JP6391579B2 - 植物病害を治療及び防除する方法及び組成物 - Google Patents
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Description
本出願は、それらの全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする、2012年10月19日付で出願された米国仮出願第61/716,245号、及び2013年3月14日付で出願された同第61/785,535号の利益を主張する。
アメリカ政府は、テキサス州ピアス病研究及び教育プログラムに対する動植物検疫局(APHIS)協力協定賞、AgriLife Researchとの協定番号11−8500−0955−CA、及びAgriLife Researchと大塚製薬株式会社の協定番号406039に従って、本発明において一定の権利を有する。
Microsoft Windows(登録商標)オペレーティングシステムにより計測され、2013年10月17日付で作成された907キロバイトの「TAMC019WO_ST25.txt」と名前が付けられたファイルに含まれる配列表は、本明細書と共に電子出願され、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
配列番号1 X.ファスチジオーサgyrBに合わせて設計されたX.ファスチジオーサ特異的オリゴヌクレオチドフォワードプライマー。
配列番号2 X.ファスチジオーサgyrBに合わせて設計されたX.ファスチジオーサ特異的オリゴヌクレオチドリバースプライマー。
配列番号3 バクテリオファージDNAプライマーゼ遺伝子に合わせて設計されたバクテリオファージXfas304特異的オリゴヌクレオチドフォワードプライマー。
配列番号4 バクテリオファージDNAプライマーゼ遺伝子に合わせて設計されたバクテリオファージXfas304特異的オリゴヌクレオチドリバースプライマー。
配列番号5 バクテリオファージDNAプライマーゼ遺伝子に合わせて設計されたバクテリオファージXfas303特異的オリゴヌクレオチドフォワードプライマー。
配列番号6 バクテリオファージDNAプライマーゼ遺伝子に合わせて設計されたバクテリオファージXfas303特異的オリゴヌクレオチドリバースプライマー。
配列番号7 バクテリオファージDNAヘリカーゼ遺伝子に合わせて設計されたバクテリオファージXfas103特異的オリゴヌクレオチドフォワードプライマー。
配列番号8 バクテリオファージDNAヘリカーゼ遺伝子に合わせて設計されたバクテリオファージXfas103特異的オリゴヌクレオチドリバースプライマー。
配列番号9 バクテリオファージDNAヘリカーゼ遺伝子に合わせて設計されたバクテリオファージXfas106特異的オリゴヌクレオチドフォワードプライマー。
配列番号10 バクテリオファージDNAヘリカーゼ遺伝子に合わせて設計されたバクテリオファージXfas106特異的オリゴヌクレオチドリバースプライマー。
配列番号11 バクテリオファージXfas101のゲノム配列。
配列番号12 バクテリオファージXfas102のゲノム配列。
配列番号13 バクテリオファージXfas103のゲノム配列。
配列番号14 バクテリオファージXfas104のゲノム配列。
配列番号15 バクテリオファージXfas105のゲノム配列。
配列番号16 バクテリオファージXfas106のゲノム配列。
配列番号17 バクテリオファージXfas107のゲノム配列。
配列番号18 バクテリオファージXfas110のゲノム配列。
配列番号19 バクテリオファージXfas301のゲノム配列。
配列番号20 バクテリオファージXfas302のゲノム配列。
配列番号21 バクテリオファージXfas303のゲノム配列。
配列番号22 バクテリオファージXfas304のゲノム配列。
配列番号23 バクテリオファージXfas305のゲノム配列。
配列番号24 バクテリオファージXfas306のゲノム配列。
Xfas103、Xfas106、Xfas302、Xfas303、Xfas304及びXfas306の各株の代表的なバクテリオファージの寄託、並びに本明細書において上記に開示され、特許請求項の範囲において参照されるX.アクソノポディス(X. axonopodis)EC−12の代表的な細菌の寄託は、米国20108バージニア州マナサス私書箱1549に位置するATCCにより行われた。上記アクセッションに対する寄託の日は、2012年7月24日であり、上記寄託された株のアクセッション番号はそれぞれPTA−13096、PTA−13095、PTA−13098、PTA−13099、PTA13100、PTA13097、及びPTA−13101である。上記寄託に対する全ての制限は、特許査定により除外され、上記寄託は、37C.F.R.第1.801節〜第1.809節の全ての要求を満たすと意図される。上記寄託は、30年間、又は最後の請求から5年、又は特許の有効期間のいずれか長いものの間受託機関に維持され、必要に応じてその期間中に交換される。
培地、培養条件及び細菌株
本実施例は、X.ファスチジオーサ及びキサントモナス種に対して毒性のバクテリオファージの単離、増殖、並びに形態学的特性評価及びゲノム特性評価を記載する。この研究で使用される培地は、X.ファスチジオーサの成長に使用される、急速な成長を可能とするが、バクテリオファージの感染能力に影響を及ぼす標準培地とは異なる。Hill及びPurcell(Phytopathology 85(12):1368-1372, 1995)によって改変されるように最終ウシ血清アルブミン含有量が0.3%であること以外は、PW−Mと名付けられた、Sherald et al.(Plant Disease 67:849-852, 1983)によって改変されたPWブロス培地を、X.ファスチジオーサ単離物の成長に使用した。固体培地(PW−MA)及び軟寒天用に、PW−Mブロスを15g/l及び7.5g/lのPlant Cell Culture Tested agar(Sigma)でそれぞれ補正した。非X.