CN101972475A

CN101972475A - 一种细菌多糖-蛋白结合疫苗及其制备方法

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Publication number: CN101972475A
Application number: CN2010101447230A
Authority: CN
Inventors: 李建平
Original assignee: Individual
Current assignee: Puda Biotechnology Taizhou Co ltd
Priority date: 2010-04-12
Filing date: 2010-04-12
Publication date: 2011-02-16
Anticipated expiration: 2030-04-12
Also published as: CN101972475B

Abstract

本发明涉及一种具有免疫原性的细菌多糖-蛋白结合疫苗，具体讲，涉及一种采用重组轮状病毒蛋白与细菌多糖以共价键连接的结合疫苗，本发明还涉及一种编码本发明所述重组轮状病毒蛋白的核苷酸序列、重组表达系统、重组表达系统所表达的蛋白，以及这种结合疫苗的制备方法。本发明还涉及一种肺炎球菌多糖-重组轮状病毒蛋白结合疫苗。其中，细菌多糖以共价键与重组轮状病毒表面蛋白相连接，所述的重组轮状病毒蛋白选自P基因型轮状病毒蛋白的部分氨基酸序列或全序列、G基因型轮状病毒蛋白的部分氨基酸序列或全序列。

Description

一种细菌多糖-蛋白结合疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种具有免疫原性的细菌多糖-蛋白结合疫苗，具体讲，涉及一种采用轮状病毒蛋白与细菌多糖共价键连接的结合疫苗。

背景技术

通过接种疫苗来预防疾病是人类在一个多世纪的临床实践中，证明是行之有效的手段。经过多年的努力，医学界已经开发出各种不同的疫苗用以预防，诸如细菌、病毒和真菌等，感染造成的各种疾病，极大地提高了人类的健康水平。生物技术的不断发展，促进了疫苗品种的多样化。今天，用以预防病毒导致的传染病有灭活病毒技术开发出来的疫苗，如乙脑疫苗、脊髓灰质炎疫苗、流感疫苗等；用减毒病毒技术开发出来的减毒活疫苗，如轮状病毒疫苗、口服脊髓灰质炎病毒疫苗、麻疹病毒疫苗、腮腺炎病毒疫苗、风疹病毒疫苗和水痘疫苗等。预防细菌性传染病的有用蛋白和多糖等生物大分子纯化技术开发出来的细菌类疫苗，如破伤风类毒素、白喉类毒素、百日咳类毒素及其亚细胞组分、流行性脑膜炎球菌多糖和23价肺炎球菌多糖等。用基因重组蛋白技术开发出来的疫苗，如乙肝表面抗原(预防乙型肝炎)、人类乳头状类病毒颗粒病毒(预防子宫颈癌)等。用半化学结合技术开发出来的预防脑膜炎和肺炎的细菌疫苗，如流行性嗜血杆菌b型多糖-蛋白结合疫苗、7价或10价肺炎球菌多糖-蛋白结合疫苗以及4价脑膜炎球菌多糖-蛋白结合疫苗。由此可见，医学生物技术的发展，是疫苗产品不断发展的原动力，通过对生物技术的不断改进，能够开发出更多的新型疫苗产品来应付不同的传染病对人类健康的挑战。

细菌感染仍然是儿童的主要杀手，尤其是发展中国家，每年有数百万的儿童因患传染病而死亡，其中最常见的病原体有肺炎球菌、流行性嗜血杆菌b型、奈瑟氏脑膜炎球菌、沙门氏伤寒杆菌、金黄色葡萄球菌和引起腹泻的痢疾杆菌、沙门氏菌和霍乱弧菌等。

从化学结构上来看，以上每一个病原体都拥有一个细胞表面荚膜多糖(Capsular polysaccharide，CPS)或脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)壳，或者两者兼有，其功能是帮助病原体感染宿主。荚膜多糖能够屏蔽细菌细胞表面功能成分免于被宿主免疫系统识别，防止补体系统被细菌表面蛋白激活和免疫细胞吞噬，如果细菌被吞噬，荚膜多糖能够防止细菌被杀灭。大多数病原菌中，不同的菌株表达不同结构的荚膜多糖和脂多糖，产生多种不同的血清型菌株。流行性嗜血杆菌绝大多数是由b型一种血清型引起，肺炎球菌所致的肺炎和脑膜炎是由已知的90种血清型中的很大一部分菌株感染所导致的，脑膜炎球菌造成的脑膜炎则主要是A、B和C群细菌感染引起，尽管W135和Y型也开始出现。由此可见，大多数细菌多糖类疫苗必需含有多种不同种类的细菌多糖以提高致病菌株覆盖率，优化和选择包含何种细菌或者血清型多糖在疫苗中是一个非常复杂的流行病学问题。一旦明确何种多糖抗体具有保护作用，则可用这种多糖作为免疫原来生产疫苗。临床使用证明，荚膜多糖制作的疫苗明确有效，并在多个国家广泛使用。但是这类疫苗有几个缺陷，第一，具有重复结构的多糖是T细胞独立型2类的免疫原，没有T细胞的参与，它们是无法诱导免疫记忆效应，刺激机体产生的抗体主要是IgM和IgG2，不能够有效地激活补体系统；第二，更重要的是这种疫苗不能够诱导年龄小于2岁的婴幼儿产生免疫应答来预防疾病，而这一人群正是免疫系统发育不完善，容易患传染病的高危人群。

荚膜多糖和脂多糖的O-特异性多糖具有严格的重复性化学结构，这个化学结构可由一个单糖单位或含有最多达7-8单糖残基形成的寡聚糖组成。这种重复性单位可为线性或含有非碳水化合物取代基团的分叉结构，这些非碳水化合物取代基团可为O-乙酰基(O-acetyl)、甘油磷酸(glycerol phosphate)或丙酮酸(pyruvate)。细菌多糖可能含有不常见的单糖残基，如二氨基(diamino-)，脱氧和分叉链糖等。总的来说，荚膜多糖倾向于带负电，而O-特异性寡聚糖为中性。试验表明，相对少量高亲和力的直接针对多糖主链结构的抗体在免疫学上最为重要。

半化学结合技术(也称结合技术)开发疫苗的方法是从20世纪80年代出现的开发细菌疫苗的技术。John Robbins通过将流行性嗜血杆菌b型(Haemophilusinfluenzae type b，Hib)荚膜多糖(Polyribosylribitolphosphate，PRP)，用共价键的形式连接到蛋白载体(破伤风类毒素)合成出了流行性嗜血杆菌b型多糖PRP-破伤风类毒素结合疫苗(PRP-TT)，在免疫动物后，能够产生杀菌的保护性抗体[1]，从而开创了新一代细菌疫苗开发技术。特别有意义的是，对于年龄小于2岁的婴幼儿来说，由于免疫系统发育不完善，多糖对于婴幼儿是属于一种非T细胞依赖性抗原，不能够刺激机体如成人一样产生长效的针对于该多糖来源的细菌特异性保护IgG抗体。因此，多糖对于小于2岁的婴幼儿是一种半抗原，不能够作为疫苗来接种小于2岁的儿童。当将细菌多糖以共价键的形式连接到蛋白载体，如破伤风类毒素(Tetanus Toxoid，TT)，由于蛋白质是一种T细胞依赖性抗原，能够将共价键连接的多糖转变成T细胞依赖性抗原，从而刺激机体产生针对于该多糖的特异性IgG抗体，保护机体不受细菌的感染。

流行性嗜血杆菌b型多糖-破伤风类毒素(PRP-TT)结合疫苗开发的成功，开创了一个开发细菌疫苗的技术平台，即将细菌多糖，如荚膜多糖，O-特异性多糖(O-specific polysaccharide)，或寡聚糖(Oligosaccharide)，以共价键连接到蛋白载体上而制成的结合疫苗。基于这一概念的成功，医学生物研究界通过采用同一种化学合成方法开发出了不同细菌的结合疫苗；同样也用不同的合成技术开发出同一种细菌的结合疫苗。1980年，John Robbins用溴化氰来随机活化Hib荚膜多糖，然后，将己二酰二肼(Adipic Dihydrazide，ADH)作为连接物(linker)加到活化的多糖上，最后以EDC法[1]将衍化后的多糖共价键地连接到载体蛋白破伤风类毒素上，合成出了流行性嗜血杆菌b型多糖-破伤风类毒素结合疫苗(PRP-TT)。由于在每个多糖链上有多个活化点，蛋白载体上同样的有多个连接点，形成的结合物是一种多糖和蛋白交叉连接的大分子，平均分子量约为5×106Da。1980年，Harold Jennings在美国专利4356170里，陈述了用牛血清蛋白(Bovine serum albumin，BSA)为载体，将脑膜炎球菌的A，C群多糖通过还原胺法共价键地连接到BSA上，合成出了流行性脑膜炎多糖-BAS结合疫苗。1987年和1990年，Porter Anderson分别在美国专利4673574和4902506里，描述了用变异无毒株白喉毒素197(Cross reaction material sub 197，CRM₁₉₇)作为载体蛋白，以还原胺法合成了流行性嗜血杆菌b型寡聚糖-变异无毒株白喉毒素197(HbOC-CRM₁₉₇)结合疫苗。具体的方法是用高碘酸钠氧化Hib荚膜多糖，产生在两末端为醛基的寡聚糖，通过还原剂氰基硼氢化钠(sodiumcyanoborohydride)，将寡聚糖共价键连接到蛋白载体上。形成分子量约为90kDa的脂多糖结合物，制成了含有30％的多糖和每一个蛋白上带有6个糖分子的结合疫苗。随后，美国默克(Merck，Sharpe and Dohme)以巯基化学方法，用纯化的奈瑟氏脑膜炎B群菌株(Neisseria meningitidis groups B)细菌表面蛋白复合物(outer membrane protein complex，OMP)作为蛋白载体，合成出流行性嗜血杆菌b型多糖-细菌表面蛋白复合物(PRP-OMP)结合疫苗。运用这些合成技术，先后开发出了三种现已广泛用于临床接种的流行性嗜血杆菌b型结合疫苗，即PRP-TT、PRP-HbOC和PRP-OMP。

Hib结合疫苗的成功为开发其它细菌结合疫苗提供了理论和技术基础，随后的开发进入了技术更为复杂的多价结合疫苗阶段，其原因是某些传染病，如肺炎球菌导致的肺炎、流行性脑膜炎球菌所致的脑膜炎等，可由多种不同的血清型或菌株感染所致，并且各血清型或菌株间由于细菌表面多糖的化学结构的不同，其抗体没有交叉免疫反应，因此，接种单一的血清型或菌株结合疫苗，无法保护被接种人体免于其它血清型或菌株的感染。由于这个原因，合成和配制多价结合疫苗来扩大疫苗的保护覆盖率成为开发的主要目标。通过多年的努力，用结合技术开发出了多种覆盖率广的多价结合疫苗。2000年，美国惠氏(Wyeth)公司成功开发并上市了7价肺炎球菌多糖-CRM₁₉₇结合疫苗，是由7个不同的肺炎球菌血清型多糖分别共价键连接到CRM₁₉₇蛋白载体上，混合配制而成的一种多价疫苗，用以预防小儿肺炎，该7个血清型肺炎球菌涵盖了北美和欧洲90％以上流行的肺炎球菌不同血清型菌株。2006年，Sanofi Pasteur开发出了4价脑膜炎球菌多糖-破伤风类毒素结合疫苗，用于预防4种流行性脑膜炎球菌群，即A，C，Y，W135，所致的脑膜炎。2009年，GlaxoSmithKline(GSK)也开发出了一种10价肺炎球菌多糖-蛋白质结合疫苗，用以预防10种肺炎球菌血清型所导致的肺炎。该疫苗运用了三种蛋白质作为蛋白载体，其中最主要的载体是蛋白-D(Protein D，PD)，有8个血清型多糖是用这个蛋白作为载体。蛋白-D是用非可分型的流行性嗜血杆菌的基因重组方法表达出来的无酯化表面蛋白，能够刺激机体产生保护性抗体，有潜在的预防非可分型的流行性嗜血杆菌感染所致的急性中耳炎，其他还有破伤风类毒素和白喉内毒素作为作为载体，被分别用作血清型18C和19F的结合疫苗的蛋白载体。

