JP2020503345A - 肺におけるインフラマソーム活性及び炎症をモジュレートする方法 - Google Patents
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Abstract
Description
[0002] 本発明は、米国政府の支援を受けてNational Institute of Neurological Disorders and Stroke(NINDS)により授与された助成金番号4R42BS086274−02のもとなされた。米国政府は、本発明における一定の権利を有する。
[0003] 本明細書とともに電子的に提出されたテキストファイルの内容は、参照により全体として本明細書に組み込まれる:配列表のコンピュータ読取可能フォーマットコピー(ファイル名:UNMI_010_01WO_SeqList_ST25.txt、記録日:2017年12月28日、ファイルサイズ2キロバイト)。
[0004] 本発明は、一般に、免疫学及び医学の分野に関する。より特定すると、本発明は、肺における炎症を産生する病態に応答して炎症を低減させるための治療として哺乳動物の肺におけるASC(カスパーゼ活性化リクルートメントドメイン(CARD)含有アポトーシス関連スペック様タンパク質(Apoptosis-associated Speck-like protein containing a Caspase Activating Recruitment Domain(CARD)))活性及びアブセントインメラノーマ2(Absent in Melanoma 2)(AIM2)インフラマソーム活性をモジュレートするための組成物及び方法に関する。
[0005] 重度外傷性脳損傷(TBI)は広範な公衆衛生上の問題であり、世界中にわたる死亡及び罹患の主因である(3)。脳への直接的損傷の他、TBIは、他の器官、例えば、肺における合併症をもたらし得る。急性肺損傷(ALI;2)は、一般的な外傷後の心肺障害であり、40%超の院内死亡率を伴う(4)。TBI患者は、特に、ALIを発症しやすく、一部の研究は30%ほども高い発生率を報告している(5)。近年の研究は、全身性炎症因子がTBI後の肺機能不全及び肺損傷をもたらし得ることを示しているが(6)、TBI誘導肺損傷の基礎となる正確な分子機序の定義は不十分のままである。
[0009] 一態様において、本明細書において、肺における炎症の治療を、それを必要とする患者において行う方法であって、インフラマソームシグナリングを阻害する薬剤を含む組成物を患者に投与し、それにより患者の肺における炎症を治療することを含む方法が提供される。一部の例において、肺における炎症は、中枢神経系(CNS)損傷、神経変性疾患、自己免疫疾患、喘息、慢性閉塞性肺疾患、嚢胞性線維症、間質性肺疾患及び急性呼吸窮迫症候群から選択される病態により引き起こされる。一部の例において、CNS損傷は、外傷性脳損傷(TBI)、脳卒中及び脊髄損傷(SCI)からなる群から選択される。一部の例において、神経変性疾患は、筋委縮性側索硬化症(ALS)、多発性硬化症(MS)及びパーキンソン病(PD)からなる群から選択される。一部の例において、組成物の投与は、患者の肺細胞におけるインフラマソーム活性の阻害をもたらす。一部の例において、組成物の投与は、対照と比較して患者の肺細胞におけるカスパーゼ−1、ヌクレオチド結合ロイシンリッチリピートピリンドメイン含有タンパク質1(nucleotide-binding leucine-rich repeat pyrin domain containing protein 1)(NLRP1)、ヌクレオチド結合ロイシンリッチリピートピリンドメイン含有タンパク質2(NLRP2)、ヌクレオチド結合ロイシンリッチリピートピリンドメイン含有タンパク質3(NLRP3)、NLRファミリーCARDドメイン含有タンパク質4(NLRC4)、カスパーゼ−11、X連鎖アポトーシス阻害タンパク質(XIAP)、パンネキシン−1、カスパーゼ活性化リクルートメントドメイン含有アポトーシス関連スペック様タンパク質(ASC)、インターロイキン−18(IL−18)、ハイモビリティーグループボックス1(HMGB1)又はアブセントインメラノーマ2(AIM2)レベルの低減をもたらし、対照は、非処理患者である。一部の例において、肺細胞は、II型肺胞細胞である。一部の例において、組成物の投与は、対照と比較して急性肺損傷(ALI)の低減をもたらし、対照は、非処理患者である。一部の例において、ALIの低減は、肺胞及び/又は間質腔中への好中球浸潤の低減、肺胞中隔肥厚の低減若しくは不存在又はそれらの組合せにより証明される。一部の例において、薬剤は、細胞外ベシクル(EV)取り込み阻害剤、インフラマソーム構成成分に結合する抗体又はそれらの組合せである。一部の例において、EV取り込み阻害剤は、化合物又は抗体であり、抗体は、表1から選択される。