DE69730814T2 - Das NucA Protein von Haemophilus influenzae und dessen kodierendes Gen - Google Patents

Das NucA Protein von Haemophilus influenzae und dessen kodierendes Gen Download PDF

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Description

  • Bereich der Erfindung
  • Diese Erfindung betrifft ein 63000 Dalton Protein, hergestellt durch Haemophilus influenzae, mit der Bezeichnung NucA, und das nucA-Gen, welches für dieses Protein kodiert.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Nicht-typisierbare Haemophilus influenzae (NTHi) ist ein streng humaner, kommensaler Organismus, welcher in den oberen Atemwegen von bis zu 80% von gesunden Erwachsenen gefunden wird (Bibliographie-Eintrag 1). Er ist eine führende Ursache von Otitis media und Atemwegsinfektionen bei Kindern, einschließlich Lungenentzündung und Sinusitis (2). Da NTHi-Stämme nicht eingekapselt sind, sind die bestehenden Impfstoffe für H. influenzae, welche auf der Kapsel-Struktur vom Typ b (Hib) basieren, nicht wirksam. Somit wird ein Impfstoff speziell für NTHi-Organismen gebraucht und potentielle Impfstoffbestandteile haben sich auf Oberflächen-exponierte Antigene konzentriert, wie Proteine der äußeren Membran.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Entsprechend ist es ein Ziel dieser Erfindung, ein zusätzliches Protein von H. influenzae zu isolieren und zu reinigen und zu testen, ob das Protein ein brauchbarer Impfstoffkandidat in passenden Modellsystemen ist.
  • Es ist ein weiteres Ziel dieser Erfindung, das Gen zu isolieren und zu klonieren, welches für solch ein Protein kodiert, und das Protein rekombinant zu exprimieren.
  • Diese und weitere Ziele der Erfindung wie unten diskutiert werden durch die Isolierung und Reinigung eines Proteins von H. influenzae, welches als NucA bezeichnet wird, als auch Peptiden von NucA-Protein, welche ein Epitop oder Epitope davon umfassen, erreicht. Das isolierte und gereinigte NucA-Protein von H. influenzae hat die Aminosäuresequenz von Aminosäuren 26–603 von SEQ ID Nr. 2 oder eine biologisch äquivalente Aminosäuresequenz davon. Aminosäuren 1–25 von SEQ ID Nr. 2 sind das Signalpeptid, welches während der Verarbeitung des reifen Proteins abgespalten wird. Das NucA-Protein hat ein Molekulargewicht von annähernd 63000 Daltons, wie an einem 12% SDS-PAGE Gel gemessen, und besitzt 5'-Nucleotidase-Wirksamkeit.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung wird das NucA-Protein durch Isolierung und Reinigung von dem H. influenzae Organismus erhalten. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das NucA-Protein rekombinant durch eine isolierte und gereinigte nucA-DNA-Sequenz exprimiert, welche für das Protein kodiert.
  • Die Erfindung schließt eine isolierte und gereinigte DNA-Sequenz ein, welche eine DNA-Sequenz umfasst, welche unter Hoch-Stringenz Southern-Hybridisierung Standardbedingungen mit einer DNA-Sequenz hybridisiert, welche für das NucA-Protein von H. influenzae kodiert, mit der Aminosäuresequenz von Aminosäuren 26–603 von SEQ ID Nr. 2 oder einer biologisch äquivalenten Aminosäuresequenz davon.
  • Beispiele für solche biologisch äquivalenten NucA-Sequenzen sind jene, worin die Aminosäuresequenz von Aminosäuren 26–603 von SEQ ID Nr. 2 durch eine oder mehrere der folgenden Aminosäurerest-Veränderungen modifiziert ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus K79E, N186K, S262G, V294A, E305Q, K327R, T337A, D360Y, R376H oder V436I.
  • Die Erfindung schließt ferner solch eine DNA-Sequenz ein, welche unter Hoch-Stringenz Southern-Hybridisierung Standardbedingungen mit einer DNA-Sequenz mit der Nukleotidsequenz von Nukleotiden 304–2037 von SEQ ID Nr. 1 hybridisiert.
  • Um Expression des NucA-Proteins zu erhalten, wird die DNA-Sequenz zuerst in einen geeigneten Plasmid-Vektor insertiert. Eine geeignete Wirtszelle wird dann mit dem Plasmid transformiert oder transfiziert. In einer Ausführungsform dieser Erfindung ist die Wirtszelle Escherichia coli Stamm InvαF'. Die Wirtszelle wird dann unter Bedingungen kultiviert, welche die Expression von besagtem NucA-Protein durch die Wirtszelle erlauben.
  • In einer weiteren Ausführungsform dieser Erfindung wird das isolierte und gereinigte NucA-Protein oder ein Peptid von NucA-Protein, welches ein Epitop oder Epitope davon umfasst verwendet, um eine Impfstoffzusammensetzung herzustellen, welche eine schützende Immunantwort in einem Säuger-Wirt auslöst. Die Impfstoffzusammensetzung kann ferner einen Hilfsstoff, Verdünnungsmittel oder Träger umfassen. Beispiele für solche Hilfsstoffe schließen Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat, MPLTM, StimulonTM QS-21 und IL-12 ein. Die Impfstoffzusammensetzung wird in einer immunogenen Menge an einen Säuger-Wirt verabreicht, welche aus reichend ist, den Wirt vor durch H. influenzae verursachte Krankheit zu schützen.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • 1 skizziert das KSCN-Extrakt von NTHi Stamm P860295 und seine Eluate von einem Bio-GelTM HT Hydroxylapatit-Säulen Durchlauf an einem 12% SDS-PAGE Gel. Spur 1 – BioRad's Standards mit niedrigem Molekulargewicht (ersichtliche Molekulargewichte von 97, 66, 45, 31 und 22 kD); Spur 2 – Vor-Säule 3 M KSCN Extrakt; Spur 3 – Säulendurchfluss; Spur 4 – 0,3 M NaPO4, pH 7,0, Eluat; Spur 5 – 0,4 M NaPO4, pH 7,0, Eluat.
  • 2 skizziert ein 12% SDS-PAGE Gel des weiter gereinigten NucA-Proteins, welches zeigt, dass es annähernd 63 kD ist. Spur 1 – BioRad's Standards mit niedrigem Molekulargewicht (gleich wie in 1); Spur 2 – konzentriertes NucA vor Ethanol-Ausfällung.
  • 3 skizziert vorgeschlagene nucA-spezifische PCR-Produkte, amplifiziert von der NTHi λ Zap Bücherei. Das Schema der λ Zap Bücherei zeigt die Insertionsstelle von P860295 Genom DNA Fragmenten in die pBluescriptTM Region der λ ZapTMII Phage und die relative Ausrichtung der nucA-spezifischen Degenerat-Primer P1 und P2 an potentiellen Genom-DNA Fragmenten, welche diese Stellen enthalten. Die Phagen-spezifischen T3 und T7 Primer-Stellen werden an der λ ZapTMII DNA fixiert gezeigt.
  • 4 (oben) skizziert die beiden PCR-Klone, welche das meiste der reifen nucA-Sequenz enthielten. Aus diesen Sequenzen wurde eine 420 bp Sonde konstruiert, die in den Southerns an P860295 chromosomaler DNA verwendet wurde. 4 (unten) skizziert eine begrenzte genomische Restriktionskarte des nucA-Gens.
  • 5 skizziert ein Schema von vorhergesehenen nucA-spezifischen inversen PCR-Reaktionen und Produkten. P860295 Genom-DNA wurde mit entweder NsiI (oben) oder EcoRI (Mitte und unten) verdaut. Die DNAs wurden verdünnt und ligiert und bildeten „selbstligierte" Kreise. Die DNA-Kreise, welche nucA-DNA enthielten, werden gezeigt.
  • Oben – der annähernd 3 kb NsiI-Kreis enthielt Sequenzinformationen oberhalb der P1 nucA Region. PCR-Amplifizierung unter Verwendung von Primer-Paaren 4313ext & 4102ext erzeugte ein annähernd 2 kb DNA-Fragment.
  • Mitte – Der annähernd 4,3 kb EcoRI Kreis würde Sequenz- Informationen oberhalb der P1 nucA Region enthalten. PCR-Amplifizierung unter Verwendung von Primer-Paaren 4121fwd & 4122ext sollte ein annähernd 4 kb DNA-Fragment erzeugen. Es wurde kein DNA-Fragment dieser Größe beobachtet.
  • Unten – Der annähernd 1,6 kb EcoRI Kreis würde Sequenzinformationen unterhalb der nucA-Kodierungsregion enthalten. PCR-Amplifizierung unter Verwendung von Primer-Paaren 4102ext & 4313ext sollte ein annähernd 0,7 kb DNA-Fragment erzeugen. Tatsächlich wurde ein annähernd 1,3 kb Fragment erhalten.
  • 6 skizziert den pRSETC-Expressionsvektor, einschließlich der DNA-Sequenz, welche die Klonierungsstellen unterhalb des Gen 10 T7 Promotors (PT7) umgibt. Die Restriktionsenzym DNA Erkennungsstellen, NdeI, NheI, BamHI und HindIII sind unterstrichen. Der Protein Start und Leserahmen wird unter der DNA-Sequenz gezeigt, als auch die Enterokinase-Spaltungsstelle (EK-Spaltung).