从以上结合疫苗产品的设计，可以看出，结合疫苗的开发从单价疫苗过渡到技术上更为复杂的多价疫苗，提高了细菌疫苗的覆盖率。但是，这些结合疫苗有一个共同点缺点，就是蛋白载体没有赋予免疫原性的保护功能，也就是说，尽管结合疫苗载体能够刺激机体产生抗体，但是，疫苗的设计者并没有利用其抗体具有的保护性来预防传染病，同时，也没有确定其产生的抗体是否达到保护性滴度水平。破伤风类毒素、白喉类毒素和白喉无毒变异株毒素等传统蛋白被选择作为载体的主要原因，并不是因为它们的产生的抗体具有保护性，而是从其安全性和能够增强结合物中多糖的免疫原性来考虑。显而易见，破伤风类毒素和白喉类毒素已经是百白破三联疫苗的二个组分，被常规接种；所以，结合疫苗中的破伤风类毒素和白喉类毒素载体是否能够刺激机体产生达到保护性抗体滴度并不重要，相反的，结合疫苗中的多糖部分的抗体滴度才是疫苗设计者需要关注的主要问题。另外，一些正在开发中的结合疫苗产品所用的载体，如E.coli所表达的基因缺失突变脱毒的重组铜绿假单胞菌外毒素A(rEPA)，E.coli所表达的基因缺失突变脱毒的重组霍乱毒素等也都是基于相同的考量。

GlaxoSmithKline在开发10价肺炎球菌多糖结合疫苗的设计中，选择了蛋白-D为载体，其原因是基于二个方面的考虑。其一，是为了避免重复使用已经作为百白破疫苗组分的破伤风类毒素和白喉类毒素作为载体。临床试验表明，当多价肺炎结合疫苗与其他含有与蛋白载体相同组分的单价疫苗或多联疫苗同时接种时，比如Hib-TT、百白破-Hib多糖结合疫苗-IPV(灭活脊髓灰质炎疫苗)-乙肝疫苗(简称6联疫苗)，多价肺炎球菌结合疫苗中的大部分血清型多糖的免疫原性会受到抑制，特别是对用破伤风类毒素作为载体的血清型多糖免疫原性影响尤其明显。原因是多价肺炎球菌结合疫苗中作为载体的破伤风类毒素和白喉类毒素总浓度过高，在同时接种含有百白破组分的联合疫苗时，如6联疫苗，会造成所谓载体受体竞争性抑制效应，降低了结合疫苗多糖部分的免疫原性。SanofiPasteur的11价肺炎球菌多糖-TT和DT混合载体蛋白结合疫苗和Merck的7价肺炎球菌多糖-OMP结合疫苗(PCV-OMP)，都是临床试验结果不佳而导致产品开发失败的例子，原因就在与此。其二，是赋予蛋白载体以真正的保护性免疫原性功能。临床试验证明蛋白-D能够刺激机体产生保护性抗体，有潜在的预防非可分型流行性嗜血杆菌感染造成的急性中耳炎。GlaxoSmithKline的10价肺炎球菌多糖结合疫苗选择蛋白-D作为载体，使得蛋白载体产生的抗体具有临床意义的保护作用，是结合疫苗技术开发过程上的一大进步。不过，非可分型的流行性嗜血杆菌实际临床意义受到该类细菌感染率低下的限制，其感染导致的急性中耳炎发病率较低。

在世界范围内，轮状病毒(Rotavirus)是导致儿童严重性腹泻的主要病原体，在发达国家，因急性腹泻住院的儿童中，轮状病毒的检出率占35～52％。在美国，估计每年有3百万儿童患轮状病毒腹泻，致使82000人住院治疗，150人死亡。在发展中国家，轮状病毒也是导致2岁以下婴幼儿严重胃肠炎最常见的病原体，估计每年有超过1.25亿5岁以下的儿童患轮状病毒性腹泻，其中一千八百万儿童患中度腹泻，87万死亡。在中国，儿童出生率约一千七百万，估计每年大约有35万儿童由于患轮状病毒腹泻导致死亡，排世界第二位。由于该病毒的感染对2岁以下婴幼儿腹泻的发病率和致死率的增加有显著作用，开发预防轮状病毒感染，有效且安全的疫苗是当务之急。

轮状病毒属呼肠孤病毒科(Reoviridae genus)，是导致人类和众多动物腹泻的病原体。全病毒直径70nm，具有特殊的三壳结构，最里层的核壳结构为核壳蛋白，包裹有病毒基因。病毒的基因由双股RNA的11个分段式片段组成，为6个结构蛋白和5个非结构蛋白编码。核壳蛋白是由VP1，VP2和VP3三个病毒蛋白构成；中间壳蛋白为VP6，外壳蛋白是由VP4和VP7组成。由于轮状病毒的基因是双股的RNA，多片段结构，这种结构的基因可以进行基因间的某种程度的重新组合，即轮状病毒基因的重配(reassortment)。当二个或者多个病毒同时感染一个宿主细胞后，在新病毒颗粒的包装阶段，各个病毒的基因片段将在细胞内重新组合，造成重配基因发生。轮状病毒这种重配基因的能力导致了人体对其免疫反应的多样性，也增加了制作特异性轮状病毒疫苗的难度。

轮状病毒根据病毒抗原性的不同可分成不同的型，亚型和血清型。现已发现有7个血清型(A型～G型)，大多数人类病原体属于A、B和C型。流行病学调查发现致使人类和动物患病的轮状病毒中以A型最常见，是疫苗开发的主要目标。A型轮状病毒根据其VP6抗原特性的不同，进一步分类为亚型，绝大部分病毒株属于亚型I或II中的一种。不同的轮状病毒表面壳蛋白VP7和VP4的中和抗原簇有所不同，能够独立地诱导各自的中和性抗体，病毒的血清型可由VP4和VP7抗原的特异性决定。A型轮状病毒根据VP7和VP4的不同可进一步分类成G血清型和P血清型。由于轮状病毒基因是由11个片段组成，VP7和VP4的编码基因能够独立分离组合，产生了一种二进制方式进行的基因重配。VP7是一种糖蛋白(glycoprotein)，因其抗原特性分为15种不同的G血清型，与其特异性的核酸序列，即基因型(genotype)相对应；也就是说，每一G血清型都有其特异的基因型，因此，通常G血清型和G基因型可通用。全球鉴定出的人类致病轮状病毒株中，超过90％的是G1，G2，G3，G4，和G9株，共有10个血清型从人体上分离出来(见表1)。VP4是一种能够被胰蛋白酶切断成两个不同的病毒蛋白，即VP8和VP5病毒蛋白，由其的抗原性的不同而决定的血清型为P血清型，有些P血清型可进一步分为2个亚血清型。由于缺乏区别不同VP4血清型分型的血清或单克隆抗体，阻碍了VP4的血清型分型。RT-PCR的应用才使得VP4的基因型分型成为可能，并运用于样品的流行病学调查。因此，VP4基本上是根据基因序列来进行分类，目前共发现14个P血清型和至少26个P基因型(标于括号中)。P血清型和P基因型可能不对应，需要同时标出，例如，轮状病毒Wa毒株被标示为P1A[8]G1病毒。人类致病的毒株中，G1，G3，G4和G9的P和G血清型组合通常是P1A[8]，而G2通常是P1B[4]。由此可见，在世界范围内流行的轮状病毒享有相同的交叉中和的抗原簇(epitopes)P1血清型，至少有7个VP4血清型在人类轮状病毒中被发现。在流行病学上有意义的人类毒株的G血清型1，3，和4是属于P血清型的1A亚血清型，和G血清型2是P血清型的1B亚血清型。

表1：感染人类的A型轮状病毒VP4的主要血清型和基因型分类

由于自然轮状病毒感染能够很好地诱导免疫保护，至少对严重轮状病毒的感染，因此，大多数开发疫苗的努力放在减毒活疫苗上。最初的研究集中于使用动物轮状病毒株，通过称之为Jennerian法来进行，原因是自然减毒的动物毒株在人体是安全的，而且主要产生的是混合型免疫保护。

在发现轮状病毒是导致儿童严重性腹泻的病原体10年后，于1983年，开始了用猪轮状病毒株RIT4237(G6P[1]型)，制成的第一个轮状病毒减毒活疫苗进行了临床试验，在芬兰试验的结果显示，该疫苗是安全和有效的，通过混合型人类轮状病毒(heterotypic human rotaviruses)的作用，预防严重轮状病毒腹泻的保护率达80％。但是，在随后的其他国家进行的临床试验效果令人失望，显示低或者没有保护作用，该试验以失败告终。

在1987年，猴轮状病毒RRV毒株被用以开发减活疫苗，是第一批开发的轮状病毒疫苗中的另一个。临床试验表明，尽管该疫苗能够诱导机体产生保护性抗体，但结果不稳定，究其原因在于，RRV毒株的G血清型是G3P[3]，当人体感染的轮状病毒是同型的G血清型时，即G3，疫苗的效果显著；如果是不同型的G血清型感染时，则效果不佳。随后，RRV株通过基因重配的方法将人类毒株中的VP7基因引入到该毒株中，使得人类轮状病毒中常见的其他三种G血清型G1，G2和G4也能够在RRV重配毒株上表达，这导致了4价Rotashield疫苗的开发成功。该疫苗于1998年获得FDA批准上市销售，但是由于大规模接种后发现了少数，但是数量明显升高的肠套叠副作用病例的发生，在1999年而被生产公司下市。

在1988年，开始用另一个轮状病毒毒株，即WC3猪毒株(G6P[5]型)，进行临床试验时，开始结果证明有效，但是在随后的试验中显示没有显著的保护性，该疫苗也停止了继续试验。到1990年，为了使得WC3毒株的抗原结构更接近于人类轮状病毒，通过基因重配(gene reassortment)的方法，将为VP4和VP7蛋白编码的基因从人类轮状病毒引入到WC3重配毒株上，这种方法称之为改进的Jennerian法。该毒株和方法就是被Merck用以开发RotaTeq的5价(pentavalent)疫苗的开发方法。

2006年，由Merck生产5价的WC3-基因重配疫苗RotaTeq也被批准上市，该疫苗含有VP7和VP4这两个人类轮状病毒蛋白取代基因，即G1，G2，G3，G4中的相应的VP7蛋白基因，和P[8]的相应的VP4。临床试验表明，该疫苗没有肠套叠副作用，对由于G1-G4轮状病毒所致的胃肠炎的保护率为74％，对严重胃肠炎的保护率达98％，对住院和急症访问的保护率为94.5％。

同年，GSK生产的人类轮状病毒减毒活疫苗Rotarix也获得上市批准，这个疫苗是基于减毒的人类毒株89-12，血清型为G1P[8]株，是世界范围内最常见血清型。该病毒是从一个患轮状病毒胃肠炎的患者临床样品中分离出来，并在组织细胞多次传代变异减毒后获得。临床试验表明，在注射两个剂量后，对所有轮状病毒感染的保护率达87％以上，对严重的胃肠炎的保护率达96％，对需要住院胃肠炎病例的保护率达100％。进一步试验表明，该疫苗的范围保护不仅仅包括由G1P[8]株导致的胃肠炎，而且包括了与VP4有关的G3P[8]，G4[8]和G9P[8]株导致的胃肠炎。对G3，G4和G9轮状病毒感染保护的有效性与G1的相同，超过了95％，而对G2株的有效性是75％，对所有轮状病毒致胃肠炎住院的保护率为75％。

