CN107058421B - 一种336型金黄色葡萄球菌中荚膜多糖的提取纯化方法 - Google Patents
一种336型金黄色葡萄球菌中荚膜多糖的提取纯化方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107058421B CN107058421B CN201710337975.7A CN201710337975A CN107058421B CN 107058421 B CN107058421 B CN 107058421B CN 201710337975 A CN201710337975 A CN 201710337975A CN 107058421 B CN107058421 B CN 107058421B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- capsular polysaccharide
- polysaccharide
- extracting
- staphylococcus aureus
- supernatant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/0003—General processes for their isolation or fractionation, e.g. purification or extraction from biomass
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种336型金黄色葡萄球菌中荚膜多糖的提取纯化方法，包括以下步骤：336型金黄色葡萄球菌发酵培养、灭活、离心，从上清液和菌体沉淀中提取荚膜多糖粗制品，再将粗制品脱蛋白后用分子筛排阻层析对其纯化，得到精制荚膜多糖。本发明的有益效果为：采用液体发酵培养，易于工艺放大与实际生产应用；分别从发酵上清液和菌体沉淀中提取多糖，提高了荚膜多糖的生产效率，降低了生产成本；使用Sevage法除蛋白，减少了苯酚的用量，同时减少了操作时间，提高了纯化效率；多糖产量稳定，纯化后的精制多糖符合相关国家质量标准；方法简便、有效，提取的荚膜多糖适用于疾病的诊断、预防和治疗，适用于336型金黄色葡萄球菌荚膜多糖疫苗的制备。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种336型金黄色葡萄球菌中荚膜多糖的提取纯化方法。
背景技术
奶牛乳房炎是奶牛生产中最为常见、最难防治，同时也是花费最多的疾病之一，严重影响了我国乃至世界奶牛业的健康发展。根据世界奶牛协会统计，全世界约有2.2亿头奶牛，其中约50%患有乳腺炎等，全球每年因乳房炎造成的损失约350亿美元。乳房炎是乳腺组织的一种炎症，常由微生物感染引起，已有超过150种微生物被认为能导致奶牛乳房炎的发生，其中金黄色葡萄球菌是引起奶牛乳腺炎的最主要致病菌之一。随着多重耐药性金黄色葡萄球菌的出现和流行，以及人们对于奶制品中抗生素残留的日益重视，研究和使用疫苗无疑是预防金黄色葡萄球菌性奶牛乳房炎的一种有效手段。
金黄色葡萄球菌之所以难以防治，是因为在菌体的表面存在一层“保护膜”，即荚膜。有研究表明，荚膜几乎存在于所有金黄色葡萄球菌菌株的表面，可保护细菌免受抑菌或杀菌物质的侵害以及宿主吞噬细胞的吞噬，同时还有助于细菌黏附于宿主细胞表面以诱发感染，是细菌得以生存的重要表面结构。荚膜的主要成分为多糖，是细菌结构变化最少的表面抗原之一，具有较好的免疫原性。据报道，94%～100%的金黄色葡萄球菌都含有荚膜，因此提取金黄色葡萄球菌荚膜多糖作为其疫苗的靶抗原已备受关注。目前，已被鉴定的金黄色葡萄球菌有11个荚膜多糖血清型，其中70％～80％的金黄色葡萄球菌可产生5型或8型荚膜多糖。然而，近年来多项研究表明，336型已成为我国奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌的优势血清型，因此对于336型金黄色葡萄球菌多糖疫苗的研究，也越来越重要。
