DE69937571T2 - Mutiertes cholera holotoxin als hilfsmittel - Google Patents

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Diese Erfindung betrifft die Verwendung eines immunogenen mutanten Cholera-Holotoxins mit im Vergleich zu einem Wildtyp-Cholera-Toxin verminderter Toxizität und einer anderen Substitution als Asparaginsäure für die Glutaminsäure in Position 29 der A-Untereinheit des Cholera-Holotoxins als ein Adjuvans zur Steigerung der in einem Vertebraten-Wirt stattfindenden Immunantwort auf ein ausgewähltes Antigen.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Das Immunsystem verwendet verschiedene Mechanismen, um Pathogene anzugreifen. Nicht alle dieser Mechanismen sind nach der Immunisierung notwendigerweise aktiviert. Eine durch Immunisierung induzierte Schutzimmunität hängt von der Fähigkeit des Impfstoffs ab, die geeignete Immunantwort auszulösen, um dem Pathogen zu widerstehen oder es zu eliminieren. Je nach dem Pathogen können hierfür eine zellvermittelte und/oder eine humorale Immunantwort erforderlich sein.
  • Eine Substanz, welche nach gemeinsamer Verabreichung mit einem Immunogen oder einem Antigen die Immunantwort verstärkt, ist als Adjuvans bekannt.
  • Das Gram-negative Bakterium Vibrio cholerae (V. cholerae) ist das ursächliche Agens für die Magen-Darm-Krankheit Cholera. Der von V. cholerae hervorgerufene Durchfall ist auf die Sezernierung des Cholera-Toxins (CT) zurückzuführen.
  • Das CT umfasst eine einzelne A-Untereinheit (CT-A), welche für die enzymatische Aktivität des Toxins verantwortlich ist, 5 identische B-Untereinheiten (CT-B), die bei der Bindung des Toxins an Epithelzellen des Darms eine Rolle spielen sowie andere Zellen, welche auf ihrer Oberfläche das Gangliosid GM1 enthalten. Zusammen umfassen die CT-A-Untereinheit und die CT-B-Untereinheiten ein Holotoxin. Die Sequenz des CT ist beschrieben worden (Literaturverzeichnis Nr. 1).
  • Das CT ist ein hexaheteromerer Komplex, der aus einem A-Polypeptid und 5 identischen B-Polypeptiden besteht (2). Das B-Pentamer wird für die Bindung an das Rezeptor-Gangliosid GM1 auf der Zelloberfläche benötigt (3). Die A-Untereinheit kann innerhalb der einzigen über eine Disulfid-Bindung ausgebildeten Schleife zwischen C187 und C199 proteolytisch gespalten werden, um das enzymatisch aktive Al-Polypeptid (4) und das kleinere Polypeptid A2 zu bilden, welches das Fragment A1 an das B-Pentamer bindet (5). Nach Eintritt in die Enterozyten wird ein regulatorisches G-Protein (Gsα) von CT-A1 ADP-ribosyliert, was zu einer konstitutiven Aktivierung der Adenylat-Cyclase, einer erhöhten intrazellulären Konzentration von cAMP und der Sekretion von Flüssigkeit und Elektrolyten in das Lumen des Dünndarms führt (6). In vitro wird die ADP-Ribosyltransferase-Aktivität des CT durch die Gegenwart von ARF genannten akzessorischen Proteinen stimuliert (7), kleinen GTP-bindenden Proteinen, von denen bekannt ist, dass sie beim Vesikeltransport innerhalb der eukaryotischen Zelle eine Rolle spielen.
  • Der Bedarf nach effektiven Immunisierungsverfahren ist besonders bei infektiösen Organismen akut, die am Körper akute Infektionen verursachen oder sich durch die Oberflächen des Magen-Darm-Trakts, der Lunge, des Nasen-Rachen-Raums oder des Urogenital-Trakts Zutritt zum, Körper verschaffen. Diese Bereiche sind in Schleim getaucht, welcher Immunglobuline enthält, die größtenteils aus sekretorischem IgA bestehen (8, 9, 10). Dieser Antikörper stammt von einer großen Zahl von IgA-produzierenden Plasmazellen, welche die unter diesen Mucosa-Membranen liegenden Lamina-propria-Abschnitte infiltrieren (11, 12). Unter der Wirkung der sekretorischen Komponente wird das IgA spezifisch zur Lumenoberfläche transportiert (13).
  • Parenterale Formen der Immunisierung sind jedoch bei der Induktion von sekretorischen IgA-Antworten gewöhnlich unwirksam. Eine sekretorische Immunität wird meistens über die direkte Immunisierung von Mucosa-assoziierten lymphatischen Geweben erreicht. Nach ihrer Induktion an einer Stelle der Mucosa treten die Vorläufer der IgA-produzierenden Plasma-Zellen aus und verteilen sich auf verschiedene Mucosa-Gewebe, wo eine abschließende Differenzierung zu einer IgA-Synthese mit hoher Ausbeute auftritt (14, 15, 16). Ausgedehnte Studien haben gezeigt, dass es möglich ist, die Schleimhaut zu immunisieren, um dieses allgemeine Immunsystem der Mukosa zu induzieren (17), aber die großen Dosen an Antigen, welche zum Erreichen einer wirksamen Immunisierung benötigt werden, haben abgesehen von seltenen Ausnahmen, diesen Ansatz für gereinigte Impfstoff-Antigene unbrauchbar gemacht. Unter den untersuchten Strategien zur Überwindung dieses Problems befindet sich die Verwendung von Mukosa-Adjuvanzien. Es ist bekannt, dass das CT eines der potentesten Adjuvanzien darstellt und dass die gemeinsame Verabreichung des CT mit einem nicht verwandten Antigen zu einer Induktion gleichzeitiger Antworten von zirkulierenden Antikörpern und Antikörpern der Mucosa gegen dieses Antigen führt (18). Somit kann das CT als ein Adjuvans wirken.
  • Die internationale Patentveröffentlichung WO 97/29771 befasst sich allgemein mit einem immunogenen entgifteten Protein, welches die Aminosäuresequenz der Untereinheit A des Choleratoxins umfasst, wobei mindestens eine Aminosäure durch eine andere Aminosäure substituiert ist, und die Veröffentlichung fasst frühere Veröffentlichungen zusammen, in welchen Mutanten des Choleratoxins an den Positionen 7, 9, 11, 44, 53, 54, 61, 63, 70, 97, 104, 106, 107, 110, 112, 114, 127, 146 oder 192, eine Doppelmutante an den Positionen 63 und 192 sowie eine Verkürzung an Position 180 beschrieben sind. Die Mutanten sind dadurch charakterisiert, dass das immunogene entgiftete Protein in gereinigter Form eine Resttoxizität aufweist, die größer ist als die um den Faktor 10.000 erniedrigte Toxizität des natürlich vorkommenden Gegenstücks. Diese Publikation gibt als Beispiel eine Mutante an der Position 106 des CT-A an, vorzugsweise eine Mutation von Prolin zu Serin (P zu S).
  • Die internationale Patentveröffentlichung WO 97/02348 betrifft entgiftete Mutanten des Choleratoxins, welche zwei Ersetzungen von Aminosäuren beim Serin an Position 63 (S63) und beim Arginin an Position 192 (R192) aufweisen, vorzugsweise durch Lysin an Position 63 (K63) und durch entweder Asparagin an Position 192 (N192) oder Glycin an Position 192 (G192). Diese Veröffentlichung fasst auch die Schriften des Standes der Technik zusammen, in welchen andere Mutanten des Choleratoxins mit einem Austausch an den Positionen 7, 9, 11, 44, 53, 54, 61, 63, 70, 97, 104, 106, 107, 110, 112, 114, 122, 127, 146 oder 192 und einer Verkürzung an Position 180 beschrieben sind.
  • Yamamoto S. et al., 1997 J. Exp. Med., 185(7): 1203–1209 beschreiben zwei Mutanten der Untereinheit A des Choleratoxins: eine mit einem Austausch der Aminosäure an Position 61 und die andere an Position 112.
  • In Glineur et al., Infection and Immunity, 1994 62(10): 4176–4185 werden zwei Mutanten der Untereinheit A des Choleratoxins beschrieben: eine mit einer Deletion der Aminosäure an Position 29 (die natürlich vorkommende Glutaminsäure ist deletiert) und die andere Mutante mit einem Austausch der natürlich vorkommenden Glutaminsäure an Position 29 durch Asparaginsäure (E29D). Glineur zeigt, dass die Deletionsmutante über eine stark verminderte ADP-Ribosyltransferase-Aktivität verfügte und keine morphologischen Veränderungen der PC12-Zellen zeigte, während die E29D-Mutante genauso aktiv war wie das Wildtyp-CT-A.
  • Es wäre von Vorzug, als Adjuvans eine Form des CT-Holotoxins einzusetzen, welche über eine verminderte Toxizität verfügt, so dass die unerwünschten Symptome der vom Wildtyp-CT hervorgerufenen Diarrhö verringert werden. Es besteht somit ein Bedarf nach der Identifizierung eines mutanten CT-Holotoxins, das in der Lage ist, die Immunantwort zu verstärken während die Toxizität des CT-Holotoxins verringert wird.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zu Grunde, als Adjuvans in einer antigenen Zusammensetzung eine mutante Form des CT-Holotoxins zu verwenden, welches im Vergleich mit einem Wildtyp-CT über eine verminderte Toxizität verfügt, um die Immunantwort in einem Vertebraten-Wirt gegen ein ausgewähltes Antigen von einem pathogenen Bakterium, Virus, Pilz oder Parasiten zu steigern.
  • Diese Aufgaben der Erfindung werden mit einem mutanten Cholera-Holotoxin gelöst, welches bei der Aminosäure 29 der A-Untereinheit eine Punktmutation aufweist, wobei der Glutaminsäurerest durch Histidin ersetzt ist. Das mutierte CT (auch als CT-CRM bezeichnet) ist als Adjuvans in einer antigenen Zusammensetzung zur Verstärkung der Immunantwort in einem Vertebraten-Wirt gegen ein ausgewähltes Antigen von einem pathogenen Bakterium, Virus, Pilz oder Parasiten von Nutzen. Das mutante CT wird mit Hilfe konventioneller Techniken mittels ortsgerichteter Mutagenese der das Wildtyp-CT codierenden DNA erzeugt. Die antigene Zusammensetzung kann ferner ein Verdünnungsmittel oder eine Trägersubstanz umfassen.
  • Die Erfindung betrifft auch Verfahren, die Fähigkeit einer ein ausgewähltes Antigen von einem pathogenen Bakterium, Virus, Pilz oder Parasiten enthaltenden antigenen Zusammensetzung zu steigern, um die Immunantwort eines Vertebraten-Wirts auszulösen, indem es eine wirksame unterstützende Menge eines mutanten Cholera-Holotoxins enthält, wobei das Holotoxin im Vergleich mit einem Wildtyp-CT eine verminderte Toxizität aufweist und die Glutaminsäure an der Aminosäureposition 29 der A-Untereinheit des Cholera-Holotoxins durch Histidin ersetzt ist.
  • Die Erfindung betrifft ferner Plasmide, die isolierte und gereinigte DNA-Sequenzen enthalten, welche DNA-Sequenzen umfassen, die ein immunogenes mutantes Cholera-Holotoxin mit einer Histidin-Substitution an Position 29 der A-Untereinheit des Cholera-Holotoxins codieren, und wobei eine derartige DNA-Sequenz funktionsfähig an einen von Arabinose induzierbaren Promotor gebunden ist, sowie geeignete, mit derartigen Plasmiden transformierte, transduzierte oder transfizierte Wirtszellen. Das immunogene mutante Cholera-Holotoxin wird gewonnen, indem eine Wirtszelle mit einem oben beschriebenen Plasmid transformiert, transduziert oder transfiziert wird und die Wirtszelle unter Bedingungen kultiviert wird, welche die Expression dieses rekombinanten, immunogenen, entgifteten Proteins durch die Wirtszelle gestatten.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • 1 zeigt die Kapazität von CT-CRMs zur Bindung des Gangliosids GM1. Jedes CT-CRM wurde bei einer Anfangskonzentration von 3 μg/ml dreifach verdünnt und zweimal untersucht. Die Bindungskapazität wurde als die mittlere Extinktion bei 410 nm für jede Verdünnung ausgedrückt.
  • 2 zeigt die Reduktion der nasalen Kolonisierung in mittleren Log10-KBE pro Nase in mit rekombinantem Pilin (rPilin) aus Meningokokken mit oder ohne CT-CRME29H-Adjuvans intranasal immunisierten Mäusen (n = 5 pro Gruppe), oder in nicht immunisierten Mäusen, wo dann jede Gruppe dem homologen Meningokokken-Bakterienstamm ausgesetzt wurde.
  • 3 zeigt die Reduktion der nasalen Kolonisierung in mittleren Log10-KBE pro Nase in mit rPilin aus Meningokokken mit oder ohne CT-CRME29H-Adjuvans, mit dem Klasse 1-Außenmembranprotein (PorA) von Meningokokken mit CT-CRME29H-Adjuvans und mit KLH mit CT-CRME29H-Adjuvans intranasal immunisierten Mäusen (n = 5 pro Gruppe), oder in nicht immunisierten Mäusen, wo dann jede Gruppe dem homologen Meningokokken-Bakterienstamm ausgesetzt wurde.
  • 4 zeigt die Reduktion der nasalen Kolonisierung in mittleren Log10-KBE des Meningokokkenstamms 870227 pro Nase in mit Meningokokken-rPilin, mit PorA aus dem Meningokokkenstamm H355, mit PorA aus dem Meningokokkenstamm 870227, mit hitzeinaktivierten ganzen Zellen des Meningokokkenstamms 870227 oder mit KLH jeweils mit CT-CRME29H-Adjuvans intranasal immunisierten Mäusen (n = 10 pro Gruppe), wo dann jede Gruppe einem heterologen Meningokokken-Bakterienstamm (870227) ausgesetzt wurde.
  • 5 zeigt die Reduktion der nasalen Kolonisierung in mittleren Log10-KBE des Meningokokkenstamms 870227 pro Nase in mit mit PorA aus dem Meningokokkenstamm H355 mit CT-CRME29H- oder MPLTM-Adjuvans, mit KLH mit MPLTM-Adjuvans oder mit hitzeinaktivierten ganzen Zellen des Meningokokkenstamms 870227 mit MPLTM-Adjuvans subkutan immunisierten Mäusen (n = 10 pro Gruppe), wo dann jede Gruppe einem heterologen Meningokokken-Bakterienstamm (870227) ausgesetzt wurde.
  • 6 zeigt einen ersten Assay der Antigen-abhängigen cytolytischen Aktivität gegen Zielzellen, die mit dem RSV (Respiratory Syncytical Virus) infiziert wurden, aufgetragen als Prozentsatz der Zelllyse gegen das Verhältnis von Effektor:Target.
  • 7 zeigt einen ersten Assay des Schutzes der Mäuselunge gegen einen RSV-Angriff mittels Immunisierung mit dem F-Protein plus Adjuvans, wobei der Titer des Lungenvirus als Log10-KBE pro Gramm gemessen ist.
  • 8 zeigt einen zweiten Assay der Antigen-abhängigen cytolytischen Aktivität gegen Zielzellen, die mit RSV infiziert wurden, aufgetragen als Prozentsatz der Zelllyse gegen das Verhältnis von Effektor:Target.
  • 9 zeigt einen zweiten Assay des Schutzes der Mäuselunge gegen einen RSV-Angriff mittels Immunisierung mit dem F-Protein plus Adjuvans, wobei der Titer des Lungenvirus als Log10-KBE pro Gramm gemessen ist.
  • 10 zeigt für Rotaviren spezifische Serum-Antikörper-Reaktionen in BALB/c-Mäusen, die intranasal mit 2/6-VLPs mit oder ohne CT-CRME29H-Adjuvans immunisiert worden waren. Die BALB/c-Mäuse wurden intranasal mit 2/6-VLPs mit (n = 49) oder ohne (n = 5) CT-CRME29H immunisiert und es wurden die Rotavirus-spezifischen Konzentrationen von IgG (10A), IgM (10B) und IgA (10C) gemessen. Die Standardabweichungen sind angegeben.
  • 11 zeigt Rotavirus-spezifische Serum-Antikörper-Reaktionen in mit 2/6-VLPs immunisierten BALB/c-Inzuchtmäusen. Die Gruppen der BALB/c-Mäuse wurden in den Wochen 0 und 2 oral (Quadrat, n = 4), intranasal (Rhombus, n = 5) oder in Kombination (intranasal plus oral, Kreis, n = 4) mit 2/6-VLPs plus CT-CRME29H immunisiert. Die Serumproben wurden in den angegebenen Wochen von einzelnen Mäusen gesammelt und die Serumkonzentrationen von IgG (11A), IgM (11B) und IgA (11C) für jede Maus mit Hilfe eines ELISA bestimmt. Für jede Gruppe wurden die geometrischen Mittel der Konzentrationen (GMT) berechnet und gegen die Wochen nach der Immunisierung aufgetragen.
  • 12 zeigt die Antikörper-Unterklassen IgG1 und IgG2a n BALB/c-Mäusen. Zur Ermittlung der IgG-Unterklassen wurden die oral oder intranasal mit virusähnlichen Partikeln (VLPs) plus CT-CRME29H vor der Behandlung immunisierten Seren der BALB/c-Mäuse verwendet. Die Standardabweichungen sind angegeben.
  • 13 zeigt Rotavirus-spezifische Darm-Antikörper-Reaktionen in mit 2/6-VLPs immunisierten BALB/c-Inzuchtmäusen. Wie für 11 beschrieben, wurden die Gruppen der BALB/c-Mäuse mit 2/6-VLPs plus CT-CRME29H immunisiert und die Konzentrationen der Rotavirus-spezifischen Darm-IgA (13A) und -IgG (13B) gemessen. In keiner der Mäuse wurde Rotavirus-spezifisches Darm-IgM nachgewiesen.
  • 14 zeigt den Schutz von mit 2/6-VLP immunisierten BALB/c- und CD-1-Mäusen nach dem Angriff durch einen murinen Rotavirus. 14A zeigt einen Vergleich der prozentualen Verminderung des Antigen-Shedding (percent reduction in antigen shedding, PRAS) zwischen mit 2/6-VLPs mit (n = 5) oder ohne (n = 4) CT-CRME29H immunisierten Mäusen. Die PRAS für jede Maus (*) sowie der Mittelwert für jede Gruppe (–) wurden berechnet. 14B zeigt die Gruppen von BALB/c-Mäusen, welche, wie gezeigt, auf verschiedenen Wegen mit 2/6-VLP plus CT-CRME29H immunisiert worden waren und die Schutzkonzentrationen wurden wie oben beschrieben ermittelt. 14C zeigt die Gruppen von CD-1-Mauskreuzungen, die wie oben beschrieben mit 2/6-VLP plus CT-CRME29H oral und intranasal immunisiert worden sind. In Woche 26 wurden die immunisierten Mäuse und die Kontrollmäuse einem Angriff mit Viren ausgesetzt und die PRAS wie oben beschrieben berechnet. In der oralen Gruppe (n = 4) starb eine Maus vor dem Angriff (n = 3 für den Schutz).
  • Genaue Beschreibung der Erfindung
  • Hier wird die Nützlichkeit von mutanten Formen des CT als Adjuvanzien für antigene Zusammensetzungen beschrieben. Es wurde ein Satz mutanter CT-Klone (CT-CRMs) in E. coli erzeugt. Die Daten zeigen, dass der CT-CRM mit überlegenen Adjuvans-Eigenschaften die Mutante mit einer nicht-konservativen Aminosäuresubstitution (Histidin für Glutaminsäure) an Position 29 in der A-Untereinheit (CT-CRME29H) ist. Die gesamten Daten zeigen, dass der CT-CRME29H ein Holotoxin und weniger toxisch als das Wildtyp-CT ist. Wichtig ist, dass der CT-CRME29H in der Lage ist, nach entweder einer intragastralen (IG) oder intranasalen (IN) Verabreichung von verschiedenen Impfstoff-Antigenen die Immunantwort in der Mucosa oder eine systemische Immunantwort zu verstärken. Diese Impfstoff-Antigene stammen entweder von bakteriellen oder viralen Pathogenen. Die Ergebnisse in den murinen Modellen einer Helicobacter felis-, Rotavirus- und RSV (Respiratory Syncytical Virus)-Infektion zeigen, dass die durch intragastrale oder intranasale Immunisierung mit einem mit CT-CRME29H hergestellten Impfstoff erleichterten Immunantworten Schutz gewähren. Die Daten zeigen, dass CT-CRME29H als Adjuvans mindestens ebenso aktiv ist wie das Wildtyp-CT. Selbst in Gegenwart von vorher auftretenden Anti-CT-Immunantworten ist CT-CRME29H in der Lage, als Mucosa-Adjuvans zu fungieren.
  • Das mutante CT-A behielt seine Fähigkeit bei, sich mit dem CT-B zusammen zu schließen, um ein Holotoxin zu bilden, das in seiner Adjuvans-Aktivität dem Wildtyp-CT glich, aber im Vergleich mit einem Wildtyp-CT eine verminderte Toxizität aufwies. Die B-Untereinheiten können über ihre native Sequenz verfügen oder sie können selbst mutiert sein.
  • Das erhaltene verminderte Ausmaß an Toxizität sorgt für ein verändertes CT zur Verwendung als Adjuvans. Das immunogene mutante CT gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt eine im Gleichgewicht befindliche verminderte Toxizität und beibehaltene Adjuvans-Aktivität, so dass das Protein als Adjuvans fungiert, während es von dem mit der antigenen Zusammensetzung immunisierten Vertebraten-Wirt sicher toleriert wird.
  • Die antigenen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung modulieren die Immunantwort, indem sie die Immunantwort und zellvermittelte Immunität des Vertebraten-Wirts nach Verabreichung einer antigenen Zusammensetzung mit einem aus einem pathogenen Bakterium, Virus, Pilz oder Parasiten ausgesuchten Antigen sowie einer wirksamen adjuvanten Menge eines mutanten CT verbessern, wobei das CT im Vergleich mit einem Wildtyp-CT eine verminderte Toxizität aufweist und die Glutaminsäure an der Position 29 der A-Untereinheit des Cholera-Holotoxins durch Histidin ersetzt ist.
  • Der hier verwendete Ausdruck "das Holotoxin weist eine verminderte Toxizität auf" bedeutet, dass die CT-CRM-Mutante, ebenso wie die CT-CRME29H-Mutante, im Vergleich mit dem Wildtyp-CT pro Einheit gereinigten Toxin-Proteins eine im wesentlichen geringere Toxizität zeigt, was die Mutante in die Lage versetzt, als Adjuvans in einer antigenen Zusammensetzung eingesetzt zu werden, ohne dass dadurch signifikante Nebenwirkungen auftreten.
  • Der hier verwendete Ausdruck "effektive adjuvante Menge" bedeutet für die CT-CRM-Mutante wie für die CT-CRME29H-Mutante eine Dosis, die geeignet ist, in einem Vertebraten-Wirt eine verstärkte Immunantwort auszulösen. Die jeweilige Dosierung hängt vom Alter, dem Gewicht und dem Befinden des Wirts sowie vom Verfahren der Verabreichung ab. Geeignete Dosen werden vom Fachmann leicht bestimmt.
  • Wie weiter unten in Beispiel 1 beschrieben, wurden fünf CT-CRMs mit den folgenden Mutationen in der A-Untereinheit erzeugt:
    Aminosäure Nativ Mutante Abkürzung
    7 Arginin Lysin CT-CRMR7K
    11 Arginin Lysin CT-CRMR11K
    29 Glutaminsäure Histidin CT-CRME29K
    110 Glutaminsäure Asparaginsäure CT-CRME110D
    112 Glutaminsäure Asparaginsäure CT-CRME112D
  • Es wurden sodann die phänotypischen Auswirkungen dieser Mutationen auf die Struktur und Funktion des CT beurteilt.
  • Wie mit Hilfe eines Gangliosid GM1-Bindungsassays (1) ermittelt, waren die varianten CT-A's R7K, E29H, E110D und E112D in der Lage, sich zu einem immunoreaktiven Holotoxin zusammenzulagern. Ein Abschnitt des gereinigten R11K schien jedoch kein Holotoxin zu sein, wenn es mit den in Beispiel 2 beschriebenen polyklonalen Antikörpern getestet wurde.
  • Jede Holotoxin-Variante wurde in einem Y-1-Assay für Nebennierentumorzellen (19) getestet um ihre Resttoxizität im Vergleich mit dem Wildtyp-CT-Holotoxin zu bestimmen.
  • Die in Tabelle 2 wiedergegebenen Ergebnisse zeigten, dass CT-CRME29H und käufliches CT-B (Sigma) eine Resttoxizität von 1,2% aufwiesen. Die Resttoxizität von 1,2% beim käuflichen CT-B war höchstwahrscheinlich auf eine Kontamination der A-Untereinheit (annähernd 0,5%) zurückzuführen. Die Resttoxität der verbleibenden CT-CRMs mit Mutationen an den Aminosäure-Positionen 1, 11, 110 oder 112 war kleiner oder gleich 0,4%.
