CN104755102A - 多价肺炎球菌多糖-蛋白质结合物组合物 - Google Patents

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Abstract

提供了包含15种不同的多糖-蛋白质结合物的免疫原性组合物。每种结合物包含由结合至载体蛋白的不同血清型肺炎链球菌，即，血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9N、9V、14、18C、19A、19F和23F制备的荚膜多糖。配制成包含铝类佐剂的疫苗的免疫原性组合物增加对于婴儿和儿童中的肺炎球菌疾病的应用范围。

Description

多价肺炎球菌多糖-蛋白质结合物组合物
技术领域
本发明涉及多价免疫原性组合物，包含：通过将源自肺炎链球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9N、9V、14、18C、19A、19F和23F的荚膜多糖(capsular polysaccharide)结合至载体蛋白如CRM197制备的15种不同的多糖-蛋白质结合物(缀合物，conjugate)。本发明总体上涉及医学领域，并且具体涉及微生物学、免疫学、疫苗以及通过免疫预防婴儿、儿童和成人中的肺炎球菌疾病。
背景技术
肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)是肺炎的主要原因。根据国家统计局公布的2010死亡趋势原因，肺炎是10大死亡原因之一，每100,000人中有14.9人死亡，比2000年增加82.9％。世界卫生组织(WHO)还估算了在2012年，全球小于5岁的476,000例HIV阴性儿童死于肺炎链球菌感染，对于小于5岁的儿童，其占各种原因死亡儿童的5％。
在1977年，Robert Austrian博士研制出14价肺炎球菌多糖疫苗来预防肺炎球菌疾病，之后该疫苗发展至23价多糖疫苗。已经证明多价肺炎球菌多糖疫苗对于预防中老年人和高危患者中的肺炎球菌疾病是有用的。然而，由于T细胞独立的免疫应答，所以婴儿和幼儿对大多数的肺炎球菌多糖应答很差。7价肺炎球菌结合疫苗(7vPnC，)包含来自7种最普遍的血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的荚膜多糖。自从2000年在美国获得批准，已经证实Prevnar是高度免疫原性的并且有效抵抗婴儿和幼儿中的侵袭性疾病和中耳炎。现在，该疫苗在全世界约80个国家获得批准。Prevnar分别在美国、欧洲和世界的其他地区覆盖了大约80-90％、60-80％和40-80％的侵袭性肺炎球菌疾病(IPD)。正如预期的，在引入Prevnar后的几年中收集的监测数据已经清楚地证实，在美国由被Prevnar覆盖的血清型引起的侵袭性肺炎球菌疾病降低。然而，血清型的覆盖率限于一些地区，并且由没有被Prevnar覆盖的血清型(特别是19A)引起的侵袭性肺炎球菌疾病增加。
咨询委员会的免疫实践(The Advisory Committee on ImmunizationPractices，ACIP)在2010年2月公布了对于用于接种新批准的13价肺炎球菌结合疫苗(PCV-13)的建议。PCV-13是包含除包含在Prevnar中的7种血清型(4、6B、9V、14、18C、19F、23F)之外的6种另外的血清型(1、3、5、6A、7F、19A)的肺炎球菌结合疫苗。根据美国活性细菌核心监测(Active Bacterial Core surveillance，ABCs)，在已知为小于5岁的儿童中的致病血清型的IPD病例中的总共64％被PCV-13覆盖。在2007年，在小于5岁的儿童的4600例IPD中的仅70病例被PCV7覆盖，而2900病例被PCV-13覆盖，其占主要部分。现在，正在研制15价肺炎球菌结合疫苗，其覆盖发病率随血清型替换而增加的另外的血清型。
发明内容
因此，本发明提供了用于预防婴儿、儿童和成人的肺炎球菌疾病的多价免疫原性组合物，该多价免疫原性组合物包含源自15种肺炎球菌血清型、包括血清型2和9N的荚膜多糖。
具体地，本发明提供了包含血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9N、9V、14、18C、19A、19F和23F的15价肺炎球菌结合物(PCV-15)组合物。
技术方案
根据本发明的一个方面，提供了多价免疫原性组合物，其包含15种不同的多糖-蛋白质结合物和生理用载体，其中，每种结合物包含源自结合至载体蛋白的肺炎链球菌的不同血清型的荚膜多糖，并且荚膜多糖由血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9N、9V、14、18C、19A、19F和23F制备。
