CN103145815B

CN103145815B - 一种从抗虫棉种子中纯化Bt毒蛋白的方法

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Publication number: CN103145815B
Application number: CN201310070417.0A
Authority: CN
Inventors: 王保民; 张亮; 曹振; 郭素琴; 谭桂玉; 南铁贵; 李召虎
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2013-03-06
Filing date: 2013-03-06
Publication date: 2014-12-31
Anticipated expiration: 2033-03-06
Also published as: CN103145815A

Abstract

本发明公开了一种从抗虫棉种子中纯化Bt毒蛋白的方法。本发明提供的从抗虫棉种子中纯化Bt Cry1Ac蛋白的方法，包括如下步骤：（1）将抗虫棉种子去壳后进行可溶性总蛋白的提取，得到溶液甲；（2）将所述溶液甲进行60%饱和度的硫酸铵沉淀，离心收集沉淀；（3）溶解步骤（2）得到的沉淀并进行透析，得到溶液乙；（4）将所述溶液乙进行免疫亲和层析，收集与抗Bt Cry1Ab/Ac蛋白的单克隆抗体特异结合的蛋白组分，即为Bt毒蛋白；所述抗Bt Cry1Ab/Ac蛋白的单克隆抗体为是由杂交瘤Bt2F9CGMCC No.5162分泌产生的单克隆抗体。本发明具有以下优点：（1）简化了纯化流程，降低了纯化成本；（2）缩短了纯化时间，减少了目的蛋白损失。

Description

一种从抗虫棉种子中纯化Bt毒蛋白的方法

技术领域

本发明属于生物化学领域，具体涉及一种从抗虫棉种子中纯化Bt毒蛋白的方法。

背景技术

苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）在形成芽孢的过程中会产生一种伴胞晶体，该晶体的主要成分是具有杀虫活性的蛋白质，被称为杀虫晶体蛋白(ICP,Insecticidal Crystal Protein)，又称Bt毒蛋白。

Bt毒蛋白可毒杀鳞翅目、双翅目、鞘翅目等昆虫，是目前世界上应用最为广泛的生物杀虫剂。虽然人畜并非Bt毒蛋白的天然靶向物种，但围绕转Bt基因作物是否对人畜和环境有害的争论从未停止。

目前研究所使用的Bt毒蛋白绝大多数来自于原核表达，由于外源基因在植物体内的表达产物可能存在复杂的翻译后修饰过程，可能会导致蛋白质在性质和功能上发生变化，所以使用原核表达的Bt毒蛋白并不能完全真实地反映转Bt基因作物的危害。

Bt Cry1Ac蛋白为Bt毒蛋白中的一种，其氨基酸序列如序列表的序列1所示，基因序列如序列表的序列2所示。

发明内容

本发明的目的是提供一种从抗虫棉种子中纯化Bt毒蛋白的方法。

本发明提供的从抗虫棉种子中纯化Bt毒蛋白的方法，包括如下步骤：

（1）将抗虫棉种子去壳后进行可溶性总蛋白的提取，得到溶液甲；

（2）将所述溶液甲进行60%饱和度的硫酸铵沉淀，离心收集沉淀；

（3）溶解步骤（2）得到的沉淀并进行透析，得到溶液乙；

（4）将所述溶液乙进行免疫亲和层析，收集与抗Bt Cry1Ab/Ac蛋白的单克隆抗体特异结合的蛋白组分，即为Bt毒蛋白；所述抗Bt Cry1Ab/Ac蛋白的单克隆抗体为是由杂交瘤Bt2F9CGMCC No.5162分泌产生的单克隆抗体。

杂交瘤Bt2F9为稳定分泌抗转基因植物中Bt Cry1Ab/Ac蛋白抗体的单克隆杂交瘤细胞株，已于2011年8月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），保藏号为CGMCC No.5162。

所述步骤（1）中，可采用pH10.5、0.01M的CAPS缓冲液提取所述可溶性总蛋白。

所述步骤（1）中，所述溶液甲的制备方法具体如下：将所述抗虫棉种子去壳并研磨成粉，然后用pH10.5、0.01M的CAPS缓冲液提取（提取温度具体可为4℃，提取时间具体可为4小时；提取过程中可用磁力搅拌器搅拌，以增加提取效率），离心（离心条件具体可为：4℃、10000rpm离心20分钟）后避开表层油脂取上部液体，即为所述溶液甲。