ファスチジオーサ培養物の日常的な維持のため、複合培地TNブロス(TNB)を使用した。固体培地(TNA)は、KNO3を欠き、20g/L寒天を追加したこと以外は、同一であった。軟寒天重層用にTN培地を7.5g/L寒天(TNSA)で補正した。植物抽出物を平板培養して菌総数を得るため、TNA培地をシクロヘキシミド(40μg/ml;TNAC)で補正した。全ての培養物を28℃で成長させ、液体培養物を、ネフェロフラスコを使用してλ=600nmでモニターした。研究に含まれるカリフォルニアX.ファスチジオーサ単離物としては、X.ファスチジオーサ亜種ファスチジオーサを代表するTemecula(XF15)、X.ファスチジオーサ亜種サンディ(sandyi)を代表するAnn1(XF108)、及びX.ファスチジオーサ亜種マルチプレックス(multiplex)を代表するDixon(XF102)が挙げられる(Hendson et al., Applied and Environmental Microbiology 67(2):895-903, 2001)。テキサスX.ファスチジオーサ単離物としては、それぞれプラタナス・オシデンタリス(Platanus occidentalis)(XF1)、ヘリアンツス・アナス(Helianthus annuus)(XF5)、アイバ・アンヌア(Iva annua)(XF18)、ブタクサモドキ(Ambrosia psilostachya)(XF23)、ラティビダ・コルムニフェラ(Ratibida columnifera)(XF37)、ヴィティス・アエスティバリス(Vitis aestivalis)(XF39)、ヴィティス・マスタンゲンシス(Vitis mustangensis)(XF41)からの単離物、アンブロシア・トリフィダ(Ambrosia trifida)変種テキサナ(texana)(XF16、40、及び43)からの3種類の単離物、キョウチクトウ(Nerium oleander)(XF93及び95)からの2種類の単離物、及びヴィティス・ヴィニフェラ(Vitis vinifera)(XF48、50、52、53、54、56、58、59、60、66、67、70、71、76、及び78)からの15種類の単離物が挙げられる。全ての単離物は、ストリーク(streak:画線)単離法により精製された単一コロニーであり、最終濃度の20%グリセロール(v/v)までPW−Mブロス培養物を補正した後に−80℃で保存した。X.ファスチジオーサ単離物を、以前に記載されるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)分析(Hernandez-Martinez et al., Plant Disease 90(11):1382-1388, 2006)を使用して種及び亜種のレベルで確認した。ガスクロマトグラフィー(GC−FAME)により脂肪酸メチルエステルを分析するMIDI Sherlock(商標)Microbial Identification Systemを使用してキサントモナス種を同定した。
植物試料の加工及び細菌の単離
テキサス州のブラゾス郡及びワシントン郡のブドウ園からヴィティス・ヴィニフェラ、V.マスタンゲンシス(V. mustangensis)及び草の植物試料を得た。テキサス州のジェファーソン郡及びワートン郡の水田からコメ(オリザ・サティバ(Oryza sativa))植物組織及び草を得た。テキサス州ボーモントのTexas AgriLife Research Centerから種もみ試料を得た。テキサス州ブラゾス郡においてバラ植物由来の試料(バラ属の1種;ノックアウト)及びハラペーニョ(TAM−mild;カプシカム・アンナム(Capsicum annuum))を得た。植物抽出物を得るため、10gの植物組織を乳鉢と乳棒とを使用して50mlのバクテリオファージバッファー(P−バッファー;50mM Tris−HCl pH7.5、100mM NaCl、8mM MgSO4)中ですりつぶし、ボルテックスを行い、二層のチーズクロスで濾して大きな粒子を除去した。その後、X.ファスチジオーサ及び非X.ファスチジオーサ細菌の単離のため、抽出物をそれぞれPW−M及びTNACの両方に希釈平板法を行い、28℃でインキュベートした。10日目まで毎日、成長に関してプレートを評価した。
植物試料からのバクテリオファージの単離、精製及び力価測定
植物組織濾過物(PTF)を得るため、清澄植物抽出物を、2回遠心分離し(10000×g、4℃にて10分間)、その組織抽出物を、0.22μmフィルター(Supor、Pall Life Sciences)を通して濾過した。PTF中のバクテリオファージの存在を、一連のX.ファスチジオーサ及びキサントモナス種の宿主の重層上に10μlの10倍希釈系列をスポッティングし、菌叢の発生後(X.ファスチジオーサ単離物については6日間〜7日間、キサントモナス種単離物については18時間)のゾーン又はプラークの形成について観察することにより直接求めた。代替的には、バクテリオファージを、各濾過物1mlを20mlのX.ファスチジオーサ単離物の活発な成長培養物(4日間培養物;A600=0.30)又はキサントモナス種宿主のA600=0.25(4時間)培養物に添加することにより、PTFより富化した。X.ファスチジオーサ又はキサントモナス種の富化について、それぞれ72時間又は24時間の成長の後、培養物を遠心分離し(10000×g、4℃で10分間)、濾過滅菌(0.22μmフィルター)した。富化した上清中のバクテリオファージの存在を判定するため、10μlの10倍希釈系列を、一連のX.ファスチジオーサ及びキサントモナス種の宿主の重層上にスポットし、ゾーン又はプラークの形成を観察した。PW−MA上で成長させたX.ファスチジオーサ単離物の5日目の培養物を使用して、PW−Mブロス(A600=0.5)中の宿主懸濁液を作製し、一方、培地TNA上で成長させたキサントモナス種単離物の18時間培養物を使用してTNブロス(A600=0.5)中の懸濁液を作製し、重層の作製に使用した。