  • 7 skizziert einen Western-Blot an Zelllysaten von den Expressionsprodukten von pPX644, sondiert mit polyklonalen Antikörpern von Kaninchen. Spur 1: Vorgefärbte Proteinstandards mit hohem Molekulargewicht (200, 97,4, 68, 43, 29, 18,4 und 14,3 kD) (Gibco BRL); Spur 2: NucA gereinigter nativer Proteinstandard; Spuren 3 & 4: BL21(DE3) pLysS/pPX644, Isolat Nr. 1, nich-tinduziert, bzw. induziert; Spuren 5 & 6: BL21(DE3)pLysS/pPX644, Isolat Nr. 5, nicht-induziert, bzw. induziert; Spuren 7 & 8: BL21 (DE3)pLysS/pPX644, Isolat Nr. 7, nicht-induziert, bzw. induziert; Spuren 9 & 10: BL21(DE3)pLysS/pRSETC, nicht-induziert, bzw. induziert. Der Pfeil zeigt die Migration von NucA.
  • 8 (oben) skizziert ein mit Coomassie gefärbtes 12% Gel und 8 (unten) skizziert einen Western-Blot an Zelllysaten von nucA reifen Sequenz-Fusionsklonen Nr. 1–3 von pPX693, welcher nicht induzierte und induzierte Lysate zeigt, sondiert mit polyklonalen Antikörpern von Kaninchen. Ein zweiter Klon von pPX707 (ompT Signalsequenz) wird ebenfalls skizziert. Spur 1 – BRL Proteinstandards mit hohem Molekulargewicht mit ersichtlichen Molekulargewichten, wie in der Figur gezeigt; Spur 2 – nNucA; Spur 3 – pPX707, Klon Nr. 2, nicht-induziert; Spur 4 – pPX707, Klon Nr. 2, induziert; Spur 5 – pPX693, Klon Nr. 1, nicht-induziert; Spur 6 – pPX693, Klon Nr. 1, induziert; Spur 7 - pPX693, Klon Nr. 2, nicht-induziert; Spur 8 – pPX693, Klon Nr. 2, induziert; Spur 9 – pPX693, Klon Nr. 3 (nucA in falscher Ausrichtung); Spur 10 – pPX693, Klon Nr. 3, induziert, zeigt keine Induktion des annähernd 68 kD Bands; Spur 11 – pPX693, Klon Nr. 3, induziert, aber bei O. D.600 von 1,7 anstelle von 1,0; Spur 12 – Lysat von einer induzierten Vektor allein (pRSETC) Kultur, negative Kontrolle; Spur 13 – ein gereinigtes Präparat von rNucA von pPX644; Spur 14 – leer; Spur 15 – BRL Standards mit niedrigem Molekulargewicht.
  • 9 skizziert die Merkmale des pTrcHisC Vektors, zusammen mit dem nucA-Signal und teilweise reifen Sequenzen, um die Insertionsstellen in den Vektor in der Konstruktion von pPX691 zu zeigen. Die ersten drei Sequenzlinien in 9 stellen eine teilweise native nucA-Sequenz dar, beginnend am ersten ATG der Signalsequenz (SEQ ID Nr. 22) und fortlaufend in die reife Sequenz für 78 Basen. Die nächsten beiden Sequenzlinien stellen die Kodierungssequenz des Vektors dar (SEQ ID Nr. 23), umfassend die NcoI-Restriktionsstelle (welche die ATG-Startstelle enthält), polyHis-Region, Enterokinase-Spaltungsstelle und die BamHI-Stelle der multiplen Klonierungsregion im Vektor. Das Plasmid enthält lacIq, um den stark induzierbaren trc-Promotor zu unterdrücken, so dass Expression bis zur Induktion abgeschaltet wird (es gibt einen geringen basalen Grad an Durchlecken).
  • 10 (oben) skizziert ein mit Coomassie gefärbtes Gel und 10 (unten) skizziert einen Western-Blot an Zelllysaten von pPX691, pPX692 und pPX707, welche Konstrukte mit entweder der nativen (pPX691 und 692) oder ompT (pPX707) Signalsequenz in unterschiedlichen Vektoren und Wirtsstämmen sind. Eingeschlossen sind negative Kontrollen von pRSETC, welches der Vektor für pPX692 ist. Die zusätzlich induzierte Spur (Nr. 9 von links) unter pPX692 stammt von einer Kultur, induziert bei O. D.600 = 1,5, anstelle von 1,0, und zeigt eine Verringerung bei der NucA-Proteinexpression. Die nicht-induzierten und induzierten pRSETC-Lysate in Spuren 10 und 11 stammen von einem Klon ohne insertiertes nucA, während das induzierte pRSETC-Lysat in Spur 14 von einem Vektor stammt, welcher in einen ähnlichen Wirtsstamm umgewandelt wurde. Spuren 1 und 15 – ersichtliche Molekulargewicht-Standards, werden an der Figur aufgelistet (200, 97, 68, 43 und 29 kD; Spur 2 – natives NucA Protein (aber es war nicht genug Protein vorhanden, um mit Coomassie-Färbung visualisiert zu werden); Spuren 3 und 5 – nicht-induzierte Zelllysate von Klonen Nr. 14 bzw. Nr. 15 von pPX691; Spuren 4 und 6 – induzierte Zelllysate der gleichen pPX691 Klone; Spur 7 – nicht induziertes Zelllysat von Klon Nr. 11 von pPX692; Spuren 8 und 9 – Zelllysate der gleichen Kultur, aber induziert bei O. D.600 von 0,9, bzw. 1,5; Spur 12 – pPX707, Klon Nr. 1, nicht-induziert; Spur 13 – pPX707, Klon Nr. 1, induziert.
  • 11 skizziert ein Coomassie-Gel der Expression von PelB und OmpT NucA Fusionsproteinen. Spur 0 – Vorgefärbte Proteinstandards mit hohem Molekulargewicht mit ersichtlichen Molekulargewichten, wie in der Figur gezeigt; Spuren 1, 3, 5 & 7 – Proben des Flüssigkeitsüberstands; Spuren 2, 4, 6 & 8 – Proben des Zellpellets; Spuren 1–4 – von BL21(DE3)pLysS/pPX707 (OmpT-NucA); Spuren 5–8 – von BL21(DE3)pLysS/pPX708 (PelB-NucA). Der Pfeil zeigt die Migration von NucA.
  • 12 skizziert ein mit Coomassie gefärbtes 12% SDS-PAGE Gel an Zelllysaten von Konstrukten mit unterschiedlichen Signalsequenzen. Ebenfalls eingeschlossen ist der reife Klon pPX709 mit einem optimierten TIR und das NTHi P860295 Lysat. Eine negative Kontrolle ist der induzierte Vektor (pTrcHisC) allein. Hier enthält der Vektor keine NucA-Sequenz. Spuren 1 und 10 – Molekulargewicht-Standards wie oben; Spur 2 – gereinigtes Präp von rNucA von pPX691; Spur 3 – nicht-induziertes Lysat von pPX691; Spur 4 – induziertes Lysat von pPX691; Spur 5 – induziertes Lysat von pPX707; Spur 6 – induziertes Lysat von pPX708; Spur 7 – induziertes Lysat von pPX709; Spur 8 – Lysat von P860295; Spur 9 – induziertes pTrcHisC.
  • 13 skizziert die Ergebnisse eines 5'-Nukleotidasetests an einer TLC-Platte. Nukleotidase-Wirksamkeit wurde mit ganzen Zellen und gereinigtem nativen oder rekombinanten NucA-Protein bestimmt. Die Umsetzungen enthielten die folgenden Zugaben: Spur 1: 10 μl P860295 Zellen; Spur 2: 5 μl rNucA; Spur 3: 1 μl rNucA; Spur 4: 5 μl nNucA; Spur 5: 1 μl nNucA; Spur 6: keine zugegebene Nukleotidase; Spur C: 1 μl von 21,5 mM Adenosin plus 1 μl der Umsetzung von Spur 6 (Kontrolle für Migration von Adenosin, gezeigt als A). Lösungsmittel Front wird gezeigt.
  • 14 skizziert die Hemmung von rNucA(pPX691) 5'-Nukleotidase-Wirksamkeit durch das Anti-nNucA Mab Nt-63-34-25. Die Hemmung von enzymatischer Wirksamkeit wird in Abwesenheit (ge füllte Quadrate) oder Anwesenheit (hohle Kreise) von Protein-A Perlen skizziert.
  • 15 skizziert die Dot-Blot Hybridisierung von mehreren NTHi und Typ b, Eagan Stamm, als auch weiteren Arten, sondiert mit einer nucA 420 bp dig-markierten Sonde. Nummern 1–22 werden in Beispiel 8 unten dargestellt.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Diese Erfindung betrifft ein isoliertes und gereinigtes H. influenzae NucA-Protein. Das NucA-Protein hat die Aminosäuresequenz von Aminosäuren 1–603 von SEQ ID Nr. 2. Aminosäuren 1–25 umfassen das Signalpeptid. Nach normaler Verarbeitung hat das reife NucA-Protein die Aminosäuresequenz von Aminosäuren 26–603 von SEQ ID Nr. 2. Das NucA-Protein hat ein Molekulargewicht von annähernd 63000 Daltons (63 kD), wie an einem 12% SDS-PAGE Gel gemessen. Das NucA-Protein hat auch 5'-Nukleotidase-Wirksamkeit (siehe Beispiel 5), welche durch einen anti-nativen NucA monoklonalen Antikörper gehemmt wird (Beispiel 6).
  • Das NucA-Protein ist in sehr kleinen Mengen an der Zelloberfläche von H. influenzae vorhanden. NucA ist ein Membran-assoziiertes Protein. Dieses Protein wird unter allen getesteten H. influenzae Stämmen hochgradig konserviert. Die Erfindung betrifft ferner Peptide von NucA-Protein, welche ein Epitop oder Epitope davon umfassen. Solche Peptide schließen ein oder mehrere Epitope ein, die mit einem oder mehreren Epitopen des NucA-Proteins immunologisch kreuz-reaktiv sind. Solche Peptide werden zuerst erzeugt und dann bezüglich Kreuz-Reaktivität getestet.