在根据本发明的多价免疫原性组合物中，载体蛋白可以是CRM197。根据本发明的多价免疫原性组合物可以进一步包含佐剂，例如，包含铝类(铝基，基于铝的，aluminum-based)佐剂的佐剂。佐剂可以选自由磷酸铝、硫酸铝和氢氧化铝组成的组，并且优选的是磷酸铝。
根据本发明的进一步方面，提供了用于诱导对肺炎链球菌荚膜多糖结合物的免疫应答的药物组合物，该药物组合物包含免疫学有效量的所述免疫原性组合物。
在一个实施方式中，药物组合物可以是被配制为包含以下的免疫原性组合物：除了在4μg的6B，2μg的每种糖；大约34μg CRM197载体蛋白；0.125mg元素铝(0.5mg磷酸铝)佐剂；和作为赋形剂的氯化钠和琥珀酸钠缓冲液。
技术效果
多价免疫原性组合物包含源自15种不同的肺炎球菌血清型(包括血清型2和9N)的荚膜多糖，从而导致升高的血清IgG效价(滴度，titer)和功能性抗体活性。因此，可以将该多价免疫原性组合物有利地用于预防婴儿、儿童和成人中的肺炎球菌疾病。
附图说明
图1至图15示出了在二次注射本发明的和比较例(Prevnar 7和Prevnar 13)的疫苗组合物3周后(即，总共6周)，测得的血清型特异性IgG的水平。
具体实施方式
发明模式
已经通过具有抗生素抗性和多重抗药性的一些血清型进行了血清型替换。血清型分布的地区差异导致地区覆盖Prevnar的差异。(Harboe ZB,Benfield TL,Valentiner-Branth P,et al.Temporal Trends in InvasivePneumococcal Disease and Pneumococcal Serotypes over 7Decades.ClinInfect Dis 2010；50:329-37)。因此，没有理由除去现有的肺炎球菌结合疫苗中的任何血清型。相反，需要通过添加血清型进一步扩大覆盖率。
在2008年，全球肺炎球菌血清型项目(Pneumococcal Global SerotypeProject，GSP)发布了基于选择的1980年至2007年的IPD数据的报道，示出继血清型18C之后，血清型2是前20个全球血清型中第11个最高发病率的血清型。此外，Samir K.Saha等人报道血清型2可能成为威胁，因为血清型2具有在孟加拉国引起肺炎球菌性脑膜炎的高可能性，但是没有被包含在任何肺炎球菌结合疫苗中(Saha SK,Al Emran HM,Hossain B,Darmstadt GL,Saha S,et al.(2012)Streptococcus pneumoniae Serotype-2Childhood Meningitis in Bangladesh:A Newly Recognized PneumococcalInfection Threat.PLoS ONE 2012；7(3):e32134)。因此，如果包含血清型2，则可以降低肺炎球菌疾病的数量，并且可以进一步为接种PCV-13可能发生的血清型替换做准备。
肺炎球菌血清型示出不同的年龄分布格局。具体地，已经发现，与24个月至59个月大的儿童相比，血清型9N对0个月至23个月大的婴儿相对重要。血清型9N是继包含在PCV-13中的13血清型之后第14个最常见的。这表明包含血清型9N将有助于减少特别是婴儿中的肺炎球菌疾病。
本发明提供了包含源自15种肺炎球菌血清型(包括血清型2和9N)的荚膜多糖的多价免疫原性组合物。具体地，本发明提供了包含以下的多价免疫原性组合物：15种不同的多糖-蛋白质结合物和生理用载体，其中，每种结合物包含来自结合至载体蛋白的肺炎链球菌的不同血清型的荚膜多糖，并且该荚膜多糖由血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9N、9V、14、18C、19A、19F和23F制备。
荚膜多糖可以由本领域技术人员已知的标准技术制备。为了减少活化的荚膜多糖的粘度或增加其溶解度，可以降低荚膜多糖的大小。在本发明中，由肺炎链球菌的血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9N、9V、14、18C、19A、19F和23F制备荚膜多糖。通过分离方法制备这些肺炎球菌结合物，并且将其配制成单剂量的制剂。例如，使每种肺炎球菌多糖血清型在大豆基(基于大豆的，soy-based)培养基中生长，然后通过离心、沉淀、和超过滤纯化。
载体蛋白优选的是无毒的和非反应原性的并且可得到充足量和纯度的蛋白。载体蛋白应当可进行标准结合程序。在本发明的多价免疫原性组合物中，载体蛋白可以是CRM197。CRM197是从生长在基于酪蛋白氨基酸(casamino acid)和酵母提取物的培养基上的棒状杆菌白喉菌株C7(β197)的培养物分离的白喉毒素的无毒变体(即，类毒素)。通过超过滤、硫化铵沉淀和离子交换色谱法纯化CRM197。可替代地，根据美国专利号5,614,382重组制备CRM197。
