CN115721711A

CN115721711A - 一种肺炎球菌荚膜多糖-带状疱疹病毒重组蛋白结合疫苗及其制备方法

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Publication number: CN115721711A
Application number: CN202211335608.0A
Authority: CN
Inventors: 赵娜; 刘苏艳
Original assignee: Puda Biotechnology Taizhou Co ltd
Current assignee: Puda Biotechnology Taizhou Co ltd
Priority date: 2022-10-28
Filing date: 2022-10-28
Publication date: 2023-03-03
Anticipated expiration: 2042-10-28
Also published as: CN115721711B

Abstract

本发明属于疫苗技术领域，涉及一种具有免疫原性的肺炎球菌荚膜多糖‑带状疱疹病毒重组蛋白结合疫苗，具体涉及一种采用带状疱疹病毒重组糖蛋白与肺炎球菌荚膜多糖以共价键连接的结合疫苗。本发明还涉及一种编码发明所述带状疱疹病毒重组蛋白的核苷酸序列、重组蛋白表达系统、以及这种结合疫苗的制备方法。本发明还涉及一种肺炎球菌荚膜多糖‑带状疱疹病毒重组蛋白结合疫苗，其中，所述带状疱疹病毒重组蛋白氨基酸序列选自gE糖蛋白中的ORF68部分氨基酸序列或ORF68的氨基酸全序列中至少一种。本发明的肺炎球菌多糖‑带状疱疹病毒重组蛋白结合疫苗，可用一种疫苗产品来同时预防两种常见老年人疾病，即肺炎及带状疱疹。

Description

一种肺炎球菌荚膜多糖-带状疱疹病毒重组蛋白结合疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于疫苗技术领域，涉及一种具有免疫原性的肺炎球菌荚膜多糖-带状疱疹病毒重组蛋白结合疫苗及其制备方法。

背景技术

由肺炎球菌引起的感染是全世界各地发病和死亡的主要原因。肺炎、发热性菌血症和脑膜炎是侵袭性肺炎球菌病最常见的表现，而细菌在呼吸道内传播可导致中耳炎、鼻窦炎或复发性支气管炎。与侵袭性疾病相比，非侵入性疾病通常不严重，但更为常见。

在欧洲和美国，肺炎球菌性肺炎是最常见的社区性细菌性肺炎，估计每年每10万名成年人中约有100人感染。发热性菌血症和脑膜炎分别为每10万名成年人中约有15-19人和每10万人1-2人。在婴幼儿和老年人以及任何年龄的免疫缺陷者中，出现其中一种或多种这些疾病的风险要搞很多。即使在经济发达地区，侵袭性肺炎球菌导致的疾病死亡率也很高；患有肺炎球菌性肺炎的成人的死亡率约为10-20％，而高危人群的死亡率可能超过50％。肺炎是迄今世界范围内导致肺炎球菌感染者死亡的最常见原因。

在中国，65岁以上老年人的肺炎发病率为1.6％(每10万名成年人中约有1600人)，随着年龄的增长，肺炎的发病率急剧上升，75岁以上老年人肺炎的发病率高达11.6％；老年人不仅仅肺炎发病率高，感染肺炎后往往病程长，不易痊愈，严重者可导致死亡。有资料显示，46％-76％的社区获得性肺炎均由肺炎球菌所致。

肺炎球菌是一种革兰氏阳性菌，细菌外膜由一层荚膜多糖包裹，依据不同荚膜多糖化学结构的不同，并以特异性抗血清进行分类，现发现有91种不同血清型肺炎球菌。研究发现细菌多糖为非T细胞依赖性抗原，在儿童及成人中能够诱导短期免疫效应，但对婴幼儿无效。多糖能与主要组织相容性复合物(Major histocompatibility complex，MHC)结合，MHC是抗原呈现和刺激T-helper淋巴细胞必需组分。多糖在没有T-helper淋巴细胞帮助下能够刺激B淋巴细胞生产抗体。非T细胞依赖的B淋巴细胞的刺激结果导致这种抗原诱导的免疫效应缺乏记忆效应。

多糖与载体蛋白共价键结合，将非T-细胞依赖性抗原转变为T-细胞依赖性抗原。结合物中的多糖组分与B细胞结合后可活化T-Helper细胞，该T-Helper细胞是特异性识别结合物载体蛋白中的多肽部分。T-Helper细胞对载体蛋白响应可放大多糖抗体产量。采用该技术制备的疫苗为肺炎球菌多糖结合疫苗，可用于预防肺炎球菌引起的疾病。目前临床上广泛使用的是13价肺炎球菌多糖结合疫苗(PCV13)，其中含有1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F及23F血清型多糖，该疫苗是全球应用最广的疫苗之一。

目前，多糖结合疫苗产品向多价多糖结合疫苗方向开发，目前临床试验中的肺炎结合疫苗产品含有20价和24价，以提高疫苗的覆盖率。但是，这些结合疫苗有一个共同缺点，就是载体蛋白没有赋予免疫原性的保护功能；也就是说，尽管结合疫苗载体能够刺激机体产生抗体，但是，疫苗设计者并没有能够利用载体蛋白产生的抗体来预防疾病。破伤风类毒素、白喉类毒素和白喉无毒变异株毒素等被用作载体蛋白的主要原因，并不是因为它们产生的抗体具有保护性，而是从其安全性和能够增强结合物中多糖的免疫原性来考虑。另外，破伤风类毒素和白喉类毒素已经是百白破三联疫苗中的二个组分，用于常规接种，所以结合疫苗中的载体蛋白是否能刺激机体产生保护性抗体并不重要。

水痘带状疱疹病毒(Varicella-zoster virus，VZV)是一种普遍存在的人类α疱疹病毒，可引起水痘(Varicella)和带状疱疹(Herpes zoster)。人类原发性VZV感染时，常见于儿童，导致发热，以及全身瘙痒的水疱疹，称之为水痘。此后，VZV潜伏在背根神经节。带状疱疹是一种局部的，疼痛的，一个或一连串皮肤上的疱疹，是由于VZV再激发的结果。可发病于任何年龄，但其发病率随年龄的增加显著增加，是老年人群易患的感染性疾病之一。据统计，中国每年新发带状疱疹病例高达156万人。带状疱疹通常发生于腰骶部及面部。急性期疼痛非常剧烈，严重影响患者日常生活及工作。而现今带状疱疹的治疗多以抗病毒及对症治疗为主，尚无特效药。