一部の例において、薬剤は、インフラマソーム構成成分に結合する抗体との組合せのEV取り込み阻害剤である。一部の例において、EV取り込み阻害剤は、ヘパリンである。一部の例において、ヘパリンは、エノキサパリンである。一部の例において、インフラマソーム構成成分に結合する抗体は、哺乳動物AIM2、NLRP1、NLRP2、NLRP3又はNLRC4インフラマソームの構成成分に特異的に結合する抗体である。一部の例において、インフラマソーム構成成分は、カスパーゼ−1、ASC又はAIM2である。一部の例において、インフラマソーム構成成分は、ASCである。一部の例において、抗体は、ASCタンパク質のN末端PYRIN−PAAD−DAPINドメイン(PYD)、C末端カスパーゼリクルートメントドメイン(CARD)ドメイン又はPYD若しくはCARDドメインに由来するエピトープに結合する。一部の例において、抗体は、配列番号1及び配列番号2からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも85%の配列同一性を有するタンパク質に結合する。一部の例において、抗体は、患者の肺におけるASC活性を阻害する。一部の例において、組成物は、薬学的に許容可能な担体又は希釈剤と配合される。一部の例において、組成物は、脳室内、腹腔内、静脈内投与するか、又は吸入により投与する。
定義
[0022] 特に定義のない限り、本明細書において使用される全ての技術用語は、本発明が属する分野の当業者により一般に理解されるものと同一の意味を有する。
[0049] 本明細書において、肺炎症をもたらすか、又は引き起こす病態を受けた、又はそれを患う哺乳動物の肺における炎症を低減させるための組成物及び方法が提供される。本明細書に記載の組成物及び方法は、細胞外ベシクル(EV)取り込みをモジュレートし(例えば、阻害するか、又は低減させ)、哺乳動物における肺炎症のための治療として使用される、哺乳動物インフラマソーム及び/又は化合物の少なくとも1つの構成成分(例えば、ASC)に特異的に結合する本明細書に提供される抗体又はその活性断片を含み得る。
[0062] 哺乳動物の肺における炎症を低減させる本明細書に記載の方法は、哺乳動物インフラマソーム(例えば、AIM2インフラマソーム)の少なくとも1つの構成成分(例えば、ASC、AIM2)に特異的に結合する本明細書に提供される抗体又はその活性断片を含む組成物を含む。哺乳動物の肺における炎症を治療し、及び/又は低減させるための組成物は、少なくとも1つの薬学的に許容可能な担体又は希釈剤をさらに含み得る。本明細書の方法における使用のための哺乳動物インフラマソームの構成成分に対して指向される例示的な抗体は、内容が参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第8685400号に見出されるものであり得る。
[0070] 本発明の組成物は、任意の好適な配合物で哺乳動物(例えば、げっ歯類、ヒト)に投与することができる。例えば、抗ASC抗体は、薬学的に許容可能な担体又は希釈剤、例えば、生理食塩水又は緩衝塩溶液中で配合することができる。好適な担体及び希釈剤は、投与方式及び経路並びに標準的な医薬実務に基づき選択することができる。例示的な薬学的に許容可能な担体及び希釈剤、並びに医薬配合物の説明は、本分野における標準的教本のRemington's Pharmaceutical Sciences、及びUSP/NFに見出すことができる。他の物質を組成物に添加して組成物を安定化し、及び/又は保存することができる。
[0072] 上記の組成物は、好ましくは、有効量、すなわち、治療される哺乳動物における所望の結果を産生し得る(例えば、CNSの外傷性損傷若しくは脳卒中を受け、又は自己免疫若しくはCNS疾患を有する哺乳動物のCNSにおける炎症を低減させ得る)量で哺乳動物(例えば、ラット、ヒト)に投与される。このような治療有効量は、下記のとおり決定することができる。
[0075] 本発明を以下の具体的な実施例によりさらに説明する。実施例は、説明のため提供するにすぎず、決して本発明の範囲を限定するものと解釈すべきでない。
TBI後のALIにおけるEV媒介インフラマソームシグナリングの役割及びその中和の効果
