 관련됨을 확인하였다(Jayaraman P et.al., J Immunol ., 190: 4196-4204, 2013; Yang CS et.al., Nat Commun., 6: 6115, 2015).

한편, 염증조절복합체(inflammasome)의 활성을 조절하는 데 있어, GRA7-Ⅰ 도메인의 역할을 규명하기 위하여, PKCα^+/+와 PKCα^-/- 마우스로부터 분리한 BMDM에 rGRA7-Ⅰ 및 이의 변형체(mutant) 단백질로 자극을 주었다. rGRA7과 rGRA7-Ⅰ^WT으로 자극을 주었을 때, PKCα가 결핍된, 즉 PKCα^-/- 마우스로부터 분리한 BMDM은 야생형(wilde type), 즉 PKCα^+/+ 마우스로부터 분리한 BMDM보다 IL-1β 및 IL-18의 생산이 현저하게 약화된 것으로 확인되었으나, GRA7의 포스포미메틱(phosphomimetic) 변형체(mutant) Ⅰ^S52D에 의해서는 PKCα가 결핍된 BMDM에서 IL-1β 및 IL-18 분비가 현저하게 증가하는 것으로 확인되었다(도 12). 상기 결과와 일치하게, rGRA7-Ⅰ^WT으로 자극에 의해, PKCα가 결핍된, 즉 PKCα^-/- 마우스로부터 분리한 BMDM에서 카스파제-1(caspase-1) 활성과 IL-1β 및 IL-18의 성숙(maturation)이 현저하게 감소되는 것으로 확인되었으며, PKCα가 결핍되어 있더라도 본질적으로 GRA7의 활성화된 형태인 I^S52D에 의해 '구조된(rescued)' 것으로, 즉, GRA7의 포스포미메틱(phosphomimetic) 변형체(mutant) Ⅰ^S52D에 의해 PKCα가 결핍된 BMDM에서 카스파제-1(caspase-1) 활성과 IL-1β 및 IL-18의 성숙(maturation)이 감소되지 않는 것으로 확인되었다(도 13). 특히 ASC-결합(binding) 의존적 상태에서, PKCα 비-인산화 변형체(non-phosphorylatable mutant)인 rGRA7-I^S52A과 shRNA에 매개된 내재적(endogenous) ASC 발현 감소는 IL-1β 및 IL-18 생산의 현저한 감소를 유도하였다.

다음, ASC 스펙(speck)의 세포내(intracellular) 형성이 GRA7-I 상호작용에 의존적이라면, 실질적으로 ASC가 올리고머화(oligomerization) 되는지 확인하였다. 활성화된 카스파제-1(caspase-1)과 IL-1β의 분비와 일치하게, 야생형(wilde type), 즉 PKCα^+/+ 마우스로부터 분리한 BMDM과 비교하여, PKCα가 결핍된, 즉 PKCα^-/- 마우스로부터 분리한 BMDM에서 ASC의 올리고머화와 스펙 형성이 두드러지게 감소하는 것을 확인되었으나, GRA7의 포스포미메틱(phosphomimetic) 변형체(mutant) Ⅰ^S52D에 의해 PKCα가 결핍된 BMDM에서 ASC의 올리고머화와 스펙 형성이 현저하게 증가되는 것을 확인하였다(도 14). 더 나아가, GRA7과 ASC의 세포내(intracellular) 상호작용(interaction)은 GRA7으로 자극을 준 후, 그들의 공배치(co-localization)에 의해 확인되었다. PKCα^+/+ 마우스로부터 분리한 BMDM의 미토콘드리아 분획(mitochondrial fraction)을 이용하여 초원심세포분획법(subcellular fractionation)과 공면역침강법(co-immunoprecipitation; co-IP) 분석을 수행한 결과, GRA7-Ⅰ 도메인이 ASC 및 PKCα와 관련되어 있음을 알 수 있었다. 특히, 이러한 결합(binding) 양상(pattern)은 PKCα^+/+ 마우스와 PKCα^-/- 마우스로부터 수득한 BMDM에서 GRA7의 포스포미메틱(phosphomimetic) 변형체(mutant) Ⅰ^S52D에 의해 증가됨을 확인하였다(도 15). 이러한 결과를 통해, GRA7-Ⅰ이 미토콘드리아에서 PKCα를 통해 ASC-의존적 염증조절복합체(inflammasome) 활성의 양성 조절자(positive regulator)로서 역할을 함을 알 수 있었다.

