ES2774291T3 - Métodos y composiciones para el tratamiento y control de enfermedades vegetales - Google Patents

Abstract

Un metodo para prevenir o reducir los sintomas o la enfermedad causados por Xylella fastidiosa en una planta, que comprende: poner en contacto dicha planta con al menos un bacteriofago virulento para Xylella fastidiosa y especies de Xanthomonas seleccionadas del grupo que consiste en bacteriofagos del tipo de fago Xfas100 y bacteriofagos del tipo de fago Xfas300, en donde el tipo de fago Xfas100 muestra las siguientes caracteristicas: (a) el bacteriofago puede lisar dichas bacterias Xylella fastidiosa y Xanthomonas; (b) el bacteriofago infecta una celula mediante su union a un pilus de Tipo IV; (c) el bacteriofago comprende una cola no contractil y un tamano de capside que varia de 55-77 nm en diametro, con una morfologia tipica de la familia Siphoviridae; y (d) el tamano genomico del bacteriofago es de 55.500 pb a 56.200 pb; y en donde ademas el tipo de fago Xfas300 muestra las siguientes caracteristicas: (e) el bacteriofago puede lisar dichas bacterias Xylella fastidiosa y Xanthomonas; (f) el bacteriofago infecta una celula mediante su union a un pilus de Tipo IV; (g) el bacteriofago comprende una morfologia tipica de la familia Podoviridae caracterizada por una cola no contractil con un tamano de capside que varia de 58-68 nm en diametro; y (h) el tamano genomico del bacteriofago es de 43.300 pb a 44.600 pb; en donde (i) el tipo de fago Xfas100 comprende un genoma con una secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17 y SEQ ID NO:18; o el tipo de fago Xfas300 comprende un genoma con una secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID 22, SEQ ID NO:23 y SEQ ID NO:24; o donde (ii) dicho bacteriofago virulento es al menos un bacteriofago seleccionado del tipo de fago Xfas100 y/o el tipo de fago Xfas300, en donde el tipo de fago Xfas100 es al menos un bacteriofago seleccionado del grupo que consiste en: Xfas103 y Xfas106; y el tipo de fago Xfas300 es al menos un bacteriofago seleccionado del grupo que consiste en: Xfas302, Xfas303, Xfas304 y Xfas306; en donde dichos tipos de fagos se han depositado con los numeros de registro de ATCC PTA-13096, PTA-13095, PTA-13098, PTA-13099, PTA- 13100 y PTA-13097, respectivamente, para los fagos Xfas103, Xfas106, Xfas302, Xfas303, Xfas304, y Xfas306.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos y composiciones para el tratamiento y control de enfermedades vegetales

Campo de la invención

La invención se refiere al campo de la fitopatología. Más específicamente, la invención se refiere a métodos y composiciones para aislar bacteriófagos y para el tratamiento de enfermedades vegetales causadas por Xylella fastidiosa y Xanthomonas axonopodis que comprenden el uso de un bacteriófago, un virus de bacterias.

Antecedentes de la invención

Las bacterias pueden causar muchas enfermedades en las plantas, que incluyen la enfermedad de Pierce de la vid y el cancro de los cítricos de las plantas de cítricos. Las bacterias infectan los tejidos vegetales y pueden causar marchitez, crecimiento deficiente, lesiones en los frutos e incluso la muerte de la planta. La infección puede ocurrir a través de su propagación por el viento, la lluvia, el equipo contaminado o los insectos vectores, propagándose rápidamente a otras plantas y dando como resultado efectos nocivos para la planta y pérdidas masivas de los cultivos. El tratamiento eficaz de estas enfermedades requiere un método de tratamiento de la planta para eliminar las bacterias.

Breve descripción de la invención

En un aspecto, la presente invención proporciona un método para propagar un bacteriófago virulento (fago) que incluye a X. fastidiosa en su rango de huéspedes, que comprende infectar un cultivo de bacterias Xanthomonas con el bacteriófago, permitir que el bacteriófago se propague y aislar partículas de bacteriófago virulento del cultivo, particularmente en donde el cultivo de bacterias Xanthomonas comprende la cepa EC-12 de Xanthomonas depositada con el número de registro de ATCC PTA-13101. En otra realización, el bacteriófago infecta la célula mediante su unión a un elemento de la superficie celular. En otra realización, el elemento de la superficie celular es un pilus de Tipo IV. En otra realización, el bacteriófago comprende un bacteriófago con cola del grupo que consiste en un podófago, un sifófago y un miófago. En otras realizaciones, el bacteriófago se aísla del medio ambiente, una planta de tratamiento de aguas residuales, o vertidos, una planta o una superficie de la misma o del suelo circundante. En otras realizaciones de la presente invención, se usa un huésped sustituto para enriquecer el bacteriófago virulento. En otra realización adicional, el bacteriófago es virulento en Xylella fastidiosa. En otras realizaciones, se usa una capa de agar para el cultivo del bacteriófago.

En el presente documento se describe además un método para obtener un agente de biocontrol candidato para la enfermedad de Pierce que comprende poner en contacto las bacterias X. fastidiosa y Xanthomonas con una muestra que comprende una población de bacteriófago virulento y aislar al menos un primer bacteriófago de la población que puede lisar dichas bacterias X. fastidiosa y Xanthomonas. En una realización, el bacteriófago infecta una célula mediante su unión a un elemento de la superficie celular. En otra realización, el elemento de la superficie celular es un pilus de Tipo IV. En otra realización adicional, el elemento de la superficie celular se requiere para la patogénesis/virulencia del huésped bacteriano. Otras realizaciones incluyen poner en contacto un crecimiento en césped de al menos una de X. fastidiosa y Xanthomonas con la muestra, poner en contacto X. fastidiosa y Xanthomonas con la muestra de manera simultánea, y poner en contacto X. fastidiosa y Xanthomonas con la muestra de manera secuencial. En otras realizaciones, el bacteriófago se aísla del medio ambiente, una planta de tratamiento de aguas residuales, o vertidos, una planta o una superficie de la misma o del suelo circundante. En otra realización, el bacteriófago usado es virulento en Xylella fastidiosa. El método puede comprender además detectar células huésped bacterianas lisadas, o la formación de placas de lisis, después de poner en contacto la bacteria huésped con el bacteriófago virulento. En realizaciones particulares, el método comprende una placa con capa de agar o una placa de las células huésped bacterianas en las que se ha introducido una muestra de bacteriófago.

En otras realizaciones, el bacteriófago se prepara mediante el uso de una capa de agar blando que contiene X. fastidiosa y Xanthomonas, y en realizaciones adicionales, los lisados de las placas con fago de alto título se preparan mediante la cosecha de una o más placas con capa que comprenden una cepa de X. fastidiosa o una cepa de Xanthomonas, tal como EC-12, que exhiben lisis confluente, seguido de maceración y clarificación por centrifugación. Después de esterilizarse por filtración, los lisados resultantes pueden almacenarse, por ejemplo, a 4 °C. Posteriormente, los lisados de fago de alto título se purifican, por ejemplo por centrifugación isopícnica en CsCl, y la solución de fago extraída se dializa. El bacteriófago purificado con CsCl resultante típicamente muestra un título de alrededor de 1 X 1011 UFP/ml.

En algunas realizaciones, una relación de bacteriófago en filtrados de tejido vegetal (PTF, por sus siglas en inglés) es de alrededor de 1 ml de PTF para 20 ml del huésped sustituto (cultivo en crecimiento activo del huésped seleccionado) durante 4 días para la cepa Temecula de X. fastidiosa o durante 4 h para la cepa EC-12 de Xanthomonas.

Otro aspecto de la invención proporciona un método para prevenir o reducir los síntomas o la enfermedad asociados con X. fastidiosa en una planta, que comprende poner en contacto dicha planta con al menos un bacteriófago virulento para X fastidiosa y especies de Xanthomonas seleccionado del grupo que consiste en bacteriófagos del tipo de fago Xfas100 y bacteriófagos del tipo de fago Xfas300, en donde el tipo de fago Xfas100 muestra las siguientes características: (a) el bacteriófago puede lisar dichas bacterias Xylella fastidiosa y Xanthomonas; (b) el bacteriófago infecta una célula mediante su unión a un pilus de Tipo IV; (c) el bacteriófago comprende una cola no contráctil y un tamaño de cápside que varía de 55-77 nm en diámetro, con una morfología típica de la familia Siphoviridae; y (d) el tamaño genómico del bacteriófago es de 55.500 pb a 56.200 pb; y en donde además el tipo de fago Xfas300 muestra las siguientes características: (e) el bacteriófago puede lisar dichas bacterias Xylella fastidiosa y Xanthomonas; (f) el bacteriófago infecta una célula mediante su unión a un pilus de Tipo IV; (g) el bacteriófago comprende una morfología típica de la familia Podoviridae caracterizada por una cola no contráctil con un tamaño de cápside que varía de 58-68 nm en diámetro; y (h) el tamaño genómico del bacteriófago es de 43.300 pb a 44.600 pb; en donde (i) el tipo de fago Xfas100 comprende un genoma con una secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste en Se Q ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17 y SEQ ID NO:18; o el tipo de fago Xfas300 comprende un genoma con una secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID 22, SEQ ID NO:23 y SEQ ID NO:24; o donde (ii) dicho bacteriófago virulento es al menos un bacteriófago seleccionado del tipo de fago Xfas100 y/o el tipo de fago Xfas300, en donde el tipo de fago Xfas100 es al menos un bacteriófago seleccionado del grupo que consiste en: Xfas103 y Xfas106; y el tipo de fago Xfas300 es al menos un bacteriófago seleccionado del grupo que consiste en: Xfas302, Xfas303, Xfas304 y Xfas306; en donde dichos tipos de fagos se han depositado con los números de registro de ATCC PTA-13096, PTA-13095, PTA-13098, PTA-13099, PTA-13100 y PTA-13097, respectivamente, para los fagos Xfas103, Xfas106, Xfas302, Xfas303, Xfas304 y Xfas306.

Los síntomas o la enfermedad asociados con X. fastidiosa pueden comprender los síntomas típicos de la enfermedad de Pierce (PD, por sus siglas en inglés), en donde las hojas muestran una apariencia amarilla o roja a lo largo de los márgenes, con eventual necrosis de los márgenes foliares. En una realización, las partículas de bacteriófago pueden introducirse en la planta. En una realización, la planta se selecciona del grupo que consiste en una planta de vid, una planta de cítrico, almendro, cafeto, de alfalfa, de adelfa, roble, liquidámbar, ciclamor, olmo, melocotonero, de albaricoque, ciruelo, de zarzamora, morera y Chitalpa tashkentensis. En otra realización, los bacteriófagos se introducen a la planta mediante inyección, un insecto vector o se suministran por medio del sistema radicular mediante inyección. En otras realizaciones, la inyección comprende una aguja o un sistema sin aguja, un sistema neumático de inyección por aire o presión. En otras realizaciones, la inyección se realiza manualmente, o una vez, o más de una vez. En otra realización, el insecto vector es una chicharrita de alas cristalinas. En otra realización, el bacteriófago a introducir en la planta es de 1 a 1012 UFP/ml (unidades formadoras de placas de lisis/ml), 104 a 1011 UFP/ml y 107 a 1010 UFP/ml. En otra realización, las partículas de bacteriófago se obtienen mediante un método que comprende infectar un cultivo de bacterias Xanthomonas con el bacteriófago, permitir que el bacteriófago se propague y aislar las partículas de bacteriófago del cultivo. En otra realización, el método comprende poner en contacto una población de plantas con las partículas de bacteriófago para prevenir o reducir los síntomas asociados con X. fastidiosa.

En otro aspecto, la invención proporciona una composición de biocontrol de enfermedades vegetales formulada para el suministro a una planta, la composición comprende al menos un portador, tal como un diluyente, adyuvante o tensioactivo, y al menos un bacteriófago del tipo de fago Xfas100 o el tipo de fago Xfas300 en donde dicho bacteriófago es virulento para Xylella fastidiosa y especies de Xanthomonas, y en donde el tipo de fago Xfas100 muestra las siguientes características: (a) el bacteriófago puede lisar dichas bacterias Xylella fastidiosa y Xanthomonas; (b) el bacteriófago infecta una célula mediante su unión a un pilus de Tipo IV; (c) el bacteriófago comprende una cola no contráctil y un tamaño de cápside que varía de 55-77 nm en diámetro, con una morfología típica de la familia Siphoviridae; y (d) el tamaño genómico del bacteriófago es de 55.500 pb a 56.200 pb; y en donde además el tipo de fago Xfas300 muestra las siguientes características: (e) el bacteriófago puede lisar dichas bacterias Xylella fastidiosa y Xanthomonas; (f) el bacteriófago infecta una célula mediante su unión a un pilus de Tipo IV; (g) el bacteriófago comprende una morfología típica de la familia Podoviridae caracterizada por una cola no contráctil con un tamaño de cápside que varía de 58-68 nm en diámetro; y (h) el tamaño genómico del bacteriófago es de 43.300 pb a 44.600 pb; en donde el bacteriófago del tipo de fago Xfas100 comprende un genoma con una secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17 y SEQ ID NO:18, y el bacteriófago del tipo de fago Xfas300 comprende un genoma con una secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23 y SEQ ID NO:24; particularmente en donde dicha composición se define además como formulada para la introducción a una planta mediante inyección, pulverización, nebulización o aplicación de polvo.

En una realización, el bacteriófago del tipo de fago Xfas100 es al menos un bacteriófago seleccionado del grupo que consiste en los fagos Xfas103 y Xfas1106, y el bacteriófago del tipo de fago Xfas300 es al menos un bacteriófago seleccionado del grupo que consiste en los fagos Xfas302, Xfas303, Xfas304 y Xfas306; en donde muestras de dichos tipos de fagos se han depositado con los números de registro de ATCC PTA-13096, PTA-13095, PTA-13098, PTA-13099, PTA-13100 y PTA-13097, respectivamente, para los fagos Xfas103, Xfas106, Xfas302, Xfas303, Xfas304 y Xfas306 y, preferentemente, la composición se define además como formulada para la introducción a una planta mediante inyección, pulverización, nebulización o aplicación de polvo. En otra realización, la composición se define además como formulada para la administración tópica a una planta.

En el presente documento se describe además un método para obtener un agente de biocontrol candidato para el cancro de los cítricos que comprende poner en contacto bacterias Xanthomonas axonopodis pv. citri con una muestra que comprende una población de bacteriófago virulento y aislar al menos un primer bacteriófago de la población que puede lisar dichas bacterias Xanthomonas axonopodis. En una realización, el bacteriófago infecta una célula mediante su unión a un elemento de la superficie celular. En otra realización, el elemento de la superficie celular es un pilus de Tipo IV. En otra realización adicional, el elemento de la superficie celular se requiere para la patogénesis/virulencia del huésped bacteriano. Otras realizaciones incluyen poner en contacto un crecimiento en césped de Xanthomonas con la muestra. En otra realización, el bacteriófago usado es virulento en Xanthomonas axonopodis.

Otro aspecto de la invención proporciona un método para prevenir o reducir los síntomas o la enfermedad asociados con Xanthomonas axonopodis pv. citri en una planta, que comprende poner en contacto una planta con un bacteriófago virulento para Xanthomonas axonopodis pv. citri, en donde el contacto comprende preferentemente introducir el bacteriófago a la planta, y en donde el bacteriófago es del tipo de fago Xfas300, en donde el bacteriófago del tipo de fago Xfas300 muestra las características: (a) el bacteriófago puede lisar dichas bacterias Xanthomonas; (b) el bacteriófago infecta una célula mediante su unión a un pilus de Tipo IV; (c) el bacteriófago comprende una cola no contráctil con un tamaño de cápside que varía de 58-68 nm en diámetro, una morfología típica de la familia Podoviridae; (d) el tamaño genómico del bacteriófago es de 43.300 pb a 44.600 pb, (e) el bacteriófago previene o reduce los síntomas asociados con el cancro de los cítricos en una planta o plantas; en donde el bacteriófago del tipo de fago Xfas300 comprende un genoma que comprende una secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23 y SEQ ID NO:24, particularmente SEQ ID NO:21; o en donde el bacteriófago es al menos un bacteriófago seleccionado del grupo que consiste en: Xfas302, Xfas303, Xfas304 y Xfas306, en donde muestras de Xfas302, Xfas303, Xfas304 y Xfas306 se han depositado con los números de registro de ATCC PTA-13098, PTA13099, PTA-13100 y PTA-13097. En una realización, las partículas de bacteriófago pueden introducirse a la planta, y la planta es una Citrus spp., una Fortunella spp., una Poncirus spp., un limero, un limonero, un naranjo, un toronjo, un pomelero e híbridos de naranja trifoliada usados para portainjertos. En otra realización, los bacteriófagos se introducen a la planta mediante inyección, mediante un insecto vector o se suministran por medio del sistema radicular mediante inyección. En algunas realizaciones, la inyección comprende una aguja o un sistema sin aguja, un sistema neumático de inyección por aire o presión. En otras realizaciones, la inyección se realiza manualmente, o una vez, o más de una vez. En otra realización, el insecto vector es una chicharrita de alas cristalinas. En otra realización, el bacteriófago a introducir en la planta está a una concentración de 1 a 1012 UFP/ml (unidades formadoras de placas de lisis/ml), 104 a 1011 UFP/ml y 107 a 1010 UFP/ml. En otra realización, el método comprende poner en contacto una población de plantas con las partículas de bacteriófago para prevenir o reducir los síntomas asociados con Xanthomonas axonopodis y patovares de la misma en la población.