バクテリオファージ活性に関して細菌上清を調査するために使用する軟寒天重層を、100μlの細菌懸濁液と7mlの溶解したPW−M又はTN軟寒天とを混合し、PW−MAプレート又はTNAプレート上に混合物を注いで、凝固させ乾燥させることにより作製した。プラーク又は透明ゾーンの形成のいずれかを示すスポットした重層を、PTF希釈物を重層する前に個々の宿主指標懸濁液と直接混合したこと以外は、上述の通り平板培養することによって更に調査した。X.ファスチジオーサ又はキサントモナス種の宿主重層のいずれかに形成された個々のプラークを切り取り、P−バッファー中に懸濁して力価測定を行った。この手順を3回繰り返して単一のプラーク単離物を得た。高力価溶菌物(1×1010PFU/ml)を、5mlのP−バッファーを用いて融合溶菌を呈するプレートの重層を回収し、軟寒天重層をふやかし、遠心分離(10000×g、4℃で15分間)により溶菌物を清澄にし、0.22μmフィルターを通して濾過滅菌することにより調製した。溶菌物を4℃で保存した。
廃水からのバクテリオファージの富化
テキサス州地域のブライアンの処理施設から、清澄にした廃水試料を得た。スティルクリーク、カータークリーク、ターキークリーク、及びバートンクリークの施設から試料を得た。試料を2回遠心分離(10000×g、4℃で10分間)、組織抽出物を、0.22μmフィルターを通して濾過した。各濾過物1mlを上述の選択した宿主の活発な成長培養物20mlに添加することによりファージを富化した。X.ファスチジオーサ又はキサントモナス種の富化のため、それぞれ72時間及び24時間の成長の後、培養物を遠心分離して濾過滅菌した。富化した濾過物を、上述のように重層上にスポットして力価測定を行った。
CsCl精製
Beckman L8−70M超遠心機において60Ti型ローターを使用する遠心分離(90000×g、5℃で2.5時間)により、濾過滅菌したバクテリオファージ懸濁液を濃縮した。ペレットをP−バッファーに再懸濁し、25℃にて2時間、1μg/mlの最終濃度でDNaseI及びRNaseA(Sigma)を用いて処理した。最終濃度0.75g/mlでCsClをバクテリオファージ懸濁液に添加し、VTi65.2ローターにおいて遠心分離(300000×g、5℃にて18時間)した。視認することができたバクテリオファージバンドを、18ゲージシリンジ針を使用して抽出し、1M NaClに補正したP−バッファー対して4℃で一晩、P−バッファーに対して25℃で4時間2回に亘って透析し、1×1011PFU/mlの懸濁液を得た。CsCl精製バクテリオファージを4℃で保存した。
透過型電子顕微鏡法
P−バッファーで希釈し、新たにグロー放電ホルムバール炭素被覆グリッド上に1分間に亘って5μlを塗布することにより、CsCl精製バクテリオファージ(1×1011PFU/ml)の電子顕微鏡法を行った。その後、グリッドを脱イオン水滴上で簡単に洗浄し、2%(w/v)水性酢酸ウラニルで染色した。100KVの加速電圧で操作するJEOL 1200EX透過型電子顕微鏡上で被検査物を観察した。
平板効率及び宿主域
同種(増殖性)宿主に対して得られたバクテリオファージプラーク力価に対する異種(非増殖性)宿主を用いて得られたバクテリオファージプラーク力価の比を計算することによって、平板効率(EOP)を得た。固体培地上に重層する前に、100μlのバクテリオファージストック希釈物と、軟寒天(7ml)中の個々の宿主指標懸濁液(A600=0.5)とを混合することによる適切な培地を使用して、X.ファスチジオーサ又はキサントモナス種宿主のいずれかに対してバクテリオファージストックの力価を測定した。
Xfas吸着部位の予備同定
植物組織又は廃水試料のいずれかから得られた又は富化されたX.ファスチジオーサファージがX.ファスチジオーサ上にプラークを形成したという観察に基づき、細胞表面成分が吸着部位として働くことができるかどうかを判定することを目的とした。ファージの既知の吸着部位として、OmpA及びOmpF等の表面タンパク質、グラム陰性細菌の細菌LPSのコア及びO鎖、性線毛及びIV型線毛、並びに鞭毛が挙げられる。野生型、及びIV型線毛を欠く誘導体をもたらすpilAの欠失を伴う誘導突然多様体を、Xfasファージの宿主として評価した。試験した全てのバクテリオファージはXF15野生型株上にプラークを形成したが、XF15ΔpilA突然多様体上にはプラークを形成しなかった。結果は、IV型線毛がXfasファージに対する付着の主な部位である可能性を示唆した。
バクテリオファージDNA単離及びゲノムシークエンシング
Promega Wizard DNA clean−upキット(Promega)の変型を使用して、濾過滅菌した高力価(1×109PFU/ml超)CsCl精製バクテリオファージ溶菌物10ml〜20mlからバクテリオファージゲノムDNAを調製した。簡単には、10ml〜20mlのバクテリオファージ溶菌物を、各DNaseI及びRNaseA(Sigma)10μg/mlを用いて37℃で30分間消化し、10%(w/v)ポリエチレングリコール8000及び1M NaClの存在下で4℃にて16時間〜20時間沈殿させた。沈殿物を10000×gにて4℃で10分間遠心分離し、ペレットを0.5mlのP−バッファーに再懸濁した。Wizardキットにより供給される1mlのDNA精製樹脂を、再懸濁したバクテリオファージに添加し、ミニカラムに充填して2mlの80%(v/v)イソプロパノールで洗浄した。80℃まで予備加熱した100μlの水を添加し、直後にミニカラムの遠心分離により樹脂からDNAを溶出した。0.8%アガロースゲル上で泳動し、エチジウムブロミドで染色することによりDNAの完全性を確認し、バンドデンシトメトリーによりDNAを定量した。1%アガロースゲル(Pulsed−Field agarose、BioRad)上でのゲノムDNAのパルスフィールドゲル電気泳動(PFGE)分析及びサイズマーカー(MidRange Marker I、NEB)との比較によりバクテリオファージゲノムサイズを推定した。
Xfasファージのゲノム分析、並びにXfas100及びXfas300ファージタイプの説明