其他白喉毒素也适于用作载体蛋白。其他合适的载体蛋白包括灭活的细菌毒素如破伤风类毒素、百日咳类毒素；霍乱类毒素(WO2004/083251)；大肠杆菌(E.coli)LT、大肠杆菌ST和绿脓杆菌(铜绿假单胞菌，Pseudomonas aeruginosa)外毒素A。还可以使用细菌外膜蛋白如外膜复合体C(OMPC)、孔蛋白、转铁结合蛋白、肺炎球菌溶血素、肺炎球菌表面蛋白A(PspA)、肺炎球菌粘附蛋白(PsaA)、组A或组B链球菌的C5a肽酶或流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)蛋白D。也可以将其它蛋白如卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或纯化的结核菌素的蛋白衍生物(PPD)用作载体蛋白。可以将白喉毒素变体如CRM173、CRM228、和CRM45用作载体蛋白。
为了制备用于与载体蛋白反应的多糖，化学活化纯化的多糖。一旦活化，将每种荚膜多糖单独结合至载体蛋白，以形成糖结合物(glycoconjugate)。在一个实施方式中，将每种荚膜多糖结合至相同的载体蛋白。通过常规的方法(例如，美国专利号4,673,574和4,902,506)实现多糖的化学活化和随后结合至载体蛋白。通过氧化剂如高碘酸盐(包括高碘酸钠、高碘酸钾、高碘酸钙或高碘酸)将多糖中的羟基基团氧化为醛基团。化学活化导致相邻的羟基基团的不规则氧化降解。通过还原氨化实现结合。例如，使活化的荚膜多糖和载体蛋白与还原剂如氰基硼氢化钠反应。通过添加强氧化剂可以除去未反应的醛基团。
在将荚膜多糖结合至载体蛋白之后，通过多种技术纯化多糖-蛋白质结合物(富集多糖-蛋白质结合物的量)。这些技术包括浓缩/渗滤(透析，dialfiltration)、柱色谱法和深层过滤。混合纯化的多糖-蛋白质结合物以配制本发明的可被用作疫苗的免疫原性组合物。可以使用本领域公认的方法实现本发明的免疫原性组合物的配制。例如，可以配制15种不同的肺炎球菌结合物与生理用载体来制备组合物。这种载体的实例包括但不限于水、缓冲盐水、多元醇(例如，丙三醇、丙二醇、液态聚乙二醇)和葡萄糖溶液。
在一个实施方式中，本发明的免疫原性组合物可以包含一种或多种佐剂。本文所定义的“佐剂”是用于增强本发明的免疫原性组合物的免疫原性的物质。因此，通常给出佐剂以加强免疫应答，并且佐剂是本技术领域熟知的。增强组合物的有效性的合适佐剂包括但不限于：
(1)铝盐(铝基盐(alum))，如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等；
(2)水包油乳液制剂(具有或不具有其他特定的免疫刺激剂如胞壁酰肽(以下定义)或细菌细胞壁组分，如例如，(a)MF59(WO 90/14837)，包含5％角鲨烯、0.5％吐温80和0.5％斯盘85(可选地包含不同量的MTP-PE(见下文)，尽管不是所需的)，使用微流化器如型号110Y微流化器(Microfluidics，Newton，MA)配制成亚微米颗粒；(b)SAF，包含10％角鲨烯、0.4％吐温80、5％普朗尼克(pluronic)嵌段的聚合物L121和thr-MDP(见下文)，被微流化成亚微米乳剂或者被涡旋生成大颗粒尺寸的乳剂；和(c)RibiTM佐剂体系(RAS)(Corixa，Hamilton，MT)，包含2％角鲨烯、0.2％吐温80和来自由以下组成的组中的一种或多种细菌细胞壁组分：美国专利号4,912,094中描述的3-O-脱酰化的单磷酰脂A(MPLTM)(Corixa)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)、和细胞壁骨架(CWS)，优选MPL+CWS(DetoxTM)；
(3)皂苷佐剂、如Quil A或STIMULONTMQS-21(Antigenics，Framingham，MA)(美国专利号5,057,540)或由其生成的颗粒如ISCOM(免疫刺激复合物)；
(4)细菌脂多糖，合成的脂A类似物如氨基烷基葡糖胺磷酸酯化合物(AGP)、或其衍生物或类似物，其可以从Corixa得到，并且在美国专利号6,113,918中描述；一种这种AGP是2-[(R)-3-十四酰氧基十四酰基氨基]乙基2-脱氧-4-O-磷酰基-3-O-[(R)-3-十四酰氧基十四酰基]-2-[(R)-3-十四酰氧基十四酰基氨基]-b-D-吡喃葡萄糖苷，其也称作529(以前称作RC529)，其被配制为水性形式或稳定的乳剂，
(5)合成的多核苷酸，如包含CpG基序的寡核苷酸(美国专利号6,207,646)；
