CN101065149A - 氨基－氧基官能团在制备疫苗结合物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种结合物的制备方法，包括将氨基－氧基同官能的或杂官能的试剂与选自多糖、寡糖、碳水化合物和包含至少一个羰基的含碳水化合物分子的实体反应，生成经至少一个肟键官能化了的多糖、寡糖、碳水化合物或含碳水化合物分子。然后经官能化的化合物直接或者间接地与蛋白质部分反应生成可以用作疫苗的蛋白质－碳水化合物结合物。

Description

氨基-氧基官能团在制备疫苗结合物中的应用

本申请要求美国临时申请Nos.60/539,573(申请日为2004年1月29日)，和美国临时申请Nos.60/589,019(申请日为2004年7月20日)的优先权利益。

背景技术

本发明涉及一种共价连接蛋白质和多糖生成结合疫苗的方法，该方法包括一个含羰基的基团与氨基-氧基官能团(amino-oxy functional groups)的反应。

在疫苗接种方法中，医学上利用身体的先天能力通过抗原免疫使自身防御侵害，所述抗原不会引起疾病但可刺激抗体生成以防御疾病。例如，注射死亡的有机体以防御细菌类疾病如伤寒和百日咳，注射类毒素防御破伤风和白喉，和注射减毒的有机体防御病毒类疾病如脊髓灰质炎和麻疹。

然而，仅仅通过注射这种外源药剂并不能够始终刺激抗体生成。也就是说，疫苗制剂必须是免疫原性的，能够诱发免疫应答。某些制剂如破伤风类毒素可自然引发免疫应答，无需修饰就可以疫苗形式施用。然而其它一些重要的药剂是非免疫原性的，必须将其转变为免疫原性的分子或结构才能诱发免疫应答。

免疫应答是复杂的系列反应，通常可描述为：(1)抗原进入身体并且遇到抗原呈递细胞，抗原呈递细胞可处理抗原并将抗原片段保持在其表面；(2)T细胞识别保持在抗原呈递细胞表面的抗原片段并协助其到达B细胞；和(3)B细胞被刺激后增殖并分化成可分泌抗体抵御抗原的抗体生成细胞。

大多数抗原仅在T细胞协助下产生抗体，因此称为T细胞依赖性(TD)。这样的T细胞依赖性抗原的实例是破伤风和白喉类毒素。

一些抗原，如多糖，不能被抗原呈递细胞正确处理并被T细胞识别。这些抗原不需T细胞辅助诱发抗体生成，但能直接活化B细胞，因此被称为非T细胞依赖性抗原(TI)。这种非T细胞依赖性抗原包括b型流感嗜血菌(H.influenza)磷酸多核糖基核糖醇(PRP)(polyribosyl-ribitol-phosphate)和肺炎球菌的荚膜多糖。

非T细胞依赖性与T细胞依赖性抗原还存在其它的差别。

A)T细胞依赖性抗原能预备免疫应答以致对同一抗原的二次激发产生记忆应答，而非T细胞依赖性抗原则不能。

B)用T细胞依赖性抗原接种后，抗体与抗原的亲合力随时间增加，而非T细胞依赖性抗原则不能。

C)T细胞依赖性抗原能比非T细胞依赖性抗原更有效地刺激未成熟的或新生的免疫系统。

D)T细胞依赖性抗原通常刺激产生IgM，IgG1，IgG2a和IgE抗体，而非T细胞依赖性抗原刺激产生IgM，IgG1，IgG2b，和IgG3抗体。

T细胞依赖性抗原能刺激产生一级和二级应答，其在成熟的和新生的免疫系统中都是长寿命的，但是必须频繁地与佐剂(增强免疫应答的物质)一起给药。很小的蛋白质，如肽，即使与佐剂一起给药时，也很少是免疫原性的。

非T细胞依赖性抗原，如多糖，在缺少佐剂的情况下能够刺激产生免疫应答，但是不能刺激产生高水平的或延长的抗体反应。它们也不能刺激未成熟的或B细胞缺陷的免疫系统(Mond，J.J.Immunological Reviews，64：99(1982)；Mosier，D.E.等人，J.Immunol.，119：1874(1977))。

人们期望为儿童提供针对非T细胞依赖性抗原的保护性免疫，特别是针对来自于生物体流感嗜血菌、肺炎链球菌(S.pneumoniae)和脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningiditis)的荚膜多糖。

增强非T细胞依赖性抗原免疫应答的一个途径涉及将多糖如流感嗜血菌PRP(Cruse，J.M.，Lewis，R.E.Jr.，eds.，Conjugate Vaccines inContributions to Microbiology and Immunology，Vol.10，1989))，或寡糖抗原(Anderson，P.W.等人，J.Immunol.142：2464，(1989))结合到T细胞依赖性抗原如破伤风或白喉类毒素上。这种途径下T细胞辅助的增多显示为对经免疫的婴儿赋予增强的免疫力。

对于不能对多糖单独产生应答的婴儿，蛋白质-多糖结合疫苗刺激其产生了抗多糖抗体应答。

蛋白质和多糖结合可产生其它有益的结果。例如申请人已经发现蛋白质/多糖结合物不仅可增强对多糖组分的抗体应答，而且可增强对蛋白质组分的抗体应答。该效果，例如，在美国专利No.5,955,079中有描述。这些效果在A.Lees，等人，Vaccine，12(13)：1160(1994)中也有描述。

技术的发展使蛋白质与多糖容易结合。参见，例如，Dick，W.E.等人，″Glyconjugates of Bacterial Carbohydrate Antigens：A Survey andConsideration of Design and Preparation Factors，″Conjugate Vaccines(Eds.Cruse，等人)，p.48(1989)。然而由于活化剂或官能试剂在水中不稳定，许多碳水化合物的活化技术不适于在水介质中使用。例如，在Marburg等的美国专利No.4,695,624中描述的N，N′-羰二咪唑，必须在有机介质中使用。

同官能的或异官能的乙烯砜(vinylsulfone)试剂已经被用于活化多糖。经活化的多糖在适当的反应条件下与蛋白质、肽、或半抗原反应，产生结合物。这些更详细地描述在美国专利No.6,309,646中。产生结合疫苗的另一种方法包括将脲阳离子盐试剂与可溶的第一部分如多糖或碳水化合物混合，并且随即与第二部分如蛋白质、肽、或碳水化合物结合，产生结合疫苗。该方法描述在美国专利No.6,299,881中。

多数碳水化合物在结合之前必须活化，并且溴化氰(CNBr)是常选的活化剂。参见，例如，Chu et al.，Inf.& Imm.，40：245(1983)。第一个被许可的结合疫苗是用CNBr活化HIB PRP，然后用己二酸二酰肼衍生并用水溶性的碳二亚胺将其与破伤风类毒素结合而制备的。

1-氰基-4-(二甲氨基)-吡啶四氟硼酸盐，也称″CDAP″，已被描述用在水介质中活化多糖。这些活化多糖可直接或间接地与蛋白质结合。CDAP的使用描述在，例如，美国专利No.5,849,301中和Lees，等人，″Activation of SolublePolysaccharides with 1-Cyano-4-Dimethylamino Pyridinium TetrafluoroborateFor Use in Protein-Polysaccharide Conjugate Vaccines and ImmunologicalReagents，″Vaccine，14(3)：190(1996)。

简要地概述CNBr-活化方法，CNBr在高pH值下与碳水化合物反应，代表性的pH值在10-12。在该高pH值下，与碳水化合物的羟基生成氰酸酯。进而与双官能试剂通常为二胺或二酰肼反应。这些衍生的碳水化合物通过双官能基团可被结合。在某些有限的情况下，氰酸酯也可直接与蛋白质反应。

高pH值对于羟基离子化是必需的，因为反应需要羟离子亲核攻击氰酸离子(CN^-)。结果，CNBr产生许多副反应，其中一些将新抗原加到多糖上。Wilcheck，M.等人，Affinity Chromatography.Meth.Enzymol.，104：3-55(1984)。更重要地是，许多碳水化合物或部分如Hib，PRP，和源自6型肺炎球菌和脑膜炎奈瑟氏球菌A的荚膜多糖在完成溴化氰活化所必需的高pH值下可能被水解或破坏。

CNBr活化法的另一个问题是所生成的氰酸酯在高pH值下不稳定并迅速水解，降低了衍生碳水化合物的产率，并因此降低了结合至蛋白质的碳水化合物的总产率。高pH值助长了许多其它的非生产性副反应，如这些副反应产生氨基甲酸酯和直链亚胺碳酸盐(imidocarbonates)。这些影响描述在Kohn等人，Anal.Biochem，115：375(1981)。而且，CNBr自身也是高度不稳定的并且在高pH值下自发水解，进一步降低了总产率。

蛋白质-多糖结合疫苗也可通过还原的氨基化作用制成。在该方法中，多糖上的醛基与蛋白质上的胺反应生成可逆的席夫碱。席夫碱随后在胺和醛基间还原生成稳定的键。该方法被许多难题所困扰。席夫碱的生成是缓慢且低效的，为了反应所述两组分(即，多糖和蛋白质)需要互相靠近，而它们的大体积进一步阻碍了总反应。为了克服该难题，在结合之前多糖常被分解为寡糖。

二甲亚砜(DMSO)的应用促进席夫碱的生成，但是该有机溶剂可能损害蛋白质。有时采用多个步骤的工艺，其中通过还原性氨基化作用将间隔臂基团(如，己二胺或己二酸二酰肼)加到多糖上，并且该间隔臂基团随后结合到蛋白质上。用高浓度的间隔臂基团促进反应并提高产率。升高温度和延长反应时间也常用于促进该反应。然而，这些对蛋白质和多糖也可能是有害的。此外，与醛基反应的胺必须是去质子化的，席夫碱的生成通常需要使用碱性溶液，即，溶液于PH≥8。在升高的温度和pH值下延长反应可能对蛋白质和多糖均是有害的。此外，通常涉及使用氰基硼氢化物(cyanoborohydride)或吡啶-甲硼烷的还原步骤可能是低效的并使蛋白质失活。工作上大量的使用这些试剂也是危险的。还原性氨基化方法的进一步局限性在于蛋白质和多糖连接位点的高度随机性。

因此，本领域需要一种高效的和有效的制备结合疫苗的方法。

发明概述

一个具体实施方式包括一种用于制备结合疫苗的方法，包括：

(a)使包含至少一个含羰基基团的第一部分与至少一种氨基-氧基试剂反应在第一部分上生成至少一个侧链官能团，其中第一部分选自多糖、寡糖、碳水化合物和含碳水化合物分子；

