CN106318992A - 利于多糖‑sph衍生物质量控制的工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利于多糖‑SPH衍生物质量控制的工艺，包括流脑A群菌种的培养、发酵、纯化，以及流脑A群荚膜多糖的活化和衍生；其中，流脑A群菌种的培养、发酵、纯化具体为：开启流脑A群菌种传代至氯化血红素流脑半综合培养基上，放入二氧化碳细胞培养箱中，36.5℃，8%CO2培养；将培养得到的流脑A群种子接种到种子罐，恒温搅拌通气培养后接种入发酵罐后，恒温36.5℃，深层通气240rpm搅拌培养，培养流脑A群细菌至对数生长期后期或静止期前期，甲醛杀菌后去除菌体，收集上清液；纯化后得到多糖，且苯酚的用量为粗糖的3/4（v/v）。本发明所示优化后的工艺一方面控制流脑A群发酵液中的核酸及蛋白等杂质成分含量较低，另一方面降低苯酚的用量。
Description
技术领域
本发明属于流脑A群疫苗制备领域，具体地，涉及一种利于多糖-SPH衍生物质量控制的工艺。
背景技术
脑膜炎奈瑟菌（N. meningitidis）简称为脑膜炎球菌（meningococcus），是流行性脑脊髓膜炎（简称流脑）的病原菌。一百多年来，流脑一直在世界各地流行或散在发生，是人类的主要急性呼吸道传染病之一。很多国家经过长期的流行病学监测，发现此病具有周期性流行的特点。意大利发现1915-1934年在其国内发生了三次流行。我国也出现过五次全国性大流行，在1938、1949、1959、1967及1977年，约每8-10年出现一次流行高峰。据WHO报告，近十余年来发病率平均为2.5/10万。当今世界各大洲发病率在1/10万-10/10万，国内1967年的大流行，全国发病率及病死率均较高。发病数占传染数的第四位，而死亡数占全部传染病死亡数的60%，严重危害人民健康及影响计划生育。其主要的特点为：易感人群主要是为儿童，以爆发型病死率最高，可达40%-60%。
流脑的预防，主要采取以疫苗接种为主的预防措施。1980年，我国正式生产A群NM多糖疫苗，推广应用取得了很好的效果。但多糖疫苗对2岁以下的婴幼儿预防效果较差，结合疫苗的研制成功解决了疫苗在婴幼儿中无效的问题。结合疫苗比以往的疫苗具有更强的免疫原性和更好的免疫效果。
制备流脑A群结合疫苗首先要获得由流脑A群荚膜多糖生成的多糖-SPH衍生物，而目前传统的生产方式生产流脑A群荚膜多糖需要先将流脑A群菌种经过培养、发酵后得到上清液，再将上清液进行纯化处理得到，而采用该传统方式生产的流脑A群发酵液中含有较多的核酸及蛋白等杂质成分，一方面影响了多糖-SPH衍生物的质量，另一方面增加了后续纯化的难度。而且上述纯化处理中通常需要用到较多的苯酚，而苯酚作为一种有毒物质，大量使用会造成环境的污染且影响多糖的质量。
发明内容
本发明提供一种能够解决上述技术问题的利于多糖-SPH衍生物质量控制的工艺。
本发明解决上述问题所采用的技术方案是：
利于多糖-SPH衍生物质量控制的工艺，包括流脑A群菌种的培养、发酵、纯化，以及流脑A群荚膜多糖的活化和衍生；其中，流脑A群菌种的培养、发酵、纯化具体为：
1）开启菌种及传代：
开启流脑A群菌种传代至氯化血红素流脑半综合培养基上，放入二氧化碳细胞培养箱中，36.5℃，8%CO2培养，二代采用半综合固体培养基培养，三代采用流脑半综合液体培养基在恒温振荡摇床中培养；
2）接种到种子罐培养：
将上述步骤1）培养得到的流脑A群种子接种到种子罐，恒温搅拌通气培养，培养至第五代；