실시예 2-4: 결핵균( Mycobacterium tuberculosis, MTB ) 감염에 대한 저항에 있어 GRA7 -Ⅰ 도메인에 의해 유도된 ASC 의존적 염증조절복합체( ASC -dependent inflammasome) 활성의 중요성

IL-1β와 IL-18는 염증(inflammation)과 숙주 방어(host defense) 체계에서 중요한 역할을 하는 사이토카인이다(Verway M et.al., PLoS Pathog ., 9: e1003407, 2013; Yang CS et.al., Nat Commun ., 6: 6115, 2015). 먼저, MTB에 감염된 대식세포(macrophage)에서 rGRA7-Ⅰ^WT 및 이의 변형체(mutant)에 의해 유도된 카스파제-1(caspase-1) 활성과, IL-1β 및 IL-18의 성숙(maturation) 정도를 측정하였다. ASC-결합(binding) 및 상기 PKCα-인산화 의존적 상태에서, 실시예 1-3의 투여량으로 MTB를 감염시킨 대식세포에 rGRA7-Ⅰ^WT을 처리함에 따라 염증조절복합체(inflammasome)의 활성이 증가되었다. 중요하게, MTB가 감염된 상태의 PKCα^+/+ 마우스와 PKCα^-/- 마우스로부터 수득한 BMDM에 GRA7의 포스포미메틱(phosphomimetic) 변형체(mutant) Ⅰ^S52D를 처리함에 따라 염증조절복합체(inflammasome)의 활성이 두드러지게 증폭되었다(도 16). ASC-결합(binding) 의존적 상태에서, PKCα 비-인산화 변형체(non-phosphorylatable mutant)인 rGRA7-I^S52A과 shRNA에 매개된 내재적(endogenous) ASC 발현 감소는 카스파제-1(caspase-1) 활성과, IL-1β 및 IL-18의 성숙(maturation) 정도의 현저한 감소를 유도하였다(도 16 및 도 17).

세포내(intracellular) 박테리아 복제(bacterial replication)를 저해하기 위해, IL-1β는 직접적으로 MTB에 감염된 대식세포를 활성화 시킨다(Jayaraman P et.al., J Immunol ., 190: 4196-4204, 2013; Mayer-Barber KD et.al., Nature, 511: 99-103, 2014). 대식세포에서 rGRA7에 의해 유도된 항균 활성(antimicrobial activity)이 PKCα를 통한 ASC-의존적 염증조절복합체(inflammasome) 활성에 의존적인지 확인하기 위해 실험을 수행하였다. 그 결과, 투여량 의존적으로 MTB에 대한 야생형(wild-type)의 rGRA7과 야생형(wild-type)의 GRA7-Ⅰ^WT에 의해 유도된 항균 반응(antimicrobial response)은 PKCα^-/- 마우스로부터 수득한 BMDM과, shASC가 형질도입(transduction)된 세포에서 현저하게 하향조절(down-regulation) 되었고, 약학적 저해제로 PKCα 활성을 저해(blockade)한 경우에도 투여량 의존적으로 MTB에 대한 야생형(wild-type)의 rGRA7과 야생형(wild-type)의 GRA7-Ⅰ^WT에 의해 유도된 항균 반응이 하향조절 되는 것을 확인하였다(도 18). 특히, PKCα^+/+ 마우스와 PKCα^-/- 마우스로부터 수득한 BMDM에 야생형(wild-type)의 rGRA7과 야생형(wild-type)의 GRA7-Ⅰ^WT를 처리한 것과 비교하여, PKCα 비-인산화 변형체(non-phosphorylatable mutant)인 rGRA7-I^S52A는 MTB의 세포내(intracellular) 생존이 상당히 증가하였다. GRA7의 포스포미메틱(phosphomimetic) 변형체(mutant) Ⅰ^S52D는 MTB에 대한 항균 반응을 현저하게 증가시켰으며, 이는 본질적으로 GRA7의 활성화된 형태인 I^S52D에 의해 PKCα의 결핍이 '구조된(rescued)' 것을 나타낸다. GRA7 재조합 단백질(rGRA7) 유무와 관련 없이, 7H9 브로스(7H9 broth)에서의 MTB 성장은 유의적 차이가 없는 것으로 확인되었으며(도 19), 이는 ASC-의존적 염증조절복합체(inflammasome) 유래 IL-1β가 MTB 감염에 대한 반응을 조절하고, 대식세포에서 기능적으로 PKCα를 통해 연결되어 있음을 나타낸다.