[0076] 肺機能不全は、重度外傷性脳損傷の合併症として見つかることが多い(1)。TBI対象の約20〜25パーセントが急性肺損傷(ALI)を発症する(2)が、TBI誘導ALIの病変を媒介する機序の定義は不十分のままである。従来の文献は、TBI後の肺機能不全が、心肺機能不全をもたらす頭蓋内圧の増加に対する交感神経応答に起因するという考えを支持している(42)。しかしながら、より近年の研究は、全身炎症応答もTBI誘導肺損傷における重要な役割を担うことを示している(43)。具体的には、HMGB1−RAGEリガンド受容体経路がTBI後の肺機能不全についての中枢伝達機序として機能する(8)。さらに、HMGB1は、AIM2インフラマソーム活性化を誘導する(37)。さらなる従来の文献は、病原体がDAMP、例えば、HMGB1を担持するEVを分泌し、炎症をトリガーすることを明らかにしている(Buzas et al.,2014)。種々の研究は、血液脳関門(BBB)が損傷後3〜6時間ほど早くTBI後に浸透性になり、脳及び血管内コンパートメント間の保護障壁への損傷をもたらし、タンパク質及び体液の漏出をもたらすことを示している(44)。損傷後のBBBの破壊は、炎症性メディエーター、例えば、DAMPの分泌をもたらし、それが脳炎症を促進し、遠位器官を損傷し得る(5)。いくつかの炎症性メディエーターは、明確な脳損傷のマーカーとして作用し得るが、それらの妥当性は広く認められているわけではない(45)。さらに現在、TBI誘導ALIについての臨床的に承認された治療もバイオマーカーも存在しない。近年、EVは、いくつかの異なるタイプの疾患、例として、肺損傷(46)及びTBI(47)についてのバイオマーカー研究の関心領域になっている。TBIを有する患者の脳脊髄液から単離されたEVにおいて、対照試料と比較してインフラマソームタンパク質が増加することが既に示されている(14)。本実施例において、TBI誘導ALIの病因におけるEV媒介インフラマソームシグナリングの寄与を試験した。
動物及び外傷性脳損傷
[0077] 全ての動物手順は、University of Miami Miller School of MedicineのInstitutional Animal Care and Use Committee(Animal Welfare Assurance A3224-01)により承認され、NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animalsに従って行った。本試験を実施する場合、ARRIVE指針に従った。全てのC57/BL6マウスは、8〜12週齢及び24〜32グラムであった。マウスをTBIについての実験群(疑似、4時間、24)、養子移植及び処理についての実験群(ナイーブ、疑似生理食塩水、非処理、エノキサパリン、抗ASC)にプロスペクティブにランダム化した。TBI実験群について、疑似動物は外科手術を受けたが損傷されなかった。養子移植処理試験について、疑似生理食塩水群は外科手術を受け、ビヒクル処理として生理食塩水を受容した。ナイーブ動物は、外科手術を受けなかった。検出力分析(G*検出力分析、効果量F=0.85、α設定0.05を使用)及び履歴データに基づきそれぞれの群について5〜6の試料サイズを使用した49,50。全てのマウスをUniversity of MiamiにおけるLois Pope Life Centerにおけるウイルス抗原不含(VAF)動物施設において12時間の明暗サイクルで飼育し、飼料及び水を自由摂餌として供給した。施設は、畜産的手順を週2回実施し、動物の状態を毎日確認した。動物を術後観察し、それらを加熱パッド上で保持し、体温を直腸プローブにより制御し、手術室内で体温を37℃に維持し、次いで動物飼育室に移した。
[0079] 全ての動物を灌流前にケタミン及びキシラジンにより麻酔した。次いで、動物は気管灌流を受けた。気管カテーテルを20cmのH2Oにおいて使用して肺に4%のパラホルムアルデヒド(PFA)を灌流させ、次いで4%のPFA中で4℃において一晩固定した。固定肺組織をパラフィン包埋し、5μm切片を加工した(16)。タンパク質単離及び分子分析のために右肺組織を回収した。次いで、動物は骨頭切除術を受け、タンパク質単離及び分子分析のために右皮質組織を回収した。
[0080] マウス肺組織溶解物を、5μmの低結合ポリビニリデンジフルオリド(PVDF)膜(Millipore)に通して濾過した。濾過後、上清を2,700×gにおいて8分間遠心分離した。ペレットを40μlの3[(3−コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]−プロパンスルホン酸(CHAPS)緩衝液(20mmol/LのHEPES−KOH、pH7.5、5mmol/LのMgCl2、0.5mmol/LのEGTA、0.1mmol/Lのフェニルメチルスルホニルフルオリド、プロテアーゼ阻害剤カクテル、及び0.1%のCHAPS)中で再懸濁させた。ピロプトソームを、2,700×gにおける8分間の遠心分離によりペレット化した。次いで、2.2μlのジスクシンイミジル基質(9)を有する27.8μlのCHAPS緩衝液中でペレットを再懸濁させ、室温において30分間インキュベートしてASC二量体を架橋させた。最後に、等量の2×Laemmli緩衝液を添加し、ASC及びガスダーミン−D(GSD)に対する市販の抗体を使用するイムノブロッティングによりタンパク質を分析した。