En otro aspecto, la invención proporciona un bacteriófago aislado que es virulento para Xylella fastidiosa y especies de Xanthomonas, en donde el bacteriófago se selecciona del grupo que consiste en bacteriófagos del tipo de fago Xfas100 y bacteriófagos del tipo de fago Xfas300, en donde el tipo de fago Xfas100 muestra las siguientes características: (a) el bacteriófago puede lisar dichas bacterias Xylella fastidiosa y Xanthomonas; (b) el bacteriófago infecta una célula mediante su unión a un pilus de Tipo IV; (c) el bacteriófago comprende una cola no contráctil y un tamaño de cápside que varía de 55-77 nm en diámetro, con una morfología típica de la familia Siphoviridae; y (d) el tamaño genómico del bacteriófago es de 55.500 pb a 56.200 pb; y en donde además el tipo de fago Xfas300 muestra las siguientes características: (e) el bacteriófago puede lisar dichas bacterias Xylella fastidiosa y Xanthomonas; (f) el bacteriófago infecta una célula mediante su unión a un pilus de Tipo IV; (g) el bacteriófago comprende una morfología típica de la familia Podoviridae caracterizada por una cola no contráctil con un tamaño de cápside que varía de 58-68 nm en diámetro; y (h) el tamaño genómico del bacteriófago es de 43.300 pb a 44.600 pb; en donde el bacteriófago del tipo de fago Xfas100 comprende un genoma con una secuencia de ADN seleccionada del grupo de SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17 y SEQ ID NO:18, y el bacteriófago del tipo de fago Xfas300 comprende un genoma con una secuencia de ADN seleccionada del grupo de SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23 y SEQ ID NO:24. En una realización, el bacteriófago aislado es virulento para Xanthomonas axonopodis y es un bacteriófago Xfas303, en donde una muestra representativa de dicho bacteriófago se ha depositado con el número de registro de ATCC PTA-13099. En otra realización, la invención proporciona un bacteriófago aislado que es virulento para especies de Xanthomonas y X. fastidiosa, en donde el bacteriófago se selecciona del grupo que consiste en: Xfas103, Xfas106, Xfas302, Xfas303, Xfas304 y Xfas306 que se han depositado con el número de registro de ATCC PTA-13096, PTA-13095,, PTA-13098, PTA-13099, PTA-13100 y PTA-13097.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona un método para prevenir o reducir los síntomas o la enfermedad asociados o causados por X. fastidiosa o especies de Xanthomonas en una planta que comprende una etapa de poner en contacto dicha planta con un bacteriófago virulento para X. fastidiosa y especies de Xanthomonas en su rango de huéspedes, en donde además el bacteriófago es al menos un bacteriófago seleccionado del grupo que consiste en el tipo de fago Xfas100, y el tipo de fago Xfas300, en donde el fago de tipo Xfas100 tiene las siguientes características: (a) el bacteriófago puede lisar dichas bacterias Xylella fastidiosa y Xanthomonas; (b) el bacteriófago infecta una célula mediante su unión a un pilus de Tipo IV; (c) el fago pertenece a un grupo de bacteriófagos con cola que exhiben colas no contráctiles largas con una cápside que varía de 55-77 mm en diámetro, una morfología típica de la familia Siphoviridae; (d) el tamaño genómico del bacteriófago es de alrededor de 55.500 pb a 56.200 pb; y opcionalmente (e) el bacteriófago previene o reduce los síntomas asociados con la enfermedad de Pierce en una planta o plantas; y en donde además el fago de tipo Xfas300 tiene las siguientes características: (a) el bacteriófago puede lisar dichas bacterias Xylella fastidiosa y Xanthomonas; (b) el bacteriófago infecta una célula mediante su unión a un pilus de Tipo IV; (c) el fago pertenece a un grupo de bacteriófagos con cola que exhiben colas no contráctiles cortas con cápside que varía de 58-68 mm en diámetro, una morfología típica de la familia Podoviridae; (d) el tamaño genómico del bacteriófago es de alrededor de 43.300 pb a 44.600 pb; y opcionalmente (e) el bacteriófago tiene una actividad de prevención o reducción de los síntomas asociados con la enfermedad de Pierce en una planta o plantas, en donde el tipo de fago Xfas100 comprende un genoma con una secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ iD n O:17 y SEQ ID NO:18; o el tipo de fago Xfas300 comprende un genoma con una secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ. ID 22, SEQ ID NO:23 y SEQ ID NO:24. En ciertas realizaciones, se introduce un solo tipo de bacteriófago virulento a una planta; en otras realizaciones, se introduce una combinación de 2, 3, 4, 5, 6 o más aislamientos o tipos de bacteriófagos virulentos a una planta, ya sea de manera simultánea o secuencial. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, el bacteriófago a introducir en una planta se selecciona del grupo que consiste en: Xfas103, Xfas106, Xfas302, Xfas303, Xfas304 y Xfas306. También se contemplan composiciones de biocontrol de enfermedades vegetales formuladas para el suministro a una planta y que comprenden dichos bacteriófagos de tipo Xfas100 y/o Xfas300. La composición de biocontrol puede comprender además un portador. En algunas realizaciones, el portador puede comprender un diluyente, un tensioactivo y/o un tampón.

Breve descripción de los dibujos

Para una comprensión más completa de las características y ventajas de la presente invención, ahora se hace referencia a la descripción detallada de la invención junto con las figuras adjuntas y en las que:

Figura 1: muestra una imagen de TEM de los fagos Xfas302, Xfas303, Xfas304 y Xfas305, con la morfología y el tamaño característicos de Podoviridae.

Figura 2: muestra una imagen de TEM de los fagos Xfas101, Xfas102, Xfas103 y Xfas104, con la morfología y el tamaño característicos de Siphoviridae.

Figura 3: muestra bacteriófagos Podoviridae y Siphoviridae de X. fastidiosa aislados de aguas residuales, capaces de formar placas de lisis en XF15 y EC-12.

Figura 4: muestra un mapa genómico de los Siphoviridae Xfas103 y Xfas106.

Figura 5: Muestra un mapa genómico de los Podoviridae Xfas302, Xfas303, Xfas304 y Xfas306.

Figura 6: muestra una planta de vid que exhibe síntomas de la enfermedad de Pierce 8 semanas después de la inoculación con la cepa XF54 y sin exposición a bacteriófago.

Figura 7: muestra un resumen del estudio terapéutico y preventivo de exposición a bacteriófago en vides.

Figura 8: muestra el movimiento y la persistencia de bacteriófagos individuales en las vides inoculadas a las 8 (arriba) y 12 (abajo) semanas después de la inoculación del fago. Panel izquierdo: fagos presentes en el tejido radicular. Panel central: fagos presentes en el cordón 1 de la vid. Panel derecho: fagos presentes en el cordón 2 de la vid.

Figura 9: muestra los niveles de XF15 en vides inoculadas expuestas a un cóctel de fagos 3 semanas después. Las muestras se recolectaron 9 semanas después de la exposición al cóctel de fagos (12 semanas después de la inoculación bacteriana). Panel izquierdo: bacterias presentes en el tejido radicular. Panel central: bacterias presentes en el cordón 1 de la vid. Panel derecho: bacterias presentes en el cordón 2 de la vid. Las barras grises muestran los niveles de XF15 en las vides inoculadas con XF15. Las barras negras muestran los niveles de XF15 en las vides inoculadas con XF15 expuestas a un cóctel de fagos en la semana 3 posterior a la inoculación del patógeno. Las flechas muestran el segmento con el punto de inoculación. Cada barra es representativa del promedio de UFC/gpt (gramo de tejido vegetal) de las raíces y 2 cordones para 3 vides.

Figura 10: muestra los niveles de los fagos del cóctel en las vides inoculadas inicialmente con XF15 y expuestas a un cóctel de fagos 3 semanas después. Las muestras se recolectaron 5, 7 y 9 semanas después de la exposición al cóctel de fagos (8, 10 y 12 semanas después de la inoculación bacteriana inicial). Panel izquierdo: fagos presentes en el tejido radicular. Panel central: fagos presentes en el cordón 1 de la vid. Panel derecho: fagos presentes en el cordón 2 de la vid. La barra negra muestra los niveles de fagos en las plantas inoculadas con el cóctel. La barra gris muestra los niveles de fagos en las vides inoculadas con XF15 expuestas a un cóctel de fagos en la semana 3 posterior a la inoculación del patógeno. Las flechas muestran el segmento con el punto de inoculación. Cada barra es representativa del promedio de UFP/gpt (gramo de tejido vegetal) de 4 fagos en el cóctel determinado a partir de las raíces y 2 cordones para 3 vides.

Figura 11: muestra los niveles de fagos en vides inoculadas inicialmente con cóctel de fagos y expuestas a XF15 3 semanas después. Las muestras se recolectaron 5, 7 y 9 semanas después de la exposición a XF15 (8, 10, 12 semanas después de la inoculación inicial del fago). Panel izquierdo: fagos presentes en el tejido radicular. Panel central: fagos presentes en el cordón 1 de la vid. Panel derecho: fagos presentes en el cordón 2 de la vid. Las barras negras muestran los niveles de fagos en las vides inoculadas con el cóctel. Las barras grises muestran los niveles de fagos en las vides inoculadas con el cóctel expuestas a XF15 en la semana 3 posterior a la inoculación de los fagos. Las flechas muestran el segmento con el punto de inoculación. Cada barra es representativa del promedio de UFP/gpt (gramo de tejido vegetal) de 4 fagos en el cóctel determinado a partir de las raíces y 2 cordones para 3 vides.

Figura 12: muestra los resultados de la titulación por gotas del fago Xfas303 en cepas de Xanthomonas axonopodis pv. citri.

Breve descripción del listado de secuencias

SEQ ID NO:1 - El cebador oligonucleotídico directo específico para X. fastidiosa diseñado para gyrB de X. fastidiosa. SEQ ID NO:2 - El cebador oligonucleotídico inverso específico para X. fastidiosa diseñado para gyrB de X. fastidiosa. SEQ ID NO:3 - El cebador oligonucleotídico directo específico para bacteriófago Xfas304 diseñado para el gen de la ADN primasa del bacteriófago.

SEQ ID NO:4 - El cebador oligonucleotídico inverso específico para bacteriófago Xfas304 diseñado para el gen de la ADN primasa del bacteriófago.

SEQ ID NO:5 - El cebador oligonucleotídico directo específico para bacteriófago Xfas303 diseñado para el gen de la ADN primasa del bacteriófago.

SEQ ID NO:6 - El cebador oligonucleotídico inverso específico para bacteriófago Xfas303 diseñado para el gen de la ADN primasa del bacteriófago.

SEQ ID NO:7 - El cebador oligonucleotídico directo específico para bacteriófago Xfas 103 diseñado para el gen de la helicasa de ADN del bacteriófago.

SEQ ID NO:8 - El cebador oligonucleotídico inverso específico para bacteriófago Xfas 103 diseñado para el gen de la helicasa de ADN del bacteriófago.

SEQ ID NO:9 - El cebador oligonucleotídico directo específico para bacteriófago Xfas106 diseñado para el gen de la helicasa de ADN del bacteriófago.

SEQ ID NO:10 - El cebador oligonucleotídico inverso específico para bacteriófago Xfas106 diseñado para el gen de la helicasa de ADN del bacteriófago.

SEQ ID NO:11 - La secuencia genómica del bacteriófago Xfas101.

SEQ ID NO:12 - La secuencia genómica del bacteriófago Xfas102.

SEQ ID NO:13 - La secuencia genómica del bacteriófago Xfas103.

SEQ ID NO:14 - La secuencia genómica del bacteriófago Xfas104.

SEQ ID NO:15 - La secuencia genómica del bacteriófago Xfas105.

SEQ ID NO:16 - La secuencia genómica del bacteriófago Xfas106.

SEQ ID NO:17 - La secuencia genómica del bacteriófago Xfas107.

SEQ ID NO:18 - La secuencia genómica del bacteriófago Xfas110.

SEQ ID NO:19 - La secuencia genómica del bacteriófago Xfas301.

SEQ ID NO:20 - La secuencia genómica del bacteriófago Xfas302.

SEQ ID NO:21 - La secuencia genómica del bacteriófago Xfas303.

SEQ ID NO:22 - La secuencia genómica del bacteriófago Xfas304.

SEQ ID NO:23 - La secuencia genómica del bacteriófago Xfas305.

SEQ ID NO:24 - La secuencia genómica del bacteriófago Xfas306.

Descripción detallada de la invención

Las siguientes definiciones y métodos se proporcionan para definir mejor la presente invención y para guiar a los expertos en la técnica en la práctica de la presente invención. A menos que se indique de otra manera, los términos deben entenderse de acuerdo con el uso convencional por los expertos en la técnica pertinente.

La invención proporciona, por primera vez, métodos que permiten la propagación y el aislamiento eficientes de bacteriófagos (fagos) que pueden infectar, replicarse en y lisar X. fastidiosa y Xanthomonas axonopodis (Xa) y patovares de la misma. La descripción proporciona además un método para controlar la enfermedad bacteriana en plantas. Las enfermedades vegetales que pueden controlarse de acuerdo con la presente invención pueden incluir, pero no se limitan a, la enfermedad de Pierce y el cancro de los cítricos. Las especies bacterianas útiles de acuerdo con la invención incluyen Xylella fastidiosa, o una especie de Xanthomonas, tal como Xanthomonas axonopodis y patovares de la misma, tales como Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac).

Como se usa en el presente documento, un "bacteriófago" o "fago" se refiere a un virus de bacterias. Como se usa en el presente documento, "Xanthomonas axonopodis"o "Xa"se refiere a una especie bacteriana de Xanthomonas axonopodis o un patovar de la misma, que puede incluir Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) o cualquier otro patovar de Xanthomonas axonopodis. En la actualidad, la propagación de bacteriófagos que pueden lisar X. fastidiosa es muy laboriosa en el laboratorio, con el uso de células huésped de X. fastidiosa y medios complejos y costosos en un formato sólido. Esto puede requerir 7-10 días para producir bajas cantidades de bacteriófago. Por lo tanto, la presente invención representa un avance significativo que proporciona la propagación de bacteriófagos que pueden infectar X. fastidiosa mediante el cultivo del bacteriófago en una bacteria huésped de crecimiento rápido tal como EC-12 de especie de Xanthomonas para producir bacteriófagos rápidamente; esto se designa como la estrategia del "huésped sustituto". La técnica es rápida y rentable, y puede usarse con componentes de medios convencionales disponibles en la técnica. La técnica también es susceptible al escalado. La capacidad de producir en un huésped sustituto fagos virulentos que lisan (matan) a X. fastidiosa y/o Xa que pueden replicarse cada hora en condiciones estándar, en lugar de días, con el uso de un huésped que en el mejor de los casos se replica diariamente en un medio muy complejo hace viable primera vez la producción e implementación de métodos de control y tratamiento de enfermedades mediadas por X. fastidiosa y/o Xanthomonas axonopodis que comprenden el uso de fagos virulentos. El cultivo de Xa puede realizarse en caldo nutriente con un tiempo de generación de aproximadamente 2-3 horas. Sin embargo, Xa es un patógeno con licencia de uso y, por lo tanto, requiere un nivel de bioseguridad de 2 (BL2) para el cultivo. Por lo tanto, de manera similar a X. fastidiosa, Xa puede no ser práctico para la producción a gran escala.

El bacteriófago puede aislarse mediante un método de capa de agar blando, que permite el aislamiento del fago a partir de células de X. fastidiosa y/o Xanthomonas, y en realizaciones adicionales, los lisados de las placas con fago de alto título se preparan mediante la cosecha de una o más placas con capa de una cepa de X. fastidiosa o una cepa de Xanthomonas, tal como la cepa EC-12, que exhiben lisis confluente, seguido de maceración, clarificación por centrifugación y esterilización por filtración. Los lisados resultantes pueden almacenarse a 4 °C. Posteriormente, los lisados de fago de alto título pueden purificarse, por ejemplo, mediante centrifugación isopícnica en CsCl, y la solución de fago extraída puede dializarse. De este modo puede obtenerse un bacteriófago purificado con CsCl resultante que tiene un título de alrededor de 1 X 1011 UFP/ml. En otras realizaciones, el bacteriófago en filtrados de tejido vegetal (PTF) puede filtrarse. Una relación preferida para la filtración es 1 ml de PTF para 20 ml del cultivo de huésped sustituto (un cultivo en crecimiento activo de un huésped seleccionado), cultivado, por ejemplo, durante 4 días para la cepa Temecula de X. fastidiosa o durante 4 h para la cepa EC-12 de Xanthomonas.

Con el uso de métodos para la detección y propagación de bacteriófagos virulentos para X. fastidiosa y patovares de Xanthomonas axonopodis ('Xa"), los bacteriófagos virulentos que pueden causar la lisis de X. fastidiosa y Xa pueden seleccionarse de una fuente deseada, tal como el medio ambiente, que incluye plantas, aguas residuales y/o agua del suelo, y propagarse de acuerdo con la invención. Los bacteriófagos que pueden identificarse pueden definirse por características particulares como las descritas por Casjens y otros (Research in Microbiology, 159:340-348, 2008), tales como la forma y el tamaño de la cápside, el tamaño del genoma, la disposición de los genes y/o los módulos de genes, la morfología y el ciclo de vida. Los bacteriófagos descritos en el presente documento pueden ser virulentos, isométricos, con un número de triangulación de T=7, un tamaño del genoma de alrededor de 60 kb o dentro de alrededor del 15 % de 60 kb, pueden incluir repeticiones terminales directas en el genoma. El bacteriófago virulento puede usarse, por ejemplo, para controlar y prevenir la enfermedad causada por especies y subespecies de Xylella y/o especies de Xanthomonas tales como Xanthomonas axonopodis y patovares de la misma, tales como citri.

En la actualidad, se reconocen cinco subespecies de Xylella causantes de enfermedades vegetales. Las especies de plantas que pueden infectarse con Xylella se relacionan, por ejemplo, en www.cnr.berkeley.edu/xylella/control/hosts.htm, como se describe en Hernández-Martínez y otros, (American Phytopathological Society, 97(7):857-864, 2007) y Nunney y otros, (PLoS ONE, 5(11): e15488, 2010), y pueden incluir cultivos comerciales tales como, pero sin limitarse a, vides, cítricos, café, almendra, melocotón, alfalfa, albaricoque, ciruela, zarzamora, mora y plantas hortícolas tales como adelfa, roble, liquidámbar, ciclamor, olmo y Chitalpa tashkentensis. El bacteriófago puede aislarse de ambientes donde X. fastidiosa no puede crecer debido a sus requisitos de crecimiento excepcionales. Además, de acuerdo con la presente invención, las especies de plantas que pueden infectarse con un patovar de Xanthomonas axonopodis pueden incluir, pero no se limitan a, una Citrus spp., una Fortunella spp., una Poncirus spp., un limero, un limonero, un naranjo, un toronjo, un pomelero e híbridos de naranja trifoliada usados para portainjertos.