(6)细胞因子，如白介素(例如，IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18等)、干扰素(例如，γ干扰素)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)、共刺激(协同刺激，costimulatory)分子B7-1和B7-2等；
(7)细菌ADP-核糖基化毒素的脱毒突变体，如野生型或者突变型的霍乱毒素(CT)，例如，其中氨基酸位置29的谷氨酸被另一氨基酸，优选组氨酸替换(根据WO 00/18434(也见W002/098368和WO 02/098369))，百日咳毒素(PT)、或者大肠杆菌不耐热毒素(LT)、具体是LT-K63、LT-R72、CT-S109、PT-K9/GU9(见例如WO 93/13302和WO 92/19265)；和
(8)补体(complement)成分，如补体成分C3d的三聚体。
胞壁酰肽包括但不限于N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-去甲胞壁酰基-L-丙氨酸-2-(1'-2'二棕榈酰基-sn-甘油基-3-羟基磷酰基氧基)-乙胺(MTP-PE)等。
在一个具体的实施方式中，将铝盐用作佐剂。铝盐佐剂可以是铝盐沉淀疫苗或铝盐吸附疫苗。铝盐包括但不限于水合氧化铝、三水合氧化铝(ATH)、氢氧化铝、三水合铝、铝胶、Superfos、Amphojel、氢氧化铝(III)、羟基磷酸铝硫酸盐(磷酸铝佐剂(APA))、和无定形氧化铝。APA是羟基磷酸铝的悬浮液。如果将氯化铝和磷酸钠以1:1的比值混合，则羟基磷酸铝硫酸盐沉淀。通过使用高剪切混合器和用生理盐水透析，随后灭菌，使沉淀物的大小为2-8μm。在一个实施方式中，将商业可获得的Al(OH)3(例如，铝胶或Superfos)用于吸附蛋白质。每1mg氢氧化铝可以吸附50-200g蛋白质，并且该比值依赖于蛋白的等电点(pI)和溶剂的pH。相比高pI的蛋白，低pI的蛋白被强烈地吸附。铝盐形成在2至3周内缓慢释放抗原的抗原储存库(depot)、非特异性活化吞噬细胞、补体和先天免疫机制。
本发明提供了用于诱导对肺炎链球菌荚膜多糖结合物的免疫应答的药物组合物(例如，疫苗制剂)，该药物组合物包含免疫学有效量的免疫原性组合物。
通过经由全身或粘膜途径给予疫苗，本发明的疫苗制剂可以用于保护或治疗易受肺炎球菌感染的人体。本文定义的术语“有效剂量”是指将抗体诱导至足以显著降低肺炎链球菌感染的可能性或其严重性所需的量。这些给予可以包括通过肌内、腹膜内、皮内或皮下途径注射；或通过粘膜给药至口腔/消化道、呼吸道或泌尿生殖道。在一个实施方式中，由于可以更有效地防止鼻咽部携带的肺炎球菌，所以将鼻内给药用于治疗肺炎或中耳炎，从而在早期阶段减弱感染。将每种疫苗剂量中的结合物的量选择为诱导无显著不利影响的免疫保护性应答的量。这种量可以根据肺炎球菌血清型变化。通常，每个剂量将包含0.1至100μg多糖，具体地0.1至10μg，以及更具体地1至5μg。可以通过涉及观察受试者适当的免疫应答的标准研究确定对于特定疫苗的组分的最佳量。例如，可以通过外推的动物测试结果确定用于人类受试者接种的量。此外，可以凭经验确定剂量。
在本发明的一个具体的实施方式中，疫苗组合物是单独结合至CRM197的血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F的肺炎球菌荚膜多糖的无菌液体制剂。将每0.5mL剂量配制为包含：除了在4μg的6B，2μg的每种糖；大约34μg CRM197载体蛋白；0.125mg元素铝(0.5mg磷酸铝)佐剂；和作为赋形剂的氯化钠和琥珀酸钠缓冲液。将该液体填充至无防腐剂的单剂量注射器中。震荡之后，该疫苗是即可用于肌内给药的均匀、白色悬浮液。
在进一步的实施方式中，可以以单次注射给予本发明的组合物。例如，可以以适当的时间间隔如1、2、3、4、5或6个月间隔或它们的组合给予2、3、4或更多次本发明的疫苗组合物。免疫时间表可以遵循对于Prevnar疫苗指定的时间表。例如，婴儿和幼儿由包含在Prevnar疫苗中的血清型抵抗由肺炎链球菌引起的侵袭性疾病的常规时间是在2、4、6和12-15个月的年龄。因此，在该方面，给予4次该组合物，即在2、4、6和12-15个月的年龄。
本发明的组合物还可以包含来自肺炎链球菌的一种或多种蛋白质。适用于包含的肺炎链球菌蛋白质的实例包括国际专利申请WO02/083855中识别的那些，以及国际专利申请WO02/053761中描述的那些。
可以通过本领域技术人员已知的一种或多种给药途径将本发明的组合物给予至受试者，如肠胃外、透皮、或经粘膜、鼻内、肌内、腹膜内、皮内、静脉内或皮下途径，并且据此配制本发明的组合物。在一个实施方式中，可以作为液体制剂通过肌内、腹膜内、皮下、静脉内、动脉内或经皮注射或呼吸道粘膜注射给予本发明的组合物。用于注射的液体制剂包括溶液等。