(b)使包含至少一个侧链官能团的第一部分与第二部分生成含结合物的组合物，其中第二部分选自蛋白质、肽和半抗原；和

(c)该结合物与药学上可接受的递送载体结合生成结合疫苗。

另一具体实施方式包括一种用于制备结合疫苗的方法，包括：

(a)使含至少一个侧链氨基-氧基基团的第一部分与第二部分反应生成包含结合物的组合物，

(b)其中第一部分选自多糖、寡糖、碳水化合物和含碳水化合物分子，和第二部分选自蛋白质、肽和半抗原；和

(c)该结合物与药学上可接受的递送载体结合生成结合疫苗。

另一具体实施方式包括一种用于制备结合疫苗的方法，包括：

(a)使选自多糖、寡糖、碳水化合物和含碳水化合物分子的第一部分，与

(b)与至少一种氨基-氧基试剂反应了的第二部分反应，其中第二部分选自蛋白质、肽和半抗原，生成含结合物的组合物；和

(c)该结合物与药学上可接受的递送载体结合生成结合疫苗。

另一具体实施方式包括一种用于制备结合疫苗的方法，包括：

(a)使第一部分与含至少一个侧链的氨基-氧基基团的第二部分反应生成含结合物的组合物，

其中第一部分选自多糖、寡糖、碳水化合物和含碳水化合物分子，且第二部分选自蛋白质、肽和半抗原；和

(b)该结合物与药学上可接受的递送载体结合生成结合疫苗。

更进一步的具体实施方式包括一种用于制备结合疫苗的方法，包括：

(a)提供选自多糖、寡糖、碳水化合物和含碳水化合物分子的第一部分；

(b)提供选自可能已被氧化成含有至少一个醛基的N-末端1，2-氨基醇的第二部分；

(c)用至少一个氨基-氧基试剂官能化所述的第二部分；

(d)用官能化了的第二部分与所述的第一部分反应生成含结合物的组合物；和

(e)该结合物与药学上可接受的递送载体结合生成结合疫苗。

更进一步的具体实施方式包括一种用于制备结合疫苗的方法，包括：

(a)使含至少一个侧链的氨基-氧基基团的第一部分反应，其中第一部分选自多糖、寡糖、碳水化合物和含碳水化合物分子；

(b)使第一部分与第二部分反应生成含结合物的组份，其中第二部分选自含至少一个羰基的糖蛋白；和

(c)该结合物与药学上可接受的递送载体结合生成结合疫苗。

另一具体实施方式仍然包括一种用于制备结合疫苗的方法，包括：

(a)使选自多糖、寡糖、碳水化合物和含碳水化合物分子的第一部分与选自蛋白质、肽和半抗原的第二部分反应生成含结合物的组合物，

(b)其中第一部分包含至少一个用氨基-氧基试剂衍生的还原末端，和

(c)该结合物与药学上可接受的递送载体结合生成结合疫苗。

附图简更说明

图1为大量蛋白质-多糖结合物的SDS-page图谱。

图2为BSA-多糖结合物的SDS-page图谱。

图3表示从S-400HR^TM(Pharmacia)凝胶过滤柱洗脱的部分碳水化合物和蛋白质的间苯二酚分析结果。

图4表示SDS-PAGE图谱证实蛋白质-多糖结合的存在。

图5A-5D说明从S-400HR^TM(Pharmacia)凝胶过滤柱洗脱的高分子量结合物的存在。

图6SDS-PAGE图谱说明结合级分的存在。

图7为结合物与它的非结合组分的比较图谱。

图8说明调理素的分析结果。

定义

氨基-氧基试剂指具有NH₂-O-R结构的试剂。R可能是能够键接到氨基-氧基氮上的任何基团。根据本发明公开的一个方面，R是官能团，例如，胺、硫醇或其它的易于偶联的化学基团，如蛋白质。

结合意指化学连接或结合。

官能化意指增加至少一个可促进进一步反应的基团。典型的官能团包括氨基-氧基、硫醇、顺丁烯二酰亚胺、卤素、卤酰基、醛、酰肼、肼和羧基。其它的官能团是本领域普通技术人员熟知的并且能在Hermanson所著的Bioconjugation Techniques中找到。

半抗原指小的分子，例如那些自身不能诱发抗体应答，一旦与载体偶联能诱发抗体应答的化学实体。

当述及氨基-氧基试剂时，同官能的，指至少有两个氨基-氧基官能团的试剂。同官能的试剂可以是同双官能的或同多官能的，即具有两个、三个、四个或更多个氨基-氧基官能团。

当述及一种氨基-氧基试剂时，杂官能的，指有至少一个氨基-氧基官能团和至少一个其它的非氨基-氧基官能团的试剂。杂官能的试剂可以是杂双官能的或杂多官能的，即具有两个、三个、四个或更多个氨基-氧基官能团。它也可以具有超过一个其它的非氨基-氧基官能团，如两个、三个、或四个或更多个，其中可以是相同类型的或不同类型的。

部分指结合物的其中一个部分。

侧链的官能团指存在于或暴露于分子上的官能团。

间隔臂基团指一个额外的分子用于间接地将第一部分偶联到第二部分上。

发明详述

A.结合的策略

本发明提供一种现有技术的替代方法用于制备结合疫苗。特别地本发明提供了新的将第一部分结合到第二部分的方法，其中第一部分选自多糖、寡糖、碳水化合物和含碳水化合物分子且第二部分选自蛋白质、肽和半抗原，并且这种结合至少使用一个氨氧基官能团。

在本发明范围内第一部分与第二部分反应有许多方式并且其中每一种方法依赖于在结合过程中使用至少一个氨基-氧基基团。

至少一种具有一个氨基-氧基基团的氨基-氧基试剂可与第一部分反应生成具有至少一个非氨基氧基侧链官能团的组合物。

至少一种具有多于一个氨基-氧基基团的氨基-氧基试剂可与第一部分反应生成具有至少一个氨基-氧基侧链官能团的组合物。在这一具体实施方式中，可以允许任选存在额外的至少一个非氨基-氧基侧链官能团。

至少一种具有一个氨基-氧基基团的氨基-氧基试剂可与第二部分反应生成具有至少一个非氨基氧基侧链官能团的组合物。

至少一种具有多于一个氨基-氧基基团的氨基-氧基试剂可与第二部分反应生成具有至少一个氨基-氧基侧链官能团的组合物。在这一具体实施方式中，可以允许任选存在另外的至少一个非氨基-氧基侧链官能团。

因此，在本发明中，至少一个第一部分和第二部分要与氨基-氧基试剂反应，并产生具有至少一个侧链官能团(至少一个氨基-氧基或非氨基-氧基侧链官能团)的组合物。如刚刚所述的，根据策略1或2(第一部分)和策略3或4(第二部分)的任意混合，第一部分和第二部分均可以官能化。在另一具体实施方式中，第一部分或第二部分可被官能化。

然后第一部分和第二部分可被结合在一起。这种结合可以直接进行，通过第一部分上的侧链官能团与第二部分直接连接。另外，这种结合可间接进行，通过将第一部分上的侧链官能团与称之为间隔臂基团的额外试剂连接，然后再与第二部分连接。

当然，类似的策略可采用第二部分上的侧链官能团，仅仅是将第一部分和第二部分的位置转换。

B.第一部分：多糖、寡糖、碳水化合物和含碳水化合物分子

在此所使用的，″碳水化合物″意指任何可溶性单糖、二糖、寡糖或多糖。用于本发明方法中适宜的多糖的实例包括细菌、真菌和病毒多糖。可溶性多糖(即，溶液中的多糖)，如水溶性的多糖，适用于本发明。适宜多糖的特殊例子包括伤寒沙门菌(Salmonella typhi)Vi抗原；脑膜炎奈瑟氏球菌多糖C；和肺炎球菌多糖如14型肺炎球菌多糖。

根据本发明的某些具体实施方式，碳水化合物可是天然的、半合成的或全合成的大分子量分子。根据一个具体实施方式，至少一个含碳水化合物部分选自大肠杆菌多糖、金黄色葡萄球菌(S.aureus)多糖、右旋糖酐、羧甲基纤维素、琼脂糖、肺炎球菌多糖(Pn)、聚蔗糖、新型隐球菌(Cryptococcusneoformans)、流感嗜血菌PRP、P.aeroginosa、肺炎链球菌、A和B组链球菌、脑膜炎奈瑟氏球菌或它们的混合物。

根据一个具体实施方式，含碳水化合物部分是右旋糖酐。在此所使用的，″右旋糖酐″(dex)指由任何来源的单个糖(如Pharmacia)组成的多糖。另一优选的含碳水化合物部分是聚蔗糖，其是无活性的、半合成的、非离子化的高分子聚合物。根据本发明，可用于本发明的各部分的另一非限制性实例包括脂多糖(″LPS″)、脂低聚多糖(lipooligopolysaccharides)(″LOS″)、脂磷壁质酸(″LTA″)、脱酰化LPS、脱酰化LTA、去脂LPS、去脂LTA，和相关的分子。通常，已用还原性氨基作用结合的含碳水化合物分子需要生成醛部分。在一些实例中，例如，这些醛也可用在此描述的氨基-氧基化学的偶联。

还原性氨基化作用已用于偶联LPS和LOS，其中二者均可用氨基-氧基化学偶联。用还原的氨基化化学过程将LPS和LOS偶联的实例可在Mieszala等人，Carbohydrate Research，338：167(2003)；Jennings等人，Inf.& Immun.，43：407(1984)；和美国专利No.4,663,160中找到。

C.第二部分：蛋白质、肽和半抗原

根据本发明，多种不同的蛋白质可与多种不同的多糖偶联。以下列举包括了可用于本发明的适宜蛋白质的实例：病毒蛋白、细菌蛋白、真菌蛋白、寄生虫蛋白、动物蛋白。来自上述任何来源的糖蛋白也可与第一部分生成结合物。脂质、糖脂、肽和半抗原也适于用作本发明的第二部分。半抗原化蛋白，即半抗原衍生的蛋白质，也适于用作本发明的第二部分。

特殊的蛋白质包括破伤风类毒素(TT)、百日咳类毒素(PT)、牛血清蛋白(BSA)、脂蛋白、白喉类毒素(DT)、热休克蛋白、T细胞超级抗原、蛋白D、CRM197和细菌外膜蛋白。所有这些蛋白质的起始材料从生物化学或药物供应商商购可得(如American Tissue Type Collection in Rockville，MD或BernaLaboratories of Florida)或可用标准的方法制备，如J.M.Cruse and R.E.Lewis(Eds.)，″Conjugate Vaccines in Contributions to Microbiology andImmunology″，Vol.10(1989)所述。

D.用氨基-氧基基团对第一或第二部分官能化的方法

氨基-氧基(也可称为氧基-胺(oxy-amine)、氨基-氧基(amino-oxy)、氨氧基(aminooxy)和氨基-氧基(amino-oxy))官能团，NH₂-O-R，具有比蛋白质中的胺更低的pKa值，并且在极度低的pH值下是亲核的。氨基-氧基基团与含羰基基团反应良好，如醛和酮，生成极稳定的肟。该反应的最适pH值为4至8，例如5至7。根据本发明的一个方面，最适pH值约为5。因为肟是稳定的，如上述所讨论的，还原性氨基化作用方法中还原步骤是任选的。反应的高效可以缩短反应时间。更进一步的，可能采用一些措施控制互补试剂的反应位点。相反，酰肼和胺与基团如酮的反应是慢的且低效的。

蛋白质和多糖用互补的成肟基团官能化，并反应生成肟连接的蛋白质-多糖结合疫苗。根据本发明的一个方面，蛋白质与多糖直接连接。

根据一个具体实施方式，提供的方法包括使氨基-氧基同官能的或异官能的试剂与具有至少一个羰基的选自多糖、寡糖、碳水化合物和含碳水化合物分子的实体结合，生成被至少一个肟键官能化了的多糖、寡糖、碳水化合物或含碳水化合物分子。官能化意指添加一个基团以利于进一步反应，如硫醇、羧基、氨基-氧基、卤素、醛基等等。这些具体实施方式可用以下非限制性的实例说明(″Ps″表示多糖)：

R是官能团如氨基-氧基、胺、硫醇或如以下列举的其它化学基团，以利于与蛋白质结合：

NH₂-O(CH₂)_x-CH₂-          双氨-氧基试剂

(x≥0)

二硫代吡啶基氨基-氧基试剂

(x≥0)

NH₂-OCH₂(CH₂)_x-CH₂-S·S-CH₂(CH₂)_x-CH₂-    双氨基-氧基试剂与二硫化物结合

(x≥0)

(x≥0)

当x＝0，氨基-氧基乙酸(AoAc)

然后至少一个侧链官能团直接或间接地与蛋白质部分反应生成蛋白质-多糖结合物。

根据另一具体实施方式，蛋白质用至少一个侧链氨基-氧基基团官能化，随后与多糖、寡糖、碳水化合物或含碳水化合物的部分上的羰基反应。羰基例如用高碘酸钠生成。例如，就多糖而言，官能化了的蛋白质与该多糖反应生成蛋白质多糖结合物。以下图谱非限制性地说明该方法：