VZV病毒由核衣壳包裹一个线性、双链DNA构成，有一个蛋白层将核衣壳与酯包被(lipid envelope)分离，这个蛋白层组成了主要的病毒糖蛋白。VZV生产约六种糖蛋白，现标明为gB，gC，gE，gH，gI和gL，这些蛋白在病毒繁殖时，也表达在被感染的细胞膜表面。在被感染的细胞中，gE蛋白是产生最多的蛋白，它以非共价键形式与gI吸附，可与抗体G(IgG)的Fc片段吸附。gB蛋白是中和性抗体结合的目标，在病毒进入细胞中起重要作用。gH蛋白具有融合功能，便于病毒在细胞与细胞间的扩散；gH蛋白需要gL蛋白存在进行糖基化和向细胞表面转移。gC蛋白对VZV繁殖没有功能性。gE基因，开放阅读框架(Open reading frame，ORF)68，是在VZV基因组的Us区域，这个蛋白加上信号肽共含623氨基酸序列，gE蛋白包含有蛋白主体，一个疏水锚定区域(氨基酸残基546-558)，以及一个C末端尾区域。

目前市场上有两种带状疱疹疫苗，在2006年，默沙东的康栢苗(Zostavax)获批上市。该疫苗为减毒活疫苗。Zostavax在50-59岁人群中的保护效力为69.8％，60-69岁人群中的保护效力为65.5％，70岁以上人群中保护效率仅为55.4％。

2019年5月22日，葛兰素史克的Shingrix在中国获批上市，Shingrix对50岁以上人群的保护效力为97.2％，对70岁以上人群的保护效力可达91.3％。该疫苗为带状疱疹病毒重组蛋白疫苗，含有糖蛋白gE和AS01B佐剂。区别Zostavax减毒活疫苗，疫苗中仅含带状疱疹糖蛋白。其中的AS01B佐剂则有助于增强免疫应答肺炎，亦可产生持续预防作用。现有研究显示，在美国，带状疱疹病毒重组蛋白疫苗Shingrix在所有年龄组中可降低超过90％的带状疱疹发病风险，接种四年后仍然有效。对70岁及以上人群的整体保护效果达到88.8％。

亚单位疫苗成功的关键在于选择有效的抗原和诱导适当的适应性免疫反应。不幸的是，免疫接种单独纯化蛋白抗原通常不足以诱导适当的免疫应答；因此，需要联合采用佐剂的免疫刺激成分。带状疱疹亚单位疫苗的另一个挑战是需要诱导CMI，可以起到一个治疗性效果，即限制潜伏VZV病毒和防止带状疱疹复活，而不仅仅是预防作用的体液免疫。Shingrix包含VZV的糖蛋白gE作为其抗原，因为gE是VZV最丰富的糖蛋白，含有潜在的中和作用表位和T细胞表位，对于病毒繁殖和在神经节细胞间传导具有关键性作用。目前gE蛋白作为疫苗制剂时，使用了QS21和单磷酸酯A(Monophosphoryl lipid A，MPL A)作为佐剂，这种佐剂被证明起协同作用，诱导AS01B佐剂系统的脂质体中的gE生产高频率CD4+T细胞。

适龄儿童需要接种至少15种疫苗，接种次数是疫苗种类的数倍，因此，多联多价疫苗的开发来取代单品种疫苗是疫苗领域首要任务。同时，由于人群的老龄化，仅中国老年人口已达三亿多，保护老年人的健康，开发针对于老年人的疫苗产品也是目前疫苗领域热点。

宿主采用多种主动和被动免疫机制来抵御感染，主动免疫由先天性和获得性免疫系统介导。先天免疫通过暴露于进化保守分子结构，所谓病原体相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)，而这些分子结构由多种传染病病原体产生。PAMPs识别是由模式识别受体介导，包括Toll-like受体(TLRs)，Nod-like受体和RIG-I-like受体。TLRs是构成模式识别受体中最多，研究最广泛的类别之一。TLR激活引起的先天免疫响应的主要特征是产生促炎细胞因子、趋化因子、I型干扰素，和抗菌肽。

先天免疫提供了主动防御感染性病原体的第一道防线，限制病原体在体内的早期繁殖和扩散。随后，宿主启动以抗原特异性T细胞和B细胞扩增为特征的获得性免疫响应，导致产生高亲和力抗体和细胞毒性T细胞，提供杀菌免疫并确保防止随后的感染的长期记忆。细菌DNA为一种PAMPs，是激活先天性免疫系统的一个例证。非甲基化CG二核苷酸在原核DNA出现频率高，但在真核DNA中罕见。感染过程中释放的细菌DNA，是表达TLR-9受体的细胞暴露于这些非甲基化CpG基序(CpG Motifs)(由中央未甲基化CG二核苷酸加侧翼区域组成)，从而触发宿主消除病原体能力的保护性免疫响应。合成含有去甲基化CpG基序的寡核苷酸(oliogodeoxynucleotides，ODNs)是模拟细菌DNA免疫刺激活性，被靶细胞吞噬后，CpG ODN到达内质网/溶菌体后室，通过与TLR-9相互作用发出信号。B细胞和浆细胞样树突状细胞(pDCs)是人类表达TLR-9受体和响应CpG刺激的主要细胞类型。有实验结果表明，在免疫了肺炎多糖结合疫苗二剂后，再免疫肺炎多糖疫苗时，由于TLR9刺激剂的CpG佐剂作用，动物的PBMCs响应肺炎多糖的刺激作用，增加促炎性细胞因子的释放。