可以以单位剂量小瓶、多剂量小瓶或预填充的注射器的形式配置本发明的组合物。用于液体制剂的药用载体包括水性或非水性溶剂、悬浮液、乳剂或油。非水性溶剂的实例包括丙二醇、聚乙二醇和油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水性溶剂、乳剂或悬浮液、生理盐水、缓冲溶液。油的实例包括植物油或动物油、花生油、大豆油、橄榄油、葵花子油、鱼肝油、合成油如海洋油，以及获自奶类或蛋类的脂质。药物组合物可以是等渗的、高渗的或低渗的。然而，期望用于输注或注射的药物组合物是基本上等渗的。因此，等渗或高渗对于存储组合物可以是有利的。当药物组合物是高渗的时，在给予前，可以将组合物稀释至等渗。张度剂(tonicity agent)可以是离子张度剂如盐，或非离子张度剂如碳水化合物。离子张度剂包括氯化钠、氯化钙、氯化钾和氯化镁，但不限于此。非离子张度剂包括山梨醇和丙三醇，但不限于此。优选地，至少包括一种药用缓冲液。例如，当输注或注射药物组合物时，优选的是在具有pH 4至10如pH 5-9或6-8的缓冲能力的缓冲液中配制。缓冲液可以选自由TRIS、乙酸盐、谷氨酸盐、乳酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、碳酸盐、甘氨酸、组氨酸、甘氨酸、琥珀酸盐和三乙醇胺缓冲溶液组成的组。
具体地，如果将药物组合物用于肠胃外给予，则缓冲液可以选自适用于美国药典(USP)的那些。例如，缓冲液可以选自由一元酸如乙酸、苯甲酸、葡糖酸、甘油酸、和乳酸；多元酸如乌头酸、己二酸、抗坏血酸、碳酸、谷氨酸、苹果酸、琥珀酸和酒石酸；以及碱如氨水、二乙醇胺、甘氨酸、三乙醇胺和TRIS组成的组。对于肠胃外给药，载体(用于皮下、静脉内、关节内和肌肉内注射)包括氯化钠溶液、林格氏(Ringer’s)右旋糖溶液、右旋糖和氯化钠、乳酸化林格氏溶液和不挥发油(固定油，fixedoil)。用于静脉给药的载体包括林格氏右旋糖溶液或类似基于的右旋糖的输注溶液、营养补剂(补足物，supplement)和电解质补剂。实例包括具有或不具有表面活性剂和药用佐剂的无菌液体如水和油。通常，水、生理盐水、右旋糖溶液、相关的糖溶液和二醇如丙二醇或聚乙二醇(特别是聚山梨醇酯80)适合于注射。油的实例包括动物和植物油、花生油、大豆油、橄榄油、葵花子油、鱼肝油、合成油如海洋油以及来自于奶类或蛋类的脂质。
本发明的制剂可以包含表面活性剂。优选地，聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯(通常称为吐温)，特别是聚山梨酯20和聚山梨酯80；环氧乙烷(EO)、环氧丙烷(PO)、环氧丁烷(BO)的共聚物(如DOWFAXTM)；具有不同重复的乙氧基(氧基-1,2-乙二基)基团的辛苯昔醇(oxtocynol)，特别是辛苯昔醇-9(Triton-100)；乙基苯氧基聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40)；磷脂如卵磷脂；壬基酚乙氧基化物如TergitolTM NP系列；月桂醇、鲸蜡醇、硬脂醇、油醇衍生的聚氧乙烯脂肪醚(Brij表面活性剂)，特别是三乙二醇单月桂基醚(Brij30)；称为斯盘(SPAN)的脱水山梨醇醚，特别是脱水山梨糖醇三油酸酯(斯盘85)和脱水山梨糖醇单月桂酸酯，但不限于此。优选地将吐温80包含在乳剂中。
可以使用表面活性剂如吐温80/斯盘85的混合物。聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯如吐温80和辛苯昔醇如Triton X-100的组合也是适合的。月桂醇聚醚9(Laureth 9)和吐温和/或辛苯昔醇的组合也是有利的。优选地，包含的聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯(如吐温80)的量是0.01％至1％(w/v)，特别是0.1％；包含辛基苯氧基聚氧乙醇或壬基苯氧基聚氧乙醇(如TritonX-100)的量是0.001％至0.1％(w/v)，特别是0.005％至0.02％；包含的聚氧乙烯醚(如月桂醇聚醚9)的量是0.1％至20％(w/v)，可能地0.1％至10％，特别是0.1％至1％或约0.5％。在一个实施方式中，通过释放控制系统传递药物组合物。例如，可以将静脉内输注、透皮贴剂、脂质体或其它途径用于给药。在一个方面中，可以使用大分子如微球或植入物。
以上公开一般性地描述了本发明。通过参考以下具体实施例可以得到更全面的理解。然而，描述这些实施例仅是用于示出的目的，并且不旨在限制本发明的范围。