统计数据表明，G1株在世界范围内是最常检测到的毒株，在亚洲、北美和欧洲，G1-G4株占总感染轮状病毒的97.5％。在南美洲、非洲、澳大利亚占83.5％-90.4％，同时，在这些地区G5、G8和G9毒株开始变得重要起来。从P血清型来看，P1A[8]株最常见，接下来的是P1B[4]株。这一结果是可以预见的，因为VP7血清型G1是P1A[8]，为最常检测到的VP7血清型；其他两个流行病学重要的VP7血清型，G3和G4，也具有相同的VP4血清型。另一个主要血清型G2的VP4有P1B[4]的特征。尽管G和P血清型或基因型可有多种不同的组合，但是，4种P-G的组合，即P[8]G1，P[4]G2，P[8]G3，和P[8]G4组成了88.5％的常见的致病性毒株。

由此可见，如果以G血清型的VP7蛋白来配置疫苗，需要包含多种不同的G血清型毒株来提高疫苗的覆盖率，即G1、G2、G3、G4、G9、G8和G5，7价的轮状病毒减毒活疫苗也是目前开发新一代疫苗的努力方向。如果从另一个策略来开发轮状病毒疫苗，以P血清型决定蛋白VP4的不同来配制新一代的疫苗，则可大大减少疫苗中包含的毒株品种来达到相同发覆盖率。从以上的分析可见，如果以P[8]和P[4]两个P血清型毒株来配制疫苗，免疫的效果将和7价的G血清型相当。从临床上使用的Rotarix和Rotateq效果来看，几乎没有区别，而且，现有的统计数据上看，Rotarix似乎比Rotateq更有效。从分析这两个疫苗所包含的毒株血清型决定蛋白的组成来看，Rotarix仅含有G1这一种VP7病毒蛋白；尽管Rotateq含有G1、G2、G3、和G4的四种VP7病毒蛋白，免疫效果并没有增强；而从两者含有的P血清型决定蛋白VP4的数量来看，Rotarix含有P[8]一种，而Rotateq含有P[8](其中一个毒株)和P[5](WC-3原始毒株为G6P[5])两种；但是Rotarix中的重要抗原成分P[8]的含量将高于Rotateq中的含量。由此可见，从P血清型的角度来评估，含P[8]的VP4毒株轮状病毒疫苗有着重大的意义。如果新一代疫苗中包含有P血清型的P[8]、P[4]和P[6]三种VP4抗原成分，即可涵盖全球大部分地区的流行毒株。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题为提出一种细菌多糖-蛋白结合疫苗。

本发明要解决的第二个技术问题为提出一种编码本发明所述重组轮状病毒蛋白的核苷酸序列。

本发明要解决的第三个技术问题为提出一种本发明所述重组轮状病毒蛋白表达系统。

本发明要解决的第四个技术问题为提出本发明重组蛋白表达系统所表达的蛋白，

本发明要解决的第五个技术问题为提出这种结合疫苗的制备方法。

本发明要解决的第六个技术问题为提出这种结合疫苗的制剂。

本发明要解决的第七个技术问题为提出这种结合疫苗的一种多价肺炎球菌多糖-重组轮状病毒蛋白结合疫苗。

为了完成本发明之目的，采用的技术方案为：

本发明涉及一种具有免疫原性的细菌多糖-蛋白结合疫苗，所述的具有免疫原性的细菌多糖-蛋白结合疫苗中的蛋白为具有免疫原性的重组轮状病毒蛋白。

本发明的第一优选方案为：所述的细菌多糖以共价键与重组轮状病毒蛋白相连接。

本发明的第二优选方案为：所述的作为结合疫苗载体的重组轮状病毒蛋白是P基因型轮状病毒蛋白的部分氨基酸序列或全序列。

本发明的第三优选方案为：所述的作为结合疫苗载体的重组轮状病毒蛋白基因是选自P基因型轮状病毒毒株P[8]，P[4]，P[6]或P[11]中的至少一种；其中，P基因型轮状病毒毒株选自P[8]G1，P[4]G2，P[8]G3，P[8]G4，P[8]G9，P[8]G5或P[6]G8中的至少一种。

本发明的第四优选方案为：所述重组轮状病毒蛋白选自VP8，VP4，VP8多肽链片段，核VP8，VP4多肽链片段，VP8特异性抗原簇肽链，VP4特异性抗原簇肽链中的至少一种。

本发明的第五优选方案为：所述的P基因型P[8]的轮状病毒毒株选自Wa，Ku，P，YO，MO，VA70，D，AU32，CH-32，CH-55，CHW2，CH927A，W161，F45，Ai-75，Hochi，Hosokawa，BR1054，WT78或WI79毒株中的至少一种。

本发明的第六优选方案为：所述的P基因型P[4]的轮状病毒毒株选自DS-1，RV-5，S2，L26，KUN，E210，CHW17，AU64，107E18，MW333或TB-Chen毒株中的至少一种。

本发明的第七优选方案为：所述的P基因型P[6]的轮状病毒毒株选自M37，1076，RV-3，ST3，SC2，BrB，McN13，US1205，MW023，US585或AU19毒株中的至少一种。

本发明的第八优选方案为：所述的重组轮状病毒蛋白是G血清型轮状病毒的VP7蛋白的部分氨基酸序列或全序列。

本发明的第九优选方案为：所述的G血清型轮状病毒毒株选自G1，G2，G3，G4，G9，G5，G8，G10或G11血清型中的至少一种。

本发明的第十优选方案为：所述G血清型轮状病毒毒株选自P[8]G1，P[4]G2，P[8]G3，P[8]G4，P[8]G9，P[8]G5或P[6]G8血清型中的至少一种。

本发明的第十一优选方案为：所述的细菌多糖选自革兰氏阳性菌荚膜多糖，革兰氏阴性菌O-特异性多糖，革兰氏阳性菌荚膜多糖片段，革兰氏阳性菌荚膜寡聚糖中的至少一种。

本发明的第十二优选方案为：所述的革兰氏阳性菌荚膜多糖选自肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、15B、18C、19A、19F、23F，流行性嗜血杆菌b型，脑膜炎球菌A、C、Y或W135群细菌中的至少一种。

本发明的第十三优选方案为：所述的革兰氏阴性菌选自大肠杆菌O157、伤寒杆菌、副伤寒杆菌或霍乱弧菌细菌中的至少一种。

本发明还涉及一种编码本发明所述重组轮状病毒蛋白的核苷酸序列。

本发明还涉及一种重组表达系统，所述的重组蛋白表达系统中含有所述的重组轮状病毒蛋白核苷酸序列。

本发明的又一优选方案为：所述的重组蛋白表达系统选自大肠杆菌表达系统、昆虫杆状病毒表达系统、CHO细胞表达系统或酵母表达系统。

本发明还涉及所述重组蛋白表达系统表达的蛋白，所表达的蛋白含有P基因型轮状病毒蛋白的部分氨基酸序列或全序列或G基因型轮状病毒蛋白的部分氨基酸序列或全序列。

本发明的又一优选方案为，本发明重组蛋白表达系统所表达的蛋白为轮状病毒非结构性蛋白NSP4与P基因型轮状病毒蛋白的部分氨基酸序列或全序列或G基因型轮状病毒蛋白的部分氨基酸序列或全序列所构成的融合蛋白。优先选择的是NSP4-VP8，或NSP4-VP7。

本发明还涉及细菌多糖-蛋白结合疫苗的制备方法，所述的细菌多糖和轮状病毒蛋白在水溶液或有机溶剂通过化学合成反应得到结合物。

本发明的又一优选方案为，所述的有机溶剂选自二甲基亚砜或二甲基甲酰胺。

本发明的再一优选方案为，所述的化学合成反应选自还原胺法、己二酰二肼法或1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐法中的一种。

本发明的制备方法还包括细菌多糖的前处理、重组轮状病毒蛋白的表达和纯化以及对结合物的纯化。

其中，所述的细菌多糖的前处理包括降解和活化，所述的降解方法选自酸水解法、碱水解法、超声法、酶消化法或微射流法，优选微射流法。

本发明还涉及所述的细菌多糖-蛋白结合疫苗的制剂，所述的具有免疫原性的结合疫苗为冻干剂或水剂，其中，所述的结合疫苗中含有佐剂。

本发明的又一优选方案为，所述的佐剂是氢氧化铝、磷酸铝、氢氧化铝和磷酸铝混合物中的至少一种。

本发明还涉及一种肺炎球菌多糖-重组轮状病毒蛋白结合疫苗，所述的重组轮状病毒蛋白选自P[8]毒株中的至少一种、P[4]毒株的至少一种或P[6]毒株中的至少一种，肺炎球菌多糖选自血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、15B、18C、19A、19F、23F中的至少一种；其中P[8]毒株选自Wa、Ku、P、YO、MO、VA70、D、AU32、CH-32、CH-55、CHW2、CH927A、W161、F45、Ai-75、Hochi，Hosokawa，BR1054，WT78或WI79；P[4]毒株选自DS-1、RV-5、S2、L26、KUN、E210、CHW17、AU64、107E18、MW333或TB-Chen；P[6]毒株选自M37、1076、RV-3、ST3、SC2、BrB、McN13、US1205、MW023、US585或AU19。

本发明的又一优选方案为，所述肺炎球菌多糖-重组轮状病毒蛋白结合疫苗，其中，所述的重组轮状病毒蛋白选自P[8]毒株的至少一种、P[4]毒株中的至少一种或P[6]毒株中的至少一种；所述的肺炎球菌多糖选自血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、15B、18C、19A、19F、23F中的至少一种，其中，优选其中的8～15种，更优选10～15种。

本发明的又一优选方案为，所述的重组轮状病毒蛋白为由Wa毒株、DS-1毒株和M37毒株构成混合载体的多价疫苗。

本发明的再一优选方案为，所述的重组轮状病毒蛋白为Wa毒株和DS-1毒株构成的混合载体的多价疫苗。

本发明还提供了一个配制具有免疫原性的细菌多糖-轮状病毒蛋白结合疫苗的制剂和试验方法，用于小白鼠试验。

本发明最后提供了检测细菌多糖-轮状病毒蛋白结合疫苗在动物体上免疫效果的方法，包括ELISA抗体滴度和中和抗体滴度的检测。

为了更进一步解释和说明本发明，下面对本发明进行详述。

本发明提出一种将细菌多糖与重组轮状病毒蛋白以共价键形式连接而合成的结合疫苗，能够诱导机体同时产生两种保护性抗体，即针对于细菌多糖的抗体和针对于轮状病毒表面蛋白的抗体，达到接种一种疫苗预防两类疾病的临床效果。该发明不仅仅限于合成单价结合疫苗，同样适用于合成多价结合疫苗。目的是制备一种新颖的细菌多糖-蛋白结合疫苗，用于合成的多糖是纯化的细菌多糖，蛋白载体是基因重组的轮状病毒表面蛋白，将这两个生物大分子用化学合成反应以共价键连接后制成的具有免疫原性结合疫苗，在接种人体后，能够产生具有保护性的抗细菌同时也抗轮状病毒感染的抗体，达到接种一种结合疫苗能够预防同时两种传染病的结果。

本发明另外还设计制备了一种细菌多糖-轮状病毒蛋白结合疫苗，其轮状病毒蛋白载体是非全长的，经过剪切的VP8多肽链，称作核VP8，含有160个氨基酸序列，蛋白基因的来源可以是P血清型中的P1A[8]、P1B[4]或者P2A[6]中的任何一个毒株。

本发明提供了合成细菌多糖-轮状病毒蛋白结合疫苗的方法，用有机溶剂DMOS作为结合反应的溶剂，合成了肺炎球菌19F血清型多糖-轮状病毒VP8蛋白结合疫苗。

轮状病毒由一个11个分段式双股RNA基因、无囊膜，多层壳蛋白组成的病毒颗粒。这11个基因片段中，6个是为结构蛋白编码，5个是为非结构蛋白编码。这6个结构蛋白排列成3个包裹病毒基因的同心圆层。最外层是由2个蛋白组成，即能够分别刺激机体产生中和轮状病毒抗体的VP7和VP4。VP7是一个分子量为34kDa的糖蛋白，占总病毒蛋白的30％，组成了病毒光滑的外壳，是决定病毒特异性G血清型的蛋白。VP4构成了一些从VP7蛋白壳向外的突刺，其整个分子含有两个分离的末梢区域，一个中间体，和插入到VP7层的一个内球体区域的独特结构，组成了病毒外壳的小部分。VP4是一种非糖蛋白，分子量为88kDa，占病毒蛋白总量的1.5％，是决定病毒的P血清型的蛋白。研究表明，轮状病毒的VP4蛋白具有几个重要的功能，包括粘附细胞受体，进入宿主细胞，产生溶血，刺激机体产生中和抗体，致病性等。用胰蛋白酶消化后，VP4被切成2个连接于病毒体的多肽片段，一个是60-kDa的C-末端片段VP5，该片段含有帮助病毒穿透细胞膜区域，包含有VP4的中间体和内球体的结构区域；另一个是28-kDa的N-末端片段VP8，该片段含有溶血区域，位于VP4的突出末梢球形区域。蛋白酶切后能够稳定突刺结构，通过提高病毒穿透细胞的能力而大大地增强轮状病毒的感染性。