不论是荚膜多糖疫苗还是多糖蛋白结合疫苗的研制，荚膜多糖的提取与纯化是其中的关键步骤之一。目前，关于金黄色葡萄球菌荚膜多糖提取的报道有很多，但提取方法各异。杨正涛等采用固体培养基对5型金葡菌荚膜多糖进行培养，收集菌体经高压裂解释放荚膜多糖，但固体培养法不利于扩大生产。杨琦采用了液体发酵离心收集菌体，高压裂解菌体收集上清液，再往上清液中加入十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）以沉淀多糖，纯化后多糖产量为1.3mg/L；吴建勇等采用液体发酵培养，离心收集菌体沉淀经溶菌酶裂解菌体，采用乙醇沉淀对金黄色葡萄球菌336型荚膜多糖进行了提取纯化。中国专利CN 102971009 A，公开了5型和8型金黄色葡萄球菌荚膜多糖的提取纯化工艺，该发明使用了酸处理金黄色葡萄球菌以释放多糖。然而，林树乾利用金黄色葡萄球菌发酵上清液，也成功提取到了荚膜多糖，经纯化后，多糖产量为12.5mg/L。
发明内容
本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，克服现有技术纯化金黄色葡萄球菌荚膜多糖的局限，采用液体发酵培养，经甲醛灭活离心后分别对上清及菌体中的多糖进行提取，以提高荚膜多糖产量，降低生产成本；同时，利用Sevage法替代传统工艺中苯酚抽提去除蛋白质的方法，减少了苯酚的用量，提高了多糖纯化效率。
本发明所采用336型金黄色葡萄球菌，分离自患临床型奶牛乳房炎的乳样中，其特点为菌株传代稳定性好，毒力强，荚膜多糖产量高。
为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：一种336型金黄色葡萄球菌中荚膜多糖的提取纯化方法，包括以下步骤：
1）发酵培养：
将336型金黄色葡萄球菌种子液按1%（体积百分比）的接种量接种到pH为7.0的装有哥伦比亚培养基的三角摇瓶中，37℃，200rpm/min摇床震荡培养16～18h，收获得到发酵液；
2）灭活：
将步骤1）得到的发酵液中，按终体积的0.3%（体积百分比）加入甲醛溶液，置37℃摇床灭活20～24h，经灭活检测合格后备用，得到灭活发酵液；
3）提取荚膜多糖：
将步骤2）得到的灭活发酵液低温离心，采用阳离子去垢剂从发酵上清液中提取荚膜多糖，采用高压裂解法从菌体沉淀中提取荚膜多糖；
4）纯化荚膜多糖：
采用分子Sevage法抽提多糖中的蛋白质，并利用分子筛排阻层析对脱蛋白的荚膜多糖溶液做进一步纯化。
进一步的，上述的一种336型金黄色葡萄球菌中荚膜多糖的提取纯化方法，所述步骤1）中，金黄色葡萄球菌的培养中所使用的哥伦比亚培养基中，添加有按照体积百分比计为2%的无菌乳清。
进一步的，上述的一种336型金黄色葡萄球菌中荚膜多糖的提取纯化方法，所述步骤3）中，阳离子去垢剂为十六烷基三甲基溴化铵、十四烷基三甲基氯化铵或十四烷基二甲基苄基氯化铵。
进一步的，上述的一种336型金黄色葡萄球菌中荚膜多糖的提取纯化方法，所述步骤3）中的灭活发酵液低温离心，是指温度为4℃，离心转速为5000rpm/min，离心时间为20min，收集上清液，菌体沉淀置-20℃保存备用。
进一步的，上述的一种336型金黄色葡萄球菌中荚膜多糖的提取纯化方法，所述步骤3）中的采用阳离子去垢剂从发酵上清液中提取荚膜多糖，是指向离心后得到的发酵上清液中加入阳离子去垢剂，边加边搅拌，4℃静置过夜沉淀多糖；沉淀用1M的CaCl2溶液溶解，加入冷无水乙醇至终浓度为25%（体积百分比），震荡混匀后4℃静置过夜；4℃，5000rpm/min离心20min弃沉淀，上清液中加入冷无水乙醇至终浓度为80%（体积百分比），4℃静置过夜；4℃，5000rpm/min离心20min，收集沉淀，用无水乙醇和丙酮洗涤后冻干，即得到荚膜多糖粗制品。
进一步的，上述的一种336型金黄色葡萄球菌中荚膜多糖的提取纯化方法，所述步骤3）中的采用高压裂解法从菌体沉淀中提取荚膜多糖，是指将离心后得到的菌体沉淀悬浮于PBS缓冲液中，高压裂解后，4℃，5000rpm/min离心20min，收集上清液，沉淀再次高压裂解并离心，合并裂解上清液；将所得上清液用10KD超滤膜超滤浓缩；加入冷的无水乙醇至终浓度为25%（体积百分比），震荡混匀后4℃静置过夜；4℃，5000rpm/min离心20min取上清，加入冷无水乙醇至终浓度为80%（体积百分比），4℃静置过夜，4℃，5000rpm/min离心20min收集沉淀，用无水乙醇和丙酮洗涤后冻干，即得到荚膜多糖粗制品。
