CN102146138A - 一种抗氯霉素单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗氯霉素单克隆抗体，所述单克隆抗体对氯霉素有特异性，所述抗单克隆抗体由保藏编号为CCTCC C2010110的细胞株分泌产生。本发明提供的抗氯霉素单克隆抗体可应用于检测氯霉素残留量。本发明还提供一种检测氯霉素残留量的试剂盒，所述试剂盒含有本发明提供的抗氯霉素单克隆抗体。本发明提供的抗氯霉素单克隆抗体的质量具有很强的可控性和可重复性。并通过对所得抗体特性的初步分析及鉴定，为特异、灵敏的CAP免疫测定方法的进一步建立和应用提供了实验依据。

Description

一种抗氯霉素单克隆抗体及其应用

一、技术领域

本发明提供一种抗氯霉素单克隆抗体，特别是一种以氯霉素-牛血清白蛋白为免疫原制备得到的抗氯霉素单克隆抗体。

二、背景技术

氯霉素是一种广谱性抗生素，对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有很好的抑制作用。由于其优良的抗菌性、稳定的药性和低廉的价格，因此作为细菌性疾病的治疗药物应用于人和动物临床，并作为饲料添加剂广泛应用于畜牧业和人工水产养殖业生产。但是，氯霉素具有毒性，易引起人体血中毒，长期应用可导致再生障碍性贫血和粒细胞缺乏症。婴儿长期食用氯霉素污染的乳汁，可能会引起“灰婴综合征”。此外长期微量摄入氯霉素，不仅使大肠杆菌、沙门氏菌等产生耐药性，而且会引起机体正常菌群失调，使人们易感染各种疾病。如果氯霉素在食用动物中残留，可通过食物链传给人类，对人类的健康造成危害，因此，抗氯霉素单克隆抗体的制备对动物性食品检测以及人类健康具有重要意义。

三、发明内容

本发明的目的是提供一种抗氯霉素单克隆抗体，所述单克隆抗体对氯霉素有特异性，所述抗单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO：C2010110的细胞株分泌产生。

本发明还提供一种产生抗氯霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，保藏编号CCTCC NO：C2010110，保藏日期2010年12月30日，培养物名称：杂交瘤细胞株3G₁₂。

本发明所述的抗氯霉素单克隆抗体的制备方法为：用氯霉素人工免疫原免疫小鼠，取小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合，由间接ELISA和间接竞争ELISA两种方法结合筛选出对氯霉素有特异性的杂交瘤细胞，从杂交瘤细胞的上清液中或从注射杂交瘤细胞的动物腹水中，分离获得所述抗氯霉素单克隆抗体；所述氯霉素人工免疫抗原为氯霉素-牛血清白蛋白偶联物(CAP-BSA)，是按以下方法自制得到：

(1)氯霉素溶于乙醇，盐酸调pH值为1～2，加入锌粉，50℃～70℃温度下反应0.5～2小时，离心取上清液；所述锌粉的质量与氯霉素的质量之比为0.1～1∶1，所述乙醇的用量以氯霉素的质量计为5～50mL/g；

(2)取步骤(1)得到的上清液在0～5℃温度下，盐酸调pH值为1～2，搅拌下滴加0.1～1mol/L的NaNO₂溶液，使淀粉碘化钾试纸变灰蓝，再滴加0.1～1mol/L尿素溶液，使淀粉碘化钾试纸变浅蓝；再加0.1～1mol/L NaOH溶液调pH值为7～9，得清液作为溶液A备用；

(3)牛血清蛋白溶于pH值7.4，浓度为0.01M磷酸缓冲液中，作为溶液B；步骤(1)所述氯霉素与牛血清蛋白的物质的量之比为100～20∶1；所述磷酸缓冲液的用量以牛血清蛋白的质量计为5～50mL/g；