[0081] NE-PER核細胞質抽出試薬(Thermo Scientific)を製造業者の説明書に従って使用して核及び細胞質分画を抽出した。簡潔に述べると、マウス肺組織試料を、20〜100mgの小片に切断し、500×gにおいて5分間遠心分離した。組織片を細胞質抽出試薬によりホモジナイズし、16,000×gにおいて5分間遠心分離した。次いで、上清(細胞抽出物)を除去し、ペレットを核抽出試薬(Thermo Scientific)により16,000×gにおいて10分間遠心分離した。この上清は核分画に対応し、それを取り出し、−80℃において貯蔵した。
[0082] 肺及び脳組織試料を液体窒素中でスナップ冷凍し、−80℃において貯蔵した。プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤カクテル(Sigma,St Louis,MO,USA)を含有する抽出緩衝液中で右下肺及び右皮質組織の2mm切片をホモジナイズし、4〜20%のトリス−TGX Criterionプレキャストゲル(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)中で、de Rivero Vaccari et al.2015(13)に記載のとおり、カスパーゼ−1(Novus Biologicals)、ASC(Santa Cruz)、IL−1β(Cell Signaling)、IL−18(Abcam)AIM2(Santa Cruz)及びHMGB1(Millipore)に対する抗体を使用して分解した。Image Labを使用してバンド密度の定量を実施し、全てのデータをβ−アクチンに対して正規化した。
[0083] 組織切片をキシレン中で脱パラフィン化し、次いでエタノール及びトリス緩衝生理食塩水を使用して再水和した。次いで、免疫組織化学的手順を既に記載のとおり(16)、二重染色について実施した。切片を、カスパーゼ−1及びASC(Millipore)、AIM2(Santa Cruz)、HMGB1(Millipore)及びSPC(Millipore)に対する抗体と4℃において一晩インキュベートした。疑似、4時間、及び24時間マウスの免疫染色した肺切片を、Zeissレーザー走査共焦点顕微鏡(Zeiss,Inc.,Thornwood,NY,USA)により試験した。群盲検化した者により肺切片を分析した。
[0084] 全エクソソーム抽出溶液を製造業者の説明書(Invitrogen)に従って使用してTBI損傷マウス及び損傷マウスからの血清からEVを単離した。簡潔に述べると、100μlのそれぞれの試料を2000×gにおいて30分間遠心分離した。次いで、上清を20μlの全エクソソーム抽出(TEI)試薬と4℃において30分間インキュベートし、次いで10,000×gにおいて室温において10分間遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを100μlのPBS中で再懸濁させた。EVをCD81の発現により、及びNanosightトラッキング分析により特徴づけした(図6)。
[0085] C57BL−6TBI及び疑似マウスからの血清由来EVを、ナイーブC57BL−6マウス中に頸静脈を介して体重1グラム当たり1.0×1010個の粒子の用量において注射した48。粒子数をNanosightトラッキング分析により計測し、それに基づき試料を希釈した。術前、動物をケタミン及びキシレンにより麻酔した。1〜2cmの切開部を顎及び鎖骨間に作製した。頸静脈を上昇させ、拘束し、次いでカテーテルを配置した。血清由来EVを移植し、分析(n=5)のために注射の24時間後に肺及び脳組織を回収した。
[0086] TBIマウスからの血清由来EVを、ナイーブC57−BL6マウス中に頸静脈注射を介して注射した。1時間後、エノキサパリン(3mg/kg)(n=4)及び抗ASC(5mg/kg)(n=4)をレシピエント動物に投与した。以下の群を使用した:1)ナイーブ群は、処理を受容せず、2)疑似生理食塩水群は、陰性対照として使用し、生理食塩水のみの頸静脈注射を受け、3)非処理群は、いかなる処理もせずにTBIマウスからのEVを受容し、陽性対照として使用し、4)ENOX群は、TBIマウスからのEV及びエノキサパリンを受容し、並びに5)抗ASC群は、TBIマウスからのEV及び抗ASCを受容した。処理順序はランダム化した。分析のため、注射の24時間後に肺及び脳組織を回収した。処理実験において使用される抗ASC抗体は、ASCに対するヒト化モノクローナル抗体であり、ネズミ、ヒト及びブタASCを認識することを留意すべきである。
[0087] 組織学的検査、形態計測及びALIスコアリングのため、標準的なヘマトキシリン及びエオシン法により肺組織切片を染色した。American Thoracic Society Workshop Reportからの肺損傷スコアリングシステム(17)を使用して盲検病理学者により肺切片をスコアリングした。スコアリングのために20個のランダムな高倍率視野を選択した。ALIスコアリングについての基準は、肺胞腔、間質腔中の好中球の数、ヒアリン膜、空隙を満たすタンパク質性破片及び肺胞中隔肥厚に基づいた。これらの基準に基づき、0(損傷なし)〜1(重度損傷)間のスコアを付与した。