실시예 2-5: GRA7 -Ⅲ 도메인에 의한 PLD1의 활성화 유도

대식세포(macrophage)의 선천면역반응(innate immune response)에 있어서, 톡소포자충(toxoplasma gondii, T. gondii) GRA7-Ⅲ 도메인의 역할을 규명하기 위하여, 이전에 공지된 실험 방법대로 박테리아를 이용하여 정제된 His 표지(His-tagged) GRA7-Ⅲ와 이의 변형체(mutant) 단백질을 만들었다(Yang CS et.al., Infect Immun ., 84: 339-350, 2016; Alaganan A et.al., Proc Natl Acad Sci USA, 111: 1126-1131, 2014). 정제된 rGRA7-Ⅲ(5 kDa)은 SDS-PAGE와 면역 블롯 분석을 통해 확인하였다(도 20).

PLD2와는 아니지만, GRA7이 PLD1과는 연관되어 있기 때문에, GRA7-Ⅲ 도메인에 의한 PLD1의 활성화가 많은 세포작용(cellular process)에서 인산화(phosphorylation) 이벤트(event)에 의해 조절되는 것인지를 확인하기 위해 실험을 수행하였다(Kim JH et.al., Cell Immunol ., 298: 9-17, 2015; Jenkins GM et.al., Cell Mol Life Sci ., 62: 2305-2316, 2005). PLD1의 활성화는 PKCα에 의해 PX 도메인(PX domain)에서의 트레오닌 147(Thr¹⁴⁷)과 PLD1의 음성조절고리부위(negative regulatory loop region)에서의 세린 561(Ser⁵⁶¹)의 인산화에 의해서 조절된다(Kim JH et.al., Cell Immunol ., 298: 9-17, 2015; Jenkins GM et.al., Cell Mol Life Sci ., 62: 2305-2316, 2005). 먼저, 대식세포에서 PKCα 비-인산화 변형체(non-phosphorylatable mutant)인 rGRA7-Ⅲ^S135A에 의해서는 아니지만, 트레오닌 147(Thr¹⁴⁷) 및 세린 561(Ser⁵⁶¹)에서 rGRA7-Ⅲ에 의해 유도된 PLD1의 인산화가 측정되었다. 중요하게, PKCα^+/+ 마우스와 PKCα^-/- 마우스로부터 수득한 BMDM에 GRA7의 포스포미메틱(phosphomimetic) 변형체(mutant) Ⅲ^S135D를 처리함에 따라 PLD1의 활성이 두드러지게 증폭되었다(도 21). 상기 결과와 일치하게, PKCα^+/+ 마우스와 PKCα^-/- 마우스로부터 수득한 BMDM에서 PLD 활성은 PKCα 비-인산화 변형체(non-phosphorylatable mutant)인 rGRA7-Ⅲ^S135A에 의해 현저하게 감소되었으며, GRA7의 포스포미메틱(phosphomimetic) 변형체(mutant) Ⅲ^S135D에 의해서는 두드러지게 증가되었다(도 22). 그러나, PLD1^-/- 대식세포에서는 포스포미메틱(phosphomimetic) 변형체(mutant)를 처리하여도 PLD 활성이 기저수준(basal level)으로 나타났다. 이는, 인산화된(phosphorylated) rGRA7-Ⅲ 도메인이 PKCα에 의해 활성화된 PLD1과 상호작용하고, PLD1의 트레오닌 147(Thr¹⁴⁷) 및 세린 561(Ser⁵⁶¹)에서의 인산화를 통해 이의 효소 활성이 자극됨을 나타낸다. 더 나아가, 면역염색(immunostaining) 및 이미지 오버레이(overlay)에 의해 나타난 바와 같이, GRA7과 PLD1의 세포내(intracellular) 상호작용(interaction)은 rGRA7으로 자극을 준 후, 그들의 공배치(co-localization)에 의해 확인되었다(도 23). 작은 얼룩과 반점으로 표시된 바와 같이, GRA7은 세포질(cytoplasm)에서 PLD1과 함께 위치하고 있는 것으로 나타났다. 특히, 이러한 공배치(co-localization) 양상(pattern)은, PLD1^-/- 마우스로부터 수득한 BMDM에서는 아니지만, PKCα^+/+ 마우스와 PKCα^-/- 마우스로부터 수득한 BMDM에서는 GRA7의 포스포미메틱(phosphomimetic) 변형체(mutant) Ⅲ^S135D에 의해 증가됨을 확인하였다. 이러한 결과를 통해, GRA7-Ⅲ가 대식세포에서 PKCα를 통해 PLD1활성의 양성 조절자(positive regulator)로서 역할을 함을 알 수 있었다.