  • Das NucA-Protein wird durch Isolierung aus dem H. influenzae Organismus, durch rekombinante DNA-Expression oder durch chemische Synthese erhalten. Chemische Synthese bezieht Verwenden von Standardchemien für Fest- und Flüssigphasensynthese ein, insbesondere für die Herstellung von Peptiden von NucA-Protein, welche ein Epitop oder Epitope davon umfassen.
  • Ein Verfahren für die Isolierung des NucA-Proteins aus dem H. influenzae Organismus wird in Beispiel 1 unten detailliert beschrieben. Zusammenfassend wird der Organismus mit KSCN extrahiert, das Extrakt wird durch zwei Hydroxylapatit-Säulen passiert und SDS-PAGE unterworfen. Das Band bei 63 kD an dem Gel wird ausgeschnitten, um gereinigtes NucA-Protein zu erhalten. Beispiel 4 beschreibt detailliert zwei alternative Reinigungs verfahren. Die zweite Hydroxylapatit-Säule kann durch eine MonoQ-Säule ersetzt werden. Alternativ wird der KSCN-Extraktionsschritt durch einen NaCl-Extraktionsschritt ersetzt.
  • Klonieren des Gens, welches für das NucA-Protein kodiert, war nicht einfach. Beispiel 2 unten stellt die mehreren Strategien dar, welche erfolglos versucht wurden, als auch die letztendlich erfolgreiche Klonierung des nucA-Gens, welches die DNA-Sequenz enthält, welche für das NucA-Protein kodiert. Erfolgreichem Klonieren folgte die Expression des NucA-Proteins und Sequenzieren des nucA-Gens. Die vollständige nucA-Gensequenz wird in SEQ ID Nr. 1, Nukleotide 229–2037 dargestellt. Das Signalpeptid wird durch Nukleotide 229–303 kodiert. Das reife NucA-Protein wird durch Nukleotide 304–2037 kodiert.
  • Beispiel 3 unten beschreibt detailliert die Expression des NucA-Proteins. Das nucA-Gen in voller Länge wurde in einen E. coli Expressionsvektor, pTrcHisC, kloniert und als pPX691 bezeichnet. Das nucA-Gen wurde in E. coli als reifes NucA-Protein exprimiert mit seiner Signalsequenz verarbeitet. Eine Kultur wurde mit IPTG für Expression des NucA-Proteins induziert. Expression wurde durch sowohl Western-Blot Analyse, als auch Coomassie-Gel Analyse bestätigt.
  • Diese Erfindung betrifft ferner eine isolierte und gereinigte DNA-Sequenz, welche eine DNA-Sequenz umfasst, welche für das NucA-Protein von H. influenzae kodiert, als auch begleitende DNA-Sequenzen, welche für Peptide von NucA-Protein kodieren, welche ein Epitop oder Epitope davon umfassen.
  • Eine Vielfalt an Wirtszellen-Vektorsystemen wird verwendet, um das NucA-Protein und Peptide dieser Erfindung zu exprimieren, zusätzlich zu jenen, welche in Beispiel 3 detailliert beschrieben werden. Das Vektorsystem ist mit der verwendeten Wirtszelle kompatibel. Geeignete Wirtszellen schließen Bakterien ein, transformiert mit Plasmid-DNA, Cosmid-DNA oder Bakteriophage-DNA; Viren, wie Kuhpocken-Virus und Adenovirus; Hefe wie Pichia-Zellen; Insektenzellen wie Sf9 oder Sf21 Zellen; oder Säuger-Zelllinien wie Zellen von Eierstöcken von Chinesischen Hamstern; als auch weitere herkömmliche Organismen.
  • Eine Vielfalt an herkömmlichen transkriptionalen und translationalen Elementen kann für das Wirtszellen-Vektorsystem verwendet werden. Die nucA-DNA wird in ein Expressionssystem inser tiert und der Promotor und andere Kontrollelemente werden in spezifische Stellen innerhalb des Vektors ligiert, so dass, wenn der Plasmid-Vektor in eine Wirtszelle insertiert wird, die nucA-DNA durch die Wirtszelle exprimiert werden kann.
  • Heterologe Signalpeptide werden verwendet, um das rekombinante NucA-Protein auf der zellulären Membran zu translokieren. Beispiel 3 beschreibt detailliert das separate Klonieren oberhalb des reifen nucA-Gens der OmpT und PelB Signalsequenzen. Expression des NucA-Proteins war mit jeder dieser Signalsequenzen erfolgreich.
  • Das Plasmid wird durch Transformation, Transduktion oder Transfektion in die Wirtszelle eingeführt, je nach verwendetem Wirtszellen-Vektorsystem. Die Wirtszelle wird dann unter Bedingungen kultiviert, welche Expression des NucA-Proteins durch die Wirtszelle erlauben.
  • Zusätzlich zu der von NTHi Stamm P860295 erhaltenen DNA-Sequenz, welche für das NucA-Protein kodiert (SEQ ID Nr. 1), umfasst die vorliegende Erfindung ferner DNA-Sequenzen, welche aufgrund der Redundanz des genetischen Codes zu den Sequenzen biologisch äquivalent sind, welche für das NucA-Protein kodieren, also jene anderen DNA-Sequenzen werden durch Nukleotid-Sequenzen gekennzeichnet, welche sich von jenen unterscheiden, die hierin dargestellt werden, aber welche für ein Protein oder Peptide mit den gleichen Aminosäuresequenzen kodieren wie jene, für welche durch die DNA-Sequenz von SEQ ID NR. 1 kodiert wird.
  • Insbesondere erwägt die Erfindung jene DNA-Sequenzen, welche von der Sequenz von SEQ ID Nr. 1 ausreichend duplikativ sind, um so Hybridisierung damit unter Hoch-Stringenz Southern-Hybridisierung Standardbedingungen zu erlauben, wie jene, welche bei Sambrook et al. (3) beschrieben werden, als auch die dadurch hergestellten biologisch wirksamen Enzyme.
  • Diese Erfindung umfasst ebenfalls DNA-Sequenzen, welche für Aminosäuresequenzen kodieren, welche sich von jenen des NucA-Proteins unterscheiden, aber welche zu jenen biologisch äquivalent sind, welche für das Protein beschrieben werden (SEQ ID Nr. 2). Von solchen Aminosäuresequenzen kann gesagt werden, dass sie biologisch äquivalent zu jenen des NucA-Proteins sind, falls sich ihre Sequenzen nur durch geringere Deletionen von oder herkömmliche Substitutionen zur NucA-Sequenz unterscheiden, so dass die tertiären Konfigurationen der Sequenzen gegenüber jenen des NucA-Proteins im Wesentlichen unverändert sind.
  • Zum Beispiel kann ein Codon für das Aminosäurealanin, eine hydrophobe Aminosäure, durch ein Codon substituiert sein, welches für einen anderen, weniger hydrophoben Rest kodiert, wie Glycin oder einen hydrophoberen Rest, wie Valin, Leucin oder Isoleucin. Ähnlich kann von Veränderungen, welche Substitution von einem negativ geladenen Rest für einen anderen, wie Asparaginsäure für Glutaminsäure, oder einem positiv geladenen Rest für einen anderen, wie Lysin für Arginin, als auch Veränderungen basierend auf Ähnlichkeiten von Resten in ihrem hydropathischen Index, ebenfalls erwartet werden, dass sie ein biologisch äquivalentes Produkt erzeugen. Von Nukleotid-Veränderungen, welche Veränderung der N-terminalen oder C-terminalen Anteile des Proteinmoleküls ergeben, wurde ebenfalls nicht erwartet, dass sie die Wirksamkeit des Proteins verändern. Jede der vorgeschlagenen Modifikationen befindet sich gut innerhalb der Routinefähigkeiten nach Stand der Technik, wie Bestimmung von Retention von biologischer Wirksamkeit der kodierten Produkte. Daher, wenn die Begriffe „nucA-DNA" oder „NucA-Protein" in entweder der Beschreibung oder den Ansprüchen verwendet werden, werden sie jeweils so verstanden, dass sie alle solche Modifikationen und Variationen umfassen, welche die Herstellung eines biologisch äquivalenten Proteins ergeben.
  • Speziell, wie in Beispiel 9 unten dargestellt, kann das NucA-Protein dieser Erfindung eine oder mehrere der folgenden Veränderungen der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 haben: K79E, N186K, S262G, V294A, E305Q, K327R, T337A, D360Y, R376H oder V436I. Eine oder mehrere dieser Aminosäureveränderungen sind in weiteren NTHi-Genomen und dem Typ b, Eagan-Stamm vorhanden.
  • Das NucA-Protein und Peptide von NucA-Protein, welche ein Epitop oder Epitope davon umfassen, sind bei der Herstellung von Impfstoffen brauchbar, um Schutz von warmblütigen Tieren vor durch H. influenzae verursachte Otitis media und Lungenentzündung zu verleihen.
  • Diese Impfstoffzusammensetzungen umfassen ein isoliertes und gereinigtes NucA-Protein von H. influenzae oder ein Peptid von NucA-Protein, welches ein Epitop oder Epitope davon umfasst, wobei die Impfstoffzusammensetzung eine schützende Immunantwort in einem Säuger-Wirt auslöst.
  • Impfstoffe, welche das NucA-Protein oder Peptide enthalten, können mit immunologisch annehmbaren Verdünnungsmitteln oder Trägern auf herkömmliche Weise gemischt werden, um injizierbare Lösungen oder Suspensionen herzustellen. Zusätzlich können die Impfstoffe Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat (Alaun) oder weitere pharmazeutische Hilfsstoffe einschließen, wie StimulonTM QS-21 (Cambridge Biotech Corporation, Worcester, MA), MPLTM (3-O-deacyliertes Monophosphoryl Lipid A; RIBI ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, Montana), und IL-12 (Genetics Institute, Cambridge, MA).