[0088] 2つの群についてのスチューデントT検定及び2つ以上の群についての一元ANOVAとそれに続くテューキー多重比較検定(GraphPad Prismバージョン7.0)を使用してデータを分析した。ダゴスティーノ・パーソン検定を使用して正規性について検定した。データを平均+/−SEMとして表現する。使用された有意性のP値は、*p<0.05であった。
重度TBIは、マウスの脳におけるAIM2インフラマソームタンパク質及びHMGB1発現を増加させる
[0089] 炎症促進性サイトカインIL−1β及びIL−18、並びにインフラマソームタンパク質の発現レベルは、流体パーカッション脳損傷後の二次損傷に関連する(18)。重度CCIが炎症促進性サイトカインのプロセシング及びインフラマソームタンパク質レベルの変更を誘導したか否かを決定するため、皮質溶解物を分析したが、重度TBIにおけるインフラマソーム活性化に対する研究が制限された。本実施例において、重度CCIの後、皮質溶解物をカスパーゼ−1(図1A、B)(p<.001)、ASC(図1A、C)(p=.003)、IL−18(図1A、D)(p=.0042)、AIM2(図1A、F)(p=0.0197)及びIL−1β(図1A、G)(p=0.0141)のレベルについて損傷の4及び24時間後において試験した。カスパーゼ−1、ASC、AIM2、及びIL−Iβのレベルは、CCIの4時間後においてピークに達し、24時間までに減少した。炎症性サイトカインの成熟の経時変化はわずかに異なったが、TBIの24時間後までにピークに達した。他者らがAIM2インフラマソームを活性化させるインフラマソームDAMP HMGB1についての役割を示しているため、それらのタンパク質のレベルも皮質溶解物において決定した。図1A、1Eに示されるとおり、CCIは、損傷の4及び24時間後においてHMGB1(図1A、1E)(p=0.0121)のレベルの有意な増加を誘導した。これらのデータは、マウスにおける重度CCIの後、AIM2インフラマソームタンパク質のレベルが損傷後の皮質において有意に上昇したことを示す。
[0090] CCIが肺におけるインフラマソーム活性化を誘導したか否かを決定するため、肺溶解物のイムノブロット分析をカスパーゼ−1(図1H、I)(p=.0026)、ASC(図1H、J)(p=.0427)、IL−18(図1H、K)(p=.0025)、IL−1β(図1H、N)(p=.0012)及びAIM2(図1H、M)(p<.001)、及びNLRP3(p=.0047)(補足図1)について実施した。カスパーゼ−1、ASC、IL−18及びAIM2のレベル増加は、疑似対照と比較して損傷の4時間及び24時間後において有意に増加した。しかしながら、タンパク質発現の増加の経時変化は、それらがCCIの24時間後においてピークに達した脳において観察されたものとわずかに異なった。HMGB1−RAGE軸がTBIが肺機能不全を誘導する機序における役割を担うため(8)、肺溶解物をHMGB1タンパク質発現のレベルについて分析した。図1H、1L(p=.0158)は、HMGB1発現がTBIの4及び24時間後において増加したことを示し、AIM2インフラマソーム及びHMGB1がTBI後の肺における炎症応答における役割を担うことを示す。
[0091] 既に示されるとおり、皮質ニューロンにおけるAIM2インフラマソームの活性化は、ピロトーシス細胞死をもたらす(19)。TBIがマウス肺組織においてピロトーシスをもたらすか否かを調査するため、肺組織中のピロプトソームをTBI後に単離した。損傷の4時間後において屠殺したTBI動物は、疑似動物と比較したASCオリゴマー化の証拠を示した(図4A)。ASC二量体、及び三量体がTBI動物において見られた(それぞれ、50、75kDA)。これらの結果は、ピロプトソーム形成を示し、それはASCオリゴマーの超分子集合により特徴づけすることができる。さらに、カスパーゼ−1の活性化時に開裂され、ピロトーシス及びIL−1βの放出をトリガーするガスダーミン−D(GSDMD)(20)は、疑似と比較してTBI動物の肺において有意に増加した(図4B及び4C)(p=0.0001)。これらの知見は、ピロトーシスがTBI後の肺組織において細胞死に寄与することを示した。