Por lo tanto, la descripción proporciona métodos para el desarrollo de tratamientos basados en bacteriófagos para el control de enfermedades vegetales causadas por X. fastidiosa, que es una bacteria gramnegativa limitada al xilema, transmitida por insectos, que causa enfermedades en muchas plantas. En particular, X. fastidiosa es el agente causal de la enfermedad de Pierce (PD) de las uvas, que en la actualidad es un factor limitante en el cultivo de uvas para vino de alta calidad en áreas de los EE.UU., que incluyen Texas y California. Una enfermedad vegetal importante causada por X fastidiosa es la enfermedad de Pierce ("PD") de la uva, que causa síntomas visibles que incluyen hojas amarillentas u hojas enrojecidas a lo largo de los márgenes. Eventualmente, puede ocurrir el secado y la necrosis de los márgenes y las hojas. Los insectos vectores tales como el saltahojas chicharrita de alas cristalinas ("GWSS", por sus siglas en inglés) pueden propagar la enfermedad, así como al fago que infecta las bacterias causantes de la enfermedad y que puede ser útil para la eficacia del biocontrol.

En la actualidad, no existen medidas de control eficaces para PD, salvo el sacrificio agresivo de las vides infectadas. La presente invención permite el tratamiento de tales enfermedades al proporcionar, por primera vez, un sistema viable para generar cantidades suficientes de bacteriófagos de una manera rentable para permitir tratamientos de las plantas. La descripción proporciona además métodos para el desarrollo de tratamientos basados en bacteriófagos para el control de enfermedades vegetales causadas por Xa, que incluye Xac, que es el agente causal del cancro de los cítricos. En una realización particular, la descripción proporciona un método para controlar la enfermedad de Xa en una planta.

Como se usa en el presente documento, el término "virulento" se refiere a un virus, particularmente un bacteriófago, que puede infectar, replicarse en y lisar (matar) una célula huésped. El término "atemperado" se refiere a un bacteriófago que puede integrarse en el genoma del huésped (lisogenizar) o lisar la célula huésped. En una realización, los fagos se propagan en un huésped adecuado, como se describe en el presente documento. El término "huésped" se refiere a una célula bacteriana que puede usarse para producir grandes cantidades de bacteriófago. Una etapa en el desarrollo de una estrategia de control basada en bacteriófagos proporcionada en el presente documento es la identificación y propagación de fagos virulentos que reconocen sitios receptores bacterianos particulares. La producción y el suministro de bacteriófagos virulentos para bacterias causantes de enfermedades deben ser económicos para representar una opción de biocontrol viable.

Los fagos infectan una célula huésped por medio del reconocimiento de receptores, que pueden incluir, pero no se limitan a, proteínas de superficie tales como Omp A y OmpF, el núcleo y la cadena O del LPS bacteriano en bacterias Gram negativas, el sexo y los pili de tipo IV (por ejemplo, Roine y otros, Mol. Plant Microbe Interact., 11:1048-1056 (1998)), y los flagelos. Sin limitarse a ninguna teoría determinada, se cree que el bacteriófago puede infectar las células de X. fastidiosa y Xa por medio de los pili de tipo IV. Por lo tanto, un huésped de acuerdo con la presente descripción puede ser cualquier tipo de bacteria, y particularmente cualquier especie bacteriana a la que un bacteriófago atemperado virulento, o un derivado del mismo, tal como un fago pasado, puede adsorberse e infectar por medio de un receptor de superficie que se requiere para la virulencia y/o la patogenicidad, tal como un pilus de Tipo IV o una proteína similar a TonB. Por "fago pasado" se entiende una población de fagos que se ha propagado por uno o más períodos de cultivo en células huésped cultivadas. Los huéspedes típicos usados en la presente descripción pueden ser células bacterianas, particularmente especies bacterianas de la familia Xanthomonadaceae, que incluye tanto Xylella como Xanthomonas. En algunas realizaciones, las cepas de X. fastidiosa pueden incluir Temecula1 (ATCC 700964); Ann-1 (ATCC 700598); Dixon (ATCC 700965); XF53, XF54 y XF95 (Whitehorn y otros, Science, 336:351-352 (2012)); XF134, XF136, XF140, XF141, XF15-1, XF15-1-1, TM1 (Jones, y otros, Ann. Rev Phytopathol., 45:245-262 (2007)); y tonB1 (Summer y otros, J. Bacteriol.

192:179-190 (2010)). Las cepas ilustrativas de Xanthomonas, que son susceptibles a uno o más de los aislamientos de bacteriófagos descritos, y que pueden ser útiles para esta invención incluyen EC12, Pres-4 y Jal-4 (proporcionado por Dr. N. Wang, Univ. de Florida, Gainesville, FL), Noth 40, Ft. Basinger y Block22, entre otros. También se pueden utilizar otras bacterias Xanthomonas en vista de su susceptibilidad al bacteriófago Xfas100 y/o Xfas300.

Como se usa en el presente documento, el término "aislamiento" se define como la separación e identificación de un organismo a partir de una solución que contiene un cultivo mixto de organismos. Los organismos que pueden aislarse pueden incluir virus, bacterias, células vegetales o similares. El bacteriófago puede aislarse como se describe en el presente documento y se conoce en la técnica. En una realización, los métodos de laboratorio generales para aislar bacteriófagos pueden incluir, pero no se limitan a, cultivo en células cultivadas, ensayo de bacteriófagos, método de agar doble y ensayo de placas de lisis, entre otros. La presente descripción proporciona un método para aislar bacteriófagos mediante un método que implica extender una capa con al menos una primera muestra que comprende cepas diferentes de células huésped bacterianas juntas para aislar los bacteriófagos que pueden infectarlas y propagarse dentro de ambos tipos de células huésped.

La invención proporciona además un método para propagar un virus (bacteriófago) virulento para Xylella fastidiosa. Los métodos para propagar bacteriófagos se conocen en la técnica, y pueden abarcar cualquier método que pueda producir cantidades de bacteriófagos suficientes para tratar enfermedades vegetales. En una realización, la propagación del bacteriófago virulento para X fastidiosa puede comprender cultivar un bacteriófago en bacterias Xanthomonas, permitir que el bacteriófago se propague y aislar las partículas de bacteriófago del cultivo.

El bacteriófago virulento para X. fastidiosa puede prepararse con el uso de un método de capa de agar blando. Los lisados de las placas con fago de alto título pueden prepararse, por ejemplo, mediante la cosecha de una placa con capa de la cepa Temecula de X. fastidiosa o la cepa EC-12 de Xanthomonas que exhibe lisis confluente, seguido de maceración y clarificación por centrifugación. Después de esterilizarse por filtración, los lisados resultantes pueden almacenarse a 4 °C. Posteriormente, los lisados de fago de alto título pueden purificarse por centrifugación isopícnica en CsCl, y la solución de fago extraída se dializa. Puede obtenerse un bacteriófago purificado con CsCl que tiene un título de, por ejemplo, 1 X 1011 UFP/ml.

Una relación preferida de bacteriófago en filtrados de tejido vegetal (PTF) para la filtración es, por ejemplo, 1 ml de PTF para 20 ml del cultivo de huésped sustituto (cultivo en crecimiento activo del huésped seleccionado), cultivado durante 4 días para la cepa Temecula de X fastidiosa o durante 4 horas para la cepa EC-12 de Xanthomonas.

La invención proporciona además un método para tratar o reducir los síntomas asociados con X. fastidiosa y/o patovares de Xa en una planta o plantas. Los síntomas típicos de la enfermedad de Pierce (PD) incluyen hojas que se vuelven ligeramente amarillas o rojas a lo largo de los márgenes, respectivamente; eventualmente los márgenes foliares pueden secarse o morir en sus zonas

Una realización de los métodos contemplados implica administrar, a una planta infectada con X. fastidiosa y/o Xa, bacteriófago(s) virulento(s) para X. fastidiosa y Xa de una manera que dará como resultado el tratamiento de la planta. El tratamiento de las plantas para la infección puede realizarse mediante pulverización, nebulización, aplicación de polvo, inyección o cualquier otro método conocido en la técnica. Los métodos para formular composiciones para tales aplicaciones también son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, X. fastidiosa infecta los tejidos vasculares de las plantas y, por lo tanto, la invención tal como se describe en el presente documento puede comprender introducir por medio de inyección una población purificada de partículas de bacteriófago virulento para X. fastidiosa a una planta infectada con X. fastidiosa de manera que el bacteriófago pueda infectar y lisar las células de X. fastidiosa para tratar de ese modo la infección de la planta. Sin embargo, un experto en la técnica reconocerá que también pueden usarse con éxito otros métodos. Xa es un patógeno foliar e infecta de forma natural las hojas, tallos y frutos de las plantas mediante la lluvia que salpica directamente a través de los estomas de las hojas o por medio de las heridas producidas durante fuertes vientos o por insectos. Por lo tanto, en una realización, la presente invención puede comprender introducir mediante pulverización una composición que comprende una población purificada de partículas de bacteriófago virulento para Xa a una planta infectada con Xa.

Como se usa en el presente documento, los términos "tratamiento", "que trata" y "tratar" se definen como actuar sobre una enfermedad, trastorno o afección con un agente para reducir o mejorar los efectos fisiológicos de la enfermedad, trastorno o afección y/o sus síntomas. El "tratamiento", como se usa en el presente documento, incluye cualquier tratamiento de una enfermedad en un huésped (por ejemplo, una especie de planta, que incluye las de interés agrícola, tales como plantas comestibles o aquellas usadas para producir productos comestibles, así como especies de plantas ornamentales), e incluye: (a) reducir el riesgo de aparición de la enfermedad en una planta, (b) impedir el desarrollo de la enfermedad, y (c) aliviar la enfermedad, es decir, causar la regresión de la enfermedad y/o aliviar uno o más síntomas de la enfermedad. "Tratamiento" también pretende abarcar el suministro de un agente inhibidor para proporcionar un efecto, incluso en ausencia de una enfermedad o afección. Por ejemplo, "tratamiento" abarca el suministro de un agente inhibidor de la enfermedad o el patógeno que proporciona efectos potenciados o convenientes en la planta (por ejemplo, la reducción de la carga del patógeno, reducción de los síntomas de la enfermedad, etcétera).

La invención proporciona además una composición de biocontrol de enfermedades vegetales formulada para el suministro a una planta, la composición comprende al menos un portador y al menos un bacteriófago que es virulento para Xylella fastidiosa y especies de Xanthomonas tales como Xa.

El bacteriófago virulento para Xylella fastidiosa y especies de Xanthomonas tales como Xa como ingrediente activo en la composición de la presente invención se proporciona como uno de los bacteriófagos seleccionados del grupo que consiste en el tipo de fago Xfas100, Xfas103 y Xfas106, y/o el tipo de fago Xfas300, Xfas302, Xfas303, Xfas304 y Xfas306, en donde dichos tipos de fago Xfas103, Xfas106, Xfas302, Xfas303, Xfas304 y Xfas306, se han depositado con los números de registro de ATCC PTA-13096, PTA-13095, PTA-13098, PTA-13099, PTA-13100 y PTA-13097, respectivamente.

El bacteriófago virulento del tipo de fago Xfas100 como ingrediente activo en la presente invención muestra las siguientes características: (a) el bacteriófago tiene una actividad que puede lisar dichas bacterias Xylella fastidiosa y Xanthomonas, (b) el bacteriófago infecta una célula mediante su unión a un pilus de Tipo IV, (c) el bacteriófago con cola exhibe colas no contráctiles largas con una cápside que varía de 55-77 mm en diámetro, una morfología típica de la familia Siphoviridae, (d) el tamaño genómico del bacteriófago es de alrededor de 55.500 pb a 56.200 pb y opcionalmente (e) el bacteriófago tiene una actividad de prevención o reducción de los síntomas asociados con la enfermedad de Pierce en una planta o plantas.

El bacteriófago virulento del tipo de fago Xfas300 como ingrediente activo en la presente invención tiene las siguientes características; (a) el bacteriófago tiene una actividad que puede lisar dichas bacterias Xylella fastidiosa y Xanthomonas; (b) el bacteriófago infecta una célula mediante su unión a un pilus de Tipo IV; (c) el grupo de un bacteriófago con cola exhibe colas no contráctiles cortas con una cápside que varía de 58-68 mm en diámetro, una morfología típica de la familia Podoviridae; (d) el tamaño genómico del bacteriófago es de alrededor de 43.300 pb a 44.600 pb; y opcionalmente (e) el bacteriófago tiene una actividad de prevención o reducción de los síntomas asociados con la enfermedad de Pierce en una planta o plantas. El bacteriófago virulento como ingrediente activo en las composiciones de la presente invención comprende al menos un bacteriófago seleccionado del tipo de fago Xfas100 y/o el tipo de fago Xfas300, en donde dicho tipo de fago Xfas100 es Xfas103 y Xfas106 y/o dicho tipo de fago Xfas300 es Xfas302, Xfas303, Xfas304 y Xfas306.

El bacteriófago virulento para Xylella fastidiosa y especies de Xanthomonas, tales como Xa, usado como ingrediente activo en la composición de la presente invención también se proporciona mediante una combinación de fagos, tal como un cóctel de dos, tres, cuatro, cinco, seis o más aislamientos o tipos de bacteriófagos virulentos, que pueden proporcionarse de manera simultánea o secuencial, con inclusión de un portador. El término "portador" se refiere a un diluyente, adyuvante, tensioactivo, excipiente o vehículo con el que se administra el fago. Tales portadores pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, que incluyen los originados de petróleo, animales, vegetales o sintéticos, tales como aceite de maní, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. Las soluciones salinas, que incluyen las soluciones de fosfato tales como monohidrógeno fosfato de sodio, dihidrógeno fosfato de potasio y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol también pueden emplearse como portadores líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Los excipientes adecuados pueden incluir almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, creta, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche descremada en polvo, glicerol, propilenglicol, agua, etanol y similares.

Una composición de biocontrol de enfermedades vegetales, si se desea, también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes reguladores del pH.

Los agentes protectores tales como, pero sin limitarse a, formulaciones a base de caseína, formulaciones a base de harina, sacarosa, rojo Congo, N-propil-galato y formulaciones a base de lignina, pueden añadirse a una composición de biocontrol de enfermedades vegetales.

La concentración de fagos requerida para el control eficiente de la enfermedad no está limitada, pero por ejemplo puede ser de 1 X 10-1 X 1012 UFP/ml, 1 X 104-1 X 1011 UFP/ml o 1 X 107-1 X 1010 UFP/ml.

En dependencia de la edad de crecimiento del árbol, el grosor del tallo, el tamaño de la raíz, la dosis se ajusta adecuadamente. Una composición de biocontrol de enfermedades vegetales puede ser un producto seco, un producto sustancialmente seco, un producto líquido o un producto sustancialmente líquido. En algunas realizaciones, un producto seco o sustancialmente seco puede reconstituirse en un líquido (por ejemplo, agua, etcétera) y después aplicarse a una planta. En otras realizaciones, dicha composición puede aplicarse en forma seca o sustancialmente seca, donde el líquido que ya está presente en la planta, que se aplica de manera simultánea a la planta, o que aparece posteriormente en la planta (por ejemplo, por aplicación, condensación, etcétera) facilita la exposición del bacteriófago a las bacterias diana. En otra realización, dicha composición puede aplicarse por pulverización, nebulización o polvo sobre la planta.

Una composición de biocontrol de enfermedades vegetales puede adoptar la forma de una solución, una suspensión, una emulsión, un polvo, una tableta y similares.

La frecuencia de aplicación de una composición de biocontrol de enfermedades vegetales no está limitada, pero puede ser, por ejemplo, diaria, semanal o dos veces por semana, mensual, bimestral o trimestral.

La presente invención proporciona además un bacteriófago aislado que es virulento para Xylella fastidiosa y especies de Xanthomonas, tales como Xa y patovares de la misma, en donde el bacteriófago aislado es un bacteriófago seleccionado del grupo que consiste en el tipo de fago Xfas100, Xfas103 y Xfas106, y/o el tipo de fago Xfas300, Xfas302, Xfas303, Xfas304 y Xfas306, que se han depositado con los números de registro de ATCC PTA-13096, PTA-13095, PTA-13098, PTA-13099, PTA-13100 y PTA-13097, respectivamente.

Dicho bacteriófago puede detectarse mediante la confirmación de la capacidad de formar placas de lisis en especies de Xylella fastidiosa y/o Xanthomonas.

Información de depósito

Se realizó un depósito de bacteriófagos representativos de cada una de las cepas Xfas103, Xfas106, Xfas302, Xfas303, Xfas304 y Xfas306, y un depósito de bacterias representativas de X. anopodis EC-12, que se describen anteriormente en el presente documento y se mencionan en las reivindicaciones con la ATCC, ubicada en P. O. Box 1549, Manassas, VA 20108, EE.UU. La fecha de depósito de los registros fue el 24 de julio de 2012 y los números de registro para las cepas depositadas son PTA-13096, PTA-13095, PTA-13098, PTA-13099, PTA13100, PTA13097 y PTA-13101, respectivamente. Todas las restricciones sobre el depósito se eliminarán tras la concesión de una patente, y el depósito está destinado a cumplir con todos los requisitos de 37 C. F. R. §1.801-1.809. El depósito se mantendrá en el depositario durante un período de 30 años, o 5 años después de la última solicitud, o durante la vigencia de la patente, lo que sea más largo, y se reemplazará si es necesario durante ese período.

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar las realizaciones preferidas de la invención. Los expertos en la técnica deben apreciar que las técnicas descritas en los ejemplos que siguen representan técnicas que el inventor descubrió que funcionan bien en la práctica de la invención, y por lo tanto pueden considerarse modos preferidos para su práctica.