溶原性コロニーを感染症から単離できず、テンペレートな生活様式(リプレッサー、インテグラーゼ)と関連する遺伝子がゲノム配列中に見出されないことから、キサントモナスEC−12並びにX.ファスチジオーサ及び亜種を攻撃する能力について単離されたファージは、いずれも感染にIV型線毛を必要とし、いずれも毒性である。上記ファージは、Casjens et al.(Research in Microbiology, 159:340-348, 2008)により定義される2つのファージタイプに更に分類され得る。
バクテリオファージXfas304を使用するブドウ蔓における移動、チャレンジ感染及び保護の研究
バクテリオファージXfas304は、ポドウイルス科のメンバーであり、X.ファスチジオーサ及びキサントモナス種の両方を含む宿主域を有する環境試料から単離された。ここで提示される研究では、バクテリオファージを用いた植物の処理が後のX.ファスチジオーサによる感染を予防し得るかどうかを判定するため、感受性宿主の不在下でブドウ蔓においてXfas304の移動及び持続性を求めた。さらに、上記バクテリオファージがピアス病の発症を治療的に防除し得るかどうかを判定するため、最初にX.ファスチジオーサで接種したブドウ蔓を、その後、バクテリオファージXfas304を用いて病原体接種の4週間後にチャレンジ感染に供した。
細菌及びバクテリオファージを用いたブドウ蔓の接種
バクテリオファージ処理の治療評価のため、15本の蔓(それぞれ2つの垣根)をXファスチジオーサ株XF15又はXF54で接種した。接種に使用した細菌懸濁液を分光光度的に調整した(A600=0.4;1×109CFU/ml)。3組の蔓から同様の位置にある3つの節(例えば、1/1a、1/1b、1/1c)からのqRT−PCR結果の平均を使用してCFU/グラム植物組織(gpt)及びPFU/gptを求めた。Hopkins(Plant Dis. 89:1348-1352, 2005)によって記載される針接種技法を使用して40μlの細菌懸濁液により、反対側の第2及び第3の結節の間(1つの垣根当たり2点)で個々の垣根を接種した。同じプロトコルに従ってリン酸バッファーを用いて対照蔓を模擬接種した。病原体の接種の4週間後、各処理に由来する15本の蔓を、同じ接種プロトコル及び技法を使用して40μlのバクテリオファージXfas304懸濁液(1×1010PFU/ml)を用いチャレンジ感染した。12週間に亘って週2回、症状の発症について蔓を採点し、以下に記載されるように接種時、並びに8週目、10週目及び12週目にX.ファスチジオーサ及びバクテリオファージについて三連でアッセイした。予防的な方法でバクテリオファージが作用するかどうかを判定するため、9本の蔓(それぞれ2つの垣根)を上記と同じ接種プロトコル及び接種技法を使用して40μlのバクテリオファージXfas304で接種した。バクテリオファージ接種後4週目において、上記と同じ接種プロトコルを使用して40μl(A600=0.4;1×109CFU/ml)の株XF15を用いて蔓をチャレンジ感染した。
試料採取及び加工
各蔓に由来する二連の垣根を5〜6の節に分け、下から上に節に番号を付した。各節を20mm×115mmのジェネレータ(米国コネチカット州のPRO Scientific)を備えたPRO250ホモジナイザーを使用し、15mlのP−バッファー(50mM Tris−HCl、pH7.5、100mM NaCl、8mM MgSO4)中でホモジナイズし、滅菌チーズクロス(米国、Fisher Scientific)を通して濾過して植物組織残屑を除去した。バクテリオファージをアッセイするため、濾過物を遠心分離し(10000×gで15分間)、濾過滅菌した。濾過物をバクテリオファージDNA抽出に使用した。細菌DNA抽出用にペレットを1mlのMilli−Q水に再懸濁すること以外は、同じプロトコルを細菌アッセイについて使用した。
試料のプロピジウムモノアジド(PMA)処理
Nocker(J Microbiol Meth 67:310-20, 2006)により記載されるPMAプロトコルを使用して、アッセイ用及び蔓組織抽出物をアッセイするための標準曲線を作製するために使用されるアッセイからX.ファスチジオーサの死細胞を排除した。簡単には、PMA(カリフォルニア州ヘイワード、Biotium Inc.)を20%のジメチルスルホキシド(ドイツのSigma-Aldrich)に溶解して、20mMのストック溶液を得て、暗所に−20℃で保存した。1.25μlの容量のPMAストック溶液を500μlのX.ファスチジオーサ細胞懸濁液(A600=0.4;1×109CFU/ml)又は対照及び接種した蔓に由来する抽出物に添加した。調製物を繰り返しひっくり返しながら5分間暗所で透明な微量遠沈管中でインキュベートした。インキュベーションに続き、微量遠沈管を氷上に置き、20cmの距離で1分間、650Wのハロゲン光源(米国のUshio)に曝露した。遠沈管を15秒毎に手で簡単に回転し、光照射(illumination)の30秒後にひっくり返して、利用可能なDNAの完全な架橋及び遊離PMAのヒドロキシアミノプロピジウムへの転化を確実にした。光誘導性架橋の後、遠心分離(12000×g、25℃で2分間)により生存細胞を採取し、500μlの滅菌蒸留水で洗浄し、DNA抽出のためMili−Q水に再懸濁した。
リアルタイムPCRを使用するX.ファスチジオーサ及びバクテリオファージXfas304の検出