用氨基-氧基基团官能化蛋白质的方法是本领域普通技术人员已知的。蛋白质能用氨基-氧基基团使用化学的、酶的或遗传工程的方法官能化。在此描述的方法用胺或者羧基官能化蛋白质，并且控制氨基-氧基基团在蛋白质上的数目。

在另一具体实施方式中，多糖用侧链的氨基-氧基基团官能化，随后与含羰基糖蛋白反应。这也可以，例如，通过氧化糖蛋白上的碳水化合物来完成。醛基可通过选择性地氧化N-末端的丝氨酸或苏氨酸产生。

根据本发明，例如当多糖、寡糖、碳水化合物或含碳水化合物部分用氨基-氧基基团官能化时，蛋白质最好含至少一个以例如酮或醛形式存在的羰基。醛可在含N-末端丝氨酸或苏氨酸的蛋白质上产生，并且产生的蛋白质可与氨基-氧基试剂反应，这样独特地官能化N-末端。然后，如果氨基-氧基试剂是同官能的，该单价官能化蛋白质能直接地与例如含羰基多糖反应，或者利用间隔臂基团间接的反应。N-末端丝氨酸或苏氨酸可以是天然的，或是利用工程的方法加入到蛋白质中。

用至少一个氨基-氧基基团官能化蛋白质的情况下，多糖、寡糖或碳水化合物包含至少一个羰基。该羰基可以是多糖结构中的天然部分，如聚合物的还原端，或者例如通过氧化作用产生。还原性氨基化作用已经广泛用于产生蛋白质-多糖结合物。因此，生产含羰基多糖的手段是本领域技术人员熟知的。

一些含还原糖末端的多糖，如Hib、PRP、和奈瑟氏球菌PsC。这些多糖含有作为半缩醛的醛基并且能与氨基-氧基试剂反应。其它的醛基可通过对多糖的特异性降解产生。通常的方法描述在，例如，Lindberg等人“SpecificDegradation of Polysaccharides-Adv in Carbohydrate Chemistry andBiochemistry，”Tipson等人，eds.Vol 31，pp.185-240(Academic Press，1975)。例如，当PRP被高碘酸钠氧化时，多糖链被切割产生了每个末端具有醛基的寡糖。

许多其它用于产生醛基的方法是本领域技术人员已知的。例如Jennings等人，美国专利No.4,356,170发明名称为″Immunogenic Polysaccharide-Protein Conjugates″；Tai等人，美国专利No.5,425,946发明名称为″Vaccines against Group C Neisseria Meningitidis″；Porro，美国专利No.5,306,492发明名称为″Oligosaccharide Conjugate Vaccines″；Yang等人，美国专利No.5,681,570发明名称为″Immunogenic conjugate molecules″；Constantino等人，″Development and phase 1 clinical testing of a conjugatevaccine against meningococcus A and C，″Vaccine 10：691(1992)；Laferriere等人，″The synthesis of Streptococcus pneumoniae polysaccharide-tetanustoxoid conjugates and the effect of chain length onimmunogenicity，″Vaccine，15：179(1997).

根据本发明，将醛基部分加到蛋白质和/或多糖上是较理想的。本领域普通技术人员将会赏识许多这样做的可接受方法。将醛添加到蛋白质和多糖上的适宜方法的非限制性实例包括如下：

1.在基质中羟基与氯己醇二甲基乙缩醛(chlorohexanol dimethyl acetal)反应，并且被遮挡的醛随后通过弱酸水解暴露出来。Dick等人，ConjugateVaccines(Eds.Cruse，et al.)，pp.91-93(1989)。

方案A

2.葡萄糖醛内酯和氰基硼氢化钠用于还原性胺化蛋白质胺类。皂化作用用于打开内酯。糖然后被高碘酸钠氧化成醛。

方案B

3.用碳二亚胺试剂将羧基化碳水化合物，例如，葡萄糖醛酸、半乳糖二酸、甘油酸或酒石酸加入蛋白质胺类中。然后用高碘酸钠氧化糖基化蛋白生成醛部分。

    半乳糖二酸                葡萄糖醛酸

4.醛也可通过酶氧化作用产生，用适宜的氧化酶如，例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和neurominidase(神经苷酶)。例如，neurominidase可用于消除末端唾液酸，随后用半乳糖氧化酶氧化(Hermanson，BioconjugationTechniques，p.116-117)。

5.化学方法将醛加到蛋白质或多糖上则可使用琥珀酰亚胺基-P-甲酰基苯甲酸或琥珀酰亚胺基-P-甲酰基苯氧基乙酸。这些醛的NHS酯与胺反应并且导致醛的加成。

琥珀酰亚胺基-p-甲酰基苯甲酸

MW247

琥珀酰亚胺-p-甲酰基苯氧基乙酸

6.还有另一方法采用双醛(如戊二醛)与胺反应(Hermanson，Bioconjugation Techniques，p.119-120)。

方案C

7.另一适宜的方法是用还原性氨基化作用将甘油醛添加至蛋白质胺，随后用高碘酸钠氧化生成醛。

任选的，如果结合物含有残余的自由氨基-氧基基团或醛，并且如果希望消除这些基团，可采用附加的步骤。消除具有醛的结合物的其中一个方法是用，例如，硼氢化钠还原。或者，残余的羰基可用单氨基-氧基试剂，如氨基羟基乙酸酯消除。残余的氨基-氧基基团可用单官能羰基，如甘油醛、丙酮或琥珀酸半醛消除。

E.氨基-氧基试剂

用于制备结合疫苗的可使用多种氨基-氧基试剂来实现。本领域技术人员可制备各种有效的同官能的和杂官能的氨基-氧基试剂，并且也可从Solulink，Inc.^TM，9853 Pacific Heights Blvd.，Suite H，San Diego，California 92121，和别人所描述的文献中获得。还可构想更多试剂并很容易制得。Toyokuni等人，″Synthesis of a new heterofunctional linker，N-[4-(amino-oxy)butyl]maleimide for facile access to a thiol-reactive 18F-labelingagent.″Bioconjugate Chem.14：1253(2003)。

可用于本发明的包括适宜试剂的非限制性实例包括Solulink^TM(San Diego，California)制备的产品。例如，双(氨基-氧基)胱胺是一种可被转换为杂官能硫醇-氨基-氧基试剂的同官能氨基-氧基试剂。″Boc″是本领域公认的叔丁氧基羰基保护基团的缩写。根据下述方案，例如，Boc-氨基羟基乙酸酯可用于合成许多适宜的氨基-氧基试剂：

″R″定义的配体是可用于本发明的亲核配体的适宜的非限制性实例。

上述基于2-(Boc-氨基-氧基)乙酸的试剂可从Bachem公司获得(产品编号No.A4605.005)。其它制备氨基-氧基试剂的有效起始试剂包括N-Boc-羟胺和N-Fmoc-羟胺。这些试剂可购自Aldrich Chemical公司。可使用N-Boc-羟胺按下述的方法制备有效的氨基-氧基试剂：

根据本发明，可使用同官能的氨基-氧基试剂。可使用的适宜同官能的氨基-氧基试剂包括，例如，双(氨基-氧基)乙二胺、双(氨基-氧基)丁烷、和双(氨基-氧基)四甘醇，所有这些是已知的并可用本领域公知的方法制备。例如，双(氨基-氧基)丁烷可按下述方法制备：

各种有用的杂官能化的氨基-氧基试剂的合成已经描述在文献中，例如Mikolajczyk等人，Bioconjugate Chem 5：636(1994)(顺丁烯二酰亚胺-氨基-氧基试剂)；Mikola & Hanninen Bioconjugate Chem.3：182(1992)(氨基-氧基烷基胺类)；Webb & Kaneko Bioconjugate Chem.1：96(1990)(氨基-氧基-二硫代硝基吡啶基试剂)。Jones等人描述了从N-Boc羟胺、烷基碘和溴化物合成氨基-氧基醚类的方法，提供了合成有用的氨基-氧基试剂的另一途径。Dixon & Weiss，J.Org Chem.49：4487(1984)描述了根据本发明可用的双-氨基-氧基试剂。

可使用，例如，如NHS levulate(来自Solulink^TM)的试剂将酮加到胺上。蛋白质如糖蛋白上的碳水化物基团能用，例如，高碘酸钠氧化成羰基。此外，如Rose等人，″Preparation of well-defined protein conjugates usingenzyme-assisted reverse proteolysis，″Bioconjugate Chem.2：154(1991)所述的，蛋白质水解的逆反应可用来添加羰基或氨基-氧基基团。蛋白质上的N-末端苏氨酸或丝氨酸可被选择性的氧化成醛。

小的连结分子也可用来官能化具有氨基-氧基基团的蛋白质和多糖。例如，参见Vilaseca等人，″Protein conjugates of defined structure：synthesisand use of a new carrier molecule，″Bioconj.Chem.4：515(199 3)；和Jones等人，″Synthesis of LJP 993，a multivalent conjugate of the N-terminaldomain of b2GPI and suppression of an anti-b2GPI immune response，″Bioconj.Chem.12：1012(2001)。

如本领域普通技术已知，氨基-氧基、氨基氧基、氨氧基、和氧基-胺是含义相同的术语。

F.间接结合

如上所述，第一部分和第二部分可以间接地或直接地结合。在一些情况下，蛋白质和多糖混合的联合可能引起不良的副作用。有时，直接偶联可使蛋白质和多糖彼此间靠近，以促使蛋白质和多糖间形成过度的交联。在这种极端状态下，合成的物质可能变得很稠(如，凝胶状态)。

过度交联也可能导致蛋白质和多糖组分的免疫原性的降低。此外，交联过程可能将外源的抗原决定簇引入到结合物中或者可能对有效疫苗的生产是不利的。过度交联的引入是个难题。

蛋白质和多糖间交联的程度可通过各自的活性基团的数目、浓度、pH值、缓冲液组合物、温度、间隔臂基团和/或电荷的使用，和其它本领域熟知的方式来控制。

例如，可在蛋白质和多糖间提供间隔臂基团来控制交联度。间隔臂基团有助于蛋白质和多糖分子间物理分离，并可限制蛋白质和多糖间的交联数目。作为另外一个优点，间隔臂基团也可控制合成的结合物的结构。如果结合物具有不正确的结构，这样的问题可能对结合物质的免疫原性产生不利的影响。偶联的速度，太快或太慢，也可影响结合产物的总产率、结构和免疫原性。Schneerson等人，Journal of Experimental Medicine，152：361(1980)。

G.疫苗组份

根据本发明的方法，本发明更进一步涉及根据本发明的方法产生的结合物制备的疫苗及其它免疫学试剂。例如，出于生产疫苗或其它免疫学试剂的目的，根据本发明方法产生的结合物可通过本领域常规方法与药学上可接受的介质或递送载体结合。这样的疫苗或免疫学试剂包含本发明结合物的有效治疗量，与适量的载体一起提提供用于患者的适当给药的剂型。这些疫苗可以包括明矾或其它佐剂。

示例性的药学上可接受的介质或载体包括，例如，无菌液体如水和油剂，包括源于石油、动物、植物或合成的，如花生油、豆油、矿物油、芝麻油等等。当药物混合物通过静脉内给药时，盐水是优选的载体。液体葡萄糖和甘油溶液可用作液态载体，特别是作为可注射溶液。适当的药学载体是本领域熟知的，如E.W.Martin，Remington′s Pharmaceutical Sciences中所描述的。