进一步的，上述的一种336型金黄色葡萄球菌中荚膜多糖的提取纯化方法，所述步骤4）中，采用的分子筛排阻层析填料为Sepharose 2B，Sepharose 4B，Sepharose CL-2B，Sepharose CL-4B或superdex 200。
进一步的，上述的一种336型金黄色葡萄球菌中荚膜多糖的提取纯化方法，所述步骤4）中，采用分子Sevage法抽提多糖中的蛋白质，是指合并步骤3）中提取得到的两种荚膜多糖粗品，用注射用水溶解至多糖粗制品的终浓度为10 mg/ml，加入1/3体积的氯仿与正丁醇体积比为4:1的Sevage试剂，充分震摇25 min后，4℃，5000rpm/min离心20min，上清液经30KD超滤管超滤后冻干后，得到脱蛋白的多糖。
进一步的，上述的一种336型金黄色葡萄球菌中荚膜多糖的提取纯化方法，所述步骤4）中的利用分子筛排阻层析对脱蛋白的荚膜多糖溶液做进一步纯化，是指利用分子筛排阻层析对脱蛋白的荚膜多糖溶液进行纯化，收集峰值处及附近的洗脱液，30KD超滤管进行超滤后低压冻干，得到白色粉末状物质即为荚膜多糖纯品。
本发明的有益效果为：
1、本发明采用液体发酵培养细菌，对发酵上清液及菌体中的多糖进行了提取，易于临床生产，同时提高了荚膜多糖产量，降低了生产成本。
2、本发明利用Sevage法替代传统工艺中苯酚抽提去除蛋白质的方法，减少了苯酚的用量，提高了多糖纯化效率。
3、本发明的纯化过程避免了核酸、蛋白酶等外源因子的应用，工艺简单、降低了后续检测项目的压力。
4、本发明提取的荚膜多糖纯度高，杂质含量少，符合《中华人民共和国药典》(2010版)中相关质量标准的规定。
5、本发明方法简便、有效，设备要求低，投入成本少，可用于规模化生产。
具体实施方式
材料来源：
336型金黄色葡萄球菌菌株J581，分离自患临床型奶牛乳房炎的乳样中，其特点是菌株传代稳定性好，毒力强，荚膜多糖产量高，该菌株保藏与中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所微生物与免疫实验室。
哥伦比亚液体培养基（Columbia Broth, CB），由招远托普生物工程有限公司生产，十六烷基三甲基溴化铵（CTAB，天津市大茂化工有限公司），Lowry法蛋白浓度测定试剂盒（Solarbio生物科技有限公司）。
主要仪器设备：
10KD超滤膜包（Sartorius），30KD超滤离心管（Millipore），Sepharose CL-4B 琼脂糖凝胶，为Solarbio生物科技有限公司生产。
高速冷冻离心机（Backman，J6-HC），冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司，FD-1B-50）。
实施例1：
336型金黄色葡萄球菌荚膜多糖的提取与纯化：
一、336型金黄色葡萄球菌的发酵培养
1. 培养基的配置：按说明书取35g哥伦比亚培养基，加入适量蒸馏水溶解，用2M的NaOH或1M的HCl盐酸调pH至7.0，蒸馏水定容至1L，121℃高压灭菌15min，冷至室温后加入2%体积比的无菌乳清，置4℃冰箱备用。
2. 种子液的培养：开启冻存的菌种J581，以1%的接种量接种至2mL哥伦比亚肉汤（CB），37℃静置培养10h得一级种子发酵液；取0.3mL一级种子液接种于30mL哥伦比亚肉汤三角锥瓶中，摇床振荡培养（37℃，200rpm/min）12h得工作种子发酵液，置4℃冰箱备用。
3. 摇瓶发酵培养 将工作种子液以1%的接种量，接种于装有哥伦比亚培养基的摇瓶中，37℃，200rpm/min摇床震荡培养至16～18h。
二、发酵液的灭活与荚膜多糖提取：
1. 在336型金黄色葡萄球菌发酵液中加入至终浓度为0.3%的甲醛溶液，37℃摇床灭活过夜20～24h。
2. 灭活发酵液经检测确认无菌后，低温离心(4℃，5000rpm/min离心20min，下同)，收集上清，沉淀置-20℃保存备用。
3. 往步骤2制备的上清液中加入阳离子去垢剂，这里优选的是十六烷基三甲基溴化铵（CTAB），边加边搅拌，4℃静置过夜沉淀多糖，CTAB的加入量为：每升发酵上清液中加入1克的CTAB。
