CN114392345B - E199l蛋白在促进细胞凋亡中的用途及方法 - Google Patents

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Abstract

E199L蛋白在促进细胞凋亡中的用途及方法。本发明提供一种E199L促进细胞凋亡的用途，E199L通过与BCL‑XL、MCL‑1、BCL‑W、BCL‑2A1等抗凋亡蛋白的广泛的相互作用，竞争性地破坏抗凋亡蛋白与BAK和/或BAX的相互作用，最终诱导细胞凋亡。

Description

E199L蛋白在促进细胞凋亡中的用途及方法
技术领域
本发明涉及细胞生物学，并且更具体地涉及一种用于诱导细胞凋亡的物质的用途及方法
背景技术
程序性细胞死亡(Programmed Cell Death,PCD)，是指细胞接受某种信号或受到某些因素刺激后，为了维持内环境稳定而发生的一种主动性消亡过程。凋亡、自噬、细胞程序性坏死、细胞焦亡都是程序性死亡的表现形式。
凋亡也称为“固缩坏死”、“程序性细胞死亡”或“细胞自杀”，是由基因介导的一系列变化，细胞依靠它来主动地引起它自身的破坏。正常起消除老化细胞或未参与免疫反应的淋巴细胞的凋亡过程，如发生病理性干扰，可对肿瘤生成起作用。
凋亡可以是生理性的，或由化疗药物及放射诱发，是存在于细胞中的自毁机制。这个过程机体能清除衰老及异常细胞，并在维持很多细胞功能方面有重要作用。细胞发生变异的癌细胞就是因为关闭了细胞内线粒体的这一调控功能，所以才躲过这一调控机制，不会自我毁灭。
细胞凋亡的启动是细胞在感受到相应的信号刺激后胞内一系列控制开关的开启或关闭，不同的外界因素启动凋亡的方式不同，所引起的信号转导也不相同，目前比较清楚的通路主要有：
1)细胞凋亡的膜受体通路
Fas是一种跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子受体超家族成员，Fas一旦和配体FasL结合，可通过Fas分子启动致死性信号转导，最终引起细胞一系列特征性变化，使细胞死亡。Fas作为一种普遍表达的受体分子，可出现于多种细胞表面，但FasL的表达却有其特点，通常只出现于活化的T细胞和NK细胞，因而已被活化的杀伤性免疫细胞，往往能够最有效地以凋亡途径置靶细胞于死地。
2)细胞色素C释放和Caspases激活的生物化学途经
线粒体是细胞生命活动控制中心，它不仅是细胞呼吸链和氧化磷酸化的中心，而且是细胞凋亡调控中心。实验表明了细胞色素C从线粒体释放是细胞凋亡的关键步骤。释放到细胞浆的细胞色素C在dATP存在的条件下能与凋亡相关因子1(Apaf-1)结合，使其形成多聚体，并促使caspase-9与其结合形成凋亡小体，caspase-9被激活，被激活的caspase-9能激活其它的caspase如caspase-3等，从而诱导细胞凋亡。
尽管凋亡过程的详细机制尚不完全清楚，但是已经确定Caspase即半胱天冬蛋白酶在凋亡过程中是起着必不可少的作用，细胞凋亡的过程实际上是Caspase不可逆有限水解底物的级联放大反应过程，至少已有14种Caspase被发现，Caspase分子间的同源性很高，结构相似，都是半胱氨酸家族蛋白酶。
凋亡细胞的特征性表现，包括DNA裂解为200bp左右的片段，染色质浓缩，细胞膜活化，细胞皱缩，最后形成由细胞膜包裹的凋亡小体，然后，这些凋亡小体被其他细胞所吞噬，这一过程大约经历30-60分钟，Caspase引起上述细胞凋亡相关变化的全过程尚不完全清楚，但至少包括以下三种机制：
1)凋亡抑制物
正常活细胞因为核酸酶处于无活性状态，而不出现DNA断裂，这是由于核酸酶和抑制物结合在一起，如果抑制物被破坏，核酸酶即可激活，引起DNA片段化(fragmentation)。
2)破坏细胞结构