Ejemplo 1

Medios, condiciones de cultivo y cepas bacterianas

Este ejemplo describe el aislamiento, la propagación y la caracterización morfológica y genómica de bacteriófagos virulentos para X. fastidiosa y especies de Xanthomonas. El medio usado en este estudio difiere del medio estándar usado para cultivar X. fastidiosa, lo que permite un crecimiento rápido pero afecta la capacidad de infección del bacteriófago. El medio de caldo PW modificado por Sherald y otros (Plant Disease 67:849-852, 1983) designado PW-M, se usó para el cultivo de aislamientos de X. fastidiosa, excepto que el contenido final de albúmina de suero bovino fue 0,3 % según la modificación de Hill y Purcell (Phytopathology 85(12):1368-1372, 1995). Para medio sólido (PW-MA) y agar blando, el caldo PW-M se modificó con 15 g/l y 7,5 g/l, respectivamente, de agar probado en cultivo de células vegetales (Sigma). El medio complejo caldo TN (TNB) se usó para el mantenimiento sistemático de cultivos que no son de X. fastidiosa. El medio sólido (TNA) era idéntico, con la excepción de que carecía de KNO3 y se complementó con 20 g/l de agar. Para las capas de agar blando, el medio TN se modificó con 7,5 g/l de agar (TNSA). Para la siembra de los extractos vegetales para obtener los recuentos bacterianos totales, el medio TNA se modificó con cicloheximida (40 |jg/ml; TNAC). Todos los cultivos se cultivaron a 28 °C y los cultivos líquidos se supervisaron a A=600 nm con el uso de matraces Nephelo. Los aislamientos de X. fastidiosa de California incluidos en el estudio fueron Temecula (XF15), que es representativo de X. fastidiosa subespecie fastidiosa, Ann1 (XF108), representativo de X. fastidiosa subespecie sandyi y Dixon (XF102), representativo de X. fastidiosa subespecie multiplex (Hendson y otros, Applied and Environmental Microbiology 67(2):895-903, 2001). Los aislamientos de X. fastidiosa de Texas incluyeron uno de cada Platanus occidentalis (XF1), Helianthus annuus (XF5), Iva annua (XF18), Ambrosia psilostachya (XF23), Ratibida columnifera (XF37), Vitis aestivalis (XF39), Vitis mustangensis (XF41), tres aislamientos de Ambrosia trifida var. texana (XF16, 40 y 43), dos de Nerium oleander (XF93 y 95) y 15 de Vitis vinifera (XF48, 50, 52, 53, -54, 56, 58, 59, 60, 66, 67, 70, 71,76 y 78). Todos los aislamientos se purificaron a partir de una sola colonia mediante el método de aislamiento por estrías y se almacenaron a -80 °C después de modificar los cultivos en caldo PW-M a una concentración final de glicerol al 20 % (v/v). Los aislamientos de X. fastidiosa se confirmaron a nivel de especie y subespecie con el uso del análisis de reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) como se describió anteriormente (Hernández-Martínez y otros, Plant Disease 90(11):1382-1388, 2006). El sistema de identificación microbiana Sherlock® MIDI que analiza los ésteres metílicos de ácidos grasos por cromatografía de gases (GC-FAME) se usó para identificar las especies de Xanthomonas.

Ejemplo 2

Procesamiento de muestras vegetales y aislamiento de bacterias

Se obtuvieron muestras vegetales de Vitis vinifera, V. mustangensis y malezas de viñedos en el condado de Brazos y el condado de Washington, Texas. Se obtuvieron tejidos vegetales de arroz (Oryza sativa) y malezas de campos de arroz del condado de Jefferson y el condado de Wharton, Texas. Se obtuvieron muestras de semillas de arroz del Centro de Investigación AgriLife de Texas en Beaumont, Texas. Se obtuvieron muestras de plantas de rosa (Rosa spp.; Knock Out) y jalapeño (TAM-mild; Capsicum annuum) en el condado de Brazos, Texas. Para obtener los extractos vegetales, se trituró 10 g de tejido vegetal con el uso de un mortero y mano de mortero en 50 ml de tampón de bacteriófago (tampón P; Tris-HCl 50 mM pH 7,5, NaCl 100 mM, MgSO48 mM), se agitó con vórtex y se filtró a través de una doble capa de tela de gasa para eliminar las partículas grandes. Después el extracto se sembró por dilución en placas con PW-M y TNAC para el aislamiento de X. fastidiosa y bacterias que no son X. fastidiosa, respectivamente, y se incubó a 28 °C. El crecimiento en las placas se evaluó diariamente durante hasta 10 días.

Ejemplo 3

Aislamiento, purificación y titulación de bacteriófagos a partir de muestras vegetales

Para obtener filtrados de tejido vegetal (PTF), el extracto vegetal clarificado se centrifugó (10.000 x g, 10 min a 4 °C), dos veces y el extracto de tejido se filtró a través de un filtro de 0,22 jm (Supor, Pall Life Sciences). La presencia de bacteriófago en los PTF se determinó directamente por aplicación de gotas de 10 j l de una serie de diluciones en base 10 sobre capas de un panel de X. fastidiosa y especies de Xanthomonas huéspedes, y observación de la formación de zonas o placas de lisis después del desarrollo del crecimiento en césped (6-7 días para aislamientos de X fastidiosa y 18 h para aislamientos de especies de Xanthomonas). Alternativamente, los bacteriófagos se enriquecieron a partir de los PTF mediante la adición de 1 ml de cada filtrado a 20 ml de un cultivo en crecimiento activo de un aislamiento de X. fastidiosa (cultivo de 4 días; A600= 0,30) o un cultivo con A600 = 0,25 (4 h) de una especie de Xanthomonas huésped. Después de 72 h o 24 h de cultivo para el enriquecimiento en X. fastidiosa o especies de Xanthomonas, respectivamente, los cultivos se centrifugaron (10.000 x g, 10 min a 4 °C) y se esterilizaron por filtración (filtro de 0,22 jm ). Para determinar la presencia de bacteriófago en los sobrenadantes enriquecidos, se aplicaron gotas de 10 j l de una serie de diluciones en base 10 sobre capas de un panel de X. fastidiosa y especies de Xanthomonas huéspedes y se observó la formación de zonas o placas de lisis. Se usaron cultivos de cinco días de aislamientos de X. fastidiosa cultivados en PW-MA para preparar suspensiones del huésped en caldo PW-M (A6oo= 0,5), mientras que se usaron cultivos de 18 h de aislamientos de especies de Xanthomonas cultivados en medio TNA para preparar suspensiones en caldo TN (A600= 0,5), y se usaron para preparar las capas. Los capas de agar blando usadas para examinar la actividad de los bacteriófagos en los sobrenadantes bacterianos se prepararon mezclando 100 |_il de la suspensión bacteriana con 7 ml de agar blando fundido en PW-M o TN, vertiendo la mezcla en placas de PW-MA o TNA y permitiendo que se solidifique y seque. Las capas con gotas aplicadas que muestran formación de placas de lisis o zonas claras se investigaron adicionalmente mediante la siembra en placas como se indicó anteriormente, excepto que las diluciones de PTF se mezclaron directamente con suspensiones indicadoras de huéspedes individuales antes de extender la capa. Las placas de lisis individuales formadas sobre las capas de X. fastidiosa o especies de Xanthomonas huéspedes se cortaron, se suspendieron en tampón P y se titularon. Este procedimiento se repitió tres veces para obtener un aislamiento de placa de lisis individual. Los lisados de alto título (1 x 1010 UFP/ml) se prepararon mediante la cosecha de las capas de las placas que exhibían lisis confluente con 5 ml de tampón P, maceración de la capa de agar blando, clarificación del lisado por centrifugación (10.000 x g, 15 min a 4 °C) y esterilización por filtración a través de un filtro de 0,22 |_im. Los lisados se almacenaron a 4 °C.

Los extractos vegetales se sembraron en placas de PW-M y TNAC para la selección de X. fastidiosa y para obtener los recuentos bacterianos totales, respectivamente. Los extractos vegetales de todas las plantas analizadas no produjeron prueba alguna de aislamientos de X. fastidiosa. Sin embargo, la siembra no selectiva en placas produjo una gran variedad de tipos de colonias bacterianas. Se escogieron colonias individuales representativas de bacterias pigmentadas amarillas de las placas y se purificaron por estrías para obtener reservas. Las reservas se usaron para preparar capas en las que se aplicaron gotas de los PTF para observar la formación de zonas o placas de lisis. Todos los aislamientos bacterianos Presidio-4, Jal-4 y EC-12 obtenidos de extractos de semillas de arroz, hojas de jalapeño y tejido de arroz, respectivamente, se identificaron como especies de Xanthomonas con el uso del análisis de ésteres metílicos de ácidos grasos por cromatografía de gases (GC-FAME) y se usaron como huéspedes para la evaluación de los PTF. También pueden utilizarse otras cepas de Xa, en vista de la virulencia de uno o más bacteriófagos descritos en tales cepas.

Las diluciones de varios PTF produjeron placas de lisis en los aislamientos XF15, XF53, XF54, XF95, después de 5 a 6 días de incubación, lo que indica la presencia en el tejido vegetal de bacteriófagos que pueden formar placas de lisis en estos huéspedes. Los títulos iniciales observados a partir de los extractos variaron de 5 X 101 a 7 X 105 UFP/gramo de tejido. Dado que todos los PTF mostraron el mismo patrón de producción en XF15, XF53, XF54 y XF95, la cepa XF15 se usó como huésped para la purificación y producción de placas de lisis. El alto título encontrado en este PTF no enriquecido indica que los huéspedes bacterianos naturales asociados con el tejido vegetal pueden servir como huésped para el bacteriófago, que puede producir placas de lisis en capas de X. fastidiosa. La siembra en serie del PTF produjo placas de lisis individuales de tamaño uniforme. Las placas de lisis individuales se cortaron y se purificaron tres veces con el uso de XF15 como huésped para obtener aislamientos clonales. Una placa de cultivo de bacteriófago Xfas302 se purificó e incrementó con el uso de la cepa huésped Temecula de Xylella fastidiosa (1 x 109 UFP (unidades formadoras de placas de lisis/ml)) y se tituló con los aislamientos Pres-4 y EC-12 de especies de Xanthomonas (ambos de 5 x 107 UFC (unidades formadoras de colonias)/ml), lo que indica que el bacteriófago Xfas302 propagado en la cepa XF15 de X. fastidiosa (Jones y otros, 2007) o en la cepa Temecula de X. fastidiosa (ATCC 700964) pudo formar placas de lisis en las cepas Pres-4 y EC12 de especies de Xanthomonas (EC12 depositada con el número de registro de ATCC PTA-13101) lo que proporciona pruebas de que el bacteriófago propagado en X. fastidiosa puede adsorberse, replicarse y formar placas de lisis en cepas de Xanthomonas. Los estudios del rango de huéspedes que se presentan a continuación corroboran estos resultados.

Todos los fagos Xfas101-Xfas105 produjeron placas de lisis claras pequeñas en los crecimientos en césped de XF15, mientras que los fagos Xfas301-Xfas305 produjeron placas de lisis claras grandes en el mismo huésped. Las imágenes de TEM de Xfas 302-Xfas305 y Xfas101-Xfas104 se muestran en la Figura 1 y la Figura 2, respectivamente. Los lisados de alto título producidos con el uso de XF15 se usaron para obtener preparaciones purificadas con CsCl de cada bacteriófago, que se usaron para realizar los estudios de microscopía electrónica de transmisión (TEM). Todos los fagos Xfas101 - Xfas105 exhibieron colas no contráctiles largas con cápsides que varían de 55-64 nm en diámetro y, por lo tanto, se determinó que pertenecían a la familia Siphoviridae. Todos los Xfas301-Xfas305 exhibieron colas no contráctiles cortas con cápsides que varían de 58-65 nm en diámetro, morfología típica de Podoviridae.

Ejemplo 4

Enriquecimiento de bacteriófagos de aguas residuales

Se obtuvieron muestras clarificadas de aguas residuales de las instalaciones de tratamiento en el área de Bryan, Texas. Se obtuvieron muestras de las instalaciones de Still Creek, Carter Creek, Turkey Creek y Burton Creek. Las muestras se centrifugaron (10.000 x g, 10 min a 4 °C) dos veces y los extractos de tejido se filtraron a través de un filtro de 0,22 |_im. Los fagos se enriquecieron mediante la adición de 1 ml de cada filtrado a 20 ml de un cultivo en crecimiento activo de huéspedes seleccionados como se describió anteriormente. Después de 72 y 24 h de cultivo para el enriquecimiento en X. fastidiosa o especies de Xanthomonas, respectivamente, los cultivos se centrifugaron y se esterilizaron por filtración. Los filtrados enriquecidos se aplicaron en gotas para su titulación sobre capas como se describió anteriormente.

Los fagos Xfas106-109 y Xfas306 se aislaron a partir de muestras enriquecidas individualmente obtenidas de las cuatro plantas de tratamiento de aguas residuales con el uso del huésped EC-12 como huésped. Los estudios de TEM de los concentrados de bacteriófagos purificados identificaron morfológicamente el bacteriófago Xfas306 como Podoviridae por una cola no contráctil corta con una cápside de 68 nm de diámetro (Figura 3), mientras que los fagos Xfasl 06-109 aislados exhibieron colas no contráctiles largas con cápsides de ~77 nm de diámetro (Figura 3) características de Siphoviridae. El bacteriófago Xfas306 produjo placas de lisis claras grandes en ambos huéspedes EC-12 y XF15, mientras que los fagos Xfas106-109 produjeron placas de lisis claras pequeñas en los mismos huéspedes (Figura 3). Por lo tanto, el método usado en este experimento permitió el aislamiento del bacteriófago de X. fastidiosa a partir de muestras ambientales.

Ejemplo 5

Purificación con CsCl

Las suspensiones de bacteriófagos esterilizadas por filtración se concentraron por centrifugación (90.000 x g durante 2,5 h a 5 °C) con el uso de un rotor Tipo 60Ti en una ultracentrífuga Beckman L8-70M. Los sedimentos se resuspendieron en tampón P y se trataron con DNasa I y RNasa A (Sigma) a una concentración final de 1 pg/ml a 25 °C durante 2 h. Se añadió CsCl a la suspensión de bacteriófagos a una concentración final de 0,75 g/ml y se centrifugó (300.000 x g durante 18 h a 5 °C) en un rotor VTi 65.2. La banda de bacteriófagos visible se extrajo con el uso de una aguja de jeringa de calibre 18 y se dializó contra tampón P modificado a NaCl 1 M durante toda la noche a 4 °C y dos veces durante 4 h a 25 °C contra tampón P para obtener una suspensión de 1 X 1011 UFP/ml. El bacteriófago purificado con CsCl se almacenó a 4 °C.

Ejemplo 6

Microscopía electrónica de transmisión

La microscopía electrónica del bacteriófago purificado con CsCl (1 x 1011 UFP/ml) se realizó mediante dilución con tampón P y la aplicación durante 1 min de 5 pl en una rejilla recubierta con formvar-carbono recién tratada con descarga luminiscente. Después las rejillas se lavaron brevemente con gotas de agua desionizada y se tiñeron con acetato de uranilo acuoso al 2 % (p/v). Los especímenes se observaron en un microscopio electrónico de transmisión JEOL 1200EX que funciona a un voltaje de aceleración de 100 KV.

Ejemplo 7

Eficiencia de siembra en placa y rango de huéspedes

La eficiencia de siembra en placa (EOP) se obtuvo mediante el cálculo de la relación del título de placa de lisis de bacteriófago obtenido con el huésped heterólogo (no propagador) respecto al obtenido en el huésped homólogo (propagador). Las reservas de bacteriófagos se titularon en X. fastidiosa o especies de Xanthomonas con el uso del medio adecuado mediante la mezcla de 100 pl de diluciones de reserva de bacteriófagos con suspensiones indicadoras de huéspedes individuales (A6qq= 0,5) en agar blando (7 ml) antes de extender la capa en medio sólido.

Los estudios que comparan la EOP de los fagos Xfas se muestran en la Tabla 1. La EOP para los fagos aislados de muestras vegetales propagadas con el uso de la cepa EC-12 de especie de Xanthomonas y después titulados con el uso de la cepa XF15 de X. fastidiosa como huésped, varió de 1 X 10-1 a 1 X 10-3, con observación de resultados similares cuando los bacteriófagos propagados con el uso de la cepa XF15 se titularon después con el uso de EC-12 como huésped. Estudios similares con fagos aislados de filtrados de aguas residuales y propagados en la cepa EC-12 exhibieron EOP que varían de 1 X 10-1 a 5 X 10-1. Se obtuvieron EOP de 1 X 10-1 a 3 X 10-1 cuando los fagos xfas106-109 se propagaron en la cepa XF15 y se sembraron en placas con el huésped EC-12, lo que indica que, aunque pueden existir barreras de restricción y modificación del ADN, los fagos propagados en la cepa de crecimiento rápido EC-12, en un día, pueden adsorberse, replicarse y formar placas de lisis en X. fastidiosa, un proceso que puede demorar hasta 10 días en X. fastidiosa sola.

TABLA 1. Eficiencia de siembra en placa para fagos Xfas propagados en X. fastidiosa o especies de Xanthomonas huéspedes

Designación del bacteriófago Propagado ^ Sembrado Propagado ^ Sembrado

XF15 ^ EC-12 EC-12 ^ XF15

Xfas101 3,00E-02 5,00E-02

Xfas102 3,33E-02 5,00E-02

Xfas103 1,00E-02 3,33E-03

Xfas104 4,00E-01 5,00E-02

Xfas105 1,00E-01 1,00E-01

Xfas106 1,00E-01 2,50E-01

Xfas301 5,00E-03 1,00E-02

Xfas302 1,00E-01 5,00E-04

Xfas303 2,67E-03 1,00E-03

Xfas304 1,00E-02 5,00E-03

Xfas305 1,00E-02 5,00E-02

Xfas306 3,33E-01 3,00E-01

Los crecimientos en césped del huésped se prepararon mediante la extensión en placas de una capa del medio adecuado, PW-M (para XF15) o t Na (para EC-12) con la semilla de agar blando homóloga con el huésped individual. Después los lisados de alto título (1 x 109 UFP/ml) de preparaciones de bacteriófagos individuales se titularon por aplicación de gotas sobre los crecimientos en césped individuales mediante la aplicación de gotas de 10 |_il de una serie de diluciones en base 10 sobre capas de X. fastidiosa o especies de Xanthomonas huéspedes. Después de la incubación de las placas a 28 °C durante los tiempos adecuados, (24 h para EC-12 o 5-7 días para XF15) se evaluó la formación de zonas y placas de lisis en las placas.