根据本发明可制备的疫苗包括，但不限于，白喉疫苗；百日咳(亚单位)疫苗；破伤风疫苗；b型流感嗜血菌(多核糖磷酸酯)；肺炎链球菌，所有血清型；大肠杆菌，内毒素或J5抗原(LPS、脂质A、和Gentabiose)；大肠杆菌，O多糖(血清型特异)；克雷伯氏杆菌属(Klebsiella)，多糖(血清型特异)；金黄色葡萄球菌，5和8型(血清型特异和普通保护性抗原)；表皮葡萄球菌(S.epidermidis)，血清型多糖I、II和III(和普通保护性抗原)；脑膜炎奈瑟氏球菌，血清型特异或蛋白质抗原；脊髓灰质炎疫苗(Polio vaccine)；流行性腮腺炎、麻疹、风疹疫苗；呼吸道合胞体病毒；狂犬病；甲、乙、丙型及其它型肝炎；人类免疫缺陷病毒I和II(GP120、GP41、GP160、p24、其它)；单纯性疱疹1型和2型；CMV(巨细胞病毒)；EBV(e-b病毒)；水痘/带状疱疹；疟疾；肺结核；白色念珠菌(Candida albicans)，其它的念珠菌属；卡氏肺孢子虫(Pneumocystis carinii)；支原体；流行性感冒病毒A和B；腺病毒；A组链球菌，B组链球菌，血清型，Ia，Ib，II和III；Pseudomonas aeroginosa(血清型特异)；鼻病毒属；副流感(1、2和3型)；冠状病毒；沙门氏菌；志贺菌属；轮状病毒；肠道病毒；沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)和肺炎链球菌(TWAR)；和新型隐球菌。

本发明也涉及对患者施用免疫刺激量的疫苗的治疗方法。术语″患者″指治疗可产生益处的任何对象并包括哺乳动物，特别是人类、马、牛、猪、绵羊、鹿、犬、和猫，也包括其它动物，如鸡。″免疫刺激量″指疫苗的量能刺激患者的免疫应答以预防、改善或治疗疾病。本发明的疫苗可以任何适宜的途径给药，但优选的是通过静脉内、肌肉、鼻内或皮下注射。例如，基于碳水化合物的疫苗可使用于癌症治疗。

此外，本发明的疫苗和免疫学试剂可为了任何目的给药，例如治疗、预防或诊断的目的。

本发明也涉及制备针对细菌、病毒、寄生虫、真菌或化合物感染的免疫治疗剂的方法，其通过用上述的疫苗免疫患者，以使该供体产生直接针对疫苗的抗体。可分离抗体或获得B细胞后与骨髓瘤细胞融合制备单克隆抗体。单克隆抗体的制备通常是本领域已知的(参见Kohler等人，Nature，256：495(1975))。在此所使用的，″免疫治疗剂″指直接用于患者的被动治疗的针对特异性免疫原的抗体组合物。血浆供体是指为了产生对抗疫苗中含有的免疫原的抗体而注射了该疫苗的任何对象。

实施例

实施例1：氨基-氧基官能化蛋白质的制备

以下的实施例说明可与多糖结合的氨基-氧基官能化蛋白质的制备。牛血清蛋白(BSA)用作模式蛋白质。

双(氨基-氧基)四甘醇用碳二亚胺与牛血清蛋白(BSA)上的羧基相连。单体BSA用(Lees等人，Vaccine 14：190，1996)描述的方法制备。双(氨基-氧基)四甘醇(85mg)(Solulink^TM制备，MW 361)定容于850μl的0.5MHCl中。用5N NaOH调pH值约至4.5。加入1ml BSA单体(mono)(42.2mg/ml盐水溶液)。加入25μl的新配制的EDC(1-(3-二甲基氨基)丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，100mg/ml水溶液)启动反应。大约3小时后，溶液在4℃盐水中透析过夜。然后溶液用盐水定容至4ml并用Amicon Ultra 4^TM(30kDa截留)离心设备浓缩至约0.5ml，并进一步用经盐水平衡了的1×15cm G-10柱(Pharmacia)脱盐。然后用Amicon Ultra 4^TM装置将外水体积级分(void volumefraction)浓缩至约1ml。使用BCA测定(Pierce Chemical Co)，蛋白质浓度测定为34mg/ml BSA。三硝基苯磺酸测定呈现鲜艳的红色/橙色，表明氨基-氧基基团存在。

实施例2：经氨基-氧基衍生的多糖的制备

以下实施例说明可结合至蛋白质、肽或半抗原的任意氨基-氧基官能化多糖的制备。

加入40mg CDAP(100mg/ml贮于乙腈中)活化Pn14(10ml的5mg/ml水溶液)，用三乙胺调pH值至9.4。大约2.5分钟后，加入4ml的0.5M己二胺(pH 9.4)。反应持续约2小时。过量试剂用盐水透析去除，得到氨基-Pn14。

然后氨基-Pn14在pH 8下与过量NHS溴乙酸反应并在4℃黑暗中盐水透析。溴乙酰化的Pn14用压滤法浓缩并随后用水透析。

如下用TCEP还原双氨基-氧基胱胺，随后用Dowex 1X-8柱离子交换制备氨基-氧基半胱胺：

双(氨基-氧基)胱胺(从Solulink获得)用50％NMP/水定容至0.1M。TCEP在水中定容至0.5M并且加入3x摩尔当量的1M碳酸氢钠。1.5摩尔过量的TCEP与双(AO)胱胺结合，并用碳酸钠调pH值至～7。10分钟后，混合物用pH值为5的10mM bistris稀释5倍。反应混合物应用于1×3cm Dowex 1-x8柱(该柱用1M NaCl清洗过并用pH值为5的10mM bistris平衡过)。在流过该柱的液体中发现了还原的氨基-氧基半胱胺。

氨氧基半胱胺加入到溴乙酰化的Pn14并在pH8下在黑暗中反应。然后反应混合物浓缩、透析过滤，然后水透析。

用间苯二酚/硫酸法测定Pn14浓度为9.1mg/ml。用TNBS测定并以氨基羟基乙酸酯作为标准，氨基-氧基浓度测定为0.74mM，即每100kDa的多糖中产生约8个氨基-氧基基团。

实施例3：BSA-右旋糖酐结合物的制备

以下实施例说明用氨基-氧基官能化蛋白质与氧化多糖制备结合疫苗的方法。特别是实施例2制备的氨基-氧基官能化BSA与氧化右旋糖酐结合。

右旋糖酐用高碘酸钠按如下方法氧化：用pH值为5的乙酸钠将10mg/mlT2000右旋糖酐溶液(Pharmacia)稀释至10mM，然后与10mM高碘酸钠(来自贮于水中的0.5M溶液)在室温下黑暗中孵育。在1、5、10和15分钟时，取等分试样，加入甘油停止反应，并用水在暗中透析。右旋糖酐的最终浓度测定为约4.5mg/ml。

蛋白质按如下方法结合至多糖：各110μl氧化右旋糖酐制剂(1-15分钟的氧化反应)与15μl BSA-氨基-氧基(各0.5mg)结合。在室温下黑暗中过夜反应，样品用SDS PAGE(4-12％梯度凝胶，NuPAGE，Invitrogen)分析。参考图1，泳道分别是用(A)dex ox 1分钟、(B)dex ox 5分钟、(C)dex ox10分钟、(D)dex ox 15分钟制备的结合物、仅仅BSA-氨基-氧基。显然，每个结合反应均产生了未进入凝胶的高分子量物质。基本上没有明显的非结合的蛋白质，表明高度地结合。

收集这四个结合物并用盐水平衡的S-400HR^TM胶过滤柱(1×60cm)分级。外水体积级份被收集并分析蛋白质和多糖。确定了收集液中含有0.21mg/ml BSA和0.27mg/ml右旋糖酐。回收了至少50％的初始的蛋白质和多糖。也就是说，氨基-氧基蛋白质与氧化多糖以优良的产率生产可溶性结合物。

实施例4：AO-官能化TT.的制备

以下设想的实施例说明使用二步的方法制备用氨基-氧基基团衍生的破伤风类毒素。

于2M NaCl中的1ml破伤风类毒素(10mg/ml)加入pH值为8的50μl1M HEPES将pH值调为8。通过增加7μl 0.1M NHS溴乙酸溴乙酰化蛋白质。1小时反应后，加入2μM氨基半胱胺。过夜反应后，过量试剂用2M NaCl透析去除。

蛋白质浓度用BCA测定(Pierce Chemical)并用TNBS确定氨基-氧基基团的存在。

实施例5：用二步的方法制备经氨基-氧基衍生的BSA

BSA的溴乙酰化(Bromoacetylation)：

4.1ml的单体BSA(48.5mg/ml)加入pH 8的400μl 1M HEPES和5.5ml水，调至pH值8。边搅拌边缓慢加入溶于NMP的1ml的0.2M NHS溴乙酸(ProChem)。在室温下黑暗中过夜反应，溶液用盐水透析2天，离心且过滤。获得浓度为15.3mg/ml的BSA 10.6ml。

氨基-氧基半胱胺的制备：

将56mg TCEP加入1.1ml 1M碳酸钠、586μl DMSO和586μl水，向该溶液中添加51.5mg Bisaminoxocystamine。15分钟后，TCEP用1×5cm Dowex1x-8柱去除，用10mM pH 6的Bistris平衡。收集DTNB正向流(DTNB positiveflow thru)，发现为22.6mM的硫醇。

6ml加入到溴乙酰化的BSA并调pH值至8。在黑暗中过夜反应，然后多次更换盐水地于4℃下透析2天。氨基-氧基BSA测定为大约8.6mg/ml。等分试样与TNBS在pH 8下反应呈现橘色，表明氨基-氧基基团存在。

实施例6：使用CDAP制备氨基-氧基衍生的多糖和氨基-氧基结合物

本试验说明使用CDAP制备氨基-氧基衍生的多糖和氨基-氧基结合物。它说明如何用非氧化反应的化学过程用氨基-氧基基团官能化多糖。

I.用CDAP化学过程制备氨基-氧基衍生多糖

溶解29mg双-氨基羟基乙酸酯(乙二胺)(由Solulink^TM制备)于200μl 1M pH值为5的NaAc中以制备双官能的氨基-氧基试剂溶液。右旋糖酐用CDAP化学过程按如下方法活化。向10mg/ml的0.5ml T2000右旋糖酐水溶液加入25μl CDAP(100mg/ml乙腈)，30秒后加入25μl 0.2M三乙胺(TEA)和三个5μl的TEA整洁剂(TEA neat)提升pH值。

在2.5分钟时，加入100μl 1M NaAc降低pH值，然后加入pH 5 200μl BisAO。反应～30分钟后，溶液在经NaAc缓冲液(10mM NaAc，150mM NaCl，5mM EDTA，pH 5)平衡的1×15cm P6DG柱(BioRad)上脱盐。用间苯二酚测定脱盐多糖，测定为1.7mg/ml右旋糖酐，用TNBS测定每100kDa dex大约有11个氨基-氧基基团。

II.氧化卵清蛋白的制备

向0.4ml卵清蛋白(14.4mg)(OVA)溶液中加入10μl 1M pH 5的乙酸钠，随后加入10μl 0.5M高碘酸钠(溶于水中)。在室温下黑暗中反应15分钟后，加入几滴50％甘油终止反应。反应混合物在黑暗中用NaAc缓冲液透析。于280nm的吸收下，氧化卵清蛋白(″OVA(ox)″)的浓度为6.6mg/ml。

III.结合物和对照的制备

配制下述溶液并在室温下黑暗中孵育过夜：

A.500μl Dex AO(0.85mg)+75μl OVA(氧化)+100μl 1M NaAc pH 5

B.250μl Dex AO(0.0.43mg)+37.5μl NaAc缓冲液+50μl 1M NaAc

C.250μl NaAc缓冲液+37.5μl OVA(氧化)+50μl 1M NaAc。

每种溶液用SDS PAGE和SEC HPLC分析。经SEC HPLC测定，只有样品A含有高分子量(HMW)物质，其中有～20％的蛋白质结合物。经过SEC HPLC或SDSPAGE分析，样品B或C不含有任何高分子量物质。