疫苗领域产品的特点是一种疫苗可预防特异性病原体的感染，比如，肺炎球菌多糖结合疫苗可预防由肺炎球菌感染引起的肺炎、脑膜炎及中耳炎，带状疱疹病毒重组蛋白疫苗可预防带状疱疹病毒复活导致的带状疱疹。为了达到一个制剂可预防多种病原体感染，目前采用的手段是联合疫苗，如儿童用白喉、百日咳、破伤风三联、儿童用白喉、百日咳、破伤风、脊髓灰质炎和流感嗜血杆菌五联、儿童用白喉、百日咳、破伤风、脊髓灰质炎、流感嗜血杆菌及乙型肝炎六联，这些疫苗都是由单一产品疫苗混合制备，到目前临床评估来看，部分联合苗中的单苗的预防效果不佳。

当今社会人类医疗水平不断提高，人口出生率不断下降，儿童用疫苗市场不断成熟和饱和。而老年人口急速增加，满足老年人的健康需求是疫苗领域的新挑战。开发能够满足老年人的健康需求的疫苗具有很大的社会价值和市场价值。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明利用结合疫苗中的载体蛋白具有抗原性，设计一套合成方案，使得免疫后载体蛋白产生的抗体具有保护作用，具体的方案就是采用带状疱疹病毒重组gE蛋白作为载体蛋白，免疫结合疫苗后，载体蛋白产生的抗体具有中和带状疱疹病毒，达到预防带状疱疹的目的。

本发明的技术方案如下：

在本发明的第一方面，提供了一种具有免疫原性的肺炎球菌荚膜多糖-带状疱疹病毒重组蛋白结合疫苗，所述肺炎球菌荚膜多糖-带状疱疹病毒重组蛋白结合疫苗中的蛋白为具有免疫原性的带状疱疹病毒重组糖蛋白。

进一步地，所述的肺炎球菌荚膜多糖以共价键与带状疱疹病毒重组蛋白相连接。

进一步地，所述的带状疱疹病毒重组蛋白选自gE糖蛋白。

进一步地，所述带状疱疹病毒重组蛋白氨基酸序列选自gE糖蛋白中的ORF68部分氨基酸序列或ORF68的氨基酸全序列中至少一种。

在本发明的一个实施方式中，所述具有免疫原性的肺炎球菌荚膜多糖-带状疱疹病毒重组蛋白结合疫苗，所述的带状疱疹病毒重组蛋白选自gE糖蛋白，其氨基酸序列如SEQID No：1或SEQ ID No：2所示，所述的肺炎球菌荚膜多糖选自血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F及23F中的至少一种。

进一步地，所述具有免疫原性的肺炎球菌荚膜多糖-带状疱疹病毒重组蛋白结合疫苗，其制剂形式为水剂或冻干剂。

进一步地，所述具有免疫原性的肺炎球菌荚膜多糖-带状疱疹病毒重组蛋白结合疫苗中含有佐剂。

进一步地，所述的佐剂为CpG、QS21、磷酸铝、CpG与磷酸铝混合物、或QS21与磷酸铝混合物中的一种。

在本发明的第二方面，提供了编码如第一方面所述的带状疱疹病毒重组蛋白的核苷酸序列。

在本发明的第三方面，提供了含有如第二方面所述的核苷酸序列的重组表达载体，所述的重组表达载体。

所述的重组表达载体的构建方法如下：

1)VZV gE目的基因的合成

gE糖蛋白基因的ORF68经过截短，去掉跨膜区及胞内区，保留N端546个氨基酸。在该区段基因C端加入限制性核酸内切酶EcoRI序列，N端加入限制性核酸内切酶XbaI序列，化学合成设计的核苷酸序列。

2)质粒扩增及目的基因提取

pUC19质粒载体经EcoRI和XbaI限制酶双酶切后与合成的基因连接，导入扩增宿主DH5α，用LB(Amp+)琼脂固体培养基筛选单克隆；含有目的基因的单克隆接种于LB(Amp+)液体培养基中，37℃，200rpm培养扩增，提取质粒pUC19-gE；利用EcoRI和XbaI限制酶双酶切提取的质粒，回收目的基因片段gE。

3)真核表达载体的构建

利用EcoRI和XbaI限制酶双酶切哺乳动物细胞表达质粒pGN-M，该质粒包含CMV启动子和二氢叶酸还原酶(DHFR)基因，回收载体DNA片段；载体DNA片段与目的基因片段通过粘末端方式连接并导入DH5α扩增宿主，筛选获得包含真核表达质粒pGN-M_gE的单克隆；接种于LB(Amp+)进行扩增培养，抽提扩增的质粒，命名该质粒为VZVgE。

在本发明的第四方面，提供了利用如第三方面所述的重组表达载体制备带状疱疹病毒重组蛋白的表达方法，所述的表达方法采用CHO细胞表达系统或昆虫杆状病毒表达系统。

在本发明的第五方面，提供了如第一方面所述的具有免疫原性的肺炎球菌荚膜多糖-带状疱疹病毒重组蛋白结合疫苗的制备方法，所述的肺炎球菌荚膜多糖和带状疱疹病毒重组蛋白是在缓冲液或有机溶剂中，通过化学合成反应得到的结合物。

进一步地，所述的有机溶剂选自二甲基亚砜或二甲基甲酰胺。

进一步地，所述化学合成反应选自还原胺法、1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate法，己二酰二肼法或1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐法中的一种。

进一步地，所述的制备方法还包括肺炎球菌荚膜多糖的前处理、带状疱疹病毒重组蛋白的表达和纯化以及结合物的纯化。

进一步地，所述的多糖前处理包括降解和活化，所述的降解方法选自高压均质机降解、酸水解法、或酶消化法。

本发明具有如下技术效果：

1)本发明提供了一种创新型疫苗，肺炎球菌多糖-带状疱疹病毒重组蛋白结合疫苗，可用一种疫苗产品来同时预防两种常见老年人疾病，即肺炎及带状疱疹。这两种疾病是当前老年人需预防，同时两种疫苗接种程序完全相同，是一种非常适用老年人临床应用的疫苗产品设计。