[0092] TBIは、毛細血管漏出をもたらし、血管浸透性の増加及びII型肺細胞と呼ばれる特殊化肺胞上皮細胞の損傷をもたらし得る(5)。損傷後の肺におけるインフラマソーム発現に対するTBIの細胞効果を試験するため、免疫組織化学的分析を、疑似、4時間、及び24時間損傷動物の肺切片において実施した。II型肺胞上皮細胞は、主なタイプのALIにおける損傷肺細胞であることが公知である(17)。肺切片をAIM2、カスパーゼ−1、及びASC(緑色)に対する抗体により染色し、II型上皮細胞のマーカーであるプロ−サーファクタントプロテインC(Pro−SPC、赤色)、及びDAPI核染色(青色)により同時染色した。図2A〜2Cに示されるとおり、活性カスパーゼ−1(図2A)、ASC(図2B)、及びAIM2(図2C)は、SPC陽性細胞中に存在する(矢印)。これらのインフラマソームタンパク質の免疫反応性は、TBI後に増加した。これらの知見は、インフラマソームタンパク質がII型肺胞上皮細胞中で発現されること及びTBIがそれらの細胞における免疫反応性の増加をもたらすことを示す。
[0093] TBI後の肺細胞におけるHMGB1の細胞分布を決定するため、肺ホモジネートからの核及び細胞質分画を単離した(図3A、3C)(p=.0337)。イムノブロッティングは、両方の分画がTBIの4時間後におけるHMGB1発現の有意な増加を有したことを示した(図3B、3D)(p=.0345)。HMGB1の免疫組織化学的分析も実施してTBI後の肺切片における免疫反応性の変化を決定した。切片をHMGB1(緑色)及びSPC(赤色)及びDAPI核染色(青色)について同時染色した。HMGB1の免疫反応性は、疑似と比較して4時間及び24時間において増加した。HMGB1の弱い免疫反応性がSPC陽性細胞において観察され(矢印)(図3E);したがって、損傷肺組織におけるHMGB1変化が細胞質であり得ることを示唆する。
[0094] ALIは、肺胞及び間質浮腫並びに肺胞腔中への炎症性細胞の浸潤をもたらす炎症プロセスにより特徴づけすることができる(23)。肺組織の組織病理学的分析(図5A)は、重度TBIが損傷の4及び24時間後における肺構造及び形態のかなりの変化を引き起こすことを示す。疑似動物は、正常な肺胞形態を示した一方、損傷動物は、肺胞浮腫の急激な変化を示したが、損傷の24時間後までにわずかに減少した(長矢印)。さらに、両方の時点において好中球浸潤(矢印頭部)及び肺胞毛細血管膜の形態の変化(*)の証拠が存在した。損傷動物は、間質浮腫の徴候を示し、それは損傷の4時間後においてより顕著であったが、損傷の24時間後においても依然として明らかであった(短矢印)。最後に、損傷動物は、間質区域及び肺胞中隔の肥厚の証拠も示した(ポンド、#)。
[0096] TBI後に循環中に放出され得るEV及びそれらの積み荷が肺においてインフラマソーム活性化を誘導し得る証拠を提供するため、重度CCIマウスからの血清由来EVを使用して古典的養子移植実験を実施した。EVマーカーCD81についてのウエスタンブロットを使用してEV調製物をバリデートした(図6)。対照は、疑似及びナイーブ動物から単離されたEVを受容した。図7A〜7Fに示されるとおり、活性カスパーゼ−1(図7A、7B)、ASC(図7A、7C)、IL−18(図7A、7D)、AIM2(図7A、7E)及びHMGB1(図7A、7F)は、非損傷又はナイーブマウス又はナイーブマウスからのEVを受容する動物の肺と比較してTBI損傷動物からのEVを受容した動物の肺において有意に上昇した。さらに、炎症性細胞の浸潤(矢印)は、TBIマウスからのEVにより処理された肺において明らかであった(図7G)。最後に、ALIスコアも、損傷マウスからのEVを受容した動物において有意に高かった(図7H)。これらの試験は、TBI後に循環中に放出されるEVが、ALIの病変に寄与する肺標的細胞におけるインフラマソームを活性化させる神経−呼吸器−インフラマソーム軸(neural-respiratory-inflammasome axis)についての証拠を提供した。
[0098] TBIは、より高い割合のある医学的合併症、特に肺及び中枢神経系機能不全に関連し得る。本実施例において、重度TBIは、皮質及び肺組織中でHMGB1及びインフラマソーム発現(例えば、AIM2、カスパーゼ−1及びASC発現)を増加させ、ALIと一致する肺形態の変化(例えば、肺胞及び間質腔中への好中球の浸潤、肺胞中隔肥厚、並びに肺胞浮腫及び出血)を誘導することが示され、神経細胞呼吸器炎症軸(Neural Respiratory Inflammatory Axis)の考えを導入する。重要なことに、TBIは、肺組織における(例えば、GSDMD開裂の存在下で)ピロトーシスをもたらし、II型肺胞上皮細胞におけるインフラマソームタンパク質の発現を増加させた。さらに、TBIマウスからのEVの養子移植は、インフラマソームを活性化させ、ALIを誘導し、そのことは脳損傷がインフラマソームタンパク質の積み荷を含有するEVの放出を誘導し、次いでそれがALIをもたらすことを示した。さらに、EV取り込み(エノキサパリン)及びインフラマソーム活性化(抗ASC抗体(IC100)処理)の両方の阻害により、インフラマソームタンパク質発現及びALIの発生が低減することが示された。
[00100] 以下の参照文献は、全ての目的のために参照により全体として組み込まれる。