VP8亚单位在病毒的传染性和刺激机体产生中和抗体上具有重要的作用。研究动物和人类轮状病毒发现，在VP4上都有8个中和性抗原簇，其中5个在VP8片段上，而且轮状病毒特异性抗原簇，或有限混合型中和抗原簇坐落在VP4蛋白的VP8多肽片段上。这些发现表明，VP8亚单位具有轮状病毒的P血清型特异性抗原簇，也含有其它毒株VP8交叉反应的抗原决定簇。当用VP8单克隆抗体中和VP8时，不仅抑制了病毒粘附细胞的能力，也能够使得已经粘附于细胞表面的病毒脱落，在体外实验表明，VP8单克隆抗体能够中和病毒。由此可见，轮状病毒VP8蛋白在病毒免疫学上的重要性，能够刺激机体产生针对于轮状病毒的特异性中和抗体，具有免疫原性可作为疫苗来开发。

通过CD分析重组Wa毒株VP8二级结构表明，VP8有少量的α-螺旋(α-helix)结构，但有大量的β-折叠(β-sheet)结构；用病毒的VP8蛋白结构的研究证明，VP8是由11个被环结构(loop)分离的β-折叠结构，侧面链接着2个小的α-螺旋组成。以上的结构表明，重组表达的VP8蛋白的结构和病毒原始蛋白的结构相似。

由于缺乏区别不同VP4血清型分型血清或单克隆抗体，阻碍了VP4的血清型分型。作为替代，VP4主要是根据核酸序列来进行分类。目前已经证明至少有26个不同的VP4基因型。与VP7进行G型分类不同的是，其基因型和血清型的相关性已经确认，但是VP4的两者关联性不明确，尽管VP8区域氨基酸71-204的变异性已经用以决定P特异性型的抗原簇。从免疫学角度来说，用P基因型分类来作为免疫反应结果的判定标准是不正确的；也就是说，分类在同一基因型组的毒株，尽管基因序列相近，但是，可能没有明确的交叉免疫反应；同样的，分类在不同的基因型组内的毒株，尽管基因序列差异较大，但是，可能有明显的交叉免疫反应，这就给选择具有代表性用于疫苗开发的毒株带来了困难。本发明的目的是开发疫苗，需要选择的病毒蛋白具有的抗原簇产生的保护性抗体具有广泛的交叉反应的功能。现将主要的人类轮状病毒的毒株基因型分类列入表2。

表2：A型轮状病毒VP4[P]基因型和血清型表

表中可见，对人类致病的轮状病毒的P基因型毒株主要集中在P[8]，其次是P[4]，而P[6]较少。与已经明确了的P血清型共同来分类后，流行病学统计数据表明，P1A[8]株最常见，包括了Wa、KU、P、YO、MO、VA70、Hochi、Hosokawa、W161和F45毒株，这些毒株都具有P[8]基因型和P1A血清亚型(见表2)，免疫学试验表明，其中的Wa或KU毒株基因重组VP8产生的抗体与该组内的其他毒株有明显的免疫交叉反应；其次常见的毒株是P1B[4]株，DS-1、S2、RV-5和L26属于该组，较少见的P2[6]。

以上分析得出结论，P血清型的P[8]组中的Wa，其基因型为P1A[8]的VP8的抗原簇，和P[4]中的DS-1，其基因型为P1B[4]的VP8的抗原簇产生的抗体覆盖率可达88.5％。本发明选择这两个VP8病毒蛋白作为多价细菌-蛋白结合疫苗载体，以达到一种疫苗可同时预防两种疾病，即细菌性感染(根据多糖来源的不同而定，比如肺炎球菌导致的肺炎和脑膜炎、流行性嗜血杆菌b型导致的脑膜炎、或脑膜炎球菌导致的脑膜炎等)和轮状病毒的感染。

本发明首选基因重组P[8]基因型毒株的全长(full-length)VP8病毒蛋白来作为蛋白载体合成多糖结合疫苗，VP8核酸序列的模板可为P血清型分类中的P1A[8]中任何一个毒株，包括Wa、KU、P、YO、MO、VA70、Hochi、Hosokawa、W161和F45毒株；也可选择P血清型分类中的P1B[4]中的任何一个毒株，包括DS-1、S2、RV-5和L26毒株；也可是P血清型分类中的P2A[6]中的任何一个毒株，如M37、1076、MeN、RV-3和ST3。本发明优先使用各个P血清型分类中代表性毒株的VP8蛋白作为重组蛋白载体，毒株包括P1A[8]的Wa、P1B[4]的DS-1和P2A[6]中的M37。这三个VP8重组蛋白可以通过结合反应分别连接到不同的细菌多糖(如流行性嗜血杆菌、脑膜炎球菌、肺炎球菌、伤寒、副伤寒、霍乱或痢疾等)或者血清型多糖(如肺炎球菌)上来合成不同的单价多糖蛋白结合疫苗，然后根据流行病学资料，进行不同组份地混合，最终配制成不同制剂的多价多糖蛋白结合疫苗，比如，配制10价肺炎球菌多糖结合疫苗时，可用这三种蛋白作为载体，分别连接到不同的血清型多糖上，然后混合配制成含有三种轮状病毒VP8蛋白的多价肺炎结合疫苗。这种方法配制的优点是，控制了任何一种载体蛋白的总含量，以避免多价结合疫苗中一种载体蛋白含量过高造成的对多糖免疫原性的抑制效应；同时，也能够增加该疫苗预防轮状病毒感染的覆盖率。如果是合成单价多糖结合疫苗，优先选择的是用Wa毒株的VP8作为蛋白载体，因为从预防轮状病毒感染的角度来看，Wa或KU毒株P1A[8]的P血清型流行的范围更广泛。

不同毒株的基因重组VP8蛋白的核酸序列长短有差异，表达后的氨基酸序列长短在240～250之间，涵盖了VP8所有的抗原决定簇。VP8病毒蛋白是轮状病毒的壳蛋白，属于结构蛋白，全长VP8蛋白在水溶液中的可溶性差，造成在多糖蛋白结合疫苗的合成反应中结合物产量低；而且，不同毒株VP8在水溶液中的可溶性也有差别。通过选择性地克隆不同长度的VP8多肽链的片段，可以提高剪切后的VP8蛋白在水溶液中的可溶性。VP8的剪切点可以在蛋白的N-末端，或C-末端，也可以同时两个末端进行剪切。本发明优先选择的是在N-末端和C-末端同时剪切，即N-末端在64位前，和C-末端的223位以后进行剪切，得到的剪切后VP8蛋白有160氨基酸，试验证明，这一多肽片段是轮状病毒吸附于宿主细胞受体的区域，宿主细胞表面唾液酸(sialic acid)被认为是VP8蛋白吸附的受体成分，尽管唾液酸并不是必需不可少的成分。VP8蛋白这一多肽片段被称作核VP8(Core VP8)。

为了增强VP8蛋白或核VP8蛋白的免疫原性或水可溶性，可用基因重组VP8-蛋白质的融合蛋白来作为结合疫苗的蛋白载体，这种融合蛋白的功能有两方面，一方面增加蛋白的水溶性，便于进行结合反应；另一方面增加载体蛋白上有效保护性抗体的抗原簇的品种和数量。本发明优先考虑的是VP8-NSP4。轮状病毒的非结构性蛋白4(Non-structural protein 4，NSP4)是一种轮状病毒感染的宿主细胞分泌出来的一种肠毒素(enterotoxin)。这种融合蛋白载体刺激机体产生的抗体具有更广泛的保护作用，同时，也能够增强VP8蛋白的可溶性。另外，VP8-破伤风变异无毒类毒素、VP8-白喉变异无毒类毒素(如VP8-CRM₁₉₇)或VP8-霍乱变异无毒类毒素制成的融合蛋白也能够增强VP8蛋白的可溶性。另外，VP8也可以和其它轮状病毒蛋白，如VP7、VP6或VP7的抗原簇多肽链片段形成重组融合蛋白来用作结合疫苗载体。

重组VP8蛋白的表达系统，本发明优先采用高表达质粒构建的E.coli表达系统，如用ρET28-BL21 DE3表达系统。但也可采用任何商业或自行构建的表达系统，包括哺乳动物细胞表达系统，如CHO细胞表达系统、杆状病毒-昆虫细胞表达系统；细菌表达系统，如E.coli细菌表达系统；酵母表达系统，如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表达系统等。

轮状病毒VP4蛋白，其包含了VP8的所有抗原簇的多肽链，也可以通过基因重组方法进行制备，作为蛋白载体来合成结合疫苗。其基因克隆模板的来源和方式和上述的VP8相似，包括毒株的基因模板、融合蛋白的设计、表达系统的选择等。

本发明也可通过基因重组的方法来克隆、表达轮状病毒的G血清型决定蛋白VP7，作为多糖结合疫苗的载体使用，合成出的结合疫苗和含VP8载体蛋白的结合疫苗有相同的功效。由于VP7是一种糖蛋白，抗原决定簇的结构较为复杂，表达出来的蛋白的水溶性和免疫原性较差；为了克服这一困难，可以通过基因重组的方法来合成VP7多肽链上的抗原决定簇多肽链的融合蛋白，如VP8-VP7融合蛋白，来作为载体，以提够结合疫苗中蛋白载体的免疫覆盖率。

结合疫苗中的细菌多糖是纯化过的革兰氏性菌的荚膜多糖、革兰氏阴性菌的O-特异性多糖以及荚膜多糖的降解多糖片段。多糖来源的细菌是根据最终合成结合疫苗的品种来决定，如多价肺炎多糖结合疫苗可用纯化的肺炎球菌荚膜多糖，流行性嗜血杆菌b型多糖结合疫苗可用纯化的荚膜多糖PRP，脑膜炎球菌多糖结合疫苗可用纯化的其各群，如A、C、Y或W135荚膜多糖，伤寒多糖结合疫苗可用纯化的Vi多糖，E.coli O157、副伤寒多糖结合疫苗可用其O-特异性多糖。

将载体蛋白与细菌多糖共价键地连接的合成方法有多种。常用的方法有直接连接法、ADH法、还原胺法、巯基化学法等，具体的每个结合疫苗的合成需要根据蛋白载体和多糖的化学特性来选择。这些大分子在溶剂中的可溶性也是需要考虑到的问题，有些VP8蛋白，特别是全长VP8蛋白在水中无法溶解，而无法完成结合反应，需要在有机溶剂中来完成，常用的有机溶剂有DMSO(dimethylsulfoxide)、DMF。对于无法溶于水溶液的蛋白载体，本发明优先选择DMSO作为反应溶剂。

细菌多糖-重组轮状病毒结合疫苗的合成可分为四个阶段：

1、细菌多糖前处理：

细菌的不同，多糖的化学结构和特性有很大的差异，有些多糖在合成前需要进行前处理，处理的方法根据合成方法的不同有所不同，如果多糖的物理形状比较粘稠，直接用于合成后形成的结合物易于沉淀，需要进行适当的降解(depolymerization)，来降低多糖的粘度。降解多糖的方法有酸水解法、碱水解法、超声法、酶消化法或微射流(microfluidization)法，本发明优先选择微射流法来进行物理降解多糖。如果是用还原胺法进行合成，多糖需要进行活化，本发明优先选择使用高碘酸钠，通过氧化多糖来引入醛基来活化多糖。如果用ADH法，则可用溴化氰或CDAP，将连接物ADH引入到多糖上来衍化多糖。