3）发酵罐发酵：
将上述步骤2）培养得到的流脑A群五代种子接种入发酵罐后，恒温36.5℃，深层通气240rpm搅拌培养，中途补加葡萄糖溶液为流脑A群细菌生产荚膜多糖提供原料，培养流脑A群细菌至对数生长期后期或静止期前期，此时菌浓度达到100-200亿/mL，甲醛杀菌后去除菌体，收集发酵液上清液；
4）一次纯化：
加入十六烷基三甲基溴化铵至终浓度1.0g/L，充分搅拌后静置过夜，离心收集多糖，沉淀的多糖用氯化钙溶液搅拌3小时使多糖和十六烷基三甲基溴化铵解离，离心收集上清，上清加入乙醇至终浓度为25%（v/v），2-8℃静置过夜，离心收集上清，上清加入乙醇至终浓度为75-80%（v/v），充分振摇使多糖沉淀，静置18小时以上，离心收集沉淀，然后用无水乙醇和丙酮各洗三次，得到粗糖；
5）二次纯化：
将粗糖溶解于10%饱和中性醋酸钠溶液中，然后按粗糖与苯酚之比为4:3（v/v）的比例加入苯酚溶液，振荡混匀后离心收集上清液，抽提1-3次至上清液澄清，收集上清液，用超滤膜包超滤去除残余的苯酚及核酸，超滤后的多糖溶液中加入4mol/L NaCl溶液，至NaCl终浓度为0.3mol/L，然后加入95%乙醇至乙醇终浓度为75%（v/v），充分混匀后2-8℃静置过夜，沉淀多糖，离心收集沉淀，然后依次用无水乙醇、丙酮各洗涤两次。
利于多糖-SPH衍生物质量控制的工艺，包括以下步骤：
1）开启菌种及传代：
开启流脑A群菌种传代至氯化血红素流脑半综合培养基上，放入二氧化碳细胞培养箱中，36.5℃，8%CO2培养，二代采用半综合固体培养基培养，三代采用流脑半综合液体培养基在恒温振荡摇床中培养；
2）接种到种子罐培养：
将上述步骤1）培养得到的流脑A群种子接种到种子罐，恒温搅拌通气培养，培养至第五代；
3）发酵罐发酵：
将上述步骤2）培养得到的流脑A群五代种子接种入发酵罐后，恒温36.5℃，深层通气240rpm搅拌培养，中途补加葡萄糖溶液为流脑A群细菌生产荚膜多糖提供原料，培养流脑A群细菌至对数生长期后期或静止期前期，此时菌浓度达到100-200亿/mL，甲醛杀菌后去除菌体，收集发酵液上清液；
4）一次纯化：
加入十六烷基三甲基溴化铵至终浓度1.0g/L，充分搅拌后静置过夜，离心收集多糖，沉淀的多糖用氯化钙溶液搅拌3小时使多糖和十六烷基三甲基溴化铵解离，离心收集上清，上清加入乙醇至终浓度为25%（v/v），2-8℃静置过夜，离心收集上清，上清加入乙醇至终浓度为75-80%（v/v），充分振摇使多糖沉淀，静置18小时以上，离心收集沉淀，然后用无水乙醇和丙酮各洗三次，得到粗糖；
5）二次纯化：
将粗糖溶解于10%饱和中性醋酸钠溶液中，然后按粗糖与苯酚之比为4:3（v/v）的比例加入苯酚溶液，振荡混匀后离心收集上清液，抽提1-3次至上清液澄清，收集上清液，用超滤膜包超滤去除残余的苯酚及核酸，超滤后的多糖溶液中加入4mol/L NaCl溶液，至NaCl终浓度为0.3mol/L，然后加入95%乙醇至乙醇终浓度为75%（v/v），充分混匀后2-8℃静置过夜，沉淀多糖，离心收集沉淀，然后依次用无水乙醇、丙酮各洗涤两次；
6）流脑A群荚膜多糖的活化和衍生：
称取上述步骤5）二次纯化后得到的多糖400mg，溶解于注射用水中，配制成浓度为8mg/mL的溶液，恒温至20℃，调节pH至10.5，加入与多糖等质量的溴化氰，维持pH10.5活化20分钟；调节pH至8.5，加入与多糖溶液等体积、等浓度的癸二酸二酰肼溶液（SPH），维持pH8.5反应15分钟，反应物经反复稀释超滤浓缩，去掉残余溴化氰，得到多糖-SPH衍生物。