Caspase可直接破坏细胞结构，如裂解核纤层，核纤层(Lamina)是由核纤层蛋白通过聚合作用而连成头尾相接的多聚体，由此形成核膜的骨架结构，使染色质(chromatin)得以形成并进行正常的排列。在细胞发生凋亡时，核纤层蛋白作为底物被Caspase在一个近中部的固定部位所裂解，从而使核纤层蛋白崩解，导致细胞染色质的固缩。
3)调节蛋白丧失功能
Caspase可作用于几种与细胞骨架调节有关的酶或蛋白，改变细胞结构。其中包括凝胶原蛋白(gelsin)、聚合粘附激酶(focal adhesion kinase,FAK)、P21活化激酶α(PAKα)等。这些蛋白的裂解导致其活性下降。如Caspase可裂解凝胶原蛋白而产生片段，使之不能通过肌动蛋白(actin)纤维来调节细胞骨架。
参与凋亡过程的相关基因有几十种，其中Fas\Bax\P53等基因有促进凋亡作用，Bcl-2\Bcl-XL等基因有抑制凋亡作用，而c-myc等基因则具有双向调节作用。
通过干扰凋亡的途径，来促进非正常细胞的死亡，从而调节机体的免疫反应，将在肿瘤等疾病的治疗中产生积极影响。
发明内容
我们发现，非洲猪瘟病毒(ASFV)强毒株(ASFV HLJ/18)在体内和体外感染后期均可引起细胞死亡。其中ASFV E199L蛋白参与了细胞死亡的过程，即E199L可以显著诱导细胞死亡。进一步，我们的研究发现E199L(SEQ ID No.1)诱导的细胞死亡具有细胞凋亡的特征，并与线粒体断裂有关，即E199L与BAK竞争结合BCL-XL，并依赖BAK诱导线粒体断裂和凋亡。此外，我们还发现ASFV HLJ/18强毒株感染引起线粒体断裂，并在caspase激活的同时引发细胞凋亡。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂抑制ASFV诱导的细胞凋亡可延缓病毒生长。因此，我们认为晚期蛋白E199L在非正常细胞的生长过程中是一个重要的凋亡诱导因子，该因子的参与，会加速细胞的凋亡。
据此我们提出本发明：
第一方面，本发明提供一种促进细胞凋亡的组合物，该组合物包含E199L蛋白。E199L蛋白能够使细胞活力显著降低，且呈剂量依赖性，诱导细胞的死亡率大于50％，进一步优选大于60％。
进一步，本发明提供一种肿瘤细胞生长抑制剂，该抑制剂包含E199L蛋白。
第二方面，本发明提供一种E199L促进细胞凋亡的用途，E199L不与BAK或BAX直接相互作用(图4A)，而是与BCL-XL、MCL-1、BCL-W、BCL-2A1等抗凋亡蛋白有广泛的相互作用(图4B)。E199L竞争性地破坏抗凋亡蛋白与BAK和/或BAX的相互作用，最终诱导细胞凋亡。E199L与BAK竞争结合BCL-XL(图4C)。同时，E199L依赖于BAK诱导线粒体断裂和凋亡(图4D、E和F)
进一步，本发明提供一种E199L促进肿瘤细胞凋亡的用途，在E199L的作用下，肿瘤细胞因线粒体断裂而死亡。
第三方面，本发明提供一种促进细胞凋亡的方法，所述方法包括使所述细胞与本发明的含E199L蛋白的促进细胞凋亡的组合物接触，从而诱导所述细胞的凋亡。E199L是一个膜蛋白，既不定位于线粒体，也不定位于内质网。表达E199L的细胞中线粒体被破坏，出现分裂(图3A)，实时共聚焦技术观察过度表达E199L的细胞的线粒体动力学可以发现线粒体从延长分裂形成沿细胞质的网状结构到肿胀、堆积和点状、碎裂的变化，并伴随着细胞形态从收缩、起泡到最终细胞死亡的变化(图3B)
进一步，本发明提供一种促进肿瘤细胞凋亡的方法，所述方法包括使所述肿瘤细胞与本发明的含E199L蛋白的肿瘤生长抑制剂接触，从而诱导肿瘤细胞的凋亡。
附图说明