(4)在0～5℃温度，搅拌下将溶液A全部滴入溶液B中，同时滴加NaOH溶液保持pH值为7～9，滴完后在0～5℃下反应6～24小时，然后反应液装入截留分子量为20000的透析袋，放入0～5℃，pH7.4，浓度0.01M的磷酸缓冲液进行透析，冷冻干燥得到所述氯霉素人工免疫原。

所述间接ELISA和间接竞争ELISA筛选杂交瘤细胞按以下方法进行：用包被液将CAP-OVA抗原(氯霉素-鸡卵清蛋白偶联物)稀释，按1μg/孔包被酶标板，设置空白对照孔，37℃包被2h；PBS-T溶液浸洗三次，每孔加入200μL待测样，37℃孵育1小时；PBS-T溶液浸洗三次，每孔加入100μL用BSA溶液按1∶3000稀释的羊抗小鼠IgG-HRP，37℃孵育1小时；PBS-T溶液浸洗三次，双蒸水浸洗三次，每孔加入100μL邻苯二胺底物溶液，置于暗处反应5分钟，阳性孔变为棕黄色，每孔加入100μL 2M H₂SO₄终止反应。筛选出的阳性孔再用CAP-OVA包被的酶标板进行竞争抑制性ELISA法，先将细胞培养上清与2×10^-3M的CAP溶液等量混合，37℃感作1小时，再加入已包被的酶标板中。同时用0.01M，Ph7.4的PBS替代CAP溶液作对照，其余步骤同上。若经抑制后的OD值降至对照孔50％以下，则判为阳性孔。

本发明提供的抗氯霉素单克隆抗体可应用于检测氯霉素残留量。

本发明还提供一种检测氯霉素残留量的试剂盒，所述试剂盒含有本发明提供的抗氯霉素单克隆抗体。

本发明提供的抗氯霉素单克隆抗体的质量具有很强的可控性和可重复性。并通过对所得抗体特性的初步分析及鉴定，为特异、灵敏的CAP免疫测定方法的进一步建立和应用提供了实验依据。

四、附图说明

图1腹水抗体层析柱纯化结果图，图中1为穿透峰，2为抗体洗脱峰。

图2腹水抗体纯化中的电泳检测图，图中1为标准蛋白marker，2为腹水，3为穿透峰，4为洗脱峰。

附图3氯霉素检测浓度标准曲线。

五、具体实施方式

实施例1

1材料

1.1动物、细胞株

BALB/c小鼠，浙江省动物实验中心；F1小鼠，浙江中医药大学动物实验中心；SP2/0骨髓瘤细胞，南京凯基生物科技发展有限公司。

1.2主要仪器

层流超净台SCV-4A1，Streamline Laboratory Products；三目倒置相差显微镜ELWD0.3T1-SNCP，Nikon；二氧化碳恒温培养箱3111，Thermo Electron Corporation；HiTrap r-Protein A FF层析柱(5mL)、AKTA purifier，GE Healthcare；无菌培养板、培养瓶、培养皿、离心管，Corning公司。

1.3主要试剂

氯霉素，上海晶纯试剂有限公司；HAT培养液、HT培养液、PEG(2000D)，Sigma公司；胎牛血清，民海生物工程有限公司；RPML 1640培养液，吉诺生物医药技术有限公司；羊抗小鼠IgG-HRP，博士德生物工程有限公司。

免疫抗原CAP-BSA和检测抗原氯霉素-鸡卵清蛋白偶联物(CAP-OVA)，按以下方法合成得到；

①合成免疫抗原CAP-BSA：称取氯霉素323mg(1mmol)，溶于15ml无水乙醇，用1mol/L盐酸调pH值至1，加入锌粉300mg，65℃水浴加热50分钟，离心取上清液，冰浴，在0～5℃下，1mol/L盐酸调pH值至1，磁力搅拌，逐滴加入1mol/L NaNO₂溶液，使淀粉碘化钾试纸变灰蓝(使NaNO₂稍过量，以0.5-2s内变化为准，保持5-10分钟)。再滴加0.2mol/L尿素水溶液，直至试纸从很深的蓝色(灰蓝)变成浅蓝色。再加入0.2mol/L NaOH溶液调pH值为8，作为溶液 A备用。