实施例1：制备肺炎链球菌荚膜多糖
根据本领域技术人员已知的进行肺炎链球菌的培养和荚膜多糖的纯化。肺炎链球菌血清型是从美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection，ATCC)得到的。肺炎链球菌由荚膜和在血液琼脂培养基中的不动性(无运动性，immobility)、革兰氏阳性柳叶刀形双球菌和α溶血表征。通过使用特异性抗血清的荚膜肿胀(Quelling)试验识别血清型(美国专利号5,847,112)。
制备细胞库
产生几代种子原液(seed stock)以扩大菌株并且除去动物源组分(F1、F2、和F3代)。产生另外两代种子原液。由F3小瓶制成第一另外的代，并且由第一另外的代的小瓶制成随后的代。冷冻(≤-70℃)保存种子小瓶，用合成甘油作为冷藏剂。为了制备细胞库，使所有培养物在大豆基培养基上生长。冷冻之前，通过离心浓缩细胞，除去用尽的培养基，并且将细胞颗粒重新悬浮于包含冷藏剂(如合成甘油)的新鲜培养基中。
接种
使用工作细胞库的培养物来接种包含大豆基培养基的种子瓶。使用种子瓶来接种包含大豆基培养基的种子发酵罐。
种子发酵
在具有受控的温度和pH的种子发酵罐中进行种子发酵。在达到目标光密度之后，使用种子发酵罐接种包含大豆基培养基的生产发酵罐。
生产发酵
生产发酵是发酵的最后步骤。控制温度、pH和搅拌速度。
失活
通过添加灭活剂停止生长后，终止发酵。灭活后，冷却发酵罐中的内容物，并且调节溶解的培养液的pH。
纯化
离心和过滤发酵罐中的肉汤(broth)以除去细菌细胞碎片。使用几个浓缩/渗滤操作、沉淀/洗脱和深层过滤步骤除去污染物，并且纯化荚膜多糖。
实施例2：制备肺炎链球菌荚膜多糖-CRM197结合物
根据不同的途径活化不同血清型的多糖，然后将其结合至CRM197。活化处理包括降低荚膜多糖的大小至目标分子量、化学活化和通过超滤更换缓冲液。将纯化的CRM197结合至荚膜多糖，并且使用超滤纯化结合物，以及最后通过0.22μm的过滤器过滤。过程参数如pH、温度、浓度和时间如下。
(1)活化
步骤1
用注射用水、乙酸钠和磷酸钠稀释每种血清型多糖至1.0至2.0mg/ml的最终浓度范围。对于血清型1，添加氢氧化钠(最终碱浓度0.05M)，并且在50℃±2℃温育该溶液。然后，将溶液冷却至21至25℃，并且通过添加1M HCl停止水解，直到达到目标pH 6.0±0.1。对于血清型3，添加HCl(最终酸浓度0.01M)，并且在50℃±2℃温育该溶液。然后，将溶液冷却至21至25℃，并且通过添加1M磷酸钠停止水解，直到达到目标pH6.0±0.1。对于血清型4，添加HCl(最终酸浓度0.1M)，并且在45℃±2℃温育该溶液。然后，将溶液冷却至21至25℃，并且通过添加1M磷酸钠停止水解，直到达到目标pH 6.0±0.1。对于血清型6A，添加冰醋酸(最终酸浓度0.2M)，并且在60℃±2℃温育该溶液。然后，将溶液冷却至21至25℃，并且通过添加1M氢氧化钠停止水解，直到达到目标pH 6.0±0.1。对于血清型14和18C，添加冰醋酸(最终酸浓度0.2M)，并且在94℃±2℃温育该溶液。然后，将溶液冷却至21至25℃，并且通过添加1M磷酸钠停止水解，直到达到目标pH 6.0±0.1。
步骤2：高碘酸盐反应
使用总糖含量确定用于肺炎球菌糖活化所需的高碘酸钠的摩尔当量。通过充分混合，除了对于1、7F和19F的温度是≤10℃，对所有血清型允许氧化反应在21-25℃进行16至20小时。
步骤3：超滤
在100kDa MWCO超滤器上浓缩以及用注射用水(WFI)渗滤氧化的糖(30kDa超滤器用于血清型1，以及5kDa超滤器用于血清型18C)。对于血清型1，使用0.9％氯化钠，对于血清型7F，使用0.01M醋酸钠缓冲液(pH 4.5)，以及对于血清型19F，使用0.01M磷酸钠，实现渗滤。废弃渗透物，并且通过0.22μm的过滤器过滤渗余物。
步骤4：冷冻干燥
对于血清型3、4、5、9N、9V和14，将浓缩的糖与CRM197载体蛋白混合物进料至玻璃瓶，冻干，然后保存在-25℃±5℃。对于血清型2、6A、6B、7F、19A、19F和23F，加入指定量的蔗糖，将其计算为达到在结合反应混合物中5％±3％的蔗糖浓度。不需要向血清型1和18C添加蔗糖。然后将浓缩的糖进料至玻璃瓶，冻干，然后保存在-25℃±5℃。
(2)结合过程
对于血清型1、3、4、5、9N、9V、14和18C进行水性结合，以及对于血清型2、6A、6B、7F、19A、19F和23F进行DMSO结合。
步骤1：溶解
水性结合
对于血清型3、4、5、9N、9V和14，在室温解冻以及平衡冻干的活化的糖-CRM197混合物。然后在0.1M磷酸钠缓冲液中，以与血清型的通常比值，重建冻干的活化的糖-CRM197。对于血清型1和18C，以0.11L磷酸钠/1L CRM197溶液的通常比值，在CRM197于1M磷酸氢二钠的溶液中，重建冻干的糖。