2、结合：

结合反应的溶剂需根据多糖和轮状病毒蛋白(全长VP8、核VP8、VP4或VP8融合蛋白)溶解特性进行选择，包括水溶液，缓冲溶液，有机溶剂DMSO、DMF等。如果用还原胺法进行合成，可加入还原剂氰基硼酸化钠。如果是用ADH法，可加入EDC，通过衍化的多糖上hydrazide基团和轮状病毒蛋白上的COOH基团反应形成共价键。或者通过加入EDC，通过多糖上的COOH基团与轮状病毒蛋白上的氨基反应形成共价键而将多糖和蛋白载体直接连接。其中，细菌多糖与轮状蛋白载体的物质的量的比为，1∶2～2∶1，其中优选为0.8∶1～1∶0.8，更优选为0.9∶1～1∶0.9。

3、结合物纯化：

制备结合疫苗需要将结合物和未反应的多糖和蛋白载体分离纯化，纯化方法可用层析法或超滤法。层析法优选采用Sepharose CL-4B或Sepharose CL-6B进行；而超滤法是采用不同滞留分子量膜来分离结合物和未反应物。

4、制剂：

结合疫苗制剂可采用水剂或冻干剂。为了增强其免疫原性，可加入佐剂，常用的佐剂有铝佐剂，如氢氧化铝、磷酸铝，本发明优先选择磷酸铝。结合物的溶剂可为0.2氯化钠溶液、1×PBS缓冲液或其它能够稳定多糖或者结合物的缓冲液。本发明的细菌多糖-蛋白结合疫苗的制备方法采用本技术领域的常规手段制备。其中，优选在糖(例如蔗糖或乳糖)存在下冻干。另外优选将其冻干，在林永前复原。冻干处理可是组合物疫苗更加稳定。

根据结合疫苗的用途的不同，可以配制成单价疫苗，如Hib多糖-轮状病毒VP8结合疫苗、伤寒Vi多糖-轮状病毒VP8结合疫苗。也可配置成多价肺炎球菌结合疫苗，如10价肺炎多糖-轮状病毒蛋白(WaVP8蛋白，DS-1蛋白和M37蛋白混合)载体结合疫苗。

本发明还提供疫苗盒，该疫苗包括装有本发明细菌多糖-蛋白结合疫苗(任选为冻干形式)的小瓶，还包括装有本发明所述佐剂的小瓶。在使用过程中，佐剂用来将冻干的疫苗复原成溶液的形式。

本发明的细菌多糖-蛋白结合疫苗可以以任何已有的途径进行免疫，包括真皮层或皮肤给药、肌肉给药等形式。其中，所给予的量是本领域技术人员根据常识可以确定的。

本发明中的重组蛋白氨基酸序列为：

其中，SEQ ID NO：1为毒株Wa的VP8的氨基酸的序列；

SEQ ID NO：2为毒株Wa的核VP8的氨基酸的核序列；

SEQ ID NO：3为毒株DS1的VP8的氨基酸序列；

SEQ ID NO：4为毒株DS1的核VP8的氨基酸的核序列；

SEQ ID NO：5为毒株M37的VP8的氨基酸序列；

SEQ ID NO：6为毒株M37的核VP8的氨基酸的核序列；

SEQ ID NO：7为毒株Wa的VP4的氨基酸序列；

SEQ ID NO：8为毒株DS1的VP4的氨基酸序列；

SEQ ID NO：9为毒株M37的VP8的氨基酸序列；

SEQ ID NO：10为毒株Wa的VP7的氨基酸序列；

SEQ ID NO：11为毒株DS1的VP7的氨基酸序列；

SEQ ID NO：12为毒株M37的VP7的氨基酸序列；

SEQ ID NO：13为编码VP7基因型的核苷酸序列。

附图说明

图1：肺炎球菌血清型19F荚膜多糖-WaVP8结合物中的多糖和蛋白质在Sepharose CL-4B柱上的分布；

图2：SDS-PAGE电泳对肺炎球菌血清型19F荚膜多糖-WaVP8结合物的分析图：

其中，从左向右依次为孔1～6，其中，孔1为蛋白分子标记，孔2为重组VP8参照标准，孔3为结合物一、孔4为结合物二，孔5为结合反应1沉淀物，孔6为结合反应2沉淀物。

图3：免疫扩散双向电泳图：其中，1和3为肺炎球菌血清型19F荚膜多糖；2、4肺炎球菌血清型19F荚膜多糖-WaVP8结合物；5为兔抗肺炎球菌血清型19F荚膜多糖血清。

具体实施方式

术语定义

核VP8：是轮状病毒蛋白VP8中的一段具有和细胞表面含有唾液酸(sialic acid)粘合功能的多肽链，通常含有160氨基酸残基。

VP8多肽链片段：为任何分子量低于全长VP8的多肽链。

VP4多肽链片段：为任何分子量低于全长VP4的多肽链。

VP8特异性抗原簇链：全VP8多肽链含有多个抗原决定簇，通过基因重组的方法剪切去不含重要的氨基酸，而保留含有特异性抗原簇的多肽链，分子量通常小于全长VP8多肽链。

VP4特异性抗原簇链：全VP4多肽链含有多个抗原决定簇，通过基因重组的方法剪切去不含重要的氨基酸，而保留含有特异性抗原簇的多肽链，分子量通常小于全长VP4多肽链。

VP8融合蛋白：用基因重组方法，将VP8蛋白和其它可溶性蛋白多肽链融合表达，以提高VP8在水溶液中的可溶性；或增强VP8的免疫原性。

NSP4蛋白：是非结构性蛋白，具有肠毒素特性，分子量为28kDa，含有175个氨基酸。

VP8-NSP4融合蛋白：用基因重组的方法，将VP8和NSP4多肽链融合表达，以提高VP8在水溶液中的可溶性，同时使得融合蛋白具有刺激机体产生抗NSP4的保护性抗体。

荚膜多糖片段：通过物理(如超声波、微粒喷雾)、化学(如酸、碱、酶消化)等方法将由细菌培养液中纯化的多糖(称全多糖或原始多糖)降解(depolymerization)所获得的多糖片段，分子量通常低于原始多糖。荚膜寡聚糖：通过物理(如超声波、微粒喷雾)、化学(如酸、碱、酶消化)等方法将由细菌培养液中纯化的多糖(称全多糖或原始多糖)降解(depolymerization)所获得的多糖片段，分子结构中的单糖残基通常低于10。不过单糖残基数量的定义有差异，有些文献将多于10个少于20个单糖残基的多糖链也成为寡聚糖。

以下是一些举例本发明的实施方法，包括轮状病毒蛋白的克隆和纯化，细菌多糖-轮状病毒蛋白VP8结合物的合成和动物实验的检验。不过这并不表明本发明所包括的结合疫苗的合成和制备仅仅限制于这些方法，其它任何以重组轮状病毒蛋白为载体来合成细菌多糖-蛋白结合疫苗及其制备的方法都属于本发明保护的范围。

实施例1 建立轮状病毒的cDNA库

人类轮状病毒Wa毒株(2018-VR，ATCC)在加有1μg/ml胰蛋白酶的MA104细胞(猴胚胎肾细胞)中，温度36℃扩增1至2天。低速离心去除细胞碎片，加入羟磷灰石(hydroxyapatite，HA)至上清液中纯化病毒RNA。具体步骤为：600μl的6M异硫氰酸胍(GITC)溶液加入到400μl的培养上清液中，混匀。然后加入50μl(两滴)HA悬浮液，室温下上下颠倒混合试管或在震荡器上放置20分钟以便将核酸吸附到HA上。以13,000g离心1分钟，丢弃上清液。用1ml的10mM磷酸钾pH6.8洗RNA-HA两次。加入40μl的200mM磷酸钾pH6.8溶液从HA结晶上洗脱RNA，以13000g离心3分钟收集纯化的RNA。立即进行反转录-聚合酶链式反应，将样品溶液保存在-20℃。

为了扩增编码有Wa毒株VP8蛋白的VP4基因，引物设计如下：sense引物HWaVP4ρET28：5’-TTACATATGGCTTCGCTCATTTATAG-3’，anti-sense引物AHWaVP4ρET28：

5’-CCGGATCCCTAGTCTTCATTAACTTGTGCT-3’。

用Super Script One-Step RT-PCR系统，含有Platinum Taq DNA聚合酶试剂盒进行RT-PCR扩增。

具体步骤如下：8μl纯化的RNA加入到加有4μl的DMSO，2μl的20mMHWaVP4ρET28和AHWaVP4ρET28引物的0.2-ml试管，在94℃加热2分钟，冰浴上退火。然后加入86μl的含有0.2mM各种dNTP，1.5mM的MgCl₂和2μl的反转录酶和Taq酶反应混合溶液。在PCR仪上进行如下条件的反应：42℃孵化60分钟，然后进入35个周期的PCR反应，94℃30秒，42℃50秒，72℃70秒，最后72℃孵化7分钟。在GFX柱上纯化RT-PCR扩增产物。

用直接连接方法将PCR产物引入到pGEM-T Easy的载体。将构建的扩增质粒转化入到Competent细胞E.coli Top10里。用Wizard SV Mini prep DNA，选择阳性的转化菌落，在LB培养基中扩增细菌，收集细菌体，纯化系统重组DNA质粒。该含有VP8蛋白表达序列的质粒称为pGEM-TWaVP8，将质粒保存于-20℃。

实施例2构建pET28aWaVP8表达全长VP8质粒

用核酸限制性内切酶NdeI和BamHI来消化实施例1制得的pGEM-TWaVP8，以获得VP8基因插入序列。同样用核酸限制性内切酶NdeI和BamHI来消化载体pET28a(+)。加入10μg的VP8基因插入序列，T4 DNA连接酶和切过的pET28a(+)于试管中，在16℃反应过夜。该构建完成的质粒称为pET28aWaVP8。该质粒表达出来的蛋白含有6-组氨酸标记(hexa-histidine tag，6×His-Tag)，和在5′末端有凝血酶识别位点(thrombin recognition site)。

将pET28aWaVP8质粒转化入competent细胞E.coli TOP10中，该克隆在有50μg/ml的卡那霉素(Kanamycin)的LB培养基皿筛选pET28aWaVP8阳性菌落。接种于LB培养液中进行扩增，保存表达菌种-20℃以下，同时从细菌中提取ρET28aWaVP8质粒，证实VP8的核酸序列(SEQ ID NO：1)。

实施例3表达重组VP8蛋白

1.将实施例2制得的pET28aWaVP8质粒转化入BL21(DE3)competent细胞中，接种细胞到50μg/ml卡那霉素LB培养皿，在37℃下于CO₂培养箱内过夜。

2.挑选出一个菌落，接种到10毫升含有50μg/ml的卡那霉素LB培养液(1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH 7.5)中扩增，在37℃培养过夜。

3.将培养液转接种到100毫升的50μg/ml卡那霉素LB培养液，继续培养。待吸光度600nm的OD到达1.0时，将培养液转接种到6升到50μg/ml卡那霉素LB培养液中，继续在37℃，摇速200rpm的摇床内培养，待吸光度600nm的OD到达0.6～0.8时，加入0.3mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导VP8表达。

4.在相同的培养条件下，诱导4小时后，以4000g下，在10℃离心20分钟后，收集菌体。

5.将细菌悬浮于20ml的1×PBS溶液，用法式压滤壶(French press)破碎细菌后，在10000g下，在10℃离心30分钟，丢弃上清液，收集沉淀的包涵体。在进一步纯化前，存储包涵体于-40℃。

实施例4从包涵体中纯化VP8蛋白

1.称取实施例3制备的VP8包涵体0.5克(湿重)，用清洗缓冲液(10mM Tris，100mM磷酸盐缓冲液，2M urea，pH 8.0)悬浮包涵体，在室温下孵育30分钟，以10,000g离心10分钟，收集包涵体。重复以上步骤三次除去污染的杂蛋白。