실시예 2-6: 결핵균( Mycobacterium tuberculosis, MTB ) 감염에 대한 저항에 있어 GRA7 -Ⅲ 도메인에 의해 유도된 PLD1의 파고솜 성숙( phagosome maturation)의 중요성

PLD1의 활성은 액틴 세포골격(actin cytoskeleton), 분비(secretion) 및 엔도시토시스(endocytosis)를 위한 소포 유통(vesicle trafficking), 및 수용체 신호전달(receptor signaling)을 조절한다. 세포 내에서 PLD1의 동적 순환(dynamic cycling)의 새로운 개념으로, 위치화(localization)의 다양한 보고 중 일부는 사용된 세포주(cell line)의 소포 순환(vesicles cycling)의 수와 비율이 다르기 때문일 수 있으며, 따라서 PLD1의 위치화는 다른 조절에 의한 것일 수 있다(Greco E et.al., Proc Natl Acad Sci USA, 109: E1360-1368, 2012; Kim JH et.al., Cell Immunol., 298: 9-17, 2015; Jenkins GM et.al., Cell Mol Life Sci ., 62: 2305-2316, 2005). 비록 마이코박테리아(mycobacteria)가 오직 초기 엔도솜(endosome) 막 융합(membrane fusion)을 허용하고, 후기 엔도솜과 라이소솜(lysosome)의 융합을 방지하기 위한 선택적 Rab GTPase 모집(recruitment)에 의해 파고솜(phagosome) 정지(arrest)를 유도할지라도, MTB는 우선적으로 폐포(alveolar)의 대식세포에 감염된다(Seto S et.al., Traffic., 12: 407-420, 2011; Zhang M et.al., Biosci Rep., 29: 193-209, 2009). PLD1의 초원심세포분획법(subcellular fractionation) 분석을 수행하기 위해, MTB가 감염된 BMDM에 rGRA7과 이의 변형체(mutant)를 처리하고, 이후, 수크로오스 단계 구배 초원심분리(sucrose-step-gradient-ultra-centrifugation)에 의해 정제된 마이코박테리아를 포함하는 파고솜 분획(파고솜 및 파고-라이소솜(phago-lysosome))을 이용하여 파고솜 성숙 조절자(regulator)인 Rab5, Rab7, LAMP1(Lysosomal-associated membrane protein 1) 및 LAMP2(Lysosome-associated membrane protein 2) 단백질 유도 수준을 확인하였다. 흥미롭게도, GRA7에 의해 유도된 MTB를 포함하고 있는 파고솜은 후기 엔도솜과 라이소솜 마커(marker)인 Rab7, LAMP1 및 LAMP2에 모였으며, 이는, GRA7이 PKCα와 PDL1에 의존적인 상태로 대식세포에서 마이코박테리아 파고솜-라이소솜 융합(mycobacterial phagosome-lysosome fusion)을 가능하게 한다는 것을 보여준다(도 24). 또한, 결합 의존적 상태(binding-dependent manner)로 파고솜 분획(phagosomal fraction)에서 GRA7이 PLD1과 관련되어 있으며, GRA7의 포스포미메틱(phosphomimetic) 변형체(mutant) Ⅲ^S135D는 파고솜 수송(phagosomal trafficking)과 PLD1에 대한 결합(binding)이 두드러지게 증가되었으며, 이는 본질적으로 GRA7의 활성화된 형태인 Ⅲ^S135D에 의해 PKCα의 결핍이 '구조된(rescued)' 것을 보여준다(도 25). 이와 일치되게, 세포내(intracellular) MTB의 생존력(viability) 및 성장률(growth rate)은, PLD1^-/- 마우스로부터 수득한 BMDM에서는 아니지만, PKCα^+/+ 마우스와 PKCα^-/- 마우스로부터 수득한 BMDM에서는 GRA7의 포스포미메틱(phosphomimetic) 변형체(mutant) Ⅲ^S135D를 처리함에 따라 현저히 감소됨을 확인하였다(도 26). 종합적으로 이러한 결과를 통해, GRA7이 PLD1과의 상호작용을 통해 파고솜 성숙(phagosomal maturation)을 촉진시킬 수 있으며, 이에 따라, PKCα를 통해 결합 의존적 상태(binding-dependent manner)로 세포내 마이코박테리아에 대한 살균 활성(bacterial killing activity)의 두드러진 조절에 영향을 끼침을 알 수 있었다.