  • Die Impfstoffe dieser Erfindung können auch zusätzliche H. influenzae Proteine einschließen, welche nach Stand der Technik gut bekannt sind. Beispiele für solche Proteine sind jene, welche als P6 und P4 bezeichnet werden (das Letztere ist auch als Protein „e" bekannt).
  • Die Impfstoffe dieser Erfindung werden durch Injektion auf herkömmliche Weise verabreicht, wie subkutane, intraperitoneale oder intramuskuläre Injektion in warmblütige Tiere, als auch durch orale Verabreichung und intranasale Verabreichung, um eine wirksame Immunantwort zum Schutz vor Otitis media, verursacht durch NTHi herbeizuführen. Die zu verabreichende Dosis wird durch Mittel bestimmt, welche den Fachleuten bekannt sind. Schutz kann durch eine einzelne Impfstoffdosis verliehen werden, oder er kann die Verabreichung von mehreren Verstärkungsdosen erfordern.
  • Normalerweise wird sich in Abwesenheit von menschlichen klinischen Daten auf wirksame Immunisierung in einem anerkannten Tiermodell verlassen, um die Wirksamkeit eines Impfstoffs in Menschen vorherzusagen. Es ist vorgeschlagen worden, dass das Chinchilla ein Tiermodell für wirksame Immunisierung gegen NTHi (4) vorsieht.
  • Jedoch zeigten die späteren wirksamen Immunisierungsversuche mit NTHi-Protein Kandidaten, dass das Chinchilla kein annehmbares Modell ist (unveröffentlichte Daten, Lederle-Praxis Biologicals, West Henrietta, N.Y.).
  • Das anerkannte Tiermodell für Hib besteht aus passiver Immunisierung von Rattenjungen (5), zusammen mit bakteriziden Tests (6) in vitro. Aktive Immunisierung ist mit den Rattenjungen nicht möglich. Das Rattenjunge ist für nur 4–5 Tage anfällig für Hib; danach ist es nicht anfällig. Aufgrund dieses kurzen Zeitraums ist es nicht möglich, das Rattenjunge aktiv zu immunisieren, weil der Challenge mit dem Bakterium mehr als fünf Tage nach Immunisierung stattfinden muss und das Tier zu der Zeit nicht auf Challenge reagiert. Daher sieht passive Immunisierung mit dem Rattenjungen das einzige durchführbare Tiermodell für Haemophilus vor, wenn es mit bakteriziden Testdaten zusammen genommen wird.
  • In der vorliegenden Erfindung wird von dem NucA-Protein gezeigt, dass es aufgrund seiner Wirksamkeit in sowohl Studien für passive Immunisierung bei Rattenjungen, als auch bakteriziden Tests (wie in Beispiel 7 unten detailliert beschrieben) ein brauchbarer Impfstoff-Kandidat ist. In der Studie mit Rattenjungen wurde Typ b Eagan als Challenge-Stamm verwendet. Die Ergebnisse zeigten eine Verringerung in Bakteriämie bei Ratten, welche mit anti-rekombinantem NucA-Protein Serum passiv immunisiert worden waren.
  • Zusätzlich zu den vorhergehenden Arten der Impfstoffverabreichung kann eine Technik verwendet werden, welche wechselnd als genetische Immunisierung, Polynukleotid-Immunisierung oder nackte DNA-Technologie bekannt ist. Immunisierung mit DNA ist verwendet worden, um Tiere vor Challenge mit Influenza A zu schützen (7). Bei dieser Technik wird die nucA-DNA in Formen wie Plasmid DNA und nackter DNA verwendet und wird dem Säuger-Wirt auf vielfältige Weise verabreicht, einschließlich parenteral, mukosal und durch Gen-Gun Inokulation, wie zum Beispiel durch Fynan et al. beschrieben (8). Förderliche Wirkstoffe wie Bupivicain können bei dieser Technik verwendet werden.
  • Die nucA-DNA wird ebenfalls verwendet, um Sonden zur Verwendung als Diagnose im Nachweis von H. influenzae in ausgewählten klinischen Proben oder Laborstämmen zu erzeugen. Klinische Proben, welche analysiert werden, schließen klinische Isolate, Oticus Isolate und Halskulturen ein. Die Sonden werden bei der Diagnose von Meningitis, Otitis media und Lungenentzündung verwendet, welche durch Hib bzw. NTHi verursacht werden.
  • Eine solche Sonde ist die 420 bp Sonde, welche sich über Nukleotide 416–835 von SEQ ID Nr. 1 erstreckt. Wie in Beispiel 8 unten beschrieben, wurde diese 420 bp Sonde in einem Dot-Blot Hybridisierungstest verwendet. Diese Sonde war positiv für alle getesteten Haemophilus Stämme, einschließlich aller NTHi-Stämme und Typ b, Eagan Stamm. Die Sonde war negativ für andere bakterielle Stämme, einschließlich E. coli, Neisseria gonorrhoeae, Helicobacter pylori, Moraxella catarrhalis und Salmonella typhimurium. Wie erwartet war die Sonde positiv für einen E. coli Stamm, welcher ein rnucA-Plasmid enthielt. So sind nucA-Sonden für nucA-Sequenzen spezifisch und sind für die Diagnose der Gegenwart von H. influenzae Stämmen brauchbar.
  • Proben des E. coli Stamms InvαF', welche das rekombinante Plasmid pPX691 beherbergen, wurden durch die Anmelder bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, U.S.A. hinterlegt und ihnen wurde die ATCC-Eingangsnummer 98104 zugewiesen. Das Plasmid pPX691 enthält ein nucA-Insert, welches für das NucA-Protein mit der Aminosäuresequenz von Resten 26–603 von SEQ ID Nr. 2 kodiert.
  • Das Material, welches beim ATCC hinterlegt wurde, kann auch in Verbindung mit herkömmlicher Gentechnik verwendet werden, um biologisch äquivalente Sequenzen des NucA-Proteins zu erzeugen, einschließlich aber nicht beschränkt auf jene, worin die Aminosäuresequenz von Aminosäuren 26–603 von SEQ ID Nr. 2 durch eine oder mehrere der folgenden Aminosäurerest-Veränderungen modifiziert ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus K79E, N186K, S262G, V294A, E305Q, K327R, T337A, D360Y, R376H oder V436I.
  • Damit diese Erfindung besser verstanden werden kann, werden die folgenden Beispiele dargestellt. Die Beispiele dienen nur dem Zweck der Veranschaulichung und sind nicht so anzusehen, als dass sie den Umfang der Erfindung einschränken.
  • Beispiele
  • Die folgenden H. influenzae Stämme wurden verwendet: NTHi-Stämme
    P860295 Oticus Isolat vom Childrens's Hospital, Pittsburgh, PA
    P810384 Oticus Isolat vom Childrens's Hospital, Pittsburgh, PA
    P810568 Klinisches Isolat vom Childrens's Hospital, Pittsburgh, PA
    P861454 Halskultur vom Childrens's Hospital, Pittsburgh, PA
    P880859 Opticus Isolat vom Childrens's Hospital, Pittsburgh, PA
    N1955 Klinisches Isolat von der University of Texas Southwestern Medical Center in Dallas
    TN106 Klinisches Isolat von der University of Texas Southwestern Medical Center in Dallas
    SH1013 Ohrisolat aus Texas
    SH1014 Ohrisolat aus Ohio
    SH1015 Blutisolat aus Texas
    DL208 Klinisches Isolat der University of Texas Southwestern Medical Center in Dallas
    N830161E Klinisches Isolat der University of Texas Southwestern Medical Center in Dallas
    H305 Klinisches Isolat aus Pittsburgh, PA
    Typ b
    Eagan American Type Culture Collection, z. B. ATCC 31441 oder 53763
    Whittier Nicht-eingekapselter Typ b vom Childrens's Hospital, Boston, MA.
  • Es werden Standardtechniken der Molekularbiologie verwendet, die gemäß den in Sambrook et al. (3) beschriebenen Protokollen genutzt werden.
  • Beispiel 1
  • Identifizierung von NucA-Protein
  • Alle NTHi-Stämme und die Typ b Eagan und Whittier Stämme wurden in BHI (Hirn-Herz-Infusion) Brühe wachsen gelassen, ergänzt durch 10 μg/ml Hemin-Bestand (0,1 g Hemin, 0,1 g Histidin, 4 ml Triethanolamin pro 100 ml Lösung) und 40 μg/ml NAD oder durch 2% Fildes Anreicherung (Remel, Lenexa, Kansas) und 20 μg/ml NAD. Die Kulturen wurden bei 37°C unter Schütteln inkubiert.
  • Eine Zellkultur aus NTHi-Stamm P860295 wurde pelletiert, mit PBS oder Kochsalzlösung gewaschen und in 10 ml von 3 M KSCN, 0,1 M PO4, pH 6,0, pro Liter Kultur resuspendiert und bei Raumtemperatur (RT) für 30 Minuten geschüttelt. Einzigartige Bänder (anders als die Proteine der äußeren Membran (OMPs)) wurden gesehen, wenn das KSCN-Extrakt an einem 12% SDS-PAGE Gel laufen gelassen wurde. Eines dieser Proteine lief bei etwa 63 kD (siehe 1) und wurde wie unten beschrieben weiter gereinigt.