实施例7：用溴化氰标记具有双-氨基-氧基的多糖的试剂

该预示的实施例说明用溴化氰(CNBr)衍生具有氨基-氧基的多糖的试剂。

用水配制浓度10mg/ml的多糖(如，Pn-14)，在pH-恒定器中每毫克多糖用1毫克CNBr在pH 10.5下处理6分钟。然后反应混合物中添加0.5M双-氨基-氧基试剂(如双-AO(EDA))，调pH值至～7。过夜反应，该溶液在水中透析并用TNBS分析氨基-氧基基团，并且用间苯二酚分析碳水化合物。该氨基-氧基衍生的多糖用于与含羰基蛋白质结合。

根据另一具体实施方式，经CNBr活化的多糖可与氨基羟基乙酸酯反应。这将产生经羧基官能化的多糖。羧基能进一步被官能化并且间接地或直接地与蛋白质(如，用碳二亚胺)相连。

实施例8：氨基-氧基衍生的蛋白质与氧化多糖的结合

本实施例说明官能化发生在胺上的氨基-氧基衍生的蛋白质的制备。该氨基-氧基衍生的蛋白质然后与临床上相关的多糖脑膜炎奈瑟氏球菌A和C共价相连。

I.用在蛋白质胺上的氨基-氧基基团(具有位于胺上的侧链氨基-氧基基团的蛋白质)官能化蛋白质

蛋白质上的胺被溴乙酰化并且随后与硫醇-氨基-氧基试剂反应产生具有侧链氨基-氧基基团的蛋白质。双(氨基羟基乙酸酯)胱胺2HCl由Solulink^TM制备。单体的BSA为42.2mg/ml。NHS溴乙酸来自Prochem公司并且于NMP(N-甲基-2-吡咯烷酮)中配成0.1M。氨基-氧基蛋白质按如下制备。各在2个试管中，0.5ml的BSA(21.1mg)和250μl H₂O+100μl 1M HEPES配成pH 8的溶液。其中一个管与30倍摩尔过量NHS溴乙酸(93μl)反应并且另一个管与10倍摩尔过量NHS溴乙酸(31μl)反应。

1小时后，每个管用乙酸钠缓冲液(10mM NaAc，0.15M NaCl，5mM EDTA，pH 5)定至15ml并且用Amicon Ultra 15^TM装置(30kDa截留)浓缩至大约200μl。

氨基羟基乙酸酯半胱胺按如下制备：

作为还原剂，向于114μl 1M乙酸钠+114μl NMP中的9.8mg双(AOAc)胱胺(Solulink^TM公司制备)的溶液加入22.8μl于1M HEPES的pH 8的0.25M TCEP。1小时后，将被部分还原的氨基-氧基硫醇试剂加入到各溴乙酰化BSA制品中，调pH值大约为8并且在4℃下黑暗中过夜反应。

各用NaAc缓冲液补充至15ml使用Amicon Ultra 15^TM装置离心脱盐。脱盐过程重复4次。最终体积大约为200μl并用NaAc缓冲液补充至1ml。产品是预期的BSA-S-AO。通过280纳米吸光度，30x制品的浓度为29.8mg/ml，而10x制品的浓度为24.8mg/ml。

II.经氧化的脑膜炎奈瑟氏球菌多糖A和C的制备(Neiss PsA和Neiss PsC)

Neiss PsA和PsC以10mg/ml溶于水中在室温下过夜溶解并在4℃下贮存。每1ml的多糖溶液中加入50μl 1M pH 5的乙酸钠，随后加入25μl 0.5M高碘酸钠(0.5M水溶液)。在室温下黑暗中10分钟后，分别用41水透析4小时。然后分别加入水至4ml并进一步用Amicon Ultra 4^TM装置(30kDa截留)脱盐。用间苯二酚分析，经氧化的Neiss PsA的浓度测定为12.1mg/ml，且经氧化的Neiss PsC为17.8mg/ml。

III.BSA-S-AO与氧化Neiss PsA和PsC的结合

制备下述BSA-S-AO与氧化PsA和PsC混合物。

结合物	μl Ps	μl BSA	1M NaAc pH5
				BSA10x-PsA	175μl(2.1mg)	134μl(4mg)	25μl
BSA30x-PsA	175μl(2.1mg)	161μl(4mg)	25μl
				BSA10x-PsC	175μl(3.1mg)	134μl(4mg)	25μl
BSA30x-PsC	175μl(3.1mg)	161μl(4mg)	25μl

在室温下黑暗中过夜反应后，用Phast gel(8-25％)(Pharmacia)在还原条件下用SDS PAGE分析结合物。参见图2，泳道从左至右分别是BSA30x-PsA，BSA30x-PsC，BSA30x，BSA10x-PsA，BSA10x-PsC，BSA10x。显然有显著量的高分子量物质没有进入凝胶中，表明出现蛋白质与多糖的结合。

收集PsA结合物并通过凝胶过滤法在盐水平衡的S-400HR柱(1×60cm，Pharmacia)上分级分离。类似地，PsC结合物也被收集和分级分离。大约收集1ml级分并分析蛋白质(通过吸光度)和用间苯二酚分析碳水化合物。所得结果示于图3中。

对于PsC结合物，收集管18-22，对于PsA结合物，收集管19-23，并用SDS PAGE在还原条件下测定。

参考图4，BSA-Neiss PsC结合物在左侧且PsA结合物与之相邻。右边是分子量标准参照物。在每个泳道上可观察到有少量的游离BSA，表明结合物和游离蛋白质的不完全分离。每个泳道中含有显著量的进入凝胶的高分子量结合物质。

实施例9：(BSA-戊酮酸)-氨基-氧基-Pn14结合物的制备

本实施例说明氨基-氧基基团与酮反应并表明这可用于生成结合物，尤其是用于(BSA-戊酮酸)-氨基-氧基-Pn14的制备。

NHS戊酮酸来自Solulink公司，将5.1mg溶于100μl NMP中。该溶液缓慢地加入到200μl于48.5mg/ml的BSA、200μl水和100μl 1M HEPES、pH 8中的搅拌溶液中。过夜反应后，该混合物用Amicon Ultra 15装置(30kDa截留)过滤。最终体积是0.5ml。产品为BSA-LEV

100μl BSA-LEV与300μl氨基-氧基Pn14(4.5mg/mlPn14)混合并且在黑暗中孵育几天。结合物和单一组分用SEC HPLC法使用Superose 6柱(Pharmacia)分析。所述结合物然后在S400HR柱上分级分离。蛋白质用Bradford染色法分析，多糖用间苯二酚法分析。发现高分子量级分含有0.6mgBSA/mg Pn14。

实施例10：氨基-氧基-BSA-奈瑟氏球菌PsC结合物的制备

如Jennings & Lugowski J.Imm.127：1011(1981)一般性描述的，氧化Neiss PsC生成醛末端。SEC HPLC表明了PsC的分子量被显著降低。

PsC和BSA-AO过夜结合反应后，用SEC HPLC Superose 6 0.5ml/min进行分析。所述结合物在1×60cm S200HR柱上分级分离，用10mM乙酸钠、150mMNaCl、2mM的EDTA、pH5平衡。SEC分析和凝胶过滤都确定了多数BSA被结合。分析了蛋白质与碳水化合物的高分子量峰并且确定了含0.2mg BSA/mg PsC。

实施例11：氨基-氧基-BSA-奈瑟氏球菌PsA结合物的制备

本实施例说明通过用氨基-氧基基团官能化蛋白质的途径制备奈瑟氏球菌PsA-BSA结合物。

如在Jennings & Lugowski J.Imm.127：1011(1981)中一般性描述的，用NaBH4将Neiss PsA末端还原成醛糖醇然后氧化生成醛末端。

Neisseria PsA以20mg/ml溶解于水中15分钟。向1ml的经溶解的多糖中加入10mg的硼氢化钠。pH值保持大约8-9。1小时后，加入100μl 1MNaAc，并调pH值至5。还原的PsA在盐水平衡的1×15cm G10柱上脱盐，用AmiconUltra 4(10kDa截留装置)浓缩外水体积级分至大约1ml。随100μl 1M pH5的乙酸钠一起加入20mg固体高碘酸钠。在室温下黑暗中氧化15分钟后，加入一滴甘油终止反应然后在用10mM NaAC、150mM NaCl和2mM的EDTA、pH5平衡的1×15cm G10柱上脱盐(乙酸酯缓冲液)。收集外水体积级分并用BCA分析发现结果是阳性的，表明还原糖存在。透析过滤该物质并用Ultra 4装置浓缩后溶于乙酸盐缓冲液。

氨基-氧基BSA和PsA(red/ox)均用SEC HPLC检测。通过还原/氧化过程显著地降低了PsA的分子量。

结合

在结合步骤中，150μl浓度为6mg/ml的氨基-氧基-BSA与50μl PsA(还原型/氧化型)和25μl 1M pH5的NaAc混合。

在4℃下黑暗中过夜孵育后，用SEC HPLC法(Superose6，盐水，0.5ml/min)分析结合物。发现PsA几乎没有吸光度而AO-BSA因结合而提高了分子量。

结合物在1×60cm S200HR凝胶过滤柱上分级分离并且分析高分子量级分中的蛋白质和PsA，发现含0.4mg BSA/mg PsA。

结论：还原/氧化法易生成能够与氨基-氧基-蛋白质相连的醛。在提高的pH值下，PsA可能在NaBH₄步骤中被水解。

实施例12：PRP(氧化型)-BSA-AO结合物的制备

1.PRP Hib的氧化

22.7mg PRP Hib配成10mg/ml水溶液，并与100μl 1M NaAc和46μl0.5M高碘酸钠混合。在黑暗中冰上反应15分钟，然后用50％甘油终止反应。反应混合物用Amicon Ultra 4(10kDa截留)装置，4×4ml，透析过滤于水中，最终体积大约为1ml。间苯二酚分析浓度定至10mg/ml。BCA分析表明样品是阳性的，存在醛。

2.氨基-氧基BSA结合

提供浓度为15mg/ml的AO-S-BSA。667μl BSA-S-AO 10mg与100μl 1M pH5的乙酸钠和大约1ml PRP(ox)混合，并且允许在黑暗中过夜反应。然后加入50μl 0.25M氨基羟基乙酸酯终止反应。

3.用SEC Superose6 prep grade HR10/30分析，平衡PBS 0.5ml/min，OD220。

在此，0.5ml结合物在PBS平衡的1×60cm S200HR分级分离。在BSA之前所有的级分均洗脱，显示更高的MW。

级分	BSA/mg Hib PRP(mg)
		9	0.7
10	0.6
		11	0.4
12	0.5

实施例13：经环氧丙酸的氧化制备BSA-Pn14

本实施例说明用碳二亚胺将环氧丙酸加到BSA的胺上的工艺。蛋白质上的环氧丙酸然后被氧化并与氨基-氧基-Pn14反应。

I.BSA-环氧丙酸

单体BSA和环氧丙酸(购自Fluka Chemical公司)分别以终浓度为12.5mg/ml和28mg/ml共同溶于水中。pH值调至大约为5并且加入220μl的100mg/ml EDC水溶液。pH值保持在约为5共大约1.5小时，并加入.025ml 1M pH5的乙酸钠终止反应。反应混合物在4℃下盐水透析过夜。

II.BSA-环氧丙酸的氧化

在1ml的BSA-环氧丙酸(7.8mg/ml)中加入100μl 1M pH5的乙酸钠，随后加入25μl 0.5M高碘酸钠水溶液。在黑暗中10分钟后，加入甘油终止反应，并用Amicon Ultra离心装置(30kDa截留)去除过量的试剂。最终体积大约为400μl。