실시예 2-7: 체내( in vivo )에서의 결핵균( Mycobacterium tuberculosis, MTB ) 감염에 대한 GRA7 -Ⅰ 및 GRA7 -Ⅲ 도메인 의존적 숙주 방어 효과

GRA7-Ⅰ 및 GRA7-Ⅲ가 각각 ASC와 PLD1과 관련되어 있음을 확인하였으며, 이후, 종래 확립된 결핵(tuberculosis) 마우스 동물모델을 이용하여 체내(in vivo)에서 rGRA7과 이의 결합(binding) 변형체(mutant)의 효능(efficacy)을 평가하였다(Willand N et.al., Nat Med ., 15: 537-544, 2009). 상기 실시예 1-3과 같이, 마우스에 MTB를 감염시키고, 감염 3주 후, MTB에 감염된 마우스에 rGRA7 또는 이의 변형체(mutant)를 처리하였다. PKCα 비-인산화 변형체(non-phosphorylatable mutant)인 rGRA7-I^S52A 및 Ⅲ^S135A(I^S52A + Ⅲ^S135A)로 처리된 마우스는 아니지만, 야생형(wild-type)의 rGRA7, 야생형(wild-type)의 GRA7-Ⅰ^WT 및 Ⅲ^WT(Ⅰ^WT + Ⅲ^WT), 또는 GRA7의 포스포미메틱(phosphomimetic) 변형체(mutant)인 Ⅰ^S52D 및 Ⅲ^S135D(Ⅰ^S52D + Ⅲ^S135D)로 각각 처리된 마우스는, 벡터(rVector)만 처리한 마우스와 비교하여, 폐(lung), 간(liver) 및 비장(spleen)에서의 세균 적재(bacillary load)가 현저하게 감소되었으며, 병소(foci)의 크기와 수에 있어 폐 육아종 병변(lung granulomatous lesion) 형성이 감소된 것을 확인하였다(도 27). 특히, rGRA7의 포스포미메틱(phosphomimetic) 변형체(mutant)인 Ⅰ^S52D 및 Ⅲ^S135D(Ⅰ^S52D + Ⅲ^S135D)는 PKCα^+/+ 마우스에서는 야생형(wild-type)의 rGRA7를 처리한 경우와 유사한 세균 적재(bacillary load) 수준을 나타냈으나, PKCα^-/- 마우스에서는 야생형(wild-type)의 rGRA7를 처리한 경우와 비교하여 세균 적재(bacillary load) 수준이 현저하게 감소됨을 확인하였다.