  • Das KSCN-Extrakt wurde durch Zentrifugation in der Sorvall Zentrifuge bei 8000 U/Min. für 20 Minuten zentrifugiert, dann bei 10000 U/Min. für 15 Minuten in einem SS-34 Rotor. Der Flüssigkeitsüberstand wurde durch einen 0,22 um Filter passiert und gegen zwei Wechsel von zwei Litern von jeweils 0,05 M Natriumphosphat, pH 7,0, dialysiert. Das dialysierte Extrakt wurde auf eine Bio-GelTM HT Hydroxylapatit (HA)-Säule (0,2–0,3 ml HA pro ml Extrakt) geladen und mit 0,05 M Phosphat, pH 7,0, äquilibriert. Die Säule wurde mit etwa 10 Säulen-Volumina von 0,05 M Phosphat, pH 7,0, gewaschen. Das 63 kD Protein wurde mit etwa 5–6 Säulen-Volumina von 0,3 M Phosphat, pH 7,0, gefolgt von einem ähnlichen Volumen von 0,4 M Phosphat, pH 7,0, Schritt-eluiert. Die Fraktionen, welche das Protein enthielten, wurden gepoolt und in einer Amicon Rührzelle unter Verwendung der YM30 Membran konzentriert und Feststoffteilchen wurden bei 3000 U/Min. für 10 Minuten pelletiert. Der Füssigkeitsüberstand wurde gegen 0,05 M Phosphat, pH 7,0, dialysiert, für weitere Reinigung über einer zweiten HA-Säule (etwa die Hälfte des Volumens der ersten Säule) und mit 0,05 M Phosphat, pH 7,0, äquilibriert. Nachdem die Probe geladen war, wurde die Säule zuerst mit 0,05 M Phosphat, pH 7,0, dann 0,3 M Phosphat, pH 7,0 (etwa 2 Säulen-Volumina) gewaschen. Das Protein wurde mit einem 0,3 M–0,4 M Phosphat, pH 7,0, Gradienten (etwa 3 Säulen-Volumina) eluiert. Fraktionen wurden gesammelt und all jene, welche das im Wesentlichen reine 63 kD Band enthielten (identifiziert auf der Basis von Größe durch ein SDS-PAGE gel) wurden gepoolt und konzentriert.
  • Zum Schluss wurden 100 μg Protein, eluiert aus einer dritten HA-Säule, wiederholt in einer Centricon 30 ultrafiltriert, um das Phosphat mit sterilem Wasser zu ersetzen, Ethanol-ausgefällt und SDS-PAGE unterworfen (siehe 2). Die Konzentration wurde durch das Peterson-Lowry Verfahren bestimmt und N-terminale Aminosäuresequenz-Analyse wurde durchgeführt. Die ersten 26 Amino-terminalen Reste haben die in Resten 26–51 von SEQ ID Nr. 2 dargestellte Sequenz. Reinigung zu Homogenität wurde durch Elektrophorese des Proteins an einem Gel und dann Ausschneiden des 63 kD Bands erreicht. Das Protein wurde aus der Gelscheibe elekto-eluiert, mit Ethanol ausgefällt, quantifiziert, an einem SDS-PAGE überprüft und in Immunogenizitätsstudie Nr. 1 verwendet. Siehe Beispiel 7 unten.
  • Eine Tierstudie (Studie Nr. 1) wurde durchgeführt, um die Immunogenizität von NucA-Protein zu bestimmen. Siehe Tabellen 3, 5 und 6 unten für die Daten der Tierstudie. Antikörpertiter zu diesem Protein wurden gemessen. Ganzzellen (WC) und bakterizide (BC) Tests wurden an den Seren bestimmt. Vom nativen Protein mit der Bezeichnung „NucA" wurde befunden, dass es antigenisch und kreuz-reaktiv unter allen getesteten Stämmen in WC Enzym-gebundenen Immunosorbent-Tests (ELISA) ist. Zusätzlich hatten die Seren bakterizidale Wirksamkeit für zwei von vier getesteten heterologen Stämmen. Daher wurde das NucA-Protein als potentieller Impfstoffkandidat angesehen. Um größere Mengen des NucA-Proteins zu erzeugen, müsste das Gen, welches für das Protein kodiert, zuerst identifiziert und kloniert werden, um rekombinant exprimiert zu werden.
  • Beispiel 2
  • Klonieren des nucA-Gens
  • Vorbereitende Schritte
  • Beim Durchführen dieser Arbeit wurden die folgenden Reagenzien und Stämme verwendet: DNA-modifizierende Enzyme von New England Biolabs (Beverly, MA) oder Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN); Agarose LE von Boehringer Mannheim; Sea PlaqueTM bei niedriger Temperatur schmelzende Agarose von FMC (Rockland, ME); Adenosin-5'-monophosphat und Adenosin von Sigma (St. Louis, MO); Si250F TLC Platten von J. T. Baker Chemical Co. (Phillipsburg, NJ); TA Cloning Kit, INVαF' und pRSETC und pTrcHisC Expressionsvektoren von Invitrogen (San Dieago, CA); BL21(DE3)pLysS, pET12a und pET20b von Novagen (Madison, WI); der λ ZapTMII Vektor und XL1-Blue MRF' Wirtsstamm von Stratagene (LaJolla, CA).
  • Die verwendeten Standardverfahren der Molekularbiologie waren ähnlich jenen, von welchen durch Sambrook et al. (3) berichtet wurde.
  • Alle NTHi-Stämme und die Typ b Eagan und Whittier Stämme wurden in BHI (Hirn-Herz-Infusion) Brühe wachsen gelassen, ergänzt durch 10 μg/ml Hemin-Bestand (0,1 g Hemin-0,1 g Histidin-4 ml Triethanolamin pro 100 ml Lösung) und 40 μg/ml NAD, oder durch 2% Fildes Anreicherung und 20 μg/ml NAD. Die Kulturen wurden bei 37°C mit Schütteln inkubiert.
  • Konstruktion einer P860295 Bücherei in einem λ ZapTMII Vektor
  • Annähernd 50 μg (100 μl von P860295 chromosomaler DNA wurden mit 20 Einheiten Tsp509I Restriktionsenzym (New England Biolabs [NEB]) in 10 × Puffer 4 (NEB) bei 65°C für 50 Minuten verdaut. Fragmente (4–10 kb) wurden an einem 0,7% Sea Plaque (FMC) Agarosegel, betrieben bei 40 V für etwa 14 Stunden, isoliert. Die Bänder mit der passende Größe wurden aus dem Gel geschnitten, bei 70°C geschmolzen, mit einem Volumen von 1 × TE, pH 7,5, verdünnt und mit einem gleichen Volumen von warmem (RT-37°C) Phenol extrahiert. Der Flüssigkeitsüberstand wurde mit Chloroform extrahiert, um Phenol zu entfernen, Ein-Zehntel Volumen 3 M Natriumacetat wurde zugegeben und die DNA wurde mit zwei Volumina von kaltem absoluten Ethanol ausgefällt. Die DNA wurde pelletiert, in 70% Ethanol gewaschen, getrocknet und in 10 μl sterilem Wasser resuspendiert. Unterschiedliche Mengen an DNA wurden an Eco-RI verdauten und entphosphorylierten λ ZapTMII Vektorarmen (Stratagene) bei 12°C über Nacht ligiert. Der λ ZapTMII Vektor ist entworfen worden, um in vivo Ausschneiden und Rezirkularisation von klonierten Inserts, welche innerhalb des Vektors enthalten sind, zu erlauben, um ein Phagemid zu bilden, welches das klonierte Insert enthält. Ligierungen wurden unter Verwendung von Stratagene's Extrakten gepackt und auf X11 Blue MRF' Zellen plattiert. Die Effizienz der Insertion variierte von 90% bis 95%, basierend auf weißen gegenüber blauen Plaques an X-gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid) Platten. Die weißen Plaques enthielten Inserts von etwa 4–6 kb.
  • Plaques aus der Bücherei wurden mit monoklonalen und polyklonalen Antikörpern oder mit DNA-Sonden entweder durch Hybridisierung mit Digoxigenin-11-dUTP (dig-dUTP) Sonden (Boehringer Mannheim) oder in PCR-Umsetzungen (siehe unten) gescreent.
  • Immunoblot-Screening der λ ZapTMII Bücherei
  • Die λ Plaques wurden plattiert, etwa 500 pfu auf 100 mm TY (5 g NaCl, 2 g MgSO4·7H2O, 5 g Hefeextrakt, 10 g Trypton, pro Liter Brühe, angepasst an pH 7,5 mit NaOH, plus 15 g Difco Agar) plus Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranosid (IPTG) Platten und bei 37°C über Nacht inkubiert. Die Platten wurden bei 4°C für mindestens zwei Stunden gekühlt. Die Plaques wurden mit trockenen Schleicher & Schuell (Keene, NH) NCTM Nitrozellulosemembranen für 5–10 Minuten geblottet. Die Filter wurden in 15 ml 5% BLOTTO (in 1 × PBS) in 100 mm Petrischalen blockiert. TweenTM-20 (0,1–0,3%) wurde manchmal zugegeben, um Hintergrund bei 0,1–0,3% zu verringern. Der Filter wurde bei RT für 4–6 Stunden oder bei 37° C für eine Stunde geschüttelt. Das BLOTTO wurde entfernt und primärer Antikörper in 5% BLOTTO wurde mit dem Filter bei 4°C über Nacht inkubiert. Die verwendeten primären Antikörper waren monoklonale Antikörper Nt63-34-25, Nt63-60-14, Nt63/2-1-45 und Nt63/2-13-42 (erzeugt wie in Beispiel 7 beschrieben), oder ein Gemisch dieser vier monoklonalen Antikörper, oder polyklonales Kaninchen-Serum, das zu XL1-Blue MRF', Y1090R', Y1089R' und Y1088 Zellkulturen und λ ZapTMII Lysat absorbiert worden war. Wäschen wurde bei RT mit 15 ml 5% BLOTTO für jeweils 5–10 Minuten durchgeführt und dreimal wiederholt. Dann wurde der Filter mit sekundärem Antikörper (KPL Anti-Maus IgG + M Nr. QJ08-1, Phosphatase-konjugiert), verdünnt in 1 : 1000 in 5% BLOTTO ±0,1–0,3% TweenTM-20 inkubiert und für eine Stunde bei RT geschüttelt. Wieder wurde der Filter 3× mit 15 ml von jeweils 1 × PBS + 0,1–0,3% TweenTM-20 bei RT für 5–10 Minuten gewaschen. Eine zusätzliche Wäsche wurde in 1 × PBS durchgeführt. Der Filter wurde dann in entwickelndem Puffer (0,1 M Tris, pH 9,5, 0,1 M NaCl, 5 mM MgCl2) für fünf Minuten bei RT äquilibriert. Der Filter wurde dann in Petrischalen platziert, welche 10 ml Entwicklungspuffer plus 45 μl NBT (Nitro-Blau Tetrazolium) und 35 μl BCIP (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-phosphat) enthielten und geschüttelt, um sicherzustellen, dass der Filter in Entwickler eingetaucht war. Er wurde dann im Dunkeln an einer ebenen Oberfläche gehalten, bis die Flecken ausreichend dunkel waren. Die Umsetzung wurde durch mehrmaliges Spülen des Filters in entionisiertem Wasser gestoppt und auf 3MM Whatman-Papier im Dunkeln getrocknet.