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ヒト患者におけるTBI後のALIにおけるEV媒介インフラマソームシグナリングの役割
[0151] 実施例1におけるマウスに対する実験へのフォローアップとして、ヒト肺内皮細胞におけるインフラマソームシグナリングに対するヒトTBI患者から単離されたEVの役割を試験した。
[0154] 図10A〜10Fに示されるとおり、TBI患者からの血清由来EVの送達は、肺内皮細胞におけるインフラマソームタンパク質発現を増加させた。図10A〜10Eは、カスパーゼ−1、ASC、AIM2、及びHMGB1が、対照EVと4時間インキュベートされたPMVECと比較してTBI−EVと4時間インキュベートされたPMVECにおいて上昇することを示した。免疫アッセイ結果は、Ellaシンプルプレックスアッセイを使用してIL−1ベータ発現の有意な増加を示した(図10F)。
[0156] これらの試験は、TBI後に循環中に放出されるEVがALIの病変に寄与する肺標的細胞におけるインフラマソームを活性化させる神経細胞−呼吸器−インフラマソーム軸についてのさらなる証拠を提供した。
Claims (42)
- 肺における炎症の治療を、それを必要とする患者において行う方法であって、インフラマソームシグナリングを阻害する薬剤を含む組成物を前記患者に投与し、それにより前記患者の前記肺における前記炎症を治療することを含む方法。
- 前記肺における前記炎症が、中枢神経系(CNS)損傷、神経変性疾患、自己免疫疾患、喘息、慢性閉塞性肺疾患、嚢胞性線維症、間質性肺疾患及び急性呼吸窮迫症候群から選択される病態により引き起こされる、請求項1に記載の方法。
- 前記CNS損傷が、外傷性脳損傷(TBI)、脳卒中及び脊髄損傷(SCI)からなる群から選択される、請求項2に記載の方法。
- 前記神経変性疾患が、筋委縮性側索硬化症(ALS)、多発性硬化症(MS)及びパーキンソン病(PD)からなる群から選択される、請求項2に記載の方法。
- 前記組成物の前記投与が、前記患者の肺細胞におけるインフラマソーム活性化の阻害をもたらす、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組成物の前記投与が、対照と比較して前記患者の肺細胞におけるカスパーゼ−1、ヌクレオチド結合ロイシンリッチリピートピリンドメイン含有タンパク質1(NLRP1)、ヌクレオチド結合ロイシンリッチリピートピリンドメイン含有タンパク質2(NLRP2)、ヌクレオチド結合ロイシンリッチリピートピリンドメイン含有タンパク質3(NLRP3)、NLRファミリーCARDドメイン含有タンパク質4(NLRC4)、カスパーゼ−11、X連鎖アポトーシス阻害タンパク質(XIAP)、パンネキシン−1、カスパーゼ活性化リクルートメントドメイン含有アポトーシス関連スペック様タンパク質(ASC)、インターロイキン−18(IL−18)、ハイモビリティーグループボックス1(HMGB1)又はアブセントインメラノーマ2(AIM2)レベルの低減をもたらし、前記対照は、非処理患者である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記肺細胞が、II型肺胞細胞である、請求項5又は6に記載の方法。
- 前記組成物の前記投与が、対照と比較して急性肺損傷(ALI)の低減をもたらし、前記対照は、非処理患者である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- ALIの前記低減が、肺胞及び/又は間質腔中への好中球浸潤の低減、肺胞中隔肥厚の低減若しくは不存在又はそれらの組合せにより証明される、請求項8に記載の方法。
- 前記薬剤が、細胞外ベシクル(EV)取り込み阻害剤、インフラマソーム構成成分に結合する抗体又はそれらの組合せである、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記EV取り込み阻害剤が、化合物又は抗体であり、前記抗体は、表1から選択される、請求項10に記載の方法。
- 前記薬剤が、インフラマソーム構成成分に結合する抗体との組合せのEV取り込み阻害剤である、請求項10又は11に記載の方法。
- 前記EV取り込み阻害剤が、ヘパリンである、請求項12に記載の方法。
- 前記ヘパリンが、エノキサパリンである、請求項13に記載の方法。
- インフラマソーム構成成分に結合する前記抗体が、哺乳動物AIM2、NLRP1、NLRP2、NLRP3又はNLRC4インフラマソームの構成成分に特異的に結合する抗体である、請求項10〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記インフラマソーム構成成分が、カスパーゼ−1、ASC又はAIM2である、請求項10又は15に記載の方法。