步骤（1）中：Bt毒蛋白是碱溶性蛋白，使用碱性溶液进行可溶性总蛋白的提取能提高Bt毒蛋白的提取效率；可溶性总蛋白的提取过程中会使种子内部的蛋白水解酶释放到溶液中，在4℃下进行可溶性总蛋白的提取，可以使蛋白酶的活性降低，提高Bt毒蛋白的提取效率；可溶性总蛋白的提取过程中使用磁力搅拌，可以混匀提取体系，防止局部蛋白浓度过高而降低蛋白质进入溶液中的速率。

所述步骤（2）中，所述“进行60%饱和度的硫酸铵沉淀”的实现方法如下：在所述溶液甲中加入硫酸铵并使其达到60%饱和度，然后冰浴放置。所述冰浴放置的时间具体可为40分钟。所述冰浴放置过程中可用磁力搅拌器搅拌。所述离心的参数具体可为：4℃、7000rpm离心20分钟。

步骤（2）中：抗体对蛋白质抗原的识别依赖于蛋白质一定的空间构象，温度较高容易使蛋白质的空间构象发生改变，从而导致不能被抗体识别，在冰浴中进行硫酸铵沉淀可以避免Bt毒蛋白的构象发生改变，减少操作造成的Bt毒蛋白损失；硫酸铵沉淀的过程中使用磁力搅拌，可以混匀沉淀体系，使硫酸铵浓度迅速均匀化。

所述步骤（3）中，可用去离子水溶解所述沉淀并用Tris水溶液调pH至10.5。所述Tris水溶液具体可为1M Tris水溶液。所述透析具体在PBS缓冲液中进行。所述透析的条件具体可为：用PBS缓冲液4℃透析6小时（每两个小时更换新的PBS缓冲液）。

步骤（3）中：使用去离子水和1M Tris水溶液溶解沉淀，去离子水中含有极微量离子，能减少盐溶性杂蛋白的溶解，使用Tris是促使溶液迅速变为碱性，有利于Bt毒蛋白的溶解。

所述步骤（4）中，所述免疫亲和层析的步骤可如下：①将所述溶液乙上样于连接有所述抗Bt Cry1Ab/Ac蛋白的单克隆抗体的免疫层析柱；②用清洗液清洗柱子，去除杂蛋白；③用洗脱液进行洗脱，收集过柱后洗脱液，即为含有目的蛋白的溶液。

所述免疫亲和层析的填充料可为CNBr-activated Sepharose4B。

所述清洗液具体可为pH2.5、0.01M的Gly-HCl缓冲液。

所述洗脱液具体可为含体积比为50%的乙二醇的pH2.5、0.01M的Gly-HCl缓冲液。

所述免疫亲和层析过程中，具体可采用4转/分的上样流速、清洗流速和洗脱流速。

所述步骤②中具体可用2倍上样体积的清洗液清洗柱子。

所述步骤③中具体可用3倍体积的洗脱液进行洗脱。

所述步骤③中具体可按1ml每管收集过柱后的洗脱液。

步骤（4）中：免疫亲和层析的原理是利用抗原与抗体特异性识别并结合的特性，使抗原吸附到结合有抗体的填料上，杂蛋白由于不能与抗体结合而随液流流出亲和层析柱，因而使目的蛋白与杂蛋白分离，再使用较为苛刻的条件破坏抗原抗体的结合力而使抗原从结合有抗体的填料上分离下来，从而达到纯化目的蛋白的目的；较慢的上样流速是为了使样品中的Bt毒蛋白能充分吸附到免疫亲和层析柱上，较慢的清洗流速是为了充分地破坏杂蛋白与抗体间的作用力，去除杂蛋白，较慢的洗脱流速是为了充分地破坏Bt毒蛋白与抗体间的作用力，使Bt毒蛋白从免疫亲和层析柱上解吸附。

所述方法中还可包括将所述过柱后洗脱液用Tris水溶液调pH至7.5的步骤。所述Tris水溶液具体可为1M Tris水溶液。

所述方法中还可包括将所述过柱后洗脱液用Tris水溶液调pH至7.5然后进行透析的步骤。所述Tris水溶液具体可为1M Tris水溶液。所述透析具体在PBS缓冲液中进行。所述透析的条件具体可为：用PBS缓冲液4℃透析6小时（每两个小时更换新的PBS缓冲液）。