综上，本发明的有益效果是：
本申请通过对多糖-SPH衍生物的制备工艺进行优化，一方面控制流脑A群发酵液中的核酸及蛋白等杂质成分含量较低，另一方面降低苯酚的用量，相较于目前采用的方法中一般对粗糖进行二次提纯时粗糖与苯酚之比为1:1（v/v），而本申请中将苯酚的用量减少至原来用量的75%，大大减少苯酚的用量，利于环保。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步的详细说明，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
利于多糖-SPH衍生物质量控制的工艺，包括以下步骤：
1）开启菌种及传代：
开启流脑A群菌种传代至氯化血红素流脑半综合培养基上，放入二氧化碳细胞培养箱中，36.5℃，8%CO2培养，二代采用半综合固体培养基培养，三代采用流脑半综合液体培养基在恒温振荡摇床中培养；
2）接种到种子罐培养：
将上述步骤1）培养得到的流脑A群种子接种到种子罐，恒温搅拌通气培养，培养至第五代；
3）发酵罐发酵：
将上述步骤2）培养得到的流脑A群五代种子接种入发酵罐后，恒温36.5℃，深层通气240rpm搅拌培养，中途补加葡萄糖溶液为流脑A群细菌生产荚膜多糖提供原料，培养流脑A群细菌至对数生长期后期或静止期前期，此时菌浓度达到100-200亿/mL，甲醛杀菌后去除菌体，收集发酵液上清液；
4）一次纯化：
加入十六烷基三甲基溴化铵至终浓度1.0g/L，充分搅拌后静置过夜，离心收集多糖，沉淀的多糖用氯化钙溶液搅拌3小时使多糖和十六烷基三甲基溴化铵解离，离心收集上清，上清加入乙醇至终浓度为25%（v/v），2-8℃静置过夜，离心收集上清，上清加入乙醇至终浓度为75-80%（v/v），充分振摇使多糖沉淀，静置18小时以上，离心收集沉淀，然后用无水乙醇和丙酮各洗三次，得到粗糖；
5）二次纯化：
将粗糖溶解于10%饱和中性醋酸钠溶液中，然后按粗糖与苯酚之比为4:3（v/v）的比例加入苯酚溶液，振荡混匀后离心收集上清液，抽提1-3次至上清液澄清，收集上清液，用超滤膜包超滤去除残余的苯酚及核酸，超滤后的多糖溶液中加入4mol/L NaCl溶液，至NaCl终浓度为0.3mol/L，然后加入95%乙醇至乙醇终浓度为75%（v/v），充分混匀后2-8℃静置过夜，沉淀多糖，离心收集沉淀，然后依次用无水乙醇、丙酮各洗涤两次；取样按照中国药典记载的方法检测蛋白含量、核酸含量、O-乙酰基含量、磷含量、内毒素含量，并记录于下表1中。
6）流脑A群荚膜多糖的活化和衍生：
称取上述步骤5）二次纯化后得到的多糖400mg，溶解于注射用水中，配制成浓度为8mg/mL的溶液，恒温至20℃，调节pH至10.5，加入与多糖等质量的溴化氰，维持pH10.5活化20分钟；调节pH至8.5，加入与多糖溶液等体积、等浓度的癸二酸二酰肼溶液（SPH），维持pH8.5反应15分钟，反应物经反复稀释超滤浓缩，去掉残余溴化氰，得到多糖-SPH衍生物。取样检测产品衍生率并记录于下表1中。
表1
| 批次 | 蛋白含量（mg/g） | 核酸含量（mg/g） | 衍生率（%） | O-乙酰基含量mmol/g | 磷含量mg/g | 内毒素EU/μg |
| 标准要求 | <10 | <10 | —— | ≥2 | ≥80 | <50 |
| 实施例1 | <2 | 2 | 1.21% | 2.5 | 84 | <3.125 |