아울러, MTB 감염에 대한 체내(in vivo)에서의 숙주 반응에 있어 GRA7-Ⅲ의 영향을 분석해 본 결과, 도 28에 나타난 바와 같이, PLD1^-/- 마우스에서는 아니었지만, PLD1^+/+ 마우스에서는 rGRA7의 PLD1-결합 도메인(binding domain)인 야생형(wild-type)의 GRA7-Ⅲ^WT과, 포스포미메틱(phosphomimetic) 변형체(mutant)인 Ⅲ^S135D를 처리한 경우, 살균 효과(bacterial killing effect)가 두드러지게 증가하였으며, 육아종 병소(granulomatous foci)의 수는 감소함을 확인하였다. rGRA7의 PLD1-결합 결핍 변형체(PLD1-binding deficient mutant), 즉, PKCα 비-인산화 변형체(non-phosphorylatable mutant)인 rGRA7-Ⅲ^S135A는 PLD1^+/+ 마우스와 PLD1^-/- 마우스 둘 다에서 살균 효과(bacterial killing effect) 또는 육아종 병변(granulomatous lesion)에 있어 유의한 영향을 미치지 않았다. 이는, GRA7-Ⅲ의 항-마이코박테리아 효과(anti-mycobacterial effect)가 생체내(in vivo)에서 PKCα를 통해 PLD1-결합(binding) 의존적 상태로 작용함을 보여준다. 이러한 결과를 통해, MTB 감염에 대한 숙주 방어(host defense)가 GRA7-Ⅰ과 GRA7-Ⅲ 도메인에 의해 상당히 많은 영향을 받음을 분명하게 알 수 있었다.