低pH条件下，蛋白质的构象会发生改变，也更易降解，使用1M Tris水溶液中和过柱后洗脱液，可以减少Bt毒蛋白的在低pH条件下地降解，并有助于其保持并恢复正常的构象。

PBS缓冲液中含有足够的盐离子，可以有效地帮助Bt毒蛋白在表面形成水化层，从而有利于Bt毒蛋白在溶液中的稳定。

所述方法中还可包括将所述过柱后洗脱液用Tris水溶液调pH至7.5，然后检测其中是否含有Bt毒蛋白，最后将含有Bt毒蛋白的溶液进行透析的步骤。所述Tris水溶液具体可为1M Tris水溶液。所述透析具体在PBS缓冲液中进行。所述透析的条件具体可为：用PBS缓冲液4℃透析6小时（每两个小时更换新的PBS缓冲液）。

所述“检测其中是否含有Bt毒蛋白”的具体方法如下：

（ⅰ）用抗Bt Cry1Ac蛋白的兔多克隆包被酶标板；

（ⅱ）在步骤（ⅰ）的酶标板中加入调pH至7.5后的过柱后洗脱液，37℃温育30min；

（ⅲ）在步骤（ⅱ）的酶标板中加入辣根过氧化物酶标记的抗Bt Cry1Ac蛋白单克隆抗体，37℃温育30min；

（ⅳ）向步骤（ⅲ）的酶标板中加入底物缓冲液，室温反应15min后终止反应；

（ⅴ）在492nm下测定OD值；

（ⅵ）将对照棉花品种的叶片于研钵中研磨，用PBS缓冲液于4℃提取12小时，8000r/min4℃离心取上清，然后将上清进行上述步骤（ⅰ）至（ⅴ）；

（ⅶ）如果步骤（ⅴ）得到的OD值是步骤（ⅵ）得到的OD值的三倍以上，结果为阳性。

所述“检测其中是否含有Bt毒蛋白”的具体方法如下：

（ⅰ）将1mg/mL抗Bt Cry1Ac蛋白的兔多克隆抗体用500倍体积的包被缓冲液进行稀释后加入到酶标板中，每孔100μL，37℃温育3小时；

（ⅱ）在步骤（ⅰ）的酶标板中加入调pH至7.5后的过柱后洗脱液，每孔100μL，37℃温育30min；

（ⅲ）将1mg/mL辣根过氧化物酶标记的抗Bt Cry1Ac蛋白单克隆抗体用1000倍体积的PBS缓冲液进行稀释后加入步骤（ⅱ）的酶标板中，每孔100μL，37℃温育30min；

（ⅳ）向步骤（ⅲ）的酶标板中加入底物缓冲液，每孔100μL，室温反应15min后每孔中加入50μL2.0M硫酸水溶液终止反应；

（ⅴ）在492nm下测定OD值；

所述对照棉花品种为不含有Bt Cry1Ac蛋白的编码基因的棉花品种，具体可为棉花品种石远321。

所述抗虫棉可为转Bt Cry1Ac蛋白的编码基因的棉花，具体可为国欣棉6号。

所述Bt毒蛋白可为Bt Cry1Ac蛋白。

以上任一所述Bt Cry1Ac蛋白可为如下（a）或（b）：

（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与就有杀虫晶体蛋白活性的由序列1衍生的蛋白质。

以上任一所述Bt Cry1Ac蛋白的编码基因可为如下1）或2）或3）的DNA分子：

1）编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；

2）在严格条件下与1）限定的DNA序列杂交且编码杀虫晶体蛋白的DNA分子；

3）与1）限定的DNA序列具有90%以上的同源性且编码杀虫晶体蛋白的DNA分子。

本发明针对现有的Bt毒蛋白纯化方法十分繁琐的问题，提供了一种简便的纯化方法，具有以下优点：（1）简化了纯化流程，降低了纯化成本；（2）缩短了纯化时间，减少了目的蛋白损失。

附图说明

图1为纯化过程中的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

抗Bt Cry1Ab/Ac蛋白的单克隆抗体的制备方法：将杂交瘤Bt2F9CGMCC No.5162置于细胞培养基中，37℃培养2天，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到抗Bt Cry1Ab/Ac蛋白的单克隆抗体溶液，冻干-20℃保存。