从上表1中可以看出，本申请制得的多糖内杂质含量较低，质量较好，且制备工艺中减少苯酚用量，减少至普通工艺中的苯酚用量的75%。最终产品的衍生率较高。
如上所述，可较好的实现本发明。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，依据本发明的技术实质，在本发明的精神和原则之内，对以上实施例所作的任何简单的修改、等同替换与改进等，均仍属于本发明技术方案的保护范围之内。
Claims (1)
1.利于多糖-SPH衍生物质量控制的工艺，其特征在于，包括以下步骤：
1）开启菌种及传代：
开启流脑A群菌种传代至氯化血红素流脑半综合培养基上，放入二氧化碳细胞培养箱中，36.5℃，8%CO2培养，二代采用半综合固体培养基培养，三代采用流脑半综合液体培养基在恒温振荡摇床中培养；
2）接种到种子罐培养：
将上述步骤1）培养得到的流脑A群种子接种到种子罐，恒温搅拌通气培养，培养至第五代；
3）发酵罐发酵：
将上述步骤2）培养得到的流脑A群五代种子接种入发酵罐后，恒温36.5℃，深层通气240rpm搅拌培养，中途补加葡萄糖溶液为流脑A群细菌生产荚膜多糖提供原料，培养流脑A群细菌至对数生长期后期或静止期前期，此时菌浓度达到100-200亿/mL，甲醛杀菌后去除菌体，收集发酵液上清液；
4）一次纯化：
加入十六烷基三甲基溴化铵至终浓度1.0g/L，充分搅拌后静置过夜，离心收集多糖，沉淀的多糖用氯化钙溶液搅拌3小时使多糖和十六烷基三甲基溴化铵解离，离心收集上清，上清加入乙醇至终浓度为25%（v/v），2-8℃静置过夜，离心收集上清，上清加入乙醇至终浓度为75-80%（v/v），充分振摇使多糖沉淀，静置18小时以上，离心收集沉淀，然后用无水乙醇和丙酮各洗三次，得到粗糖；
5）二次纯化：
将粗糖溶解于10%饱和中性醋酸钠溶液中，然后按粗糖与苯酚之比为4:3（v/v）的比例加入苯酚溶液，振荡混匀后离心收集上清液，抽提1-3次至上清液澄清，收集上清液，用超滤膜包超滤去除残余的苯酚及核酸，超滤后的多糖溶液中加入4mol/L NaCl溶液，至NaCl终浓度为0.3mol/L，然后加入95%乙醇至乙醇终浓度为75%（v/v），充分混匀后2-8℃静置过夜，沉淀多糖，离心收集沉淀，然后依次用无水乙醇、丙酮各洗涤两次；
6）流脑A群荚膜多糖的活化和衍生：
称取上述步骤5）二次纯化后得到的多糖400mg，溶解于注射用水中，配制成浓度为8mg/mL的溶液，恒温至20℃，调节pH至10.5，加入与多糖等质量的溴化氰，维持pH10.5活化20分钟；调节pH至8.5，加入与多糖溶液等体积、等浓度的SPH，维持pH8.5反应15分钟，反应物经反复稀释超滤浓缩，去掉残余溴化氰，得到多糖-SPH衍生物。
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|---|---|---|---|---|
| CN107058421A (zh) * | 2017-05-15 | 2017-08-18 | 中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所 | 一种336型金黄色葡萄球菌中荚膜多糖的提取纯化方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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