  • Es schien ein Problem mit der hohen Hintergrund-Reaktivität zu λ ZapTMII Plaques zu geben. Vom sekundären Antikörper wurde befunden, dass er die Hauptursache für die Hintergrundbindung war. Ziege Anti-Maus IgG + M Partie Nr. QJ08-1 (Kirkegaard & Perry Labs, Gaithersburg, MD), Alkaliphosphatase-konjugiert, hatte unter den getesteten den niedrigsten Hintergrund, wenn sie bei 1 : 1000 Verdünnung verwendet wurde. Immunoblot-Screening ergab keine positiven Klone für NucA. Aufgrund der nicht-spezifischen Bindung des Hintergrunds schien weitere Arbeit in dieser Richtung nicht vielversprechend. Daher wurde eine andere Strategie eingesetzt, um zu versuchen, nucA-Klone und Sequenzen herauszuziehen.
  • Plaque-Hybridisierung an λ ZapTMII Bücherei
  • Zwei 24-mer Degenerat Oligonukleotid-Sonden wurden aus der N-terminalen Sequenz des NucA-Proteins entworfen (siehe Beispiel 4 unten) und unter Nutzung einer H. influenzae Codon Usage Tabelle für diesen Zweck zusammengestellt. Die Sonden umfassen Aminosäuren 1–8 und 14–21 des N-Terminus des reifen Proteins und wurden P1, bzw. P2 genannt:
    P1 AAAGAAGCACCACAAGCACATAAA (SEQ ID Nr. 3)
    P2 ATTTTACATATTAATGATCATCAT (SEQ ID Nr. 4)
  • P1 und P2 wurden jeweils an vier Basen gewobbelt. Für P1 kann das A an Rest 9 ein T sein, das A an Rest 12 kann ein T sein, das A an Rest 18 kann ein T sein, und das T an Rest 21 kann ein C sein. Für P2 kann das T an Rest 3 ein C sein, das T an Rest 9 kann ein C sein, das T an Rest 12 kann ein C sein und das T an Rest 21 kann ein C sein. Der Primer P1 entspricht Nukleotiden 304–327 von SEQ ID Nr. 1, außer, dass das G an Nukleotid 309 ein A in diesem Primer ist. Der Primer P2 entspricht Nukleotiden 343–366 von SEQ ID Nr. 1, außer, dass das G an Nukleotid 348 in diesem Primer ein A ist. Die Oligos waren 3'-End markiert mit dig-dUTP gemäß den Empfehlungen des Lieferanten.
  • Die P1 und P2 Sonden wurden mit Genom-DNA durch Southern-Hybridisierungen an EcoRI und BamHI verdauter P860295 chromosomaler DNA und EcoRI verdauter XL1-BlueMRF' chromosomaler DNA überprüft. Bei P860295 DNA wurde nur ein Band mit der P1 Sonde bei annähernd 4 kb im EcoRI-Verdau gesehen, während zwei Bänder bei der P2 Sonde bei annähernd 4 kb und 1,8 kb gesehen wurden. Der BamHI-Verdau von P860295 DNA zeigte ein annähernd 30 kb Band. XL1-BlueMRF' DNA kreuz-reagierte nicht mit den Sonden. Vorhybridisierungs- und Hybridisierungsinkubationen mit P1 als Sonde wurden bei 53°C durchgeführt; für die P2 Sonde wurden sie bei 45°C durchgeführt. Wäschen für P1 Hybridisierung wurden bei 48°C durchgeführt; Wäschen für P2 wurden bei 40°C durchgeführt, Standardprotokollen folgend.
  • Plaque-Hebungen wurden gemäß dem Verfahren im Hybond-N (Amersham) Protokollbuch durchgeführt. Vorhybridisierung und Hybridisierung wurden bei 42°C durchgeführt, während Wäschen bei 45°C für P1 und 38°C für P2 durchgeführt wurden. Zehn Platten von Bücherei-Lysat, etwa 1000 pfu pro 100 mm Platte, wurden unter Verwendung von P1 oder P2 als Sonden gescreent. Sechs vermeintlich Positive wurden aufgenommen, fünf vom Filter Nr. 9 (P2 Sonde) und einer von Filter Nr. 5 (P1 Sonde). Diese wurden bewahrt und durch PCR weiter gescreent. Siehe unten im PCR-Screening Abschnitt.
  • Phage-Bücherei DNA Reinigung
  • Etwa 5 ml von P860295 λ ZapTMII Bücherei Phage wurden durch einen Glycerol-Stufengradienten greinigt (9). Die Phagen-DNA wurde mit 20 μl TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) bei annähernd 1 ng/μl resuspendiert.
  • DNA-Reinigung
  • DNAs wurden entweder direkt oder aus Agarosegels unter Verwendung des LiCl-Protokolls (10) oder des GeneClean Kits (Bio 101 Inc.) wie durch den Hersteller beschrieben gereinigt. Plasmid Mini-Prep DNAs wurden aus 1 ml über Nacht Kulturen unter Verwendung von Wizard Mini-Plasmid DNA-Kit (Promega) oder alkalischen Lysis-Phenol Standardextraktionsverfahren isoliert. Plasmid DNA in großem Maßstab wurde aus 100–500 ml über Nacht Kulturen unter Verwendung des Maxi Plasmid DNA Kits (QIAGEN Inc.) isoliert.
  • Partielle DNA-Sequenz von nucA
  • Das Grundprinzip zum Durchführen des folgenden Versuchs war zweifach: (1) Die NTHi λ ZapTMII Bücherei wurde aus einem partiellen Tsp509I Genom-Verdau konstruiert, daher sollten PCR-Bänder in separater Größe durch Amplifizieren der NTHi λ ZapTMII Bücherei unter Verwendung von Kombinationen der Phage-spezifischen Primer T3 (SEQ ID Nr. 16) und T7 (SEQ ID Nr. 8) und nucA spezifischen Primer P1 (SEQ ID Nr. 3) und P2 (SEQ ID Nr. 4) wie in 3 veranschaulicht erzeugt werden; und (2) PCR kann so hergestellt werden, dass es weniger stringent ist, und daher toleranter gegenüber Nukleotid-Fehlanpassungen bei Verglühen der Primer. Primer T3 hat die folgende Sequenz (welche nicht nucA entspricht):
    T3 ATTAACCCTCACTARAGGGA (SEQ ID Nr. 16)
  • Zwei DNA-Amplifizierungsumsetzungen wurden durchgeführt, eine mit Taq DNA Polymerase (Boehringer Mannheim) und die andere mit PFU DNA Polymerase (Stratagene). Amplifikationszyklen waren wie folgt: Denaturierung, 95°C für 50 Sekunden; Verglühen, 58°C für 60 Sekunden; Verlängerung, 72°C für 4 Minuten, 30 Zyklen, und dann 72°C für 10 Minuten. Eine Aliquote der Umsetzung wurde in einem Agarosegel elektrophoretisch behandelt. DNA-Fragmente von annähernd 2000 bp und 600 bp wurden unter Verwendung von T3 + P1 Primern, bzw. T7 + P1 Primern beobachtet. Der Primer T7 (SEQ ID Nr. 8) hat die folgende Sequenz (welche nicht nucA entspricht):
    T7 CGACTCACTATAGGGAGACC (SEQ ID Nr. 8)
  • Sowohl die annähernd 600 bp, als auch 2000 bp DNAs wurden mit Gel isoliert. Es wurde ein Versuch unternommen, diese DNAs zu reamplifizieren, als auch die vorhergehende PCR-Umsetzung mit NTHi λ ZapTMII Bücherei DNA zu wiederholen. Die Extensionszeit bei der PCR-Umsetzung wurde auf zwei Minuten bei 72°C verringert. Nur die PCR-Umsetzung mit NTHi λ ZapTMII Bücherei DNA erzeugte ein PCR-Produkt von annähernd 600 bp.