称取670mg牛血清蛋白(BSA，0.01mmol)溶于10ml pH值7.4，浓度为0.01M的磷酸缓冲液中，作为溶液B。

0～5℃温度下，将溶液A边搅拌边滴加入溶液B中，同时滴加0.1mol/L的NaOH溶液，保持pH值为8，滴完后搅拌反应，0～5℃反应12小时，然后将反应液装入截留分子量为20000的透析袋，放入0～5℃，pH7.4，0.01M的磷酸缓冲液中进行透析，换液3次，总透析时间为7天，冷冻干燥保存得到氯霉素人工免疫原。

②合成检测抗原(CAP-OVA)：称取氯霉素323mg(1mmol)，溶于15ml无水乙醇，用1mol/L盐酸调pH值至1.5，加入锌粉200mg，50℃水浴加热120分钟，离心取上清液，冰浴，盐酸调pH值至1，磁力搅拌，逐滴加入1mol/L NaNO₂溶液，使淀粉碘化钾试纸变灰蓝(使NaNO₂稍过量，以0.5-2s内变化为准，保持5-10分钟)。再滴加0.1mol/L尿素水溶液，直至试纸从很深的蓝色(灰蓝)变成浅蓝色。再加入0.2mol/L NaOH溶液调pH值为7.5，作为溶液A备用。

称取2.25g鸡卵清蛋白(OVA，0.05mmol)溶于10ml pH值7.4，浓度为0.01M的磷酸缓冲液中，作为溶液B。

0～5℃温度下，将溶液A边搅拌边滴加入溶液B中，同时滴加1mol/L的NaOH溶液，保持pH值为7.5，滴完后搅拌反应，0～5℃反应8小时。然后将反应液装入截留分子量为20000的透析袋，放入0～5℃，pH7.4，0.01M的磷酸缓冲液中进行透析，换液4次，总透析时间为5天，冷冻干燥保存得到氯霉素人工免疫原。

2方法

2.1免疫取6周龄的BALB/c小鼠，用上述合成的CAP-BSA抗原淋巴免疫，每次免疫量为100μg/只，第一次免疫与等量的弗氏完全佐剂充分乳化，第二次、 第三次免疫与等量的弗氏不完全佐剂充分乳化，每次间隔7天，融合前三天腹腔直接注射100μg抗原加强免疫。

2.2细胞融合将小鼠处死，无菌摘取脾脏，研磨制取脾B淋巴细胞悬液，洗涤调整细胞浓度为(1-5)×10⁷/mL备用。将免疫脾B淋巴细胞与处于对数生长期的骨髓瘤细胞按10∶1混合后离心弃上清，缓慢加入分子质量2000D的50％PEG 1mL，间隔1min后，缓慢滴入无血清培养液，终止融合剂的作用，经洗涤去除融合剂后加入所含有HAT的细胞培养液，分种于96孔培养板孔内，每孔200μL。

2.3杂交瘤细胞的筛选在接种96孔培养板，经过1周的培养后，骨髓瘤细胞与B淋巴细胞的杂交瘤细胞即被选择培养出，然后进行单克隆化。克隆化方法用有限稀释法，一般克隆化3-4次，直至克隆细胞生长的各个孔检测100％抗体阳性为止。

2.4腹水抗体的制备用弗氏不完全佐剂0.5mL/只注射小鼠腹腔，一周后腹腔注射杂交瘤细胞5×10⁶/只，待7日后每日观察小鼠的腹部情况及精神状况，待腹部凸起，颜色变黑，小鼠精神差，即可抽取腹水，每隔1天抽取一次。