2.将包涵体沉淀溶于溶解缓冲液(10mM Tris-HCl，100mM磷酸盐缓冲液，8M尿素，pH 8.0，简称缓冲液B)中，在冰上搅拌孵育1小时。以16,000g离心30分钟，收集上清液，丢弃不溶沉淀物。

3.用固定金属离子亲和层析色谱法(IMAC)纯化His-tagged重组VP8蛋白。

具体方法为：将螯合Sepharose FF胶预先在0.1M的NiSO₄溶液中，在室温下混合平衡，摇动数次，使得Ni²⁺螯合在胶上后，用去离子水清洗Ni-Sepharose两次，除去未螯合的Ni²⁺离子。将胶悬浮于缓冲液B中，装柱制成IMAC柱。用缓冲液B预先平衡柱，然后将溶有VP8蛋白的缓冲液B上柱，室温下，待溶液在柱上平衡30分钟使得重组VP8蛋白中的His-tag与Ni离子吸附。用缓冲液B洗柱，以含有10mM的imidazole缓冲液B洗柱。进一步用缓冲液C(10mM Tris-HCl，100mM磷酸盐缓冲液，8M尿素，pH 6.3)洗柱。然后用洗脱缓冲液(含有100mM EDTA，2mM β-巯基乙醇和缓冲液B)洗脱VP8蛋白。

4.收集含有VP8的洗脱液，转入透析袋中在含有20mM β-巯基乙醇1和8M尿素的TBS(pH 4.0)中透析，并逐渐降低尿素的浓度(即8，6，4，2，和1M)，在4℃中透析过夜。然后在含有2mM β-巯基乙醇的TBS pH 5.5溶液中透析两次，最后在TBS溶液中透析。根据重组VP8蛋白来源的毒株不同，来进行最后透析。

实施例5肺炎球菌血清型19F发酵和荚膜多糖纯化

1.从存放肺炎球菌血清型19F工作种子批的低温冰箱里取出一个工作种子批菌种管，在室温下解冻后接种到平皿培养基上，在36℃培养箱中过夜。

2.接种一个菌落与5毫升的新鲜培养液中，过夜至生长指数期，转接种于45毫升新鲜培养液，在摇床培养箱中，以300rpm，36℃培养18-20小时。

3.将处于指数生产期的培养液转入1升新鲜培养液中，在摇床培养箱中，以300rpm，36℃培养16-18小时。

4.将培养液转入装有20升培养液的150升发酵罐中，开始通入N₂气(0.15vvm)。定时加入50％(w/v)葡萄糖溶液3.2升，46.2％(w/v)醋酸胺1.4升和培养液110升，控制pH至7.2。通入空气(0.15vvm)，培养了14.5小时后收获多糖。加入福尔马林杀菌，最终浓度为0.5％，培养1小时。

5.用Millipore 0.45μm的微滤膜进行微滤除菌，设备可用Millipore公司的Pellicon Mini超滤系统，收集微滤溶液于20升储液罐。

6.用Millipore公司的0.22μm膜进行超滤，清除可能的颗粒，细胞碎片等，收集超滤液于20升储液罐。以100kDa膜进行超滤浓缩，将溶液浓缩到2升(10×浓缩)，收集超滤液于10升储液罐中。

7.用磷酸盐缓冲液，以100kDa膜进行超滤清洗。加入等体积的十六烷基三甲基季铵溴化物(HB)的磷酸盐缓冲液来沉淀多糖，将溶液置于4～8℃环境过夜。

8.将得到的沉淀溶液滤过深层过滤器，使得多糖/HB沉淀截留在过滤器膜上，丢弃过滤液。清洗沉淀物，氯化钠溶液通入深层过滤器，溶解、洗脱过滤器收集溶液于储液罐。加入碘化钠溶液于储液罐中，置储液罐于4℃冷柜中过夜，沉淀溶液中的HB。将沉淀溶液滤过深层过滤器，使得HB/I沉淀截留在过滤器膜上，收集多糖滤液于储液罐中。

9.用0.22μm膜过滤多糖洗脱溶液。用30kDa膜超滤浓缩粗制多糖溶液到2升左右，然后以0.2M NaCl溶液超滤清洗。用磷酸盐缓冲液平衡HA柱。上柱粗制多糖溶液，然后用磷酸盐缓冲液进行洗脱。用0.22μm膜过滤多糖洗脱溶液，用30kDa膜超滤浓缩精制多糖溶液至体积约2升。用0.22μm膜过滤精制多糖溶液。真空冻干，多糖储存于-25±5℃低温冰箱备用。

实施例6合成肺炎球菌血清型19F-WaVP8结合疫苗

1、氧化：

称取实施例5制得的肺炎球菌血清型19F 20mg于反应瓶，加入3.3ml去离子水后，用磁力搅拌溶解，多糖浓度为5mg/ml，调节pH至6.0。加入等当量的高碘酸钠，在4℃下，氧化过夜。将氧化后的多糖溶液转移到透析袋(6～8000分子截留)中，在冷库中用去离子水透析。在更换三次去离子水后，将多糖溶液转入冻干瓶中，真空冻干。

2、合成

(1)还原胺法：称取5mg的氧化过的Pn19F多糖入反应瓶中，加入同等量的实施例4制得的载体蛋白VP8(液体或固体粉末)，将反应物溶于0.5ml的去离子水，调节pH至7.0。搅拌混合均匀后，真空冻干。加入1ml的DMSO到反应瓶，搅拌1小时溶解反应物。加入8mM的氰基硼氢化钠入反应瓶。放置培养瓶于室温下反应2天。加入等当量的硼氢化钠于反应瓶，在室温下搅拌3小时终止反应。将反应混合物转入透析袋(6～8000分子截留)在0.2M的NaCl溶液中透析，换三次透析液。以10000rpm离心透析后的反应混合液，收集上清液。将上清液装柱(Sepharose CL-4B)进行纯化。分管收集过柱样品(每管32滴)。

(2)ADH法：该方法可以不用氧化多糖，直接进入合成阶段。称取10mg纯化的Pn19F多糖入反应瓶中，加1ml注射用水溶解多糖。加入CDAP(1-氰基-4-二甲基氨基-吡啶四氟化硼)溶液入反应瓶中活化多糖，搅拌溶液后，加入TEA，条件pH至8～9.5。加入1ml的ADH(己二酰肼)溶液，搅拌反应3小时。调节pH至8.0～8.5。将衍化后的多糖转入透析袋中，在水中透析过夜。过Sephadex G-50纯化，收集多糖溶液峰，转入透析袋中透析过夜。真空冻干。称取5毫克衍化后的多糖，加入无菌盐溶液(0.2M NaCl)溶解多糖，调节pH至5.0，加入VP8重组蛋白(粉末或浓溶液)，加入适当的无菌盐溶液，最终体积为1ml，搅拌使得蛋白完全溶解和混合。加入EDAC(N-(3-二甲基氨丙基)-N′-乙基碳二亚胺)试剂，在室温下反应3小时。将反应混合液转入到透析袋中，以0.2M NaCl溶液透析。上Sepharose CL-4B柱进行纯化，收集结合物峰，无菌过滤，4℃下保存。

3、结合物分析：

检测分析过柱后分管收集样品中多糖和VP8蛋白的分布情况。蛋白的测定方法为Lowry法(以牛血清蛋白为标准品)，多糖的含量测定方法为酚-硫酸法(以葡萄糖为标准)。结合物在Sepharose CL-4B柱上的分布情况见附图1。根据多糖和蛋白分布结果，收集第一个峰值样品液(25～32管，共17毫升)，分析蛋白(Lowry法)和多糖(酚-硫酸法)的总含量。同时分析过柱前离心沉淀物中多糖和蛋白含量，结果如表3：

表3：过柱前离心沉淀物中多糖和蛋白含量

	过柱后结合物收集溶液	过柱前离心沉淀
			蛋白(VP8)	92μg/ml	528μg/ml
多糖(Pn19F荚膜)	69μg/ml	472μg/ml

结合物溶液中多糖和蛋白的比率为0.76，多糖的回收率为23％，蛋白质的回收率为31％。

用十二烷基硫酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对结合物进行分析，可见结合物中蛋白VP8分子量变大，广泛的分布于每条样带的上部，这边表明多糖和蛋白载体直接进行了广泛的交叉连接。见图2，其中，从左向右依次为孔1～6，其中，孔1为蛋白分子标记，孔2为重组VP8参照标准，孔3为结合物一、孔4为结合物二，孔5为结合反应1沉淀，孔6为结合反应2沉淀。

用双向免疫扩散试验来验证结合物中VP8的抗原簇是否保存，见图3，其中，1和3为Pn19F荚膜多糖；2、4为多糖-蛋白结合物；5为兔抗Pn19F荚膜多糖抗体；琼脂凝胶浓度为在1×PBS中0.5％。图中可见结合物中的多糖能够与兔抗血清机体形成沉淀反应，荚膜多糖的沉淀线和结合物的沉淀线完全融合，表示经过化学合成反应，多糖的抗原性没有任何变化。

实施例7注射小白鼠检测结合疫苗的免疫原性

取6～8周的NIH/GP小白鼠50只，每支小鼠注射实施例6制备的结合疫苗5微克，注射容量为每支0.1毫升。注射的小鼠分两大组，一组注射液不含佐剂胶状磷酸铝；另一组注射液加入了佐剂胶状磷酸铝，浓度为每支小鼠0.2mg。具体的配制方法见表4，注射程序见表5：

表4：实验用疫苗配制方法

编号

组成

多糖浓度

VP8浓度

磷酸铝(佐剂)

1	无佐剂对照组(Pn19F荚膜多糖)	25μg/ml	-	-
					2	无佐剂疫苗组(结合疫苗)	67μg/ml	50μg/ml	-
3	含佐剂对照组(Pn19F荚膜多糖)	25μg/ml	-	2mg/ml
					4	含佐剂疫苗组(结合疫苗)	67μg/ml	50μg/ml	2mg/ml

表5：程序注射

疫苗小白鼠数量第一周第二周第三周第四周第五周第六周

无佐剂对照组 5 注射 - 注射 - 注射采血

无佐剂疫苗组

10 注射采血

(注射一次组)

无佐剂疫苗组

10 注射注射采血

(注射二次组)

无佐剂疫苗组

10 注射注射注射采血

(注射三次组)

含佐剂对照组 5 注射注射注射采血

含佐剂疫苗

10 注射采血

(注射一次组)

含佐剂疫苗

10 注射注射采血

(注射二次组)

含佐剂疫苗

10 注射注射注射采血

(注射三次组)

采血后，在室温放置1小时，以10000g离心10分钟，取血清，存储于4℃冰箱内。

实施例8ELISA测定抗体滴度

1、肺炎球菌血清型19F荚膜多糖IgG抗体滴度测定：

配制肺炎球菌血清型19F荚膜多糖储备液1mg/ml(1×PBS溶液中)，存储于冰箱。稀释多糖存储液至包被缓冲液(Coating buffer，1％BSA+0.05％Brij35在1×PBS)2μg/ml，加100μl包被溶液到每一个孔中来包被ELISA板(Nunc，96孔Maxisorp Nunc-Immuno板)，在室温下孵育过夜。用洗板缓冲液洗4次，加入100μl封闭缓冲液(Blocking buffer，1％BSA在1×PBS)，在室温下孵育2小时，用洗板缓冲液洗4次，可在4℃下保存一周。

将实施例7制得的待测血清1∶10稀释成工作样品血清，稀释适当倍数，加入到ELISA板第一排孔内，总体积200μl，从第一排开始向下进行二倍系列稀释，在室温下孵育2小时。用洗板缓冲液洗4次，加入100μl碱性磷酸酶标记羊抗鼠抗体(1∶2000稀释)，在室温下孵育4小时。用洗板缓冲液洗4次，加入100μl磷酸-4-硝基苯酯二钠盐(4-nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate)底物溶液，在405nm读盘。