SYBR−greenベースリアルタイムPCR(RTPCR)は、7500 Real−Time PCR System(米国カリフォルニア州のApplied Biosystems)でgyrBに合わせて設計されたX.ファスチジオーサ特異的プライマーINF2 5’−GTTTGATTGATGAACGTGGTGAG−3’(配列番号1)及びINR1 5’−CATTGTTTCTTGGTAGGCATCAG−3’(配列番号2)(Bextine and Child, FEMS Microbiology Letters 276: 48-54, 2007)、並びにDNAプライマーゼ遺伝子に合わせて設計されたバクテリオファージXfas304特異的プライマー304−PrimF 5’−AAGAAGCGTGGTTTGTTTGC−3’(配列番号3)及び304−PrimR 5’−CTACCGGCTTCCCTAACTCC−3’(配列番号4)を使用して実施した。1つの反応当たり、10μlのExpress SYBR GreenER SuperMix(Invitrogen)、0.4μlの両プライマー(10μMの濃度)、8.56μlの滅菌分子グレード水、0.04μlのROX参照色素(Invitrogen)、及び1μlのDNAテンプレートを使用して、マスターミックスを作製した。全ての反応について、95℃で3分の最初の変性工程、その後、40サイクルの以下のパラメーター:95℃で30秒、55℃で30秒、及び72℃で30秒による標準条件を使用した。PCRの最後に、0.5℃/10秒の速度で温度を72℃から99℃に上昇させ、10秒毎に蛍光発光を計測した。各DNA試料を三連で分析した。陽性対照として、上述の方法を使用してDNAをX.ファスチジオーサ細胞、及びバクテリオファージXfas304溶菌物から抽出した。ベースラインよりも蛍光発光が上がるPCRサイクル数を説明するサイクル閾値(Ct)を、Applied Biosystemsにより提供されるソフトウェアパッケージを使用して求めた。
溶原菌形成アッセイ研究
ファージ溶原菌形成についてアッセイするため、ファージ感染の生存細胞(survivors)をプロファージの存在について試験した。各ファージについて、細菌を約3のインプットMOIで感染させ、軟寒天重層法で平板培養した。コロニー成長に関してプレートをモニターした(X.ファスチジオーサ株Temeculaについては10日間〜15日間、キサントモナス株EC−12については2日間〜3日間)。出現した個々のコロニーを選択し、精製し(3回)、軟寒天重層において同じファージの希釈物のスポッティングによりファージ感受性について再度試験した。その後、Xfas103及びXfas106ヘリカーゼ遺伝子、又はXfas303及びXfas304プライマーゼ遺伝子に特異的なプライマー対(表5)を使用して、ファージ非感受性単離物中のプロファージ配列の存在について試験した。野生型細菌DNAを陰性対照として使用し、ファージDNAが添加された野生型細菌DNAを陽性対照とした。
溶原性の可能性を検査するため、X.ファスチジオーサ株Temecula及びキサントモナス株EC−12のそれぞれ40個のファージ非感受性単離物を、ファージXfas103、Xfas106、Xfas303又はXfas304によるチャレンジ感染の後に回収した。ファージ特異的プライマーを使用するPCRは、耐性単離物においてファージ溶原菌の存在を検出せず、耐性は溶原性によるものではないことを示した。さらに、未熟な溶原性の可能性を、高MOIでの感染の使用及び生存の計測(Gill et. al (2011))により調査した。表4に示されるように、感染後に、予測された生存細胞と実際の生存細胞との間に有意差はなく、高MOIでのファージ感染は阻止の確立をもたらさなかったことを示した。併せると、これらの結果は、溶原性又は阻止に関して何らの痕跡もないことを示し、4種のファージが毒性であるという結論を支持する。
ファージカクテルの保護及び予防の研究
細菌株、ファージ、及び接種調製物:本研究で使用した細菌単離物は、X.ファスチジオーサ株Temecula(XF15)及びXF54(実施例3を参照されたい)であった。X.ファスチジオーサの培養物を、実施例1に記載されるPW−M上で維持した。XF15及びXF54の接種菌液を実施例11に記載されるように調製した。Xfas303、Xfas304、Xfas103及びXfas106の高力価ファージ溶菌物(1×1010PFU/ml)を、実施例3に記載されるように調製し、力価測定を行った。ファージカクテルを各々4種のファージを混合することにより調製し、カクテル中の各ファージについて1×1010PFU/mlの最終濃度を得た。
ヨコバイによるX.ファスチジオーサの伝染
ヨコバイ(GWSS)、ホマロジスカ・ビトリペニス(Homalodisca vitripennis)は、X.ファスチジオーサを伝染する木質部を摂食するヨコバイ類である。GWSSは、南カリフォルニア及びテキサス州のブドウ生育地域全体で流行している。GWSSによるX.ファスチジオーサ又はファージの取り込みを調査するため、3つの試験において48時間に亘って実験室で育てられたX.ファスチジオーサを伴わないGWSSにX.ファスチジオーサ又は毒性ファージXfas304のいずれかを有するカウピー(ビグナ・ウンギィクラタ亜種ウンギィクラタ(Vigna unguiculata subsp. unguiculata))植物を与えた。GWSSの細菌又はファージを植物に伝染する能力を判定するため、細菌又はファージを有するGWSSに細菌又はファージを含まない植物を与えた。細菌を有するGWSSのサブセットに、48時間又は96時間に亘ってファージを有する植物を与えることによりチャレンジ感染させた。GWSS及び植物を全ての実験において個別にアッセイし、qRTPCRを使用して細菌及び/又はファージの取り込み、伝染又は持続性を評価した。GWSSはX.ファスチジオーサ及び/又はファージを取り込んで伝達することができた。X.ファスチジオーサを有し、ファージでチャレンジ感染されたGWSSでは、ファージXfas304の力価は、X.ファスチジオーサを伴わないGWSSで観察された力価と比較して2倍増加した。ファージXfas304でチャレンジ感染した場合、チャレンジ感染しなかったものと比較して、GWSSにおいて細菌集団の2倍の減退が観察された。GWSSは、X.ファスチジオーサ及び/又はファージを植物へと伝染した。これは、GWSSによるファージ伝達の最初の報告であると考えられる。
キサントモナス・アクソノポディス病原型シトリに対するファージ活性