Los estudios iniciales del rango de huéspedes que se muestran en la Tabla 2 indican que todos los fagos que pudieron formar placas de lisis en el huésped XF15 de X. fastidiosa también formaron placas de lisis en el huésped EC-12, mientras que los huéspedes Jal-4 y Pres 4 exhibieron insensibilidad a la mayoría de los sifófagos. Las razones para la resistencia varían desde la falta de adsorción u otro mecanismo posterior a la adsorción tal como los bloqueos de la captación del genoma del bacteriófago, la inmunidad a la sobreinfección, la modificación de restricción y las repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR).

TABLA 2. Rango de huéspedes de fagos Xfas*

Ejemplo 8

Identificación preliminar de los sitios de adsorción de Xfas

En base a la observación de que los fagos de X. fastidiosa obtenidos o enriquecidos a partir de muestras de tejido vegetal o de aguas residuales formaron placas de lisis en X. fastidiosa fue de interés determinar si los componentes de la superficie celular podrían servir como sitios de adsorción. Los sitios de adsorción conocidos para fagos incluyen proteínas de superficie tales como OmpA y OmpF, el núcleo y la cadena O del LPS bacteriano en bacterias Gram negativas, el sexo y los pili de tipo IV y los flagelos. El tipo silvestre y un mutante derivado con una deleción de pilA, que da como resultado un derivado desprovisto de pili de tipo IV, se evaluaron como huéspedes para los fagos Xfas. Todos los bacteriófagos evaluados formaron placas de lisis en la cepa XF15 de tipo silvestre pero no en el mutante XF15ApilA. Los resultados sugirieron que los pili de tipo IV pueden ser un sitio primario de adhesión para los fagos Xfas.

En base a los resultados obtenidos con XF15-ApilA, fue de interés determinar si los mutantes por deleción de pilA de la cepa EC-12 de especie de Xanthomonas serían insensibles a los fagos Xfas Xfas103, Xfas106 Xfas302, Xfas303 Xfas304 y Xfas306. La cepa EC-12ApilA fue insensible a los fagos en los ensayos de titulación en placa, y en un experimento de adsorción con el fago Xfas303 no se observó adsorción al huésped. El EC-12ApilA complementado en trans para el pilA fue sensible a todos los fagos evaluados. Esto demostró aún más que los pili de tipo IV son un sitio primario de adhesión para los fagos como se observa para X. fastidiosa.

Ejemplo 9

Aislamiento del ADN de los bacteriófagos y secuenciación del genoma

El ADN genómico de los bacteriófagos se preparó a partir de 10-20 ml de lisados de bacteriófagos purificados con CsCl, de alto título (> 1 x 109 UFP/ml) y esterilizados por filtración con el uso de una forma modificada del kit Promega Wizard DNA Clean-up (Promega). Brevemente, se digirió 10-20 ml de lisado de bacteriófago con DNasa I y RNasa A (Sigma) a 10 |jg/ml cada una a 37 °C durante 30 minutos y se precipitó en presencia de polietilenglicol 8000 al 10 % (p/v) y NaCI 1 M durante 16-20 h a 4 °C. El precipitado se centrifugó a 10.000 x g, 4 °C durante 10 minutos y el sedimento se resuspendió en 0,5 ml de tampón P. Se añadió un ml de la resina de purificación de ADN suministrada con el kit Wizard al bacteriófago resuspendido, se aplicó en una minicolumna y se lavó con 2 ml de isopropanol al 80 % (v/v). El ADN se eluyó de la resina mediante la adición de 100 j l de agua precalentada a 80 °C seguido inmediatamente de la centrifugación de la minicolumna. La integridad del ADN se comprobó mediante su análisis en un gel de agarosa al 0,8 % y la tinción con bromuro de etidio y el ADN se cuantificó por densitometría de banda. El tamaño del genoma del bacteriófago se estimó mediante análisis de electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) del ADN genómico en un gel de agarosa al 1 % (agarosa de campo pulsado, BioRad) y comparación con un marcador de tamaño (MidRange Marker I, NEB).

Los fagos se secuenciaron con el uso de pirosecuenciación "454" (Roche/454 Life Sciences, Branford, CT, EE.UU., en Emory GRA Genomics Core: Univ. de Emory, Atlanta, GA). El ADN genómico de los bacteriófagos se preparó a partir de aislamientos de bacteriófagos como se describió anteriormente y se mezcló en cantidades equimolares a una concentración final de aprox. 100 ng/jl. El ADN mezclado se fragmentó, se ligó con una etiqueta de identificación múltiple (MID) específica para cada uno de los cuatro grupos y se secuenció por pirosecuenciación con el uso de una reacción de placa completa en un secuenciador Roche FLX Titanium de acuerdo con los protocolos del fabricante. El ADN de bacteriófagos mezclados estuvo presente en dos reacciones de secuenciación. La reacción contenía ADN genómico que representa 39 elementos genómicos que suman aprox. 3.331 kb de secuencia genómica, y el experimento de secuenciación produjo 987.815 lecturas con una longitud promedio de 405 pb, lo que proporciona una cobertura total de 120 veces para la mezcla completa. Los resultados filtrados del diagrama de flujo de FLX Titanium correspondientes a cada uno de los cuatro grupos se ensamblaron individualmente con el uso del ensamblador Newbler versión 2.5.3 (454 Life Sciences) mediante el ajuste de la configuración para incluir solamente las lecturas que contengan un solo identificador MID por ensamblaje. La identidad de los cóntigos individuales se determinó por PCR con el uso de cebadores generados contra secuencias de cóntigos y preparaciones de ADN genómico de bacteriófagos individuales como molde; la generación del producto de tamaño esperado a partir de un molde de ADN de bacteriófago se usó para comparar los fagos individuales con sus cóntigos. Se usó Sequencher (Gene Codes Corporation) para el ensamblaje y edición de las secuencias. Las regiones codificantes de proteínas se predijeron con el uso de Genemark (opal.biology.gatech.edu/GeneMark/gmhmm2_prok.cgi) y se editaron manualmente en Artemis (www.sanger.ac.uk/Software/Artemis/) (Lukashin y otros, Nucleic Acids Research 26(4):1107-1115, 1998; Rutherford y otros, Bioinformatics 16(10):944-945, 2000). Los diagramas de puntos se generaron con el uso de DOTTER (Brodie y otros, Bioinformatics 20(2):279-281, 2004). Las proteínas predichas se compararon con proteínas en la base de datos GenBank con el uso de BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi). Los ominios conservados, las señales de procesamiento de lipoproteínas y los dominios transmembrana (TMD) se identificaron con InterProScan (www.ebi.ac.uk/Tools/webservices/services/interproscan), LipoP (www.cbs.dtu.dk/services/LipoP/) y TMHMM (www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/), respectivamente.

TABLA 3. Tamaño genómico de los fagos Xfas.

Tabla 3

Ejemplo 10

Análisis genómico de fagos Xfas y descripción de los tipos de fagos Xfasl 00 y Xfas300

Se aislaron los fagos que requieren los pili de tipo IV para la infección por su capacidad de atacar a EC-12 de Xanthomonas y X. fastidiosa y subespecies y todos son virulentos, dado que no pueden aislarse colonias lisogénicas de las infecciones y no se encuentran genes asociados con el estilo de vida atemperado (represor, integrasa) en las secuencias genómicas. Los fagos pueden clasificarse adicionalmente en dos tipos de fagos, como se define en Casjens y otros (Research in Microbiology, 159:340-348, 2008).

(1) Tipo de fago Xfas100: el tipo de fago Xfas100 está compuesto por Sifófagos virulentos (ICTV Siphoviridae) de Xanthomonas y Xylella, cuyos prototipos son los fagos Xfas101, Xfas102, Xfas103, Xfas104, Xfas105, Xfas106, Xfas107, Xfas108, Xfas109 y Xfas110 (Tabla 12) y ejemplos adicionales de los cuales se relacionan en la Tabla 3 como cualquier fago designado "Xfas1nn", donde n es cualquier número (denominado la serie Xfas 100). Este sistema de nomenclatura flexible es necesario porque se prevé que se aislarán otras variantes del tipo de fago Xfas1nn. Los fagos de tipo Xfas100 son sifófagos, tienen un estilo de vida virulento y requieren los pili de tipo IV para la infección de especies de Xylella y Xanthomonas. Los fagos de tipo Xfas100 tienen cabezas de cápside icosaédricas que miden aproximadamente 55-77 nm de diámetro y colas flexibles de aproximadamente 200-262 nm de longitud; ambos valores dimensionales se determinan dentro de la precisión estándar de la microscopía electrónica de tinción negativa (ver las Figuras 2 y 3). El ADN viral de la serie Xfas100 tiene extremos cohesivos (cos) caracterizados por salientes de ADN monocatenario (Casjens, y otros, Methods Mol Biol 502: 91-111, 2009), lo cual es importante para que los fagos se usen en aplicaciones antibacterianas porque el empaquetamiento del ADN de cos evita la generación de partículas transductoras generalizadas que potenciarían la transferencia de determinantes de la patogénesis. El genoma de Xfas100 tiene una organización general característica (ver la Figura 4) con los genes dispuestos en dos grupos de genes divergentes, Al y Ar y Bl y Br. El tipo de fago Xfas100 se distingue además por el hecho de que los genes estructurales y de lisis esenciales del fago se agrupan en el grupo de genes Bl hacia la derecha. El tipo de fago de la serie Xfas100 se distingue además por codificar su propia ADN polimerasa de molécula única (Xfas103gp71 y Xfas106gp66), primasa (Xfas103gp76 y Xfas106gp71) y helicasa (Xfas103gp69 y Xfas106gp64).

(2) Tipo de fago Xfas300: el tipo de fago Xfas300 está compuesto por podófagos virulentos (ICTV Podoviridae) de Xanthomonas y Xylella, cuyos prototipos son los fagos Xfas301, Xfas302, Xfas303, Xfas304, Xfas305 y Xfas306, y ejemplos adicionales de los cuales se relacionan en la Tabla 3, y se refiere a cualquier fago con la designación "Xfas3nn" donde n es cualquier número (denominado serie Xfas300). Este sistema de nomenclatura flexible es necesario porque se prevé que se aislarán otras variantes del tipo de fago Xfas300. Los fagos de tipo Xfas300 tienen cabezas de cápside icosaédricas que miden aproximadamente 58-68 nm de diámetro; este valor dimensional se determina dentro de la precisión estándar de la microscopía electrónica de tinción negativa (ver las Figuras 1 y 3). El genoma de Xfas302-306 codifica una ARN polimerasa de subunidad única ubicada adyacente a la región de proteínas estructurales. El genoma de la serie Xfas300 tiene una organización general característica (ver la Figura 5) con los genes dispuestos en una cadena, que incluyen los genes de replicación, estructurales y de lisis del fago. El tipo de fago Xfas300 se distingue además por codificar su propia ADN polimerasa de molécula única (Xfas302gp18, Xfas303gp17, Xfas304gp17 y Xfas306gp17), ARN polimerasa de subunidad única (Xfas302gp31, Xfas303gp28, Xfas304gp27 y Xfas306gp30, respectivamente, y helicasa (Xfas302gp15, Xfas303gp14, Xfas304gp15 y Xfas306gp14 (ver la Figura 5 para ver el esquema del genoma del fago).

Ejemplo 11

Estudios de movimiento, exposición y protección en vides con el uso del bacteriófago Xfas304

El bacteriófago Xfas304 es un miembro de la familia Podoviridae, aislado de muestras ambientales, que tiene un rango de huéspedes que incluye X. fastidiosa y especies de Xanthomonas. En los estudios presentados en este documento, el movimiento y la persistencia de Xfas304 se determinó en vides en ausencia de un huésped sensible, para determinar si el tratamiento de una planta con bacteriófago puede prevenir la infección posterior por X. fastidiosa. Además, las vides que se inocularon primero con X. fastidiosa se expusieron después al bacteriófago Xfas304 a las 4 semanas posteriores a la inoculación del patógeno, para determinar si el bacteriófago podría controlar terapéuticamente el desarrollo de la enfermedad de Pierce.

Para los estudios de prevención, las vides se inocularon con 40 |_il de una suspensión del bacteriófago Xfas304 (1 x 1010 UFP/ml) y después se expusieron a X. fastidiosa a las 4 semanas posteriores a la inoculación del bacteriófago. Las suspensiones bacterianas de X. fastidiosa usadas para la inoculación se ajustaron por espectrofotometría (A600 = 0,4; 1 X 109 UFC/ml). Los cordones individuales se inocularon entre el segundo y el tercer nódulo en sitios opuestos (dos puntos/cordón) con 40 |_il de la suspensión bacteriana con el uso de la técnica de inoculación con aguja como se describe por Hopkins (Plant Dis. 89: 1348-1352, 2005). Las vides de control se inocularon de forma simulada con tampón fosfato en el mismo punto de inoculación de las anteriores.

Los resultados indicaron que el bacteriófago Xfas304 puede usarse para tratar y prevenir la enfermedad de Pierce causada por X. fastidiosa subespecie fastidiosa en vides. Por lo tanto, el bacteriófago Xfas304 y otros fagos virulentos de Xylella-Xanthomonas identificados a partir de estos estudios tienen un uso potencial en la protección y el tratamiento de las plantas contra enfermedades causadas por otras subespecies de X. fastidiosa y especies de Xanthomonas.

Las bacterias usadas en el estudio incluyeron las cepas Temecula (XF15) y XF54 de X. fastidiosa, asociadas con la enfermedad de Pierce de la vid en California y Texas, respectivamente. Los cultivos de X. fastidiosa se mantuvieron en medio PW-M agar (Summer y otros, J Bacteriol 192(1 ):179-190, 2010) a 28 °C durante 5-7 días. Se usaron cultivos de cinco días de los aislamientos de X. fastidiosa cultivados en PW-MA para preparar suspensiones bacterianas en tampón fosfato (0,125 M, pH 7,1) para las inoculaciones en las vides.

El clon 08 latente de V. vinifera cv. Cabernet Sauvignon en portainjerto 1103P se adquirió en el vivero Vintage Nurseries (Wasco, California, EE.UU.). Las vides se plantaron en macetas de 7 galones con el uso de la mezcla 101 Sunshine Mix 1 (Sun Gro Horticulture, Vancouver, Columbia Británica, Canadá). Las plantas se cultivaron en un invernadero en un ciclo de 16 h de luz (26 °C, 300-400 |jE/mzs)/8 h de oscuridad (18 °C) complementado con iluminación de lámparas de vapor de sodio. Las plantas se regaron cada dos días con agua del grifo. Cada 15 días, las vides se fertilizaron con fertilizante y micronutrientes de uso general 20-20-20 de Peter. Las plantas se podaron progresivamente para proporcionar plantas uniformes de la siguiente manera: tras producir dos brotes solitarios no ramificados de 100-150 cm, se podaron dos brotes a 80 cm. Se eliminaron brotes laterales y las yemas. Se arrodrigaron dos cordones y se dejaron crecer hasta que cada cordón tuvo ~2,5-2,75 m de longitud antes de que las vides se usaran para los experimentos anteriores.

Se obtuvieron los gráficos de líneas de qRT-PCR estándar para las cepas XF15 y XF54 de X. fastidiosa, así como para el bacteriófago Xfas304, todos los cuales tenía valores de R2 de más de 0,9 y eficiencias de 157 %, 130 % y 123 %, respectivamente. La evaluación cuantitativa de cordones duplicados de muestras triplicadas de XF15 y XF54 mostró la distribución de los patógenos a lo largo de todos los segmentos analizados, con síntomas visibles típicos de la enfermedad de Pierce (PD), tales como que las hojas se vuelven ligeramente amarillas o rojas a lo largo de los márgenes, respectivamente, y eventualmente los márgenes foliares se secan o mueren en sus zonas en la semana 8 posterior a la inoculación (Figura 6). En las vides inoculadas con el bacteriófago Xfas304, en ausencia de un huésped permisivo, se observó una progresión en la distribución del bacteriófago a las 2, 4 y 6 semanas posteriores a la inoculación, con una disminución entre las semanas 8-12 y sin síntomas en la vid.

Ejemplo 12

Inoculación de vides con bacterias y bacteriófago

Para la evaluación terapéutica del tratamiento con bacteriófago, se inocularon 15 vides (dos cordones cada una) con las cepas XF15 o XF54 de X. fastidiosa. Las suspensiones bacterianas usadas para la inoculación se ajustaron por espectrofotometría (A600 = 0,4; 1 X 109 UFC/ml). El promedio de los resultados de qRT-PCR de tres segmentos (por ejemplo, 1/1a, 1/1b, 1/1c) con ubicaciones similares de vides por triplicado se usó para determinar las UFC/gramo de tejido vegetal (gpt) y las UFP/gpt. Los cordones individuales se inocularon entre el segundo y el tercer nódulo en sitios opuestos (dos puntos/cordón) con 40 |_il de la suspensión bacteriana con el uso de la técnica de inoculación con aguja como se describe por Hopkins (Plant Dis. 89: 1348-1352, 2005). Las vides de control se inocularon de forma simulada con tampón fosfato siguiendo el mismo protocolo. A las cuatro semanas posteriores a la inoculación con el patógeno, las 15 vides de cada tratamiento se expusieron a 40 |_il de una suspensión del bacteriófago Xfas304 (1 X 1010 UFP/ml) con el uso del mismo protocolo y técnica de inoculación. Las vides se calificaron en cuanto al desarrollo de los síntomas dos veces por semana durante 12 semanas y se analizaron por triplicado para detectar X. fastidiosa y bacteriófago en el momento de la inoculación, y a las 8, 10 y 12 semanas, como se describe a continuación. Para determinar si el bacteriófago podría actuar de manera preventiva, se inocularon nueve vides (dos cordones cada una) con 40 |_il de bacteriófago Xfas304 con el uso del mismo protocolo de inoculación y la misma técnica de inoculación anteriores. A las cuatro semanas posteriores a la inoculación del bacteriófago, las vides se expusieron a 40 |_il (A600 = 0,4; 1 X 109 UFC/ml) de la cepa XF15 con el uso de los mismos protocolos de inoculación anteriores.