  • Die annähernd 600 bp amplifizierte DNA wurde mit Gel isoliert und unter Verwendung des TA-Klonierungskits wie durch den Lieferanten (Invitrogen) empfohlen in pCRTMII Vektor kloniert; das sich ergebende Plasmid wurde pPX640 genannt. Die DNA-Sequenz des PCR-Inserts wurde an einem ABI 370 DNA Sequenzer unter Verwendung von fluoreszenten Dideoxynukleotid-triphosphaten bestimmt und entspricht Nukleotiden 304 bis etwa 840 von SEQ ID Nr. 1 mit zwei Basenunterschieden in den Wobble-Positionen der P1 Region. Nukleotid 309 ist ein A und Nukleotid 315 ist ein T. Die Aminosäuresequenz, welche vom 5'-Ende der insertierten DNA abgeleitet wird, war identisch mit der N-terminalen Proteinsequenz des nativen reifen NucA-Proteins, welches in Beispiel 1 beschrieben wurde. Dies bestätigte die korrekte Klonierung des partiellen nucA-Gens.
  • Ähnliche PCR-Bänder wie oben wurden erhalten, wenn die PCR-Umsetzung mit den P2-Paaren durchgeführt und die Glühtemperatur auf 48°C verringert wurde. Ein annähernd 1,7 kb Band wurde mit dem T3 Primer-Paar amplifiziert und ein annähernd 600 bp Band wurde mit dem T7 Primer-Paar gesehen. Diese amplifizierten Fragmente wurden ähnlich in pCRTMII Vektor kloniert. Sechs weiße Kolonien wurden jeweils von P2/T3 und P2/T7 Ligierungen aufgenommen. Alle hatten Inserts, wenn sie durch EcoRI-Verdau geprüft wurden. Etwa 600 Basen und annähernd 1,7 kb an Sequenzen wurden aus dem P1/T7 Klon, bzw. dem P2/T3 Klon erhalten. Die überlappenden Sequenzen der beiden Klone war ähnlich, mit erwarteten Veränderungen in der P2 Region, weil der P2 Primer ein degeneriertes Oligonukleotid ist. Der P1/T7 Klon enthielt die 5'-536 Basen von nucA und der P2/T3 Klon startete unterhalb von P1 und setzte sich für etwa 1600 Basen fort. Die vollständigen oberen und unteren Sequenzen wurden in diese Klone nicht eingeschlossen.
  • PCR-Screening
  • Vermeintlich Positive von Immunoblots (vom Immunoblot-Screening der λ ZapTMII Bücherei, siehe oben) und Oligonukleotid-Hybridisierungsblots (von Plaque-Hybridisierung, siehe oben) wurden unter Verwendung von nucA Primern 4101ext und 4102ext, SEQ ID Nr. 5 bzw. 6 PCR-Amplifizierung unterworfen. Diese Primer wurden während Sequenzieren der nucA-Region von pPX640 erzeugt und haben die folgenden Sequenzen:
    4101ext CCAAAGTGGATATTGGTG SEQ ID Nr. 5
    4102ext CATCATAGAACTTCACATC SEQ ID Nr. 6.
  • Der Primer 4101ext entspricht Nukleotiden 416–433 von SEQ ID Nr. 1. Der Primer 4102ext entspricht dem Komplement von Nukleotiden 817–835 von SEQ ID Nr. 1 in umgekehrter Richtung.
  • Keines der vermeintlich Positiven von Immunoblots oder Oligonukleotid-Hybridisierung ergab das vorhergesehene 420 bp Band, wenn es mit diesen beiden nucA Primern amplifiziert wurde.
  • Erzeugung und Markierung der nucA 420 bp Sonde
  • Die gleichen sequenzierenden Primer, 4101ext (SEQ ID Nr. 5) und 4102ext (SEQ ID Nr. 6) wurden verwendet, um eine 420 bp Sonde zu erzeugen (siehe 4 oben). Anfänglich wurden die Sonden aus pPX640 erzeugt. Später wurden alle markierten Sonden aus P860295 Genom-DNA hergestellt. Verwendung von chromosomaler P860295 DNA verringerte den Hintergrund für das Screening von λ ZapTMII Klonen. Die 420 bp Sonde wurde unter Verwendung eines Gemisches aus nicht markierten Nukleotiden und variierenden Konzentrationen des markierten dig-dUTP Nukleotids in einer PCR-Umsetzung mit Taq DNA Polymerase (Boehringer Mannheim) dig-dUTP markiert. Chromosomale P860295 DNA wurde als Matrize verwendet, was einen verringerten λ ZapTMII Hintergrund vorsah. PCR-Amplifizierung wurde für 30 Zyklen durchgeführt, jeder betrieben bei 95°C für 30–45 Sekunden (Denaturierungsschritt), 42–52°C für 40–50 Sekunden (Verglühungsschritt) und 72°C für 55–60 Sekunden (Extensionsschritt). Ein Heißstart wurde an der Genom-DNA bei 95–98°C für 2–5 Minuten durchgeführt. Diese PCR-Sonden wurden in LiCl-Ethanol ausgefällt und in 0,1% SDS in der Hälfte bis dem Gleichen des ursprünglichen Volumens resuspendiert, bei 37°C für 10 Minuten für bessere Resuspension erhitzt und bei –20°C gelagert. Eine 1 : 500–1 : 1000 Verdünnung der 420 hp Sonde wurde bei der Hybridisierung verwendet. Eine Schätzung der Konzentration wurde durch Klecksen von 1 μl von jeder Verdünnung, 10–2 bis 10–6 auf einen Streifen Hybond-N Membran zusammen mit bekannten Mengen an markiertem Standard und Abgleichen der Intensitäten nach Entwicklung durchgeführt.
  • Plaque-Hybridisierung mit 420 bp Sonde
  • Plaque-Hybridisierungen wurden auch unter Verwendung einer dig-dUTP markierten 420 bp Sonde von pPX640 Plasmid DNA (siehe oben) gemäß den Empfehlungen des Herstellers (Hybond-N Membran von Amersham, dig-dUTP für Sondenmarkierung von Boehringer Mannheim) unter Verwendung des Standardprotokolls (3) durchgeführt. Jedoch erzeugte diese Sonde hohen Hintergrund, wenn sie mit Vektor allein (λ ZapTMII) Plaques getestet wurde. Potentiell positive Plaques der λ ZapTMII Bücherei wurden identifiziert und analysiert, aber ergaben nicht die Bänder mit korrekter Größe in einem Southern Hybridisierungsversuch.
  • Mehr Büchereifilter und ein λ ZapTMII Kontrollfilter wurden mit einer dig-dUTP markierten 420 bp Sonde sondiert, erzeugt aus P860295 chromosomaler DNA (sieht oben). Zwei vermeintlich Positive wurden identifiziert, zusammen mit mehreren fraglichen Positiven. Die Plaques wurden aufgenommen und für sekundäres Screening plattiert. Erneutes Sondieren zeigte ein paar schwache Plaques. Phagemide wurden induziert und Verdau wurde an den DNAs durchgeführt. Es wurde eine Southern Hybridisierung an dem Verdau durchgeführt und die beiden vermeintlich Positiven zeigten etwas Homologie zu der vermeintlichen nucA-Sequenz (von pPX643; siehe unten). Wenn sie PCR-Amplifizierung mit 4101ext (SEQ ID Nr. 5) und 4102ext (SEQ ID Nr. 6) Primern unterworfen wurden, zeigten die beiden Positiven keine Amplifizierung des erwarteten 420 bp Bands. Die Klone schienen eine begrenzte Homologie zu nucA zu haben und zeigten ein unterschiedliches Restriktionsmuster, wenn sie mit dem PCR-Klon pPX643 verglichen wurden.
  • 3'-Ende nucA-DNA
  • Um die DNA-Sequenz von sowohl den 5'-, als auch 3'-Enden des nucA-Gens zu erhalten (welche nicht in dem anfänglichen pPX640 Konstrukt vorhanden sind), wurde umgekehrte PCR-Methodik verwendet, wie schematisch in 5 gezeigt. Southern Analyse von NTHi Genom-DNA, verdaut mit EcoRI oder EcoRV und hybridisiert mit der nucA-spezifischen 420 bp DNA-Sonde ergab die folgenden Ergebnisse: Für EcoRI verdaute Genom-DNA wurden zwei Bänder bei annähernd 4,5 gb und 1,6 kb nachgewiesen; für EcoRV verdaute DNA wurde ein Band bei annähernd 7 kb nachgewiesen. Zehnfache Verdünnungen dieser mit EcoRI und EcoRV verdauten P860295 Genom-DNAs wurden dann unter Verwendung von T4 DNA Ligase (NEB) selbst-ligiert. Diese DNAs wurden unter Verwendung von umgekehrter PCR-Methodik mit Taq DNA Polymerase amplifiziert. Amplifikationszyklen waren wie folgt: 95°C für 50 Sekunden, 52°C für 90 Sekunden, 72°C für 4 Minuten, 30 Zyklen, und dann 72°C für 10 Minuten. Eine Aliquote der Umsetzung wurde in einen Agarosegel elektrophoretisch behandelt. Bei der EcoRI ligierten DNA wurden Primer 4121fwd (SEQ ID Nr. 17) GCTTTCAGCTAATGTGATTCC und 4122ext (SEQ ID Nr. 18) CATCACAGCTGCATCTGCAG für die obere nucA DNA Amplifizierungsumsetzung verwendet und Primer 4313ext (SEQ ID Nr. 7) und 4102ext (SEQ ID Nr. 6) wurden für die untere nucA DNA Amplifizierungsumsetzung verwendet. Der Primer 4121fwd entspricht Nukleotiden 669–689 von SEQ ID Nr. 1. Der Primer 4122ext ent spricht dem Komplement von Nukleotiden 551–570 von SEQ ID Nr. 1 in umgekehrter Richtung. Primer 4122ext und 4313ext wurden mit der EcoRV ligierten DNA für sowohl die obere, als auch untere nucA-DNA Amplifizierung verwendet. Ein annähernd 1,3 kb Fragment wurde für die nucA EcoRI obere Region beobachtet. Ein schwaches annähernd 2 kb Fragment wurde für die EcoRV verdaute DNA beobachtet. Kein DNA-PCR-Produkt wurde für die nucA-EcoRI obere Region beobachtet. Weitere Versuche, das 5'-Ende des nucA-Gens von einer von beiden Genom-DNAs oder von der NTHi λ ZapTMII Bücherei DNA zu amplifizieren, versagten darin, entweder ein DNA-Produkt oder eine DNA-Sequenz herzustellen, das durch andere Mittel erhaltener nucA-Sequenz entsprach. Das annähernd 1,3 kb PCR untere Produkt wurde direkt sequenziert, als auch in pCRTMII Vektor kloniert, und das Plasmid wurde pPX800 genannt. Von den DNA-Sequenzdaten wurden die vollständige 3'-Endsequenz, der TAA-Stop-Codon und zusätzlich untere nicht-kodierende Sequenz des nucA-Gens erhalten.