以前の研究はミカン類潰瘍病の防除に対するファージの使用を評価したが、何らの決定的なデータもファージの毒性の特徴を確認しなかった(Balogh et al., Plant Disease, 92:1048-1052, 2008)。毒性で非形質導入ファージのみを持続可能なファージ生物防除系の評価及び実行に使用すべきである。それぞれ、ポドウイルス科(Xfas303)及びシホウイルス科(Xfas103)の代表的な2種の完全に特性評価された毒性ファージに対するフロリダから得られた3種のXac分野の株(North 40、Block 22、Fort Basinger)の感受性を試験した。結果は、試験した3種のXac株は、ファージXfas303にのみ感受性であったことを示す(図12)。ファージXfas303は、試験した3種のXac株上で透明プラークを形成することができた。Xfas303ゲノムに対して454パイロシークエンシングを行い、予測した遺伝子を完全にアノテートした(annotated)。T7及びKMV(Dunn et al., J. Mol. Biol. 166:477-53521, 1983; Lavigne et al., Virology 312:49-59, 2003)等の毒性ファージの指標である、単一サブユニットRNAポリメラーゼ(SSRNAP)の存在が見出された。さらに、上記細菌においてpilAのインフレーム欠失突然多様体を作製することにより、キサントモナス亜種株EC−12のIV型線毛がファージXfas303に対する主な受容体部位であることを特定した。ファージXfas303及びファージXfas103はいずれも吸着して株EC−12上に透明プラークを形成するが、ΔpilA誘導体には形成せず、EC−12又はEC−12ΔpilA上のファージXfas303の平板培養に関する結果のみを示す。また、IV型線毛は、ファージXfas303に対する主な受容体部位あるため、このファージが感染に必要な異なる第2の受容体部位を有し得るか、又はファージDNAが制限されることを特定した。結果は、開発したXac非依存性の手法は、平板効率(EOP 0.75)を損なわずにXacに対して毒性のファージを単離するのに使用され得ることを示す。
XacにおけるIV型線毛の発現に関する証拠
文献における報告は、感染過程におけるIV型線毛の発現及び役割、並びにXacの病因と矛盾する(Brunings et al., Mol. Plant. Pathol. 4:141-57, 2003; Li et al., PLoS ONE6:e21804, 2011; Yang et al., Curr. Microbiol. 48:251-61, 2004)。上記に提示される結果は、ファージの吸着及び感染を促進するために線毛を縮めなければならないため、試験した3種全てのXac株は機能性のIV型線毛を発現することを示す。光学顕微鏡研究を使用することにより、上記3種のXac株を、機能性のIV型線毛の指標である単攣縮運動性(twitching motility)について評価した。シュードモナス・アエルギノーザ(Pseudomonas aeruginosa)株PAO1及びキサントモナス亜種株EC−12を陽性対照として使用し、E−12ΔpilAを陰性対照として使用した。3種のXac株(North 40、Block 22及びFort Basinger)を単攣縮運動性について評価した。PAO1、EC−12、及び3種のXac株は、単攣縮運動性を呈したのに対し、EC−12ΔpilAは単攣縮運動性を呈しなかった。顕微鏡研究は、ファージ感受性試験により得られた結果を確認し、3種のXac株がファージXfas303に対する吸着部位として作用する機能性IV型線毛を有することを示した。結果は、IV型線毛がXacにより発現されるという他者(Brunings et al., Mol. Plant. Pathol. 4:141-57, 2003; Li et al., PLoS ONE 6:e21804, 2011; Yang et al., Curr. Microbiol. 48:251-61, 2004)の観察を確認する。
PTA−13096
PTA−13097
PTA−13098
PTA−13099
PTA−13100
PTA−13101
Claims (34)
- 植物においてキシレラ・ファスチジオーサ(Xylella fastidiosa)によって引き起こされる症状又は病害を予防又は軽減する方法であって、該植物と、その宿主域にキシレラ・ファスチジオーサ及び/又はキサントモナスを含むXfas100ファージタイプのバクテリオファージ及びXfas300ファージタイプのバクテリオファージからなる群から選択される毒性バクテリオファージとを接触させることを含み、前記Xfas100ファージタイプが、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、及び配列番号18からなる群から選択される配列と99%以上同一のDNA配列を有するゲノムを含み、又は前記Xfas300ファージタイプが、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、及び配列番号24からなる群から選択される配列と99%以上同一のDNA配列を有するゲノムを含む、
方法。 - 接触が、バクテリオファージ粒子を前記植物に導入することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記植物が、ブドウ蔓、柑橘類、アーモンド、コーヒー、アルファルファ、キョウチクトウ、オーク、モミジバフウ、アメリカハナズオウ、ニレ、モモ、アンズ、プラム、ブラックベリー、クワ、又はチタルパ・タシュケンテンシス植物である、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記接触が、注入により、媒介昆虫により、注入し根系を介した送達により、スプレーにより、噴霧により、又は植物と散布接触する(dust contacting)ことにより、バクテリオファージを植物に導入することを含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記媒介昆虫がヨコバイである、請求項4に記載の方法。
- 前記植物に導入される前記バクテリオファージの数が1PFU/ml〜1×1012PFU/mlである、請求項2〜5のいずれか一項に記載の方法。