2)本发明还提供了一种多价肺炎球菌-带状疱疹病毒重组蛋白结合疫苗制备方法，带状疱疹重组蛋白是以基因重组技术生产的氨基酸部分序列或全序列，在与新型佐剂制剂，并免疫动物后，结合物多糖抗原部分可刺激机体产生特异性血清型多糖抗体，载体蛋白部分可刺激机体产生针对于带状疱疹病毒的体液免疫(保护性抗体)和细胞免疫，达到一种肺炎球菌-带状疱疹病毒重组蛋白结合物疫苗免疫后，可同时预防肺炎球菌及带状疱疹的感染。

3)另外，从具体实施方式可以看出，本发明的13价肺炎球菌多糖-带状疱疹病毒重组蛋白结合疫苗，相对于13价肺炎球菌多糖-CRM197结合疫苗，由于用带状疱疹重组蛋白作为载体蛋白，对多糖的抗原性增强效果更好。含佐剂的13价肺炎多糖-gE结合疫苗，在gE抗原或病毒刺激下，被致敏免疫细胞产生IFN-γ；采用13价肺炎多糖-gE结合疫苗致敏的免疫细胞生产的IFN-γ明显高于含佐剂gE疫苗。上述结果证明了本发明的13价肺炎球菌多糖-带状疱疹病毒重组蛋白结合疫苗，具有协同增效的预料不到的技术效果。

附图说明

图1为在生物反应器中进行gE细胞培养过程中细胞活化率变化。

图2为在生物反应器中进行gE细胞培养过程中gE蛋白产量变化。

具体实施方式

以上对本发明进行了概括，为了进一步详细说明和理解，可以阅读以下具体例子。描述这些例子的目的仅是为了对本发明进行说明，而不是限制本发明在这些例子范围内。

实施例一：肺炎球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19、19F及23F荚膜多糖制备

(一)主种子和工作种子制备

肺炎球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19、19F及23F的发酵液中纯化荚膜多糖，具体方法如下：

肺炎球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19、19F及23F从美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection)获得，将冻干种子管中的菌种接种于5mL酵母(BD)-酸水解酪素(BD)培养液，36℃培养16小时，当细菌生长至OD600读数为1.0时，将菌液转接种至150mL的新鲜酵母-酸水解酪素培养液中，在36℃±2℃下，培养8小时至指数生长期，停止培养，分装冻干，储存于4℃为主种子。

肺炎球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19、19F及23F的主种子冻干管的菌种接种于5mL酵母-酸水解酪素培养液，36℃培养16小时，当细菌生长至OD600读数为1.0时将菌液转接种至150mL新鲜酵母-酸水解酪素培养液中，在36℃下，培养8小时至指数生长期，停止培养，分装冻干，储存于4℃为血清型的工作种子。

(二)细菌发酵

从工作种子库取出种子管接种至5mL酵母-酸水解酪素培养液中，在36℃培养至细菌生长指数中期。将菌液转接种至150mL新鲜酵母-酸水解酪素培养液中，在36℃培养下，培养8小时至指数生长期，将50mL菌液转接种至2L酵母-酸水解酪素培养液中，

在36℃下，培养至指数生长期中期而制备成发酵种子液，将发酵种子液接种至装有30升酵母-酸水解酪素培养液的50L发酵罐中。用氢氧化钠来维持发酵液pH在6.8，待细菌生长至指数后期。

(三)荚膜多糖纯化

1、加入磷酸(Sigma-Aldrich)调节发酵液pH至3-5之间，搅拌1小时；

2、通过碟片式离心机(阿法拉伐)进行离心，离心速度9600rpm，收集离心上清液，丢弃排渣部分；

3，用微滤膜(Millipore)对离心液进行微滤，以去除其中的残留细胞碎片和不溶小颗粒物质，用0.22μm膜(科百特)微滤发酵离心上清液，收集过滤液；

4，采用100kD膜包(Millipore)对微滤液进行浓缩及洗滤，获得粗制细菌荚膜多糖溶液，再用缓冲液，以30Kd膜包(Millipore)超滤洗滤15个样品体积；

5、采用50kD膜包(Millipore)对多糖溶液进一步洗滤10样品体积，浓缩多糖样品溶液。

6、收集纯化多糖溶液至冻干瓶中，在真空冻干机上冻干，在-70℃下储存。

实施例二：带状疱疹病毒重组蛋白制备

水痘-带状疱疹病毒(v a r i c e l l a-z o s t e r v i r u s，V Z V)是疱疹病毒属(Herpesviridae)α疱疹病毒亚科成员，即Human herpesvirus 3。

gE(glycoprotein E，gE)由ORF68基因编码，该基因由1869个碱基组成，位于VZV基因组的短片段区，编码的gE含623个氨基酸(amino acid,AA)，其氨基酸序列如SEQ ID No：1所示。其N端为546个AA的亲水胞外区(含有信号肽)，C端是17AA的跨膜疏水区和62AA的胞内区。基因序列号GeneID:1487709。其氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。

(一)含水痘带状疱疹病毒gE蛋白基因(VZV gE)的CHO细胞表达株的构建

1、VZV gE目的基因的合成

完整的gE基因经过截短，去掉跨膜区及胞内区，保留N端546个氨基酸。在该区段基因C端加入限制性核酸内切酶EcoRI序列，N端加入限制性核酸内切酶XbaI序列，化学合成设计的核苷酸序列。

2、质粒扩增及目的基因提取

pUC19质粒载体经EcoRI和XbaI限制酶双酶切后与合成的基因连接，导入扩增宿主DH5α，用LB(Amp+)琼脂固体培养基筛选单克隆；含有目的基因的单克隆接种于LB(Amp+)液体培养基中，37℃，200rpm培养扩增，利用Sigma-Aldrich GenEluteTMHP质粒中量制备试剂盒提取质粒pUC19-gE；利用EcoRI和XbaI限制酶双酶切提取的质粒，利用TaKaRa MiniBestAgarose Gel Extraction Kit回收目的基因片段gE。