细胞培养基的制备方法：向DMEM培养基中添加小牛血清（购自GIBCOBRL，产品目录号为26170-043）和碳酸氢钠，小牛血清的终浓度为20%（质量百分含量），碳酸氢钠的终浓度为0.2%（质量百分含量），pH为7.4。

Bt Cry1Ac蛋白：上海佑隆生物科技有限公司，产品目录编号为C010301。

棉花品种石远321：河北神农高科技股份有限公司。

国欣棉6号（转Bt Cry1Ac蛋白的编码基因的抗虫品种）的种子，购自河北省河间市国欣农研会。

如无特殊说明本实施例中所用的PBS缓冲均如下：PBS缓冲液的配方（pH7.5）：溶剂为水，含有0.02M Na₂HPO₄、0.0015M KH₂PO₄和0.14M NaCl。

实施例1、从抗虫棉种子中纯化Bt Cry1Ac蛋白

1、可溶性总蛋白的提取

将国欣棉6号的种子去壳并研磨成细粉，取10g细粉，加入100ml pH10.5、0.01MCAPS缓冲液，使用磁力搅拌器4℃搅拌提取4小时，然后4℃、10000rpm离心20分钟，避开表层油脂取上部液体，该液体即为可溶性总蛋白提取液。

2、硫酸铵沉淀

向步骤1得到的可溶性总蛋白提取液中加入硫酸铵粉末，使其在提取液中的饱和度达到60%，在冰浴中使用磁力搅拌器搅拌40分钟。

3、沉淀的复溶和透析

将完成步骤2的提取液4℃、7000rpm离心20分钟，收集沉淀；向沉淀中加入2ml去离子水，用1M Tris水溶液调pH至10.5，小心地溶解沉淀，然后转移至透析袋中，用2000ml PBS缓冲液4℃透析6小时（每两个小时更换新的PBS缓冲液）。

4、免疫亲和层析

填料：CNBr-activated Sepharose4B（购自GE公司，商品型号为17-0430-01）。

用于免疫亲和层析的抗体：抗Bt Cry1Ab/Ac蛋白的单克隆抗体。

平衡缓冲液：PBS缓冲液。

清洗液：pH2.5、0.01M的Gly-HCl缓冲液。

洗脱液：含体积比为50%的乙二醇的pH2.5、0.01M的Gly-HCl缓冲液。

流速：平衡流速为20转/分，上样流速、清洗流速和洗脱流速均为4转/分。

免疫亲和层析过程：（1）将填料和用于免疫亲和层析的抗体按照填料附带的使用说明书制备好免疫亲和层析柱，柱床体积为3.5ml；（2）用5倍柱床体积的平衡缓冲液平衡柱子；（3）上样步骤3得到的溶液；（4）用2倍上样体积的清洗液洗涤柱子，以去除杂蛋白；（5）用3倍上样体积的洗脱液进行洗脱，按1ml每管收集过柱后的洗脱液。

5、将每管过柱后洗脱液立即用1M Tris水溶液调pH至7.5。

6、采用申请号为“201210012498.4”的专利申请的实施例2的步骤一制备的试剂盒检测每管步骤5得到的溶液，方法如下：

（1）多克隆抗体的包被：将1mg/mL抗Bt Cry1Ac蛋白的兔多克隆抗体用包被缓冲液进行稀释，按照抗Bt Cry1Ac蛋白的兔多克隆抗体与包被缓冲液的体积比为1:500的比例稀释后加入到酶标板中，每孔100μL，37℃温育3小时；倒去酶标板中的溶液，用PBS缓冲液洗板4次，甩干。

（2）在步骤（1）的酶标板中加入步骤5得到的溶液，每孔100μL，对照孔加入100μL PBS缓冲液；37℃温育30min；倒掉酶标板中的溶液，用PBS缓冲液洗板4次，甩干。

（3）将1mg/mL辣根过氧化物酶标记的抗Bt Cry1Ac蛋白单克隆抗体（即酶标记抗体）用PBS缓冲液进行稀释，按照酶标记抗体与PBS缓冲液的体积比为1:1000稀释后，分别向上述步骤（2）的酶标板中加入100μL稀释后的酶标记抗体；37℃温育30min；倒掉酶标板中的溶液，用PBS缓冲液洗板4次，甩干。