Para evaluar el movimiento bacteriano y de bacteriófagos en la vid, se inocularon 15 vides con XF15 o XF54 y se inocularon 24 vides con bacteriófago Xfas304 solamente con el uso de los mismos protocolos de inoculación anteriores. Las vides inoculadas con XF15 o XF54 se analizaron por triplicado inmediatamente después de la inoculación y en las semanas 8, 10 y 12 posteriores a la inoculación. Las vides inoculadas con bacteriófago se analizaron por triplicado inmediatamente después de la inoculación y cada dos semanas durante 12 semanas. Los métodos de ensayo se describen a continuación.

Para determinar cómo afectaría el bacteriófago a las poblaciones de patógenos y el desarrollo de la enfermedad en las vides, las vides inoculadas con X. fastidiosa se expusieron al bacteriófago Xfas304 a las cuatro semanas posteriores a la inoculación del patógeno. A las 8 semanas posteriores a la inoculación con XF15, las vides expuestas a Xfas304 en la semana 4 no mostraron síntomas de PD y las poblaciones bacterianas fueron de uno a tres logaritmos más bajas en las vides expuestas al bacteriófago en comparación con las vides no expuestas. Las plantas que no se expusieron al bacteriófago mostraron síntomas de PD (Figura 7, columna 2), mientras que las vides expuestas al bacteriófago no mostraron síntomas de PD después de la semana 5 (Figura 7, columna 6). Durante las semanas 8 a 12 posteriores a la inoculación de XF15 (semanas 4 a 8 posteriores a la exposición a Xfas304), no se observaron síntomas de PD en las vides expuestas al bacteriófago y las poblaciones de XF15 continuaron disminuyendo a niveles casi indetectables en comparación con las vides que no se expusieron al bacteriófago.

Una evaluación cuantitativa de la población de bacteriófagos en presencia y ausencia de un huésped introducido (XF15) indicó que los bacteriófagos pudieron replicarse en huéspedes sensibles que crecían en las vides y disminuían en ausencia de huéspedes sensibles. Los experimentos con la cepa XF54 expuesta a Xfas304 a las 4 semanas posteriores a la inoculación del patógeno mostraron resultados similares a los observados para las vides expuestas a XF15. La población de XF54 en extractos de vid, medida por UFC/ml de extracto, disminuyó de las semanas 8 a 12 en las vides expuestas al bacteriófago en comparación con la observada en las vides que no se expusieron al bacteriófago. En las semanas 8 a 12 posteriores a la inoculación de XF54 (semanas 4 a 8, posteriores a la exposición a Xfas304), no se observaron síntomas de PD en las vides expuestas a bacteriófagos (Figura 7, columna 7). La población de bacteriófagos se incrementó durante el período posterior a la exposición en presencia de XF54 y disminuyó en ausencia de un huésped, lo que indica nuevamente que el bacteriófago pudo replicarse en huéspedes sensibles cuando estaban presente en las vides. Un resumen del estudio de exposición se presenta en la Figura 7, que muestra que en las vides inoculadas con XF15 o XF54 expuestas al bacteriófago Xfas304 (semana 4 posterior a la inoculación del patógeno) no se observaron síntomas adicionales de PD después de la semana 5 (Figura 7, columnas 6 y 7), mientras que se desarrollaron síntomas hasta la semana 9 y 10 en las vides que no se expusieron al bacteriófago inoculadas con la cepa XF15 o XF54, respectivamente (Figura 7, columnas 2 y 3).

Se realizaron estudios adicionales con vides inoculadas con el bacteriófago Xfas304 y expuestas después a XF15 en la semana 4 posterior a la inoculación del bacteriófago para determinar el potencial de protección (profiláctico) del tratamiento con bacteriófago. En las semanas 4 y 8 posteriores a la exposición a XF15, las vides no mostraron síntomas de PD (Figura 7, columna 8), mientras que las vides que no se trataron con el fago desarrollaron síntomas (Figura 7, columna 2). La población de bacteriófagos se incrementó de la semana 8 a 12 posteriores al período de exposición en presencia de XF15 y disminuyó en ausencia de un huésped.

Estos resultados confirman que el tratamiento con bacteriófago previene o reduce los síntomas de PD por X. fastidiosa en una planta y que el tratamiento con fago no causa efectos adversos en una planta.

Ejemplo 13

Recolección y procesamiento de las muestras.

Los cordones duplicados de cada vid se dividieron en 5-6 segmentos y los segmentos se numeraron de abajo hacia arriba. Cada segmento se homogeneizó con el uso de un homogeneizador PRO250 con generador de 20 X 115 mm (PRO Scientific, CT, EE.UU.) en 15 ml de tampón P (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 100 mM, MgSO48 mM), se filtró a través de una tela de gasa estéril (Fisher Scientific, EE.UU.) para eliminar los restos de tejido vegetal. Para analizar el bacteriófago, el filtrado se centrifugó (10.000 x g durante 15 min) y se esterilizó por filtración. El filtrado se usó para la extracción del ADN de bacteriófago. Se usó el mismo protocolo para los ensayos bacterianos, excepto que el sedimento se resuspendió en 1 ml de agua Milli-Q para la extracción del ADN bacteriano.

Ejemplo 14

Tratamiento de muestras con propidio monoazida (PMA)

El protocolo de PMA descrito por Nocker (J Microbiol Meth 67: 310-20, 2006) se usó para excluir las células muertas de X. fastidiosa de los ensayos usados para desarrollar curvas estándar para los ensayos y para el análisis de los extractos de tejidos de vid. Brevemente, PMA (Biotium Inc., Hayward, CA) se disolvió en dimetilsulfóxido al 20 % (Sigma-Aldrich, Alemania) para producir una solución de reserva de 20 mM y se almacenó en la oscuridad a -20 °C. Se añadió un volumen de 1,25 |_il de la solución de reserva de PMA a 500 |_il de suspensiones de células de X. fastidiosa (A600 = 0,4; 1 X 109 UFC/ml) o extractos de vides de control e inoculadas. Las preparaciones se incubaron en tubos de microcentrífuga transparentes en la oscuridad durante 5 minutos con inversión repetida. Después de la incubación, los tubos de microcentrífuga se colocaron en hielo y se expusieron a una fuente de luz halógena de 650 W (Ushio, EE.UU.) a una distancia de 20 cm durante 1 minuto. Los tubos se agitaron brevemente de manera manual cada 15 s y se invirtieron después de 30 s de iluminación para garantizar la reticulación completa del ADN disponible y la conversión del PMA libre a hidroxilamino propidio. Después de la reticulación fotoinducida, las células viables se recolectaron por centrifugación a (12.000 x g durante 2 minutos a 25 °C) y se lavaron con 500 |_il de agua destilada estéril y se resuspendieron en agua Mili-Q para la extracción del ADN.

El ADN bacteriano se extrajo a partir de las preparaciones de células tratadas con PMA y los extractos de vid con el uso de un kit minipreparativo de ADN fúngico/bacteriano ZR (Zymo Research, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante.

El ADN de bacteriófago de las preparaciones de control y de los extractos vegetales se extrajo con el uso del sistema Wizard DNA Cleanup (Promega, WI, EE.UU.) con las modificaciones descritas por Summer (Methods Mol. Biol. 502: 27­ 46, 2009).

Ejemplo 15

Detección de X. fastidiosa y bacteriófago Xfas304 con el uso de PCR en tiempo real

Se realizó una PCR en tiempo real (RTPCR) basada en SYBR Green en el sistema de PCR en tiempo real 7500 (Applied Biosystems, CA, EE.UU.) con el uso de los cebadores específicos para X. fastidiosa INF2 5'-GTTTGATTGATGAACGTGGTGAG-3' (SEQ ID NO:1) e INR1 5'-CATTGTTTCTTGGTAGGCATCAG-3' (SEQ ID NO:2) diseñados para el gen gyr B (Bextine y Child, FEMS Microbiology Letters 276: 48-54, 2007), y los cebadores específicos para el bacteriófago Xfas304 304-PrimF 5'-AAGAAGCGTGGTTTGTTTGC-3' (SEQ ID NO:3) y 304-PrimR 5'-CTACCGGCTTCCCTAACTCC-3' (SEQ ID NO:4) diseñados para el gen de la ADN primasa. Se preparó una mezcla maestra con el uso de 10 j l de Express SYBR GreenER SuperMix (Invitrogen), 0,4 j l de ambos cebadores (a una concentración de 10 j M), 8,56 j l de agua estéril de grado molecular, 0,04 j l de colorante de referencia ROX (Invitrogen) y 1 j l de molde de a Dn por reacción. Se usaron condiciones estandarizadas para todas las reacciones con una etapa de desnaturalización inicial de 3 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de los siguientes parámetros: 95 °C durante 30 s, 55 °C durante 30 s y 72 °C durante 30 s. Al final de la PCR, la temperatura se incrementó de 72 a 99 °C a una velocidad de 0,5 °C/10 s, y la fluorescencia se midió cada 10 s. Cada muestra de ADN se analizó por triplicado. Como control positivo, se extrajo el ADN de células de X. fastidiosa y de los lisados de bacteriófago Xfas304 con el uso de los métodos descritos anteriormente. Los valores de ciclo umbral (Ct), que describen el número del ciclo de PCR en el que la fluorescencia se eleva por encima de la línea base, se determinaron con el uso del paquete de programas proporcionado por Applied Biosystems.

Para determinar la curva estándar para la cuantificación absoluta, se trataron volúmenes de 1 ml de suspensiones de células de XF15 y XF54 de 1 x 108 UFC/ml con el uso del protocolo de PMA. El ADN bacteriano se extrajo como se describió anteriormente, se diluyó en serie de 1 X 10-1 a 1 X 10-5 y se sometió al ensayo de PCR en tiempo real descrito anteriormente. De manera similar, el ADN de bacteriófago se extrajo a partir de un volumen de 1 ml de bacteriófago Xfas304 a 1 X 109 UFP/ml como se describió anteriormente, se diluyó de 1 X 10-1 a 1 X 10-6 y se sometió al ensayo de PCR en tiempo real. Se usaron tres réplicas de cada muestra para X. fastidiosa y bacteriófago Xfas304 para producir las curvas estándar. Las curvas estándar se construyeron mediante la representación gráfica de los valores de Ct generados a partir de la PCR en tiempo real contra las concentraciones de ADN de X. fastidiosa (Log conc. ADN/jl determinado por A260). La eficiencia (E) se calculó de la siguiente manera: E = 10<-1/Pendiente)-1 (Klein y otros, Electrophoresis 20: 291-299, 1999).

Ejemplo 16

Estudios de ensayo de formación de lisógenos

Para analizar la formación de lisógenos de fagos, se evaluó la presencia de profagos en los sobrevivientes de la infección por fagos. Para cada fago, las bacterias se infectaron con una MOI inicial de ~3 y se sembraron en una capa de agar suave. Las placas se supervisaron para el crecimiento de colonias (10-15 días para la cepa Temecula de X. fastidiosa y 2-3 días para la cepa EC-12 de Xanthomonas). Las colonias individuales que surgieron se escogieron, se purificaron (tres veces) y se volvieron a evaluar para determinar la sensibilidad a los fagos mediante la aplicación de gotas de diluciones del mismo fago en una capa de agar blando. Los pares de cebadores específicos para el gen de la helicasa de Xfas 103 y Xfas 106, o el gen de la primasa de Xfas 303 y Xfas 304 (Tabla 5) se usaron después para evaluar la presencia de secuencias de profagos en los aislamientos insensibles a los fagos. Se usó ADN bacteriano de tipo silvestre como control negativo y el ADN bacteriano de tipo silvestre enriquecido con ADN de fago sirvió como control positivo.

Para evaluar si podían encontrarse pruebas de lisogenia abortiva (es decir, el establecimiento de la represión), se siguió el procedimiento de Gill y otros (Gill J. J., y otros, J. Bacteriol., 193: 5300-5313 (2011)), excepto que los fagos unidos de forma reversible se eliminaron mediante tres lavados sucesivos. Los cultivos líquidos de la cepa EC-12 de Xanthomonas en crecimiento logarítmico se cultivaron hasta una OD600 de ~0,3-0,5. Alícuotas de un ml se sedimentaron por centrifugación y se resuspendieron en 0,20 ml de lisado de fago (cosechado en TNB) o TNB estéril. Después de una incubación de 30 minutos a 25 °C, las mezclas de fagos y células se centrifugaron y el sobrenadante se extrajo y se tituló para determinar el fago adsorbido. En experimentos preliminares se determinó que los fagos estaban unidos de forma reversible, lo que afectó el cálculo real de MIO (Kasman, L. M., y otros, J. Virol., 76: 5557-5564 (2002)). Para evitar este problema y obtener una MOI real exacta, las células se resuspendieron en TNB estéril, se incubaron durante 5 minutos a 25 °C, se centrifugaron y se extrajeron los sobrenadantes. Este procedimiento se repitió tres veces para eliminar el fago no unido. Cada sobrenadante se tituló para determinar las UFP. Los sedimentos de células se resuspendieron en 0,20 ml de TNB estéril, se diluyeron en serie y se sembraron para contar los sobrevivientes bacterianos restantes tras la exposición al fago. A partir de estos datos, se calculó la MOI real, es decir, la relación entre el número de fagos adsorbidos respecto al número de UFC en los controles sin fagos). Estos valores de MOI real se usaron para calcular la proporción predicha de células no infectadas con el uso de la distribución de Poisson. Este experimento se repitió tres veces, con el uso de Xfas 103 y Xfas 303.

Lisogenia.

Para examinar el potencial de lisogenia, se recuperaron 40 aislamientos insensibles a los fagos de cada una de la cepa Temecula de X. fastidiosa y la cepa EC-12 de Xanthomonas después de una exposición a los fagos Xfas 103, Xfas 106, Xfas 303 o Xfas 304. La PCR con el uso de cebadores específicos para fagos no detectó la presencia de lisógenos de fagos en aislamientos resistentes, lo que indica que la resistencia no se debió a la lisogenia. Además, se examinó el potencial de lisogenia abortiva con el uso de infección a una MOI alta y medición de la supervivencia (Gill y otros (2011)). Como se muestra en la Tabla 4, después de la infección, no hubo diferencias significativas entre los sobrevivientes predichos y los reales, lo que indica que la infección por fagos con una MOI alta no condujo al establecimiento de la represión. En conjunto, estos resultados indican que no hay pruebas de lisogenia o represión, lo que respalda la conclusión de que los cuatro fagos son virulentos.

Tabla 4 Sobrevivientes bacterianos predichos en base a la MOI real en comparación con los sobrevivientes bacterianos medidos de la cepa EC-12 de Xanthomonas después de la exposición a los fagos Xfas 103 o Xfas 303a.

Núm. de réplica MO|real % Predicho de % Medido de células Exceso en veces de células sobrevivientes sobrevivientes sobrevivientes frente a predicción Xfas 103 1 6,51 0,15 0,12 0,8

2 5,57 0,38 0,25 0,65

3 5,99 0,30 0,24 0,80

Xfas 303 1 5,40 0,45 0,38 0,80

2 5,39 0,45 0,49 1,08

3 5,52 0,40 0,37 0,92

a Los sobrevivientes predichos se calcularon a partir de la distribución de Poisson para la MOI real medida. Los datos mostrados son de tres experimentos replicados independientes.______________________________

Ejemplo 17

Estudios de prevención y protección con cóctel de fagos

Cepas bacterianas, fagos y preparación del inóculo: los aislamientos bacterianos usados en el estudio fueron las cepas Temecula (XF15) y x F54 de X. fastidiosa (ver el Ejemplo 3). Los cultivos de X. fastidiosa se mantuvieron en PW-M como se describe en el Ejemplo 1. Los inóculos de XF15 y XF54 se prepararon como se describe en el Ejemplo 11. Se prepararon y titularon lisados de fago de alto título de Xfas303, Xfas304, Xfas103 y Xfas106 (1 x 1010 UFP/ml) como se describe en el Ejemplo 3. El cóctel de fagos se preparó mediante la mezcla de cada uno de los cuatro fagos para obtener una concentración final de 1 X 1010 UFP/ml para cada fago en el cóctel.

Inoculación de vides con bacterias y cóctel de fagos: las vides se inocularon con la cepa XF15 o XF54 de X. fastidiosa para evaluar el movimiento bacteriano en la vid. Las vides se analizaron por triplicado inmediatamente después de la inoculación (0 min) y a las 8 y 12 semanas posteriores a la inoculación. Además, a las 3 semanas posteriores a la inoculación las vides inoculadas con XF15 o XF54 se expusieron al cóctel de fagos para evaluar su eficacia terapéutica. En la semana 3 posterior a la inoculación de los fagos las vides inoculadas con el cóctel de fagos se expusieron a XF15 o XF54 para evaluar la eficacia preventiva del cóctel. Las vides de cada tratamiento se calificaron en cuanto al desarrollo de los síntomas dos veces por semana. Para determinar la distribución de los fagos individuales que comprenden el cóctel, las vides se analizaron en las semanas 0, 2, 4, 6, 8, 10 y 12 posteriores a la inoculación como se describe a continuación. Las vides inoculadas en estudios de exposición a fagos o patógenos se analizaron para detectar la infección por fagos y/o X. fastidiosa en las semanas 0, 6, 8, 10 y 12 como se describe a continuación. Las vides de control se analizaron a las 0, 8 y 12 semanas posteriores a la inoculación para supervisar la distribución del patógeno y el desarrollo de la enfermedad. Todos los ensayos en vides se realizaron por triplicado con vides que contenían dos cordones. Cada cordón (por ejemplo Cordón1 = S1 o Cordón2 = S2) se dividió en 5-6 segmentos (de 5 pulgadas). Los segmentos de vid se numeraron desde el punto de inoculación (0) y se numeraron como abajo (-) o arriba (+) del punto de inoculación en segmentos de 5 pulgadas. La parte de la raíz se dividió en tres segmentos: R1, R2 o R3.