2、VP8重组蛋白IgG抗体滴度测定：

用WaVP8参照标准蛋白溶液配制包被缓冲液(Coating buffer)2μg/ml，加100μl包被溶液到每一个孔中来包被ELISA板(Nunc，96孔MaxisorpNunc-Immuno板)，在室温下孵育过夜。用洗板缓冲液洗4次，加入100μl封闭缓冲液(Blocking buffer)，在室温下孵育2小时，用洗板缓冲液洗4次，可在4℃下保存一周。将实施例7制得的待测血清1∶10稀释成工作样品血清，稀释适当倍数，加入到ELISA板第一排孔内，总体积200μl，从第一排开始向下进行二倍系列稀释，在室温下孵育2小时。用洗板缓冲液洗4次，加入100μl碱性磷酸酶标记羊抗鼠抗体(1∶2000稀释)，在室温下孵育4小时。用洗板缓冲液洗4次，加入100μl磷酸-4-硝基苯酯二钠盐(4-nitrophenyl phosphate disodium salthexahydrate，1mg/ml)底物溶液，在405nm读盘。

表6：小白鼠抗Pn19F多糖-VP8结合疫苗中的多糖和蛋白IgG抗体滴度结果

实施例9轮状病毒中和试验结果

将实施例7制得的小鼠血清每组(空白多糖对照，结合疫苗注射一针，结合疫苗注射二针和结合疫苗注射三针)的每个小鼠血清各取10微升混合，用于中和试验样品血清。

注射小白鼠产生的抗WaVP8抗体的中和试验在微板(microplate)上用BSC-1细胞进行。将加热灭活血清进行系列稀释后，与100TCID₅₀的Wa轮状病毒毒株混合后，在37℃培养1小时。然后将BSC-1细胞接种到微板上，孵化1小时。加DMEM(不含血清)加入到每个孔，37℃孵化1小时。最后，稀释抗血清能够防止轮状病毒细胞病变效应(CPE)发生的浓度为中和滴度。多糖对照组血清用作阴性对照。实验结果见表7.