4. 沉淀用1M的CaCl2溶液解离，加入冷无水乙醇至终浓度为25%，震荡混匀后4℃静置过夜；
5. 低温离心弃沉淀，上清液中加入至终浓度为80%的冷无水乙醇，4℃静置过夜；
6. 低温离心收集沉淀，用无水乙醇和丙酮洗涤后冻干，即得荚膜多糖粗制品。
7. 将步骤2冻存的菌体沉淀悬浮于PBS缓冲液中（按0.25g/mL加入），121℃高压1h裂解后离心收集上清液。
8. 沉淀加入PBS缓冲液后再次高压裂解，低温离心收集上清液。
9. 合并步骤8和步骤9所得的上清液，经10KD超滤膜超滤浓缩至原体积的1/10。
10. 向浓缩液中加入冷无水乙醇至终浓度为25%，震荡混匀后4℃静置过夜。
11. 低温离心弃沉淀，上清液中加入至终浓度为80％的冷无水乙醇4℃静置过夜。
低温离心收集沉淀，用无水乙醇和丙酮洗涤后冻干，即得荚膜多糖粗制品。
三、336型金黄色葡萄球菌荚膜多糖的纯化：
1. 合并步骤6和步骤11所得荚膜多糖，按照10 mg/mL的量，用注射用水溶解。
2. 加入1/3体积的Sevage试剂(氯仿与正丁醇体积比为4:1)，充分震摇25 min后低温离心，同时采用苯酚抽提法进行比较研究（结果见表1）。
3. 上清液经30KD超滤管超滤，浓缩液冻干，得脱蛋白多糖。
4. 利用分子筛排阻层析对脱蛋白的荚膜多糖溶液(5mg/mL)进行纯化，这里优选的填料是Sepharose CL-4B。
5. 收集峰值处及附近的洗脱液，30KD超滤管进行超滤后低压冻干，得到白色粉末状物质即为荚膜多糖纯品。
表1
四、336型金黄色葡萄球菌精制荚膜多糖的质量检测：
1. 对制得的多糖精密称重，计算出每升发酵液提取多糖的量。
2. 采用Lowry法蛋白浓度测定试剂盒，测定精制荚膜多糖中蛋白质含量。
3. 采用紫外分光光度计法，测定精制荚膜多糖中核酸的含量。
336型金黄色葡萄球菌精制荚膜多糖质量检测结果如表2所示。
表2
由表2以看出，本发明一种用于336型金黄色葡萄球菌荚膜多糖的提取纯化方法，工艺稳定，荚膜多糖产量高，纯度较高。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种336型金黄色葡萄球菌中荚膜多糖的提取纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）发酵培养：
将336型金黄色葡萄球菌种子液按体积百分比1%的接种量接种到pH为7 .0的装有哥伦比亚培养基的三角摇瓶中，37℃，200rpm/min摇床震荡培养16～18h，收获得到发酵液；
2）灭活：
将步骤1）得到的发酵液中，按终体积的以体积百分比计0 .3%加入甲醛溶液，置37℃摇床灭活20～24h，经灭活检测合格后备用，得到灭活发酵液；
3）提取荚膜多糖：
将步骤2）得到的灭活发酵液低温离心，采用阳离子去垢剂从发酵上清液中提取荚膜多糖，采用高压裂解法从菌体沉淀中提取荚膜多糖；
4）纯化荚膜多糖：
采用分子Sevage法抽提多糖中的蛋白质，并利用分子筛排阻层析对脱蛋白的荚膜多糖溶液做进一步纯化；
所述步骤1）中，金黄色葡萄球菌的培养中所使用的哥伦比亚培养基中，添加有按照体积百分比计为2%的无菌乳清；
所述步骤3）中的灭活发酵液低温离心，是指温度为4℃，离心转速为5000rpm/min，离心时间为20min，收集上清液，菌体沉淀置-20℃保存备用；
所述步骤3）中的采用阳离子去垢剂从发酵上清液中提取荚膜多糖，是指向离心后得到的发酵上清液中加入阳离子去垢剂，边加边搅拌，4℃静置过夜沉淀多糖；沉淀用1M的CaCl2溶液溶解，加入冷无水乙醇至终浓度为按体积百分比计25%，震荡混匀后4℃静置过夜；4℃，5000rpm/min离心20min弃沉淀，上清液中加入冷无水乙醇至终浓度为按体积百分比计80%，4℃静置过夜；4℃，5000rpm/min离心20min，收集沉淀，用无水乙醇和丙酮洗涤后冻干，即得到荚膜多糖粗制品；