图1：ASFV E199L体外诱导细胞死亡。(A)ASFV诱导细胞死亡蛋白的筛选。我们将94个ASFV基因合成到真核表达载体pCAGGS-Flag中，分别在HEK293T细胞中表达36h，然后根据ATP活性检测细胞活力。这条点线意味着由于Fluc实验的高度敏感性，只有那些至少比转染pCAGGS-Flag的对照组低30％的候选细胞死亡率才被认为是有意义的。(B)E199L在ASFV感染的PAM中的表达。用猪/HLJ/18分离株在0、2、4、6、8、12、24、48HPI的1个MOI感染PAMS。收集细胞，用qRT-PCR分析E199L的表达。(C)E199L诱导的细胞活力下降。(D)E199L转染剂量对细胞活力的影响。将表达的E199L质粒分别以50ng、100ng、200ng转染HeLa细胞36h，检测ATP活性。(E，F)转染pEGFP-E199L或空载体(EV)36h后，收集细胞，PI染色，流式细胞仪分析PI阳性细胞占总细胞(D)或GFP阳性细胞(E)的比例。结果代表了三个独立的实验。数据以均数±SD表示，n＝3。两组间差异的显著性采用单因素方差A检验或学生t检验(**代表p<0.01，*代表p<0.001)。
图2：ASFV E199L诱导的细胞死亡表现为细胞凋亡的特征。(A)HeLa细胞实时共聚焦图像表达pEGFP-E199L或pEGFP。时间代表相对时间(hh：mm)。Scale Bar，50μm。(B，C)代表性的共聚焦图像，显示转染pEGFP-E199L的细胞(绿色)中TUNEL阳性细胞(凋亡；橙色)，而转染pEGFP-E199L的细胞中未见TUNEL阳性细胞(凋亡；橙色)。比例尺，10μm(B)。(B)中TUNEL阳性细胞占GFP阳性细胞的百分比被量化，如(C)所示。(D)凋亡水平。将pFLAG-E199L或空载体转染HeLa细胞36h，收获细胞，对Annexin V-FITC和PI进行染色，流式细胞仪分析。(E)转染后36h，透射电镜观察凋亡细胞核形态。N：细胞核，C：细胞质，箭头：细胞核形态变化。数据以均数±SD表示，n＝3。组间差异的显著性采用单因素方差或学生t检验(**代表p<0.0 1)。
图3：E199L诱导线粒体功能障碍。(A)共聚焦显微镜分析转染pEGFP-E199L或pEGFP后线粒体的形态学变化。转染后36h，用线粒体外膜20(TOM20；red)特异性抗体对HeLa细胞进行免疫组化染色。放大图像显示Mock和GFP组典型的管状线粒体网络，pEGFP-E199L转染细胞线粒体碎裂。Scale，10μm。(B)实时共聚焦图像显示pEGFP-E199L(绿色)和pDsRed-mito(橙色)共表达，pEGFP-E199L(绿色)和pdsRed-mito(橙色)共表达。时间代表相对时间(hh：mm)。比例尺，50μm。(C，D)线粒体电位测定。转染Flag-E199L或空载体36h的HeLa细胞经JC-1染色后用流式细胞仪(FCM)进行定量。Mito Red CMXRos(Red)基于线粒体膜电位(D)标记E199L表达的HeLa细胞中的线粒体。数据以均数±SD表示，n＝3。标尺，20μm。组间差异用单因素方差A或学生t检验(**代表p<0.0 1)。
图4：E199L与BCL-XL竞争性结合BAK导致细胞凋亡。(A，B)Co-IP和Western blot分析单独或与HA-X(BAK，BAX，BCL-XL，BCL-W，BCL-1，BCL-X)共转染HEK293T细胞中E199L与凋亡(BAK，BAX)或抗凋亡蛋白(BCL-XL，MCL-1，BCL-W，BCL-2，BCL-2A1)的相互作用。(C)E199L对BAK和BCL-XL相互作用的竞争干扰分析。Flag-BAK、HA-BCL-XL单独或与HA-E199L联合转染HEK293T细胞，竞争IP和Western blot检测。(D)线粒体电位测定。转染Flag-E199L或空载体36h的HeLa或其基因敲除的BAK(HeLa-BAK)细胞，JC-1染色，流式细胞仪(FCM)定量。(E，F)BAK依赖性E199L诱导细胞凋亡的隧道分析。将表达GFP-E199L的质粒转染HeLa或HeLa-BAK细胞36h，共聚焦图像显示转染pEGFP-E199L的细胞(绿色)可见TUNEL阳性细胞(凋亡；橙色)，而转染pEGFP-E199L的细胞未见TUNEL阳性细胞。比例尺，10μm(E)。流式细胞仪检测HeLa-BAK细胞的相对凋亡率，并与HeLa(F)细胞进行比较。(G，H)表达E199L的HeLa细胞中Caspase-9(G)、Caspase-3/7(H)的活性。将表达GFP-E199L或GFP的质粒转染HeLa细胞36h，然后加入caspase底物。使用Enspire MultiScan测量caspase-9和caspase-3/7的活性。数据以均数±SD表示，n＝3。组间差异的显著性采用单因素方差A或学生t检验(*代表p<0。1，**代表p<0.01，*代表p<0.001)。