2.5间接竞争ELISA测抗体效价及阳性孔将氯霉素-卵清蛋白(CAP-OVA)抗原1μg/孔包被酶标板，设置空白对照孔，37℃包被过夜；PBS-T溶液浸洗三次，每孔加入200μL待测样，以PBS稀释，37℃孵育1小时；PBS-T溶液浸洗三次，每孔加入100μL用1％BSA溶液按1∶3000稀释的羊抗小鼠IgG-HRP，37℃孵育1小时；PBS-T溶液浸洗三次，双蒸水浸洗三次，每孔加入100μL邻苯二胺底物溶液，置于暗处反应5分钟，阳性孔变为棕黄色，每孔加入100μL 2M H₂SO₄终止反应。筛选出的阳性孔再用CAP-OVA包被的酶标板进行竞争抑制性ELISA法，先将细胞培养上清与2×10^-3M的CAP溶液等量混合，37℃感作1小时，再加 入已包被的酶标板中。同时用0.01M，Ph7.4的PBS替代CAP溶液作对照，其余步骤同上。若经抑制后的OD值降至对照孔50％以下，则判为阳性孔。

2.6抗体的纯化选择5mL HiTrap r-Protein A FF预装层析柱纯化抗体。取适量腹水，10,000r/min离心15min，取上清，经过0.22μm微孔滤膜过滤后，用20mmol/L磷酸缓冲液上样，用0.1mol/L甘氨酸-盐酸缓冲液洗脱。考察选择上样缓冲液的pH值和离子强度、洗脱缓冲液的pH值，控制样品流速。

2.7SDS-PAGE法鉴定单抗纯度分离胶浓度12％，浓缩胶浓度4％，还原状态下处理样品，电泳后用考马斯亮蓝R250染色，乙醇乙酸脱色，然后经凝胶成像系统扫描分析其纯度。

3结果

3.1CAP杂交瘤细胞株的建立

3.1.1小鼠血清抗体效价检测CAP-BSA抗原免疫的BALB/c小鼠共四只，眼眶取血检测效价。四只小鼠的血清抗体效价都达到了10^-6以上，免疫效果较好，可进行细胞融合。

3.1.2杂交瘤细胞株的建立方法2.2细胞融合后，按照方法2.3铺三块96孔板，经HAT培养液筛选后，按照方法2.5测出9个阳性孔，取上清效价最高(10^-4)的两孔细胞株(1D₁，3G₁₂)单克隆化4次，第2，3，4次单克隆时，2株细胞的阳性率均为100％。杂交瘤细胞株经14周的培养后依旧能稳定分泌单克隆抗体。经液氮冻存复苏后仍能稳定分泌抗CAP单克隆抗体。将3G₁₂杂交瘤细胞株进行保藏，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，保藏编号CCTCC NO：C2010110，保藏日期2010年12月30日。

3.2单克隆抗体的制备及其性质的鉴定

3.2.1杂交瘤细胞上清抗体效价的检测细胞上清抗体效价达到了10^-4以上

3.2.2腹水抗体效价的检测2株杂交瘤细胞株(1D₁，3G₁₂)按照方法2.4制备腹水抗体，注射小鼠腹腔产生的抗体效价均在10^-7以上。

3.3腹水抗体的纯化

将2株杂交瘤细胞株(1D₁，3G₁₂)分别制备的腹水抗体按照方法2.6进行腹水抗体纯化，在上样缓冲液pH6.5、7.0、7.5条件下，目的单抗基本保留在层析介质上。在pH7.0的上样条件下，洗脱的目的蛋白峰中杂蛋白含量较少，纯度略高。

上样缓冲液的离子强度大于4mol/L时会产生盐析效应，影响抗体的稳定性。在(0～3.0)mol/L NaCl的离子强度下，目的单抗均能较好地与层析介质结合，在3.0mol/L NaCl的离子强度下，洗脱的目的蛋白峰中杂蛋白含量较少，纯度较高。