DMSO结合
在室温平衡并且在DMSO中重建冻干的活化的糖血清型2、6A、6B、7F、19A、19F、23F和冻干的CRM197载体蛋白。
步骤2：结合反应
水性结合
对于血清型1、3、4、5、9N、9V、14和18C，通过添加氰基硼氢化钠溶液(100mg/mL)开始结合反应，以达到1.0-1.2摩尔氰基硼氢化钠/摩尔糖。在23℃至37℃温育反应混合物44-96小时。根据血清型调节温度和反应时间。然后将温度降低至23℃±2℃，并且添加0.9％氯化钠至反应器。添加硼氢化钠溶液(100mg/mL)以达到1.8-2.2摩尔当量的硼氢化钠/摩尔糖。在23℃±2℃温育混合物3-6小时。该过程还原存在于糖上的任何未反应的醛。用0.9％氯化钠稀释混合物，并且使用1.2μm预过滤器过滤稀释的结合混合物至保留容器中。
DMSO结合
对于血清型2、6A、6B、7F、19A、19F和23F，以0.8g-1.25g糖/gCRM197的比值范围混合活化的糖和CRM197载体蛋白。通过以0.8-1.2摩尔的氰基硼氢化钠与1摩尔活化的糖的比值，添加羟基硼氢化钠溶液(100mg/mL)开始结合反应。添加WFI至反应混合物达到1％(v/v)目标，并且在23℃±2℃温育该混合物11-27小时。添加100mg/mL硼氢化钠溶液(通常是1.8-2.2摩尔当量硼氢化钠溶液/摩尔活化的糖)和WFI(目标5％v/v)至反应，并且在23℃±2℃温育3-6小时。该过程还原存在于糖上的任何未反应的醛。然后，用0.9％氯化钠稀释反应混合物，并且使用1.2μm预过滤器过滤稀释的结合混合物至保留容器中。
步骤3：超滤
在具有最小20体积0.9％氯化钠或缓冲液的100kDa MWCO超滤过滤器上，浓缩和渗滤稀释的结合混合物。废弃渗透物。
步骤4：无菌过滤
100kDa MWCO渗滤之后，通过0.22μm过滤器过滤渗余物。在过滤的产物上进行过程质量控制(糖含量、游离蛋白、游离糖、残余的DMSO和残余的氰化物；对于DMSO结合，除此外残余的DMSO)。进行过滤的渗余物的过程质量控制以确定是否需要另外的浓缩、渗滤和/或稀释。必要时，用0.9％氯化钠稀释过滤的结合物以达到小于0.55g/L的最终浓度。在该阶段进行糖含量、蛋白含量和糖:蛋白质比值的释放测试。最后，过滤(0.22μm)结合物，并且进行释放测试(外观、游离蛋白、游离糖、内毒素、分子大小确定、残留的DMSO、糖识别、CRM197识别)。将最终本体浓缩的溶液保存在2℃-8℃。
实施例3：配制多价肺炎球菌结合疫苗
基于批量体积和大部分糖的浓度，计算最终的本体浓缩物所需的体积。在所需的0.85％氯化钠(生理盐水)的量后，添加聚山梨酯80和琥珀酸缓冲液至预标记的配制容器中，添加本体浓缩物。然后充分混合并且通过0.22μm的膜灭菌过滤制品。在添加本体磷酸铝期间及以后，轻轻地混合配制的本体。如果必要，检测并调节pH。将配制的本体产物保存在2-8℃。0.5ml体积的产物包含2μg每种糖，除了在4μg的6B；大约34μgCRM197载体蛋白；0.125mg元素铝(0.5mg磷酸铝)佐剂；4.25mg氯化钠；295μg琥珀酸钠缓冲液；和100μg聚山梨酯80。
实施例4：多价肺炎球菌结合疫苗的免疫原性
测试多价肺炎球菌疫苗，即实施例3中制备的疫苗组合物(SK-15)在兔中诱导免疫原性应答的能力。这些免疫原性效果通过血清IgG浓度的抗原特异性ELISA和抗体功能的调理吞噬(opsonophagocytic)测定(OPA)来表征。用计划的人类临床剂量的各种多糖(2μg每种PS，除了4ug 6B)，在第0周和第3周使新西兰白兔肌内免疫。免疫后每3周，采样血清。
测量血清型特异性IgG浓度
以500ng/孔将每种血清型的荚膜多糖(PnP)涂覆在96孔板上。从每个受试者采样等效量的血清，并且将其汇集为组。依次用包含4ug/mL吐温20(C-PS)和4ug/mL血清型22F荚膜多糖(PnP 22F)的抗体稀释缓冲液稀释血清池10次，然后在室温反应30分钟。用洗涤缓冲液洗涤板5次，然后用预吸附和稀释的50uL血清涂覆孔板，并且使其在室温温育18小时。以相同的方式洗涤孔板，然后将山羊抗兔IgG-碱性磷酸酯酶结合物(1:50000)添加至每个孔，随后在室温温育2小时。根据以上描述的洗涤板，并且添加作为基质的1mg/mL对硝基苯胺缓冲液至每个孔，然后在室温温育2小时。通过添加50uL 3M NaOH淬灭反应，并且在405nm和690nm处测量吸光度。作为比较例，使7价疫苗(Prevnar 7，Pfizer)和13价疫苗(Prevnar 13，Pfizer)经受相同的过程。结果示于图1-15。
功能免疫原性测试(OPA)