- 前記インフラマソーム構成成分が、ASCである、請求項16に記載の方法。
- 前記抗体が、前記ASCタンパク質のN末端PYRIN−PAAD−DAPINドメイン(PYD)、C末端カスパーゼリクルートメントドメイン(CARD)ドメイン又は前記PYD若しくはCARDドメインに由来するエピトープに結合する、請求項17に記載の方法。
- 前記抗体が、配列番号1及び配列番号2からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも85%の配列同一性を有するアミノ酸に結合する、請求項17に記載の方法。
- 前記抗体が、前記患者の前記肺におけるASC活性を阻害する、請求項17〜19のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組成物が、薬学的に許容可能な担体又は希釈剤と配合される、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組成物を、脳室内、腹腔内、静脈内投与するか、又は吸入により投与する、請求項1〜21のいずれか一項に記載の方法。
- 中枢神経系(CNS)損傷を受けた患者の肺における炎症を治療する方法であって、インフラマソームシグナリングを阻害する薬剤を含む組成物を前記患者に投与し、それにより前記患者の前記肺における前記炎症を治療することを含む方法。
- 前記CNS損傷が、外傷性脳損傷(TBI)、脳卒中及び脊髄損傷(SCI)からなる群から選択される、請求項23に記載の方法。
- 前記組成物の前記投与が、前記患者の肺細胞におけるインフラマソーム活性化の阻害をもたらす、請求項23又は24に記載の方法。
- 前記組成物の前記投与が、対照と比較して前記患者の肺細胞におけるカスパーゼ−1、NLRP1、NLRP2、NLRP3、NLRC4、カスパーゼ−11、XIAP、パンネキシン−1、カスパーゼ活性化リクルートメントドメインを含有するアポトーシス関連スペック様タンパク質(ASC)、インターロイキン−18(IL−18)、ハイモビリティーグループボックス1(HMGB1)又はアブセントインメラノーマ2(AIM2)レベルの低減をもたらし、前記対照は、非処理患者である、請求項23又は24に記載の方法。
- 前記肺細胞が、II型肺胞細胞である、請求項25又は26に記載の方法。
- 前記組成物の前記投与が、対照と比較して急性肺損傷(ALI)の低減をもたらし、前記対照は、非処理患者である、請求項23〜27のいずれか一項に記載の方法。
- ALIの前記低減が、肺胞及び/又は間質腔中への好中球浸潤の低減、肺胞中隔肥厚の低減若しくは不存在又はそれらの組合せにより証明される、請求項28に記載の方法。
- 前記薬剤が、細胞外ベシクル(EV)取り込み阻害剤、インフラマソーム構成成分に結合する抗体又はそれらの組合せである、請求項23〜29のいずれか一項に記載の方法。
- 前記EV取り込み阻害剤が、化合物又は抗体であり、前記抗体は、表1から選択される、請求項30に記載の方法。
- 前記薬剤が、インフラマソーム構成成分に結合する抗体との組合せのEV取り込み阻害剤である、請求項30又は31に記載の方法。
- 前記EV取り込み阻害剤が、ヘパリンである、請求項32に記載の方法。
- 前記ヘパリンが、エノキサパリンである、請求項33に記載の方法。
- インフラマソーム構成成分に結合する前記抗体が、哺乳動物AIM2、NLRP1、NLRP2、NLRP3又はNLRC4インフラマソームの構成成分に特異的に結合する抗体である、請求項30〜34のいずれか一項に記載の方法。
- 前記インフラマソーム構成成分が、カスパーゼ−1、ASC又はAIM2である、請求項30又は35に記載の方法。
- 前記インフラマソーム構成成分が、ASCである、請求項36に記載の方法。
- 前記抗体が、前記ASCタンパク質のPYD、CARDドメイン又は前記PYD若しくはCARDドメインに由来のエピトープに結合する、請求項37に記載の方法。
- 前記抗体が、配列番号1及び配列番号2からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも85%の配列同一性を有するアミノ酸に結合する、請求項37に記載の方法。
- 前記抗体が、前記患者の前記肺におけるASC活性を阻害する、請求項37〜39のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組成物が、薬学的に許容可能な担体又は希釈剤と配合される、請求項23〜40のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組成物を、脳室内、腹腔内、静脈内投与するか、又は吸入により投与する、請求項23〜41のいずれか一項に記載の方法。
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