  • Der CT-CRME29H wurde in dem patentierten Gewichts-Assay für das Intestinum der Maus (2) getestet, um die Flüssigkeitsansammlung im Intestinum als in vivo-Maß für die Toxizität zu veranschlagen. Die in Tabelle 3 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass CT- CRME29H bei der Stimulierung eines Anstiegs der Flüssigkeitsansammlung im Darmtrakt von Mäusen signifikant weniger aktiv war als das Wildtyp-CT.
  • Jeder CT-CRM wurde auch in einem ADP-Ribosyltransferase-Aktivitäts-Assay mit dem CT verglichen. Die Ergebnisse waren im Allgemein in Übereinstimmung mit den in dem Y-1-Assay für Nebenierenrindenzellen gewonnenen und legten nahe, dass die Mutation in der A1-Untereinheit zu einer verminderten ADP-Ribosyltransferase-Aktivität durch die verschiedenen CT-CRMs führte, wenn sie mit dem Wildtyp-CT verglichen wurde (Tabelle 4). Die Mutante mit der größten Enzymaktivität schien CT-CRME29H zu sein. Diese Aktivität betrug etwa 10% von der des Wildtyp-CT.
  • Die Trypsinisierung von CT-CRME29H verursachte eine Aufspaltung des CT-A in die Fragmente A1 und A2 auf eine Art und Weise, die von einer auf der Western-Blot-Analyse beruhenden Behandlung des Wildtyp-CT nicht zu unterscheiden ist. Dies führt zu einem weiteren Beweis dafür, dass die Struktur des CT-CRME29H der des Wildtyp-CT ähnlich ist.
  • Die offensichtlichen Unterschiede in der Aktivität des Y-1-Assays für Nebennierentumorzellen und des ADP-Ribosylierung-Aktivitäts-Assays sind auf die Trypsin-Aktivierung des mutanten Holotoxins in letzterem Assay zurückzuführen. Somit trägt das Fehlen der CT-A-Spaltung in die A1- und A2-Untereinheit in Folge der verminderten Protease-Aktivität in E. coli zu der Schwächung des von E. coli exprimierten CT-CRME29H bei. Insgesamt zeigen die vereinigten Daten, dass CT-CRME29H ein Holotoxin ist, welches sich an das Gangliosid GM1 bindet und signifikant weniger toxisch ist als das Wildtyp-CT.
  • Es wurde eine Reihe von Untersuchungen durchgeführt, um die Wirksamkeit von CT-CRME29H als Mucosa-Adjuvans für Zusammensetzungen zu beurteilen, welche bakterielle oder virale Antigene enthalten, die wie folgt als Impfstoffkandidaten identifiziert worden sind: (1) von nicht typisierbarem Hämophilus influenzae (NTHi) stammendes rekombinantes P4-Protein, welches auch als Protein "e" (rP4) (21) bekannt ist, rekombinantes NTHi-P6-Protein (rP6) (22) und das gereinigte native Adhäsions- und Penetrationsprotein von Hämophilus influenzae (Haps) (23); (2) das rekombinante Urease-Protein (rUrease) von Helicobacter pylori (24); (3) das rekombinante Klasse 1-Pilin von Neisseria meningitidis Gruppe B (25) und das Klasse 1-Außenmembran-Protein von Neisseria meningitidis Gruppe B (26); (4) das gereinigte native Fusionsprotein des RSV (Respiratory Syncytical Virus) (RSV F) (27) und (5) die 2/6-virusähnlichen Teilchen vom Rotavirus (28).
  • CT-CRME29H wurde als ein Adjuvans für das NTHi-rP4-Protein und das NTHi-rP6-Protein mit vier anderen CT-Mutanten und mit dem Wildtyp-CT verglichen. Die Ergebnisse zeigten, dass die 5 unterschiedlichen CT-CRMs die Fähigkeit des rP4-Proteins und des rP6-Proteins zur Auslösung von systemischen humoralen Immunantworten steigerte (Tabellen 5 und 6). Beispielsweise waren zwei Wochen nach der tertiären IN-Immunisierung die Anti-rP4-IgG-Antikörpertiter der Mäuse, die mit rP4- und rP6-Proteinen, welche entweder mit CT-CRME29H oder mit CT-CRME110D formuliert worden waren, 40 Mal größer als bei Mäusen, welche mit den rekombinanten Proteinen in PBS allein immunisiert worden waren (Tabelle 5). Die Antikörpertiter von Mäusen, denen die rekombinanten Proteine plus das Wildtyp-CT-Holotoxin verabreicht worden waren, waren um das 20-fache erhöht. Die Anti-rP4-Antikörpertiter von mit CT-CRMR11K immunisierten Mäusen wurden um das 10-fache angehoben.
  • Noch dramatischere Unterschiede wurden beobachtet, wenn die Seren auf Anti-natives P6-Antikörpertiter hin untersucht wurden (Tabelle 6). Zwei Wochen nach der sekundären IN-Immunisierung waren die Serum-anti-natives P6-Antikörpertiter der Mäuse, die mit den entweder mit CT-CRME29H oder CT-CRME110D formulierten Impfstoffen immunisiert worden waren, mehr als 30 Mal größer als bei mit rP6 plus PBS immunisierten Mäusen. Im Gegensatz dazu wiesen die Impfstoffe, welche mit Wildtyp-CT hergestellt wurden, Anti-natives P6-Antikörpertiter auf, welche 90 Mal höher waren als diejenigen, welche von der mit PBS hergestellten Formulierung hervorgerufen wurden. Die Anti-natives P6-Antikörpertiter der mit entweder einem CT-CRME112D-, CT-CRME112D- oder CT-CRME112D-Präparat immunisierten Mäuse lagen nur zwei bis vier Mal höher als die von Empfängern, welche mit einem nur mit PBS allein formulierten rP4 plus rP6-Präparat immunisiert worden waren.
  • Eine Untersuchung der Protein-spezifischen Antikörper in den Ausscheidungen der Mucosa zwei Wochen nach einer tertiären Immunisierung zeigte ferner, dass die CT-CRMs das Hervorrufen lokaler Immunantworten gegen das rP4-Protein erleichterten. Darüber hinaus waren die Anti-rP4-Antikörpertiter denen vergleichbar, welche vom Wildtyp-CT induziert wurden (Tabelle 7). Lokale Antikörpertiter gegen das native P6- Protein wurden nicht nachgewiesen (Daten nicht angegeben). Somit legten die Daten, wenn sie zusammen betrachtet werden, nahe, dass die günstigsten mutanten CTs zum Hervorrufen von sowohl systemischen als auch lokalen Antikörperantworten gegen rP4- und rP6-Proteine die CT-CRMs waren, welche entweder in Position 29 oder in Position 110 eine Mutation aufwiesen.
  • Es wurde eine zusätzliche Untersuchung durchgeführt, um die Eignung von CT-CRME29H als ein Adjuvans zu bestätigen und die passende Dosis für eine IN-Immunisierung zu ermitteln (Tabelle 8). Die Ergebnisse zeigten, dass 1 μg CT-CRME29H die größten systemischen und lokalen humoralen Immunantworten gegen das rP4-Protein erleichterte. Wurde die Dosis des CT-CRME29H von 1 auf 10 oder 30 μg pro Dosis erhöht, legten die Daten nahe, dass sowohl die systemische Immunantwort als auch die Immunantwort der Mucosa vermindert wurden. Beispielsweise betrugen am Tag 48 der Untersuchung die Serum-Anti-P4-IgG-Antikörpertiter von Mäusen, die mit 10 μg CT-CRME29H immunisiert worden waren, ein siebtel von denen bei Mäusen, welche mit 1 μg CT-CRME29H immunisiert worden waren (Tabelle 8). Darüber hinaus betrugen am Tag 49 die lokalen Anti-P4-IgA-Antikörpertiter aus den bronchoalveolären und vaginalen Waschflüssigkeiten der ersteren Gruppe ein vierunddreißigstel und ein sechzehntel von denen der letzteren Gruppe von Mäusen. Die Daten zeigten, dass die lokale und systemische humorale Immunantwort der mit rP4 plus rP6/CT-CRME29H immunisierten Mäuse im Wesentlichen identisch mit denen waren, welche nach Immunisierung mit dem das Wildtyp-CT enthaltenden Impfstoff erhalten wurden (Tabelle 8).
  • Es wurde die Wirkung der Zugabe von CT-CRME29H auf die Antikörperantworten im Serum untersucht, welche durch Immunisierung mit dem Haps-Protein ausgelöst wurden. Eine Zugabe von CT-CRME29H half, im Serum eine Antikörperantwort gegen das Haps-Protein zu induzieren (Tabelle 9). Die Immunantwort wurde in den Seren in Woche 7 gesehen; in den früheren Seren wurden keine Antikörpertiter nachgewiesen. Die Anti-Haps-ELISA-Titer der aus immunisierten Mäusen erhaltenen Seren sind in Tabelle 9 wiedergegeben. Die Antworten stiegen dosisabhängig an und wurden durch Zugabe von 0,1 μg CT-CRME29H um etwa das dreifache gesteigert. Diese Steigerung trat bei beiden Dosis-Konzentrationen auf.
  • Mit Hilfe eines Maus-Modells (29) wurde die Fähigkeit der fünf unterschiedlichen CT-CRMs zur Steigerung der systemischen und lokalen Immunantwort nach intragastraler (IG) Immunisierung mit dem rUrease-Protein von H. pylori beurteilt. Die Ergebnisse waren ähnlich denen, welche mit den NTHi-Proteinen nach intranasaler Verabreichung erhalten worden sind. Die Daten zeigten, dass CT-CRME29H die Mutante mit der größten Fähigkeit darstellte, eine systemische und lokale humorale Immunantwort nach einer IG-Immunisierung zu verstärken. Die geometrischen Mittelwerte der Serum-Anti-rUrease-IgG- (Tabelle 10) und -IgA-Antikörpertiter (Tabelle 11), welche durch den mit CT-CRME29H formulierten Impfstoff ausgelöst wurden, waren am Tag 28 der Untersuchung um das sechsfache bzw. dreifache höher als diejenigen, welche durch CT-CRME110D ausgelöst wurden. Ferner waren die durch den mit CT-CRME29H formulierten Impfstoff ausgelösten Serum-IgG- und -IgA-Antikörpertiter gleich demjenigen, welcher durch den das Wildtyp-CT enthalten Impfstoff hervorgerufen wurde.
  • Besonders wichtig ist, dass die IG-Immunisierung mit der mit CT-CRME29H formulierten rUrease die größte lokale humorale Immunantwort hervorzurufen schien (Tabelle 12) Dies war nach der Untersuchung der bronchoalveolären Waschflüssigkeiten am deutlichsten. Die Anti-rUrease-IgA-Antikörpertiter in den bronchoalveolären Waschflüssigkeiten waren fünf Mal größer als die durch den mit CT-CRME110D hergestellten Impfstoff hervorgerufenen. Im Vergleich mit der Wildtyp-CT-Formulierung betrugen die Anti-rUrease-IgA-Antikörpertiter ein fünftel von deren Titer. Die proteinspezifischen IgA-Antikörpertiter in den vaginalen Waschflüssigkeiten der Gruppe, die mit dem mit CT-CRME29H formulierten Impfstoff immunisiert worden waren, waren jedoch im Wesentlichen gleich denjenigen, die von dem mit Wildtyp-CT hergestellten Impfstoff hervorgerufen worden wurden (Tabelle 12).
  • Es war bemerkenswert, dass die Daten implizieren, dass eine parenterale Immunisierung keine merklichen rUrease-spezifischen IgA-Antikörper in den bronchoalveolären Waschflüssigkeiten hervorrief, wenn sie mit denjenigen verglichen wurden, welche in Mäusen hervorgerufen werden, die mit dem mit CT-CRME29H hergestellten Impfstoff immunisiert wurden (Tabelle 12).
  • Es wurde daher eine zweite Studie durchgeführt, um die Wirksamkeit der Immunantworten zu testen, die von mit CT-CRME29H formulierter rUrease erzeugt wurden.
  • Die Daten legen nahe, dass CT-CRME29H bei der Unterstützung der Induktion protektiver Immunantworten gegen H. felis genauso wirksam ist wie das Wildtyp-CT (Tabelle 13). Die Anti-rUrease-IgA-Antikörpertiter im Serum der ersteren Gruppe waren am Tag 28 der Studie gleich denjenigen der letzteren Gruppe von Mäusen. Die proteinspezifischen IgA-Antikörpertiter in den Seren von parenteral mit rUrease plus StimulonTM QS-21 immunisierten Mäusen waren 12 Mal größer als diejenigen der IG mit dem mit CT-CRME29H hergestellten Impfstoff immunisierten Mäuse. Die proteinspezifischen IgA-Antikörpertiter in den bronchoalveolären Waschflüssigkeiten von Mäusen, die mit CT-CRME29H immunisiert worden waren, waren jedoch mehr als 10 Mal größer als diejenigen von parenteral immunisierten Mäusen (Tabelle 13).
  • Die Ergebnisse legen eine Korrelation zwischen IG-Immunisierung und der Fähigkeit von Mäusen nahe, H. felis aus dem Magengewebe zu vertreiben. Zehn Tage nach dem letzten Befall mit Bakterien waren 80% der Mäuse, die IG mit Impfstoffen immunisiert worden waren, welche entweder mit CT oder CT-CRME29H formuliert wurden, in der Lage, Urease enthaltende Bakterien aus den Magengeweben zu vertreiben. Im Gegensatz dazu zeigte es sich, dass natürliche Kontrollmäuse (10%), IG mit rUrease plus PBS allein immunisierte Mäuse (20%) oder subkutan mit rUrease und einer Zumischung von StimulonTM QS-21 immunisierte Mäuse (30%) über eine geringere Fähigkeit verfügen, H. felis zu entfernen (Tabelle 13). Es war bemerkenswert, dass die Daten keinen Zusammenhang zwischen der Wirksamkeit und den proteinspezifischen IgA-Antikörpertitern in den bronchoalveolären Waschflüssigkeiten nahe legten. Die proteinspezifischen IgA-Antikörpertiter in den bronchoalveolären Waschflüssigkeiten von Mäusen, die IG mit rUrease plus Wildtyp-CT immunisiert worden waren, betrugen ein zehntel derjenigen von Mäusen, die mit CT-CRME29H immunisiert worden waren (Tabelle 13). Mit beiden Impfstoffen wurden aber immer noch 80% Schutz erzielt. Somit kann die Beobachtung von lokalen humoralen Immunantworten in den Lungengeweben nur eine geringe Relevanz zu den protektiven Immunantworten aufweisen, welche sich im Magen ereignen.
  • Von Dr. Jani O'Rourke (Universität von New South Wales, persönliche Mitteilung) ist vermutet worden, dass C57BL/6-Mäuse, anders als BALB/c-Mäuse, nach einer Infektion mit H. pylori ein ähnliches Krankheitsbild aufweisen wie es beim Menschen zu beobachten ist. Um die Wirksamkeit der von CT-CRME29H unterstützten Anti-rUrease-Immunantworten zur Vertreibung von H. pylori aus den Magengeweben zu testen, wurden unter Einsatz von C57BL/6-Mäusen separate Untersuchungsreihen eingeleitet. Die Ergebnisse legten nahe, dass eine IG-Immunisierung mit rUrease, welche mit CT-CRME29H formuliert worden war, systemische und lokale humorale Immunantworten auslöste, die denjenigen ähnlich waren, welche von mit Wildtyp-CT formulierter rUrease hervorgerufen wurden (Tabelle 14). Die Anti-rUrease-IgA-Antikörpertiter im Serum und den bronchoalveolären und vaginalen Waschflüssigkeiten von Mäusen, die entweder mit Wildtyp-CT oder mit CT-CRME29H hergestellten Impfstoffen am Tag 28 der Studie immunisiert worden waren, ließen sich nicht voneinander unterscheiden. Die einzigen Unterschiede bestanden in den IgA-Antikörpertitern, welche in den Extrakten der Kotbällchen von Mäusen nachgewiesen wurden, die mit dem mit CT-CRME29H hergestellten Impfstoff immunisiert worden waren (Tabelle 14), welche Titer drei Mal höher waren. Es war bemerkenswert, dass die proteinspezifischen IgA-Antikörpertiter in den Fäzes der Mäuse, die parenteral mit rUrease plus Alaun immunisiert worden waren, wesentlich niedriger waren als diejenigen von mit entweder Wildtyp-CT- oder CT-CRME29H-Formulierungen IG immunisierten Mäusen (ein achtunddreißigstel bzw. ein vierzehntel). Somit schien das C57BL/6-Mausmodell in der Lage zu sein, die Kapazität von CT-CRME29H zur Unterstützung der nach einer IG-Immunisierung ausgelösten Immunantworten zu beurteilen. Darüber hinaus wiesen die Daten daraufhin, dass das Modell in der Lage war, die Rollen der lokalen und systemischen Immunantworten beim Schutz der Mucos-Oberflächen gegen H. pylori zu definieren.
  • Es ist berichtet worden, dass das CT für Immunantworten der Mucosa als Adjuvans kontraindiziert ist (30, 31). Die Hypothese bestand darin, dass das CT die Impfstoffe dazu veranlasste, erhöhte IgE-Antikörpertiter hervorzurufen, welche unerwünscht sind. IgE steht mit einer Idiosynkrasie und allergischen Reaktionen in Zusammenhang. Es wurde ferner impliziert, dass das Hitze-labile Enzym von E. coli (LT) oder die LT-CRMs über eine geringere Fähigkeit verfügten, erhöhte IgE-Antikörpertiter hervorzurufen. Es wurde daher geschlossen, dass LT oder LT-CRMs geeignetere Impfstoff-Adjuvanzien zum Auslösen von Immunantworten der Mucosa sind. Um diese Hypothese zu testen, wurden aus rUrease zusammengesetzte Impfstoffe entweder mit CT, LT oder CT-CRME29H formuliert und in C57BL/6-Mäusen auf ihre Fähigkeit hin getestet, nach einer IG-Immunisierung IgE-Antikörper hervorzurufen (Tabelle 15). Die Daten legten nahe, dass mit entweder CT-CRME29H oder Wildtyp-CT hergestellte Impfstoffe weniger wahrscheinlich in der Zirkulation Gesamt- oder Urease-spezifische IgE-Antikörper hervorrufen als dies mit Wildtyp-LT hergestellte tun. Tatsächlich wurde impliziert, dass mit CT-CRME29H formulierte Impfstoffe mit einer geringeren Wahrscheinlichkeit erhöhte IgE-Antikörpertiter erzeugten. Sowohl die Gesamtendpunkts- als auch die rUrease-spezifischen IgE-Antikörpertiter betrugen ein viertel von solchen Mäusen, die mit dem mit einem Wildtyp-LT hergestellten Impfstoff immunisiert worden waren (Tabelle 15). Somit legen diese Daten nahe, dass, zumindest in einer rUrease-Formulierung, CT-CRME29H vor LT als Adjuvans bevorzugt ist.
  • Ohne uns auf eine Theorie festlegen zu wollen bietet der vor kurzem von van den Akker et al. (32) vorgeschlagene Mechanismus für eine LT-Aktivität eine geeignetere Erklärung für die verminderte Toxizität von an oder um E29 veränderten CT-Varianten. Nach Spaltung der Disulfid-Schleife und Reduktion der Disulfid-Bindung, welche die Domänen A1 und A2 miteinander verbindet, wird vorgeschlagen, dass die aus den Resten 30–33 in der A1-Domäne bestehende Schleife als Folge der Bewegung der langen Helix der Domäne A2 ihre Position verändert. Substitutionen für E29 können das Verhalten der Schleife 30–33 verändern, was zu einer Abnahme der Aktivierung von CT-A1 führt. Eine mögliche Erklärung für die verminderte Toxizität von CT-Y30WAH und CT-G34GGP kann durch Effekte auf der 30–33-Schleife erklärt werden, welche für die Aktivierung von CT-A1 schädlich sind. Der nächste Schritt auf dem vorgeschlagenen Aktivierungsweg ist die Bewegung der gesamten 25–36-Schleife, was die Wechselwirkungen zwischen R25 und Y55 unterbricht. CT-R25G zeigte eine Abnahme der Toxizität in einem größeren Ausmaß als CT-R25W, möglicherweise weil die Seitenketten von R25 und Y55 an den hydrophoben Wechselwirkungen beteiligt sind, welche durch CT-R25W bewahrt werden können, aber nicht von CT-R25G. Die Phänotypen unserer Varianten stimmen mit dem von van den Akker et al. vorgeschlagenen Modell (32) zur Aktivierung von hitzelabilen Enterotoxinen überein.
  • Es wurde eine Reihe von Experimenten durchgeführt, um die Wirksamkeit von CT-CRME29H als Mucosa- und parenterales Adjuvans für zwei Impfstoffkandidaten aus Neisseria meningitidis Gruppe B zu beurteilen. Der erste Kandidat war ein rekombinantes Klasse-1-Pilin (rPilin) (25). Der zweite Kandidat war ein Klasse-1-Außenmembran-Protein (PorA), welches von einem mutanten Meningokokken-Stamm exprimiert wurde, der das Klasse 2/3-Protein nicht exprimierte (26).
  • In einem ersten Experiment wurde ein Mucosa-Adjuvanzien-Effekt dadurch gezeigt, dass die Titer von rPilin-spezifischen Serum-IgG-Antikörpern in Gruppen, denen CT-CRME29H zugesetzt worden war, um 3- bis 19-fache Zuwächse im Vergleich mit den Titern erhöht wurden, die in Mäusen erhalten wurden, welche rPilin in Saline empfingen (Tabelle 16). Spezifisches Serum-IgA erfuhr auch einen Zuwachs um das 3- bis 5-fache in den Mäusen, welche mit in CT-CRME29H (mit sowohl 0,1 als auch 1,0 μg) verabreichtem rPilin immunisiert worden waren. Es ist bemerkenswert, dass CT-CRME29H (1 μg) das rPilin-spezifische IgA in den nasalen, vaginalen und bronchoalveolären Waschwassern um das 3- bis 10-fache verstärkten. Ferner reduzierte eine IN Immunisierung mit rPilin plus CT-CRME29H signifikant die nasale Kolonisierung des homologen N. meningitidis GruppeB-Stamms bis auf die Nachweisgrenze in Swiss-Webster-Mäusen (2).
  • Es wurde ein zweites Experiment durchgeführt, um zu zeigen, dass CT-CRME29H den Schutz von rPilin gegen einen homologen Meningkokken-Stamm verstärkte. Wie in Tabelle 17 gezeigt, waren die Serum-IgG-Titer des Meningokokken B-Whole-Cell-ELISA in der Gruppe mit rPilin plus CT-CRME29H mindestens um das vier-fache erhöht im Vergleich mit dem homologen Stamm sowie bei den heterologen Stämmen FAM18 und M982 im Vergleich mit den Titern aus Mäusen, die rPilin allein empfingen. Als Kontrolle induzierten bei jedem der untersuchten Stämme mit KLH plus CT-CRME29H immunisierte Mäuse kein Serum-IgG im Whole-Cell-ELISA. In Tabelle 18 waren die rPilin-spezifischen IgG- und IgA-Antikörpertiter in der Gruppe mit rPilin plus CT-CRME29H im Vergleich mit der Gruppe ohne Adjuvans erhöht. Darüber hinaus schützte CT-CRME29H als Mucosa-Adjuvans für rPilin Mäuse gegen eine nasale Kolonisierung durch den homologen GruppeB-Meningokokken-Stamm (3).
  • Als nächstes wurde die Immunogenizität von PorA plus CT-CRME29H bei einer IN Immunisierung gezeigt. Die Gruppe, welche PorA mit CT-CRME29H-Adjuvans empfing, rief erhöhte Serum-IgG-Antikörpertiter gegen Ganzzellen von N. meningitidis H44/76 hervor und erzeugte im Vergleich mit einer PorA-Gruppe ohne Adjuvans 7- bis 14-fach höhere PorA-spezifische Antikörpertiter (Tabelle 19). Serum-IgG-Antikörper gegen PorA H44/76 konnten jedoch nicht nachgewiesen werden. Es wurden auch keine PorA-spezifischen Antikörper in jeder der gesammelten Proben der Mucosa-Sekretion nachgewiesen (Tabelle 19).
  • Ein viertes Experiment wurde durchgeführt. um zu zeigen, dass CT-CRME29H den Schutz durch entweder rPilin oder PorA gegen einen heterologen Meningokokken-Stamm verstärkte. Die Daten, insbesondere aus Tabelle 20, zeigen, dass eine IN Verabreichung von mit CT-CRME29H verabreichtem Klasse 1-rPilin oder PorA nicht nur für hohe Serum-Antikörpertiter gegen Antigene und Ganzzellen von Meningokokken sorgte, sondern auch Swiss-Webster-Mäuse gegen eine nasale Kolonisierung durch einen heterologen Stamm von Gruppe B-N. meningitidis schützte. Speziell steigerte CT-CRME29H im Vergleich mit der Gruppe ohne Adjuvans die Serum-Antikörperantwort gegen Klasse 1-rPilin. Ähnlich sorgte die Klasse 1-rPilin-Gruppe mit Adjuvans für eine beschleunigte Befreiung der Nase von Bakterien.