100μl的氧化BSA-环氧丙酸与250μl 9.3mg/ml的氨基-氧基Pn14、50μl 1M pH5的乙酸钠混合。用SEC HPLC(Superose 6 0.5ml/min，PBS)测定等分试样。经过夜反应，以同样方式分析另一等分试样。可见于外水体积洗脱的有显著的吸收部分(～15分钟)，显示蛋白质连接到高分子量Pn14上。

接着在S400HR柱(Pharmacia)上凝胶过滤，确定高分子量级分含0.3mgBSA/mg Pn14。该比率与上述图谱确定的高分子量蛋白质结合的百分比是相似的。

因此，用碳二亚胺将环氧丙酸连接至蛋白质的方法提供了一种生成能随后与氨基-氧基基团相连的蛋白质上的醛的途径。

实施例14：应用氨基-氧基化学过程将BSA连至右旋糖酐上

本实施例说明寡糖通过它的还原末端与氨基-氧基衍生蛋白质偶联。

T40右旋糖酐以100mg/ml溶于水中。以葡萄糖为标准用BCA分析法测定还原端的数目。发现有3.5mM还原端/100mg/ml T40右旋糖酐，因此平均分子量大约28,000kDa

5mg含～8氨基-氧基/BSA的氨基-氧基BSA与2倍pH 5的T40右旋糖酐混合。

(A)830μl BSA-AO 15.3mg/ml与620μl 100mg/ml的T40右旋糖酐和100μl 1M pH5的NaAc混合。

(B)830μl BSA-AO 15.3mg/ml与3.1ml 100mg/ml的T40右旋糖酐和500μl 1M pH5的NaAc混合。

溶液在室温下黑暗中反应1周，然后用SEC HPLC分析。

所有结合物均远先于BSA-AO洗脱，显示它们的分子量提高了。结合物然后用阴离子交换柱(IEX)分级分离。与SEC趋势一致，分子量越高，结合物洗脱的离子强度越低。分析IEX洗脱级分的碳水化合物与蛋白质比率并对分子量和摩尔比绘制曲线(用28kDa MW T40右旋糖酐)

用SEC HPLC(Superose 6 1ml/min)法分析每IEX洗脱液的主要级分。没有单体BSA且高比率对比低比率T40dex/BSA结合物提高了MW。SDS PAGE证实了结合的IEX洗脱液的高分子量属性。

实施例15：应用氨基-氧基化学过程连接寡糖和蛋白质

本实施例说明应用氨基-氧基化学过程通过寡糖的还原端将其间接地连接到蛋白质上。该工艺的一般性描述如下。T40右旋糖酐(～40kDa MW)的还原端与氨氧基乙酸酯的氨基-氧基基团反应生成在一端具有单个羧基的右旋糖酐。然后通过乙二胺与碳二亚胺反应将该羧基基团变为胺。具有胺端的右旋糖酐被巯基化并且与顺丁烯二酰亚胺衍生的BSA反应，生成具有如“线状(threads)”伸出的碳水化合物的蛋白质组成的结合物。

I.加入氨基羟基乙酸酯至右旋糖酐的还原端

在室温下850mg T40右旋糖酐(Pharmacia)溶于850μl水中过夜。

235mg的氨氧基乙酸酯溶于850μl DMSO和500μl 1M pH5的乙酸钠混合液中并与T40右旋糖酐溶液混合。另加入500μl的DMSO使溶液含大约50％DMSO。约68℃下反应大约6小时，溶液用大量水透析。产品即为在其还原末端上含单个羧基的右旋糖酐。

1.8g的乙二胺2HCl加入到溶液(大约22ml)中并且用1N NaOH调pH值大约为5。加入220mg EDC(1-(3-二甲基氨基)丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)并且pH值维持在大约为5共计3小时。加入1M pH5的乙酸钠终止反应，盐水透析，并且用Amicon Ultra 15^TM(10kDa截留)浓缩。然后进一步用盐水透析并随后用水透析。

用TNBS分析产品的胺和用间苯二酚分析产品的碳水化合物。确定每40,000kDa的右旋糖酐有大约0.45胺。该产品是在其还原末端上含单个胺基的右旋糖酐并定义为NH₂-AOAc-T40右旋糖酐。用间苯二酚分析，确定溶液中的右旋糖酐浓度大约119mg/ml。T40右旋糖酐具有分散的分子量，使得很难确定该聚合物的还原末端的实际取代程度。

II.硫醇右旋糖酐和顺丁烯二酰亚胺-BSA

顺丁烯二酰亚胺衍生的BSA按如下制备：向由200μl的单体BSA(42.2mg/ml)、50μl 0.75M HEPES、5mM pH7.3的EDTA、100μl水组成的溶液中加入GMBS(40μl贮于NMP的0.1M溶液)。反应2小时后，加入100μl 1M pH5的乙酸钠降低pH值。溶液用10mM NaAc、0.15M NaCl、5mM pH5的EDTA，使用Amicon Ultra 4^TM(30kDa截留)超滤装置脱盐。

按如下方法用SPDP对NH₂-AOAc-T40右旋糖酐巯基化：0.5ml的NH₂-AOAc-T40右旋糖酐与100μl 1M pH8的HEPES混合，并加入100μl 0.1MSPDP。大约2小时后，加入50μl 0.1M pH5的EDTA，随后加入100μl 1M pH5的乙酸钠和50μl 0.5M二硫苏糖醇水溶液。1小时孵育后，溶液在4℃下乙酸钠缓冲液中透析过夜。

具有硫醇端的T40右旋糖酐与顺丁烯二酰亚胺衍生的BSA混合(保留一小份等分试样BSA-顺丁烯二酰亚胺用于分析)。经过夜反应，一半混合物(大约1ml)使用经盐水平衡的1×60cm S-400HR柱通过凝胶过滤分级分离。为了对比，100μl的BSA单体(42.2mg/ml)，300μl的T40右旋糖酐AOAc，和0.5ml盐水在同样的凝胶过滤柱上类似地分级分离。利用于280nm的吸光度分析级分(大约1ml)中的蛋白质并用间苯二酚分析右旋糖酐。

参见图5A-D，显然蛋白质和右旋糖酐当以T40右旋糖酐AOAc-硫醇-顺丁烯二酰亚胺BSA结合物形式从柱上的洗脱早于组分混合物。这显示更高分子量的结合物已经生成。此外，右旋糖酐对蛋白质的比率提高了。

过柱级分进一步用SDS PAGE分析，结果见图6。从左至右为MW标记、结合物级分18、20、22、24、26，混合物级分#24、26、28、30，未分级分离的结合物，起始BSA-顺丁烯二酰亚胺。

显然非馏分结合物仅含小比例的游离蛋白质，表明高产率生成结合物。级分混合物中没有明显的高分子量蛋白质。在结合物级分中只有结合物而基本没有游离蛋白质。这证实高产率生成结合物。

实施例16：经环氧丙酸和氨基-氧基衍生的Pn-14制备BSA-Pn14结合物

以下实施例说明用醛取代的蛋白质制备结合物

I.用TSTU原位合成环氧丙酸的NHS酯并加入BSA

在该步骤中，7.9mg的环氧丙酸半-钙盐一水合物(MW143)溶于110μlNMP中。与200μl 0.5M于NMP中的TSTU(Novachem)和100μl的三乙胺混合，并加入1ml 24mg/ml的BSA。pH值调至8。大约2小时后，混合物用2×1升盐水透析。BSA上游离胺的数目用TNBS确定。对照的数目是33.2NH₂/BSA。环氧丙酸/TSTU/BSA的数目是25NH₂/BSA。这样的结果可以得出结论：BSA被标记为大约8个环氧丙酸单位/BSA。

II.官能化BSA的氧化

将5mg等分试样补加25mM pH5的NaAc和25mM高碘酸钠。反应在室温下黑暗中进行15分钟，然后加入一滴甘油终止反应。混合物用S200HR分级分离，收集主要馏分并浓缩。

III.BSA(ox)-AO-Pn14结合物的制备

在该步骤中，444μl的氨基-氧基官能化Pn14与0.4ml 10.1mg/ml的BSA(ox)和100μl 1M pH5的NaAc混合，在室温下过夜反应。经S400HR 1×60cm盐水凝胶过滤+0.02％叠氮化物SEC HPLC的级份显示，环氧丙酸/TSTU/BSA的氧化导致BSA聚合。

也观察到高分子量峰值递增，显示结合随时间而增加。单独AO-Pn14具有最低的吸光度。

实施例17：巯基甘油-溴乙酸酰化BSA的制备

本实施例说明BSA(疏基甘油(氧化型))-AO-右旋糖酐结合物(BSA(mercaptoglycerol(ox))-AO-dextran conjugate)的制备方法。

溴乙酰化BSA的制备

500μl单体BSA(48mg/ml)与500μl 1M pH8的HEPES和溶于NMP的25μl 0.1M NHS溴乙酸混合。250μl BSA与250μl HEPES和12μl NMP混合作为对照。

大约1小时后，分别用Amican Ultra 4装置(30kDa截留)盐水中脱盐。最终体积是450μl的BSA-bromoAc，和300μl BSA对照。

其次，配制50mM巯基乙醇和50mM巯基甘油水溶液。

E制剂：225μl BSA-BromoAC与100μl 1M pH8的HEPES和50μl 50mM巯基甘油混合。

F制剂：BSA对照与100μl 1M pH8的HEPES和50μl 50mM巯基甘油混合。

G制剂：225μl BSA-BromoAC与100μl 1M pH8的HEPES和50μl 50mM巯基乙醇混合。

30分钟后，分别使用Amicon Ultra用NaAc缓冲液(10mM NaAc、150mMNaCl、5mM EDTA，pH 5)脱盐。终体积是0.5ml。

分别加入10mm高碘酸钠(取自新配制的0.5M高碘酸钠贮液)并在4℃下黑暗中反应10分钟，然后加入甘油终止反应，用Amicon Ultra装置脱盐并在NaAc缓冲液中冲洗。经OD 280测定，分别确定为约20mg/ml BSA。

E制剂应含有BSA-醛；F制剂没被溴乙酸标记，因此它不能与巯基甘油反应。这样，它不会含有醛。G制剂具有没有氧化的侧链巯基乙醇，因此它不会含有醛。

315μl 15.9mg/ml的氨基-氧基右旋糖酐与250μl的每种BSA制剂混合，在室温下黑暗中过夜反应。

每种反应物在盐水平衡的S400HR 1×60cm上凝胶过滤分级分离。分析高分子量级分的蛋白质和右旋糖酐。

结果显示仅仅含有氧化巯基甘油的BSA生成了结合物，这也被高分子量级分的蛋白质/右旋糖酐比率证实。

E BSA-巯基甘油(氧化型)+AO-dex 0.97mg BSA/mg右旋糖酐

F BSA对照(氧化型)+AO-dex 0.1mg BSA/mg右旋糖酐

G BSA-巯基乙醇(氧化型)+AO-dex 0.1mg BSA/mg右旋糖酐。

实施例18：通过肟生成将蛋白质连至多糖

以下实施例说明通过肟生成利用蛋白质N-末端基团将蛋白质连至多糖上。

用双-氨基-氧基试剂氧化并衍生溶葡萄球菌素的N-末端苏氨酸。蛋白质的氧化按照Gaertner & Offord，″Site-specific attachment of functionalizedpoly(ethylene glycol)to the amino terminus of proteins，″BioconjugateChem.7：38(1996)中所述的操作。溶葡萄球菌素，27kDa的蛋白质由乳球菌产生。

试验1

所使用的溶葡萄菌素仅含有大约30％游离N-末端苏氨酸。Gaertner &Offord的条件用于N-末端苏氨酸的氧化。更详细地，50摩尔过量的蛋氨酸(17.5μl的1M水贮备液)加入到1ml的10mg/ml的溶葡萄菌素溶液中。加碳酸氢钠(1M)调pH值至8.3。加入高碘酸钠(7μl的0.5M水贮备液)开始氧化。反应混合物在室温下黑暗中反应10分钟，在此期间加入7.1mg双(氨基-氧基)四甘醇(购自Solulink^TM公司)(配制浓度为50mg/ml的DMSO溶液)。在黑暗中1小时后，溶液在室温下黑暗中盐水透析。产品定义为溶葡萄菌素AO。用0.49mg/ml/吸光度单位在OD 280下确定溶葡萄菌素浓度。

在pH值5下用TNBS检验等分试样。已往就发现，在这些条件下氨基-氧基而不是胺与TNBS反应。按以下方法分析：50μl的溶葡萄球菌素或溶葡萄球菌素AO加入到440μl 0.1M pH5的NaAc中，然后加入10μl 10mg/ml的TNBS水溶液。在上述溶液中加入5μl 1mM的氨基羟基乙酸作为标准。6小时黑暗中孵育后在500nm下检测样品。样品溶液是橙色的，显示氨基-氧基基团存在。根据标准，已测定大约30％的溶葡萄球菌素衍生具有AO基团。所述溶葡萄球菌素AO然后与过量的氧化T2000右旋糖酐在室温下黑暗中通过肟生成完成结合。反应通过SEC HPLC分析确定质量从低分子量(非结合的蛋白质)到高分子量(溶葡萄菌素-右旋糖酐结合物)的变化。Phenomenex Biosep SEC2000(300×4.6)用PBS平衡并且以0.5ml/min的速度在280nm下监控SEC HPLC。

参见图6，上部谱带是反应大约1分钟的混合物，中间的谱带是过夜反应和下部谱带是单独溶葡萄菌素AO谱带。应注意，反应后高分子量物质的迁移允许过夜进行。该图说明溶葡萄菌素上的AO基团连接到了高分子量的氧化右旋糖酐上。根据分子量最高的面积百分比估算，大约27％被结合。如TNBS分析所表明的，因为仅仅大约三分之一的溶葡萄菌素含游离苏氨酸并被AO衍生，所以这样的百分数是预想到的。

实施例19：DT(氧化型)-AO-Pn14结合物的制备

本实施例说明DT(氧化型)-AO-Pn14结合物的制备，并且它也同时说明如何用“单罐”反应(可以简化制备过程)制备试剂。

I.巯基甘油-白喉类毒素

0.5ml白喉类毒素(～13mg/ml)与100μl 1M pH8的HEPES和10μl0.1M NHS溴乙酸的NMP溶液混合。在黑暗中孵育大约30分钟，然后加入12.3μl巯基甘油中的10μl。随后过夜反应，溶液用Amicon Ultra 4(30kDa截留)脱盐至终体积大约400μl。

其次，加入50μl 1M pH5的乙酸钠，继之加入9μl的0.5M高碘酸钠。在室温下黑暗中氧化反应10分钟。加入50％甘油终止反应。用相同的AmiconUltra 4装置去除低分子量组分并且透析过滤进入盐水。终体积大约为200μl。

上述工艺省略了其中向含溴乙酰-DT和溴乙酸的溶液中加入过量巯基甘油的脱盐步骤。

II.结合

1ml的氨基-氧基Pn14(～9mg/ml)加入到氧化DT中并且加入100μl 1MpH5的乙酸钠。反应在室温下黑暗中过夜进行，然后在S400HR柱(1×60cm，用盐水平衡)上分级分离。

收集高分子量级分。用1mg/ml＝1 OD测定蛋白质并且用间苯二酚分析确定Pn14浓度。发现级分含大约1.3mg DT/mg Pn14。

实施例20：gp350(氧化型)-AO-S-Pn14结合物的制备

gp350是与人类补体受体相结合的EB病毒糖蛋白。由Goutam Sen博士(Uniformed Services University of the Health Sciences，Bethsda，MD)从酵母细胞重组体制备并通过疏水作用色谱层析纯化。

0.5ml 8mg/ml的gp350(溶于PBS中)中加入50μl 1M pH4.7的乙酸钠调低pH值，并且加入11μl的0.5M高碘酸钠(溶于水中)。在冰上黑暗中孵育8分钟后，加入100μl 50％甘油终止反应。过量试剂用Amicon Ultra 4(30kDa截留)装置透析滤除。用4ml PBS交换，共4次。终体积大约300μl。向上述溶液中加入100μl 1M pH5的NaAc，随后加入400μl AO-S-Pn14(9.1mg/ml)。

在4℃下黑暗中过夜反应后，加入100μl 0.25M pH5的氨基羟基乙酸酯终止反应。得到的结合物用盐水平衡的1×60cm S400HR柱凝胶过滤分级分离。收集外水体积。用间苯二酚/硫酸法确定Pn14浓度并且在280nm的吸收度用1mg/ml＝1吸光度单位的吸光系数确定蛋白质。结合物含0.9mg gp350/mgPn14。

加入氨基羟基乙酸酯而不是氨基-氧基Pn14如上氧化和制备对照gp350。

用荧光标记的gp350比较分析，对照和结合物gp350均能与人类B细胞的补体受体结合。(由Goutam Sen USUHS完成)。

在第0天、10天用gp350-Pn14结合物接种小鼠，并在第10天、23天抽血。

天	抗-Pn14 IgG滴度
		10	630
23	10643

促进抗-Pn14 IgG增加的迹象说明蛋白质和多糖是共价结合并作为一种T细胞依赖性抗原。作为一种非T细胞依赖性抗原，仅用Pn14不会呈现滴度的提高。

实施例21：[DeAcLTA(氧化型)-AO-SH]-GMBS-BSA结合物的制备

在约75℃下，LTA在pH 10碳酸氢钠中脱酰1小时。然后样品用水透析。这就是脱酰LTA(DeAcLTA)。

然后样品在室温下黑暗中在10mM pH5的高碘酸钠中过夜氧化，用水再次透析，并冻干。样品中加入少量的水，与还原的氨基-氧基半胱胺过夜孵育，并冻干。样品溶于大约1ml的水中并且用S200HR柱分级分离，该柱用10mM乙酸钠、150mM NaCl、5mM EDTA，pH 5，平衡。收集含Pi和硫醇的低分子量级分，冻干并溶于大约0.75ml水中。发现该级分含有大约1mM硫醇和350μM的磷酸酯。该物质就是硫醇标记的DeAcLTA。

用50倍摩尔过量的pH 7.2的GMBS(Prochem公司)标记BSA并且在乙酸钠缓冲液中脱盐和用Amicon Ultra 4(30kDa截留)装置浓缩至终浓度大约55mg/ml。

60μl的BSA-GMBS加入到硫醇标记的DeAcLTA中。随着反应进行，硫醇的浓度降低至少10倍(通过DTNB分析确定)。

用SEC HPLC法使用Superose 6柱监控结合(用PBS平衡，1ml min，OD280)。下扫描线代表仅仅为GMBS标记的BSA的图谱，上扫描线代表早先洗脱的结合物，显示分子量增加。通过SDS PAGE分析，很明显结合物的MW增加与SEC图谱的趋势一致。结合物中没有明显的单体BSA。

通过蛋白质印迹说明在高分子量蛋白质上存在LTA。可见对于LTA，结合物是有活性的。无论单独的BSA或LTA还是其组合物均没有显示任何高分子量LTA。

为了进一步说明LTA和BSA共价连接，进行双ELISA。用抗-BSA，随后用结合物或LTA，BSA或其混合物包被ELISA板。然后应用抗-LTA并确定结合量。这样，仅仅均含BSA和LTA的物质能被检测到。在该分析中仅仅结合物是阳性的。

由此通过对反应的监测，分子量、蛋白质印迹法和双ELISA均显示蛋白质和LTA间生成了共价键。

实施例22：LTA-TT结合物的制备

试剂购自Aldrich公司。氨基-氧基-乙酰胱胺由Solulink公司(San Diego，CA)的David Schwartz博士制备。TCEP购自Pierce公司。

来自Kemp Biotech公司(Frederick，MD)的金黄色葡萄球菌血清型5实验室菌株(MSSA)培养在100升发酵罐中。离心细胞，重悬浮并离心分成约10升细胞的等分试样。细胞糊状物贮于-70℃。解冻一等分试样并用0.1M pH4.7的柠檬酸钠重悬浮，使用小球击打器(Bead Beater)(Biospec产品)用0.1m的锆小球分裂。装置用冰致冷并依次开、关机各1分钟连续4个周期。清除液体并用柠檬酸盐缓冲液清洗小球。或者，细胞用1mg/ml的溶葡萄球菌素在pH54℃的条件下过夜处理，然后用型号110Y的微流化器(Microfluidizer公司，Newton，MA)在23,000psi条件下分裂3次。

I.LTA提取

用Fischer等人，Improved preparation of lipoteichoic acids.Eur JBiochem，1983.133(3)：p.523-30所描述的苯酚提取法方法稍作改良，或用Morath等人，Structure-function relationship of cytokine inductionby lipoteichoic acid from Staphylococcus aureus.J Exp Med，2001.193(3)：p.393-7所描述的丁醇方法从细胞团块提取和纯化LTA。

简而言之，分裂的细胞悬液与等量的正丁醇充分混合30min。然后溶液在13,000xg条件下离心20min。移去上层(丁醇)并将下层的水相冻干。刚开始时重新提取丁醇相并用ELISA法检测新水相中的LTA，然而没有回收显著量的LTA。团块用25ml的柠檬酸盐缓冲液重悬浮并冷冻。将来自不同提取过程的团块混合，重复分裂和提取过程。

所述溶解的提取液用Whatman 0.45μm针筒式过滤器过滤(#6894-2504)并上载于2.6×20cm辛基Sepharose柱(Pharmacia公司)(该柱用溶于15％正丙醇中的0.1M pH4.7的乙酸铵溶液平衡)，流速0.5ml/min。然后该柱用溶于15％正丙醇中的0.1M乙酸钠清洗直至在280纳米下的吸光度恢复基本值。然后该柱用溶于40％正丙醇中的25mM乙酸钠以4ml/min洗脱并收集8ml级分。收集含磷酸酯的级分并上载到5ml Sepharose Q FF柱上(该柱用相同缓冲液平衡)。当吸光度降到基本值时，用缓冲液+0.5M KCl洗脱。集中含磷酸酯的试管，部分冻干以缩小体积，用水透析去除盐，并再一次冻干。

II.LTA与破伤风类毒素的结合

将1ml(10mg/ml)LTA在0.1M碳酸钠+0.1M羟胺中在75℃下脱酰2小时，随后使用3.5kDa截留膜(Pierce公司)用水透析。将该溶液冻干并溶于0.5ml水中。脱酰LTA中加入100μl 1M pH5的乙酸钠和125μl 0.5M高碘酸钠氧化。2小时后加入100μl 50％甘油终止反应并在黑暗中用水过夜透析。用紫醛分析(purpald assay)(Lee，C.H.and C.E.Frasch，Quantificationof bacterial polysaccharides by the purpald assay：measurement ofperiodate-generated formaldehyde from glycol in the repeating unit.AnalBiochem，2001.296(1)：p.73-82)检测该物质中醛呈阳性。

将11mg双(氨基羟基乙酸)胱胺溶于25％NMP的水溶液中制备(氨基羟基乙酸)半胱胺。加入溶于1M碳酸钠中的TCEP(17mg)，并孵育10分钟，然后使用Dowex 1x-8柱(1×3cm)过柱(该柱用10mM pH 6的Bistris平衡)。收集过柱的DTNB阳性级分。用硫醇分析收集的(氨基羟基乙酸)半胱胺并确定含5.2微摩尔SH。该试剂与氧化脱酰LTA混合并在4℃下黑暗中过夜孵育，然后用10mM乙酸钠、0.15M氯化钠、5mM的EDTA pH5透析去除过量的试剂。终体积为2ml，其中硫醇浓度为2.5mM，磷酸酯浓度25mM。