<110> Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University ERICA Campus <120> Pharmaceutical composition for preventing or treating tuberculosis comprising Toxoplasma gondii-GRA7 recombinant protein as an active ingredient <130> P16U22D1468 <160> 16 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 236 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GRA7-1-236_wild type(X1: S52, X2: S135) <400> 1 Met Ala Arg His Ala Ile Phe Ser Ala Leu Cys Val Leu Gly Leu Val 1 5 10 15 Ala Ala Ala Leu Pro Gln Phe Ala Thr Ala Ala Thr Ala Ser Asp Asp 20 25 30 Glu Leu Met Ser Arg Ile Arg Asn Ser Asp Phe Phe Asp Gly Gln Ala 35 40 45 Pro Val Asp Ser Leu Arg Pro Thr Asn Ala Gly Val Asp Ser Lys Gly 50 55 60 Thr Asp Asp His Leu Thr Thr Ser Met Asp Lys Ala Ser Val Glu Ser 65 70 75 80 Gln Leu Pro Arg Arg Glu Pro Leu Glu Thr Glu Pro Asp Glu Gln Glu 85 90 95 Glu Val His Phe Arg Lys Arg Gly Val Arg Ser Asp Ala Glu Val Thr 100 105 110 Asp Asp Asn Ile Tyr Glu Glu His Thr Asp Arg Lys Val Val Pro Arg 115 120 125 Lys Ser Glu Gly Lys Arg Ser Phe Lys Asp Leu Leu Lys Lys Leu Ala 130 135 140 Leu Pro Ala Val Gly Met Gly Ala Ser Tyr Phe Ala Ala Asp Arg Leu 145 150 155 160 Val Pro Glu Leu Thr Glu Glu Gln Gln Arg Gly Asp Glu Pro Leu Thr 165 170 175 Thr Gly Gln Asn Val Gly Thr Val Leu Gly Phe Ala Ala Leu Ala Ala 180 185 190 Ala Ala Ala Phe Leu Gly Met Gly Leu Thr Arg Thr Tyr Arg His Phe 195 200 205 Ser Pro Arg Lys Asn Arg Ser Arg Gln Pro Ala Leu Glu Gln Glu Val 210 215 220 Pro Glu Ser Gly Glu Asp Gly Glu Asp Ala Arg Gln 225 230 235 <210> 2 <211> 156 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GRA7-26-181_wild type <400> 2 Ala Ala Thr Ala Ser Asp Asp Glu Leu Met Ser Arg Ile Arg Asn Ser 1 5 10 15 Asp Phe Phe Asp Gly Gln Ala Pro Val Asp Ser Leu Arg Pro Thr Asn 20 25 30 Ala Gly Val Asp Ser Lys Gly Thr Asp Asp His Leu Thr Thr Ser Met 35 40 45 Asp Lys Ala Ser Val Glu Ser Gln Leu Pro Arg Arg Glu Pro Leu Glu 50 55 60 Thr Glu Pro Asp Glu Gln Glu Glu Val His Phe Arg Lys Arg Gly Val 65 70 75 80 Arg Ser Asp Ala Glu Val Thr Asp Asp Asn Ile Tyr Glu Glu His Thr 85 90 95 Asp Arg Lys Val Val Pro Arg Lys Ser Glu Gly Lys Arg Ser Phe Lys 100 105 110 Asp Leu Leu Lys Lys Leu Ala Leu Pro Ala Val Gly Met Gly Ala Ser 115 120 125 Tyr Phe Ala Ala Asp Arg Leu Val Pro Glu Leu Thr Glu Glu Gln Gln 130 135 140 Arg Gly Asp Glu Pro Leu Thr Thr Gly Gln Asn Val 145 150 155 <210> 3 <211> 55 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GRA7-26-80_wild type(X1: S52) <400> 3 Ala Ala Thr Ala Ser Asp Asp Glu Leu Met Ser Arg Ile Arg Asn Ser 1 5 10 15 Asp Phe Phe Asp Gly Gln Ala Pro Val Asp Ser Leu Arg Pro Thr Asn 20 25 30 Ala Gly Val Asp Ser Lys Gly Thr Asp Asp His Leu Thr Thr Ser Met 35 40 45 Asp Lys Ala Ser Val Glu Ser 50 55 <210> 4 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GRA7-80-120_wild type <400> 4 Ser Gln Leu Pro Arg Arg Glu Pro Leu Glu Thr Glu Pro Asp Glu Gln 1 5 10 15 Glu Glu Val His Phe Arg Lys Arg Gly Val Arg Ser Asp Ala Glu Val 20 25 30 Thr Asp Asp Asn Ile Tyr Glu Glu His 35 40 <210> 5 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GRA7-120-150_wild type(X2: S135) <400> 5 His Thr Asp Arg Lys Val Val Pro Arg Lys Ser Glu Gly Lys Arg Ser 1 5 10 15 Phe Lys Asp Leu Leu Lys Lys Leu Ala Leu Pro Ala Val Gly Met 20 25 30 <210> 6 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GRA7-150-181_wild type <400> 6 Met Gly Ala Ser Tyr Phe Ala Ala Asp Arg Leu Val Pro Glu Leu Thr 1 5 10 15 Glu Glu Gln Gln Arg Gly Asp Glu Pro Leu Thr Thr Gly Gln Asn Val 20 25 30 <210> 7 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GRA7-201-236_wild type <400> 7 Leu Thr Arg Thr Tyr Arg His Phe Ser Pro Arg Lys Asn Arg Ser Arg 1 5 10 15 Gln Pro Ala Leu Glu Gln Glu Val Pro Glu Ser Gly Glu Asp Gly Glu 20 25 30 Asp Ala Arg Gln 35 <210> 8 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GRA7-49-63_point mutation(S52A) <400> 8 Pro Val Asp Ala Leu Arg Pro Thr Asn Ala Gly Val Asp Ser Lys 1 5 10 15 <210> 9 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GRA7-49-63_point mutation(X1: S52D) <400> 9 Pro Val Asp Asp Leu Arg Pro Thr Asn Ala Gly Val Asp Ser Lys 1 5 10 15 <210> 10 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GRA7-49-63_point mutation(S52E) <400> 10 Pro Val Asp Glu Leu Arg Pro Thr Asn Ala Gly Val Asp Ser Lys 1 5 10 15 <210> 11 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GRA7-120-150_point mutation(T121A) <400> 11 His Ala Asp Arg Lys Val Val Pro Arg Lys Ser Glu Gly Lys Arg Ser 1 5 10 15 Phe Lys Asp Leu Leu Lys Lys Leu Ala Leu Pro Ala Val Gly Met 20 25 30 <210> 12 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GRA7-120-150_point mutation(T121D) <400> 12 His Asp Asp Arg Lys Val Val Pro Arg Lys Ser Glu Gly Lys Arg Ser 1 5 10 15 Phe Lys Asp Leu Leu Lys Lys Leu Ala Leu Pro Ala Val Gly Met 20 25 30 <210> 13 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GRA7-120-150_point mutation(T121E) <400> 13 His Glu Asp Arg Lys Val Val Pro Arg Lys Ser Glu Gly Lys Arg Ser 1 5 10 15 Phe Lys Asp Leu Leu Lys Lys Leu Ala Leu Pro Ala Val Gly Met 20 25 30 <210> 14 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GRA7-121-135_point mutation(S135A) <400> 14 Thr Asp Arg Lys Val Val Pro Arg Lys Ser Glu Gly Lys Arg Ala 1 5 10 15 <210> 15 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GRA7-121-135_point mutation(X2: S135D) <400> 15 Thr Asp Arg Lys Val Val Pro Arg Lys Ser Glu Gly Lys Arg Asp 1 5 10 15 <210> 16 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GRA7-121-135_point mutation(S135E) <400> 16 Thr Asp Arg Lys Val Val Pro Arg Lys Ser Glu Gly Lys Arg Glu 1 5 10 15