  • Als nächstes wurde die Fähigkeit von CT-CRME29H untersucht, als Adjuvans für eine parenterale Meningokokken-Immunisierung zu fungieren. Wie in 5 gezeigt, reduzierte PorA H355 mit entweder MPLTM oder CT-CRME29H als Adjuvans eine nasale Kolonisierung des heterologen Gruppe B-Meningokokkenstammes 870227 signifikant. Insbesondere wiesen 24 Stunden nach der Infektion subkutan mit PorA H355 plus CT-CRME29H immunisierte Mäuse noch signifikant weniger Kolonieren in der Nase auf als die Gruppe mit PorA H355 plus MPLTM. Bakterizide Aktivitäten wurden jedoch nur in den Seren aus den Gruppen nachgewiesen, die mit PorA bzw. mit in der Hitze abgetöteten Ganzzellen mit MPLTM als Adjuvans immunisiert worden waren (Tabelle 22), jedoch nicht aus der Gruppe mit PorA plus CT-CRME29H. Obwohl PorA mit CT-CRME29H als Adjuvans selbst keine homologen bakteriziden Aktivitäten ähnlich denen beim MPLTM-Adjuvans auslöste, war es bei der Reduktion der Kolonisierung durch einen heterologen Gruppe B-Meningokokkenstamm hoch wirksam.
  • Mit Hilfe des gereinigten nativen Fusionsproteins (F) wurde die Fähigkeit von CT-CRME29H untersucht, systemische und Mucosa-Immunantworten gegen Glykoproteine des RSV (Respiratory Syncytical Virus) zu steigern. Zusätzlich wurde die Wirkung von vorher existierenden Anti-CT-Antikörpern auf die Fähigkeit von CT-CRME29H als Adjuvans untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass IN mit dem F-Protein und entweder CT oder CT-CRME29H als Adjuvans immunisierte BALB/c-Mäuse systemische und lokale Anti-CT- und IgA-Antikörpertiter erzeugten (Tabelle 23). Darüber hinaus zeigten die Daten, dass die von der CT-CRME29H enthaltenden Formulierung hervorgerufenen Antikörpertiter denjenigen äquivalent waren, welche von der das Wildtyp-CT enthalten Formulierung ausgelöst worden sind. Beispielsweise waren 10 Tage nach einer sekundären Immunisierung mit F-Protein/CT-CRME29H (1 μg pro Dosis) die Serum-Anti-CT-IgA- und -IgG-Antikörpertiter nur geringfügig niedriger als diejenigen von mit F-Protein/CT (1 μg pro Dosis) immunisierten Mäusen. Ähnliche Ergebnisse wurden auch nach einer Untersuchung der vaginalen Waschflüssigkeiten von Mäusen erhalten, die mit dem F-Protein immunisiert worden waren, das mit entweder 1 oder 10 μg CT-CRME29H hergestellt wurde (Tabelle 23). Die Daten legen daher nahe, dass das CT-CRME29H ebenso immunogen war wie das Wildtyp-CT.
  • Die Frage, ob Anti-CT-Immunantworten die Immunogenizität des F-Antigens negativ beeinflussten, war der Grund für ein zweites Experiment, wo BALB/c-Mäuse zunächst durch zwei IN Verabreichungen mit entweder Wildtyp-CT oder CT-CRME29H in PBS allein geprimed wurden (Tabelle 24). Danach wurden die passenden Mäuse zwei Mal mit F-Protein immunisiert, dem entweder Wildtyp-CT oder CT-CRME29H zugemischt worden war. Eine Untersuchung der zwei Wochen nach der letzten Verabreichung gesammelten Seren (Tag 56) zeigte, dass vorher vorhandene Anti-CT-Antikörper keine negative Wirkung auf die lokale oder systemische Anti-F-Protein-IgA-Konzentration und IgA-Antikörper ausübten. Die Daten zeigten tatsächlich, dass vorher vorhandene Anti-CT-Antikörper für das Hervorrufen einer verstärkten Anti-F-Protein-Antikörperantwort günstig waren. Dies war am offenkundigsten, wenn die Anti-F-Protein-Antikörpertiter an den Mucosa-Oberflächen miteinander verglichen wurden (Tabelle 24). Zwei Wochen nach einer sekundären Immunisierung waren die Anti-F-Protein-IgA-Antikörpertiter in der bronchoalveolären und vaginalen Waschflüssigkeit von zuerst mit CT-CRME29H geprimten und dann mit F-Protein/CT-CRME29H immunisierten Mäusen 7 bzw. 17 Mal höher als die von natürlichen, allein mit F-Protein/CT-CRME29H immunisierten Mäusen (Tabelle 24).
  • In einem dritten Experiment wurden systemische Immunantworten und Immunantworten der Mucosa von IN mit RSV-F-Protein und CT-CRME29H, CT-B oder Alaun immunisierten BALB/c-Mäusen begutachtet. In Tabelle 25 sind die humoralen Immunantworten von neun Tage nach einer tertiären Immunisierung gesammelten Seren wiedergegeben. Mäuse, welche Immunisierungen mit F-Protein und entweder 1 oder 10 μg CT-CRME29H empfingen (Gruppen 777 bzw. 778) zeigten signifikant erhöhte Titer für IgG, IgG1 und IgG2 im Vergleich zu mit F/PBS, F/AlOH oder RSV immunisierten Mäusen (Gruppen 784, 785 bzw. 907). Zusätzlich waren die von F/CT-CRME29H enthaltenden Impfstoffen hervorgerufenen Titer (777 und 778) zumindest gleich denjenigen, welche von F-Protein und CTB stimuliert wurden (779 und 780).
  • Die bronchoalveolären Spülflüssigkeiten und die vaginalen und nasalen Waschflüssigkeiten wurden eine Woche nach der letzten Immunisierung von den immunisierten Tieren gesammelt, um IgA-Antikörper-ELISAs durchzuführen. Die in Tabelle 26 wiedergegebenen Daten zeigen Titer aus Pools von fünf Mäusen. Die mit CT-CRME29H immunisierten Mäuse lösten nachweisbares IgA sowohl im vaginalen als auch nasalen Waschwasser aus (Gruppen 777 und 778). IgA wurde nicht in BALs gesehen, die von mit CT-CRME29H immunisierten Mäusen stammten und dies stellte einen Gegensatz zu dem dar, was im BAL von RSV-immunisierten Mäusen (Gruppe 907) und F/CTB-immunisierten Mäusen (780) gesehen wurde. IgG wurde in allen Mucosa-Waschflüssigkeiten gesehen, einschließlich der vom BAL. Die in den Waschflüssigkeiten von CT-CRME29H-immunisierten Mäusen gesehenen IgG-Konzentrationen waren denjenigen vergleichbar, welche durch Immunisierung mit CTB (Gruppen 779 und 780) und lebenden RSV erhalten wurden.
  • In einem vierten Experiment wurde die cytolytische (CTL) Aktivität, die von in vitro stimulierten von immunisierten Mäusen stammenden Milzzellen hervorgerufen wurde, begutachtet. Die Daten sind in 6 wiedergegeben. Während die RSV-immunisierten Mäuse eine Antigen-spezifische Zelllyse von annähernd 60% zeigten, blieb die CTL-Aktivität von jeder der restlichen Mäuse unter 20%. Während CT-CRME29H in der Lage war, eine sowohl systemische Immunantwort als auch eine humorale Immunantwort der Mucosa gegen das RSV-F-Protein zu induzieren (Tabellen 25 und 26), wurden keine zellvermittelten Immunantworten gegen RSV-infizierte Zielzellen beobachtet.
  • In einem fünften Experiment wurden Virenschutz-Assays durchgeführt, um zu untersuchen, ob eine intranasale Abgabe von F/CT-CRME29H den Schutz gegen eine Infektion mit lebenden RSV begünstigt. Die Daten sind in 7 wiedergegeben.
  • Eine statistische Varianzanalyse (ANOVA) der in 7 angegebenen Ergebnisse wurde wie folgt durchgeführt:
    P < 0,05: F/PBS gegen F/CT-CRME29H (1 μg und 10 μg CT-CRME29H), F/CTB (1 μg und 10 μg), F/AlOH.
    P > 0,05: PBS/CT-CRME29H gegen F/PBS
    P > 0,05: F/CT-CRME29H (1 μg und 10 μg CT-CRME29H) gegen F/CTB (1 μg und 10 μg) gegen F/AlOH.
  • Mäuse, welche IN Impfstoffe mit F/CT-CRME29H oder F/CTB empfingen, wiesen in der Lunge virale Titer auf, die denjenigen vergleichbar waren, welche bei intramuskulär mit F/AlOH (p > 0,05) immunisierten Mäusen erhalten wurden. Ferner wurde erkannt, dass eine intranasale Immunisierung mit F/CT-CRME29H die Virentiter in der Lunge im Vergleich mit einer IN Immunisierung mit F/PBS bzw. PBS/CT-CRME29H um Log10 1,6 und Log10 1,4 reduzierten. Es wurde gefunden, dass die Unterschiede zwischen F/CT-CRME29H und F/PBS oder PBS/CT-CRME29H statistisch signifikant waren (p < 0,05).
  • In einem sechsten Experiment wurden die systemische Immunantwort und die Immunantwort der Mucosa von IN mit RSV-F-Protein und CT-CRME29H oder Alaun immunisierten BALB/c-Mäusen begutachtet. In Tabelle 27 sind die humoralen Immunantworten von zwei Wochen nach einer tertiären Immunisierung gesammelten Seren wiedergegeben. Mäuse, welche Immunsierungen mit F-Protein und 1 μg CT-CRME29H erhielten (Gruppe 256), zeigten im Vergleich zu mit F/PBS oder PBS/CT-CRME29H immunisierten Mäusen (Gruppe 250 bzw. 257) signifikant erhöhte Titer für IgG, IgG1 und IgG2. In den IgG1-Titern zwischen mit F/CT-CRME29H (256) und F/AlOH (258) immunisierten Mäusen wurden keine signifikanten Unterschiede beobachtet. Eine IN Immunisierung mit F/CT-CRME29H (256) rief jedoch im Vergleich zu einer Immunisierung mit AlOH (258) signifikant erhöhte IgG2a-Titer hervor. Zusammen genommen stehen diese Ergebnisse in Übereinstimmung mit den in Tabelle 25 gezeigten. Während Serum IgA in Gruppen von Mäusen nachgewiesen wurde, welche F/CT-CRME29H erhielten, waren die Titer viel niedriger als früher beobachtet (16,202 ± 2,031 für Gruppe 777 und 444 ± 1,458 für Gruppe 256). Die Gründe für den offensichtlichen Unterschied sind nicht klar. Nichtsdestoweniger stimmt die Fähigkeit von IN abgegebenem F/CT-CRME29H zur Induktion von Serum-IgA in beiden Untersuchungen überein und steht diesbezüglich mit der Fähigkeit von F/AlOH in einem günstigen Gegensatz.
  • Von den immunisierten Tieren wurden zwei Wochen nach der abschließenden Immunisierung die bronchoalveolären Spülflüssigkeiten und die vaginalen und nasalen Waschwasser gesammelt, um IgG- und IgA-Antikörper-ELISAs durchzuführen. Die in Tabelle 28 wiedergegebenen Daten zeigen die Titer von Pools von fünf Mäusen. Ähnlich den in Tabelle 26 gezeigten Ergebnissen wiesen mit CT-CRME29H immunisierte Mäuse (Gruppe 256) sowohl in den vaginalen als auch nasalen Waschwassern nachweisbare IgA-Titer auf. Wieder ähnlich wie in den in Tabelle 26 angegebenen Daten konnte IgA, das von mit CT-CRME29H immunisierten Mäusen stammte, nicht beobachtet werden. In allen Waschwassern der Mucosa einschließlich denjenigen aus dem BAL, wurde jedoch IgG nachgewiesen. Die in den Waschwassern von mit F/CT-CRME29H immunisierten Mäusen beobachteten IgG-Konzentrationen waren mindestens denjenigen vergleichbar, die durch Immunisierung mit lebenden RSV erhalten wurden (Tabelle 28, Gruppe 256 gegen Gruppe 259).
  • In einem siebten Experiment wurde die cytolytische (CTL) Aktivität, die von in vitro stimulierten von immunisierten Mäusen stammenden Milzzellen hervorgerufen wurde, begutachtet. Die Daten sind in 8 wiedergegeben. Während die RSV-immunisierten Mäuse eine Antigen-spezifische Zelllyse von annähernd 45% zeigten, blieb die CTL-Aktivität von jeder der restlichen Mäuse unter 10%. Die Daten bestätigen die Unfähigkeit einer IN Immunisierung mit F/CT-CRME29H, einen zellvermittelten Immun-Abwehrmechanismus gegen RSV-infizierte Zielzellen in der Lymphocytenpopulation der Milz zu induzieren. Dies bestätigt die frühere Beobachtung (8).
  • In einem achten Experiment wurden zusätzliche Virenschutz-Assays durchgeführt, um zu untersuchen, ob eine intranasale Abgabe von F/CT-CRME29H den Schutz gegen eine Infektion mit lebenden RSV begünstigt.
  • Eine statistische Analyse mit ANOVA der in 9 wiedergegebenen Ergebnisse wurde wie folgt durchgeführt:
    P < 0,05: F/PBS gegen F/CT-CRME29H, F/AlOH, RSV.
    P < 0,05: Naiv gegen F/CT-CRME29H, F/AlOH, RSV.
    P > 0,05: F/CT-CRME29H gegen F/AlOH, RSV.
  • Ähnlich den in 7 wiedergegebenen Ergebnissen kontrollierten Mäuse, welche IN Impfstoffe mit F/CT-CRME29H empfingen, die Virusreplikation in der Lunge bis zu einem Ausmaß, welches statistisch demjenigen vergleichbar war (p > 0,05), das in intramuskulär bei mit F/AlOH oder IN mit lebenden RSV (Log10 1,7 gegenüber Log10 1,99 bzw. 1,94) immunisierten Mäusen erreicht wurde. Eine IN Immunisierung mit F/PBS (erster Balken) oder nicht immunisierte Mäuse (naiv) zeigten in der Lunge Virustiter von Log10 4,5 bzw. Log10 4,3. Diese Gruppen hatten ferner in der Lunge Virustiter, von denen gefunden wurde, dass sie im Vergleich mit Virustitern, die bei mit F/CT-CRME29H, F/AlOH oder lebenden RSV immunisierten Mäusen erhalten wurden, statistisch erhöht waren (p < 0,05). Daher stützen die Daten die Folgerung, dass eine IN Instillation von F/CT-CRME29H gegen infektiöse RSV-Infektionen Schutz gewährt.
  • In einem neunten Experiment wurde die Anti-F-Serum-Antikörperantwort beurteilt. Die Ergebnisse zeigten, dass in mit F/CT-CRME29H (0,1 oder 1,0 μg) immunisierten Mäusen im Vergleich mit denjenigen, welchen in PBS allein abgegebenes F-Protein verabreicht wurde, das Anti-F-Protein-IgG signifikant erhöht war (Tabelle 29). Zusätzlich war das F-Protein entweder mit 0,1 oder 1,0 μg CT-CRME29H als Adjuvans bei der Stimulation von Anti-F-Protein-IgG-Antworten mindestens ebenso wirksam wie entweder F/AlOH (intramuskulär) oder eine experimentelle Infektion mit RSV. Die Höhe der Anti-F-Protein-Antikörpertiter hing von der CT-CRME29H-Dosis in der Formulierung ab, so dass die Titer in Mäusen, welche 1,0 μg CT-CRME29H gegenüber 0,01 μg empfingen, signifikant größer waren. Im Vergleich mit F/PBS waren sowohl die Anti-F-Protein-IgGl- als auch die -IgG2-Titer mit entweder 0,1 oder 1,0 μg CT-CRME29H erhöht. CT-CRME29H stimulierte sowohl das Immunkompartiment von Typ 1 als auch von Typ 2. Im Vergleich mit einer experimentellen Infektion mit RSV wurden durch eine IN Immunisierung mit F/CT-CRME29H (0,1 oder 1,0 μg) signifikant höhere Serum-Anti-F-Protein-IgA-Antworten stimuliert. Im Gegensatz dazu wurden keine Serum-IgA-Anti-F-Protein-Antikörper als Antwort auf F/PBS (IN) oder die parenterale Verabreichung von F/AlOH beobachtet (Tabelle 29).
  • Die Anti-CT-Titer folgten auch einem Dosis-abhängigen Muster, welches mit den Anti-F-Protein-Titern übereinstimmte (Tabelle 29). Statistisch äquivalente Anti-CT-Titer wurden in Seren beobachtet, die aus mit entweder CT-CRME29H (1,0 μg) oder mit F/CT-CRME29H (1,0 μg) immunisierten Mäusen erhalten wurden. Im Vergleich mit F/CT-CRME29H (0,1 oder 0,01 μg) waren diese Titer jedoch signifikant erhöht. Darüber hinaus waren im Vergleich mit den Titern aus mit F/CT-CRME29H (0,01 μg) immunisierten Mäusen die Anti-CT-Titer in den Seren von mit F/CT-CRME29H (0,1 μg) immunisierten Mäusen statistisch erhöht. Daher ist die Adjuvanzienwirkung von CT-CRME29H für Anti-F-Protein-Antikörper-Antworten mit der Antikörperantwort gegen das mutante Cholera-Holotoxin korreliert (r = 0,97).
  • In diesem neunten Experiment wurde auch die Immunität der Mucosa beurteilt. IgA in der Mucosa wurde nur in den gepoolten nasalen Waschflüssigkeiten (NW) aus mit entweder F/CT-CRME29H (1,0 μg) oder F/CRME29H (0,1 μg) immunisierten Mäusen beobachtet (Tabelle 30). Zusätzlich hatten auch Mäuse, die IN Immunisierungen mit gereinigtem F-Protein und CT-CRME29H (0,01 bis 1,0 μg) empfingen, Anti-F-Protein-IgA in den vaginalen Waschflüssigkeiten (VW). F-Protein-spezifisches IgG wurde in der bronchoalveolären Spüllösung (BAL), VW und/oder NW von Mäusen beobachtet, die F/CT-CRME29H (0,01 und 1,0 μg) oder F/AlOH erhielten. Im Gegensatz dazu wurde Anti-F-Protein-IgA in IM mit F/AlOH immunisierten Mäusen nicht nachgewiesen.
  • In einem zehnten Experiment wurde die funktionelle Immunität in Mäusen beurteilt, die mit F-Protein immunisiert wurden, welches mit CT-CRME29H formuliert worden war. In Gegenwart des Komplements wurden im Vergleich mit der Verabreichung von F/PBS oder CT-CRME29H allein statistisch erhöhte neutralisierende Anti-RSV-Antikörper in den Seren von Mäusen nachgewiesen, welche F-Protein und entweder 0,1 oder 1,0 μg CT-CRME29H, F/AlOH oder RSV A2 empfangen hatten (Tabelle 31). In Abwesenheit des Komplements wurden in keiner der Gruppen nachweisbare neutralisierende Titer beobachtet (log10 < 1,3). In Übereinstimmung mit den Antikörper-Daten des Serums und der Mucosa (Tabellen 29 und 30) reichte eine Immunisierung mit F/CT-CRME29H (0,01 μg) nicht aus, um neutralisierende Anti-RSV-Antikörper zu erzeugen.
  • In einem elften Experiment wurden immunisierte Mäuse zwei Wochen nach einer tertiären Immunisierung infiziert, um die Fähigkeit von F/CT-CRME29H zu ermitteln, gegen eine nachfolgende Infektion zu schützen. Die Ergebnisse zeigen, dass mit F/CT-CRME29H immunisierte (0,1 oder 1,0 μg) Mäuse geschützt wurden (Tabelle 32). Im Vergleich mit naiven Mäusen oder mit F/PBS oder CT-CRME29H allein immunisierten Mäusen wiesen die Lungen von mit F-Protein und entweder 0,1 oder 1,0 μg CT-CRME29H immunisierten Mäusen signifikant reduzierte Virus-Konzentrationen auf. Zusätzlich wurden in den nasalen Geweben von mit F/CT-CRME29H (0,1 oder 1,0 μg) immunisierten Mäusen im Vergleich mit nicht immunisierten naiven Mäusen oder mit F/PBS-immunisierten Mäusen verminderte Virus-Konzentrationen beobachtet. Im Gegensatz dazu zeigten parenteral mit F/AlOH immunisierte Mäuse im Vergleich mit F/PBS-immunisierten Mäusen verringerte Virus-Titer im Lungengewebe, jedoch keine signifikante Verminderung im Nasengewebe. Insgesamt war eine IN Verabreichung von F/CT-CRME29H (0,1 oder 1,0 μg) ausreichend, um sowohl lokale als auch systemische humorale Immunantworten hervorzurufen, die einen Beitrag zum Schutz des Lungengewebes gegen eine nachfolgende Infektion mit lebenden RSV geleistet haben könnten.
  • Die in Beispiel 10 angegebenen Daten lieferten einen lebensfähigen Ansatz zur Entwicklung eines IN Impfstoffs für das RSV-F-Protein. Die Daten zeigen, dass die Produktion von sowohl humoralem IgG und IgA als auch von IgG und IgA in der Mucosa von einer IN Abgabe von F/CT-CRME29H stimuliert wird. Dass die beobachteten Antikörpertiter signifikant waren, wird auf zwei Arten gezeigt: Erstens waren der humorale Antikörpertiter und der Antikörpertiter der Mucosa, welche jeweils in mit F/CT-CRME29H immunisierten Mäusen analysiert wurden, im Vergleich zu mit F/PBS immunisierten Mäusen qualitativ ähnlich und quantitativ erhöht. Zweitens werden, wie von dem beobachteten Ausmaß des in den 7 und 9 gezeigten Schutzes angezeigt, die erhöhten Titer in eine biologisch relevante Immunantwort umgesetzt. Eine Immunisierung mit F/CT-CRME29H verstärkte im Vergleich zur Immunisierung mit F/PBS oder PBS/CT-CRME29H den Schutz gegen eine Infektion mit lebenden RSV signifikant.
  • Zusammen genommen legen die Daten einen Mechanismus nahe, bei dem die Neutralisation eines infektiösen Virus entweder durch die Immunglobuline der Mucosa oder durch humorale Immunglobuline eine Rolle spielt, welche in Reaktion auf das F/CT-CRME29H enthaltende IN Immunisierungs-Protokoll stimuliert werden.
  • Es wurden Mäuse mit einem anderen viralen Antigen, einem Rotavirus in Form eines rekombinant exprimierten VP2- und VP6-Proteins, immunisiert. Es wurden rekombinante Baculovirus-Vektoren konstruiert, welche, wie zuvor beschrieben (28), SA11-Rotavirus-VP2 und -VP6 exprimieren; es ist bekannt, dass rekombinant exprimierte Strukturproteine von Rotaviren sich selbst zu Partikeln zusammenlagern, die morphogenetisch nicht von Virionen unterschieden werden können. Die so exprimierten Proteine lagerten sich miteinander zu 2/6-Virus-ähnlichen Partikeln (VLPs) zusammen.
  • Es wurden BALB/c-Inzucht-Mäuse mit einem homogenen genetischen Hintergrund eingesetzt, wobei erwartet wurde, dass sie alle auf eine Immunisierung ansprechen und so das Profil von systemischen Immunglobulinen und Immunglobulinen der Mucosa gegen VLPs allein und in Kombination mit CT-CRME29H-Adjuvans klären. Es wurden auch genetisch heterogene nicht verwandte CD1-Mäuse eingesetzt, um die Wirkung von genetischer Diversität auf die bei der Induktion von Immunität und Schutz beteiligten Faktoren zu ermitteln.
  • Die Seren aller immunisierten BALB/c- und CD-1-Mäuse mit Ausnahme von zwei oral immunsierten CD-1-Mäusen, die nicht reagierten, enthielten Antikörper von sowohl VP2 als auch VP6. Die Seren aus der Vorimmunisierung sowie die Seren von nicht immunisierten Mäusen zeigten kein virales Antigen in mock-infizierten und/oder VP2–6-Baculovirus-infizierten Zellen. 2/6-VLP-immunisierte Seren oder für VP6 und VP2 spezifische mAbs, die nicht infizierten Zellen ausgesetzt wurden, zeigten ebenfalls keine Reaktivität (Daten nicht gezeigt). Die Immunogenität von 2/6-VLP wurde auch mit einer Western-Blot-Analyse unter Einsatz von vorher infiziertem und immunisiertem Serum von jeder Maus gegen 2/6-VLP sowie den SA11-Stamm des Rotavirus bestätigt (Daten nicht gezeigt).
  • Die Muster von Rotavirus-spezifischem Serum-IgG, -IgM und -IgA in der IN mit 2/6-VLPs allein immunisierten Gruppe waren ähnlich denen in der mit 2/6-VLPs und CT-CRME29H immunisierten Gruppe (10). In Woche 13 jedoch waren die Konzentrationen der drei Serum-Antikörper-Isotypen signifikant höher bei den Tieren, die 2/6-VLPs zusammen mit CT-CRME29H erhielten (10) (P = 0, P = 0,004 und P = 0,02 für IgG, IgM bzw. IgA.). Dies zeigte, dass CT-CRME29H signifikant erhöhte humorale Antworten gegen 2/6-VLPs aufwies. Woche 13 wurde als Anzeiger für die Antikörper-Konzentrationen ausgewählt, die nach zwei Immunisierungen aber vor der Infektion hervorgerufen wurden.
  • Wie in 11A gezeigt, produzierten BALB/c-Mäuse, denen VLPs IN gegeben wurden, eine größere Rotavirus-spezifische systemische IgG-Antwort als die oral immunisierten. Statistisch signifikante Unterschiede in den Serum-IgG-Titern zwischen den beiden Gruppen waren in Woche 13 offensichtlich (P = 0). Ähnlich waren die Serum-IgM-Titer in der IN Gruppe gegenüber der oralen Gruppe höher, wenn die Werte vor der Infektion (Woche 13) analysiert wurden (P = 0) (11B). Die Serum-IgM-Titer wiesen in Woche 2 ein Maximum auf und fielen in der IN Gruppe und der gemischten Gruppe in Woche 4 ab, während in der oralen Grippe während der gesamten Untersuchung niedrige aber relativ konstante Konzentrationen von Serum-IgM nachgewiesen wurden. Peak-Serum-IgA-Titer in oral und IN immunisierten Tieren traten in Woche 4 auf.
  • Die drei experimentellen Gruppen wiesen keine signifikanten Unterschiede in den Serum-IgA-Titern auf, wenn sie in Woche 13 untersucht wurden (11C). Insgesamt rief eine IN Immunisierung höhere Titer von systemischen IgG- und IgM-Antworten hervor als bei einer oralen Immunisierung. Die Induktion von signifikant hohen Konzentrationen an IgG und IgM in der IN Gruppe stützt die Auffassung, dass eine IN Immunisierung der bevorzugte Weg für eine Verabreichung künftiger Impfstoffkandidaten sein kann (33). Somit könnte eine zu starken systemischen neutralisierenden Antworten führende IN Immunisierung gegen virale Pathogene wirksam sein, welche die Barrieren der Mucosa durchdringen.
  • Sowohl IgG1 als auch IgG2 wurden im Serum der IN und der oral immunisierten BALB/c-Mäuse gefunden (12). Im Vergleich mit der oralen Gruppe wies die IN Gruppe statistisch signifikant höhere Titer von beiden IgG-Unterklassen auf (IgG1, P = 0,005; IgG2, P = 0,05). Innerhalb jeder Gruppe gab es jedoch keine signifikanten Unterschiede zwischen den Unterklassen. Diese Daten bestätigen die Nützlichkeit einer IN Immunisierung für eine wirksame Induktion von beiden Wegen der T-Helferzellen (TH-1 und TH-2).
  • Der Peak-Titer von fäkalem IgA für alle drei experimentellen Gruppen trat vier Wochen nach der ersten Immunisierung auf (13A) und fiel zeitlich mit der Zeit zusammen, zu der die Serum-IgA-Titer in oral und IN immunisierten Mäusen am höchsten waren (11C). Zwischen den drei Immunisierungs-Protokollen wurden keine signifikanten Unterschiede gefunden, wenn die fäkalen IgA-Titer vor der Infektion untersucht wurden (13A). Fäkales IgG war ebenfalls in Woche 4 am höchsten (13B); im Vergleich mit der oralen oder gemischten Gruppe wies die IN Gruppe in Woche 13 jedoch signifikant höhere IgG-Werte auf (P = 0 bzw. P = 0,002). Im Allgemeinen produzierten alle 2/6-VLP-immunisierten Mäuse Serum-IgG, -IgM, und -IgA sowie fäkales IgG und IgA. In keinem der Tiere wurde fäkales IgM nachgewiesen.
  • Alle CD-1-Mäuse, die 2/6-VLPs IN erhielten (n = 4) und zwei von vier oral immunisierten Mäusen produzierten Rotavirus-spezifische Antikörperantworten (Daten nicht gezeigt). Um das Profil der Antikörperantworten genauer zu bestimmen, wurden wöchentlich 26 Wochen lang Serumproben und fäkale Proben analysiert. Das Induktionsmuster von Serum-Antikörpern und fäkalen Antikörpern in den CD-1-Mäusen ähnelte dem in den BALB/c-Mäusen (11 und 13).
  • Im Gegensatz zu der IN Immunisierung mit 2/6-VLPs allein (PRAS = 39%) (P = 0,007) erwiesen sich in BALB/c-Mäusen zwei IN Immunisierungen mit 2/6-VLPs und CT-CRME29H als Schutz gewährend (PRAS = 98,7%). Die gemischte Immunisierung, IN gefolgt von einer oralen Immunisierung, schützte die Mäuse in einem der oralen und IN Gruppe ähnlichen Ausmaß, was zeigte, dass in BALB/c-Mäusen auch eine gemischte Immunisierung effektiv war. Dies zeigte die signifikante Steigerung bei auf CT-CRME29H beruhenden schützenden Immunantworten. Die BALB/c-Mäuse in allen drei Immunisierungs-Gruppen wiesen einen nahezu vollständigen Schutz vor der Infektion auf. Die PRAS betrug 99,6%, 98,8% und 98,8% für die orale, IN bzw. gemischte Gruppe (14B). Die nicht immunisierte Kontrollgruppe nahm signifikant mehr virales Antigen auf als die drei immunisierten Gruppen (P = 0) Es gab keine signifikanten Unterschiede zwischen den PRAS-Werten für die drei immunisierten Gruppen.
  • Eine IN Immunisierung induzierte in allen immunisierten CD-1-Mäusen sowohl systemische Antworten als auch Antworten der Mucosa und gewährte diesen Tieren Schutz (PRAS = 97,9%) (14C). Nur zwei von vier oral immunisierten CD-1-Mäusen zeigten systemische Antikörperantworten und Antikörperreaktionen der Mucosa sowie einen Schutz (2 von 3, PRAS 65,8%) (14C); im Gegensatz dazu zeigten alle oral immunisierten BALB/c-Mäuse Antworten der Mucosa und systemische Antworten und wurden geschützt. Insbesondere wurde die CD-1-Maus, die keine Immunantwort aufbaute, nicht vor einer Infektion geschützt, während immunreaktive Mäuse geschützt wurden (14C). Eine Maus in der oralen Gruppe mit keiner Antikörperreaktion auf eine Immunisierung starb vor der Infektion. Als Kontrollen wurden zwei CD-1-Mäuse eingesetzt, um die Anzahl der Proben in der Analyse der Antikörperantworten zu verringern. Die statistische Analyse zeigte jedoch klar, dass die Schutzergebnisse signifikant waren (P = 0, bei einem Vertrauenskoeffizient von 95%). Das Experiment mit der oralen Immunisierung wurde mit CD-1-Mäusen unter den gleichen Bedingungen wiederholt, mit der Ausnahme, dass die Tiere eher in Woche 13 als in Woche 26 infiziert wurden. Bei Einsatz von vier Mäusen in den immunisierten Gruppen und fünf Mäusen als Kontrollen wurde ein ähnliches Ausmaß an Schutz beobachtet (PRAS = 71,2%) (Daten nicht gezeigt). Insgesamt stützen diese Ergebnisse die vor kurzem von O'Neal et al. veröffentlichten (34, 35), was nahe legt, dass in CD-1-Mäusen eine intranasale Immunisierung effektiver ist als eine orale Immunisierung.
  • Angesichts dieser aufgezeigten Nützlichkeit von CT-CRME29H als Impfstoff-Adjuvans ist die Produktion geeigneter Mengen dieses Materials erwünscht. Mit Hilfe von pIIB29H (in Beispiel 1 beschrieben) wurden verschiedene Versuche unternommen, CT-CRME29H in E. coli zu exprimieren. Die erhaltene Ausbeute an gereinigtem CT-CRME29H-Holotoxin betrug annähernd 50 μg pro Liter Kulturmedium. Anfängliche Versuche, die CT-CRME29H-Ausbeute über Modifikationen am ursprünglichen Plasmid pIIB29H zu steigern, um das Plasmid pPX2492 zu erzeugen (siehe Beispiel 1), zeigten nur eine geringe oder gar keine Wirkung. Eine moderate Steigerung der Ausbeute wurde durch eine gemeinsame Expression von pIIB29H und Derivaten mit Vibrio cholerae DsbA und E. coli RpoH erzielt. Die Coexpression und Modifikationen bei der Reinigung erhöhten die Ausbeute an CT-CRME29H auf ca. 2 mg pro Liter.
  • Um die Expression von CT-CRME29H zu steigern, wurde der mit Lactose induzierbare Promotor durch einen mit Arabinose induzierbaren Promotor (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) ersetzt, der funktionsfähig mit der DNA-Sequenz verbunden war, welche CT-CRME29H codiert. Während des Klonens wurde ermittelt, dass das Plasmid pIIB29H ein mit einem ctxB-Gen von Vibrio cholerae Stamm 2125 verbundenes ctxA-Gen von V. c. Stamm 569B enthielt. Ein Crossalignment dieser Gene zeigte sieben Basen-Substitutionen zwischen den beiden ctxB-Genen und einen einzigen Basenaustausch zwischen den ctxA-Genen. Einige dieser Basen-Substitutionen führten zu Änderungen der Aminosäure in den reifen Untereinheiten. Von besonderem Interesse ist die Substitution zwischen den ctxA-Genen, welche zu einer Änderung der Aminosäure innerhalb des A-2-Abschnitts oder der Holotoxin-Assembly-Domäne der A-Untereinheit führt. Es war nicht bekannt, ob die Heterogenizität zwischen diesen Genen eine negative Auswirkung auf die Expression des Toxins oder den Zusammenbau des Holotoxins ausübte; vorzugsweise vom evolutionären Standpunkt aus wurde jedoch gedacht, dass beide Gene für die Toxin-Untereinheiten aus der gleichen Quelle stammen. Als solche stammten sowohl das ctxA-Gen als auch das ctxB-Gen, welche bei der Konstruktion des durch Arabinose induzierbaren Systems eingesetzt wurden, von Vibrio cholerae Stamm 569B. Die Konstruktion des Plasmids pPX7490 erfolgt wie in Beispiel 12 beschrieben. Die Produktion von CT-CRME29H beträgt etwa 30 mg gereinigtes Material pro Liter Kulturmedium.
  • Die Erfindung betrifft ferner Plasmide, welche isolierte und gereinigte DNA-Sequenzen enthalten, die DNA-Sequenzen umfassen, welche für ein immunogenes mutantes Cholera-Holotoxin mit einer anderen Substitution als Asparaginsäure an der Position 29 der A-Untereinheit des Cholera-Holotoxins codieren, und in welchen eine solche DNA-Sequenz funktionsfähig mit einem durch Arabinose induzierbaren Promotor verbunden ist, sowie geeignete mit derartigen Plasmiden mittels konventioneller Techniken transformierte, transduzierte oder transfizierte Wirtszellen.
  • Es werden verschiedene Wirtszell-Plasmid-Vektorsysteme eingesetzt, um das immunogene mutante Cholera-Holotoxin zu exprimieren. Das Vektorsystem, welches vorzugsweise den durch Arabinose induzierbaren Promotor enthält, ist kompatibel mit der verwendeten Wirtszelle. Geeignete Wirtszellen umfassen mit Plasmid-DNA, Cosmid-DNA oder Bakteriophagen-DNA transformierte Bakterien; Viren wie das Vaccinia-Virus und das Adenovirus; Hefe wie Pichia-Zellen; Insekten-Zellen wie Sf9- oder Sf21-Zellen oder Zelllinien von Säugetieren wie Ovarzellen des chinesischen Hamsters sowie andere konventionelle Organismen.
  • Verschiedene konventionelle Transkriptions- und Translationselemente können für das Wirtszell-Vektorsystem verwendet werden. Die das CT-CRM codierende DNA wird in ein Expressionssystem insertiert und der Promotor (vorzugsweise der durch Arabinose induzierbare Promotor) sowie andere Kontrollelemente werden in spezifische Stellen innerhalb des Vektors ligiert, so dass die das CT-CRM codierende DNA von der Wirtszelle exprimiert wird, wenn der Plasmid-Vektor in die Wirtszelle (je nach dem eingesetzten Wirtszell-Vektorsystem mittels Transformation, Transduktion oder Transfektion) insertiert ist.
  • Das immunogene mutante Cholera-Holotoxin wird produziert, indem eine Wirtszelle mit einem oben beschriebenen Plasmid transformiert, transduziert oder transfiziert wird und die Wirtszelle unter Bedingungen kultiviert wird, welche die Expression dieses rekombinanten immunogenen entgifteten Proteins durch die Wirtszelle gestatten.
  • Obwohl diese Erfindung durch eine CT-CRM-Mutante mit einem Histidin an der Aminosäureposition 29 beispielhaft veranschaulicht wird, liegen andere nicht konservative Mutationen des Wildtyp-Glutaminsäurerests ebenso im Schutzumfang dieser Erfindung. Glutaminsäure ist ein saures (negativ geladenes) Molekül. Daher ist eine nicht konservative Mutation eine Mutation, bei welcher eine Substitution zu einer anderen Aminosäure als Asparaginsäure erfolgt, welche ebenfalls ein saures Molekül ist. Geeignete alternative Aminosäuren umfassen die Aminosäuren Lysin und Arginin, welche wie Histidin basische (positiv geladene) Moleküle sind. Geeignete alternative Aminosäuren umfassen ferner die Aminosäuren mit nicht polaren funktionellen Gruppen wie Alanin, Isoleucin, Leucin, Methionin, Phenylalanin, Prolin, Tryptophan und Valin, sowie die Aminosäuren mit ungeladenen polaren funktionellen Gruppen wie Asparagin, Cystein, Glutamin, Glycin, Serin, Threonin und Tyrosin.
  • Es wird eine wirksame Menge des mutanten Cholera-Holotoxins, in welcher das Holotoxin im Vergleich mit einem Wildtyp-Cholera-Holotoxin über eine verminderte Toxizität verfügt und eine andere Substitution als Asparaginsäure für die Glutaminsäure in Position 29 der A-Untereinheit des Cholera-Holotoxins aufweist, in Kombination mit einem ausgesuchten Antigen von einem pathogenen Bakterium, Virus, Pilz oder Parasiten eingesetzt, um eine antigene Zusammensetzung herzustellen, in welcher das Holotoxin in einem Vertebratenwirt die Immunantwort gegen dieses Antigen verstärkt.
  • Die antigenen Zusammensetzungen dieser Erfindung umfassen auch CT-CRM mit mindestens einer zusätzlichen Mutation an einer anderen Position als dem Aminosäurerest 29. In der internationalen Anmeldung WO 93/13202 (36) wird eine Reihe von Mutationen in der A-Untereinheit beschrieben, die dazu dienen, die Toxizität des Cholera-Holotoxins herabzusetzen. Diese Mutationen umfassen das Substituieren des Arginins in Aminosäure-Position 7, der Asparaginsäure in Aminosäure-Position 9, des Arginins in Aminosäure-Position 11, des Histidins in Aminosäure-Position 44, des Valins in Aminosäure-Position 53, des Arginins in Aminosäure-Position 54, des Serins in Aminosäure-Position 61, des Serins in Aminosäure-Position 63, des Histidins in Aminosäure-Position 70, des Valins in Aminosäure-Position 97, des Tyrosins in Aminosäure-Position 104, des Prolins in Aminosäure-Position 106, des Histidins in Aminosäure-Position 107, der Glutaminsäure in Aminosäure-Position 110, der Glutaminsäure in Aminosäure-Position 112, des Serins in Aminosäure-Position 114, des Tryptophans in Aminosäure-Position 127, des Arginins in Aminosäure-Position 146 und des Arginins in Aminosäure-Position 192. Die Nucleotidsequenz, welche die A-Untereinheit des Cholera-Holotoxins codiert, ist in der internationalen Anmeldung WO 93/13202 wiedergegeben. In der internationalen Anmeldung WO 98/42375 (37) wird beschrieben, dass Serin in Aminosäure-Position 109 in der A-Untereinheit substituiert wird, was dazu dient, die Toxizität des Cholera-Holotoxins herabzusetzen. Daher werden mit Hilfe konventioneller Techniken Mutationen an einer oder mehreren dieser zusätzlichen Positionen erzeugt.
  • Die antigenen Zusammensetzungen dieser Erfindung werden einem Menschen oder einem nicht menschlichen Vertebraten auf verschiedenen Wegen verabreicht, einschließlich aber nicht ausschließlich intranasal, oral, vaginal, rektal, parenteral, intradermal, transdermal, (siehe z. B. internationale Anmeldung WO 98/20734 (38)), intramuskulär, intraperitoneal, subkutan, intravenös und intraarteriell. Die Menge der antigenen Komponente oder Komponenten in der antigenen Zusammensetzung variiert je nach der Art des Antigens und dem Alter, dem Gewicht und dem medizinischen Befinden des Wirts sowie dem Verfahren der Verabreichung. Geeignete Dosen sind vom Fachmann wieder leicht zu bestimmen. Es ist bevorzugt, obwohl nicht erforderlich, das Antigen und das mutante CT zur gleichen Zeit zu verabreichen. Die Anzahl der Dosen und der Ablauf der Dosierungen für die antigene Zusammensetzung sind vom Fachmann ebenfalls leicht zu bestimmen. Schutz kann mit einer einzigen Dosis der antigenen Zusammensetzung verliehen werden oder es kann die Verabreichung verschiedener Dosen zusätzlich zu den zu späteren Zeitpunkten erfolgenden Booster-Dosen erfordern, um den Schutz aufrecht zu erhalten. In einigen Fällen kann die Eigenschaft des Adjuvans aus dem mutanten CT die Anzahl der benötigten Dosen oder den zeitlichen Aufwand für die Dosierungsabfolge verringern.
  • Die antigenen Zusammensetzungen dieser Erfindung können zusätzlich zu CT-CRME29H weitere Adjuvanzien umfassen. Beispiele für derartige Adjuvanzien sind, jedoch nicht ausschließlich, StimulonTM QS-21 (Aquila Biopharmaceuticals, Inc., Framingham, MA), MPLTM (3-O-deacyliertes Monophosphoryllipid A; RIBI ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT), Aluminiumphosphat, Aluminiumhydroxid und IL-12 (Genetics Institute, Cambridge, MA). Die antigenen Zusammensetzungen können auch auf konventionelle Weise mit immunologisch verträglichen Verdünnungsmitteln oder Trägern vermischt werden.
  • Das immunogene mutante Cholera-Holotoxin dieser Erfindung ist zur Verwendung als Adjuvans in antigenen Zusammensetzungen geeignet, welche ein breites Spektrum von Antigenen aus einem breiten Spektrum pathogener Mikroorganismen enthalten, einschließlich aber nicht ausschließlich solchen aus Bakterien, Viren, Pilzen oder parasitischen Mikroorganismen, welche den Menschen und nicht menschliche Vertebraten infizieren. Das Antigen kann eine ganze Zelle oder ein Virus oder eines oder mehrere Saccharide, Proteine, Protein-Untereinheiten oder -Fragmente, Poly- oder Oligonucleotide oder andere makromolekulare Komponenten umfassen. Falls gewünscht können die antigenen Zusammensetzungen mehr als ein Antigen aus gleichen oder verschiedenen pathogenen Mikroorganismen enthalten.
  • Erwünschte Bakterien Impfstoffe mit den CT-CRM-Mutanten als Adjuvans, umfassen solche, die auf die Verhinderung und/oder Behandlung von Krankheiten gerichtet sind, die, jedoch nicht ausschließlich, hervorgerufen werden von Haemophilus influenzae (sowohl typisierbar als auch nicht typisierbar), Haemophilus somnus, Moraxella catarrhalis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus faecalis, Heliobacter pylori, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci, Bordetella pertussis, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Salmonella choleraesuis, Escherichia coli, Shigella, Vibrio cholerae, Corynebacterium diphtheriae, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium-Mycobacterium intracellulare-Komplex, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Staphylococcus aureus, Clostridium tetani, Leptospira interrogans, Borrelia burgdorferi, Pasteurella haemolytica, Pasteurella multocida, Actinobacillus pleuropneumoniae und Mycoplasma gallisepticum.
  • Erwünschte Virus Impfstoffe mit den CT-CRM-Mutanten als Adjuvans, umfassen solche, die auf die Verhinderung und/oder Behandlung von Krankheiten abzielen, die, jedoch nicht ausschließlich, hervorgerufen werden von dem RSV (Respiratory Syncytical Virus), dem Parainfluenza-Virus Typen 1–3, dem Influenza-Virus, dem Herpes-simplex-Virus, dem humanen Cytomegalovirus, HIV (Human Immunodeficiency Virus), dem Hepatitis-A-Virus. dem Hepatitis-B-Virus, dem Hepatitis-C-Virus, dem humanen Papillomavirus, dem Poliovirus, dem Rotavirus, den Caliciviren, dem Masernvirus, dem Mumpsvirus, dem Rubella-Virus, dem Adenovirus, dem Tollwutvirus, dem Distemper-Virus des Hundes, dem Coronavirus, dem Parvovirus, den infektiösen Rhinotracheitis-Viren, dem felinen Leukämie-Virus, dem felinen infektiösen Peritonitis-Virus, dem infektiösen Bursa-Virus der Vögel, dem Newcastle-Disease-Virus, dem Marek-Virus, dem PRRS-Virus (Porcine Respiratory and Reproductive Syndrome Virus), dem Pferde-Arteritis-Virus und den verschiedenen Encephalitis-Viren.
  • Erwünschte Impfstoffe Gegen Pilz-Pathogene mit den CT-CRM-Mutanten als Adjuvans, umfassen solche, die auf die Verhinderung und/oder Behandlung von Krankheiten abzielen, die, jedoch nicht ausschließlich, von Aspergillis, Blastomyces, Candida, Coccidiodes Cryptococcus und Histoplasma hervorgerufen werden.
  • Erwünschte Impfstoffe gegen Parasiten mit den CT-CRM-Mutanten als Adjuvans, umfassen solche, die auf die Verhinderung und/oder Behandlung von Krankheiten abzielen, die, jedoch nicht ausschließlich, hervorgerufen werden von Leishmania major, Ascaris, Trichuris, Giardia, Schistosoma, Cryptosporidium, Trichomonas, Toxoplasma gondii und Pneumocystis carinii.
  • Die CT-CRM-Mutanten sind auch geeignet, als Adjuvans in Polynucleotid-Vakzinen (auch als DNA-Vakzine bekannt) enthalten zu sein. Derartige Impfstoffe können ferner Facilitating Agents wie z. B. Bupivicain enthalten (sie US-Patent 5,593,972 (39)).
  • CT-CRME29H wurde mit Wildtyp-CT als Adjuvans für die Verabreichung von Plasmid-DNA (pDNA) verglichen, welche die gesamte Länge des mit Bupivicain formulierten (40) Glykoproteins D des Herpes-simplex-Virus (HSV) Typ 2 (gD2) codiert. Die Ergebnisse zeigten, dass BALB/c-Mäuse, welche CT-CRME29H zusammen mit dem pDNA-Vakzin für HSV-2 auf intradermalem Wege erhielten, eine größere mittlere zelluläre Antwort auslösten als diejenigen, welche das pDNA-HSV-gD2-Vakzin allein auf intradermalem Wege erhielten (Tabelle 34). Zusätzlich war die mittlere Antikörperantwort im Serum von Mäusen, welche das pDNA-HSV-gD2-Vakzin zusammen mit CT-CRME29H erhielten etwa gleich groß wie diejenige, welche bei Mäusen zu sehen war, die das pDNA-HSV-gD2-Vakzin ohne Adjuvans erhielten (Tabelle 35).
  • Ähnlich rief das pDNA-HSV-gD2-Vakzin in den Proben mit vaginaler Waschflüssigkeit eine gD2-spezifische Antikörperantwort in Konzentrationen hervor, die denen vergleichbar waren, die nach der Zugabe eines Vakzins ohne Adjuvans auf intradermalen oder intramuskulären Wegen zu sehen waren (Tabelle 36).
  • Mäuse, die mit dem das CT-CRME29H oder CT als Adjuvans enthaltenden und auf intradermalen Wege verabreichten pDNA-HSV-gD2-Vakzin immunisiert worden waren, erzeugten im Wesentlichen höhere Konzentrationen an gamma-Interferon als Mäuse, welche das pDNA-HSV-gD2-Vakzin ohne Adjuvans erhielten (Tabelle 37). Mäuse, die das CT-CRME29H erhielten, erzeugten auch IL-5.
  • Somit steigerte das CT-CRME29H proliferative und Gamma-Interferon-Antworten, wenn es mit einem Plasmid-DNA-Impfstoff gegen HSV verabreicht wurde.
  • Um diese Erfindung besser zu verstehen, werden die folgenden Beispiele wiedergegeben. Die Beispiele dienen nur dem Zweck der Veranschaulichung und sollen den Umfang der Erfindung nicht einschränken.
  • Somit steigerte das CT-CRME29H proliferative und Gamma-Interferon-Antworten, wenn es mit einem Plasmid-DNA-Impfstoff gegen HSV verabreicht wurde.
  • Um diese Erfindung besser zu verstehen, werden die folgenden Beispiele wiedergegeben. Die Beispiele dienen nur dem Zweck der Veranschaulichung und sollen den Umfang der Erfindung nicht einschränken.
  • Beispiele
  • Beispiel 1
  • Expression der CT-Mutanten
  • Bakterienstämme, Plasmide und Wachstumsbedingungen
  • Es wurden E. coli TG1 (Amersham-Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) und TX1, ein gegen Nalidixinsäure resistentes Derivat von TG1, welches FTc, lacIq von XL1-Blue (Stratagene, LaJolla, CA; (41)) und CJ236 (FTc, lacIq) (Bio-Rad, Hercules, CA) trägt, als Wirte für das Klonieren der rekombinanten Plasmide und für die Expression der mutierten Proteine eingesetzt. Die Plasmid-enthaltenden Stämme wurden auf LB-Agarplatten mit den erforderlichen Antibiotica (Ampicillin, 50 μg/ml; Kanamycin, 25 μg/ml; Tetracyclin (10 μg/ml) gehalten. Ein vollständiges CT-Operon aus V. cholerae 0395 wurde in den Phagemid-Vektor pSKII- unter der Kontrolle des Lac-Promotors subkloniert, um das mit IPTG induzierbare Plasmid mit der Bezeichnung pMGJ67 zu erzeugen (42).
  • Mutagenese des ctxA-Gens
  • Es wurde die Methode von Kunkel (43) eingesetzt, um die im Plasmid pMGJ67 erzeugten von Oligonucleotiden abgeleiteten Mutanten auszusortieren. Die zur Erzeugung der fünf mutanten CT-CRMs verwendeten Oligonucleotide werden in Tabelle 1 beschrieben. Tabelle 1 Sequenz der in ctxA eingeführten Oligonucleotide
    Figure 00380001
    • a Die geänderten Basen sind unterstrichen; N = jede Base; K = T oder G
  • Kurz gesagt wurde jedes einzelsträngige Oligonucleotid phosphoryliert und verwendet, um die Synthese des zweiten Strangs auf einer Uracil enthaltenden einsträngigen DNA-Matrize, die von dem E. coli dut ung-Stamm CJ 236 (F'Tc, pMGJ67) gewonnen wurde, zu lenken. Nach der Ligation und Transformation des ung+-Stammes TX1 wurde die einzelsträngige DNA aus Ampa-Transformanten gewonnen und mit Hilfe der Didesoxy-Kettenterminations-Methode (44) sequenziert.
  • Konstruktion des das CT-CRME29H codierenden Plasmids
  • Das CT-CRME29H-codierende Plasmid hat die Bezeichnung pIIB29H. Das Plasmid enthält das Polycistron der V. cholerae-Gene ctxA und ctxB, welche das CT codieren. Das ctxA-Gen in diesem Plasmid wurde wie oben beschrieben mutagenisiert, um an der Aminosäure-Position 29 des CT-A ein Histidin zu codieren. Das Wildtyp-Polycistron wurde durch Entfernen des nativen mit ToxR induzierbaren Promotors und Ersetzen desselben durch einen mit Lactose induzierbaren Promotor ebenfalls verändert. Ferner wurden die die ctxA- und ctxB-Signalsequenz codierenden Abschnitte durch den Signalsequenz-codierenden Abschnitt von E. coli LT (LTIIb-B-Leader) ersetzt, um die Sekretion von CT-CRME29H zu begünstigen. In einem Versuch, die Expression von CT-CRME29H zu steigern, wurde das Plasmid pIIB29H sodann modifiziert. Das erhaltene Plasmid mit der Bezeichnung pPX2492 enthielt jeweils upstream von ctxA und ctxB synthetische Shine-Delgarno-Sequenzen. Anders als in V. cholerae, wo die beiden Gene überlappen, liegen in pPX2492 die Gene genetisch voneinander getrennt vor. Die beiden Gene besitzen auch jeweils upstream von sich die LTIIb-B-Leadersequenz.
  • Expression von mutanten ctxA-Allelen
  • Die Produktion von jedem varianten Holotoxin wurde in 5 ml Kulturen aus TB-Medium (45) in 125 ml Erlenmeyer-Kolben bei 37°C unter Schütteln (200 Upm) getestet. Die Zellen in der logarithmischen Phase (A600 = 0,8–1,0) wurden durch Zugabe von IPTG bis zu 0,4 mM induziert und über Nacht wachsen gelassen. Es wurde bis zu 1 mg/ml Polymyxin B zugegeben, gefolgt von einer Inkubation bei 37°C über einen Zeitraum von 10 Minuten. Die Zellen wurden mittels Zentrifugation entfernt und die Überstände untersucht, um, wie unten beschrieben, die Konzentrationen des Holotoxins und des B-Pentamers zu bestimmen.
  • Bei der Produktion von CT-CRME29H in E. coli spielt speziell die Coexpression des Gens rpoH von E. coli und des Gens dsbA von V cholerae eine Rolle. Diese Genprodukte nehmen an der Konformationsausbildung von sowohl der A-Untereinheit als auch der B-Untereinheit teil.
  • Beispiel 2
  • GM1-Bindungs-Assay für intaktes Holotoxin
  • Die CT-CRMs wurden in einem Gangliosid-GM1-abhängigen Festphasen-Radioimmunassay (42) untersucht, um zu ermitteln, ob nach der Reinigung intaktes Holotoxin vorliegt. Es wurde ein ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) eingesetzt, in welchem die Mikro-Wells der ELISA-Platten über Nacht bei 4°C mit dem Gangliosid GM1 (10 μg/ml) beschichtet wurden. Danach wurden der Reihe nach die folgenden Reagenzien in Abständen einer einstündigen Inkubation bei Raumtemperatur zugesetzt: CT-CRMs (titriert von 3 μg/ml bis 0,00137 μg/ml), 100 μl Kaninchen-Anti-CT-A-Seren (1:1.000) und mit alkalischer Phosphatase konjugierte Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörper (1:2.000). Um die Reaktion sichtbar zu machen, wurden 100 μl p-Nitrophenylphosphat mit einer Konzentration von 1 μg/ml in Diethanolamin zugegeben und 30 Minuten lang inkubiert. Durch Zugabe von 100 μl 2 N NaOH wurde die Reaktion gestoppt und unmittelbar mit einem Mikro-ELISA-Autoreader abgelesen. Die Daten zeigten im Vergleich mit Wildtyp-CT, dass die CT-CRMs mit Aminosäuresubstitutionen an den Positionen 7, 29, 110 oder 112 intakte Holotoxine waren (1). Die Ergebnisse implizierten jedoch, dass ein Teil des gereinigten CT-CRMR11K kein Holotoxin zu sein schien.
  • Beispiel 3
  • Y-1-Nebennierenzellen-Assay für Resttoxizität der CT-CRMs
  • Für ihre Toxizität in dem Maus-Y-1-Nebennierentumorzellen-Assay wurden die mutanten CT-CRMs mehrmals mit Wildtyp-Holotoxin verglichen. Die Y-1-Nebennierenzellen (ATCC CCL-79) wurden in 96-Well Flachboden-Platten mit einer Konzentration von 104 Zellen pro Well ausgesät. Danach wurden zu den Tumorzellen dreifache Serienverdünnungen von CT-CRMs gegeben und bei 37°C (5% CO2) 18 Stunden lang inkubiert. Die Zellen wurden sodann zum Nachweis von Toxizität mit dem Lichtmikroskop (Zellrundung) untersucht. Der Endpunktstiter wurde definiert als die minimale Konzentration an Toxin, die benötigt wird, um eine größere Zellrundung als 50% zu verursachen. Der Prozentsatz an Resttoxizität wird berechnet, indem der Endpunktstiter des Wildtyp-CT durch den vom CT-CRM verursachten Titer multipliziert mit 100 dividiert wird. In Tabelle 2 wird die Resttoxizität von verschiedenen gereinigten, mutanten, im Y-1-Nebennierenzellen-Assay untersuchten Holotoxinen angegeben. Tabelle 2 Toxizität für Y-1-Nebennierenzellen
    Y-1-Nebennierenzellen-Assay
    CT-CRM % Resttoxizität
    E112D 0,13
    E112D 0,13
    R11K 0,04
    R7K 0,04
    E110D 0,13
    E110D 0,40
    E29H 1,20
    CT-B 1,20
    CT 100,00
  • Beispiel 4
  • Patentierter Mausdarm-Gewichts-Assay
  • In diesem Assay wurden jeder Gruppe von BALB/c-Mäusen (drei Mäuse pro Gruppe) intragastral 10 μg Wildtyp-CT oder CT-CRME29H verabreicht. Drei Stunden später wurden die Mägen sorgfältig entfernt und gewogen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 wiedergegeben. Die Daten sind als mittleres Darm/Kadaver-Gewicht pro Gruppe angegeben. Tabelle 3 Toxizität von CT-CRME29H
    Assay CT CT-CRME29H PBS
    Mausdarm-Gewicht (Darm/Kadaver-Verhältnis 0.13 ± 0.01 0.09 ± 0.01a 0.08 ± 0.007
    • a p < 0,05 im Vergleich mit der Wildtyp-CT-Kontrolle, p > 0,05 im Vergleich mit PBS.
  • Beispiel 5
  • ADP-Ribosyltransferase-Assay
  • Es wurde die ADP-Ribosyltransferase-Aktivität von NAD+:Agmatin als Freisetzung von [Carbonyl-14C]Nicotinamid aus radiomarkiertem NAD+ gemessen. Kurz gesagt wurden das CT und die CT-CRMs mit Trypsin aktiviert und 30 Minuten lang bei 30°C mit 50 mM Glycin/20 mM Dithiothreitol in TEAN-Puffer (TrisTM/EDTA/Natriumazid/Natriumchlorid) (pH 8,0) inkubiert. Danach wurden zu der Reaktion die folgenden Stoffe zugegeben: 0,1 mg Trypsininhibitor aus Sojabohnen, 50 mM Kaliumphosphat, 10 mM Agmatin, 20 mM Dithiothreitol, 10 mM Magnesiumchlorid, 100 μM GTP, 3 μM Dimyristoylphosphatidyl-cholin, 0,2% Cholat, 0,03 mg Ovalbumin, 100 μM [Adenin-U-14C]NAD (DuPont NENTM, Boston, MA) und Wasser bis zu einem Endvolumen von 300 μl. Nach Inkubation über einen Zeitraum von 90 Minuten bei 30°C wurden Proben von 100 μl auf Säulen (0,64 × 5 cm) aus AG1-X2 (BioRad) aufgetragen, die fünf Mal mit 1,0 ml destilliertem/entionisiertem Wasser gewaschen wurden. Die Eluate mit dem [14C]ADP-Ribosylagmatin wurden für den Radioassay gesammelt. Die mittlere Wiedergewinnung von 14C im Eluat wird als Prozentsatz des auf die Säule aufgetragenen 14C ausgedrückt. Tabelle 4 ADP-Ribosyltransferase-Aktivität von NAD:Agmatin
    Adjuvans gebildetes ADP-Ribosylagmatin nM/hr/μg Protein) % ADP-Ribosylierungs-Aktivität
    CT, 10 μg 57,1 100
    E29H, 10 μg 6,7 11,7
    E110D, 10 μg 0,4 0,7
    E112D, 10 μg 0,9 1,6
    R7K, 10 μg 0,4 0,7
    R11K, 10 μg 0,4 0,7
  • Beispiel 6
  • Immunantworten von mit rekombinanten (r)P4- und P6-Außenmembranproteinen von nicht typisierbarem Haemophilus influenzae (NTHi) immunisierten BALB/c-Mäusen
  • In einem ersten Experiment wurden fünf BALB/c-Mäuse pro Gruppe an den Tagen 0, 21 und 35 intranasal mit einer Dosis von 10 μl immunisiert, die 5 μg rP4 oder 10 μg rP6 plus 1 μg des in den Tabellen 5 und 6 angegebenen Adjuvans enthielt (eine Gruppe erhielt kein Adjuvans). Die Anti-rP4-IgG-Antikörpertiter wurden mit einem ELISA an gepoolten an den Tagen 0, 21, 35 und 48 gesammelten Proben ermittelt und die Ergebnisse sind in Tabelle 5 wiedergegeben. Die Anti-rP6-IgG-Antikörpertiter wurden mit einem ELISA an gepoolten an den Tagen 0, 21, 35 und 48 gesammelten Proben getrennt ermittelt und die Ergebnisse sind in Tabelle 6 wiedergegeben. Zwei Wochen nach der letzten Immunisierung (Tag 49) wurden die Antikörperantworten der Mucosa ebenfalls gemessen. Tabelle 7 zeigt die IgA- und IgG-Titer aus nasalen, bronchoalveolären bzw. vaginalen Waschflüssigkeiten.
  • In einem zweiten Experiment wurden fünf BALB/c-Mäuse pro Gruppe an den Tagen 0, 21 und 35 intranasal mit einer Dosis von 30 μl immunisiert, die 5 μg rP4 oder 10 μg rP6 plus ansteigenden Dosen von CT-CRME29H, wie in Tabelle 8 angegeben, enthielt (andere Gruppen erhielten jeweils CT oder CT-B; eine Gruppe erhielt kein Adjuvans). Die Serum-Anti-rP4-IgA- und -IgG-Antikörpertiter wurden mit einem ELISA an gepoolten an den Tagen 21, 35 und 48 gesammelten Proben ermittelt und die Ergebnisse sind in Tabelle 8 wiedergegeben. Die IgA- und IgG-Titer aus bronchoalveolären und vaginalen Waschflüssigkeiten am Tag 49 wurden ebenfalls ermittelt und sind in Tabelle 8 wiedergegeben. Tabelle 5 Systemische humorale Immunantworten von BALB/c-Mäusen, die mit rekombinanten, mit mutanten Cholera-Holotoxinen formulierten P4- und P6-Proteinena immunisiertb wurden
    Serum-Anti-rekombinantes P+IgG-Antikörpertiterc
    Adjuvansd Tag 0 Tag 21 Tag 35 Tag 48
    keines 1,157 1,277 1,893 1,968
    CT 751 1,657 17,589 45,885
    CT-B 1,111 1,118 6,917 70,578
    E29H 1,052 1,539 11,917 95,922
    E110D 1,243 1,313 6,886 83,058
    E112D 1,400 1,520 9,280 41,485
    R7K 2,546 1,771 3,311 40,936
    R11K 1,289 1,391 3,428 23,631
    • a Die rekombinanten P4- und P6-Proteine wurden mit 5 bzw. 10 μg pro Dosis verabreicht.
    • b Die Mäuse wurden an den Tagen 0, 21 und 35 intranasal immunisiert (IN, Volumen 10 μl).
    • c Die Anti-rekombinantes P4-IgG-Antikörpertiter wurden mit einem ELISA an gepoolten, zu den angegebenen Zeiten gesammelten Proben ermittelt.
    • d Das CT- und die CT-Mutanten wurden mit 1 μg pro Dosis verabreicht.
    Tabelle 6 Systemische humorale Immunantworten von BALB/c-Mäusen, die mit rekombinanten, mit mutanten Cholera-Holotoxinen formulierten P4- und P6-Proteinena immunisiertb wurden
    Serum-Anti-natives P6-IgG-Antikörpertiterc
    Adjuvansd Tag 0 Tag 21 Tag 35 Tag 48
    keines < 100 < 100 < 100 < 100
    CT < 100 < 100 9,644 54,821
    CT-B < 100 < 100 875 7,399
    E29H < 100 < 100 3,472 19,638
    E110D < 100 < 100 3,666 22,415
    E112D < 100 < 100 426 9,538
    R7K < 100 < 100 529 3,904
    R11K < 100 < 100 248 3,763
    • a Die rekombinanten P4- und P6-Proteine wurden mit 5 bzw. 10 μg pro Dosis verabreicht.
    • b Die Mäuse wurden an den Tagen 0, 21 und 35 intranasal immunisiert (IN, Volumen 10 μl).
    • c Die Anti-rekombinantes P6-IgG-Antikörpertiter wurden mit einem ELISA an gepoolten, zu den angegebenen Zeiten gesammelten Proben ermittelt.
    • d Das CT- und die CT-Mutanten wurden mit 1 μg pro Dosis verabreicht.
    Tabelle 7 Antikörperantworten der Mucosa von BALB/c-Mäusen, die mit rekombinanten, mit mutanten Cholera-Holotoxinen formulierten P4- und P6-Proteinena immunisiertb wurden
    Anti-rekombinantes P4-Antikörpertiterc
    NWd BAWd VWd
    Adjuvanse IgA IgG IgA IgG IgA IgG
    keines < 5 < 5 < 5 < 5 < 50 < 50
    CT < 5 < 5 < 5 56 54 < 50
    CT-B < 5 < 5 < 5 99 < 50 < 50
    E29H < 5 < 5 < 5 176 63 < 50
    E110D < 5 < 5 < 5 144 < 50 98
    E112D 11 < 5 < 5 48 564 58
    R7K < 5 < 5 < 5 56 < 50 < 50
    R11K 6 < 5 < 5 34 223 < 50
    • a Die rekombinanten P4- und P6-Proteine wurden mit 5 bzw. 10 μg pro Dosis verabreicht.
    • b Die Mäuse wurden an den Tagen 0, 21 und 35 intranasal immunisiert (IN, Volumen 10 μl).
    • c Die Anti-rekombinantes P4-IgG- und .IgA-Antikörpertiter wurden mit einem ELISA an gepoolten, zwei Wochen nach der letzten Immunisierung (Tag 49) gesammelten Proben ermittelt. Es waren 5 Mäuse pro Gruppe.
    • d NW, BAW und VW bezeichnen eine nasale Waschflüssigkeit, eine bronchoalveoläre Waschflüssigkeit bzw. eine vaginale Waschflüssigkeit.
    • e Das CT- und die CT-Mutanten wurden mit 1 μg pro Dosis verabreicht.
  • Figure 00470001
  • Beispiel 7
  • Immunantworten von mit dem nativen Haps-Protein von NTHi immunisierten BALB/c-Mäusen
  • Der NTHi-Stamm P860295 (46) wurde von Dr. Charles Brinton von der Universität Pittsburgh erhalten. Er wurde aus dem Nasen-Rachen-Raum eines Kindes mit NTHi-induzierter Mittelohrentzündung gewonnen. Der NTHi-Stamm TN106 (47) wurde von Dr. Eric Hansen von der Universität Texas Southwestern Medical Center in Dallas erhalten. Eine Streptomycin-resistente Mutante von TN106 stammte von einer Selektion auf BHI-XV-Platten, die 100 μg/ml Streptomycin (Sigma, St. Louis, MO) enthielten. Diese Mutante wurde zwei Mal durch den Nasen-Rachen-Raum von BALB/c-Mäusen geschleust und als Stamm TN106.P2 eingefroren.
  • Das Haps-Protein aus dem NTHi-Stamm P860295 wurde wie folgt gereinigt. Der NTHi-Stamm P860295 wurde 18 Stunden lang bei 35°C unter Belüftung in BHI-XV-Medium angezüchtet. Die Bakterienzellen wurden mittels Zentrifugation bei 10 Kg und 4°C pelletiert und verworfen. Der Überstand wurde mit festem (NH4)2SO4 auf 60% Sättigung gebracht, 2 bis 3 Stunden lang bei Raumtemperatur gehalten und der Niederschlag mittels Zentrifugation gesammelt. Der Niederschlag wurde in 50 mM Natriumphosphat-Puffer, pH 5,8, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl (Puffer 1) gelöst und bei 4°C gegen den obigen Puffer dialysiert. Eine CM-SepharoseTM-Säule mit einem Bettvolumen von 10 ml (Pharmacia, Piscataway, NJ) wurde mit Puffer 1 äquilibriert und 30 ml des obigen löslichen Materials wurden auf die Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min aufgetragen. Die Säule wurde mit Puffer 1 gewaschen bis die OD280 die Baseline erreichte. Das Ausfluss-Material wurde verworfen. Die gebundenen Proteine wurden aus dem Harz unter Einsatz eines Drei-Stufen-Gradienten eluiert: (1) Natriumphosphat-Puffer, pH 7,0, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl; (2) Natriumphosphat-Puffer, pH 8,0, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl und (3) Natriumphosphat-Puffer, pH 8,0, 0,5 M NaCl, 1 mM EDTA. Die in jedem Schritt eluierten Proteine wurden gepoolt und für die Analyse aufbewahrt. Eine SDS-PAGE-Analyse (48) der Pools zeigte, dass das Haps-Protein in den Gradientenstufen 2 und 3 eluiert wurde. Diese Pools enthielten hoch gereinigtes Haps und wurden vereinigt.
  • Sodann wurden sechs Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse (zehn pro Gruppe) IN mit aus dem NTHi-Stamm P860295 gereinigten Haps immunisiert. Das Haps-Protein wurde in D-PBS mit oder ohne CT-CRME29H auf 5 oder 15 μg/40 verdünnt. Wurde es eingesetzt, dann wurde das CT-CRME29H mit einer Dosierung von 0,1 μg/Maus eingesetzt. Die Kontrollformulierungen, welche CT-CRME29H in D-PBS, D-PBS allein und den Formalin-fixierten TN106.P2 (den NTHi-Infektions-Stamm) enthielten, wurden den Mäusen ebenfalls in Volumina von 40 μl verabreicht.
  • Vor der IN Immunisierung wurden die Mäuse narkotisiert und dann mittels intranasaler Inokulation von 20 μl/Nasenloch aus einer Pipette immunisiert. Die Pipette wurde so gehalten, dass die Spitze die Öffnung des Nasenlochs berührte und die Formulierung während des Atmens automatisch in das Nasenloch gezogen wurde. Die Mäuse wurden in Rückenlage gebracht, so dass die Nasen nach Verabreichung der Formulierung oder der Infektion nichts berührten. Die Mäuse wurden in den Wochen 0, 1, 3 und 5 immunisiert. Die Seren wurden in Woche 7 entnommen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 wiedergegeben. Tabelle 9 Systemische humorale Immunantwort in BALB/c-Mäusen nach intranasaler Immunisierung mit Haps mit oder ohne CT-CRME29H-Zumischung
    Immunogen Dosis (μg) Adjuvans Anti-Haps-IgG-ELISA
    Hap 5 - 1,604
    Hap 15 - 5,204
    Hap 5 CT-E29H 4,653
    Hap 15 CT-E29H 15,111
    - - CT-E29H < 500
    1 × PBS - - < 500
    Formalin-fixierten TN106.P2 - < 500
  • Beispiel 8
  • Immunantworten von mit dem rekombinanten (r)Urease-Protein von Heliobacter pylori immunisierten BALB/c- und C57BL/6-Mäusen
  • In einem ersten Experiment wurden fünf BALB/c-Mäuse pro Gruppe wie folgt immunisiert: Sieben Gruppen wurden an den Tagen 0, 2, 14 und 16 intragastral mit 100 μg rUrease plus 10 μg des in den Tabellen 10m–12 angegebenen Adjuvans immunisiert. Eine Gruppe wurde mit 10 μg rUrease subkutan in das Hinterteil immunisiert; eine andere Gruppe wurde mit 10 μg rUrease subkutan in den Hals immunisiert; beide Gruppen erhielten auch an den Tagen 0 und 16 20 μg StimulonTM QS-21 als Adjuvans. Die Anti-rUrease-Antikörpertiter wurden mit Hilfe eines ELISA an gepoolten, am Tag 28 gesammelten Proben bestimmt. Die IgG-Ergebnisse werden in Tabelle 10 gezeigt und die IgA-Ergebnisse in Tabelle 11. Es wurden auch die Antikörperantworten der Mucosa gegen rUrease am Tag 29 gemessen. In Tabelle 12 werden die IgA- und IgG-Titer der bronchoalveolären bzw. vaginalen Waschflüssigkeiten gezeigt.
  • In einem zweiten Experiment wurde die Fähigkeit von rUrease plus Adjuvans beurteilt, Mäuse gegen eine Infektion mit H. felis zu schützen. Zehn BALB/c-Mäuse pro Gruppe wurden wie folgt immunisiert: Zwei Gruppen wurden an den Tagen 0, 2, 14 und 16 intragastral mit 100 μg rUrease plus 10 μg des in Tabelle 13 angegebenen Adjuvans immunisiert; eine Kontrollgruppe erhielt PBS an Stelle von rUrease plus 10 μg des Adjuvans. Eine Gruppe wurde an den Tagen 0 und 16 subkutan mit 10 μg rUrease plus 20 μg StimulonTM QS-21 immunisiert. Die Anti-rUrease-Antikörpertiter wurden mit Hilfe eines ELISA an gepoolten, am Tag 28 gesammelten Proben bestimmt. Die Mäuse wurden auch an den Tagen 29, 31 und 34 mit drei Dosen von 108 H. felis infiziert und am Tag 44 auf ihren Schutz hin untersucht. Der Schutz wurde mit dem schnellen Urease-Test beurteilt. Im schnellen Urease-Test wird ein halber Magen bei 37°C fünf Stunden lang in 0,5 ml des Urease-Testmediums inkubiert, das 2% Harnstoff und Phenolrot und einen pH-Indikator bei 7 μg/ml enthält. Die Urease-Aktivität erzeugt aus Harnstoff Ammonium und Bicarbonat und hebt somit den pH-Wert an und induziert eine kolorimetrische Änderung der Lösung mit einer größeren Extiktion bei 550 nm. Das Ausmaß der Urease-Aktivität wurde mittels spektrophotometrischer Analyse gemessen. Der Test wurde für H. felis als positiv betrachtet, wenn der Mittelwert der Extinktionswerte zwei Standardabweichungen über denen lag, die für Magengewebe von nicht infizierten Mäusen erhalten wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 13 wiedergegeben.
  • In einem dritten Experiment wurden zwei Gruppen von C57BL/6-Mäusen (fünf pro Gruppe) an den Tagen 0, 2, 14 und 16 intragastral mit 100 μg rUrease plus 10 μg des in Tabelle 14 angegebenen Adjuvans immunisiert. Eine dritte Gruppe wurde an den Tagen 0 und 16 subkutan mit 10 μg rUrease plus 100 μg Alaun immunisiert. Eine vierte Grippe wurde an den Tagen 0, 2, 14 und 16 intragastral mit 100 μg rUrease, aber ohne Adjuvans, immunisiert. Die Anti-rUrease-Antikörpertiter wurden mit Hilfe eines ELISA an gepoolten, am Tag 28 gesammelten Proben bestimmt. In Tabelle 14 werden die IgA- und IgG-Titer aus den Seren, der bronchoalveolären Waschflüssigkeit, dem Kotbällchen-Extrakt bzw. der vaginalen Waschflüssigkeit angegeben.
  • In einem vierten Experiment wurden fünf C57BL/6-Mäuse pro Gruppe wie folgt immunisiert: Drei Gruppen von Mäusen wurden an den Tagen 0, 2, 14 und 16 IG mit 100 μg rUrease plus 10 μg des in Tabelle 15 angegebenen Adjuvans immunisiert; eine vierte Gruppe erhielt kein Adjuvans. Die Anti-rUrease-Antikörpertiter wurden mit Hilfe eines ELISA an gepoolten, am Tag 29 gesammelten Proben bestimmt. Die IgA- und IgG-Ergebnisse sind in Tabelle 15 wiedergegeben. Tabelle 15 zeigt auch den IgE-Titer (PCA) und den Gesamt-IgE-Titer. PCA gibt an, dass die IgE-Antikörpertiter mit Hilfe der passiven kutanen Anaphylaxis-Reaktion bestimmt wurden. Die PCA wurde an weiblichen Sprague-Dawley-Ratten durchgeführt. Die Ratten wurden mit Ketamin/Xylazin sediert, rasiert und ihnen wurden intradermal 0,1 ml Serum (vierfache Reihenverdünnung) aus C57BL/6-Mäusen injiziert, welche mit rUrease immunisiert worden waren, die entweder mit CT, LT oder CT-CRME29H formuliert worden war. Die Ratten wurden 48 bis 60 Stunden später sediert, dann wurde ihnen intravenös über die Schwanzvene 2 μg rUrease in PBS, in welcher 1% Evans-Blau enthalten war (0,1 ml), injiziert. Tabelle 10 Wirkung von CT-CRMs auf die Erzeugung von systemischen Anti-Urease-IgG-Antikörpertitern in BALB/c-Mäusen
    Anti-rekombinante Urease-IgA-Antikörpertitera
    Adjuvansb Wegb Mittelwert SE
    CT IG 234.010 43.316
    E29H IG 131.032 64.183
    R7K IG 17.692 9.271
    R11K IG 25.502 11.413
    W110D IG 22.299 8.571
    E112D IG 8.784 5.208
    CT-B IG 47.060 38.991
    QS-21 SC-R 4.038.430 1.702.556
    QS-21 SC-N 5.609.764 353.824
    • a Die geometrischen mittleren Anti-rekombinante Urease-IgA-Antikörpertiter wurden mittels eines ELISA an am Tag 28 gesammelten Serum-Proben bestimmt. Eine Gruppe bestand aus 5 Mäusen.
    • b Die Mäuse wurden an den Tagen 0 und 16 subkutan (SC) mit 10 μg rUrease in das Hinterteil (R) oder in den Hals (N) immunisiert. Die intragastral (IG) immunisierten Mäuse erhielten an den Tagen 1, 2, 14 und 16 100 μg rUrease. Die Adjuvanzien waren entweder StimulonTM QS-21 (20 μg), CT (10 μg) oder CT-Derivate (10 μg).
    Tabelle 11 Wirkung von CT-CRMs auf die Erzeugung systemischer Anti-Urease-IgA-Antikörpertiter in BALB/c-Mäusen
    Anti-rekombinante Urease-IgA-Antikörpertitera
    Adjuvansb Wegb Mittelwert SE
    CT IG 2.529 584
    E29H IG 1.013 426
    R7K IG 82 15
    R11K IG 153 39
    W110D IG 351 137
    E112D IG 232 93
    CT-B IG 455 280
    QS-21 SC-R 5.675 562
    QS-21 SC-N 4.793 528
    • a Die geometrischen mittleren Anti-rekombinante Urease-IgA-Antikörpertiter wurden mittels eines ELISA an am Tag 28 gesammelten Serum-Proben bestimmt. Eine Gruppe bestand aus 5 Mäusen.
    • b Die Mäuse wurden an den Tagen 0 und 16 subkutan (SC) mit 10 μg rUrease in das Hinterteil (R) oder in den Hals (N) immunisiert. Die intragastral (IG) immunisierten Mäuse erhielten an den Tagen 0, 2, 14 und 16 100 μg rUrease. Die Adjuvanzien waren entweder StimulonTM QS-21 (20 μg), CT (10 μg) oder CT-Derivate (10 μg).
    Tabelle 12 Wirkung von CT-CRMs auf die Erzeugung von Anti-Urease-IgA-Antikörpertitern in den Mucosa-Sekreten von BALB/c-Mäusen
    Anti-rekombinante Urease-IgA-Antikörpertitera
    BAWb VWb
    Adjuvansc Wegc IgA IgG IgA IgG
    CT IG 387 1005 3.471 464
    E29H IG 63 317 2.095 265
    R7K IG < 5 27 79 42
    R11K IG 7 62 29 21
    W110D IG 13 98 217 84
    E112D IG < 5 17 991 108
    CT-B IG 65 312 140 60
    QS-21 SC-R 6 9816 809 10.272
    QS-21 SC-N 11 10.545 235 6.237
    • a Die Anti-rUrease-IgG- und -IgA-Antikörpertiter wurden mittels eines ELISA an gepoolten am Tag 29 gesammelten Proben bestimmt. Eine Gruppe bestand aus 5 Mäusen.
    • b BAW und VW bezeichnen eine bronchoalveoläre Waschflüssigkeit bzw. eine vaginale Waschflüssigkeit.
    • c Die Mäuse wurden an den Tagen 0 und 16 subkutan (SC) mit 10 μg rUrease in das Hinterteil (R) oder in den Hals (N) immunisiert. Die intragastral (IG) immunisierten Mäuse erhielten an den Tagen 1, 2, 14 und 16 100 μg rUrease. Die Adjuvanzien waren entweder StimulonTM QS-21 (20 μg), CT (10 μg) oder CT-Derivate (10 μg).
    Tabelle 13 Erzeugung von Schutz gewährenden Immunantworten in BALB/c-Mäusen, welche mit rekombinanter Urease immunisiert wurden, die mit CT oder CT-CRME29H formuliert worden ist.
    IgA-Titera
    Antigenb Adjuvansc Weg Seren BAWd Anzahl geschützt/gesamt (%)e
    PBS CT IG < 100 o. A. 2/10 (20)
    rUrease CT IG 2.730 11 8/10 (80)
    rUrease E29H IG 1.225 124 8/10 (80)
    rUrease QS-21 IG 14.917 7 3/10 (30)
    keines keines o. A. < 100 o. A. 1/10 (10)
    • a Die Anti-rekombinante (r)Urease-IgA-Antikörpertiter wurden mittels eines ELISA an am Tag 28 gesammelten Proben bestimmt. Eine Gruppe bestand aus 10 Mäusen.
    • b Die Mäuse wurden an den Tagen 0, 2, 14 und 16 intragastral (IG) mit 100 μg rUrease pro Dosis immunisiert. Den Kontrollmäusen wurden an den Tagen 0 und 16 subkutan (SC) 10 μg rUrease pro Dosis injiziert.
    • c .. Die rUrease wurde entweder mit 10 μg CT oder 10 μg CT-CRM pro Dosis formuliert oder mit 20 μg StimulonTM QS-21 pro Dosis vermischt.
    • d BAW bezeichnet eine bronchoalveoläre Waschflüssigkeit.
    • e Diese Mäuse wurden an den Tagen 29, 31 und 34 mit 3 Dosen von 108 H. felis infiziert und am Tag 44 auf einen Schutz hin untersucht. Ein Schutz wurde mit dem schnellen Urease-Test beurteilt.
    Figure 00560001
    Tabelle 15 Erzeugung von Urease-spezifischen IgE-Antikörpern im Blutkreislauf von C57BL/6-Mäusen, die mit rekombinanter Urease immunisiert wurden, welche entweder mit CT, LT oder CT-CRME29H hergestellt worden war.
    Anti-rUrease-Antikörpertitera
    Adjuvansb IgA IgG IgE (PCA)c Gesamt-IgEd
    keines 732 30.591 < 4 o. A.
    CT 2.504 496.373 32 1591
    CT-CRME28H 4.039 477.098 16 888
    LT 5.251 670.907 64 3589
    • a Die Endpunkttiter der IgA- und IgG-Antikörper wurden mit Hilfe eines ELISA an gepoolten, am Tag 29 gesammelten Serum-Proben ermittelt. Eine Gruppe bestand aus 5 Mäusen.
    • b Die Mäuse wurden an den Tagen 0, 2, 14 und 16 intragastral (IG) mit 100 μg rUrease immunisiert. Die Adjuvanzien waren 10 μg CT, CT-CRME29H oder LT.
    • c... PCA gibt an, dass die IgE-Antikörpertiter mittels der passiven kutanen Anaphylaxis-Reaktion bestimmt wurden. Die PCA wurde an weiblichen Sprague-Dawley-Ratten durchgeführt. Die Ratten wurden mit Ketamin/Xylazin sediert, rasiert und ihnen wurden intradermal 0,1 ml Serum (vierfache Reihenverdünnung) aus C57BL/6-Mäusen injiziert, welche mit rUrease immunisiert worden waren, die entweder mit CT, LT oder CT-CRME29H formuliert worden war. Die Ratten wurden 48 bis 60 Stunden später sediert, dann wurde ihnen intravenös über die Schwanzvene 2 μg rUrease in 1% Evans-Blau enthaltender PBS (0,1 ml) injiziert.
  • Beispiel 9
  • Immunantworten von mit rekombinantem Klasse 1-Pilin und Klasse 1-Außenmembran-Protein von Neisseria meningitidis immunisierten Swiss-Webster-Mäusen
  • In einem ersten Experiment wurden 6–8 Wochen alte Swiss-Webster-Mäuse (15 pro Gruppe) in den Wochen 0, 2 und 3 IN (10 μl) mit 5 μg gereinigtem, rekombinantem, mit CT-CRME29H (0,1 oder 1 μg/Maus) formuliertem Klasse 1-Pilin (rPilin) immunisiert. Zur Bestimmung der spezifisch gegen das N. meningitidis-Pilin gerichteten IgA- und IgG- Antikörper des Serums und der Mucosa mittels eines ELISA in Woche 4 wurden die Serumproben, die bronchoalveolären Waschflüssigkeiten (BAW), die nasalen Waschflüssigkeiten (NW) und die vaginalen Waschflüssigkeiten von fünf Mäusen in jeder Gruppe gesammelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 16 wiedergegeben. Die restlichen parallel immunisierten zehn Mäuse in jeder Gruppe wurden in Woche 4 IN mit 2 × 107 KBE des homologen N. meningitidis-Stammes H355P* *p2IR (zweimal durch junge Ratten geschleust) infiziert. Die Wiedergewinnung von Gruppe B-N. meningitidis aus dem Nasengewebe wurde, wie in 2 gezeigt, mittels einer quantitativen Kultur bestimmt.
  • In einem zweiten Experiment wurde der Schutz des mit CT-CRME29H formulierten rPilin gegen einen homologen Meningokokken-Stamm mit dem mit CT-CRME29H formulierten rPilin verglichen, welchem ein nicht verwandtes Protein, KLH, zugemischt worden war. Gruppen aus fünf Swiss-Webster-Mäusen (6 Wochen alt) wurden in den Wochen 0, 2 und 3 IN (10 μl Volumen) mit 5 μg rPilin mit und ohne CT-CRME29H (0,1 μg) oder mit PorA H355 mit CT-CRME29H (0,1 μg) immunisiert. Die Kontrollgruppen waren entweder nicht immunisiert (naive Gruppen) oder IN mit KLH (5 μg) plus CT-CRME29H (0,1 μg) immunisiert. Die Antikörper-Endpunkttiter wurden mittels eines Ganzzell-ELISA und eines Antigen-spezifischen ELISA an gepoolten Serumproben bestimmt, welche in Woche 4 vor der Infektion mit 1 × 107 KBE des Meningokokken-Stammes H355P* gesammelt worden waren. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 17 und 18 wiedergegeben.
  • In einem dritten Experiment wurde die Immunogenizität des mit CT-CRME29H formulierten Meningokokken-PorA für eine IN Immunisierung beurteilt. In den Wochen 0, 2 und 3 wurden 5 Swiss-Webster-Mäuse pro Gruppe IN mit 20 μg/Dosis PorA aus dem Meningokokken-Stamm H44/76, wie in Tabelle 19 angegeben, mit oder ohne CT-CRME29H (1 μg/Dosis) immunisiert. Die Anti-PorA H44/76-Antikörpertiter und der Ganzzell-ELISA für IgG wurden an gepooltem Serum und Mucosa-Proben untersucht, welche in Woche 4 des Experiments gesammelt worden waren. Die Ergebnisse sind in Tabelle 19 wiedergegeben.
  • In einem vierten Experiment wurde die Fähigkeit von rPilin und PorA mit CT-CRME29H als Adjuvans beurteilt, Mäuse gegen eine Infektion mit einem heterologen Meningokokken-Stamm zu schützen. Es wurden 10 Swiss-Webster-Mäuse pro Gruppe IN (10 μl Volumen) mit 5 μg von entweder rPilin, PorA aus dem Stamm H355 oder PorA aus dem Stamm 870227, welche in den Wochen 0, 2 und 3 mit CT-CRME29H (0,1 μg) formuliert worden waren, immunisiert. Die Kontrollgruppen waren entweder ganze Zellen des hitzeinaktivierten Meningokokken-Stammes 870227 oder KLH (5 μg) plus CT-CRME29H (0,1 μg). Die IgG- und IgA-Endpunkttiter wurden mittels eines Ganzzell-ELISA und eines Antigen-spezifischen ELISA an gepoolten Serumproben bestimmt, welche in Woche 4 vor der Infektion mit dem 870227-Stamm gesammelt worden waren. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 20 und 21 wiedergegeben. Die Widergewinnung der Bakterien aus dem Nasengewebe wurde 24 Stunden nach der Infektion mit dem Stamm 870227 mittels einer quantitativen Kultur bestimmt und ausgedrückt als Log10 KBE ± Standardabweichung. Die Ergebnisse sind in 4 wiedergegeben.
  • Ein fünftes Experiment wurde durchgeführt, um die Fähigkeit von CT-CRME29H als Adjuvans für eine parenterale Immunisierung zu untersuchen. Gruppen von 10 weiblichen 5 bis 6 Wochen alten Swiss-Webster-Mäusen wurden in den Wochen 0 und 4 subkutan mit 5 μg PorA H355 immunisiert, das entweder mit CT-CRME29H (10 μg) oder mit MPLTM (100 μg) formuliert worden war. Die Kontrollgruppen wurden subkutan mit ganzen Zellen des hitzeinaktivierten Meningokokken-Stammes 870227 oder mit KLH (5 μg) plus MPLTM (100 μg) immunisiert. Die Mäuse wurden in Woche 6 IN mit 1,2 × 107 KBE des Meningokokken-Stammes 870227 infiziert. 24 Stunden nach der Infektion wurden die Mäuse getötet und die Nasengewebe homogenisiert und auf Selektionsmedium ausplattiert. Nach Inkubation bei 37°C über Nacht wurden die Kolonien ausgezählt und das Ergebnis als Log10 KBE ± Standardabweichung ausgedrückt. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Tabelle 22 und 5 wiedergegeben. Tabelle 16 Adjuvans-Wirkungen von CT-CRME29H auf die systemische Immunantwort und die Immunantwort der Mucosa gegen das N. meningitidis-rPilin (Klasse I H44/76) in Swiss-Webster-Mäusen
    Immunogen Anti-rPilin-Antikörpertiter im ELISA
    Seren (Woche 0) Seren (Woche 4) BW NW VW
    IgA IgG IgA IgG IgA IgG IgA IgG IgA IgG
    rPilin < 50 < 50 878 69.013 4 41 23 2 37 17
    rPilin + CT-CRME29H (0,1 μg) < 50 < 50 2.209 209.228 < 2 19 34 40 61 51
    rPilin + CT-CRME29H (1 μg) < 50 < 50 4.089 1.344.776 41 540 75 45 135 216
    Tabelle 17 Wirkung von CT-CRME29H auf die Immunantwort gegen Meningokokken-Antigene in Swiss-Webster-Mäusen
    Gesamtserum-IgG des Meningokokken B-Ganzzell-ELISA
    Gruppe H355*-Stamm FAM 18-Stamm M982-Stamm
    Woche 0 Woche 4 Woche 0 Woche 4 Woche 0 Woche 4
    5 μg rPilin 175* 2.371 294* 639 137* 2.375
    5 μg rPilin + 0,1 μg CT-CRME29H 175* 24.965 294* 2.702 137* 21.862
    5 μg PorA + 0,1 μg CT-CRME29H 175* 10.156 294* 9.136 137* 5 733
    5 μg KLH + 0,1 μg CT-CRME29H 175* 192 294* 230 137* 100
    • * Die in Woche 0 gepoolten Proben aus allen Gruppen
    Tabelle 18 Wirkung von CT-CRME29H auf die Immunantwort gegen Meningokokken-Antigene in Swiss-Webster-Mäusen
    ELISA-Anti-rPilin- und Anti-PorA-Antikörpertiter bei gepoolten Mäusen
    Gruppe rPilin Klasse I OMP H255
    Serum-IgG Serum IgA Serum-IgG Serum IgA
    Woche 4 Woche 4 Woche 4 Woche 4
    5 μg rPilin 8.840 < 50 < 50 < 50
    5 μg rPilin + 0,1 μg CT-CRME29H 149.221 860 120 < 50
    5 μg PorA H355 + 0,1 μg CT-CRME29H < 50 < 50 13.795 60
    5 μg KLH + 0,1 μg CT-CRME29H < 50 < 50 < 50 < 50
    Tabelle 19 Immunantworten von intranasal mit Meningokokken-PorA und CT-CRME29H immunisierten Mäusen
    Anti-PorA H44/76-Antikörpertiter
    Gruppe Seren BW NW VW
    IgG IgA IgG IgA IgG IgA IgG IgA
    20 μg PorA WCE 3.530 o. A. o. A. o. A. o. A. o. A. o. A. o. A.
    PorA 1.220 < 50 < 2 < 2 < 2 < 2 < 7 < 7
    20 μg PorA + 1 μg CT-CRME29H WCE 26.660 o. A. o. A. o. A. o. A. o. A. o. A. o. A.
    PorA 17.675 < 50 5 < 2 < 2 < 2 < 7 < 7
    o. A.
    = ohne Angaben
    WCE
    = Ganzzell-ELISA für H44/76-Stamm
    PorA
    = PorA H44/76-spezifischer ELISA.
    Tabelle 20 Immunantworten von intranasal mit heterologem und homologem Meningokokken-PorA und -rPilin mit CT-CRME29H immunisierten Swiss-Webster-Mäusen
    Antigen in Assay Serum in Woche IgG-Titer# mittels ELISA in Mäusen, die immunisiert worden waren mit
    5 μg KLH + 0,1 μg CT-CRME29H 5 μg rPilin + 0,1 μg CT-CRME29H 5 μg PorA H355 + 0,1 μg CT-CRME29H 5 μg PorA 870227 + 0,1 μg CRME29H 25 μg HI WC + 0,1 μg CT-CRME29H
    WC 870227 0 < 100 < 100 < 100 < 100 < 100
    4 350 13.376 7.000 24.815 74.930
    WC H355P 0 257 257 257 257 257
    4 310 3.687 5.140 3.930 5.933
    rPilin 0 146 146 146 146 146
    4 585 1.999.530 < 100 < 100 < 100
    PorA H355 0 < 100 < 100 < 100 < 100 < 100
    4 < 100 637 29.770 19.009 463
    PorA 870227 0 < 100 < 100 < 100 < 100 < 100
    4 < 100 < 100 10.020 23.045 5.935
    • # Die Titer in Woche 0 sind Pools von allen Gruppen
    WC
    = ganze Zellen
    HI
    = hitzeinaktiviert
    Tabelle 21 Immunantworten von intranasal mit heterologem und homologem Meningokokken-PorA und -rPilin mit CT-CRME29H immunisierten Swiss-Webster-Mäusen
    Antigen in Assay Serum in Woche IgG-Titer# mittels ELISA in Mäusen, die immunisiert worden waren mit
    5 μg KLH + 0,1 μg CT-CRME29H 5 μg rPilin + 0,1 μg CT-CRME29H 5 μg PorA H355 + 0,1 μg CT-CRME29H 5 μg PorA 870227 + 0,1 μg CRME29H 25 μg HI WC + 0,1 μg CT-CRME29H
    WC 870227 0 < 25 < 25 < 25 < 25 < 25
    4 < 25 < 25 < 25 < 25 o. A.
    WC H355P 0 < 25 < 25 < 25 < 25 < 25
    4 < 25 < 25 < 25 < 25 < 25
    rPilin 0 < 25 < 25 < 25 < 25 < 25
    4 < 25 5.097 < 25 < 25 < 25
    PorA H355 0 < 25 < 25 < 25 < 25 < 25
    4 < 25 < 25 233 200 < 25
    PorA 870227 0 < 25 < 25 < 25 < 25 < 25
    4 < 25 < 25 < 25 < 25 < 25
    • # Die Titer in Woche 0 sind Pools von allen Gruppen
    WC
    = ganze Zellen
    HI
    = hitzeinaktiviert
    o. A.
    = ohne Angabe
    Tabelle 22 Bakterizide N. meningitidis-Aktivität von subkutan mit PorA plus CT-CRME29H oder MPLTM immunisierten Mäuseseren
    Mäuseseren H355 p+ 870227
    Woche 5, Tag 6 Woche 5, Tag 6 KLH (5 μg), MPLTM (100 μg) < 25 < 25
    Woche 5, Tag 6 H355 Klasse 1-OMP (5 μg), MPLTM (100 μg) 200 < 25
    Woche 5, Tag 6 870227 Klasse 1-OMP (5 μg), MPLTM (100 μg) < 25 100
    Woche 5, Tag 6 hitzeinaktiviertes 870227 WC (25 μg), MPLTM (100 μg) 25 200
    Woche 5, Tag 6 H355 Klasse 1-OMP (5 μg), CT-CRME29H (10 μg) < 25 < 25
    Woche 0 Pool negative Kontrolle < 10 < 10
    Woche 6 positive Kontrolle 1 200 < 10
    Woche 6 positive Kontrolle 2 n. a.* 400
    • * n. a. = nicht ausgeführt
    • verwendetes Komplement: menschliches UR4-97
  • Beispiel 10
  • Immunantworten von mit dem gereinigten nativen Fusions (F)-Glycoprotein des RSV (Respiratory Syncytical Virus) immunisierten BALB/c-Mäusen.
  • In einem ersten Experiment wurden 6 – 8 Wochen alte BALB/c-Mäuse (5 Mäuse pro Gruppe) in den Wochen 0, und 14 intranasal (10 μl) mit 3 μg gereinigtem, nativem, mit CT-CRME29H (1 μg oder 10 μg/Maus), Wildtyp-CT (1 μg/Maus), CT-B (1 μg oder 10 μg/Maus) oder keinem Adjuvans formuliertem Protein immunisiert. Die IgG- und IgA-Antikörper-Endpunkttiter wurden am Tag 24 des Experiments mit einem ELISA untersucht. Die Titer wurden aus Seren, bronchoalveolärer Spülflüssigkeit, nasaler Waschflüssigkeit und vaginaler Waschflüssigkeit erhalten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 23 wiedergegeben.
  • In einem zweiten Experiment wurden an den Tagen 0 und 14 6–8 Wochen alte BALB/c-Mäuse (5 Mäuse pro Gruppe) intranasal (50 μl) entweder mit Wildtyp-CT (1 μg/Maus) oder mit CT-CRME29H (1 μg/Maus) vorimmunisiert. Die Kontrollgruppen wurden nicht vorimmunisiert. Danach wurden an den Tagen 28 und 42 alle Mäuse intranasal mit 3 μg mit den gleichen Mengen an CT oder CT-CRME29H formuliertem F-Protein immunisiert. Die Antikörper-Endpunkttiter wurden mit einem ELISA an gepoolten, an den Tagen 56 (Seren) und 57 (bronchoalveoläre und vaginale Waschflüssigkeit) gesammelten Proben bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 24 wiedergegeben.
  • In einem dritten Experiment wurden naive weibliche BALB/c-Mäuse (6–8 Wochen, 5 Mäuse pro Gruppe) in den Wochen 0, 1 und 2 intranasal (IN) mit gereinigtem nativen Fusions (F)-Protein aus RSV A2 immunisiert. Die Immunisierungen wurden hergestellt, indem das F-Protein (3 μg pro Maus) mit CT-CRME29H (1 μg oder 10 μg pro Maus), CT-B (1 μg oder 10 μg pro Maus) oder Alaun (100 μg pro Maus) formuliert wurde. Das Vakzin wurde intranasal verabreicht, indem man den narkotisierten Mäusen gestattete, in das an der Spitze des Nasenlochs angebrachte Vakzin zu atmen. Das Gesamtvolumen pro Dosis in den Wochen 0, 1 und 2 betrug (in Tabelle 25) 10 μl pro Maus Die Kontrollmäuse erhielten intramuskulär eine primäre Immunisierung mit F/AlOH oder sie erhielten primäre und sekundäre Immunisierungen von intranasal abgegebenen lebenden RSV A2. Neun Tage (für die Tabellen 25 und 26) nach einer tertiären Immunisierung wurden die systemischen humoralen Immunantworten mittels eines ELISA untersucht. Die bronchoalveoläre Spülflüssigkeit sowie die vaginale und nasale Waschflüssigkeit wurden ebenfalls gesammelt und bei der Charakterisierung der Antikörperantworten der Mucosa verwendet. Die Milzen aus den immunisierten Mäusen wurden dazu verwendet, die Antigen-abhängige Aktivität der Killerzellen gegen Zielzellen, die mit MHC-kompatablen RSV infiziert wurden, zu untersuchen. Eine zweite Gruppe von Mäusen, welche nach gleichem Schema immunisiert worden waren, wurde mit lebenden RSV infiziert. Am Tage 4 nach der Infektion wurde danach der Schutz der Lungenflügel innerhalb dieser Gruppe analysiert, indem die Virus-Plaques im gesammelten homogenisierten Lungengewebe bestimmt wurden. Die statistische Analyse wurde mit Hilfe einer Varianzanalyse durchgeführt. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 25 und 26 wiedergegeben.
  • In einem vierten Experiment wurden BALB/c-Mäuse in den Wochen 0, 1 und 2 intranasal mit gereinigtem RSV-F-Protein (3 μg/Maus) in Kombination mit CT-CRME29H (1 μg oder 10 μg pro Maus), CTB (1 μg oder 10 μg pro Maus) oder PBS immunisiert. Als Kontrolle erhielten Mäuse auch intranasal RSV oder intramuskulär F/AlOH. Neun Tage nach der letzten Immunisierung wurden die Milzzellen isoliert und in vitro mit syngenetischen RSV-infizierten Stimulatorzellen stimuliert. Nach sechs Tagen in Kultur wurde die Antigen-abhängige Aktivität der Killerzellen mittels quantitativer Bestimmung der 51Chrom-Freisetzung durch RSV-infizierte Zielzellen ermittelt. Die Ergebnisse sind in 6 wiedergegeben.
  • In einem fünften Experiment, einem Virus-Schutz-Assay, wurden die Lungenflügel von immunisierten Mäusen vier Tage nach einer Infektion mit lebenden RSV isoliert, homogenisiert und eine quantitative Ermittlung des infektiösen Virus durchgeführt. Die BALB/c-Mäuse wurden intranasal mit Impfstoffen immunisiert, die gereinigtes F-Protein aus RSV und entweder CT-CRME29H, CTB oder PBS enthielten. Gruppen von Mäusen wurden auch intramuskulär mit F/AlOH als Kontrolle immunisiert. Acht Tage nach der letzten Immunisierung (drei Wochen nach dem F/AlOH-Impfstoff) wurden die Mäuse mit lebenden RSV infiziert. Vier Tage später wurde das Lungengewebe geerntet und bei der quantitativen Bestimmung der infektiösen Viren eingesetzt. Die Ergebnisse sind in 7 wiedergegeben.
  • In einem sechsten Experiment wurden in den Wochen 0, 1 und 2 naive weibliche BALB/c-Mäuse (6–8 Wochen, 5 Mäuse pro Gruppe) intranasal (IN) mit gereinigtem nativen Fusions (F)-Protein aus RSV A2 immunisiert. Die Immunisierungen wurden hergestellt, indem das F-Protein (3 μg pro Maus) mit CT-CRME29H (1 μg pro Maus) oder Alaun (100 μg pro Maus) formuliert wurde. Das Vakzin wurde intranasal verabreicht, indem man den narkotisierten Mäusen gestattete, in das an der Spitze des Nasenlochs angebrachte Vakzin zu atmen. Das Gesamtvolumen pro Dosis in den Wochen 0, 1 und 2 betrug (in Tabelle 27) 5 μl pro Maus. Die Kontrollmäuse erhielten intramuskulär eine primäre Immunisierung mit F/AlOH oder sie erhielten primäre und sekundäre Immunisierungen von intranasal abgegebenen lebenden RSV A2. Zwei Wochen (für die Tabellen 27 und 28) nach einer tertiären Immunisierung wurden die systemischen humoralen Immunantworten mittels eines ELISA untersucht. Die bronchoalveoläre Spülflüssigkeit sowie die vaginale und nasale Waschflüssigkeit wurden ebenfalls gesammelt und bei der Charakterisierung der Antikörperantworten der Mucosa verwendet. Die Milzen aus den immunisierten Mäusen wurden dazu verwendet, die Antigen-abhängige Aktivität der Killerzellen gegen Zielzellen, die mit MHC-kompatablen RSV infiziert wurden, zu untersuchen. Eine zweite Gruppe von Mäusen, welche nach gleichem Schema immunisiert worden waren, wurde mit lebenden RSV infiziert. Vier Tage nach der Infektion wurde danach der Schutz der Lungenflügel innerhalb dieser Gruppe analysiert, indem die Virus-Plaques im gesammelten homogenisierten Lungengewebe bestimmt wurden. Die statistische Analyse wurde mit Hilfe einer Varianzanalyse durchgeführt. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 25 und 26 wiedergegeben.
  • In einem siebten Experiment wurde die Vorschrift aus dem sechsten Experiment erneut verwendet, um die Antigen-abhängige CTL-Aktivität gegen RSV-infizierte Zielzellen zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in 8 wiedergegeben.
  • In einem achten Experiment, einem anderen Virus-Schutz-Assay, wurden BALB/c-Mäuse (5 Mäuse pro Gruppe) intranasal mit Formulierungen immunisiert, die gereinigtes RSV-F-Protein mit oder ohne CT-CRME29H enthielten. Gruppen von Mäusen wurden auch intramuskulär mit F/AlOH immunisiert und als Kontrolle nicht immunisiert (naiv) gelassen. Zwei Wochen nach der letzten Immunisierung (vier Wochen nach Verabreichung des F/AlOH) wurden alle Gruppen mit lebenden RSV infiziert. Vier Tage später wurden die Lungengewebe geerntet und bei der quantitativen Bestimmung des infektiösen Virus eingesetzt. Die Ergebnisse sind in 9 wiedergegeben.
  • In einem neunten Experiment wurde eine Vorschrift mit drei Dosen verwendet, um die Adjuvans-Antwort des CT-CRME29H genauer zu untersuchen. Gruppen von 5 BALB/c-Mäusen wurden in den Wochen 0, 1 und 2 IN (5 μl) mit dem F-Protein (3 μg) immunisiert, dem entweder 0,01, 0,1 oder 1,0 μg CT-CRME29H zugemischt worden war. Die Kontrollmäuse wurden am Tag 0 mit F/AlOH (intramuskulär) oder RSV A2 (IN) geprimt. Zwei Wochen nach der tertiären Immunisierung wurden die Serum-Antikörpertiter bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 29 wiedergegeben. Die Daten sind als log10 des mittleren geometrischen Antikörpertiters (±1 SD) dargestellt. Ähnliche Ergebnisse wurden in zwei getrennten Untersuchungen erhalten.
  • Nach der IN Immunisierung mit F/CT-CRME29H wurden die Mäuse aus dem neunten Experiment auch auf ihre lokalen Antikörperantworten gegen das F-Protein hin getestet. Mucosa-Waschflüssigkeitsproben wurden zwei Wochen nach der tertiären Immunisierung getöteten Mäusen entnommen und mit einem ELISA auf Anti-F-Protein-spezifisches IgG und IgA hin analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 30 wiedergegeben. Die Daten sind als log10 des mittleren geometrischen Endpunkttiters dargestellt, der sich bei einer OD410 von 0,03 einstellte. Ähnliche Ergebnisse wurden in zwei getrennten Untersuchungen erhalten.
  • Um die die funktionelle Leistungsfähigkeit der über eine F/CT-CRME29H-Immunisierung induzierten humoralen Immunantworten zu untersuchen, wurden in einem zehnten Experiment Seren in einem Plaque-Reduktions-Assay für neutralisierende Antikörpertiter gegen RSV A2 getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 31 wiedergegeben. Das geometrische Mittel der neutralisierenden Antikörpertiter (log10) wurde an einzelnen Seren (5 Mäuse pro Gruppe) in Gegenwart (+C') und Abwesenheit (–C') von 5% Meerschweinchen-Serum als Komplement-Quelle bestimmt. Ähnliche Ergebnisse wurden in zwei getrennten Untersuchungen erhalten.
  • In einem elften Experiment erhielten Mäuse (5 Mäuse pro Gruppe) an den Tagen 0, 7 und 14 IN Immunisierungen des mit 0,01, 0,1 oder 1 μg CT-CRME29H formulierten F-Proteins. Die Kontrollmäuse wurden mit F/AlOH (intramuskulär) oder RSV A2 (IN) immunisiert.
  • Die immunisierten Mäuse wurden zwei Wochen nach der tertiären Immunisierung infiziert, um die Fähigkeit des CT-CRME29H zu ermitteln, gegen eine nachfolgende Infektion Schutz zu gewähren. Vier Tage nach der Infektion wurden die Viruskonzentrationen in den homogenisierten Lungen- und Nasengeweben einzelner Mäuse ermittelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 32 wiedergegeben. Die Daten sind als geometrisches Mittel der Virustiter pro Gramm Gewebe (±1 Standardabweichung) angegeben.
    Figure 00700001
    Figure 00710001
    Tabelle 25 Systemische Immunantworten von intranasal mit dem RSV-F-Protein und CT-CRME29H immunisierten BALB/c-Mäusen
    Anti-F-Antikörpertiter
    Gruppe Immunogen IgG IgG1 IgG2a IgA
    776 10 μg E29H < 100 < 100 < 100 < 100
    777 3 μg F 1 μg E29H 126.463 +/– 32.646 62.344 +/– 27.002 4.899 +/– 1.027 16.202 +/– 2.031
    778 3 μg F 10 μg E29H 209.123 +/– 75.688 75.711 +/– 29.659 19.425 +/– 13.508 15.706 +/– 10.909
    779 3 μg F 1 μg CT 46.742 +/– 32.987 26.902 +/– 14.985 4.239 +/– 3.658 4.076 +/– 614
    780 3 μg F 10 μg CTB 285.116 +/– 110.154 116.245 +/– 34.596 10.512 +/– 11.016 11.679 +/– 7.246
    784 3 μg F PBS 2.171 +/– 1.921 521 +/– 743 < 100 < 100
    785 3 μg F 100 μg AlOH 23.303 +/– 16.994 5.519 +/– 2.348 < 1000 < 100
    907 RSV A2 52.749 +/– 23.557 6.252 +/– 4.286 8.718 +/– 2.826 4.284 +/– 2.350
  • Für Gesamt-IgG:
    • p < 0,05: 777 bis 780 gegenüber 784; 780 gegenüber 779; 777 bis 780 gegenüber 785; 777, 778, 780 gegenüber 907 (779 gegenüber 907 p = 0,7)
    • p < 0,05: 778 gegenüber 777 (p = 0,125);
  • Für IgG1:
    • p < 0,05: 777 bis 780 gegenüber 784; 777 bis 780 gegenüber 907; 777 bis 780 gegenüber 785
    • p < 0,05: 781 bis 780 gegenüber 907
  • Für IgG2:
    • p < 0,05: 777 bis 780 gegenüber 784
  • Tabelle 26 Mucosa-Immunantworten von intranasal mit dem RSV-F-Protein und CT-CRME29H immunisierten BALB/c-Mäusen
    Anti-F-Antikörpertiter
    Gruppe Immunogen BAL-Pools VW-Pools NW-Pools
    IgG IgA IgG IgA IgG IgA
    776 10 μg E29H < 25 < 25 < 25 < 25 < 25 < 25
    777 3 μg F + 1 μg E29H 463 < 25 253 2855 < 25 237
    778 3 μg F + 10 μg E29H 370 < 25 239 848 491 242
    779 3 μg F + 1 μg CTB 137 < 25 298 426 77 272
    780 3 μg F + 10 μg CTB 1109 226 903 3574 512 372
    784 3 μg F PBS < 25 < 25 < 25 78 < 25 < 25
    785 3 μg F + 100 μg AlOH < 25 < 25 < 25 < 25 < 25 < 25
    907 RSV A2 2870 1126 167 738 172 170
    Tabelle 27 Systemische Immunantworten von intranasal mit dem RSV-F-Protein und CT-CRME29H immunisierten BALB/c-Mäusen
    Anti-F-Antikörpertiter
    Gruppe Immunogen IgG IgG1 IgG2a IgA
    250 3 μg F PBS < 100 < 100 < 100 < 100
    256 3 μg g 1 μg E29H 315.878 +/– 131.746 78.380 +/– 40.870 10.718 +/– 16.475 444 +/– 1.458
    257 1 μg E29H < 100 < 100 < 100 < 100
    258 3 μg F 100 μg AlOH 121.551 +/– 52.023 63.595 +/– 27.491 428 +/– 4.205 < 100
    259 RSV A2 112.451 +/– 50.247 8.871 +/– 5.206 9.953 +/– 4.924 224 +/– 344
  • Für Gesamt-IgG:
    • p < 0,05: 256 gegenüber 250 und 257
    • p < 0,05: 256 gegenüber 258 und 259
  • Für IgG1:
    • p < 0,05: 256 gegenüber 250 und 257
    • p < 0,05: 256 gegenüber 258
  • Für IgG2a:
    • p < 0,05: 256 gegenüber 250, 257 und 258
    • p < 0,05: 256 gegenüber 259
  • Für IgGA:
    • p < 0,05: 256 gegenüber 259
  • Tabelle 28 Mucosa-Immunantworten von intranasal mit dem RSV-F-Protein und CT-CRME29H immunisierten BALB/c-Mäusen
    Anti-F-Antikörpertiter
    Gruppe Immunogen BAL-Pools VW-Pools NW-Pools
    IgG IgA IgG IgA IgG IgA
    250 3 μg PBS < 25 < 25 < 25 < 25 < 25 < 25
    256 3 μg F 1 μg E29H 826 < 25 1.195 3.730 554 875
    257 1 μg E29H < 25 < 25 < 25 < 25 < 25 < 25
    258 3 μg F 100 μg AlOH 706 < 25 577 108 148 < 25
    259 RSV A2 347 < 25 172 1.449 305 < 25
    Figure 00760001
    Tabelle 30 Anti-F-Protein-Antikörper in den Mucosa-Flüssigkeiten von Mäusen, die mit dem mit CT-CRME29H formulierten F-Protein immunisiert worden waren.
    Immunogen BAL VW NW
    IgG IgA IgG IgA IgG IgA
    F/PBS < 1.4 < 1.4 < 1.4 < 1.4 < 1.4 < 1.4
    CT-CRME29H (1 μg) < 1.4 < 1.4 < 1.4 < 1.4 < 1.4 < 1.4
    F/CT-CRME29H (1 μg) 3.1 < 1.4 2.8 3.5 2.0 2.2
    F/CT-CRME29H (0.1 μg) 2.5 < 1.4 2.5 2.9 < 1.4 2.3
    F/CT-CRME29H (0.01 μg) < 1.4 < 1.4 < 1.4 2.2 < 1.4 < 1.4
    F/AlOH 2.4 < 1.4 < 1.4 < 1.4 < 1.4 < 1.4
    Tabelle 31 Erzeugung von systemischen neutralisierenden Anti-RSV-Antikörpern nach IN Immunisierung mit dem mit CT-CRME29H formulierten F-Protein
    Immunogen neutralisierender Antikörpertiter (+C') neutralisierender Antikörpertiter (+C')
    F/PBS < 1.3 < 1.3
    CT-CRME29H (1 μg) < 1.3 < 1.3
    F/CT-CRME29H (1 μg) 2.3 ± 0.7a < 1.3
    F/CT-CRME29H (0.1 μg) 2.2 ±0.4b < 1.3
    F/CT-CRME29H (0.01 μg) < 1.3 < 1.3
    F/AlOH 2.0 ± 0.3 < 1.3
    RSV A2 2.3 ± 0.3 < 1.3
    • a p < 0,05 im Vergleich mit F/PBS oder F/CT-CRME29H (0,01 μg), p > 0,05 im Vergleich mit F/CT-CRME29H (0,1 μg), F/AlOH oder RSV A2.
    • b p < 0,05 im Vergleich mit F/PBS oder F/CT-CRME29H (0,01 μg), p > 0,05 im Vergleich mit F/CT-CRME29H (1 μg), F/AlOH oder RSV A2.
    Tabelle 32 Virus-Infektiosität von Lungen- und Nasengewebe nach IN Immunisierung mit dem F-Protein und CT-CRME29H
    Immunogen Virustiter in der Lunge (log10 Mittelwert ± Standardabweichung Virustiter in der Nase (log10 Mittelwert ± Standardabweichung
    F/PBS 4.6 ± 0.5 2.7 ± 0.2
    CT-CRME29H (1 μg) 4.6 ± 0.5 3.5 ± 0.2
    F/CT-CRME29H (1 μg) < 2.0 ± 0.1a,b < 1.9 ± 0.1c
    F/CT-CRME29H (0.1 μg) < 1.9 ± 0.1a < 1.8 ± 0.1d
    F/CT-CRME29H (0.01 μg) 3.9 ± 0.7 2.9 ± 0.4
    F/AlOH 2.6 ± 0.7 2.3 ± 0.4
    RSV < 2.0 ± 0.03 < 1.8 ± 0.1
    Naivo 4.6 ± 0.1 3.4 ± 0.5
    • a p < 0,05 im Vergleich mit F/PBS, F/CT-CRME29H (0,01 μg), CT-CRME29H oder naiv, p > 0,05 im Vergleich mit F/AlOH oder RSV A2.
    • b p > 0,05 im Vergleich mit F/CT-CRME29H (0,1 μg).
    • c p < 0,05 im Vergleich mit F/CT-CRME29H (0,01 μg), F/PBS, CT-CRME29H oder naiv, p > 0,05 im Vergleich mit F/CT-CRME29H (0,1 μg), F/AlOH oder RSV A2.
    • d p < 0,05 im Vergleich mit F/PBS, F/CT-CRME29H (0,01 μg), CT-CRME29H oder naiv, p > 0,05 im Vergleich mit F/CT-CRME29H (1 μg), F/AlOH oder RSV A2.
  • Beispiel 11
  • Immunantworten von mit rekombinanten virusähnlichen Partikeln von Rotaviren immunisierten Mäusen
  • Zellen von Spodoptera frugiperda (Sf-9) (American Type Culture Collection, Manassas, VA) wurden in SF-900 II Serum-freiem Medium (Gibco-BRL, Grand Island, NY) gehalten. Die Sf9-Zellen wurden mit rekombinanten Konstrukten aus Baculoviren coinfiziert, welche das VP2- und VP6-Gen aus dem Affen-Rotavirus-Stamm SA11 exprimieren (32).
  • Die freigesetzten 2/6-VLPs wurden aus dem Wachstumsmedium dieser infizierten Sf9-Zellen wie folgt gewonnen. Die Zellen wurden mittels Zentrifugation bei 830 g über einen Zeitraum von 30 Minuten bei Raumtemperatur sich absetzen gelassen. Die Überstände wurden dann mittels Zentrifugation bei 8000 g über einen Zeitraum von 30 Minuten weiter geklärt. Die VLPs wurden von den Überständen mittels zweimaliger Zentrifugation durch 35% Sucrose in TNC-Puffer (10 mM Tris, 140 mM NaCl, 10 mM CaCl2, pH 8,0) bei 96.500 g über einen Zeitraum von zwei Stunden gereinigt, sodann in TNC-Puffer suspendiert und bei 4°C aufbewahrt. Die gereinigten VLPs wurden mittels SDS-PAGE analysiert und dann einer Silber- und Commassie-Brillant-Blau-Färbung zur Ermittlung der Reinheit, einer Western-Blot-Analyse zur Bestimmung der Integrität der Teilchen und einem BCA-Protein-Assay zur Messung der Gesamtprotein-Konzentration unterzogen.
  • Die Commassie-Brilliant-Blau-Färbung, die Silberfärbung und die Western-Blot-Analyse der gereinigten 2/6-VLPs bestätigten das Vorkommen von VP2- und VP6-Proteinen sowie ihre Reinheit und Immunoreaktivität mit spezifischen monoklonalen Antikörpern. Die Reinheit der VLPs wurde aus den Band-Intensitäten der Gele auf etwa 95% geschätzt. Zusätzlich bestätigte eine elektronenmikroskopische Analyse dieser gereinigten 2/6-VLPs deren morphologische Integrität (Daten nicht wiedergegeben).
  • Die Mäuse wurden wie folgt immunisiert. Die in diese Untersuchung verwendeten und in einer Rotavirus-freien Umgebung aufgezogenen BALB/c- und CD-1-Mäuse wurden von den Charles River Laborstories (Storeridge, NY) bezogen. Vier Wochen alte BALB/c-Mäuse wurden in den Wochen 0 und 2 zweimal entweder oral (n = 4) oder IN (n = 5, n 4) mit 100 μg bzw. 10 μg 2/6-VLPs immunisiert; jede Dosis wurde mit 10 μg CT-CRME29H formuliert. Eine dritte Gruppe von BALB/c-Mäusen (n = 4) erhielt die 2/6-VLPs mit CT-CRME29H IN, gefolgt von einer oralen Booster-Immunisierung (d. h. eine gemischte Gruppe). Die Kontrollmäuse in diesem Experiment wurden mit CT-CRME29H (n = 10), mit 1 × TNC-Puffer (n = 5) oder mit 2/6-VLPs plus 1 × TNC-Puffer (n = 5) immunisiert. Jede Maus wurde IN mit 20 μl Inokulum, zu einer bestimmten Zeit 2 μl, mit Intervallen von einer Minute jeweils abwechselnd in ein Nasenloch immunisiert. In den Wochen 0, 1, 2, 4, 6, 8, 10 und 13 wurden von allen Tieren Serum- und Kotproben gesammelt und die Konzentrationen der produzierten Rotavirus-spezifischen Serum-IgG-, -IgM- und -IgA-Antikörper sowie der IgA und IgG im Kot mittels eines ELISA bestimmt. Die Ergebnisse für die Antikörper im Serum sind in den 10 und 11 wiedergegeben; die Ergebnisse für die Antikörper im Kot sind in 13 wiedergegeben. Die Serumproben aus Woche 13 wurden verwendet, um die IgG1- und IgG2a-Unterklasse zu bestimmen. Die Ergebnisse für die Antikörper-Unterklassen sind in 12 wiedergegeben.
  • Die 1:100 verdünnten Seren aus der Vorimmunisierung und die 1:2 verdünnten Kotproben aus der Vorimmunisierung zeigten im ELISA keine Reaktivität. Dies Seren und der Kot aus den Kontrollen, welche nur TNC-Puffer oder CT-CRME29H erhielten, wurden parallel analysiert. Die Kontrollgruppen zeigten während der gesamten Untersuchung keine Rotavirus-spezifischen Antikörper im Serum oder Kot.
  • Unter Einsatz von CT-CRME29H als Adjuvans wurden in den Wochen 0, 2 und 13 vier Wochen alte CD-1-Mäuse wie oben dreimal oral (n = 4) oder IN (n = 4) immunisiert. Eine Kontrollgruppe (n = 2) erhielt CT-CRME29H allein. In den Wochen 0–9, 11–14 und 26–28 wurden die Serum- und Kotproben gesammelt und die Konzentrationen der Rotavirus-spezifischen Antikörper im Serum und Kot bestimmt.
  • Zum Nachweis und der quantitativen Bestimmung von IgG, IgM und IgA in Kot- und Serumproben wurden 96-Well-Mikrotiterplatten aus Polyvinylchlorid (Dynex Technologies, Chantilly, VA) mit einem in phosphatgepufferter Saline (PBS) verdünntem Anti-SA11-Rotavirus-Hyperimmunserum aus Meerschweinchen beschichtet und vier Stunden lang bei 37°C oder über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden sodann mit 5% BLOTTO (5% w/v entfettetes Milchpulver in PBS) bei 37°C zwei Stunden lang blockiert. Die suspendierten Kotproben wurden in 1% BLOTTO 1:1 verdünnt und zu den Platten gegeben. Die Platten wurden sodann über Nacht bei 4°C inkubiert, worauf sie drei Mal mit TNC-Puffer plus 0,05% TweenTM 20 (TNC-T) gewaschen wurden. Ein Anti-Rhesus-Rotavirus-Hyperimmunserum aus Kaninchen wurde in 1% BLOTTO plus 2,5% normalem Meerschweinchenserum (NGPS) verdünnt und den Platten für eine Stunde bei 37°C zugesetzt. Die Platten wurden sodann drei Mal mit TNC-T gewaschen. Mit Meerrettich-Peroxidase konjugierte Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG, -IgM und -IgA (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaitherburg, MD) wurden in 1% BLOTTO plus 2,5% NGPS verdünnt und zu den Platten gegeben, welche eine Stunde lang bei 37°C inkubiert wurden. Die Platten wurden sodann vier Mal mit TNC-T gewaschen. Es wurde TMB-Substrat (Kirkegaard and Perry Laboratories) zugesetzt und die erfolgenden Farbreaktionen sich 7 Minuten lang bei Raumtemperatur entwickeln gelassen. Durch Zugabe von 1 M Phosphorsäure wurde die Reaktion gestoppt. Mit Hilfe eines Mikroplatten-Readers (BIO-TEK Instrument, Winooski, VT) wurde die OD bei 450 nm bestimmt. Messwerte, die um 0,1 über dem Blank lagen, wurden als signifikant angesehen. Das SA11-Stock-Virus wurde in 1% BLOTTO verdünnt und zu den Platten gegeben, welche dann bei 4°C über Nacht inkubiert wurden. Die Platten wurden drei Mal mit TNC-T gewaschen; danach wurden die in 1% BLOTTO 1:1 verdünnten Kotproben oder die seriell in 1% BLOTTO verdünnten Serumproben aufgetragen. Als negative Kontrolle wurden Duplikate der Kotproben in ein Well ohne Anti-SA11-Antikörperbeschichtung gegeben. Die Platten wurden zwei Stunden lang bei 37°C inkubiert und dann drei Mal mit TNC-T gewaschen. Mit Peroxidase konjugierten Ziegen-Anti-Maus-IgG, -IgM und -IgA wurden in 1% BLOTTO plus 2,5% NGPS verdünnt und zu den Wells gegeben; die mit Peroxidase konjugierten Ziegen-Anti-Maus-IgA+IgG+IgM-Antikörper (H + L) wurden seriell verdünnt und zum vor der Immunisierung erfolgenden Nachweis von Antikörpern in die Wells gegeben. Die Platten wurden 1 Stunde lang bei 37°C inkubiert und dann vier Mal mit TNC-T gewaschen. Für den ELISA zum Nachweis von Antikörpern wurden die Platten wie oben beschrieben entwickelt. Die eingesetzte ELISA-Vorschrift zur Bestimmung der IgG-Unterklassen war eine Abwandlung der beschriebenen Vorschrift, in welcher HRP-markierte (monoklonale) Anti-Maus-IgG1 und -IgG2a als sekundäre Antikörper verwendet wurden (Biosource International, Camarillo, CA).
  • Ein von Ishida et al. (49) beschriebener histochemischer Immunassay wurde abgewandelt und zum Nachweis von Anti-Rotavirus-VP2- und -VP6-Antikörpern im Serum von mit den 2/6-VLPs immunisierten Mäusen eingesetzt. Kurz gesagt wurden sich in der frühen log-Phase in Schüttelkolben befindliche Sf9-Zellen mit einer Dichte von 2,5 × 104 Zellen/Well in 96-Well Gewebekulturplatten ausgesät und sodann eine Stunde lang bei Raumtemperatur (RT) inkubiert. Danach wurden die Zellen mit rekombinanten, das VP2- oder VP6-Gen codierenden Baculovieren mit einer MOI (Multiplicity of Infection) von 10 infiziert und die Infektion drei Tage lang bei 28°C fortschreiten gelassen. Das Kulturmedium wurde sodann verworfen und die Platten wurden in einem Vakuumofen bei RT eine Stunde lang getrocknet und mit 10% Formalin (10% bis 15% Methanol enthaltende 37% Formaldehydlösung, Sigma) in PBS bei RT 30 Minuten lang fixiert. Die Zellen wurden sodann bei RT fünf Minuten lang mit 1% Triton X-100 (Sigma) in TNC-Puffer permeabilisiert.
  • Jeder Satz infizierter Zellen, welche das bezeichnete Rotavirus-Protein exprimieren, wurde einem Vorinfektions- oder Nachimmunisierungs-Serum von jeweils einer BALB/c- oder einer CD-1-Maus ausgesetzt und dann einer Immunfärbung unterzogen. Die Mäuseserum-Proben wurden seriell in PBS mit 5% FCS verdünnt. Die Proben wurden in die Wells gegeben und die Platten zwei Stunden lang bei 37°C inkubiert. Die Platten wurden sodann vier Mal mit PBS gewaschen. Es wurde ein mit Merrettich-Peroxidase markierter Anti-Maus-IgG-, -IgM- oder -IgA-Antikörper (Kirkegaard & Perry Laboratories) in PBS mit 5% FCS zugegeben und bei 37°C eine Stunde lang inkubiert. Nach zweimaligem Waschen der Wells mit PBS wurden die angefärbten Zellen mit 3-Amino-8-Ethylcarbazol (AEC) (Sigma) nachgewiesen. Als negative Kontrollen wurden nicht infizierte Sf9-Zellen, Serum von nicht immunisierten Mäusen und Vorimmunisierungsseren von immunisierten Mäusen verwendet. Als positive Kontrollen wurden monoklonale Antikörper gegen VP6 (7D9, 5E6) und VP2 (BP2) benutzt (50).
  • Die nicht immunisierten Tiere und die mit den 2/6-VLPs immunisierten Tiere wurden in Woche 26 (CD-1-Mäuse) und Woche 13 (BALB/c-Mäuse) mittels Zwangsernährung mit 10 SD50 muriner EDIM-Wildtyp-Rotavirus (51) infiziert. Der Titer des EDIM-Stammes wurde als Shedding-Dosis 50 (SD50) bestimmt, der Dosis, die benötigt wird, um in 50% der adulten Mäuse ein fäkales Virus-Shedding zu induzieren. Die Trypsin-aktivierte Virus-Infektion (100 μl) wurde nach oraler Verabreichung von 100 μl 4% Natriumbicarbonat-Lösung verabreicht, um die Magensäure zu neutralisieren. Die Viren wurden in M199-Medium (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) verdünnt und mit 10 μl Trypsin-Stock (1 mg/ml) (Sigma Chemical Co, St. Louis, MO) pro ml viraler Stocklösung aktiviert. Nach der Infektion wurden die Kotproben von allen Mäusen 9 Tage lang gesammelt.
  • Das Rotavirus-Antigen-Shedding in den Kotproben wurde mit Hilfe eines ELISA gemessen und als optische Nettodichte-Werte (OD) ausgedrückt, d. h. die OD der Kotprobe nach der Infektion minus der OD der Probe vor der Infektion derselben Mäuse. Für jedes Tier wurde die Fläche unter der Shedding-Kurve ermittelt und die prozentuale Reduktion beim Antigen-Shedding (PRAS) für jedes Tier wurde berechnet, indem für jedes Tier die Fläche unter der Kurve mit dem Mittelwert der Fläche für die Kontrollgruppe verglichen wurde. Für jede immunisierte Gruppe wurde dann der mittlere PRAS berechnet. Nur PRAS-Werte über 50% wurden als Schutz gewährend angesehen. Die Ergebnisse sind in 14 wiedergegeben.
  • Mit SPSS für Version 8,0 für Windows (SPSS, Inc., Chicago, IL.) wurden statistische Analysen durchgeführt. Unabhängige t-Tests wurden herangezogen, um die Werte für die mittleren geometrischen Titer vor der Infektion miteinander zu vergleichen und um den PRAS zwischen den Gruppen zu vergleichen. Bis zu drei Stellen nach dem Komma wurden bei der Berechnung der P-Werte (0,000 = 0) berücksichtigt.
  • Beispiel 12
  • Steigerung der Expression von CT-CRME29H durch Einsatz eines mit Arabinose induzierbaren Promotors.
  • Die Konstruktion des mit Arabinose induzierbaren Systems war wie folgt: Es wurden PCR-Primer synthetisiert, um das das Toxin codierende Bicistron aus pIIB29H zu amplifizieren. Primer #1, CT29 vorwärts NHeI: 5'-TTTTTTGGGCTAGCATGGAGGAAAAGATG AGC-3' (SEQ ID NO: 6); Primer #2, CT29 rückwärts HindIII: 5'-GCAGGTCGAAGCTTGCATGTTTGGGC-3' (SEQ ID NO: 7). Das CT-CRME29H, ctxA und ctxB codierende PCR-Fragment wurde unter Ausnutzung der Endonuclease-Stellen NheI und HindIII in pBAD18-Cm cloniert, was zu dem Konstrukt pCT18 führte. Das ctxB-Gen (V. cholerae) aus pCT18 wurde unter Ausnutzung von ClaI und HindIII entfernt und durch ein ähnliches Fragment aus dem Plasmid pMGJ142 ersetzt, von dem gezeigt wurde, dass es ein ctxB-Gen aus V. cholerae Stamm 569B codiert. Das erhaltene Konstrukt pPX7490 codiert die CT-CRME29H-, ctxA- und ctxB-Gene aus dem Stamm 569B unter der Kontrolle des Arabinose-Promotors und weist die LTIIb-B-Leadersequenz auf.
  • Es wurden die folgenden Vorschriften für die in großem Maßstab stattfindende Expression und Reinigung von CT-CRME29H entwickelt: Es wurden geriffelte 3 l Fernbach-Kolben mit 1 l Hy-Soy-Wachstumsmedium pro Kolben eingesetzt (pro Liter: Hy-Soy 10 g; Hefeextrakt 12,5 g; Natriumchlorid 5 g; einbasisches Natriumphosphat 3,3 g; zweibasisches Natriumphosphat 13,1 g). Für die Start-Stockpräparation wurden einem Kolben 20 μg/ml Chloramphenicol und 20 ml sterile 50% Glucose zugesetzt (1% Glucose-Endkonzentration). Der Kolben wurde dann mit 300 μl mit pPX7490 transformiertem DH5α, dem bei –70°C eingefrorenen Stock, inokuliert. Der Kolben wurde bei 37°C unter Schütteln bei 200 Upm über Nacht inkubiert. Alle Wachstumsmedien, die am folgenden Tag eingesetzt werden sollten, wurden vorher durch Schütteln bei 37°C und 200 Upm über Nacht erwärmt. Am folgenden Tag wurde die über Nacht gewachsene Kultur in dem mit 20 μl/ml Chloramphenicol und 10 ml sterilem Glycerin (1% Glycerin-Endkonzentration) als Kohlenstoffquelle supplementierten Hy-Soy-Medium 1:40 verdünnt. Diese Kultur wurde in Fernbach-Kolben bei 37°C bis zu einer OD600 von 4,5–5,5 wachsen gelassen (oder größer in einem Bioreaktor). Diese Kultur wurde sodann mit 20 ml Arabinose (0,5% Endkonzentration) induziert und weitere drei Stunden inkubieren gelassen. Nach einem Induktionszeitraum von drei Stunden war das meiste Toxin zellassoziiert. Die Zellen wurden mittels Zentrifugation geerntet und das Pellet in 10 mM NaPO4, 1 mM EDTA-Puffer (pH 7,0) mit einem Volumen von 9% der ursprünglichen Kultur resuspendiert. Die Zellsuspension wurde mechanisch durch einen Mikrofluidizer aufgeschlossen und 10 Minuten lang bei 8500 g zentrifugiert, um die Zelltrümmer zu entfernen. Das Zelllysat (Überstand) wurde bei 42.000 Upm eine Stunde lang in einem 45Ti-Rotor bei durchschnittlich 160.000 g weiter geklärt. Das geklärte Zelllysat wurde auf eine mit 10 mM NaPO4 (pH 7,0) äquilibrierte Carboxymethyl (CM)-SepharoseTM-Säule (Pharmacia) gepackt. Es wurden ungefähr 300 ml CM-SepharoseTM pro 10 Liter Kulturvolumen verwendet. Das Zelllysat wurde auf die Säule mit der Geschwindigkeit von 0,102 cm/min (2 ml/min) gepackt. Die Säule wurde mit 10 bis 15 Säulenvolumina an 10 mM NaPO4 (pH 7,0) mit 0,255 cm/min (5 ml/min) eingehend gewaschen, um Verunreinigungen zu entfernen. Das CT-CRME29H-Holotoxin wurde mit 4 Säulenvolumina an 10 mM NaPO4 (pH 8,3) mit 0,255 cm/min eluiert. Beim CT-CRME29H enthaltenden Eluat wurde mittels Filtration oder Dialyse gegen PBS der Puffer ausgetauscht, dann wurde es bei 4°C aufbewahrt.
  • Beispiel 13
  • Immunantworten von BALB/c-Mäusen, die mit einer Plasmid-DNA immunisiert wurden, welche die volle Länge von Glykoprotein D des Herpes Simplex Virus Typ 2 codiert.
  • Sechs bis acht Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse wurden mit Plasmid-DNA (pDNA) immunisiert, welche die volle Länge von Glykoprotein D des Herpes Simplex-Virus Typ 2 (gD2) codiert (das Plasmid, welches das gD2-Gen enthält, wird in Pachuk et al. (40) beschrieben, welche Veröffentlichung hiermit als Referenz einbezogen wird) und mit 0,25% Bupivacain und mit Wildtyp-CT, CT-CRME29H als Adjuvans oder ohne Adjuvans formuliert worden ist. Den Tieren wurde drei Wochen nach der primären Immunisierung eine sekundäre Immunisierung gegeben und sie wurden zwei Wochen nach der letzten Infektion getötet. Der Ablauf der Immunisierung war wie folgt. Tabelle 33
    Gruppe Verabreichungsweg Konzentration des Plasmids Konzentration des Adjuvans injiziertes Volumen
    Maus 1 ID 50 μg 024 50 μg CT-CRME29H 10 μl
    Maus 2 ID 50 μg 024 50 μg CT 10 μl
    Maus 3 ID 50 μg 024 50 μg CT 10 μl
    Maus 4 IM 50 μg 024 50 μg CT 100 μl
    Maus 5 ID 50 μg 023 50 μg CT 10 μl
    • 024 = pDNA mit gD2-Gen; 023 = pDNA-Backbone ohne insertiertes gD2-Gen ID = intradermal; IM = intramuskulär
  • Die Gruppe 4 diente als positive Kontrolle; die Gruppe 5 diente als negative Kontrolle.
  • Ein Proliferations-Assay wurde wie folgt durchgeführt: 1 × 105 Milzzellen wurden in Gegenwart oder Abwesenheit von 200 ng/ml gD2-Protein in RPMI-Vollmedium mit 10% FCS kultiviert. Nach vier Tagen Inkubation bei 37°C in Gegenwart von 5% CO2 wurden die Kulturen über Nacht mit 3[H] gepulst. Der 3[H]-Einbau wurde mit einem Betacounter gemessen. Die Counts wurden als SI (Stimulations-Index = Counts in Gegenwart einer Antigen-Stimulierung dividiert durch die Counts in Abwesenheit einer Antigen-Stimulierung). angegeben. Die Ergebnisse sind in Tabelle 34 wiedergegeben.
  • Es wurde ein ELISA durchgeführt, um die Antigen-spezifische humorale Antwort in den Seren und vaginalen Waschflüssigkeiten zu messen. Kurz gesagt wurden 96 Well Flachbodenplatten (Maxisorb, Nunc) über Nacht bei 4°C mit gereinigtem gD2-Protein in einer Konzentration von 0,4 μg/ml beschichtet. Die Platten wurden drei Mal mit PBS gewaschen und mit 4% BSA eine Stunde lang bei Raumtemperatur blockiert. 50 μl der Serumproben (Verdünnung 1:100) oder 50 μl der Probe mit vaginaler Waschflüssigkeit wurden zu der Platte gegeben. Nach einstündiger Inkubation für die Seren und über Nacht bei 4°C für die vaginale Waschflüssigkeit wurden die Platten 5 Mal mit PBS gewaschen und eine 1:3000-Verdünnung von mit Peroxidase konjugiertem Anti-Maus-IgG (Sigma, St. Louis, MO) zugegeben und die Platten eine Stunde lang inkubiert. Vor Zugabe des Substrats 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB)-H2O2 (Biotecx, Houston, TX) wurden die Platten mit PBS gewaschen. Die Farbe wurde 30 Minuten sich entwickeln gelassen bevor sie mit einem Emax-Mikroplatten-Reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) bei 450 nm gemessen wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 35 (Seren) und Tabelle 36 (vaginale Waschflüssigkeiten) wiedergegeben.
  • Die Cytokine wurden unter Einsatz eines Standard-ELISA wie oben beschrieben gemessen. Die Platten wurden auf geeignete Weise beschichtet, um aus den Überständen von 24 Stunden bzw. 72 Stunden alten gD2-stimulierten Kulturen entweder IL-5 oder gamma-Interferon herauszufischen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 37 wiedergegeben. Tabelle 34 gD2-spezifische Zellproliferations-Antwort (SI) nach Verabreichung von pDNA für HSV-gD2 mit CT oder CT-CRME29H
    Gruppe ID CT ID CT-CRME29H ID IM
    Maus 1 6521 28826 24696 30949
    Maus 2 9641 15760 20249 26159
    Maus 3 32078 25558 12472 35366
    Maus 4 28792 19023 7092 5151
    Maus 5 12486 22510 14702 30790
    Mittelwert 17904 22335 15842 25683
    Tabelle 35 gD2-spezifische humorale Antwort (ng/ml) nach Verabreichung von pDNA-HSV-gD2 mit CT oder CT-CRME29H in Seren
    Gruppe ID CT ID CT-CRME29H ID IM
    Maus 1 –27 606 516 932
    Maus 2 –15 1387 1547 1315
    Maus 3 333 33 113 430
    Maus 4 582 755 688 108
    Maus 5 3 208 13 234
    Mittelwert 175 598 575 604
    Tabelle 36 gD2-spezifische humorale Antwort (ng/ml) nach Verabreichung von pDNA-HSV-gD2 mit CT oder CT-CRME29H in vaginalen Waschflüssigkeiten
    Gruppe ID CT ID CT-CRME29H ID IM
    Maus 1 0 0 69 374
    Maus 2 0 224 0 198
    Maus 3 0 145 0 83
    Maus 4 0 0 347 0
    Maus 5 0 –49 0 0
    Mittelwert 0 70 54 112
    Tabelle 37 gD2-spezifisches Cytokin-Elisa-Profil (pg/ml)
    024 + CT ID 024 + CT-CRME29H ID 024 ID 024 IM 023 Kontrolle
    Gamma-IFN 1597 1751 136 716 505
    IL-5 63 209 9 388 16
  • Literaturverzeichnis
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    Figure 00920001
  • Figure 00930001

Claims (10)

  1. Antigene Zusammensetzung mit einem aus einem pathogenen Bakterium, Virus, Pilz oder Parasiten ausgesuchten Antigen sowie einer wirksamen adjuvanten Menge eines mutanten Cholera-Holotoxins, wobei das Holotoxin im Vergleich mit einem Wildtyp-Cholera-Holotoxin eine verminderte Toxizität aufweist und an der Position 29 der A-Untereinheit des Cholera-Holotoxins substituiert ist, wobei der Glutaminsäurerest durch Histidin ersetzt ist; und wobei das Holotoxin in einem Vertebraten-Wirt die Immunantwort gegen dieses Antigen verstärkt.
  2. Antigene Zusammensetzung nach Anspruch 1, in welcher das ausgesuchte Antigen das rekombinante P4-Protein auf der Außenmembran von nicht-typisierbarem Hämophilus influenzae, das rekombinante P6-Protein auf der Außenmembran von nicht-typisierbarem Hämophilus influenzae, das rekombinante Urease-Protein von Heliobacter pylori oder das Fusionsprotein des RS-Virus ist.
  3. Antigene Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, welche ferner ein Verdünnungsmittel oder einen Träger umfasst.
  4. Antigene Zusammensetzung nach jedem der vorhergehenden Ansprüche, in welcher an der A-Untereinheit des Cholera-Holotoxins an einer anderen Position als der Aminosäure 29 mindestens eine zusätzliche Mutation erfolgt ist, wobei diese Mutation das Ersetzen des Arginins an der Position 7, der Asparaginsäure an der Position 9, des Arginins an der Position 11, des Histidins an der Position 44, des Valins an der Position 61, des Serins an der Position 63, des Histidins an der Position 70, des Valins an der Position 97, des Tyrosins an der Position 104, des Prolins an der Position 106, des Histidins an der Position 107, des Serins an der Position 109, der Glutaminsäure an der Position 110, der Glutaminsäure an der Position 112, des Serins an der Position 114, des Tryptophans an der Position 127, des Arginins an der Position 146 oder des Arginins an der Position 192 umfasst.
  5. Verwendung einer antigenen Zusammensetzung nach jedem der vorhergehenden Ansprüche bei der Herstellung eines Medikaments, wobei die Zusammensetzung ferner ein aus einem pathogenen Bakterium, Virus, Pilz oder Parasiten ausgesuchtes Antigen enthält und wobei das Antigen eine Immunantwort eines Vertebraten-Wirts auslöst.
  6. Verwendung nach Anspruch 5, wobei in der antigenen Zusammensetzung das ausgesuchte Antigen das rekombinante P4-Protein auf der Außenmembran von nicht-typisierbarem Hämophilus influenzae, das rekombinante P6-Protein auf der Außenmembran von nicht-typisierbarem Hämophilus influenzae, das gereinigte native Adhäsions- und Penetrationsprotein von Hämophilus influenzae (Haps), das rekombinante Urease-Protein von Helicobacter pylori, das rekombinante Klasse 1-rPilin von Neisseria meningitidis Gruppe B, das Klasse 1-PorA-Protein von Neisseria meningitidis Gruppe B, das Fusionsprotein des RS-Virus, die 2/6 virusähnlichen Teilchen vom Rotavirus oder das Glykoprotein D des Herpes simplex-Virus (HSV) Typ 2 (gD2) ist.
  7. Plasmid, das eine isolierte und gereinigte DNA-Sequenz enthält, welche eine DNA-Sequenz umfasst, die für ein immunogenes mutantes Cholera-Holotoxin mit einer Substitution an der Position 29 der A-Untereinheit des Cholera-Holotoxins codiert, wobei der Glutaminsäurerest durch Histidin ersetzt ist; und wobei die DNA-Sequenz funktionsfähig an einen durch Arabinose induzierbaren Promotor gebunden ist.
  8. Eine mit dem Plasmid des Anspruchs 7 transformierte, transduzierte oder transfizierte Wirtszelle.
  9. Verfahren zur Herstellung eines immunogenen mutanten Cholera-Holotoxins, wobei das Holotoxin im Vergleich mit einem Wildtyp-Cholera-Holotoxin eine verminderte Toxizität aufweist und an der Position 29 der A-Untereinheit des Cholera-Holotoxins substituiert ist, wobei der Glutaminsäurerest durch Histidin ersetzt ist; und wobei das Verfahren die Transformation, Transduktion und Transfektion einer Wirtszelle mit dem Plasmid des Anspruchs 7 umfasst sowie die Kultivierung der Wirtszelle unter Bedingungen, welche die Expression des rekombinanten, immunogenen, entgifteten Proteins durch die Wirtszelle erlauben.
  10. Verwendung einer effektiven adjuvanten Menge eines mutanten Cholera-Holotoxins, wobei das Holotoxin an der Position 29 der A-Untereinheit des Cholera-Holotoxins substituiert ist, wobei der Glutaminsäurerest durch Histidin ersetzt ist; zusammen mit einem aus einem pathogenen Bakterium, Virus, Pilz oder Parasiten ausgesuchten Antigen, um eine antigene Zusammensetzung herzustellen, wobei das Holotoxin in einem Vertebraten-Wirt die Immunantwort gegen das Antigen verstärkt.
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