Recolección y procesamiento de las muestras: para la cuantificación de los fagos del cóctel y los patógenos, las muestras se obtuvieron como se describe en el Ejemplo 13. Para el análisis de los fagos, el filtrado se centrifugó (10.000 X g a 4 °C durante 15 min) y se esterilizó por filtración. El filtrado se usó para la extracción del ADN de fago para llevar a cabo la PCR cuantitativa en tiempo real (qRTPCR) (ver a continuación). Se usó el mismo protocolo que para los ensayos bacterianos, excepto que el sedimento se resuspendió en 1 ml de agua Milli-Q para el aislamiento del ADN bacteriano usado en qRTPCR. El promedio de los resultados de qRTPCR de tres segmentos (por ejemplo, 0a, 0b, 0c) con ubicaciones similares de vides por triplicado se usó para determinar las UFC y UFP. Para determinar si la X. fastidiosa resistente a fagos se desarrollaría como resultado de los experimentos de exposición a los fagos, las muestras recolectadas de vides en la semana 12 posterior a la inoculación del patógeno se procesaron como se describe en el Ejemplo 13. Brevemente, 100 j l de una suspensión del sedimento en 1 ml de Milli-Q se sembró en PW-MA (Ejemplo 1) complementado con 40 |jg/ml de cicloheximida (PW-MAC) y se incubó a 28 °C. Después de 10-12 días, las colonias individuales se escogieron y se purificaron 3 veces por estrías en PW-MAC. Se confirmaron colonias individuales representativas (20 colonias en total) de cada muestra de vid a nivel de especie y subespecie con el uso de análisis de PCR como se describe por Hernández-Martínez y otros (Ejemplo 1). La sensibilidad a los fagos de los aislamientos confirmados se determinó mediante el ensayo de aplicación de gotas de diluciones en serie sobre capas y el método de capa de agar blando como se describe en el Ejemplo 3.

Tratamiento con PMA y qRTPCR: los protocolos de tratamiento con PMA y de qRTPCR basada en SYBR-green se realizaron como se describe en el Ejemplo 15 con el uso de los cebadores específicos para X. fastidiosa INF2 (SEQ ID NO:1) e INR1 (SEQ ID NO:2) y los cebadores específicos para el bacteriófago Xfas303303-PrimF (SEQ ID NO:5) y 303-PrimR (SEQ iD NO:6), los cebadores específicos para Xfas304 304-PrimF (SEQ ID NO:3) y 304-PrimR (SEQ ID No :4), los cebadores específicos para Xfas103 103-HelF (SEQ ID NO:7) y 103-HelR (SEQ ID NO:8); y los cebadores específicos para Xfas106 106-HelF (SEQ ID NO:9) y 106-HelR (SEQ ID NO:10) que se relacionan en la Tabla 5.

Tabla 5 Cebadores usados para qRT_PCR (SEQ ID NO. 1-10)

Conjunto de

cebadores Secuencia Organismo y gen específicos Referencia

INF2 GTTTGATTGATGAACGTGGTGAG Xylella fastidiosa. Bextine y

INR1 CATT GTTT CTTGGT AGGCAT CAG gyr B Child, 2007

303-PrimF AACT ACCT GACAGCGACT Xfas303, primasa Este trabajo

303-PrimR CGTACTAGCTTGGCTTCTA

304-PrimF AAGAAGCGTGGTTTGTTTGC Xfas304, primasa Este trabajo

304-PrimR CT ACCGGCTRCCCT AACT CC

103-HelF AACCT GAT CTGGT ACGAC Xfas103, helicasa Este trabajo

103-HelR GGACATTTTT CAGTT CT CT C

106-HelF CAACCT CAT CTGGTAT GAC Xfas106, helicasa Este trabajo

106-HelR GT CTTGGGT AATTT CTTT CT

*Todas las reacciones de PCR se realizaron durante 40 ciclos con desnaturalización a 95 °C durante 30 segundos, hibridación a 55 °C durante 30 s y extensión a 72 °C durante 30 s.

Movimiento de X. fastidiosa y desarrollo de la enfermedad en vides: la evaluación cuantitativa de cordones duplicados de muestras triplicadas de las vides inoculadas con XF15 o XF54 mostró la distribución del patógeno en los segmentos de vid analizados. La qRTPCR detectó la presencia de un promedio de 1 X 104 y 1 X 105 UFC/g de tejido vegetal (gpt) de XF15 en el segmento (Seg) S1/1 (segmento 1 de 1,5 pulgadas del cordón por encima del punto de inoculación) y S2/1 respectivamente, y un promedio de 1 X 104 UFC/gpt de XF54 en S1/2 y S2/2 en la semana 8 posterior a la inoculación. Los síntomas típicos de la enfermedad de Pierce eran visibles, tales como hojas que se vuelven ligeramente amarillas o rojas a lo largo de los márgenes y márgenes foliares secos o necróticos en la semana 8, posterior a la inoculación en vides que no se expusieron al cóctel. En la semana 12 posterior a la inoculación, se detectó un promedio de 1 X 104 y 1 X 106 UFC/gpt de XF15 en S1/3 y S2/2, respectivamente. En el mismo intervalo de ensayo, se detectó un promedio de 1 X 105 y 1 X 104 UFC/gpt de XF54 en S1/3 y S2/1, respectivamente, en la semana 12 posterior a la inoculación, con vides que exhibían síntomas de PD. Ambos patógenos (XF15 y XF54) se detectaron en el sistema radicular de las vides en las semanas 8 y 12 posteriores a la inoculación del patógeno a un promedio de 1 X 101-1 X 102 UFC/gpt.

Movimiento de fagos y persistencia en vides: se obtuvieron gráficos de líneas de qRTPCR estándar para los fagos Xfas303, Xfas304, Xfas103 y Xfas106 que tenían valores de R2 mayores que 0,9 y eficiencias de 127 %, 123 %, 129 % y 120 %, respectivamente. La evaluación cuantitativa de cordones duplicados de muestras triplicadas de las vides inoculadas con el cóctel de fagos (Xfas303, Xfas304, Xfas103 y Xfas106) mostró la distribución de todos los fagos individualmente dentro de los segmentos de vid analizados en las semanas 2-8 posteriores a la inoculación del cóctel (Figura 8). En las semanas 8 y 12, los fagos individuales ya no eran detectables en las raíces y habían disminuido a un promedio de 1 X 101-1 X 102 UFP/gpt en la semana 12 en los segmentos analizados sin observación de síntomas en las vides (Figura 8).

Eficacia terapéutica del fago contra X. fastidiosa en vides: las vides inoculadas con XF15 se expusieron al cóctel de fagos a las tres semanas posteriores a la inoculación del patógeno. A las 8 semanas (5 semanas posteriores a la exposición al cóctel), la población de XF15 fue un promedio de 2-3 logaritmos más alta en las vides no expuestas en comparación con las vides expuestas. Las vides que no se trataron terapéuticamente mostraron síntomas típicos de PD, mientras que las vides expuestas no lo hicieron. En la semana 1 posterior a la inoculación de XF15 (9 semanas posteriores a la exposición al cóctel), las poblaciones bacterianas fueron un promedio de 2-3 logaritmos más altas en las vides no expuestas en comparación con las vides expuestas al cóctel de fagos (Figura 9). Durante todo el ensayo (12 semanas) no se observaron síntomas de PD en las vides expuestas a los fagos, mientras que las vides no tratadas con el cóctel exhibieron síntomas tan pronto como a las 4 semanas, los cuales progresaron hasta la semana 12. De manera similar, la población bacteriana en las vides expuestas al cóctel inoculadas con XF54 disminuyó significativamente de las semanas 8 a la 12 en comparación con las vides no expuestas, sin que se observaran síntomas en las vides expuestas al cóctel. La siembra en placa de extractos vegetales de vides expuestas al cóctel a las 12 semanas produjo un promedio de 1 X 102 UFC/gpt. Todos los aislamientos representativos (20 ea) confirmados como X. fastidiosa de cada cordón de cada una de las tres vides fueron sensibles a los cuatro fagos que componían el cóctel.

Eficacia profiláctica del tratamiento con cóctel para la prevención de PD en vides: la eficacia profiláctica del cóctel de fagos se evaluó en primer lugar mediante la inoculación de las vides con el cóctel y después la exposición a la cepa XF15 o XF54 de X. fastidiosa en la semana 3 posterior a la inoculación. Las vides tratadas profilácticamente no mostraron síntomas de PD en las semanas 8 y 12 posteriores a la inoculación del cóctel. En las vides inoculadas con el cóctel que se expusieron a XF15, las poblaciones de patógenos alcanzaron un máximo de un promedio de 1 X 103 UFC/gpt en los segmentos de las vides examinadas en las semanas 8 y 12, y tan alto como un promedio de 1 X 106 UFC/gpt en las vides que no se trataron profilácticamente. Se observaron resultados similares en vides tratadas profilácticamente con el cóctel y expuestas después a XF54 en la semana 3 posterior a la inoculación del cóctel de fagos. La siembra en placa de extractos vegetales de vides expuestas a cóctel a las 12 semanas produjo un promedio de 3 X 102 UFC/gpt. Todos los aislamientos representativos (20 ea) confirmados como X. fastidiosa de cada cordón de cada una de las tres vides fueron sensibles a los cuatro fagos que componían el cóctel.

Persistencia y replicación de fagos en vides: fue de interés determinar las poblaciones de fagos en vides en presencia o ausencia de huéspedes introducidos (XF15 y XF54). La cuantificación de las poblaciones de fagos en presencia o ausencia de huéspedes confirmó que los fagos del cóctel podían replicarse y mantenerse en poblaciones más altas si los huéspedes sensibles estaban presentes en las vides y después disminuían en ausencia de un huésped sensible en los estudios terapéuticos y profilácticos (Figuras 10 y 11). Las poblaciones de fagos en vides que no contienen huésped disminuyeron durante las semanas 8-12, mientras que las poblaciones de fagos se incrementaron un promedio de 1-2 logaritmos durante el mismo período en vides inoculadas con XF15 o XF54 y expuestas (tratamiento terapéutico) al cóctel de fagos (Figura 10). Se obtuvieron resultados similares en el estudio profiláctico, con poblaciones de fagos que se incrementaron un promedio de 1-2 logaritmos respecto a lo observado en vides que no contienen huésped (Figura 11). Estos resultados confirmaron que el tratamiento con bacteriófago previene o reduce los síntomas de PD por X. fastidiosa en una planta y no demuestra efectos adversos en una planta tratada.

Ejemplo 18

Transmisión de X. fastidiosa por la chicharrita de alas cristalinas

La chicharrita de alas cristalinas (GWSS), Homalodisca vitripennis, es un saltahojas que se alimenta de xilema y transmite X. fastidiosa. La GWSS prevalece en todas las regiones de cultivo de la uva del sur de California y Texas. GWSS libres de X. fastidiosa criadas en laboratorio se alimentaron de plantas de caupí (Vigna unguiculata subsp. unguiculata) que albergaban X. fastidiosa o fago virulento Xfas304 durante 48 h en tres ensayos para examinar la captación de X. fastidiosa o fago por parte de GWSS. Para determinar la capacidad de las GWSS de transmitir bacterias o fagos a las plantas, las GWSS que albergan bacterias o fagos se alimentaron de plantas libres de bacterias y fagos. Un subconjunto de GWSS que albergan bacterias se expuso por alimentación con plantas que albergan fagos durante 48 o 96 h. Las GWSS y las plantas se analizaron individualmente en todos los experimentos para evaluar la captación, transmisión o persistencia de bacterias y/o fagos con el uso de qRTPCR. Las GWSS pudieron captar y transferir X. fastidiosa y/o fagos. En las GWSS que albergan X. fastidiosa y expuestas al fago, el título del fago Xfas304 se incrementó dos veces, en comparación con el observado en GWSS libre de X. fastidiosa. Se observó una disminución de dos veces en la población bacteriana en las GWSS cuando se expusieron al fago Xfas304, en comparación con las no expuestas. Las GWSS transmitieron X. fastidiosa y/o fago a las plantas. Se cree que este es el primer informe de transferencia de fagos mediante GWSS.

Cepas bacterianas, fagos y preparación del inóculo: en este estudio se usó la cepa XF54 de X. fastidiosa (ver el Ejemplo 1) y el fago Xfas304 (ver el Ejemplo 3). El cultivo de XF54 se cultivó en PW-M como se describe en el Ejemplo 1. Se usó un cultivo de cinco días de XF54 cultivado en PW-MA para preparar suspensiones bacterianas en tampón fosfato (0,125 M, pH 7,1). Se preparó un lisado de fago de alto título de Xfas304 (1 x 1010 UFP/ml) y se tituló como se describe en el Ejemplo 3 en agua desionizada estéril (SDW, por sus siglas en inglés).

Condiciones y preparación del cultivo de plantas: las plantas de caupí (Vigna unguiculata subsp. unguiculata) se cultivaron en macetas de 3 pulgadas con el uso de mezcla Metro-Mix y se mantuvieron a 24 °C a 29 °C (16 y 8 h de luz y oscuridad, respectivamente) y se regaron según fuera necesario.

Chicharrita de alas cristalinas: las GWSS criadas en laboratorio se criaron originalmente por múltiples generaciones en invernaderos en cualquiera de los dos sitios: (i) Departamento de Alimentos y Agricultura de California (CDFA), Arvin o (ii) Extensión Cooperativa de la Universidad de California, San Marcos, CA. Todas las GWSS usadas en este estudio eran machos y hembras adultos y se transportaron desde los dos sitios anteriores. Después de recibirlos, los insectos se alimentaron de plantas de caupí mantenidas a 24 °C a 29 °C (16 y 8 h de luz y oscuridad, respectivamente), durante dos días para adaptarlos al nuevo clima antes de usarlos en los experimentos.

Diseño experimental: cada unidad experimental (es decir, jaula) contenía un tallo de caupí de 15 cm de largo en la etapa de 3-4 hojas y un tubo de fondo plano de 50 ml con 50 ml de una suspensión de fago o bacterias en SDW según corresponda. Los tallos de caupí con hojas unidas en la etapa de 3-4 hojas (tallo cortado) se recolectaron de plantas de dos o tres semanas se insertaron a través de un agujero en la tapa y se fijaron en su lugar con Parafilm (tallo cortado fijado). Las GWSS (3 GWSS/tallo cortado/jaula) se colocaron en jaulas y se les permitió alimentarse según corresponda.

Captación de X. fastidiosa y fago por GWSS: Para determinar la captación de X. fastidiosa y/o fago por GWSS, los tallos cortados de caupí con hojas unidas se fijaron en un tubo lleno con una suspensión de X. fastidiosa (1 x 109 UFC/ml) o fago Xfas304 (1 x 1010 UFP/ml) durante 4 h para permitir la captación por capilaridad de X. fastidiosa o fago. Los tallos cortados de control se colocaron en SDW. Después de permitir que los tallos cortados captaran la suspensión adecuada durante 4 h, se analizó un subconjunto (3 tallos cortados) para cuantificar X. fastidiosa o Xfas304. Después del período de captación de 4 h, se permitió que las GWSS (3 GWSS/tallo cortado/jaula) se alimentaran de los tallos cortados. Cada conjunto experimental se realizó por triplicado (1 tallo cortado X 3 GWSS X 3 jaulas). Después de 48 h, se analizaron todos los tallos cortados de caupí y las GWSS para cuantificar la presencia de X. fastidiosa y/o fago mediante qRTPCR. Se realizaron controles de captación de agua para todos los experimentos en las mismas condiciones y se analizaron para detectar X. fastidiosa y fago.

Los experimentos iniciales se diseñaron para determinar si las GWSS podían adquirir X. fastidiosa o fago de tallos cortados que albergaban el patógeno o el fago, y si es así, si podían transferir la X. fastidiosa o el fago a otros tallos cortados. Después de 48 h, los tallos cortados y las GWSS albergaron un promedio de 2 X 108 ±1 X 108 UFC/g de tejido vegetal (gpt) y 1 X 106 ±0,7 X 106 UFC/Gw Ss , respectivamente lo que confirmó que las GWSS podían adquirir X. fastidiosa como se informó anteriormente (Bextine y otros, Biotechniques 38: 184, 186, 2005). En un experimento paralelo para determinar si las GWSS podían adquirir el fago al alimentarse de tallos cortados, las GWSS analizadas después de 48 h albergaron un promedio de 2 X 106 ±0,9 X 106 UFP/GWSS que se adquirió de tallos cortados que contenían 2 X 108 ±1 X 108 UFP/gpt. Los resultados mostraron que las GWSS podían adquirir el fago al alimentarse de tallos cortados.

Captación y transferencia del fago por GWSS: para determinar la captación y transferencia del fago por GWSS, los tallos cortados de caupí (9) se fijaron en tubos de 50 ml llenos con suspensión de fago Xfas304 (1 x 1010 UFP/ml). Los controles (3 tallos cortados) se colocaron en SDW. Se permitió que ambos conjuntos de tallos cortados captaran el medio respectivo. Después de 4 h, se analizaron tres de los tallos cortados a los que se permitió captar el fago para determinar la concentración del fago. Cada uno de los 6 tallos cortados restantes se colocó en jaulas individuales con GWSS (3 GWSS/tallo cortado/jaula). Después de 48 h, se analizaron 9 GWSS y sus 3 tallos cortados respectivos para detectar el contenido de fagos y los 9 GWSS restantes se transfirieron a tallos cortados de caupí nuevos fijados en SDW (3 GWSS/tallo cortado X 3 jaulas) y se les permitió alimentarse durante 48 horas adicionales para determinar la transferencia del fago a los tallos cortados. Los tallos cortados (3) y las GWSS (9) se analizaron para detectar el fago después del período designado. Se realizaron controles de captación de agua para todos los experimentos en las mismas condiciones y se analizaron para detectar el fago.

Habiendo determinado que los GWSS pueden adquirir tanto el fago como las bacterias, fue de interés determinar si las GWSS que adquirieron el fago de los tallos cortados podrían transferir el fago y/o las bacterias a otro tallo cortado. Se transfirió un subconjunto de GWSS que albergaban fagos a tallos cortados de caupí nuevos en SDW y se les permitió alimentarse. Después de 48 h, los tallos cortados y las GWSS albergaron un promedio de 3 X 102 ±2,5 X 102 UFP/gpt y 3 X 103 ±1,6 X 103 UFP/GWSS, respectivamente, lo que indica que las GWSS podían transferir el fago.