（4）向步骤（3）的酶标板中分别加入100μL底物缓冲液，室温反应15min后，再向每孔中加入50μL2.0M的硫酸水溶液终止反应。

（5）在492nm下测定OD值。

（6）将棉花品种石远321的叶片于研钵中研磨，用PBS缓冲液于4℃提取12小时，8000r/min4℃离心取上清，然后将上清进行上述步骤（1）至（5）。

（7）如果步骤（5）得到的OD值是步骤（6）得到的OD值的三倍以上，结果为阳性。

7、将步骤6中检测为阳性的管中的溶液合并，转移至透析袋中，用2000ml PBS缓冲液4℃透析6小时（每两个小时更换新的PBS缓冲液）。

纯化过程中的聚丙烯酰胺凝胶电泳图见图1。图1中，泳道1对应的样本为溶液甲，泳道2对应的样本为步骤3中溶解沉淀得到的溶液，泳道3对应的样本为步骤7得到溶液，泳道4对应的样本为蛋白质marker，泳道5对应的为原核表达的Bt Cry1Ac蛋白。商购的Bt Cry1Ac蛋白与泳道3的结果一致。

回收泳道3中的目的条带并进行N端15个氨基酸残基的测序，结果表明，该目的条带确实为Bt Cry1Ab/Ac蛋白。

8、虫饲实验

去步骤7中回收的目的蛋白，用0.1%（体积比）Triton-100水溶液稀释，配成5个稀释度的稀释液（以0.1%Triton水溶液作对照），将稍小于培养皿底部的洁净甘蓝叶片浸入稀释液10秒钟后自然晾干，放入底部铺有浸湿滤纸的培养皿中，每皿接入10头三龄初期小菜蛾幼虫，置于25℃、相对湿度65%、光周期比为16:8的培养箱内，120小时后用笔轻触小菜蛾幼虫腹部末端，若其头部不能摆动，不能向前爬动则视为死亡。每个浓度设置4个重复处理组。结果表明，回收的目的蛋白对小菜蛾幼虫的LC50值为6.23mg/L。

Claims

1.一种从抗虫棉种子中纯化Bt毒蛋白的方法，包括如下步骤：

(1)将抗虫棉种子去壳后进行可溶性总蛋白的提取，得到溶液甲；

所述溶液甲的制备方法如下：将所述抗虫棉种子去壳并研磨成粉，然后用pH10.5、0.01M的CAPS缓冲液提取，离心后避开表层油脂取上部液体，即为所述溶液甲；

(2)将所述溶液甲进行60％饱和度的硫酸铵沉淀，离心收集沉淀；

(3)溶解步骤(2)得到的沉淀并进行透析，得到溶液乙；所述步骤(3)中，用去离子水溶解所述沉淀并用Tris水溶液调pH至10.5；

(4)将所述溶液乙进行免疫亲和层析，收集与抗Bt Cry1Ab/Ac蛋白的单克隆抗体特异结合的蛋白组分，即为Bt毒蛋白；所述抗Bt Cry1Ab/Ac蛋白的单克隆抗体为是由杂交瘤Bt2F9 CGMCC No.5162分泌产生的单克隆抗体；

所述免疫亲和层析的步骤如下：①将所述溶液乙上样于连接有所述抗Bt Cry1Ab/Ac蛋白的单克隆抗体的免疫层析柱；②用清洗液清洗柱子，去除杂蛋白；③用洗脱液进行洗脱，收集过柱后洗脱液，即为含有目的蛋白的溶液；

所述免疫亲和层析的填充料为CNBr-activated Sepharose 4B，所述清洗液为pH2.5、0.01M的Gly-HCl缓冲液，所述洗脱液为含体积比为50％的乙二醇的pH2.5、0.01M的Gly-HCl缓冲液；所述免疫亲和层析过程中，采用4转/分的上样流速、清洗流速和洗脱流速；

所述方法中还包括将所述过柱后洗脱液用Tris水溶液调pH至7.5然后进行透析的步骤；所述透析的条为：用PBS缓冲液4℃透析6小时，每两个小时更换新的PBS缓冲液；

所述抗虫棉为国欣棉6号。