所述步骤3）中的采用高压裂解法从菌体沉淀中提取荚膜多糖，是指将离心后得到的菌体沉淀悬浮于PBS缓冲液中，高压裂解后，4℃，5000rpm/min离心20min，收集上清液，沉淀再次高压裂解并离心，合并裂解上清液；将所得上清液用10KD超滤膜超滤浓缩；加入冷的无水乙醇至终浓度为按体积百分比计25%，震荡混匀后4℃静置过夜；4℃，5000rpm/min离心2 0m i n取上清，加入冷无水乙醇至终浓度为按体积百分比计8 0 % ，4℃静置过夜，4℃，5000rpm/min离心20min收集沉淀，用无水乙醇和丙酮洗涤后冻干，即得到荚膜多糖粗制品；
所述步骤4）中，采用分子Sevage法抽提多糖中的蛋白质，是指合并步骤3）中提取得到的两种荚膜多糖粗品，用注射用水溶解至多糖粗制品的终浓度为10 mg/ml，加入1/3体积的氯仿与正丁醇体积比为4:1的Sevage试剂，充分震摇25 min后，4℃，5000rpm/min离心20min，上清液经30KD超滤管超滤后冻干后，得到脱蛋白的多糖；利用分子筛排阻层析对脱蛋白的荚膜多糖溶液做进一步纯化，是指利用分子筛排阻层析对脱蛋白的荚膜多糖溶液进行纯化，收集峰值处及附近的洗脱液，30KD超滤管进行超滤后低压冻干，得到白色粉末状物质即为荚膜多糖纯品。
2.根据权利要求1所述的一种336型金黄色葡萄球菌中荚膜多糖的提取纯化方法，其特征在于，所述步骤3）中，阳离子去垢剂为十六烷基三甲基溴化铵、十四烷基三甲基氯化铵或十四烷基二甲基苄基氯化铵。
3.根据权利要求1所述的一种336型金黄色葡萄球菌中荚膜多糖的提取纯化方法，其特征在于，所述步骤4）中，采用的分子筛排阻层析填料为Sepharose 2B，Sepharose 4B，Sepharose CL-2B，Sepharose CL-4B或superdex 200。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710337975.7A CN107058421B (zh) | 2017-05-15 | 2017-05-15 | 一种336型金黄色葡萄球菌中荚膜多糖的提取纯化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710337975.7A CN107058421B (zh) | 2017-05-15 | 2017-05-15 | 一种336型金黄色葡萄球菌中荚膜多糖的提取纯化方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN107058421A CN107058421A (zh) | 2017-08-18 |
| CN107058421B true CN107058421B (zh) | 2021-01-26 |
Family
ID=59596501
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201710337975.7A Active CN107058421B (zh) | 2017-05-15 | 2017-05-15 | 一种336型金黄色葡萄球菌中荚膜多糖的提取纯化方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN107058421B (zh) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110387341A (zh) * | 2019-07-17 | 2019-10-29 | 安徽赛德齐瑞生物科技有限公司 | 一种葡萄球菌培养液及其培养方法 |
| CN115043954A (zh) * | 2022-06-27 | 2022-09-13 | 江西赛基生物技术有限公司 | 甘露聚糖的制备方法与甘露聚糖 |
| CN115043953A (zh) * | 2022-06-27 | 2022-09-13 | 江西赛基生物技术有限公司 | 半乳甘露聚糖抗原的制备方法和半乳甘露聚糖抗原 |
| CN114957509B (zh) * | 2022-08-01 | 2022-10-21 | 深圳柏垠生物科技有限公司 | 一种可放大的可拉酸纯化方法 |