具体实施方式
本发明首此阐明了ASFV中的蛋白E199L在诱导细胞凋亡中的作用，这不但为我们更全面地理解病毒诱导的疾病的致病机理提供依据，而且也为促进非正常细胞凋亡的需求提供了新的手段。
本文中使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并且无意具有限制性，因为本发明的范围将仅受所附权利要求书限制。
1、一种促进细胞凋亡的组合物，该组合物包含E199L蛋白。
2、如权利要求1所述的组合物，其中所述细胞为因健康需要机体希望清除的细胞，选自肿瘤细胞、被感染细胞、变异细胞或受损细胞。
3、如权利要求1或2所述的组合物，所述组合物还可以进一步含有第二活性成分，所述第二活性成分可以是促进细胞死亡的物质或增加机体机能的物质。
4、一种肿瘤细胞生长抑制剂，该抑制剂包含E199L蛋白。
5、一种促进细胞凋亡的方法，所述方法包括使细胞与含E199L蛋白的促进细胞凋亡的组合物在体外接触，从而诱导所述细胞的凋亡。
6、一种促进肿瘤细胞凋亡的方法，所述方法包括使肿瘤细胞与含E199L蛋白的肿瘤生长抑制剂在体外接触，从而诱导肿瘤细胞的凋亡。
7、E199L蛋白在制备促进细胞凋亡的制剂中的用途。
8、如权利要求7所述的用途，其中所述细胞为因健康需要机体希望清除的细胞，选自肿瘤细胞、被感染细胞、变异细胞或受损细胞。
9、E199L蛋白在制备促进肿瘤细胞凋亡的抑制剂中的用途。
术语的解释：
本发明涉及的促进细胞凋亡的组合物，该组合物含有E199L蛋白。所述细胞一般为非正常细胞(即机体不希望的细胞或带来不利影响的细胞)，进一步所述细胞为因健康需要机体希望清除的细胞，如肿瘤细胞、被感染细胞、变异细胞、受损细胞。
本发明的促进细胞凋亡的组合物因能够清除非正常细胞，可以用于治疗疾病病症或其他异常病状如癌症、自身免疫性疾病如红斑狼疮、牛皮癣、湿疹。所述癌症包括实体癌如肺癌、肝癌、胰腺癌、直肠癌、胃癌、膀胱癌、前列腺癌、骨癌、淋巴癌等以及血液癌症如白血病、骨髓瘤等。
本发明的组合物还可以进一步含有第二活性成分，所述第二活性成分可以是促进细胞死亡的物质或增加机体机能的物质。
本发明的组合物涉及药物组合物，特别是药物组合产品，包括所示组合伴侣(第二种活性成分)和至少一种药学上可接受的载体。
本发明组合物可采用多种形式，这些包括例如液体、半固体和固体剂型，如液体溶液(可注射和不溶性溶液)、分散液或悬液、脂质体和栓剂。优选的给药模式是胃肠外如静脉内、皮下、腹膜内、肌肉内。
本发明组合物可包括治疗有效量或预防有效量的施用于受试者。
所用术语“受试者”是指哺乳动物受试者。此类动物包括但不限于猪、马、猫、狗、兔、小鼠、山羊、绵羊、非人灵长类动物和人。因此，本公开的方法被考虑用于兽医学应用以及人使用。
表述“有效量”是指有效预防、改善或治疗疾病或病症的促细胞凋亡的量。这种有效量通常将导致疾病或病症的病征、症状或其他指标的改善。
提供以下实施方案来进一步说明和解释本发明的实施方案
实施例1：材料与方法
1.1重组质粒的构建
在GenScript公司合成了94个表达ASFV编码蛋白(pCAGGS-Flag-X)和表达BCL-2家族成员(pCAGGS-HA/Flag-Y、BAK、BAX、BCL-XL、MCL-1、BCL-W、BCL-2、BCL-2A1)的质粒。利用同源重组的方法将E199L及其突变体质粒(pEGFP-E199L、pEGFP-E199L-dMTD、pEGFP-E199L-dBH3、pEGFP-E199L-dBH1、pCAGGS-HA-E199L)构建到pEGFP-C1或pCAGGS-HA载体中。所有构建的质粒均经DNA测序验证。
1.2细胞
HEK293T和HeLa细胞由本实验室保存，在37℃，5％CO2的培养箱中培养,培养基中含10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100mg/mL链霉素的。HeLa-ΔBAK及其亲本细胞购自EDIGENE公司(目录号：LS0032850802A)。
1.3抗体
本研究中使用的主要抗体是特异性TOM20(612278，BD Biosciences)，PDI(MA3-19，Thermo)，HA(3724S，细胞信号技术)，FLAG(14793S，细胞信号技术)，GAPDH(10494-1-AP，Proteintech)，ATP1A1(14418-1-AP，Proteintech)，BAK(AB32371，Abcam)，抗P72小鼠多克隆抗体(本实验室制备)。WB或IFA二抗为抗小鼠Ig G(H+L)DyLight Fisher 800标记(042-07-18-06)，800CW羊抗兔IgG(H+L)(925-32211)，LI-COR，Alexa Fluor594-羊抗鼠IgG(H+L)F(ab＝)2片段(A-24921，USA,Thermo Fisher Science)。
1.4细胞活力测定
细胞存活率测定采用CellTiter-Glo荧光细胞存活率测定法(PROMEGA)。简言之，HEK293T和HeLa细胞以1×104个/孔的密度接种于白色96孔板中12h，质粒(200ng/孔)转染36h，加入2.0试剂(25μL/孔)，1：1稀释。ATP活性用Enspire MultiScan测量。
1.5细胞凋亡或细胞死亡分析
将HEK293T细胞(1×106个/孔)接种于12孔板上培养12h，转染质粒(2μg/孔)36h后，取细胞，分别用Annexin V-FITC(0.1g/ml)和碘化丙啶(PI)(1μg/ml)或单独PI染色，用Annexin V-FITC/PI检测试剂盒(BD PharmingenTM)进行流式细胞仪检测。用BD Accuri C6Plus软件对数据进行分析。将PAMS(2×106)接种于12孔板上，用指示浓度的caspase抑制剂(z-DEVD-fmk、z-Lehd-fmk和z-IETD-fmk)(Selleck)预处理1h，然后用1moi感染ASFV。用Caspase抑制剂再次培养细胞24h，PI(1μg/ml)染色，用美国Beckman公司的FC500型流式细胞仪进行分析。
1.6共聚焦显微镜分析
转染HeLa细胞36h，4％多聚甲醛固定30min，RT条件下0.2％Triton X-100透膜10min，5％牛血清白蛋白封闭1h，用鼠抗PDI或抗Tom20一抗孵育1h，Alexa Fluor594标记的羊抗鼠IgG染色1h，RT条件下DAPI染色10min。用蔡司LSM-800激光扫描荧光显微镜(德国奥伯科臣的卡尔·蔡司股份公司)在63×物镜下对亚细胞定位进行可视化分析。所有的共焦图像至少代表了三个独立的实验。将pEGFP-E199L质粒转染HeLa细胞或与pEGFP-E199L和pDsRed-mito(作为线粒体标志物)共转染细胞(1μg/皿)，观察细胞形态和线粒体动力学变化，并与pEGFP-E199L和pDsRed-mito共转染(1μg/皿)。用蔡司LSM-800激光扫描荧光显微镜(Carl Zeiss AG，Oberkochen，德国)在63×物镜下每隔5分钟或8分钟记录细胞死亡的实时图像。
1.7TUNEL检测
采用末端脱氧核糖核酸转移酶介导的标记法(TUNEL)检测细胞凋亡状态下的DNA片段。简言之，细胞以5×105细胞密度接种于共焦玻璃培养皿中，37℃，5％CO2孵育。转染后36h，细胞用4％多聚甲醛固定30min，0.3％Triton X-100在1×磷酸盐缓冲液中渗透，TUNEL试剂(200μL/皿)37℃染色1h，。用蔡司LSM-800激光扫描荧光显微镜(德国奥伯科臣的卡尔·蔡司股份公司)检查图像。在63×物镜下，通过计数100个GFP阳性细胞中的TUNEL阳性细胞来评估DNA片段。TUNEL法至少重复3次。
1.8Co-IP和Western blotting分析
共免疫印迹和蛋白质印迹分析如前所述。详细的实验步骤如下：对于Co-IP，全细胞提取液在含有1mM PMSF和1×蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Roche)的裂解缓冲液(50mMTris-HCl，pH7.4,150mMNaCl，5mMMgCl2，1mMEDTA，1％Triton X-100，10％甘油)中裂解。然后将细胞裂解物与抗Flag微珠(Genescript)在4℃的混匀器上孵育8h。沉淀珠用细胞裂解缓冲液洗涤5次。在Western blot分析中，等量的细胞裂解物和免疫沉淀物在10-12％SDS-PAGE凝胶电泳上溶解，然后转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜(微孔)上。与一抗和二抗孵育后，用奥德赛双色红外荧光成像系统(LI-COR)对膜进行可视化。
1.9Caspase蛋白酶活性测定
将HEK293T细胞(2×104)或PAM(3×105)接种于96孔白板(康宁)上培养12h，然后将质粒(100μg/孔)转染36h。参考说明书，使用8，9，3或7(Promega)检测细胞。
1.10线粒体膜电位的测量
JC-1是一种亲脂性阳离子荧光染料，选择性地进入线粒体。当线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体基质中，并以聚合形式(红色荧光)存在。当线粒体膜电位丧失时，JC-1不能聚集在线粒体基质中，而是以单体形式(绿色荧光)存在。因此，通常用红色荧光与绿色荧光的比值来检测线粒体膜电位的变化。按照说明，我们使用Mito探针分析试剂盒(Invitgen，USA)进行了这项测试。将HeLa细胞或HeLa-BAK(5×105个/孔)接种于12孔培养板上过夜，分别转染pCAGGS-Flag-E199L和空载体于12孔培养板上。转染或感染后48h收集细胞，悬浮于终浓度为2nM的JC-1与PBS混合后，37℃孵育30min，在美国Beckman公司的FC500型流式细胞仪上，激发波长分别为488nm和633nm，用合适的荧光素荧光滤光片进行分析。Red CMXRos是一种线粒体染料，它的积累依赖于膜电位，膜电位用于标记线粒体电位的变化。将所示质粒转染HeLa细胞36h后，用/>Red CMXROS(100nM)在37℃的条件下孵育30min，在63×物镜下，用蔡司LSM-800型激光扫描荧光显微镜固定并检测。所有的共焦图像至少代表了三个独立的实验。
1.11电子显微镜成像。
如前所述，对原子核进行了透射电子显微镜(TEM)观察。制备未转染的HEK293T或转染E199L表达质粒或空载体的HEK293T。转染36h后，细胞固定并包埋。在JEM2100透射电子显微镜(日本东京JEOL)200kV下观察超薄切片。
1.12统计分析
所有统计分析均采用单因素方差分析，并使用GraphPad Prism 7软件(GraphPadSoftware Inc.)进行学生T检验。数据用平均值±标准差(SD)表示。P<0.05被认为具有统计学意义。
实施例2：ASFV E199L体外诱导细胞死亡
根据图1的结果，我们提出ASFV编码的蛋白可能参与ASFV诱导细胞死亡的过程。为了验证这一假设，将94个表达ASFV编码蛋白的质粒分别转染HEK293T细胞，然后用CellTiter-GloTM荧光细胞存活率检测。筛选结果表明，4个基因(B117L、CP123L、E183L、E199L)的过表达对细胞存活率有显著影响(图1A)。特别是，E199L诱导的细胞死亡率高达60％。因此，本研究选择E199L进行进一步研究。我们的结果表明，在感染HLJ/18分离株的PAM细胞中，E199L的mRNA水平从感染后12小时(HPI)开始显著增加(图1B)，这表明E199L是一个病毒表达的晚期基因。为进一步验证E199L诱导细胞死亡的作用，将E199L表达质粒转染HEK293T和HeLa细胞，用CellTiter-Glo荧光细胞存活率测定和PI染色检测细胞存活率。与对照组相比，E199L过表达组细胞活力显著降低(图1C)，且呈剂量依赖性(图1D)。流式细胞仪分析显示，E199L表达组PI阳性细胞数明显高于对照组(图1E)，同时E199L阳性细胞中PI标记细胞比例高达40％，高于GFP阳性细胞(图1F)。这些结果表明ASFV E199L在体外可诱导细胞死亡。
实施例3：ASFV E199L诱导的细胞死亡呈现凋亡特征
为探讨E199L在体外是否通过诱导细胞凋亡而诱导细胞死亡，采用时间推移共聚焦显微镜、TUNEL标记和Annexin V-FITC/PI染色检测细胞凋亡的形态学变化、DNA片段、磷脂酰丝氨酸(PS)外翻。用实时共聚焦显微镜观察细胞凋亡的特征性形态学变化。E199L在HeLa细胞中聚集后，细胞形态开始收缩、起泡，最终形成凋亡小体(图2A)。此外，通过TUNEL试验对凋亡诱导的DNA片段化进行了标记。过表达E199L的HEK293T细胞产生TUNEL阳性信号(图2B)，TUNEL阳性细胞比例高达60％，明显高于表达GFP的HEK293T细胞(图2C)。此外，我们还发现，转染表达E199L质粒的细胞凋亡水平高于转染空载体的细胞(图2D)。透射电镜观察到转染E199L表达质粒的HEK293T细胞胞核深染和核固缩，这是晚期凋亡的特征性变化(图2E)。、这些结果提示E199L在体外通过凋亡诱导细胞死亡。
实施例4：E199L诱导的细胞凋亡与线粒体损伤有关
线粒体和内质网(ER)是富含细胞膜的细胞器，已被广泛报道参与细胞凋亡的调节。由于E199L是一个膜蛋白，我们提出了E199L定位于线粒体还是内质网的假设。为了证实这一假设，在转染pEGFP-N1或pEGFP-E199L 36h后，用抗Tom20或PDI的免疫荧光分析检测E199L与线粒体或内质网的共定位。结果表明，E199L既不定位于线粒体，也不定位于内质网。然而，与空白对照或GFP表达的细胞相比，表达E199L的细胞中的线粒体被破坏，出现分裂，E199L的聚合物被这些线粒体分裂包围(图3A)。为了证实我们的发现，我们用实时共聚焦技术观察了过度表达E199L的细胞的线粒体动力学。我们观察到线粒体从延长分裂形成沿细胞质的网状结构到肿胀、堆积和点状、碎裂的变化，并伴随着细胞形态从收缩、起泡到最终细胞死亡的变化(图3B)。此外，我们还利用5，‘5’，6，‘6’-四氯-1，1‘，3，3’-四乙基苯并咪唑碳氰化物(JC-1)染色检测了膜电位，结果表明转染E199L表达质粒后细胞的线粒体电位明显低于空白对照载体或空载体(图3C)。然后用Mito Tracker Red染色追踪线粒体的完整性，这依赖于完整的线粒体膜电位。过度表达E199L的细胞显示Mito Tracker染色丢失，这表明E199L破坏了线粒体膜电位(图3D)。这些结果为我们提供了E199L诱导的细胞凋亡与线粒体损伤有关的线索。
实施例5：ASFV E199L与BCL-XL竞争性结合导致细胞凋亡