3、真核表达载体的构建

利用EcoRI和XbaI限制酶双酶切哺乳动物细胞表达质粒pGN-M，该质粒包含CMV启动子和二氢叶酸还原酶(DHFR)基因，利用TaKaRa MiniBEST DNA Fragment PurificationKit Ver.4.0回收载体DNA片段；载体DNA片段与目的基因片段通过粘末端方式连接并导入DH5α扩增宿主，筛选获得包含真核表达质粒pGN-M_gE的单克隆；接种于LB(Amp+)进行扩增培养，利用无内毒素质粒中提试剂盒TaKaRa MidiBEST Endo-free Plasmid PurificationKit抽提扩增的质粒，命名该质粒为VZVgE。

(二)糖蛋白E蛋白在CHO K1细胞中的表达和克隆筛选

以ATCC采购的CHO K1细胞为宿主细胞，细胞复苏后培养于10％新生牛血清的DMEM培养基(Sigma-Aldrich)中，每3天传代1次。代传2代后，观察细胞长势良好，然后CHO K1细胞按0.75×10⁶细胞/孔的三个9.6cm2孔中，其中加有Iscove’s优化DMEM培养基(Sigma-Aldrich)，并加有10％胎牛血清(IMEM+FBS)(Gibco)。细胞在湿度饱和的培养箱中，5％CO2和37℃下，每个孔中加有4μg的pcDNAVZVE载体，DNA与Lipofectamine 2000(Sigma-Aldrich)混合后加至其中两个孔中，Lipofectamine 2000单独加至第三个孔中作为阴性对照。48小时后，去除培养基，以200×g离心5分钟，将离心上清液储存在-20℃。加入IMDM+FBS培养液及10μg/mL的Blasticidin-HCl(Invitrogen)至转染细胞的一个孔中，用PBS洗另一个转染细胞孔，然后用50mM的Tris-HCl，pH 8,150mM NaCl，1％(v/v)Triton X-100containing complete，EDTA-free蛋白酶抑制剂混合液了溶解细胞(RocheDiagnostics)。在4℃下，以16000×g速度离心10分钟，将裂解液储存于-20℃。用Westernblot来检测上清液和裂解液中是否有重组蛋白gE。在选择性培养基中培养5天后，用胰蛋白酶(Invitrogen)洗脱细胞，然后再接种至9cm的Petri培养皿上进行系列稀释来分离单克隆细胞。再在后继7-11天中，挑选出42个单颗克隆，转移至一个96孔板上的孔中。用Westernblot来检测培养上清液，筛选高表达VZV gE。分泌最高量VZV gE蛋白的克隆进行下一轮筛选，最终扩增细胞，并筛选30个新克隆保存。

将所选的克隆扩增至三个T175瓶(NETS)中。加入胰蛋白酶消化，用PBS洗涤，再悬浮于250mL旋转瓶中装有100mL的ProCHO4(Lonza)，加有1×ProHT、4mM L-谷氨酰胺和2％FBS(Lonza)。在37℃的加湿培养箱中37℃下，5％CO2下，搅拌速度为90rpm，盖稍微打开以确保空气扩散进行培养。每日取样，用台盼蓝染色(Sigma-Aldrich)，对细胞进行计数，并每3-5天传代一次，当活细胞浓度高于0.3×106细胞/mL，活细胞数超过90％时的平台期后。当细胞适应并生长良好，逐渐去除BFS，此时细胞被认为完全适合无血清悬浮生长。

(三)在生物反应器中生产VZV gE蛋白

在3-升生物反应器中配置1.5升灌流培养，配置旋转过滤(10μm)分离器。培养参数设置为：通过加热毯控制温度在37℃，通过CO2或0.3M氢氧化钠调节pH在6.9，搅拌速度为200-300RPM，用最大流量为200mL/min的N2和O2混合气体调节溶氧(dO2)为饱和空气的40％。灌注率为0.3至0.8V稀释/每天，每天从培养液中取样进行细胞计数。采用台盼蓝染色，并用离线检测上清液中葡萄糖和乳酸浓度。

总共收集12.5升无细胞培养液，在4℃下，以8000×g离心30分钟，用0.45μm膜过滤，再用10kDa膜包进行超滤浓缩。用缓冲液进行超滤洗滤，并浓缩样品溶液体积至0.5升，加入0.5升PBS后，再浓缩至0.5升。以上步骤重复5次。

(四)生物反应器培养gE蛋白产量和产品特性

在接种细胞进行培养时，细胞密度为0.3×106/mL(见图一)，在随后以批培养模式培养75小时直到细胞密度达3.5×106/mL。到这个阶段，开始启动灌流培养模式进行培养，最初以每天0.3培养体积交换，然后在后继120小时内每天3.逐步增加至0.65培养体积，在后期保持在每天0.65-0.77之间。当细胞密度达到9×106/mL时，细胞快速停止生长，细胞活性率由初期90％以上，逐步降低至80％。

通过在western blot膜上染色gE蛋白进行密度图分析(image analysis)来评估目的蛋白产量，然后以培养容量产率来进行计算，记录为时空产率(mg/L/天)在培养至300小时期间，gE蛋白产量逐步增加，随后开始下降(见图二)，在培养380小时后停罐。

(五)VZV gE蛋白纯化

将样品溶液上样Q-Sepharose fast flow(GE Bioscience)柱，用20mM Tris-HClpH7.5洗柱。然后用加入了200mM氯化钠的20mM Tris-HCl pH7.5洗柱，进一步去除被吸附的蛋白杂质。用增加氯化钠溶液浓度至300mM的溶液洗脱gE蛋白。在合并液中加入硫酸铵至浓度为800mM，上样至Butyl-Sepharose(GE Bioscience)柱，用磷酸盐缓冲液(PBS，6mMNa2HPO4，1.5mM KH2PO4，0.15M氯化钠pH 6.8)加入了800mM硫酸铵洗柱，用含有400mM硫酸铵的PBS溶液洗柱，最终用纯化水洗脱gE蛋白。最终上样Sephacryl S-400HR(GEBioscience),用PBS洗柱，收集gE蛋白峰，加入助溶剂，在真空冻干机上冻干，储存于-70℃下，待用。