表7：结合疫苗注射小白鼠抗体中和轮状病毒Wa毒株试验结果

核苷酸和氨基酸电子序列表

<110>一种细菌多糖-蛋白结合疫苗及其制备方法

<120>

<160>13

<170>patent version 2.1

<210>1

<211>244

<212>PRT

<213>轮状病毒Wa毒株的VP8

<220>

<400>1

MASIYRQLLT NSYSVDLHDE IEQIGSEKTQ NVTINPSPFA QTRYAPVNWG

HGEINDSTTV EPMLDGPYQP TTFTPPNDYW ILINSNTNGV VYESTNNSDF

WTAVVAIEPH VNPVDRQYTI FGESKQFNVS NDSNKWKFLE MFRSSSQNEF

YNRRTLTSDT RFVGILKYGG RVWTFHGETP RATTDSSSTA NLNNISITIH

SEFYIIPRSQ ESKCNEYINN GLPPIQNTRN VVPLPLSSRS IQYK

<210>2

<211>160

<212>PRT

<213>轮状病毒Wa毒株的核VP8

<220>

<400>2

MLDGPYQPTT FTPPNDYWIL INSNTNGVVY ESTNNSDFWT AVVAIEPHVN

PVDRQYTIFG ESKQFNVSND SNKWKFLEMF RSSSQNEFYN RRTLTSDTRL

VGILKYGGRV WTFHGETPRA TTDSSSTANL NNISITIHSE FYIIPRSQES

KCNEYINNGL

<210>3

<211>280

<212>PRT

<213>轮状病毒DS1毒株的VP8

<220>

<400>3

MASLIYRQLL TNSYSVDLHD EIEQIGSEKT QSVTVNPGPF AQTRYAPVNW

GSWEINDSTT VEPVLDGPYQ PTTFKPPNDY WLLISSNTNG VVYESTNNND

FWTAVSSVEP HVSQTNRQYI LFGENKQFNV ENNSDKWKFF ETFTGSSQGN

FSNRRTLTSS NRLVGMLKYG GRVWTFHGET PRATTDSSNT ADLNNISIII

HSEFYIIPRS QESKCNEYIN NGLPPIQNTR NVVPLSLSSR SIQYKRAQVN

EDITISKTSL WKEMQYNRDI IIRFKFGNSI

<210>4

<211>160

<212>PRT

<213>轮状病毒DS1毒株的核VP8

<220>

<400>4

VLDGPYQPTT FKPPNDYWLL ISSNTNGVVY ESTNNNDFWT AVSSVEPHVS

QTNRQYILFG ENKQFNVENN SDKWKFFETF TGSSQGNFSN RRTLTSSNRL

VGMLKYGGRV WTFHGETPRA TTDSSNTADL NNISIIIHSE FYIIPRSQES

KCNEYINNGL

<210>5

<211>289

<212>PRT

<213>轮状病毒M37毒株的VP8

<220>

<400>5

SLIYRQLLTN SYTVELSDKI NTIGSEKSQN VTINPGPFAQ TNYSPVTWSH

GEVNDSTTIE PVLDGPYQPT SFKPPSDYWI LLNPTNQQVV LEGTNKIDIW

VALLLVEPNV TNQSRQYTLF GETKQITVEN NTNKWKFFEM FRSNVSAEFQ

HKRTLTSDTK LAGFLKHYNS VWTFHGETPH ATTDYSSTSN LSEVETTIHV

EFYIIPRSQE SKCVEYVNTG LPPMQNTRNI VPVALSSRSV TYQRAQVNKD

IIISKASLWK EMQYNRDIII RFKFNNSIVK LGGLGYKWS

<210>6

<211>211

<212>PRT

<213>轮状病毒M37毒株的核VP8

<220>

<400>6

VLDGPYQPTS FKPPSDYWIL LNPTNQQVVL EGTNKIDIWV ALLLVEPNVT

NQSRQYTLFG ETKQITVENN TNKWKFFEMF RSNVSAEFQH KRTLTSDTKL

AGFLKHYNSV WTFHGETPHA TTDYSSTSNL SEVETTIHVE FYIIPRSQES

KCVEYVNTGL PPMQNTRNIV PVALSSRSVT YQRAQVNKDI IISKASLWKE

MQYNRDIIIR F

<210>7

<211>775

<212>PRT

<213>轮状病毒Wa毒株的VP4

<220>

<400>7

MASLIYRQLL TNSYSVDLHD EIEQIGSEKT QNVTINPSPF AQTRYAPVNW

GHGEINDSTT VEPILDGPYQ PTTSTPPNDY WILINSNTNG VVYESTNNSD

FWTAVVAIEP HVNPVDRQYT IFGESKQFNV SNDSNKWKFL EMFRSSSQNE

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HSEFYIIPRS QESKCNEYIN NGLPPIQNTR NVVPLPLSSR SIQYKRAQVN

EDIIVSKTSL WKEMQYNRDI IIRFKFGNSI VKMGGLGYKW

SEISYKAANY

QYNYLRDGEQ VTAHTTCSVN GVNNFSYNGG FLPTDFGISR YEVIKENSYV

YVDYWDDSKA FRNMVYVRSL AANLNSVKCT GGSYNFSLPV

GAWPVMNGGA VSLHFAGVTL STQFTDFVSL NSLRFRFSLT VDEPPFSILR

TRTVNLYGLP AANPNNGNEY YEISGRFSLI HLVPTNDDYQ TPIMNSVTVR

QDLERQLTDL REEFNSLSQE IAMAQLIDLA LLPLDMFSMF SGIKSTIDLT

KSMATSVMKK FRKSKLATSI SEMTNSLSDA ASSASRNVSI RSNLSAISNW

TNVSNDVSNV TNSLNDISTQ TSTISKKLRL KEMITQTEGM SFDDISAAVL

KTKIDMSTQI GKNTLPDIVT EASEKFIPKR SYRILKDDEV MEINTEGKFF

AYKINTFDEV PFDVNKFAEL VTDSPVISAI IDFKTLKNLN DNYGITRTEA

LNLIKSNPNM LRNFINQNNP IIRNRIEQLI LQCKL

<210>8

<211>775

<212>PRT

<213>轮状病毒DS1毒株的VP4

<220>

<400>8

MASLIYRQLL TNSYSVDLHD EIEQIGSEKT QSVTVNPGPF AQTRYAPVNW

GSWEINDSTT VEPVLDGPYQ PTTFKPPNDY WLLISSNTNG VVYESTNNND

FWTAVSSVEP HVSQTNRQYI LFGENKQFNV ENNSDKWKFF ETFTGSSQGN

FSNRRTLTSS NRLVGMLKYG GRVWTFHGET PRATTDSSNT ADLNNISIII

HSEFYIIPRS QESKCNEYIN NGLPPIQNTR NVVPLSLSSR SIQYKRAQVN

EDITISKTSL WKEMQYNRDI IIRFKFGNSII KLGGLGYKW SEISYKAANY

QYSYSRDGEQ VTAHTTCSVN GVNNFSYNGG SLPTDFSISR YEVIKENSYV

YIDYWDDSKA FRNMVYVRSL AANLNSVKCT GGSYNFRLPV

GKWPIMNGGA VSLHFAGVTL STQFTDFVSL NSLRFRFSLT VDEPSFSIIR

TRTINLYGLP AANPNNGNEY YEMSGRFSLI SLVQTNDDYQ TPIMNSVTVR

QDLERQLNDL REEFNSLSQE IAMSQLIDLA LLPLDMFSMF SGIKSTIDLT

KSMATSVMKK FRKSKLATSI SEMTNSLSDA ASSASRSASI RSNLSTISNW

TNTSKSVSNV TDSVNDVSTQ TSTISKKLRL REMITQTEGL SFDDISAAVL

KTKIDMSTQI GKNTLPDIVT EASEKFIPKR SYRVLKDDEV MEINTEGKFF

AYKVDTLNEI PFDINKFAEL VTDSPVISAI IDFKTLKNLN DNYGITRIEA

FNLIKSNPNV LRNFINQNNP IIRNRIEQLILQCKL

<210>9

<211>775

<212>PRT

<213>轮状病毒M37毒株的VP8

<220>

<400>9

MASLIYRQLL TNSYSVELSD EINTIGSEKT QNVTINPGPF AQTNYAPVVL

ESWEVNDSTT IEPVLDGPYQ PTSFKPPSDY WILLNPTDQQ VVLEGTNKTD

IWIALLLVEP NVTNQSRQYT LFGETKQITV ENNTNKWKFF EMFRKNVSAE

FQHKRTLTSD TKLAGFLKHY NSVWTFHGET PHATTDYSST SNLSEVETVI

HVEFYIIPRS QESKCVEYIN TGLPPMQNTR NIVPVALSSR SVTYQRAQVN

EDIIISKTSL WKEMQCNRDI IIRFKFNNSI VKLGGLGYKW SEISFKAANY

QYNYLRDGEQ VTAHTTCSVN GVNNFSYNGG SLPTDFSVSR YEVIKENSYV

YVDYWDDSQA FRNMVYVRSL AANLNSVKCS GGNYNFQLPV

GAWPVMSGGA VSLHFAGVTL STQFTDFVSL NSLRFRFSLT VEEPPFSILR

TRVSGLYGLP AFNPNSGHEY YEIAGRFSLI SLVPSNDDYQ TPIMNSVTVR

QDLERQLGDL REEFNSLSQE IAMTQLIDLA LLPLDMFSMF SGIKSTIDAA

KSMATKVMKK FKRSGLATSI SELTGSLSNA ASSISRSSSI RSNISSISVW

TDVSEQIAGS SDSVSNISTQ MSAISRRLRL REITTQTEGM NFDDISAAVL

KTKIDRSTHI SPDTLPDIMT ESSKKFIPKR AYRVLKDDEV MEADVDGKFF

AYKVDTFEEV PFDVDKFVDL VTDSPVISAI IDFKTLKNLN DNYGITRSQA

LDLIRSDPRV LRDFINQNNP IIKNRIEQLI LQCRL

<210>10

<211>326

<212>PRT

<213>轮状病毒Wa毒株的VP7

<220>

<400>10

MYGIEYTTIL IFLISIILLN YILKSVTRIM DYIIYRFLLI TVALFALTRA

QNYGLNLPIT GSMDAVYTNS TQEEVFLTST LCLYYPTEAS TQINDGDWKD

SLSQMFLTKG WPTGSVYFKE YSNIVDFSVD PQLYCDYNLV LMKYDQSLEL

DMSELADLIL NEWLCNPMDV TLYYYQQSGE SNKWISMGSS CTVKVCPLNT

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KLGPRENVAV IQVGGSNVLD ITADPTTNPQ TERMMRVNWK

KWWQVFYTIV DYINQIVQVM SKRSRSLNSA AFYYRV

<210>11

<211>326

<212>PRT

<213>轮状病毒DS1毒株的VP7

<220>

<400>11

MYGIEYTTIL TILISIILLN YILKTITNTM DYIIFRFLLL IALISPFVRT

QNYGMYLPIT GSLDAVYTNS TSGEPFLTST LCLYYPAEAK NEISDDEWEN

TLSQLFLTKG WPIGSVYFKD YNDINTFSVN PQLYCDYNVV LMRYDNTSEL

DASELADLIL NEWLCNPMDI SLYYYQQSSE SNKWISMGTD CTVKVCPLNT

QTLGIGCKTT DVNTFEIVAS SEKLVITDVV NGVNHKINIS INTCTIRNCN

KLGPRENVAI IQVGGPNALD ITADPTTVPQ VQRIMRINWK KWWQVFYTVV

DYINQVIQVM SKRSRSLDAA AFYYRI

<210>12

<211>326

<212>PRT

<213>轮状病毒M37毒株的VP7

<220>

<400>12

MYGIEYTTIL IFLISVILLN YILKSVTRIM DYIIYRSLLI TVALFALTRA

QNYGLNLPIT GSMDTIYANS TREGIFLTST LCLYYPTEAS TQISDGEWKD

SLSQMFLTKG WPTGSVYFKE YSSIVDFSVD PQLYCDYNLV LMKYDQNLEL

DMSELADLIL NEWLCNPMDI TLYYYQQSGE SNKWISMGSS CTVKVCPLNT

QTLGIGCRTT NVDSFEMVAE NEKLAIVDVV DGINHKINLT TTTCTIRNCK

KLGPRENVAV QVGGSNVLD ITADPTTNPQ TERMMRVNWK

RWWQVFYTIV DYINQIVQVM SKRSRSLNSA AFYYRV

<210>13

<211>1059

<212>DNA

<213>编码轮状病毒VP7的核苷酸

<220>

<400>13

GGCTTTAAAA GAGAGAATTT CCGTCTGGCT AACGGTTAGC

TCCTTTTAAT GTATGGTATT GAATATACCA CAATTCTAAT CTTTTTGATA

TCAATCATTC TACTCAACTA TATATTAAAA TCAGTGACTC

GAATAATGGA CTACATTATA TATAGATTTT TGTTGATTAC TGTAGCATTA

TTTGCTTTGA CAAGAGCTCA GAATTATGGA CTTAACTTAC

CAATAACAGG ATCAATGGAC GCTGTATATA CTAACTCTAC

TCAAGAAGAA GTGTTTCTAA CTTCTACGTT ATGTCTGTAT TATCCAACTG

AAGCAAGTAC TCAAATCAAT GATGGTGACT GGAAAGACTC

ATTGTCGCAA ATGTTTCTTA CAAAGGGTTG GCCAACAGGA

TCTGTTTACT TTAAAGAGTA CTCAAATATT GTTGATTTTT CTGTTGACCC

ACAGCTGTAT TGTGACTATA ATTTAGTACT TATGAAATAT

GACCAAAGTC TTAAATTAGA TATGTCAGAG TTAGCTGATT

TAATATTGAA TGAATGGTTA TGTAACCCAA TGGATGTAAC

ATTATACTAT TATCAACAAT CGGGAGAATC AAATAAGTGG

ATATCGATGG GATCATCATG TACCGTGAAA GTGTGTCCGC

TAAATACACA AACGTTAGGG ATAGGTTGTC AAACAACAAA

CGTAGACTCA TTTGAAATGA TTGCTGAGAA TGAGAAATTA

GCTATAGTGG ATGTCGTTGA TGGGATAAAT CATAAAATAA

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Claims

1.一种具有免疫原性的细菌多糖-蛋白结合疫苗，其特征在于，所述的细菌多糖-蛋白结合疫苗中的蛋白为具有免疫原性的重组轮状病毒蛋白。

2.根据权利要求1所述的具有免疫原性的细菌多糖-蛋白结合疫苗，其特征在于，所述的细菌多糖以共价键与重组轮状病毒蛋白相连接。

3.根据权利要求1所述的具有免疫原性的细菌多糖-蛋白结合疫苗，其特征在于，所述的重组轮状病毒蛋白选自P基因型轮状病毒毒株的病毒蛋白的部分氨基酸序列或全序列。

4.根据权利要求3所述的具有免疫原性的细菌多糖-蛋白结合疫苗，其特征在于，所述的P基因型轮状病毒毒株选自P[8]、P[4]、P[6]或P[11]基因型中的至少一种。

5.根据权利要求1所述的具有免疫原性的细菌多糖-蛋白结合疫苗，其特征在于，所述的P基因型轮状病毒毒株选自P[8]G1，P[4]G2，P[8]G3，P[8]G4，P[8]G9，P[8]G5或P[6]G8中的至少一种。

6.根据权利要求1所述的具有免疫原性的细菌多糖-蛋白结合疫苗，其特征在于，所述重组轮状病毒蛋白选自VP8，VP4，VP8多肽链片段，核VP8，VP4多肽链片段，VP8特异性抗原簇肽链，VP4特异性抗原簇肽链中的至少一种，其中优选VP8、核VP8。

7.根据权利要求4所述的具有免疫原性的细菌多糖-蛋白结合疫苗，其特征在于，所述的P基因型P[8]的轮状病毒毒株选自Wa，Ku，P，YO，MO，VA70，D，AU32，CH-32，CH-55，CHW2，CH927A，W161，F45，Ai-75，Hochi，Hosokawa，BR1054，WT78或W179毒株中的至少一种。

8.根据权利要求4所述的具有免疫原性的细菌多糖-蛋白结合疫苗，其特征在于，所述的P基因型P[4]的轮状病毒毒株选自DS-1，RV-5，S2，L26，KUN，E210，CHW17，AU64，107E18，MW333或TB-Chen毒株中的至少一种。

9.根据权利要求4所述的具有免疫原性的细菌多糖-蛋白结合疫苗，其特征在于，所述的P基因型P[6]的轮状病毒毒株选自M37，1076，RV-3，ST3，SC2，BrB，McN13，US1205，MW023，US585，或AU19毒株中的至少一种。

10.根据权利要求1所述的具有免疫原性的细菌多糖-蛋白结合疫苗，其特征在于，所述的重组轮状病毒蛋白选自G血清型轮状病毒的VP7蛋白的部分氨基酸序列或全序列。

11.根据权利要求10所述的具有免疫原性的细菌多糖-蛋白结合疫苗，其特征在于，所述的G血清型轮状病毒毒株选自G1，G2，G3，G4，G9，G5，G8，G10或G11血清型中的至少一种。

12.根据权利要求10所述的具有免疫原性的细菌多糖-蛋白结合疫苗，其特征在于，所述G血清型轮状病毒的毒株选自P[8]G1，P[4]G2，P[8]G3，P[8]G4，P[8]G9，P[8]G5或P[6]G8中的至少一种。

13.根据权利要求1所述的具有免疫原性的细菌多糖-蛋白结合疫苗，其特征在于，所述的细菌多糖选自革兰氏阳性菌荚膜多糖，革兰氏阴性菌O-特异性多糖，革兰氏阳性菌荚膜多糖片段，革兰氏阳性菌荚膜寡聚糖中的至少一种。

14.根据权利要求13所述的具有免疫原性的细菌多糖-蛋白结合疫苗，其特征在于，所述的革兰氏阳性菌荚膜多糖选自肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、15B、18C、19A、19F、23F，流行性嗜血杆菌b型，脑膜炎球菌A、C、Y或W135群细菌中的至少一种。

15.根据权利要求13所述的具有免疫原性的细菌多糖-蛋白结合疫苗，其特征在于，所述的革兰氏阴性菌选自大肠杆菌O-157、伤寒杆菌、副伤寒杆菌或霍乱弧菌细菌中的至少一种。

16.一种编码权利要求3或10所述的重组轮状病毒蛋白的核苷酸序列。

17.一种重组蛋白表达系统，其特征在于，所述的重组蛋白表达系统含有权利要求16所述的核苷酸序列。

18.根据权利要求17所述的重组蛋白表达系统，其特征在于，所述的重组蛋白表达系统选大肠杆菌表达系统、昆虫杆状病毒表达系统、CHO细胞表达系统或酵母表达系统。

19.权利要求17所述的重组蛋白表达系统表达的蛋白，其特征在于，所表达的蛋白含有权利要求3或10所述的氨基酸序列。

20.根据权利要求19所述的蛋白，其特征在于，所述的蛋白为轮状病毒非结构性蛋白NSP4与权利要求3或10所述的氨基酸序列构成的融合蛋白。

21.权利要求1所述的具有免疫原性的细菌多糖-蛋白结合疫苗的制备方法，其特征在于，所述的细菌多糖和轮状病毒蛋白是在水溶液或有机溶剂通过化学合成反应得到结合物。

22.根据权利要求21所述的制备方法，其特征在于，所述的有机溶剂选自二甲基亚砜或二甲基甲酰胺。

23.根据权利要求21所述的制备方法，其特征在于，所述的化学合成反应选自还原胺法、己二酰二肼法或1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐法中的一种。

24.根据权利要求21所述的制备方法，其特征在于，所述的制备方法还包括细菌多糖的前处理、重组轮状病毒蛋白的表达和纯化以及结合物的纯化。

25.根据权利要求24所述的制备方法，其特征在于，所述的细菌多糖的前处理包括降解和活化，所述的降解方法选自酸水解法、碱水解法、超声法、酶消化法或微射流法，优选微射流法。

26.根据权利要求1所述的具有免疫原性的细菌多糖-蛋白结合疫苗，其特征在于，所述的免疫原性结合疫苗为冻干剂或水剂。

27.根据权利要求26所述的具有免疫原性的细菌多糖-蛋白结合疫苗，其特征在于，所述的免疫原性结合疫苗中含有佐剂。

28.根据权利要求26所述的具有免疫原性的细菌多糖-蛋白结合疫苗，其特征在于，所述的佐剂为氢氧化铝、磷酸铝、氢氧化铝和磷酸铝混合物中的至少一种。

29.一种具有免疫原性的肺炎球菌多糖-重组轮状病毒蛋白结合疫苗，其特征在于，所述的重组轮状病毒蛋白选自权利要求7所述毒株的至少一种、权利要求8所述毒株的至少一种或权利要求9所述毒株中的至少一种，所述的肺炎球菌多糖选自血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、15B、18C、19A、19F、23F中的至少一种。

30.根据权利要求29所述的具有免疫原性的肺炎球菌多糖-重组轮状病毒蛋白结合疫苗，其特征在于，所述的重组轮状病毒蛋白为权利要求7所述毒株的至少一种、权利要求8所述毒株至少一种和权利要求9所述毒株至少一种所组成的轮状病毒蛋白。

31.根据权利要求30所述的具有免疫原性的肺炎球菌多糖-重组轮状病毒蛋白结合疫苗，其特征在于，所述的重组轮状病毒蛋白来源于毒株Wa、DS-1和M37。

32.根据权利要求30所述的肺炎球菌多糖-重组轮状病毒蛋白结合疫苗，其特征在于，所述的重组轮状病毒蛋白来源于毒株Wa和DS-1。