线粒体外膜通透性(MOMP)是由bcl-2家族蛋白(尤其是BAK和BAX)的促凋亡效应成员驱动的。BAX和BAK是几种病毒的靶点，如肠道病毒712B，鸡痘病毒蛋白FPV039，以调节细胞凋亡的进程。因此，我们测试了E199L与BAK或BAX的相互作用。结果表明，E199L不与BAK或BAX直接相互作用(图4A)。E199L与BCL-XL、MCL-1、BCL-W、BCL-2A1等抗凋亡蛋白有广泛的相互作用(图4B)。考虑到BAK或BAX的间接激活，我们提出E199L竞争性地破坏抗凋亡蛋白与BAK和/或BAX的相互作用，最终诱导细胞凋亡。我们的数据表明，E199L与BAK而不是BAX竞争结合BCL-XL(图4C)。同时，E199L依赖于BAK诱导线粒体断裂和凋亡(图4D、E和F)。此外，E199L过表达的HeLa细胞中caspase-9和caspase-3/7的活性显著高于空白对照和空载体组(P<0.01)(图4G和H)。这些结果表明，E199L与BCL-XL竞争性结合，导致细胞凋亡。
序列表
<110> 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心)
<120> E199L蛋白在促进细胞凋亡中的用途及方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 199
<212> PRT
<213> 重组蛋白()
<400> 1
Met Ser Cys Met Pro Val Ser Thr Lys Cys Asn Asp Ile Trp Val Asp
1 5 10 15
Phe Ser Cys Thr Gly Pro Ser Ile Ser Glu Leu Gln Lys Lys Glu Pro
20 25 30
Lys Ala Trp Ala Ala Ile Leu Arg Ser His Thr Asn Gln Gln Thr Ala
35 40 45
Glu Asp Asp Asn Ile Ile Gly Ser Ile Cys Asp Lys Gln Gly Leu Cys
50 55 60
Ser Lys Asp Glu Tyr Ala Tyr Ser Gln Tyr Cys Ala Cys Val Asn Ser
65 70 75 80
Gly Thr Leu Trp Ala Glu Cys Ala Phe Ala Pro Cys Asn Gly Asn Lys
85 90 95
Asn Ala Tyr Lys Thr Thr Glu Gln Arg Asn Ile Leu Thr Asn Lys Gln
100 105 110
Cys Pro Ser Gly Leu Thr Ile Cys Gln Asn Ile Ala Glu Tyr Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Asn Ile Ser Asp Leu Tyr Gln Asn Phe Asn Cys Asn Ser Val
130 135 140
Ile Asn Thr Phe Leu Ile Asn Val Met Asn His Pro Phe Leu Thr Leu
145 150 155 160
Ile Leu Ile Ile Leu Ile Leu Ile Ile Ile Tyr Arg Leu Met Ser Ser
165 170 175
Ser Gly Gly Lys His Asn Asp Asp Lys Leu Pro Pro Pro Ser Leu Ile
180 185 190
Phe Ser Asn Leu Asn Asn Phe
195

Claims (2)

1.E199L蛋白在制备促进细胞凋亡的制剂中的用途，其中所述细胞为因健康需要机体希望清除的细胞，选自肿瘤细胞、被感染细胞、变异细胞或受损细胞。
2.一种促进细胞凋亡的方法，所述方法包括使细胞与含E199L蛋白的促进细胞凋亡的制剂在体外接触，从而诱导所述细胞的凋亡，其中所述细胞为因健康需要机体希望清除的细胞，选自肿瘤细胞、被感染细胞、变异细胞或受损细胞。
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