- キシレラ・ファスチジオーサ及び/又はキサントモナス種に対して毒性のある2株、3株、4株、5株又は6株のバクテリオファージを前記植物に同時に又は順次導入する、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Xfas100ファージタイプがXfas103及びXfas106からなる群から選択される少なくとも1種のバクテリオファージであり、該Xfas300ファージタイプがXfas302、Xfas303、Xfas304及びXfas306からなる群から選択される少なくとも1つのバクテリオファージであり、前記ファージタイプが、ファージXfas103、ファージXfas106、ファージXfas302、ファージXfas303、ファージXfas304、及びファージXfas306に対してそれぞれ、ATCCアクセッション番号PTA−13096、PTA−13095、PTA−13098、PTA−13099、PTA−13100、及びPTA−13097により寄託されている、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 植物への送達用に製剤化された植物病害の生物防除組成物であって、前記組成物が、少なくとも1種の担体、及びXfas100ファージタイプのバクテリオファージ、及びXfas300ファージタイプのバクテリオファージからなる群から選択される少なくとも1種のバクテリオファージを含み、前記Xfas100ファージタイプが、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、及び配列番号18からなる群から選択される配列と99%以上同一のDNA配列を有するゲノムを含み、又は前記Xfas300ファージタイプが、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、及び配列番号24からなる群から選択される配列と99%以上同一のDNA配列を有するゲノムを含み、前記バクテリオファージがキシレラ・ファスチジオーサ及びキサントモナス種に対して毒性である、植物病害の生物防除組成物。
- 前記Xfas100ファージタイプのバクテリオファージがXfas103ファージ及びXfas106ファージからなる群から選択される少なくとも1種のバクテリオファージであり、前記Xfas300ファージタイプのバクテリオファージがXfas302ファージ、Xfas303ファージ、Xfas304ファージ及びXfas306ファージからなる群から選択される少なくとも1種のバクテリオファージであり、前記ファージタイプの代表試料が、ファージXfas103、ファージXfas106、ファージXfas302、ファージXfas303、ファージXfas304、及びファージXfas306に対してそれぞれ、ATCCアクセッション番号PTA−13096、PTA−13095、PTA−13098、PTA−13099、PTA−13100、及びPTA−13097により寄託されている、請求項9に記載の植物病害の生物防除組成物。
- 前記Xfas100ファージタイプのバクテリオファージが、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、及び配列番号18からなる群から選択されるDNA配列を有するゲノムを含み、前記Xfas300ファージタイプのバクテリオファージが、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、及び配列番号24からなる群から選択されるDNA配列を有するゲノムを含む、請求項10に記載の植物病害の生物防除組成物。
- 注入、スプレー、噴霧又は散布を介して植物に導入するために製剤化されると更に定義される、請求項9〜11のいずれか一項に記載の組成物。
- キシレラ・ファスチジオーサ及びキサントモナス種に対して毒性のある単離されたバクテリオファージであって、前記バクテリオファージがXfas100ファージタイプのバクテリオファージ、及びXfas300ファージタイプのバクテリオファージからなる群から選択される少なくとも1種のバクテリオファージを含み、前記Xfas100ファージタイプが、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、及び配列番号18からなる群から選択される配列と99%以上同一のDNA配列を有するゲノムを含み、又は前記Xfas300ファージタイプが、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、及び配列番号24からなる群から選択される配列と99%以上同一のDNA配列を有するゲノムを含む、バクテリオファージ。
- 前記バクテリオファージが、
ATCCアクセッション番号PTA−13096、PTA−13095、PTA−13098、PTA−13099、PTA−13100、及びPTA−13097により寄託されている、請求項13に記載の単離されたバクテリオファージ。 - 前記ファージが配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、及び配列番号18の群から選択されるDNA配列を有するゲノムを含み、又は前記ファージが配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、及び配列番号24の群から選択されるDNA配列を有するゲノムを含む、請求項13に記載の単離されたバクテリオファージ。
- 植物においてキサントモナス・アクソノポディス(Xanthomonas axonopodis)病原型シトリによって引き起こされる症状又は病害を予防又は軽減する方法であって、該植物と、キサントモナス・アクソノポディス病原型シトリに対して毒性のバクテリオファージと接触することを含み、前記バクテリオファージがXfas300ファージタイプであり、