通过测试OPA测定中的血清，评估抗体功能。从每个受试者采样等效量的血清，汇集成组并且稀释10次。根据血清型将肺炎链球菌培养在THY培养基中，并且稀释至1000CFU/10uL。混合200uL调理缓冲液、10uL稀释的血清、和10uL稀释的肺炎链球菌，并使其在室温反应1小时。添加预分化的HL-60细胞和补体的混合物，并使其在CO2温室(37℃)中反应1小时。降低温度以停止吞噬作用，并且将5uL反应物涂到预干燥30-60分钟的琼脂板上。在CO2温室(37℃)中温育板12-18小时，然后计数菌落。将OPA效价表示为观察到50％死亡的稀释速率。作为比较例，使13价疫苗(Prevnar 13，Pfizer)经受相同的过程。结果示于表1-3。
[表1]
初次免疫3周后，15种多糖血清型的OPA效价
血清型 Prevnar 13 SK-15 血清型 Prevnar 13 SK-15
1 1:16 1:4 9V 1:256 1:256
2 - 1:128 9N - 1:512
3 不稀释 不稀释 14 1:256 1:256
4 1:128 1:128 18C 1:1024 1:1024
5 1:64 1:32 19A 1:512 1:256
6A 1:512 1:256 19F 1:256 1:128
6B 1:256 1:128 23F 1:256 1:256
7F 1:1024 1:1024 - - -
[表2]
二次免疫3周后，15种多糖血清型的OPA效价
血清型 Prevnar13 SK-15 血清型 Prevnar 13 SK-15
1 1:64 1:64 9V 1:512 1:512
2 - 1:512 9N - 1:2048
3 1:2 1:4 14 1:1024 1:1024
4 1:1024 1:1024 18C 1:1024 1:512
5 1:256 1:256 19A 1:1024 1:1024
6A 1:2048 1:2048 19F 1:1024 1:512
6B 1:2048 1:2048 23F 1:2048 1:2048
7F 1:2048 1:2048 - - -
[表3]
二次免疫6周后，15种多糖血清型的OPA效价
血清型 Prevnar 13 SK-15 血清型 Prevnar 13 SK-15
1 1:64 1:64 9V 1:512 1:512
2 - 1:512 9N - 1:2048
3 1:4 1:4 14 1:1024 1:1024
4 1:1024 1:1024 18C 1:2048 1:2048
5 1:512 1:512 19A 1:2048 1:1024
6A 1:2048 1:2048 19F 1:1024 1:512
6B 1:2048 1:1024 23F 1:2048 1:2048
7F 1:2048 1:2048 - - -
通过功能性抗体的IgG ELISA和补体介导的OPA评估本发明的疫苗制剂的血清型特异性免疫应答和比较例的血清型特异性免疫应答。图1-15示出了IgG ELISA的结果，以及表1-3示出了通过比较治疗组中的免疫应答由OPA得到的功能性免疫原性测量的结果。这些结果示出了15价肺炎球菌多糖结合疫苗将诱导等价于或优于Prevnar-13的IgG效价和功能性抗体的活性。

Claims (8)

1.一种多价免疫原性组合物，包含：15种不同的多糖-蛋白质结合物以及生理用载体，其中，每种所述多糖-蛋白质结合物包含来自结合至载体蛋白的肺炎链球菌的不同血清型的荚膜多糖，并且所述荚膜多糖由血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9N、9V、14、18C、19A、19F和23F制备。
2.根据权利要求1所述的多价免疫原性组合物，其中，所述载体蛋白是CRM197。
3.根据权利要求1所述的多价免疫原性组合物，进一步包含佐剂。
4.根据权利要求3所述的多价免疫原性组合物，其中，所述佐剂是铝类佐剂。
5.根据权利要求4所述的多价免疫原性组合物，其中，所述佐剂选自由磷酸铝、硫酸铝和氢氧化铝组成的组。
6.根据权利要求5所述的多价免疫原性组合物，其中，所述佐剂是磷酸铝。
7.一种药物组合物，用于诱导对肺炎链球菌荚膜多糖结合物的免疫应答，所述药物组合物包含免疫学有效量的权利要求1至6中任一项所述的多价免疫原性组合物。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其中，所述多价免疫原性组合物是单一0.5ml剂量，被配制为包含：
除了在4μg的6B，2μg的每种糖；
大约34μg的CRM197载体蛋白；
0.125mg的元素铝(0.5mg磷酸铝)佐剂；以及
作为赋形剂的氯化钠和琥珀酸钠缓冲液。
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