实施例三：肺炎球菌血清型Pn1、3、4、5、14、18C多糖-带状疱疹病毒重组蛋白结合物制备

1)称取相应血清型纯化荚膜多糖17.5mg，溶解4mL于磷酸钠缓冲液中；

2)加入12mg的1-氰基-4-二甲基铵吡啶四氟硼酸盐(CDAP)(Sigma-Aldrich)至多糖溶液中，搅拌，室温下反应1小时；

3)加入3Eqm胱胺，室温下反应1小时；

4)加入1M赖氨酸(Sigma-Aldrich)溶液0.3mL进行淬灭反应，室温下反应1-2小时；

5)加入8Eqm的3(2-氯乙基)磷酸酯至多糖溶液中，还原多糖中的二硫键；

6)将活化多糖溶液转移至透析袋，在4℃下，对磷酸盐缓冲液透析，换液四次；

7)称取30mg载体蛋白溶解于磷酸盐缓冲液中，蛋白浓度10mg/mL；

8)加入8mg溴乙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(BAANS)(Sigma-Aldrich)至载体蛋白溶液中，室温下反应2小时，将活化蛋白溶液转移至透析袋(Thermo Scientific)，在4℃下，对磷酸盐缓冲液透析，换液四次；

9)取活化多糖溶液4mL与活化蛋白溶液4mL混合，在室温下反应4小时；

10)加入4Eqm的N-乙酰-L半胱氨酸(Sigma-Aldrich)，在2-8℃下，反应4小时，加入12Eqm碘乙酰胺(Sigma-Aldrich)，在2-8℃下，反应4小时；

11)将多糖结合物反应液转移至透析袋，在4℃下，对磷酸盐缓冲液透析；

12)将样品溶液上样Sepharose CL-4B，过程纯化，收集外水体积结合物。

13)用0.22μm滤膜过滤后，置于2-8℃下保存待制剂。

实施例四：肺炎球菌血清型Pn6A、6B、7F、9V、19A、19F及23F多糖-带状疱疹病毒重组蛋白结合物制备

1)称取相应血清型纯化荚膜多糖500mg，溶解500mL于纯化水中；

2)通过高压均质机，在压力600bar，循环三次进行降解，加入0.12eqm高碘酸钠(Sigma-Aldrich)，避光，反应18小时；

3)用超滤洗滤，分子量为50Kd膜包，对纯化水进行超滤洗滤，并浓缩，冻干；

4)称取18mg活化多糖，加入4mL的DMSO，搅拌溶解完全；

5)加入19mg载体蛋白CRM197至DMSO(Sigma-Aldrich)溶液4mL，加入2Eqm氰基硼氢化钠(Sigma-Aldrich)，室温下反应22小时；

6)加入2Eqm硼氢化钠(Sigma-Aldrich)淬灭反应4小时后，转移合成反应液至透析袋中，对缓冲液透析，换液四次；

7)将样品溶液上样Sepharose CL4B，收集外水体积的结合物部分。

8)用0.22μm滤膜过滤后，置于4℃下保存待制剂。

9)取样检测结合物分子量，多糖蛋白浓度及比率。

CRM197为载体蛋白为传统多糖蛋白结合物的制备方法，本发明以此蛋白合成结合物并制剂作为与带状疱疹病毒重组蛋白作为载体蛋白合成结合物制剂的对照。实施例五和六是采用CRM197载体蛋白合成结合物。

实施例五：肺炎球菌血清型Pn1、3、4、5、14、18C多糖CRM197结合物制备

1)称取相应血清型纯化荚膜多糖10mg，溶解2mL于磷酸钠缓冲液中；

2)加入10mg的1-氰基-4-二甲基铵吡啶四氟硼酸盐(CDAP)(Sigma-Aldrich)至多糖溶液中，搅拌，室温下反应1小时；

3)加入3Eqm胱胺，室温下反应1小时；

4)加入1M赖氨酸溶液0.2mL进行淬灭反应，室温下反应1小时；

5)加入4Eqm的3(2-氯乙基)磷酸酯至多糖溶液中，还原多糖中的二硫键；

7)称取10mg载体蛋白溶解于1mL磷酸盐缓冲液中，蛋白浓度10mg/mL；

8)加入3mg溴乙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(BAANS)至载体蛋白溶液中，室温下反应2小时，将活化蛋白溶液转移至透析袋，在4℃下，对磷酸盐缓冲液透析，换液四次；

10)加入2Eqm的N-乙酰-L半胱氨酸，在4℃下，反应4小时，加入2Eqm碘乙酰胺，在4℃下，反应4小时；

13)用0.22μm滤膜过滤后，置于4℃下保存待制剂。

实施例六：肺炎球菌血清型Pn6A、6B、7F、9V、19A、19F及23F多糖CRM197结合物制备

1)称取相应血清型纯化荚膜多糖500mg，溶解500mL于纯化水中；

2)通过高压均质机，在压力600bar，循环三次进行降解，加入0.3Eqm高碘酸钠，避光，反应18小时；

4)称取10mg活化多糖，加入2mL的DMSO，搅拌溶解完全；

5)加入10mg载体蛋白CRM197的DMSO溶液2mL，加入3eqm氰基硼氢化钠，室温下反应22小时；

6)加入1Eqm硼氢化钠淬灭反应4小时后，转移合成反应液至透析袋中，对缓冲液透析，换液四次；

7)将样品溶液上样Sepharose CL4B，收集外水体积的结合物部分。

8)用0.22μm滤膜过滤后，置于4℃下保存待制剂。

9)取样检测结合物分子量，多糖蛋白浓度及比率。

实施例七、13价肺炎球菌多糖-带状疱疹病毒重组蛋白结合疫苗+CpG+Alum(制剂A)

检测单价结合物中多糖浓度，分别量取相当于2.2μg多糖量(除Pn6B多糖量为4.4μg)，的带状疱疹病毒重组蛋白结合物溶液(见实施例三和四)，包括Pn1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F及23F至无菌容器中，取样检测蛋白含量为39.2μg，加入CpG(Genscript)，最终量为0.1mg，加入磷酸盐缓冲液pH 5.8缓冲液，用0.22μm膜除菌过滤；加入无菌磷酸铝胶，最终铝离子量为0.125mg，在4℃下搅拌1小时，无菌分装0.5mL/瓶，4℃下保存待，待免疫用。

实施例八：13价肺炎球菌多糖-CRM197结合疫苗+CpG+Alum(制剂B)

检测单价结合物中多糖浓度，分别量取相当于2.2μg多糖量(除Pn6B多糖量为4.4μg)由CRM197蛋白结合物溶液(见实施例五、和六)结合物溶液，包括Pn1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、19A、19F及23F至无菌容器中，取样检测蛋白含量为41.4μg，加入CpG，最终量为0.1mg，加入磷酸盐缓冲液pH5.8缓冲液，用0.22μm膜除菌过滤；加入无菌磷酸铝胶(Benetag)，最终铝离子量为0.125mg，在4℃下搅拌1小时，无菌分装0.5mL/瓶，4℃下保存待，待免疫用。

实施例九：制剂免疫兔及采血

取2.5-3.5公斤新西兰大白兔10只，5只一组，其中一组免疫制剂A，另一组免疫制剂B，每只兔注射0.5mL/次，分0周，2周各免疫一次；采血时间为0周免疫前，免疫后1周，第二次免疫后1周，共三次。一部分血液制备成PBMC，在干冰上速冻后低温保存，另一部分血液室温下放置4小时，在10000RPM，室温下离心，吸取离心上清血清，-70℃下保存待检测。

实施例十：ELISA法检测13价肺炎球菌多糖-gE结合疫苗兔免疫血清中多糖抗体滴度

分别配制不同血清型肺炎球菌多糖(1×PBS溶液)，存储于4℃冰箱。稀释待检血清型肺炎球菌多糖4μg/mL，加100μL包被溶液到每一个孔中来包被ELISA板，在室温下孵育过夜。用洗板缓冲液洗4次，加入100μL封闭缓冲液，在室温下孵育2小时，用洗板缓冲液洗4次，可在4℃下保存一周。

将兔注射疫苗及对照样品获得的相应待测血清1:10稀释成工作样品血清，稀释适当倍数，加入到ELISA板第一排孔内，总体积200μL，从第一排开始向下进行二倍系列稀释，在室温下孵育2小时。用洗板缓冲液洗4次，加入100μL碱性磷酸酶标记羊抗兔抗体(1:2000稀释)，在室温下孵育4小时。用洗板缓冲液洗4次，加入100μL磷酸-4-硝基苯酯二钠盐底物(Sigma-Aldrich)溶液，在405nm读盘。

表1：制剂A和B免疫兔后抗血清中肺炎多糖及带状疱疹病毒重组蛋白IgG抗体滴度检测结果

制剂A和制剂B的区别在于载体蛋白的不同，合成方法及佐剂基本相同。多糖和载体蛋白抗体IgG检测结果显示，免疫前，各血清型多糖抗体滴度无显著性差异，免疫第一针后，制剂A(带状疱疹重组蛋白载体)和制剂B(CRM197蛋白载体)刺激动物产生相应血清型多糖抗体IgG滴度根据血清型不同有所差异，如血清型1、3、4、6B、18C、19A、及23F结果显示制剂A要高于制剂B，占54％组分；血清型6A、14、及19F无显著性差异，占23％组分；血清型5、及7F制剂B稍高于制剂A，占15％。由此可见，采用带状疱疹病毒重组蛋白作为载体蛋白制备的制剂A要优于CRM197为载体蛋白制备的制剂B。免疫二针后，抗体IgG检测结果显示制剂A与制剂B差异更显著，血清型1、3、4、5、6A、7F、9V、14、及18C结果显示制剂A要高于制剂B，占69％组分，血清型6B、19A、19F无显著性差异，占23％组分；血清型23F检测结果显示制剂B稍高于制剂A，占7.7％组分。由此可见，用带状疱疹重组蛋白作为载体蛋白，对多糖的抗原性增强效果更好。

对于带状疱疹重组蛋白抗体滴度检测结果来看，随着免疫次数增加，抗体滴度显著增强，第二针免疫后的滴度显著高于第一针免疫后的IgG滴度。

实施例十一：带状疱疹重组蛋白与多价肺炎多糖-带状疱疹病毒重组蛋白结合物免疫小白鼠及采血和收集脾脏

取6周雌性BALB/c小白鼠,随机分组，每组8只，每隔两周皮下免疫一次，每次0.1mL，共免疫两次，免疫一周后采血，具体疫苗种类及剂量信息如下：

实施例十二：ELISA法检测带状疱疹病毒重组蛋白gE及13价肺炎球菌多糖-gE结合疫苗鼠免疫血清中gE蛋白抗体滴度

配制纯化gE蛋白储备液1mg/mL(1×PBS溶液)，存储于4℃冰箱。稀释gE蛋白储液至包被缓冲液4μg/mL，加100μL包被溶液到每一个孔中来包被ELISA板，在室温下孵育过夜。用洗板缓冲液洗4次，加入100μL封闭缓冲液，在室温下孵育2小时，用洗板缓冲液洗4次，可在4℃下保存一周。

将鼠注射疫苗及对照样品获得的相应待测血清1:10稀释成工作样品血清，稀释适当倍数，加入到ELISA板第一排孔内，总体积200μL，从第一排开始向下进行二倍系列稀释，在室温下孵育2小时。用洗板缓冲液洗4次，加入100μL碱性磷酸酶标记羊抗鼠抗体(1:2000稀释)，在室温下孵育4小时。用洗板缓冲液洗4次，加入100μL磷酸-4-硝基苯酯二钠盐底物溶液，在405nm读盘。

表2：不同疫苗免疫抗血清中抗gE的IgG抗体滴度几何平均值(Eu)

检测结果显示，疫苗制剂中如果无佐剂加入，带状疱疹重组蛋白gE抗原性低，无法制备成疫苗。而加入佐剂CpG+Alum后，抗原性显著提高，总IgG、IgG1、及IgG2a滴度都有提高。结果也可见，在多价肺炎球菌多糖-gE蛋白结合疫苗中，由于gE蛋白作为载体蛋白，总含量达39.3μg，显著高于常规带状疱疹病毒重组蛋白疫苗，其中免疫小鼠用gE蛋白量为5μg，因此，13价多糖-gE结合疫苗免疫血清中gE抗体，包括总IgG、IgG1、及IgG2a，都高于gE疫苗约一倍。当将13价多糖-gE结合疫苗稀释至蛋白浓度为5μg时，抗体滴度低于gE疫苗，其原因是gE蛋白在结合物合成过程中，蛋白表面抗原簇损失所致。

实施例十三：IFN-γELISpot和细胞因子检测

将实施例十一试验小鼠采血同时，收集脾脏，将脾脏研磨后，加入PBS pH7.4，悬浮后，进行梯度稀释，将获得的单细胞悬浮液加至ELISpot板中，其上预包被俘获抗体。加入5μg/mL的gE蛋白，VZV(100pfu/mL)，concanavalin A(1μg/mL，阳性对照)(Sigma-Aldrich)，在37℃，5％CO2下孵育24小时。用ELISpot试剂盒(MabTech)检测IFN-γ方面细胞，用CTL-ImmunoSpot S5UV Micro分析仪测定阳性点。

表3：不同疫苗免疫小鼠脾细胞中IFN-γSFC/10⁶细胞数量

加入了佐剂组分的疫苗，如含佐剂gE、含佐剂13价肺炎多糖-gE结合疫苗以及含佐剂13价多糖-gE结合疫苗稀释液，具备刺激动物体的脾脏中的免疫细胞，如NK细胞，吞噬细胞等，生产IFN-γ。检测结果可见，含佐剂的13价肺炎多糖-gE结合疫苗，在gE抗原或病毒刺激下，被致敏免疫细胞产生IFN-γ；采用13价肺炎多糖-gE结合疫苗致敏的免疫细胞生产的IFN-γ明显高于含佐剂gE疫苗；同样的原因，用含佐剂13价肺炎多糖-gE结合疫苗稀释液致敏的脾脏免疫细胞生产的IFN-γ数量较低。

以上仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims

1.一种具有免疫原性的肺炎球菌荚膜多糖-带状疱疹病毒重组蛋白结合疫苗，其特征在于，所述肺炎球菌荚膜多糖-带状疱疹病毒重组蛋白结合疫苗中的蛋白为具有免疫原性的带状疱疹病毒重组糖蛋白。

2.根据权利要求1所述的具有免疫原性的肺炎球菌荚膜多糖-带状疱疹病毒重组蛋白结合疫苗，其特征在于，所述的肺炎球菌荚膜多糖以共价键与带状疱疹病毒重组蛋白相连接。

3.根据权利要求1所述的具有免疫原性的肺炎球菌荚膜多糖-带状疱疹病毒重组蛋白结合疫苗，其特征在于，所述的带状疱疹病毒重组蛋白选自gE糖蛋白。

4.根据权利要求3所述的具有免疫原性的肺炎球菌荚膜多糖-带状疱疹病毒重组蛋白结合疫苗，其特征在于，所述带状疱疹病毒重组蛋白氨基酸序列选自gE糖蛋白中的ORF68部分氨基酸序列或ORF68的氨基酸全序列中至少一种。

5.根据权利要求1所述的具有免疫原性的肺炎球菌荚膜多糖-带状疱疹病毒重组蛋白结合疫苗，其特征在于，所述带状疱疹病毒重组蛋白选自gE糖蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNo：1或SEQ ID No：2所示，所述的肺炎球菌荚膜多糖选自血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F及23F中的至少一种。

6.根据权利要求1所述的具有免疫原性的肺炎球菌荚膜多糖-带状疱疹病毒重组蛋白结合疫苗，其特征在于，所述的结合疫苗，其制剂形式为水剂或冻干剂。

7.根据权利要求6所述具有免疫原性的肺炎球菌荚膜多糖-带状疱疹病毒重组蛋白疫苗，其特征在于，所述的结合疫苗中含有佐剂。

8.根据权利要求7所述的具有免疫原性的肺炎球菌荚膜多糖-带状疱疹病毒重组蛋白结合疫苗，其特征在于，所述的佐剂为CpG、QS21、磷酸铝、CpG与磷酸铝混合物、或QS21与磷酸铝混合物中的一种。

9.一种编码如权利要求3-4任意一项所述的带状疱疹病毒重组蛋白的核苷酸序列。

10.一种含有如权利要求9所述的核苷酸序列的重组表达载体。

11.利用如权利要求10所述的重组表达载体制备带状疱疹病毒重组蛋白的表达方法，其特征在于，所述的表达方法采用CHO细胞表达系统或昆虫杆状病毒表达系统。

12.如权利要求1-8所述的具有免疫原性的肺炎球菌荚膜多糖-带状疱疹病毒重组蛋白结合疫苗的制备方法，其特征在于，所述的肺炎球菌荚膜多糖和带状疱疹病毒重组蛋白是在缓冲液或有机溶剂中，通过化学合成反应得到的结合物。

13.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述的有机溶剂选自二甲基亚砜或二甲基甲酰胺。

14.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述化学合成反应选自还原胺法、1-cyano-4-dimethylamino pyridinium tetrafluoroborate法，己二酰二肼法或1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐法中的一种。

15.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述的制备方法还包括肺炎球菌荚膜多糖的前处理、带状疱疹病毒重组蛋白的表达和纯化以及结合物的纯化。

16.根据权利要求15所述的制备方法，其特征在于，所述的多糖前处理包括降解和活化，所述的降解方法选自高压均质机降解、酸水解法、或酶消化法。