前記Xfas300ファージタイプの毒性バクテリオファージが、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、及び配列番号24からなる群から選択される配列と99%以上同一のDNA配列を有するゲノムを含む、方法。 - 接触が、バクテリオファージ粒子を前記植物に導入することを含む、請求項16に記載の方法。
- 前記植物が、シトラス(Citrus)属の1種、フォーチュネラ(Fortunella)属の1種、ポンキルス(Poncirus)属の1種、ライム、レモン、オレンジ、グレープフルーツ、ポメロ、又は台木に使用されるカラタチのハイブリッドである、請求項16に記載の方法。
- 前記バクテリオファージが、注入により、若しくは媒介昆虫により植物へと導入されるか、又は注入により、スプレーにより、噴霧により、若しくは植物に散布することにより根系を介して送達される、請求項16に記載の方法。
- 前記媒介昆虫がヨコバイである、請求項19に記載の方法。
- 前記植物に導入される前記バクテリオファージの数が1PFU/ml〜1×1012PFU/mlである、請求項17に記載の方法。
- 植物集団において、キサントモナス・アクソノポディス及びその病原型と関連する症状を予防又は軽減するために植物集団と前記バクテリオファージ粒子とを接触することを含むと規定される、請求項16に記載の方法。
- 前記Xfas300ファージタイプが配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、及び配列番号24からなる群から選択されるDNA配列を含むゲノムを含む、請求項16〜22のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Xfas300ファージタイプのゲノムが配列番号21を含む、請求項23に記載の方法。
- 前記バクテリオファージが、Xfas302、Xfas303、Xfas304及びXfas306からなる群から選択される少なくとも1種のバクテリオファージであり、前記バクテリオファージのXfas302、Xfas303、Xfas304及びXfas306の代表試料が、ATCCアクセッション番号PTA−13098、PTA13099、PTA−13100、及びPTA−13097により寄託されている、請求項16〜24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記毒性バクテリオファージがXfas303であり、その試料がATCCアクセッション番号PTA−13099により寄託されている、請求項25に記載の方法。
- キシレラ・ファスチジオーサをその宿主域に含む毒性バクテリオファージを増殖する方法であって、(a)前記毒性バクテリオファージをキサントモナス細菌の培養物に感染させる工程、(b)前記バクテリオファージを増殖させる工程、及び(c)前記培養物から毒性バクテリオファージ粒子を単離する工程を含む、方法であって、前記毒性ファージが、Xfas100ファージタイプのバクテリオファージ及びXfas300ファージタイプのバクテリオファージからなる群から選択される毒性バクテリオファージを含み、前記Xfas100ファージタイプが、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、及び配列番号18からなる群から選択される配列と99%以上同一のDNA配列を有するゲノムを含み、又は前記Xfas300ファージタイプが、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、及び配列番号24からなる群から選択される配列と99%以上同一のDNA配列を有するゲノムを含む、
方法。 - 前記バクテリオファージが、植物、廃水、及び/又は土壌水から単離された、請求項27に記載の方法。
- 前記キサントモナス細菌の培養物が、ATCCアクセッション番号PTA−13101により寄託されたキサントモナス株EC−12を含む、請求項27に記載の方法。
- 前記バクテリオファージの成長のため寒天重層の使用を更に含む、請求項27に記載の方法。
- キシレラ・ファスチジオーサ及び/又はキサントモナス細菌と、毒性バクテリオファージの集団を含む試料とを接触すること、並びに該集団から該キシレラ・ファスチジオーサ及び/又はキサントモナス細菌を溶菌することが可能な少なくとも第1のバクテリオファージを単離することを含み、第1のバクテリオファージが、Xfas100ファージタイプのバクテリオファージ及びXfas300ファージタイプのバクテリオファージからなる群から選択される毒性バクテリオファージであり、前記Xfas100ファージタイプが、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、及び配列番号18からなる群から選択される配列と99%以上同一のDNA配列を有するゲノムを含み、又は前記Xfas300ファージタイプが、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、及び配列番号24からなる群から選択される配列と99%以上同一のDNA配列を有するゲノムを含む、ピアス病に対する候補となる生物防除剤を得る方法。
- 前記試料が、植物、廃水、及び/又は土壌水から単離された、請求項31に記載の方法。
- キシレラ・ファスチジオーサ及び/又はキサントモナス細菌宿主の培養重層上の毒性バクテリオファージのゾーン又はプラークの形成を検出することを更に含む、請求項31に記載の方法。
- 前記Xfas100ファージタイプが、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、及び配列番号18からなる群から選択されるDNA配列を有するゲノムを含み、又は前記Xfas300ファージタイプが、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、及び配列番号24からなる群から選択されるDNA配列を有するゲノムを含む、請求項1に記載の方法。
Applications Claiming Priority (5)
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