采用pH值为3.0的0.1mol/L甘氨酸-盐酸缓冲液进行洗脱时，洗脱峰为单一峰，而且峰形较好，洗脱较完全，回收率高。

样品在各个流速下进行上样和洗脱，都可以得到较高的纯度和回收率，流速对其影响较小。因此为了提高效率，可以采用5.0ml/min的流速进行上样和洗脱。

在最优选的上样条件pH7.0，20mmol/L磷酸缓冲液+3.0mol/L NaCl，和最优选的洗脱条件pH3.0，0.1mol/L甘氨酸-盐酸缓冲液下进行腹水抗体纯化。纯化后抗体纯度为95％，回收率82％。层析结果如附图1所示。。电泳鉴定结果如附图2所示。经柱层析分别得到单克隆抗体1D1和3G12。

实施例2

氯霉素单克隆抗体的应用

动物食品中CAP残留的检测

1、标准曲线的绘制：将实施例1中获得的抗氯霉素单克隆抗体3G₁₂包被在96孔酶标板中，分别加入50μl浓度为50，25，10，5，0ng/ml的CAP标准溶液和50μl CAP-HRP酶标记物竞争底物抗体，加入邻苯二胺底物溶液显色，2M H₂SO₄终止反应，测495nm下的吸光值，绘制标准曲线，如附图3。

2、样品检测：将1ml CAP标准溶液(50，25，10，5，0ng/ml)加入5g匀浆后鲫鱼肌肉中，混匀。按氯霉素试剂盒说明书中方法提取CAP，用竞争ELISA法测CAP的量，即可在标准曲线上查其含量。

Claims (5)

1.一种抗氯霉素单克隆抗体，所述单克隆抗体对氯霉素有特异性，所述抗单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO：C2010110的细胞株分泌产生。

2.一种产生如权利要求1所述的抗氯霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，保藏编号CCTCC NO：C2010110，保藏日期2010年12月30日。

3.如权利要求1所述的抗氯霉素单克隆抗体的制备方法，所述方法为：用氯霉素人工免疫原免疫小鼠，取小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合，由间接ELISA和间接竞争ELISA两种方法结合筛选出对氯霉素有特异性的杂交瘤细胞，从杂交瘤细胞的上清液中或从注射杂交瘤细胞的动物腹水中，分离获得所述抗氯霉素单克隆抗体；其特征在于所述氯霉素人工免疫抗原为氯霉素-牛血清白蛋白偶联物，是按以下方法自制得到：(1)氯霉素溶于乙醇，盐酸调pH值为1～2，加入锌粉，50℃～70℃温度下反应0.5～2小时，离心取上清液；所述锌粉的质量与氯霉素的质量之比为0.1～1∶1，所述乙醇的用量以氯霉素的质量计为5～50mL/g；

(2)取步骤(1)得到的上清液在0～5℃温度下，盐酸调pH值为1～2，搅拌下滴加0.1～1mol/L的NaNO₂溶液，使淀粉碘化钾试纸变灰蓝，再滴加0.1～1mol/L尿素溶液，使淀粉碘化钾试纸变浅蓝；再加0.1～1mol/L NaOH溶液调pH值为7～9，得清液作为溶液A备用；

(3)牛血清蛋白溶于pH值7.4，浓度为0.01M磷酸缓冲液中，作为溶液B；步骤(1)所述氯霉素与牛血清蛋白的物质的量之比为100～20∶1；所述磷酸缓冲液的用量以牛血清蛋白的质量计为5～50mL/g；

(4)在0～5℃温度，搅拌下将溶液A全部滴入溶液B中，同时滴加NaOH溶 液保持pH值为7～9，滴完后在0～5℃下反应6～24小时，然后反应液装入截留分子量为20000的透析袋，放入0～5℃，pH7.4，浓度0.01M的磷酸缓冲液进行透析，冷冻干燥得到所述氯霉素人工免疫原。

4.如权利要求1所述的抗氯霉素单克隆抗体应用于检测氯霉素残留量。

5.一种检测氯霉素残留量的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1所述的抗氯霉素单克隆抗体。 

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