| CN117180412B (zh) * | 2023-11-06 | 2024-02-02 | 四川大学华西医院 | 一种鲍曼不动杆菌荚膜多糖疫苗及其制备方法 |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101590226A (zh) * | 2009-06-19 | 2009-12-02 | 长春长生生物科技股份有限公司 | ACY W135群脑膜炎球菌多糖-b型流感嗜血杆菌结合疫苗 |
| CN101991847A (zh) * | 2010-11-16 | 2011-03-30 | 赤峰博恩药业有限公司 | 奶牛乳房炎三联灭活疫苗及其制备方法 |
| CN102120761A (zh) * | 2010-12-24 | 2011-07-13 | 新疆维吾尔自治区畜牧科学院兽医研究所 | 一种无荚膜型金黄色葡萄球菌胞外多糖-蛋白质偶联物及其制备方法 |
| CN102327605A (zh) * | 2011-08-25 | 2012-01-25 | 成都康华生物制品有限公司 | 四价脑膜炎球菌多糖疫苗的制备工艺 |
| CN103800900A (zh) * | 2014-01-27 | 2014-05-21 | 内蒙古华希生物科技有限公司 | 金黄色葡萄球菌以及将其灭活得到的奶牛乳房炎疫苗 |
| CN103833865A (zh) * | 2012-11-26 | 2014-06-04 | 天士力制药集团股份有限公司 | 一种肺炎链球菌荚膜多糖的制备方法 |
| CN106282262A (zh) * | 2016-08-29 | 2017-01-04 | 成都欧林生物科技股份有限公司 | 一种提高流脑a群荚膜多糖产率的制备方法 |
| CN106318992A (zh) * | 2016-08-29 | 2017-01-11 | 成都欧林生物科技股份有限公司 | 利于多糖‑sph衍生物质量控制的工艺 |
-
2017
- 2017-05-15 CN CN201710337975.7A patent/CN107058421B/zh active Active
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101590226A (zh) * | 2009-06-19 | 2009-12-02 | 长春长生生物科技股份有限公司 | ACY W135群脑膜炎球菌多糖-b型流感嗜血杆菌结合疫苗 |
| CN101991847A (zh) * | 2010-11-16 | 2011-03-30 | 赤峰博恩药业有限公司 | 奶牛乳房炎三联灭活疫苗及其制备方法 |
| CN102120761A (zh) * | 2010-12-24 | 2011-07-13 | 新疆维吾尔自治区畜牧科学院兽医研究所 | 一种无荚膜型金黄色葡萄球菌胞外多糖-蛋白质偶联物及其制备方法 |
| CN102327605A (zh) * | 2011-08-25 | 2012-01-25 | 成都康华生物制品有限公司 | 四价脑膜炎球菌多糖疫苗的制备工艺 |
| CN103833865A (zh) * | 2012-11-26 | 2014-06-04 | 天士力制药集团股份有限公司 | 一种肺炎链球菌荚膜多糖的制备方法 |
| CN103800900A (zh) * | 2014-01-27 | 2014-05-21 | 内蒙古华希生物科技有限公司 | 金黄色葡萄球菌以及将其灭活得到的奶牛乳房炎疫苗 |
| CN106282262A (zh) * | 2016-08-29 | 2017-01-04 | 成都欧林生物科技股份有限公司 | 一种提高流脑a群荚膜多糖产率的制备方法 |
| CN106318992A (zh) * | 2016-08-29 | 2017-01-11 | 成都欧林生物科技股份有限公司 | 利于多糖‑sph衍生物质量控制的工艺 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| 细菌荚膜多糖的分离纯化研究进展;赵海平，等;《微生物学免疫学进展》;20121231;第40卷(第2期);第72-78页 * |
| 金葡菌5型荚膜多糖单克隆抗体制备及ELISA方法建立;杨琦;《中国优秀硕士论文全文数据库 医药卫生科技辑》;20090915(第9期);第10-11页第1.2.2.2-1.2.2.3节及1.2.3节 * |