通过向缓冲于15M HEPES、5mM EDTA，pH7.3的浓度为14.6mg/ml的TT溶液中加入50倍摩尔过量的GMBS(于NMP中的0.1M贮液)，用顺丁烯二酰亚胺标记破伤风类毒素(TT)(购自GlaxoSmithKline公司，Rixensart，Belgium)。经1小时反应，使用Amicon Ultra 4(30kDa截留)装置在2M NaCl中脱盐，浓缩至终体积0.4ml。得到的物质呈DTNB阳性。

硫醇化的脱酰LTA与顺丁烯二酰亚胺-TT在氮流下混合并加入0.75MpH7.3的HEPES调pH值至6.5。密封后在4℃下过夜孵育，分析该溶液并确定仍为2mM硫醇。按如上方法用顺丁烯二酰亚胺标记另外的7mg TT，透析过滤，浓缩至0.5ml并加入到反应混合物中。超过30分钟硫醇含量稳步降低，此时加入100μl 0.5M碘乙酰胺+100μl 1M碳酸钠终止反应。

用筛析色谱法在盐水平衡的Superose 6(制品级)柱(1×30cm)上纯化。

III.小鼠的接种

每组20只Balb/c小鼠分别在第0、14和28天用5μg上述的LTA，或者与TT的混合物，或者与TT的结合物和用Ribi MPL佐剂一起接种，14天后抽血。用ELISA法分析个体血清中抗-IgG。结果示于图7。M110(与LTA结合的小鼠单克隆抗体)作为标准。分析血清中的抗-LTA水平。结果示于图8。结合物诱发高水平、混合物仅诱发极低水平的抗体。为了测定抗-血清的生物活性，进行调理吞噬试验。血清按1∶25稀释。

IV.磷酸酯分析

磷酸酯根据Chen，P.S.，T.Y.Toribara，and H.Warner，Microdetermination of Phosphorous.Anal Biochem，(1956)28：p.1756-1758所述的方法确定，并稍作改良。简而言之，100μl的样品+30μl硝酸镁溶液置于13×100mm硼硅酸盐试管中涡旋搅拌，在加热器中干燥并用丙烷喷灯喷烤直至有褐色气体产生。加入300μl 0.5M HCl，试管用玻璃球盖住，并在沸水浴中加热15分钟。冷却试管并且加入700μl抗坏血酸/钼酸铵混合物，在45℃下孵育20分钟并在820纳米下测定样品。6份钼酸铵溶液(0.42g+2.86ml硫酸用水补至100ml)与1份溶于水中的10％抗坏血酸混合制备所述混合物。标准磷酸酯购自Sigma公司。

对于本领域技术人员来说，根据说明书的详述和本发明在此公开的实践，其它的具体实施方式是显而易见的。说明书和实施例仅仅是示范性的，本发明真实的范围和精神显示在以下的权利要求中。

根据说明书所引用的参考文献的教导说明书可被很好地理解。说明书中的具体实施方式提供了对本发明具体实施方式的说明但并不构成对本发明范围的限制。技术人员很容易意识到其它的具体实施方式包括在本发明中。根据本发明任何先前的方法均是适宜的。上述仅作为说明的实例并没有限制性。

在此公开中所引用的所有出版物和专利包含其中的参考文献。如果参考文献中的物质与说明书中的达到相抵触或不一致的程度，说明书会替换该物质。在此引用的所有参考文献并不意味着这样的参考文献优先于本发明。

除非另有说明，在说明书中，包括权利要求中，所使用的表达成份数量的数字、反应条件等都应被理解为在所有情况下用术语“大约”进行修饰。相应地，对于相抵触的情况除非另有说明，数字参数是近似值并可根据本发明所期望性质进行改变。至少，并不想限制与权利要求的范围相当的所教导的申请，每个数字参数应包括数字本身和其普通意义上的近值。

除非另有陈述，术语“至少”应优先理解为系列元素指该系列中的每一元素。本领域技术人员可意识到或能够确定可用更多的常规试验、与本发明在此描述相当的许多特殊的具体实施方式。这样相当的具体实施方式试图包括在下述权利要求中。

Claims (52)

1.一种制备结合疫苗的方法，包括：

(a)使含至少一羰基的第一部分与至少一种氨基-氧基试剂反应形成第一部分上的至少一个侧链官能团，其中第一部分选自多糖、寡糖、碳水化合物和含碳水化合物分子；

(b)使含至少一个侧链官能团的第一部分与第二部分反应形成含结合物的组合物，其中第二部分选自蛋白质、肽和半抗原；和

(c)结合物与药物可接受的递送载体组合形成结合疫苗。

2.根据权利要求1的方法，其中所述至少一个羰基选自醛和酮基。

3.根据权利要求1的方法，其中氨基-氧基试剂选自同官能的和杂官能的试剂。

4.根据权利要求1的方法，其中含至少一个侧链官能团的第一部分直接地与第二部分反应形成结合物。

5.根据权利要求1的方法，其中含至少一个侧链官能团的第一部分间接地与第二部分反应形成结合物。

6.根据权利要求1的方法，其中第二部分在其与第一部分反应前官能化。

7.根据权利要求1的方法，其中蛋白质是半抗原化蛋白质。

8.根据权利要求1的方法，其中含碳水化合物分子选自脂多糖、脂低聚多糖、脂磷壁质酸和脱酰化脂磷壁质酸。

9.一种制备结合疫苗的方法，包括：

(a)使含至少一个侧链氨基-氧基基团的第一部分与第二部分反应形成含结合物的组合物，

(b)其中第一部分选自多糖、寡糖、碳水化合物和含碳水化合物分子，并且第二部分选自蛋白质、肽和半抗原；和

(c)结合物与药物上可接受的递送载体组合形成结合疫苗。

10.根据权利要求9的方法，其中含至少一个侧链氨基-氧基基团的第一部分直接与第二部分反应形成结合物。

11.根据权利要求9的方法，其中含至少一个侧链氨基-氧基基团的第一部分间接与第二部分反应形成结合物。

12.根据权利要求9的方法，其中第二部分在与第一部分反应前官能化。

13.根据权利要求9的方法，其中蛋白质是半抗原化蛋白。

14.根据权利要求9的方法，其中含碳水化合物分子选自脂多糖、脂低聚多糖、脂磷壁质酸和脱酰化脂磷壁质酸。

15.一种制备结合疫苗的方法，包括：

(a)将选自多糖、寡糖、碳水化合物和含碳水化合物分子的第一部分，与

(b)与至少一种氨基-氧基试剂反应的第二部分反应，其中第二部分选自蛋白质、肽和半抗原，形成含结合物的组合物；和

(c)结合物与药物上可接受的递送载体组合形成结合疫苗。

16.根据权利要求15的方法，其中氨基-氧基试剂选自同官能的和杂官能的试剂。

17.根据权利要求15的方法，其中第一部分直接与第二部分反应生成结合物。

18.根据权利要求15的方法，其中第一部分间接与第二部分反应生成结合物。

19.根据权利要求15的方法，其中第一部分在与第一部分反应前官能化。

20.根据权利要求15的方法，其中蛋白质是半抗原化蛋白。

21.根据权利要求15的方法，其中含碳水化合物分子选自脂多糖、脂低聚多糖、脂磷壁质酸和脱酰化脂磷壁质酸。

22.一种制备结合疫苗的方法，包括：

(a)使第一部分与含至少一个侧链氨氨基-氧基基团的第二部分反应形成含结合物的组合物，其中第一部分选自多糖、寡糖、碳水化合物和含碳水化合物分子，并且第二部分选自蛋白质、肽和半抗原；和

(b)结合物与药物上可接受的递送载体组合形成结合疫苗。

23.根据权利要求22的方法，其中第一部分直接与第二部分反应生成结合物。

24.根据权利要求22的方法，其中第一部分间接与第二部分反应生成结合物。

25.根据权利要求22的方法，其中第一部分在与第二部分反应前官能化。

26.根据权利要求22的方法，其中蛋白质是半抗原化蛋白。

27.根据权利要求22的方法，其中含碳水化合物分子选自脂多糖、脂低聚多糖、脂磷壁质酸和脱酰化脂磷壁质酸。

28.根据权利要求22的方法，其中在与第一部分反应之前官能化了的第二部分含至少一个侧链的氨基-氧基基团。

29.一种制备结合疫苗的方法，包括：

(a)提供选自多糖、寡糖、碳水化合物和含碳水化合物分子的第一部分；

(b)提供选自含至少一个醛基的N-末端1，2-氨基醇的第二部分；和

(c)所述的第二部分与至少一个氨基-氧基试剂反应；

(d)所述的第一部分与官能化了的第二部分反应形成含结合物的组合物；和

(e)结合物与药物可接受的递送载体组合形成结合疫苗。

30.根据权利要求29的方法，其中在第二部分上通过选择性氧化生成所述至少一个醛基。

31.根据权利要求29的方法，其中氨基-氧基试剂选自同官能的和杂官能的试剂。

32.根据权利要求29的方法，其中第一部分直接与第二部分反应生成结合物。

33.根据权利要求29的方法，其中第一部分间接与第二部分反应生成结合物。

34.根据权利要求29的方法，其中第一部分在与第二部分反应前官能化。

35.根据权利要求29的方法，其中含碳水化合物分子选自脂多糖、脂低聚多糖、脂磷壁质酸和脱酰化脂磷壁质酸。

36.一种制备结合疫苗的方法，包括：

(a)使含至少一个侧链氨基-氧基基团的第一部分反应，其中第一部分选自多糖、寡糖、碳水化合物和含碳水化合物分子；

(b)使第一部分与第二部分反应形成含结合物的组合物，其中第二部分选自包含至少一个羰基的糖蛋白；和

(c)结合物与药物可接受的递送载体组合形成含结合疫苗的组合物。

37.根据权利要求36的方法，其中所述至少一个羰基选自醛和酮基。

38.根据权利要求36的方法，其中含至少一个侧链氨基-氧基基团的第一部分直接与第二部分反应形成结合物。

39.根据权利要求36的方法，其中含至少一个侧链氨基-氧基基团的第一部分间接与第二部分反应形成结合物。

40.根据权利要求36的方法，其中第二部分在与第一部分反应前官能化。

41.根据权利要求36的方法，其中糖蛋白是半抗原化糖蛋白。

42.根据权要求36的方法，其中含碳水化合物分子选自脂多糖、脂低聚多糖、脂磷壁质酸和脱酰化脂磷壁质酸。

43.一种制备结合疫苗的方法，包括：

(a)使选自多糖、寡糖、碳水化合物和含碳水化合物分子的第一部分与氨基-氧基试剂反应，其中反应发生在第一部分的还原端，产生官能化的第一部分；

(b)使官能化的第一部分与选自蛋白质、肽和半抗原的第二部分反应，形成含结合物的组合物，和

(c)结合物与药物上可接受的递送载体组合形成结合疫苗。

44.根据权利要求43的方法，其中氨基-氧基试剂选自同官能的和杂官能的试剂。

45.根据权利要求43的方法，其中第一部分直接与第二部分反应形成结合物。

46.根据权利要求43的方法，其中第一部分间接与第二部分反应形成结合物。

47.根据权利要求43的方法，其中第二部分在与第一部分反应前官能化。

48.根据权利要求43的方法，其中蛋白质是半抗原化蛋白。

49.根据权利要求43的方法，其中含碳水化合物分子选自脂多糖、脂低聚多糖、脂磷壁质酸和脱酰化脂磷壁质酸。

50.含有根据权利要求1的方法制备的结合物的疫苗。

51.根据权利要求1的疫苗在制备药物中的应用。

52.在患者体内诱发免疫应答的方法，包括对患者施用含有根据权利要求1的方法制备的结合物的疫苗。

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