Exposición de GWSS que albergan X. fastidiosa al fago: para determinar si el fago podría afectar a la población de X. fastidiosa en GWSS, las GWSS que albergan X. fastidiosa se expusieron al fago. Brevemente, con el uso de los métodos descritos anteriormente con réplicas por triplicado, las GWSS que se alimentaron de tallos cortados que contienen X. fastidiosa, con contenido de X. fastidiosa comprobado, se transfirieron a tallos cortados de caupí que captaron el fago Xfas304 y se les permitió alimentarse. Después de 48 o 96 h de alimentación, los tallos cortados y las GWSS se analizaron para detectar el fago y/o X. fastidiosa. Para la captación de X. fastidiosa, los tallos cortados de caupí (15) se colocaron en una suspensión de XF54 (1 x 109 UFC/ml) durante 4 h antes de introducir las GWSS. A las 4 h, se analizaron 3 tallos cortados para detectar X. fastidiosa. Cada uno de los 12 tallos cortados restantes se colocó en jaulas con 3 GWSS/tallo cortado y se permitió que los GWSS se alimentaran durante 48 h de los tallos cortados que contenían X. fastidiosa. Después de 48 h, las GWSS que se alimentaron de X. fastidiosa y los tallos cortados huéspedes se subdividieron en 3 grupos: el Grupo 1 se analizó para detectar X. fastidiosa (3 tallos cortados y 9 GWSS); el Grupo 2 (9 GWSS) se transfirió a tallos cortados de caupí nuevos (3) colocados en SDW y se permitió que se alimentaran durante 48 h antes de analizar las GWSS y los tallos cortados para detectar X. fastidiosa; el Grupo 3 (18 GWSS) se transfirió a tallos cortados de caupí (3) colocados en una suspensión de XFas304 (1 x 1010 UFP/ml) y se permitió que se alimentaran durante 48 o 96 h antes de analizar las GWSS y los tallos cortados para detectar X. fastidiosa y fago. Se realizaron controles de captación de agua para todos los experimentos en las mismas condiciones y se analizaron para detectar X. fastidiosa y fago.

Se permitió que 36 GWSS se alimentaran de tallos cortados de caupí en una suspensión de X. fastidiosa y después se analizaron para determinar la captación de X. fastidiosa, la transferencia de X. fastidiosa y/o fago, y el efecto sobre el fago y/o X. fastidiosa en GWSS. Se determinó que las GWSS (Grupo 1) que se alimentaron durante 48 h de tallos cortados que se habían colocado en una suspensión de la cepa XF54 de X. fastidiosa (3 X 109 UFC/ml) albergaban un promedio de 1 X 106 ±0,7 X 106 UFC/GWSS y se determinó que los tallos cortados para la alimentación del huésped albergaban un promedio de 2 X 108 ±1 X 108 UFC/gpt. Después de que las GWSS que albergaban X. fastidiosa (Grupo 2; 1 X 106 ±0,7 X 106 UFC/GWSS) se alimentaron de tallos cortados nuevos en SDW durante 48 h, los tallos cortados mostraron un promedio de 1 X 103 ±1,3 X 103 UFC/gpt y las GWSS un promedio de X. fastidiosa residual de 2 X 103 ±1 X 103 UFC/GWSS; lo que volvió a confirmar los resultados anteriores de la transferencia de X. fastidiosa por GWSS. El Grupo 3 de las GWSS que albergan X. fastidiosa transferidas a tallos cortados en una suspensión de Xfas304 (2 X 1010 UFP/ml) y alimentadas durante 48 h, mostró captación del fago y persistencia de X. fastidiosa. Las GWSS analizadas, a las 48 h de alimentación, albergaban un promedio de 3 X 104 ±1,8 X 104 UFP/GWSS de Xfas304 y retuvieron 2 X 103 ±1,1 X 103 UFC/GWSS de XF54. Los tallos cortados analizados en el mismo intervalo de tiempo contenían un promedio de 3 X 108 ±2 X 108 UFP/gpt y 2 X 103 ±0,6 X 103 UFC/gpt. Las GWSS que se alimentaron durante 96 h albergaron un promedio de

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES

   Un método para prevenir o reducir los síntomas o la enfermedad causados por Xylella fastidiosa en una planta, que comprende: poner en contacto dicha planta con al menos un bacteriófago virulento para Xylella fastidiosa y especies de Xanthomonas seleccionadas del grupo que consiste en bacteriófagos del tipo de fago Xfas100 y bacteriófagos del tipo de fago Xfas300, en donde el tipo de fago Xfas100 muestra las siguientes características: (a) el bacteriófago puede lisar dichas bacterias Xylella fastidiosa y Xanthomonas;

   (b) el bacteriófago infecta una célula mediante su unión a un pilus de Tipo IV;

   (c) el bacteriófago comprende una cola no contráctil y un tamaño de cápside que varía de 55-77 nm en diámetro, con una morfología típica de la familia Siphoviridae; y

   (d) el tamaño genómico del bacteriófago es de 55.500 pb a 56.200 pb; y en donde además el tipo de fago Xfas300 muestra las siguientes

   características:

   (e) el bacteriófago puede lisar dichas bacterias Xylella fastidiosa y Xanthomonas;

   (f) el bacteriófago infecta una célula mediante su unión a un pilus de Tipo IV;

   (g) el bacteriófago comprende una morfología típica de la familia Podoviridae caracterizada por una cola no contráctil con un tamaño de cápside que varía de 58-68 nm en diámetro; y

   (h) el tamaño genómico del bacteriófago es de 43.300 pb a 44.600 pb;

   en donde (i) el tipo de fago Xfas100 comprende un genoma con una secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17 y SEQ ID NO:18; o el tipo de fago Xfas300 comprende un genoma con una secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste en Se Q ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID 22, SEQ ID NO:23 y SEQ ID NO:24; o donde (ii) dicho bacteriófago virulento es al menos un bacteriófago seleccionado del tipo de fago Xfas100 y/o el tipo de fago Xfas300, en donde el tipo de fago Xfas100 es al menos un bacteriófago seleccionado del grupo que consiste en: Xfas103 y Xfas106; y el tipo de fago Xfas300 es al menos un bacteriófago seleccionado del grupo que consiste en: Xfas302, Xfas303, Xfas304 y Xfas306; en donde dichos tipos de fagos se han depositado con los números de registro de ATCC PTA-13096, PTA-13095, PTA-13098, PTA-13099, PTA-13100 y PTA-13097, respectivamente, para los fagos Xfas103, Xfas106, Xfas302, Xfas303, Xfas304, y Xfas306.

   Un método para prevenir o reducir los síntomas o la enfermedad causados por Xanthomonas en una planta, que comprende: poner en contacto dicha planta con al menos un bacteriófago virulento para Xylella fastidiosa y especies de Xanthomonas seleccionado del grupo que consiste en bacteriófagos del tipo de fago Xfas100 y bacteriófagos del tipo de fago Xfas300, en donde el tipo de fago Xfas100 muestra las siguientes características: (a) el bacteriófago puede lisar dichas bacterias Xylella fastidiosa y Xanthomonas;

   (b) el bacteriófago infecta una célula mediante su unión a un pilus de Tipo IV;

   (c) el bacteriófago comprende una cola no contráctil y un tamaño de cápside que varía de 55-77 nm en diámetro, con una morfología típica de la familia Siphoviridae; y

   (d) el tamaño genómico del bacteriófago es de 55.500 pb a 56.200 pb; y en donde además el tipo de fago Xfas300 muestra las siguientes

   características:

   (e) el bacteriófago puede lisar dichas bacterias Xylella fastidiosa y Xanthomonas;

   (f) el bacteriófago infecta una célula mediante su unión a un pilus de Tipo IV;

   (g) el bacteriófago comprende una morfología típica de la familia Podoviridae caracterizada por una cola no contráctil con un tamaño de cápside que varía de 58-68 nm en diámetro; y

   (h) el tamaño genómico del bacteriófago es de 43.300 pb a 44.600 pb;

   en donde el tipo de fago Xfas100 comprende un genoma con una secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17 y SEQ ID NO:18; o el tipo de fago Xfas300 comprende un genoma con una secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ. ID 22, SEQ ID NO:23 y SEQ ID NO:24.

   El método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el contacto comprende introducir partículas de bacteriófago a la planta, particularmente en donde la planta es una planta de vid, cítrico, almendro, cafeto, de alfalfa, de adelfa, roble, liquidámbar, ciclamor, olmo, melocotonero, de albaricoque, ciruelo, de zarzamora, morera o Chitalpa tashkentensis, más particularmente en donde el contacto comprende introducir un bacteriófago a la planta mediante inyección, mediante un insecto vector, por medio del sistema radicular, mediante inyección, mediante pulverización, mediante nebulización o mediante aplicación de polvo en contacto con la planta, más particularmente en donde (i) el insecto vector es una chicharrita de alas cristalinas; o en donde (ii) el número de dicho bacteriófago introducido a dicha planta es de 1 a 1 X 1012 UFP/ml.

   El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde (i) dos, tres, cuatro, cinco o seis cepas de bacteriófago virulento para Xylella fastidiosa se introducen de manera simultánea o secuencial a la planta; o en donde (ii) el método se define como que comprende poner en contacto una población de plantas con el bacteriófago para prevenir o reducir los síntomas causados por X. fastidiosa en la población.

   5. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde (i) dos, tres, cuatro, cinco o seis cepas de bacteriófago virulento para Xylella fastidiosa y especies de Xanthomonas se introducen de manera simultánea o secuencial a la planta.

   6. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde dicho bacteriófago virulento es al menos un bacteriófago seleccionado del tipo de fago Xfas100 y/o el tipo de fago Xfas300, en donde el tipo de fago Xfas100 es al menos un bacteriófago seleccionado del grupo que consiste en: Xfas103, y Xfas106; y el tipo de fago Xfas300 es al menos un bacteriófago seleccionado del grupo que consiste en: Xfas302, Xfas303, Xfas304 y Xfas306; en donde dichos tipos de fagos se han depositado con los números de registro de ATCC PTA-13096, PTA-13095, PTA-13098, PTA-13099, PTA-13100 y PTA-13097, respectivamente, para los fagos Xfas103, Xfas106, Xfas302, Xfas303, Xfas304 y Xfas306.

   7. Una composición de biocontrol de enfermedades vegetales formulada para el suministro a una planta, la composición comprende al menos un portador y al menos un bacteriófago seleccionado del grupo que consiste en bacteriófagos del tipo de fago Xfas100 y bacteriófagos del tipo de fago Xfas300, en donde dicho bacteriófago es virulento para Xylella fastidiosa y especies de Xanthomonas, y en donde el tipo de fago Xfas100 muestra las siguientes características:

   (i) el bacteriófago puede lisar dichas bacterias Xylella fastidiosa y Xanthomonas;

   (j) el bacteriófago infecta una célula mediante su unión a un pilus de Tipo IV;

   (k) el bacteriófago comprende una cola no contráctil y un tamaño de cápside que varía de 55-77 nm en diámetro, con una morfología típica de la familia Siphoviridae; y

   (l) el tamaño genómico del bacteriófago es de 55.500 pb a 56.200 pb; y en donde además el tipo de fago Xfas300 muestra las siguientes

   características:

   (m) el bacteriófago puede lisar dichas bacterias Xylella fastidiosa y Xanthomonas;

   (n) el bacteriófago infecta una célula mediante su unión a un pilus de Tipo IV;

   (o) el bacteriófago comprende una morfología típica de la familia Podoviridae caracterizada por una cola no contráctil con un tamaño de cápside que varía de 58-68 nm en diámetro; y

   (p) el tamaño genómico del bacteriófago es de 43.300 pb a 44.600 pb;

   en donde el bacteriófago del tipo de fago Xfas100 comprende un genoma con una secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17 y SEQ ID NO:18, y el bacteriófago del tipo de fago Xfas300 comprende un genoma con una secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste en s Eq ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23 y SEQ ID NO:24;

   particularmente en donde dicha composición se define además como formulada para la introducción a una planta por medio de inyección, pulverización, nebulización o aplicación de polvo.

   8. La composición de biocontrol de enfermedades vegetales de la reivindicación 7, en donde el bacteriófago del tipo de fago Xfas100 es al menos un bacteriófago seleccionado del grupo que consiste en los fagos Xfas103 y Xfas1I06, y el bacteriófago del tipo de fago Xfas300 es al menos un bacteriófago seleccionado del grupo que consiste en los fagos Xfas302, Xfas303, Xfas304 y Xfas306; en donde muestras de dichos tipos de fagos se han depositado con los números de registro de ATCC PTA-13096, PTA-13095, PTA-13098, PTA-13099, PTA-13100 y PTA-13097, respectivamente, para los fagos Xfas103, Xfas106, Xfas302, Xfas303, Xfas304 y Xfas306; particularmente en donde dicha composición se define además como formulada para la introducción a una planta por medio de inyección, pulverización, nebulización o aplicación de polvo.

   9. Un bacteriófago aislado que es virulento para Xylella fastidiosa y especies de Xanthomonas, en donde el bacteriófago se selecciona del grupo que consiste en bacteriófagos del tipo de fago Xfas100, y bacteriófagos del tipo de fago Xfas300, en donde el tipo de fago Xfas100 muestra las siguientes características:

   (q) el bacteriófago puede lisar dichas bacterias Xylella fastidiosa y Xanthomonas;

   (r) el bacteriófago infecta una célula mediante su unión a un pilus de Tipo IV;

   (s) el bacteriófago comprende una cola no contráctil y un tamaño de cápside que varía de 55-77 nm en diámetro, con una morfología típica de la familia Siphoviridae; y

   (t) el tamaño genómico del bacteriófago es de 55.500 pb a 56.200 pb; y en donde además el tipo de fago Xfas300 muestra las siguientes

   características:

   (u) el bacteriófago puede lisar dichas bacterias Xylella fastidiosa y Xanthomonas;

   (v) el bacteriófago infecta una célula mediante su unión a un pilus de Tipo IV;

   (w) el bacteriófago comprende una morfología típica de la familia Podoviridae caracterizada por una cola no contráctil con un tamaño de cápside que varía de 58-68 nm en diámetro; y

   (x) el tamaño genómico del bacteriófago es de 43.300 pb a 44.600 pb;

   en donde el bacteriófago del tipo de fago Xfas100 comprende un genoma con una secuencia de ADN seleccionada del grupo de SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17 y SEQ ID NO:18, y el bacteriófago del tipo de fago Xfas300 comprende un genoma con una secuencia de ADN seleccionada del grupo de SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23 y SEQ ID NO:24.

   10. El bacteriófago aislado de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el bacteriófago del tipo de fago Xfas100 comprende al menos un bacteriófago seleccionado del grupo que consiste en: Xfas103 y Xfas106; y el bacteriófago del tipo de fago Xfas300 comprende al menos un bacteriófago seleccionado del grupo que consiste en: Xfas302, Xfas303, Xfas304 y Xfas306; en donde dichos tipos de fago se han depositado con los números de registro de ATCC PTA-13096, PTA-13095, PTA-13098, PTA-13099, PTA-13100 y PTA-13097, respectivamente, para los fagos Xfas103, Xfas106, Xfas302, Xfas303, Xfas304 y Xfas306.

   11. Un método para prevenir o reducir los síntomas o la enfermedad causados por Xanthomonas axonopodis pv. citri en una planta, que comprende poner en contacto dicha planta con un bacteriófago virulento para Xanthomonas axonopodis pv. citri, en donde el contacto comprende preferentemente introducir el bacteriófago a la planta, y en donde el bacteriófago es del tipo de fago Xfas300, en donde el bacteriófago del tipo de fago Xfas300 muestra las características:

   (y) el bacteriófago puede lisar dicha bacteria Xanthomonas;

   (z) el bacteriófago infecta una célula mediante su unión a un pilus de Tipo IV;

   (aa) el bacteriófago comprende una cola no contráctil con un tamaño de cápside que varía de 58-68 nm en diámetro, una morfología típica de la familia Podoviridae;

   (bb) el tamaño genómico del bacteriófago es de 43.300 pb a 44.600 pb;

   (cc) el bacteriófago previene o reduce los síntomas asociados con el cancro de los cítricos en una planta o plantas;

   en donde el bacteriófago del tipo de fago Xfas300 comprende un genoma que comprende una secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23 y SEQ ID NO:24, particularmente SEQ ID NO:21; o en donde el bacteriófago es al menos un bacteriófago seleccionado del grupo que consiste en: Xfas302, Xfas303, Xfas304 y Xfas306, en donde muestras de Xfas302, Xfas303, Xfas304 y Xfas306 se han depositado con los números de registro de ATCC PTA-13098, PTA13099, PTA-13100 y PTA-13097.

   12. El método de la reivindicación 11, en donde el contacto comprende introducir el bacteriófago a la planta, y la planta es una Citrus spp., una Fortunella spp., una Poncirus spp., un limero, un limonero, un naranjo, un toronjo, un pomelero o un híbrido de naranja trifoliada usado para portainjertos.

   13. El método de la reivindicación 11, en donde el contacto comprende introducir el bacteriófago a la planta, y el bacteriófago se introduce a la planta mediante inyección, mediante un insecto vector, o se suministra por medio del sistema radicular mediante inyección, mediante pulverización, mediante nebulización o mediante aplicación de polvo a la planta, particularmente en donde el insecto vector es una chicharrita de alas cristalinas.

   14. El método de la reivindicación 12, en donde (i) el número de dichos bacteriófagos a introducir a dicha planta es de 1 a 1 X 1012 UFP/ml; o en donde (ii) el método se define como que comprende poner en contacto una población de plantas con las partículas de bacteriófago para prevenir o reducir los síntomas asociados con Xanthomonas axonopodis, y patovares de la misma, en la población.

   15. Un método para propagar un bacteriófago virulento que incluye X. fastidiosa en su rango de huéspedes, que comprende las etapas de: (a) infectar un cultivo de bacterias Xanthomonas con dicho bacteriófago virulento; (b) permitir que dicho bacteriófago se propague; y (c) aislar las partículas de bacteriófago virulento del cultivo; particularmente en donde el cultivo de bacterias Xanthomonas comprende la cepa EC-12 de Xanthomonas, depositada con el número de registro de ATCC PTA-13101.