| 金黄色葡萄球菌336型多糖偶联抗原的制备及免疫原性;吴建勇，等;《中国兽医科学》;20131231;第43卷(第9期);第946-951页 * |
| 金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖的提取纯化及生物学特性研究;宋战辉，等;《黑龙江畜牧兽医》;20150331(第3期);第142-144、233页 * |
| 金黄色葡萄球菌液体发酵制备荚膜多糖;杨盛永;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技I辑》;20121015(第10期);第40-42页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN107058421A (zh) | 2017-08-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107058421B (zh) | 一种336型金黄色葡萄球菌中荚膜多糖的提取纯化方法 | |
| CN113234770B (zh) | 脆弱拟杆菌荚膜多糖a的制备方法 | |
| CN111961617B (zh) | 一株高产免疫多糖和细菌素的多效枯草芽孢杆菌及应用 | |
| CN109182186B (zh) | 一种乳酸菌胞外多糖及免疫佐剂 | |
| CN100540676C (zh) | 一种大孔树脂用于细菌多糖中内毒素去除的方法 | |
| CN103740625A (zh) | 一种猪支原体肺炎减毒活疫苗及其应用 | |
| CN113521265A (zh) | 一种鲈鱼弹状病毒亚单位疫苗及其制备方法 | |
| CN110201153B (zh) | 一种兔病毒性出血症、巴氏杆菌病、波氏杆菌病三联灭活疫苗及其制备方法 | |
| CN111500482A (zh) | 一种羊a型产气荚膜梭菌菌株及其灭活疫苗和疫苗制备方法 | |
| CN105695362A (zh) | 一种用于培养鸡滑液囊支原体的液体培养基 | |
| CN112870341B (zh) | 一种山羊传染性胸膜肺炎亚单位疫苗及其制备方法和应用 | |
| CN110713550B (zh) | 一种利用虫草培养物制备具有抑菌活性精多糖的方法 | |
| CN109954135B (zh) | 牛a型产气荚膜梭菌灭活类毒素疫苗及其制备方法 | |
| CN101991847A (zh) | 奶牛乳房炎三联灭活疫苗及其制备方法 | |
| CN104888213A (zh) | 一种猪瘟脾淋源复合活疫苗的制备方法 | |
| CN106237319A (zh) | 一种金黄色葡萄球菌灭活疫苗的制备方法 | |
| CN104873978A (zh) | 一种猪瘟脾淋源活疫苗用冻干保护剂 | |
| CN103143007A (zh) | 一种利用传代鸡胚成纤维细胞制备传染性法氏囊病毒活疫苗的方法 | |
| CN100540675C (zh) | 一种使用Sepharose 4FF凝胶对细菌多糖进行纯化的方法 | |
| CN105169380A (zh) | 一种兔病毒性出血症和多杀性巴氏杆菌病二联蜂胶灭活疫苗及其制备方法 | |
| CN110711203A (zh) | 一种虫草精多糖在制备用于抗革兰氏阴性植物病原细菌药剂中的用途 | |
| CN104740622B (zh) | 一种水貂绿脓杆菌、克雷伯氏菌、巴氏杆菌三联灭活疫苗 | |
| CN109414486A (zh) | 用于治疗和预防蹄和爪病的组合物 | |
| CN109943507B (zh) | 一种兽用a型产气荚膜梭菌类毒素的制备方法及其应用 | |
| CN103509120A (zh) | 一种鳗鲡嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌二联重组蛋白及其制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |