WO2015115767A1 - 수두대상포진 바이러스의 당단백질 ε를 발현하는 인간 세포를 이용한 수두대 상포진 바이러스에 대한 면역력 진단 방법 - Google Patents

수두대상포진 바이러스의 당단백질 ε를 발현하는 인간 세포를 이용한 수두대 상포진 바이러스에 대한 면역력 진단 방법 Download PDF

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zoster virus
cell line
varicella zoster
antibody
varicella
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박준수
박송용
박천일
박호선
박락현
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연세대학교 원주산학협력단
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    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms

Definitions

  • the present invention relates to a method for diagnosing immunity against varicella zoster virus using human cells expressing glycoprotein E of varicella zoster virus, and more specifically, to express glycoprotein E of varicella zoster virus,
  • An isolated human cell line which is used for detecting the presence of anti- varicella zoster virus antibody in a sample by replacing cells infected with varicella zoster virus by FAMA (f luorescent ant ibody to membrane ant igen); and
  • FAMA f luorescent ant ibody to membrane ant igen
  • Chickenpox and herpes zoster diseases include varicella zoster virus (Varicel la zoster virus,
  • VZV is a viral infectious disease caused by infection.
  • Chickenpox is a viral epidemic that causes a red, back rash on a child's skin and then turns into a small blister. Commonly found in children, it is a highly infectious disease. It is infected by air through coughing or by contact with blisters. Chickenpox is a highly infectious disease that affects 80-90% of family members who do not have antibodies if they have a family member (Report on Centers for Disease Control, Ki Hyun Ok, 2011). 5% of chickenpox patients are adults, and the symptoms are severe, unlike children, which can lead to two weeks, complications such as pneumonia, and serious deaths.
  • Varicella is an alternative site caused by the varicel la-zoster virus (art. 26). This virus is also the virus that causes shingles. Chickenpox is a clinical reaction that results from the first exposure to the virus, and after the patient's clinical recovery, the virus may settle in the nerve cells and then reactivate several years later. Thus, it reaches the skin, causing herpes zoster.
  • Shingles is a disease that occurs when the varicella zoster virus is latent and activated due to a decrease in immunity. It has recently increased rapidly.
  • the sensitivity to shingles can be determined according to the presence of antibodies to varicella-zoster virus in the serum, and it is known that immunity against diseases caused by viral infections is known to have antibodies to varicella-zoster virus. (Breuer et al., 2008).
  • the FAMA method involves infecting human blood after infecting the human fibroblast line MRC5 with the varicella zoster virus. Antibodies in isolated plasma are fluorescently stained by binding to the varicella zoster glycovirus protein expressed on the surface of MRC5 cells (Zaia et al., 1977). There is a disadvantage that each cell line must be infected with the virus.
  • Allergens can be used to treat chickenpox varicella zoster virus, which also spreads to airborne disease, and is highly contagious, causing chickenpox-like diseases to test subjects who have not been infected with the virus.
  • the FAMA method is a dangerous method because it can cause serious problems if an adult does not have an infection, and there is an additional cost for pretreatment and post-treatment since experimenting with infectious virus.
  • the present inventors have studied to develop a method for safely measuring antibodies to varicella zoster virus without using dangerous varicella zoster virus.
  • the glycoprotein E the antigenic protein of the virus in the cell instead of infecting the varicella zoster virus cell line in FAMA method
  • the antibody against varicella zoster virus without using the varicella zoster virus It was confirmed that can be measured to complete the present invention.
  • an object of the present invention is to express glycoprotein E of varicella zoster virus
  • An isolated human cell line is used to detect the presence of anti- varicella zoster virus antibodies in a sample by replacing cells infected with varicella zoster virus by FAMA (f luorescent ant ibody to membrane ant igen). To provide.
  • FAMA fluorescent ant ibody to membrane ant igen
  • Another object of the present invention is to provide a composition for detecting varicella zoster virus comprising the cell line of the present invention as an active ingredient.
  • Another object of the present invention to provide a kit for chickenpox shingles virus detection comprising the cell line of the present invention as an active ingredient.
  • the present invention expresses the glycoprotein E of varicella zoster virus and replaces cells infected with varicella zoster virus by FAMA (f luorescent ant ibody to membrane ant igen) method.
  • FAMA fluorescent ant ibody to membrane ant igen
  • An isolated human cell line is provided which is used to detect in the sample the presence of an anti- varicella zoster virus antibody.
  • (D) It provides a method for detecting varicella zoster virus comprising the step of detecting the fluorescent label.
  • the present invention provides a composition for detecting varicella zoster virus comprising the cell line of the present invention as an active ingredient.
  • the present invention provides a kit for chickenpox shingles virus detection comprising the cell line of the present invention as an active ingredient.
  • the present invention provides a use of a cell line for the preparation of a formulation for detecting varicella zoster virus.
  • the present invention expresses glycoprotein E of varicella zoster virus, FAMA
  • An isolated human cell line is used to detect the presence of anti- varicella zoster virus antibodies in a sample by replacing the cells infected with varicella zoster virus by the method of f luorescent ant ibody to membrane ant igen. to provide.
  • VZV varicella zoster virus
  • HHV-3 human herpesvirus 3
  • It is a virus known as the causative virus of chickenpox.
  • Glycoprotein E of varicella zoster virus a gene expressed by 0RF68 of varicella zoster virus, formerly called gpl, is the first type of protein expressed on the cell membrane during varicella zoster virus infection. 1 transmembrane protein). Glycoprotein E has 623 amino acids and is commonly expressed in virus infected cells. In the present invention, the glycoprotein E of the varicella zoster virus is expressed on the cell membrane surface of a transformed (or transfected) cell line, wherein the glycoprotein E on the surface of the cell membrane is an antibody in the sample. Can bind specifically with.
  • glycoprotein E of the present invention may have an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the cell line is transformed, preferably having a promoter and an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 operably linked thereto (if necessary, consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1). ) May be transformed with an expression vector comprising a polynucleotide encoding the polypeptide.
  • the polynucleotide in the above preferably consists of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 or may have a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
  • promoter refers to a DNA sequence that controls the expression of a nucleic acid sequence operably linked in a specific host cell
  • operably l inked refers to a single nucleic acid fragment. It is meant to be combined with this other nucleic acid fragment and its function or expression is affected by the other nucleic acid fragment.
  • it may further comprise any operator sequence for regulating transcription, a sequence encoding a suitable mRNA ribosomal binding site, and a sequence regulating termination of transcription and translation.
  • the promoter may be a promoter that induces the expression of a gene of interest at all times or a inducible promoter that induces the expression of a gene of interest at a specific location and time.
  • Transformation of the expression vector into the cells of the present invention is a transformation method known in the art, for example, calcium phosphate method, calcium chloride method, rubidium chloride method, microprojection method (microproject i le bombardment), Electroporat ion, particle gun bombardment, silicon carbide whiskers, sonicat ion, PEG-mediated fusion, microinjection (microinject ion), liposome mediated method (1 iposome one mediated method), magnetic nanoparticle mediated method (magnet ic nanopart icle-mediated method) and the like, ⁇ 57>
  • the cell line of the present invention may be used without limitation as long as the glycoprotein E of the transformed varicella zoster virus is expressed and has intracellular expression and targeting mechanisms that can be targeted to the cell membrane and expressed on the surface of the cell line.
  • Preferably human cell lines more preferably HEK293, HeLa, H1299 cell line can be used.
  • biological sample includes solid tissue samples, such as blood and other liquid samples of biological origin, biopsy samples, tissue cultures or cells derived therefrom. More specifically, for example, but not limited to, tissue, extract, cell lysate, whole blood, plasma, serum, saliva, ocular fluid, cerebrospinal fluid, sweat, urine, milk, ascites fluid, synovial fluid, peritoneal fluid, etc. Preferably serum.
  • the sample may be obtained from an animal, preferably a mammal, and most preferably from a human.
  • the sample may be pretreated before use for detection. For example, it may include homogenization, filtration, distillation, extraction, concentration, inactivation of interference components, addition of reagents, and the like.
  • the glycoproteins of varicella zoster virus which are expected to be antigens recognized by human antibodies in the FAMA method, were cloned and expressed in HEK293 cells, which are human fibroblasts. Staining was performed using standard antibodies of varicella zoster virus.
  • the protein encoding glycoprotein E (gE) among the genes of varicella zoster virus showed the strongest signal in the FAMA method, so that the cell line expressing glycoprotein E was infected with the virus in the FAMA method. It was confirmed that the cell line can be used without.
  • the method provides a human cell line expressing glycoprotein E for the safe diagnosis of varicella zoster virus without the use of a virus.
  • (D) It provides a method for detecting varicella zoster virus comprising the step of detecting the fluorescent label.
  • Step (a) is to separate serum from blood of an individual in need of testing.
  • Separation of blood or serum in step (a) may be performed using a blood collection method and a serum separation method by centrifugation commonly used in the art.
  • blood is collected from venous blood to separate the blood, and the blood is placed at room temperature for 20 to 30 minutes. After the blood is finished, the serum collected in the upper layer of the container is centrifuged at l, 500 rpm for 10 minutes. It can be recovered.
  • Step (b) is a step of specifically binding the antibody in the serum with glycoprotein E on the surface of the cell line by antigen / antibody reaction by contacting the serum with the cell line of the present invention.
  • the serum can be used in a dilution in the buffer
  • the buffer may be a conventional buffer used in the serum dilution in the art, but preferably may be PBS (phosphate buffered sal ine).
  • (C) step specifically binds to the bound antibody, the fluorescent label is attached
  • a second antibody an antibody in which a fluorescent substance such as FITC is bound to an anti-human serum that recognizes a human antibody.
  • step (d) the fluorescent label is detected.
  • Detection of the fluorescent label may use a known detection method according to the label.
  • Fluorescent labels fluorescein, isothiocyanate, rhodamine, phycoerythrin, phycocyanin, allophycocyanin, fluorine isothiocyanate and the like can be used as the fluorescent label.
  • fluorescent protein those known in the art may be used.
  • Green Fluorescent Protein GFP
  • EGFP Enhanced Green Fluorescent Protein
  • RFP Red Fluorescent Protein
  • RFPC m FPC Monomeric Red Fluorescent Protein
  • DsRedCDi scosoma sp. red f luorescent protein CFPCCyan Fluorescent Protein
  • CFPCCyan Fluorescent Protein CFPCCyan Fluorescent Protein
  • CGFP Cyan Green Fluorescent Protein
  • YFP Yamamoto Fluorescent Protein
  • AzG AzG (Azami Green)
  • HcR HcRed, Heteract is cr ispa red f luorescent protein
  • BFPCBlue Fluorescent Protein a Green Fluorescent Protein
  • EGFP Enhanced Green Fluorescent Protein
  • RFP Red Fluorescent Protein
  • RFPC m FPC Monomeric Red Fluorescent Protein
  • the detection method of the present invention can be used to measure the immunity to the varicella zoster virus of the individual, and has an immunity when the antibody to the varicella zoster virus is detected, and if the antibody is not detected to have immunity. It can be determined that it is not present. It is also possible to quantitatively calculate the amount of immunity by measuring the intensity of fluorescence quantitatively.
  • the present invention provides a composition for detecting varicella zoster virus comprising the cell line of the present invention as an active ingredient.
  • the present invention provides a kit for chickenpox shingles virus detection comprising the cell line of the present invention as an active ingredient.
  • kits of the present invention may further comprise tools and / or reagents known in the art for use in carrying out the FAMA method in addition to the cell lines of the present invention.
  • the kit of the present invention may further include a tube, a well plate, and an instruction sheet describing a method of use, which will be used to mix each component as necessary.
  • Experimental procedures, reagents, and reaction conditions that can be used in the FAMA methods can be any of those conventionally known in the art except for cell line infection of varicella zoster virus, which is obvious to those skilled in the art. .
  • the present invention provides a use of a cell line for preparing an agent for detecting varicella zoster virus.
  • a use for the preparation of an agent for detecting varicella zoster virus of a human cell line expressing glycoprotein E of the varicella zoster virus is provided.
  • the varicella zoster virus may be removed without using the varicella zoster virus. Since the presence of antibodies can be easily measured, diagnosis-related medical personnel can be diagnosed safely from virus infection when diagnosing varicella zoster, and it is economically excellent because it does not require special treatment and facilities for infectious virus treatment.
  • FIG. 1 is a Western blot comparing VZV infected cells with cells expressing VZV glycoprotein E using VZV serum. Number 4 expressed glycoprotein E at 293T, consistent with the darkest bands from VZV-infected cells.
  • Figure 2 is a VZV-infected HEK293 cells measured by the Internat ional standard VZV WHO antibody (upper panel), HEK293 cells expressing glycoprotein E and stained with fluorescent dye (lower panel). Expression of glycoprotein E alone yields results similar to FAMA using the entire varicella zoster virus.
  • FIG. 3 shows FAMA assay using cells expressing glycoprotein E.
  • FIG. 3 This is the result of staining with glycoprotein E using plasma with little antibody against VZV and plasma with high antibody.
  • the dyed pattern is different and dyed . It can be seen that the intensity is significantly different.
  • FIG. 4 is a photograph showing FAMA according to the method of the present invention by separating the plasma of the patient, the former three persons are known as "negative” as the existing diagnostic method, and the rest are positive persons. It can be seen.
  • ATGGGGACAGTTMTA CC (SEQ ID NO: 3) was used as the 5 'primer and TCACCGGGTCTTATCTATATAC (SEQ ID NO: 4) was used as the 3' primer to amplify by PCR polymerization method, which was cloned into pc DNA4HisMax vector (invi trogen). It was. ⁇ 105>
  • Example ⁇ 1-1> Each glycoprotein gene cloned in Example ⁇ 1-1> was introduced into 293T cells by a DNA transfection method using liposomes. 48 hours of incubation at 37 ° C. 5% CO 2 allowed each glycoprotein to be expressed on the cell membrane.
  • the protein of the cell line was isolated and confirmed by Western blot for protein expression.
  • Cells infected with varicella zoster virus were used as controls (VZV infected cel l).
  • glycoprotein E is expressed at about the same size as a gene strongly expressed in cells infected with varicella zoster virus, and thus, when glycoprotein E is infected with varicella zoster virus. It was expected to be most strongly expressed in, and suitable for FAMA method. Therefore, glycoprotein E was used as a target antigen in subsequent experiments.
  • the plasmid expressing the glycoprotein E prepared in Example 1-1 was introduced into HEK293 cells by using a liposome.
  • the conventional FAMA method and the cell line of the present invention are used. Each of them was divided by the FAMA method.
  • Glycoprotein E of Example 1-1 to HEK293 cells The expressed plasmid was stained by FAMA method after 24 hours of introduction of DNA using liposomes.
  • the method of the present invention (lower panel) was glycoprotein E as compared to that of HEK293 cells infected with VZV using the Internat ional standard VZV WHO antibody (upper panel). Only by expression of the result obtained similar to FAMA using the entire varicella zoster virus, it can be seen that it can be performed by improving the FAMA method using the cell line of the present invention.
  • the FAMA method is to check for the presence of antibodies to varicella zoster virus in an unknown sample, it was confirmed whether the cell line of the present invention can be distinguished according to the presence or absence of the antibody.
  • Plasmids expressing glycoprotein E in HEK293 cells were introduced with DNA using liposomes and stained with FAMA 24 hours later. At the time of staining, human antibodies known to have no antibody to varicella zoster virus (column 1) and human antibodies known to have high antibody to varicella zoster virus by conventional methods (columns 2 and 3). Heat).
  • Plasma samples Blood was taken from each of the 16 patient samples, and only plasma was obtained.
  • antibodies of varicella zoster virus were detected according to the method of the present invention described in Example 2-1.
  • the antibody was almost eliminated by the conventional method as the negative control group.
  • Negative patients (# 41, # 43, # 61) had negative results, and patients with known antibodies had a positive result, and the new method had the same results as the existing method. It was found that the diagnosis can be easily performed in a safe way without using the virus directly.
  • chickenpox herpes virus can be easily measured without using the varicella zoster virus and thus the chicken pox.
  • Diagnosis of shingles is highly economical because the diagnostic staff can protect the virus from infection and can safely diagnose it.

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Abstract

본 발명은 수두대상포진 바이러스의 당단백질 E를 발현하며, FAMA (fluorescent antibody to membrane antigen)법에서 수두대상포진 바이러스에 감염된 세포를 대체하여 항-수두대상포진 바이러스 항체의 존재 여부를 시료에서 검출하기 위해 이용되는 것을 특징으로 하는 분리된 인간 세포주 및 이를 이용한 수두대상포진 바이러스에 대한 면역력 진단 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, 수두대상포진 바이러스를 사용하지 않고, 수두대상포진 바이러스의 항체 유무를 용이하게 측정할 수 있으므로 수두대상포진 진단시 진단 관련 의료진들이 바이러스 감염으로부터 보호되어 안전하게 진단할 수 있고, 감염성 바이러스 처리를 위한 특별한 처리 및 시설을 필요치 않아서 경제적으로 매우 우수하다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
수두대상포진 바이러스의 당단백질 E를 발현하는 인간 세포를 이용한 수두대 상포진 바이러스에 대한 면역력 진단방법
【기술분야】
<1> 본 출원은 2014년 이월 28일에 출원된 대한민국특허출원 제 10-2014-0010842 호를우선권으로 주장하고， 상기 명세서 전체는본출원의 참고문헌이다.
<2>
<3> 본 발명은 수두대상포진 바이러스의 당단백질 E를 발현하는 인간세포를 이용 한수두대상포진 바이러스에 대한 면역력 진단 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게 는 수두대상포진 바이러스의 당단백질 E를 발현하며， FAMA (f luorescent ant ibody to membrane ant igen)법에서 수두대상포진 바이러스에 감염된 세포를 대체하여 항- 수두대상포진 바이러스 항체의 존재 여부를 시료에서 검출하기 위해 이용되는 것을 특징으로 하는 분리된 인간 세포주 및 이를 이용한 수두대상포진 바이러스에 대한 면역력 진단방법에 관한 것이다.
<4>
【배경기술】
<5> 수두 및 대상포진 질환은 수두대상포진 바이러스 (Varicel la zoster virus ,
VZV)의 감염에 의해서 일어나는 바이러스 감염성 질환이다.
<6>
<7> 수두는 어린아이의 피부에 붉고 등근 발진이 났다가 얼마 뒤에 작은 물집으 로 변하는 바이러스성 전염병이다. 소아에게서 흔히 발생하며, 감염성이 매우 높은 질환으로 기침 등을 통해 공기중으로 감염되거나 수포와의 접촉을 통해서 감염된 다. 수두는 가족내 환자가 있을 경우, 항체를 가지지 않은 가족 구성원에게 80~90% 가 감염될 정도로 감염성이 높은 질환이다 (질병관리센터 보고서, 기현옥, 2011) . 수두환자의 5%는 성인이며, 그 증세는 소아와 달리 심각하여 기간도 2주에 이르고 폐렴 등의 합병증도 생기며, 심각한 경우사망에 이를수 있다.
<8>
<9> 수두는 수포성 대상포진 바이러스 (varicel la-zoster virus)에 의해서 발생하 대체용지 (규칙 제 26조) 는데， 이 바이러스는 대상포진을 일으키는 바이러스이기도 하다. 수두는 이 바이러 스에 대한 첫 노출로 나타나는 임상반웅이며， 환자가 임상적으로 회복한 뒤에 이 바이러스는 신경세포에 정주 (定住)하고 았다가 몇 년 뒤에 다시 활동할 수도 있는 데 이 때， 신경을 따라 피부에 이르러 대상포진 (herpes zoster)을 일으킨다.
<10>
<1 1> 대상포진은 수두대상포진 바이러스가 잠복해 있다가 면역력 저하 등에 의해 서 활성화될 때 나타나는 질환으로 피부 발진과 심한 통증을 유발하는 질환으로 최 근 들어서 급격히 증가하는 추세이다. 대상포진에 대한 감수성은 혈청내에 수두대 상포진 바이러스의 항체 유무에 따라서 판별할 수 있는데， 수두대상포진 바이러스 에 대한 항체를 가지고 있을 경우， 바이러스 감염에 의해서 나타나는 질환에 대해 서 면역력을 가지고 있다고 알려져있다 (Breuer et al . , 2008) .
<12>
<ΐ3> ' 현재 수두대상포진 바이러스에 대한 면역력은 FAMA(Fluorescent Ant ibody to
Membrane Ant igen) 방법에 의해서 측정하는 것이 "Gold Standard' '로 알려져 있으 며， 1974년부터 사용되었다. FAMA 방법은 인간 섬유아세포주인 MRC5에 수두대상포 진 바이러스를 감염시킨 후, 사람의 혈액에세분리한 혈장 속의 항체가 MRC5 세포 표면쎄 표출되는 수두대상포진 당바이러스 단백질과 결합하여 형광 염색되는 방법 이다 (Zaia et al . , 1977) . 그러나 기존의 FAMA 방법으로 바이러스에 대한 항체 존 재 여부를 측정할 경우 매번 세포주에 바이러스를 감염시켜 주어야 하는 단점이 있 다.
<14>
<15> 아을러， 실험 증 수두대상포진 바이러스를 다루고， 이 바이러스가 공기증으 로도 전파되고， 전염성이 매우 높기 때문에 바이러스에 감염되지 않았던 실험자에 게 수두와 같은 질환을 일으킬 수 있고， 특히 면역력이 없는 성인에게 감염될 경우 심각한 문제를 일으킬 수 있기 때문에 FAMA 방법은 위험한 방법이며， 또한 감염성 이 있는 바이러스를 가지고 실험하기 때문에 전처리 및 후처리에 비용이 추가적으 로 들어가는 단점이 있다.
<16>
【발명의 상세한 설명】 - 【기술적 과제】
<17> 이에 본 발명자들은 위험한 수두대상포진 바이러스를 사용하지 않고， 안전하 게 수두대상포진 바이러스에 대한 항체를 측정하는 방법을 개발하기 위하여 연구하 던 중， FAMA 법에서의 세포주에 수두대상포진 바이러스의 감염시키는 단계 대신에 바이러스의 항원 단백질인 당단백질 E를 세포에서 발현시키는 경우 수두대상포진 바이러스를 사용하지 않고, 안전하게 수두대상포진 바이러스에 대한 항체를 측정할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
<18>
<19> 따라서 본 발명의 목적은 수두대상포진 바이러스의 당단백질 E를 발현하며，
FAMA (f luorescent ant ibody to membrane ant igen)법에서 수두대상포진 바이러스에 감염된 세포를 대체하여 항-수두대상포진 바이러스 항체의 존재 여부를 시료에서 검출하기 위해 이용되는 것을 특징으로 하는 분리된 인간 세포주를 제공하는 것이 다.
<20> 본 발명의 다른 목적은
<2i> (a) 검사가 필요한 개체의 혈액에서 혈청을 분리하는 단계;
<22> (b) 상기 혈청을 세포주와 접촉시켜 상기 혈청 내의 항체와 상기 세포주 표 면의 당단백질 E를 항원항체 반웅에 의해 특이적으로 결합시키는 단계 ;
<23> ( C ) 상기 결합된 항체와 특이적으로 결합하며, 형광 표지가 부착된 제 2항체 를 첨가하여 상기 항체와 상기 제 2항체를 항원항체 반웅에 의해 특이적으로 결합시 키는 단계; 및
<24> (d) 상기 형광 표지를 검출하는 단계를 포함하는 수두 대상포진 바이러스 검 출방법을 제공하는 것이다.
<25>
<26> *본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 세포주를 유효성분으로 포함하는 수두 대상포진 바이러스 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
<27> 본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 세포주를 유효성분으로 포함하는 수두 대상포진 바이러스 검출용 키트를 제공하는 것이다.
<28>
【기술적 해결방법】
<29> 상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 수두대상포진 바이러스의 당단백 질 E를 발현하며, FAMA (f luorescent ant ibody to membrane ant igen)법에서 수두대 상포진 바이러스에 감염된 세포를 대체하여 항-수두대상포진 바이러스 항체의 존재 여부를 시료에서 검출하기 위해 이용되는 것을 특징으로 하는 분리된 인간 세포주 를 제공한다.
<30> 본발명의 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 <3i> (a) 검사가 필요한 개체의 혈액에서 혈청을 분리하는 단계;
<32> (b) 상기 혈청을 세포주와 접촉시켜 상기 혈청 내의 항체와 상기 세포주 표 면의 당단백질 E를 항원ᅳ항체 반웅에 의해 특이적으로 결합시키는 단계;
<33> (C ) 상기 결합된 항체와 특이적으로 결합하며, 형광 표지가 부착된 계 2항체 를 첨가하여 상기 항체와 상기 계 2항체를 항원 ·항체 반웅에 의해 특이적으로 결합 시키는 단계; 및
<34> (d) 상기 형광 표지를 검출하는 단계를 포함하는 수두 대상포진 바이러스 검 출방법을 제공한다.
<35> 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 본 발명의 세포주를 유효성분으로 포함하는 수두 대상포진 바이러스 검출용 조성물을 제공한다 .
<36> 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명의 세포주를 유효성분으로 포함하는 수두 대상포진 바이러스 검출용 키트를 제공한다.
<37> 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 수두 대상포진 바이 러스 검출용 제제를 제조하기 위한 세포주의 용도를 제공한다.
<38>
<39> 이하， 본 발명을 상세히 설명한다.
<40>
<41> 본 발명은 수두대상포진 바이러스의 당단백질 E를 발현하며, FAMA
(f luorescent ant ibody to membrane ant igen)법에서 수두대상포진 바이러스에 감염 된 세포를 대체하여 항-수두대상포진 바이러스 항체의 존재 여부를 시료에서 검출 하기 위해 이용되는 것을 특징으로 하는 분리된 인간 세포주를 제공한다.
<42>
<43> 본 발명의 수두대상포진 바이러스 (varicel la zoster virus , VZV)는 DNA 바 이러스의 헤르페스 바이러스과에 속하는 바이러스의 일종으로, 학명은 HHV-3 (human herpesvirus 3)이다. 수두의 원인바이러스로 알려져 있는 바이러스이다.
<44>
<45> 수두대상포진 바이러스의 당단백질 E는 수두대상포진 바이러스의 0RF68에 의 해서 발현되는 유전자로써 예전에는 gpl로 불렸으며， 수두대상포진 바이러스 감염 시에 세포막에 발현되는 제 1타입의 단백질 (type 1 transmembrane protein)이다. 당 단백질 E는 623개의 아미노산을 가지고 있으며， 바이러스 감염된 세포에서 흔하게 발현된다. <47> 본 발명에서 수두대상포진 바이러스의 당단백질 E는 형질전환 (또는 형질감 염， 이하 같음)된 세포주의 세포막 표면에 표출된 것을 특징으로 하며， 세포막 표 면의 당단백질 E가 시료내의 항체와 특이적으로 결합할 수 있게 된다.
<48>
<49> 바람직하게는 본 발명의 당단백질 E는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
<50>
<51> *
<52> 당단백질 E의 발현을 위해서 세포주는 형질전환된 것이며 , 바람직하게는 프 로모터 및 이와 작동 가능하게 연결된 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 (필요 에 따라서는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진) 폴리펩티드를 암호화하는 폴 리뉴클레오티드를 포함하는 발현백터로 형질전환된 것일 수 있다. 상기에서 폴리뉴 클레오티드는 바람직하게는 서열번호 2의 염기서열로 이루어지거나 서열번호 2의 염기서열을 가질 수 밌다.
<53>
<54> 본 발명에서 '프로모터' 란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵 산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미하며， '작동 가능하게 연결된다 (operably l inked)' 는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다. 아울러, 전사 를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열， 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩 하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상 기 프로모터로는 모든 시간대에 상시적으로 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모 터 (const itut ive promoter) 또는 특정한 위치, 시기에 목적 유전자의 발현을 유도 하는 프로모터 ( inducible promoter)를 사용할 수 있다.
<55>
<56> 본 발명의 세포로의 발현백터의 형질전환은 당업계에 공지된 형질전환방법， 예를 들면, 인산칼슘법， 염화칼슴법， 염화루비듐법, 미세사출법 (microproject i le bombardment ) , 일렉트로포레이션 (electroporat ion) , 입자 총 층격 (part icle gun bombardment ) , 실리콘 탄화물 위스커 (Si l icon carbide whiskers) , 초음파 처리 (sonicat ion) , PEG-매개 융합법 (PEG-mediated fusion) , 미세주입법 (microinject ion) , 리포좀 매개법 ( 1 iposome一 mediated method) , 자성나노입자 매개 법 (magnet ic nanopart icle-mediated method) 등에 의해 수행될 수 있다, <57>
<58> 본 발명의 세포주는 형질전환된 수두대상포진 바이러스의 당단백질 E가 발현 되고 세포막으로 타겟팅되어 세포주의 표면으로 표출될 수 있는 세포내 발현 및 타 겟팅 기작을 가진 것이라면 제한 없이 이용될 수 있으나, 바람직하게는 인간의 세 포주일 수 있으며, 더 바람직하게는 HEK293, HeLa, H1299 세포주가 이용될 수 있 다.
<59>
<60> 본 발명에서 사용된 용어 "생물학적 시료" 또는 "시료 "는 혈액 및 생물학적 기원의 기타 액상 시료, 생검 표본， 조직 배양과 같은 고형 조직 시료 또는 이로부 터 유래된 세포가 포함된다. 보다 구체적으로 예를 들면 이에 한정되지는 않으나 조직, 추출물， 세포 용해물， 전혈， 혈장, 혈청， 침， 안구액， 뇌척수액, 땀, 뇨， 젖 ， 복수액, 활액， 복막액 등일 수 있으며， 바람직하게는 혈청일 수 있다. 상기 시료 는 동물, 바람직하게는 포유동물로부터 수득될 수 있으며， 가장 바람직하게는 인간 로부터 수득될 수 있다. 상기 시료는 검출에 사용하기 전에 전처리할 수 있다. 예 를 들어， 균질화 (homogenizat ion) , 여과， 증류， 추출， 농축， 방해 성분의 불활성 화， 시약의 첨가 등을 포함할 수 있다.
<61>
<62> 본 발명의 일실시예에서는 FAMA 방법에서 사람의 항체가 인식하는 항원으로 예상되는 수두 대상포진 바이러스의 당단백질 (glycoprotein)들을 클로닝하여， 각각 의 인간 섬유아 세포주인 HEK293세포에서 발현 후， 수두 대상포진 바이러스의 표준 항체를 이용하여 염색하였다. 그 결과， 수두 대상포진 바이러스의 유전자 중 당단 백질 E(glycoprotein E, gE)를 코드하는 단백질이 FAMA 방법에서 가장 강한 신호를 나타낸다는 것을 발견하여 당단백질 E를 발현하는 세포주가 FAMA 방법에서 바이러스 의 감염 없이 사용될 수 있는 세포주임을 확인하였다. 본 방법은 바이러스를 사용 하지 않는 안전한 수두대상포진 바이러스 진단을 위한 당단백질 E를 발현하는 인간 세포주를 제공한다.
<63>
<64> 아울러， 본 발명은
<65> ( a) 검사가 필요한 개체의 혈액에서 혈청을 분리하는 단계;
<66> (b) 상기 혈청을 세포주와 접촉시켜 상기 혈청 내의 항체와 상기 세포주 표 면의 당단백질 E를 항원 ·항체 반웅에 의해 특이적으로 결합시키는 단계 ; 및
<67> (C) 상기 결합된 항체와 특이적으로 결합하며， 형광 표지가 부착된 제 2항체 를 첨가하여 상기 항체와 상기 제 2,항체를 항원 ·항체 반웅에 의해 특이적으로 결합 시키는 단계; 및
<68> (d) 상기 형광 표지를 검출하는 단계를 포함하는 수두 대상포진 바이러스 검 출방법을 제공한다.
<69>
<70> 본 발명의 수두대상포진 바이러스 검출방법을 이하에서 보다 상세히 설명한 다.
<71>
<72> ( a ) 단계는 검사가 필요한 개체의 혈액에서 혈청을 분리하는 단계이다.
<73> ( a) 단계에서의 혈액 또는 혈청의 분리는 당업계에서 통상적으로 사용되는 채혈법 및 원심분리에 의한 혈청의 분리 방법이 이용될 수 있다. 바람직하게는 정 맥혈에서 혈액을 채취하여 혈액을 분리하고， 혈액을 실온에 20~30분 세워 놓아 혈 액 웅고 과정이 끝난 후에， l ,500rpm에서 10분간 원심분리하여 용기의 상층에 모아 진 혈청을 회수할 수 있다.
<74>
<75> (b) 단계는 상기 혈청을 본 발명의 세포주와 접촉시켜 상기 혈청 내의 항체 와 상기 세포주 표면의 당단백질 E를 항원 ·항체 반웅에 의해 특이적으로 결합시키 는 단계이다. 바람직하게는 혈청은 버퍼에 회석되어 사용될 수 있으며， 상기 버퍼 는 당업계에서 혈청 회석에 사용되는 통상의 버퍼일 수 있으나, 바람직하게는 PBS (phosphate buffered sal ine)일 수 있다.
<76>
<77> (c) 단계는 상기 결합된 항체와 특이적으로 결합하며， 형광 표지가 부착된
. 제 2항체 (사람의 항체를 인지하는 항 -사람 혈청에 FITC등의 형광물질이 결합된 항 체)를 첨가하여 상기 항체와 상기 계 2항체를 항원 ·항체 반웅에 의해 특이적으로 결합시키는 단계이다.
<78>
<79> (d) 단계는 상기 형광 표지를 검출하는 단계이다.
<80> 형광 표지의 검출은 표지에 따른 공지된 검출방법을 이용할 수 있다. 형광 표지로는 형광단백질， 플루오레신, 이소티오시아네이트， 로다민， 피코에리테린， 피 코시아닌， 알로피코시아닌 , 훌루오르신이소티옥시아네이트 등을 사용할 수 있다 . 그 중 형광단백질로는 당 업계에 공지된 것을 사용할 수 있으며 예를 들어,
GFP( Green Fluorescent Protein)； EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein)； RFP(Red Fluorescent Protein)； m FPCMonomeric Red Fluorescent Protein)； DsRedCDi scosoma sp. red f luorescent protein)； CFPCCyan Fluorescent Protein)； CGFP(Cyan Green Fluorescent Protein)； YFP(Yel low Fluorescent Protein)； AzG(Azami Green) , HcR(HcRed, Heteract is cr ispa red f luorescent protein) , BFPCBlue Fluorescent Protein) 등이 있다.
<81>
<82> 본 발명의 검출방법을 통해 개체의 수두대상포진 바이러스에 대한 항체 존부 가 검출된다. 따라서, 본 발명의 검출방법은 개체의 수두대상포진 바이러스에 대한 면역력 측정에 이용될 수 있으며， 수두대상포진 바이러스에 대한 항체가 검출되는 경우 면역력을 가지고 있는 것으로, 항체가 검출되지 않는 경우 면역력을 가지고 있지 않은 것으로 판별할 수 있다. 형광의 세기를 정량적으로 측정하여 면역력의 양을 정량적으로산출하는 것도 가능하다 .
<83>
<84> 한편， 본 발명은 본 발명의 세포주를 유효성분으로 포함하는 수두 대상포진 바이러스 검출용 조성물을 제공한다. 아을러， 본 발명은 본 발명의 세포주를 유효 성분으로 포함하는 수두 대상포진 바이러스 검출용 키트를 제공한다.
<85>
<86> 본 발명의 키트는 본 발명의 세포주 이외에 FAMA 방법의 수행에 사용되는 당 업계에 공지된 도구 및 /또는 시약을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 필 요에 따라 각 성분들을 흔합하는데 사용될 튜브， 웰 플레이트, 사용방법을 기재한 지시자료 둥을 추가로 포함할 수 있다. 상기 FAMA 방법들에서 이용.될 수 있는 실험 과정, 시약 및 반응 조건은 수두 대상포진 바이러스의 세포주 감염 과정을 제외한 종래 당업계에서 통상적으로 알려져있는 것들을 모두 이용할 수 있으며， 이는 당업 자에게 자명한 일이다.
<87>
<88> 본 발명은 수두 대상포진 바이러스 검출용 제제를 제조하기 위한 세포주의 용도를 제공한다. 수두대상포진 바이러스의 당단백질 E를 발현하는 인간 세포주의 수두 대상포진 바이러스 검출용 제제를 제조하기 위한 용도를 제공한다.
<89>
【유리한 효과]
<90> 따라서， 본 발명의 세포주 또는 이를 이용하는 수두 대상포진 바이러스 검출 방법에 의하면, 수두대상포진 바이러스를 사용하지 않고， 수두대상포진 바이러스의 항체 유무를 용이하게 측정할 수 있으므로 수두대상포진 진단시 진단 관련 의료진 들이 바이러스 감염으로부터 보호되어 안전하게 진단할 수 있고, 감염성 바이러스 처리를 위한 특별한 처리 및 시설을 필요치 않아서 경제적으로 매우 우수하다.
<91>
【도면의 간단한 설명】
<92> 도 1은 VZV 혈청을 이용하여 VZV 감염 세포와 VZV glycoprotein E를 발현시 킨 세포를 웨스턴 블롯으로 비교한 것이다. 4번이 glycoprotein E를 293T에서 발현 시킨 것으로 VZV에 감염된 세포에서 나오는 가장 진한 밴드와 일치한다.
<93> 도 2는 VZV에 감염된 HEK293세포를 Internat ional standard VZV WHO 항체로 측정한 것 (상부 패널)이며， HEK293세포에 당단백질 E를 발현시키고， 형광 염색약 으로 염색한 것 (하부 패널)이다. 당단백질 E의 발현만으로도 수두 대상포진 바이러 스 전체를 사용하는 FAMA와 비슷한 결과를 얻음을 알 수 있다.
<94> 도 3은 당단백질 E를 발현시킨 세포를 이용하여 FAMA assay를 한 것이다. VZV 에 대한 항체가 거의 없는 혈장과 항체가 많은 혈장을 이용하여 당단백질 E로 염색 한 결과이다. 염색된 패턴이 다르고 염색 .강도가 크게 차이나는 것을 알 수 있다.
<95> 도 4는 환자의 혈장을 분리하여 본 발명의 방법에 따라서 FAMA를 수행한 사 진, 앞의 세사람은 기존 진단 방법으로 "음성" 으로 알려진 사람들이고， 나머지는 양성인 사람들로 결과가 일치함을 알 수 있다.
<96>
【발명의 실시를 위한 형태】
<97> 이하 본 발명을 상세히 설명한다 .
<98> 단， 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실 시예에 한정되는 것은 아니다.
<99>
<ιοο> <실시예 1>
<1 1> 당다백침의 클로닝 및 형 ¾저화 세포주의 체조
<102>
<103> <1-1>수두대상포진 바이러스의 당단백질의 클로닝
<104> 수두대상포진 바이러스가 감염된 세포에서 바이러스 게놈을 Hirt Extract ion
Method로 분리하여 5 ' 프라이머로 ATGGGGACAGTTMTA CC (서열번호 3)를 사용하고 3 ' 프라이머로 TCACCGGGTCTTATCTATATAC (서열번호 4)를 사용하여 PCR중합방법을 이 용하여 증폭하였고， 이를 pcDNA4HisMax vector ( invi trogen)에 클로닝하였다. <105>
<106> <l-2> 형질전환 293T세포주의 제조
<107> 상기 실시예 <1-1>에서 클로닝한 각각의 당단백질 유전자를 리포좀을 이용하 는 DNA 도입 (transfect ion)방법에 의해서 293T세포에 도입하였다. 37°C 5% C02의 조 건에서 48시간 배양하여 각각의 당단백질이 발현되어 세포막에 표출되도록 하였다.
<108>
<109> 상기 세포주의 단백질을 분리하여 웨스턴 블럿으로 단백질 발현을 확인하였 다. 대조군으로 수두대상포진 바이러스에 감염된 세포를 사용하였다 (VZV infected cel l ) .
<110>
<ι ι ι> 그 결과， 도 1에서 보듯이, 수두대상포진 바이러스가 감염된 세포에서 강하 게 발현되는 유전자와 거의 같은 크기에서 당단백질 E가 발현되어서 당단백질 E가 수 두대상포진 바이러스에 감염시에 가장 강하게 발현되어서 FAMA방법에 적합할 것으 로 예상되었다. 따라서， 이후의 실험에서 대상 항원으로 당단백질 E를 사용하도록 하였다.
<112>
<ι ΐ3> <1-3> 형질전환 HEK293 세포주의 제조
<ι ΐ4> HEK293세포에 상기 실시예 1-1에서 제조한 당단백질 E를 발현하는 플라스미드 를 리포좀을 이용하는 방법으로 도입하여 발현되도록 하였다.
<115>
<ι ΐ6> 대조구 세포로 MRC5 세포에 수두대상포진 바이러스를 감염시키는 일반적인 방법으로 각각 당단백질 E를 발현시키는 방법으로 수두대상포진 바이러스에 감염된 세포주를 제조하였다.
<117>
<118> <실시예 2>
<119> 본 발명의 형질전환 세포주를 이용한 FAMA 방법 수행
<120>
<121> <2-1> 종래의 FAMA 방법과의 비교
<122> 상기 실시예 1에서 제조된 당단백질을 발현하는 HEK293세포주가 FAMA 방법에 의해서 수두대상포진 바이러스에 대한 항체 검출이 용이하게 이루어지는지 확인하 기 위하여 종래의 FAMA 방법과 본 발명의 세포주를 이용하는 것으로 개량한 FAMA 방법으로 나누어 각각 수행하였다. HEK293세포에 상기 실시예 1-1의 당단백질 E를 발현하는 플라스미드를 리포좀을 이용하여 DNA를 도입한 후， 24시간 후에 FAMA 방 법으로 염색하였다.
<123>
<124> 그 결과 도 2에서 보듯이， VZV에 감염된 HEK293세포를 Internat ional standard VZV WHO 항체로 측정한 것 (상부 패널)과 대비하여 본 발명의 방법에 의 한 것 (하부 패널)이 당단백질 E의 발현만으로도 수두 대상포진 바이러스 전체를 사 용하는 FAMA와 비슷한 결과를 얻어 본 발명의 세포주를 이용하는 경우 FAMA 방법을 개량하여 수행할 수 있음을 알수 있었다.
<125> .
<126> <2"2>항체 유무에 따른 구분가능여부 확인
<127> FAMA 방법이 미지의 시료에서의 수두대상포진 바이러스에 대한 항체의 존재 여부를 확인하는 것이므로 본 발명의 세포주를 이용하는 경우에도 항체 유무에 따 른 구분이 가능한지를 확인하였다. HEK293세포에 당단백질 E를 발현하는 플라스미드 를 리포좀을 이용하여 DNA를 도입한 후， 24시간 후에 FAMA 방법으로 염색하였다. 염색시에는 기존의 방법으로 수두대상포진 바이러스에 대한 항체가 없는 것으로 알 려진 사람의 항체 (제 1열)와 수두대상포진 바이러스에 대한 항체가 높은 것으로 알 려진 사람의 항체 (제 2열， 제 3열)를 이용하여 테스트를 하였다.
<128>
<129>
<130> *그 결과, 도 3에서 보듯이, VZV에 대한 항체가 거의 없는 혈장에서는 항체 결합을 반영하는 염색이 그다지 나타나지 않은데에 비해서， 항체간 많은 혈장을 이 용하여 당단백질 E로 염색한 것은 염색 강도가 매우 크게 나타남을 확인하여 염색 결과에 따라 혈장에서의 항체 여부를 확인할 수 있음을 알 수 있었다.
<131>
<132> <실시예 3>
<133> 환자 시료에서의 본 발명의 방법에 따른 함체의 검출
<134>
<135> 16명의 환자의 시료에서 각각 혈액을 채취한 다음, 혈장만을 수득하였다. 각 각의 혈장 시료에 대해서 상기 실시예 2-1에 기재된 본 발명의 방법에 따라서 수두 대상포진 바이러스의 항체를 검출하였다.
<136>
<137> 그 결과， 도 4에서 보듯이, 음성대조군으로 기존의 방법을 통해 항체가 거의 없다고 알려진 환자들 (#41 , #43, #61)에서는 음성의 결과를 얻었고, 기존의 방법 으로 항체가 있다고 알려진 환자에게서는 양성의 결과를 얻어서， 새로운 방법이 기 존의 방법과 동일한 결과를 얻을 수 있으며， 바이러스를 직접 사용하지 않는 안전 한 방법으로 쉽게 진단을 할 수 있음을 알게 되었다.
<138>
【산업상 이용가능성】
<139> 이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 세포주 또는 이를 이용하는 수두 대상포 진 바이러스 검출방법에 의하면， 수두대상포진 바이러스를 사용하지 않고， 수두대 상포진 바이러스의 항체 유무를 용이하게 측정할 수 있으므로 수두대상포진 진단시 진단 관련 의료진들이 바이러스 감염으로부터 보호되어 안전하게 진단할 수 있고， 감염성 바이러스 처리를 위한 특별한 처리 및 시설을 필요치 않아서 경제적으로 매 우 우수하다.

Claims

【청구의 범위】
[청구항 1】
수두대상포진 바이러스의 당단백질 E를 발현하며, FAMA (f luorescent ant ibody to membrane ant igen)법에서 수두대상포진 바이러스에 감염된 세포를 대 체하여 항-수두대상포진 바이러스 항체의 존재여부를 시료에서 검출하기 위해 이용 되는 것을 특징으로 하는 분리된 인간 세포주.
【청구항 2】
제 1항에 있어서， 상기 당단백질 E는 상기 세포주의 세포막 표면에 표출된 것 임을 특징으로 하는 분리된 인간 세포주.
【청구항 3】
제 1항에 있어서， 상기 당단백질 E는 서열번호 1의 아미노산서열을 가지는 것임을 특징으로 하는 분리된 인간 세포주.
【청구항 4】
제 1항에 있어서, 상기 시료는 인간의 혈청인 것을 특징으로 하는 분리된 인 간 세포주 .
【청구항 5】
제 1항에 있어서， 상기 세포주는 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 서열 번호 1의 아미노산 서열을 가지는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하 는 백터에 의해서 형질전환된 것을 특징으로 하는 분리된 인간 세포주.
【청구항 6】
제 5항에 있어서， 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 분리된 인간세포주.
【청구항 7】
(a) 검사가 필요한 개체의 혈액에서 혈청을 분리하는 단계;
(b) 상기 혈청을 제 1항의 세포주와 접촉시켜 상기 혈청 내의 항체와 상기 세 포주 표면의 당단백질 E를 항원항체 반웅에 의해 특이적으로 결합시키는 단계; 및 (c) 상기 결합된 항체와 특이적으로 결합하며， 형광 표지가 부착된 제 2항체 를 첨가하여 상기 항체와 상기 제 2항체를 항원항체 반웅에 의해 특이적으로 결합시 키는 단계; 및
(d) 상기 형광 표지를 검출하는 단계를 포함하는 수두 대상포진 바이러스 검 출방법 ·
【청구항 8】
제 7항에 있어서, 상기 검출방법은 개체의 수두대상포진 바이러스에 대한 면 역력 측정을 위한 것임을 특징으로 하는 수두 대상포진 바이러스 검출방법.
【청구항 9】
제 1항의 세포주를 유효성분으로 포함하는 수두 대상포진 바이러스 검출용 조 성물.
【청구항 10】
제 1항의 세포주를 유효성분으로 포함하는 수두 대상포진 바이러스 검출용 키 트.
【청구항 11】
수두 대상포진 바이러스 검출용 제제를 제조하기 위한 제 1항의 세포주의 용 도.
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