Claims (13)

1. 하기 [식 1]의 아미노산 서열을 포함하는 15 내지 236개의 아미노산 길이로 이루어진 재조합 GRA7 단백질(recombinant dense granule antigen 7 protein, rGRA7 protein) 및/또는 하기 [식 2]의 아미노산 서열을 포함하는 15 내지 236개의 아미노산 길이로 이루어진 재조합 GRA7 단백질(recombinant dense granule antigen 7 protein, rGRA7 protein)을 유효성분으로 포함하는, 결핵 예방 또는 치료용 약학적 조성물;
   [식 1] PVDX₁LRPTNAGVDSK
   [식 2] TDRKVVPRKSEGKRX₂
   상기 [식 1]에서 X₁= S(serin), D(aspartic acid) 또는 E(glutamic acid)이며, 상기 [식 2]에서 X₂= S(serin), D(aspartic acid) 또는 E(glutamic acid)이다. 단, X₁ 또는 X₂가 S인 경우, S는 인산화되어 있다.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 [식 1]의 아미노산 서열을 포함하는 15 내지 236개의 아미노산 길이로 이루어진 재조합 GRA7 단백질은 서열번호 1, 서열번호 3 및 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 단백질인 약학적 조성물.
   
3. 제2항에 있어서, 상기 재조합 GRA7 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질인 약학적 조성물.
   
4. 제2항에 있어서, 상기 재조합 GRA7 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 단백질인 약학적 조성물.
   
5. 제2항에 있어서, 상기 재조합 GRA7 단백질은 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 단백질인 약학적 조성물.
   
6. 제1항에 있어서, 상기 [식 2]의 아미노산 서열을 포함하는 15 내지 236개의 아미노산 길이로 이루어진 재조합 GRA7 단백질은 서열번호 1, 서열번호 5 및 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 단백질인 약학적 조성물.
   
7. 제6항에 있어서, 상기 재조합 GRA7 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질인 약학적 조성물.
   
8. 제6항에 있어서, 상기 재조합 GRA7 단백질은 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 단백질인 약학적 조성물.
   
9. 제6항에 있어서, 상기 재조합 GRA7 단백질은 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어진 단백질인 약학적 조성물.
   
10. 제1항에 있어서, 상기 재조합 GRA7 단백질은 톡소포자충(Toxoplasma gondii) 유래인 것인 약학적 조성물.
    
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 항마이코박테리아제(antimycobacterial agent)와 동시 또는 순차적으로 투여되는 것인 약학적 조성물.
    
12. 제11항에 있어서, 상기 항마이코박테리아제(antimycobacterial agent)는 이소니아지드(isoniazid), 리팜피신(rifampicin), 에탐부톨(ethambutol), 피라지나마이드(pyrazinamide), 스트렙토마이신(streptomycin), 아미카신(amikacin), 카프레오마이신(capreomycin), 카나마이신(kanamycin), 시프로플록사신(ciprofloxacin), 오플록사신(ofloxacin), 목시플록사신(moxifloxacin), 리파부틴(rifabutin), 프로티오나마이드(protionamide), 에티오나마이드(ethionamide), 사이클로세린(cycloserine), 티오아세타존(thioacetazone), 리네졸리드(linezolid), 클로파지마인(clofazimine), 아목실린/클라불라네이트(amoxicillin/clavulanate) 및 다이아미노다이페닐설폰의 유도체(derivative of dianomidiphenylsulphone)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 그 이상인 것인 약학적 조성물.
    
13. 삭제

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