  • Klonieren von genomisch "reifer" nucA
  • Um die vollständige Sequenz des reifen nucA-Gens zu bestätigen und zu erhalten, wurde eine PCR-Umsetzung unter Verwendung des P1 Degenerats (SEQ ID Nr. 3) und 63K Revers (Rev) (SEQ ID Nr. 9) Primer an nicht-verdauter P860295 Genom-DNA durchgeführt. Der 63K Rev Primer hat die folgende Sequenz, welche das Komplement von Nukleotiden 2095–2114 von SEQ ID Nr. 1 in der umgekehrten Richtung ist:
    63K Rev GAAGTCTTCAAACCTAGGAC (SEQ ID Nr. 9).
  • Etwa 1 μg von P860295 Genom-DNA wurden in einer PCR-Umsetzung, bestehend aus der Taq DNA Polymerase und diesen beiden Primern verwendet. Eine Aliquote der Umsetzung wurde in einem Agarosegel elektrophoretisch behandelt. Das DNA-Fragment der erwarteten Größe von annähernd 1,8 kb wurde beobachtet. Dieses DNA-Fragment wurde durch Gel gereinigt und in pCRTMII kloniert und das Plasmid wurde pPX643 genannt. Die DNA-Sequenz von nucA in pPX643 wurde bestimmt und entsprach der Sequenz von früheren partiellen Datensätzen. Dieser Klon enthält die vollständige reife nucA-Sequenz, aber ihm fehlt die obere Promotorregion und Signalsequenz.
  • 5' Obere Sequenz von nucA unter Verwendung von PCR
  • Mehrere Versuche wurden unternommen, um die Promotorregion von DNA zu amplifizieren, hergestellt aus der P860295 λ Bücherei unter Verwendung der T3 und T7 Primer, gekoppelt an mehrere unterschiedliche nucA Primer, die während des Sequenzierens von P1/P7 und P2/T3 Klonen synthetisiert worden waren. Keine dieser Umsetzungen erzeugte das benötigte Fragment. Versuche, diese Region durch inverse PCR aus dem EcoRI 4,3 kb Fragment zu amplifizieren, waren ebenfalls nicht erfolgreich (siehe oben). Weitere Restriktionsfragmente, vorzugsweise kleiner als das 4,3 kb Fragment, wurden daher für inverse PCR erwogen. Southerns wurden an P860295 Genom-DNA durchgeführt, unter Verwendung der dig-dUTP markierten 420 bp chromosomalen Sonde und Restriktionsenzymen PstI, SalI, EcoRV, BamHI, ApaI, AvaI, KpnI, SacI, SmaI, XbaI, XhoI und At-reichen Enzymen BglII, HindIII, NsiI, SnaBI, SspI und PacI. Aus diesen Hybridisierungen wurde eine begrenzte Genom-Restriktionskarte erhalten (siehe 4).
  • Der NsiI-Verdau ergab ein annähernd 3 kb Band, das zur nucA 420 bp Sonde hybridisierte; dieses ist eines der kleineren identifizierten Stücke. Daher wurde dieses 3 kb Fragment aus dem Genom-Verdau Gel-isoliert, selbst-ligiert und für umgekehrte PCR aufgestellt. Ein annähernd 2 kb Fragment wurde bei der Amplifizierung des selbst-ligierten NsiI-Fragments mit den 4102ext (SEQ ID Nr. 6) und 4313ext (SEQ ID Nr. 7) Primern erhalten. Der Primer 4313ext (SEQ ID Nr. 7) hat die folgende Sequenz, welche Nukleotiden 1762–1779 von SEQ ID Nr. 1 entspricht:
    4313ext GTGAGTGTTGAAGTCTTG (SEQ ID Nr. 7).
  • Das Fragment wurde sequenziert und in den pCRTMII Vektor kloniert. Elf von zwölf Kolonien hatten Inserts; zehn waren in einer Ausrichtung (und wurden pPX679 genannt) und eine war in der entgegengesetzten Ausrichtung (und wurde pPX680 genannt). DNA-Sequenzierung des Inserts innerhalb von pPX680 erzeugte etwa 1020 Basen von zusätzlicher Sequenz oberhalb des reifen nucA-Gens. Somit enthält der Klon die Promotorregion und Signalsequenz des nucA-Gens. Die Sequenz in der überlappenden Region entsprach der Sequenz von vorherigen Klonen (pPX640, dem P2/T3 Klon und pPX643, oben beschrieben), was den Klon als nucA bestä tigte. Siehe auch SEQ ID Nr. 1.
  • Cosmid-Bücherei Konstruktion
  • Eine Cosmid-Bücherei wurde ebenfalls wie folgt konstruiert: Genom-DNA von P810384 und P860295 wurde partiell mit Sau3AI verdaut, um 30–50 kb Fragmente zu erzeugen, welche in die BamHI-Stelle von SuperCosI-Vektor ligiert wurden, ein Plasmid, welches aus λ DNA konstruiert wurde und zwei Integrationsstellen enthielt (Stratagene). Der verwendete Wirtsstamm war NM554 (Stratagene). Kolonien wurden mit einem Anti-NucA monoklonalen Antikörper (Mab Nt63/2-13-42), polyklonalen Antikörper und dig-markierten DNA Sonden gescreent.
  • Immunoblot-Screening von Cosmid-Bücherei
  • Mab Nt63/2-13-42 reagierte nicht gut auf den P810384 Stamm an Kolonie-Blots. Daher wurden das Screening an der P810384 Bücherei gestoppt. Mehrere vermeintliche Positive wurden aus der P860295 Bücherei identifiziert. Die vermeintlich Positiven wurden ausgestrichen und wieder gescreent, aber sie waren von mittlerer Intensität. Ein Western wurde an diesen Positiven (über Nacht Kulturen) laufen gelassen und mit Mab Nt63-34-25 sondiert, was stark auf denaturierte NucA reagiert. Jedoch wurden keine NucA-Bänder an den Western gesehen. Daher wurde wie bei der λ ZapTMII Bücherei Immunoblot-Screening der Cosmid-Bücherei unterbrochen.
  • Kolonie-Hybridisierung an der Cosmid-Bücherei
  • Ähnlich wurde die P860295 Cosmid-Bücherei unter Verwendung der 420 bp dig-markierten Sonde gescreent. Dieser Screen erzeugte 26 vermeintlich Positive, welche aus den fünf Büchereifiltern identifiziert wurden. Sie wurden wieder gescreent und nur vier waren positiv von welchen zwei stark positiv waren. Vier isolierte Kolonien wurden aus einer der stark Positiven aufgenommen und DNA-Preps wurden für Southern Analyse bereitet. DNA von zwei Kolonien ergab ähnliche Hybridisierungs-Restriktionsmuster bei EcoRI, HindIII und ScaI&EspI Verdaus, während die anderen beiden Kolonien DNAs in unterschiedlicher Größe ergaben, eine mit einer größeren Gesamtinsertgröße und einer kleineren. Wenn der Filter bei 70°C gewaschen wurde, ergaben die beiden ähnlichen Kolonien nur Hintergrundbindung. Die anderen beiden Klone zeigten positive Hybridisierung bei 70°C und wurden durch PCR weiter analysiert. Nur einer, der größere Klon, enthielt das meiste des 5'- Endes des nucA-Gens. Bei Sequenzierung dieses Cosmid-Klons wurde vom nucA-Insert befunden, dass es bei einer Sau3AI-Stelle anfängt, 55 Basen rein vom Beginn der reifen Sequenz, und nach unten fortlaufend von der Stelle; daher fehlte ihm die Signalsequenz und zusätzliche 55 Basen von dem 5'-Ende des reifen Gens.
  • PCR an Cosmid-Bücherei
  • Ähnlich wurde die gepackte Phage von der Cosmid-Bücherei unter Verwendung von 63 K P1 Rev (SEQ ID Nr. 19) CTTAATTCCACAGCTTTGTGAGC amplifiziert (wo die 18. Base auch A und die 21. Base auch T sein kann) und T3 (SEQ ID Nr. 7) oder T7 (SEQ ID Nr. 8) Primer, um die obere Sequenz herauszuziehen. Der Primer P1 Rev entspicht dem Komplement von Nukleotiden 319–341 von SEQ ID Nr. 1 in der umgekehrten Richtung. Umsetzungen wurden ebenfalls mit dem 4122ext (SEQ ID Nr. 18) Primer und den T3 oder T7 Primern durchgeführt. Bei 42°C wurden drei verschmierte Bänder bei annähernd 250, 400 und 550 bp gesehen, bei den nucA P1 Rev/T3 oder T7 Paaren, welche alle zur 420 bp Sonde hybridisierten. Kein Band wurde mit dem 4122ext/T3 Primer-Paar erhalten. Ähnliche verschmierte Bänder wurden bei den 4122ext/T7 Primern gesehen. Bei 50°C wurde nur das 250 bp Band in allen vier Umsetzungen erhalten. T3 oder T7 allein ergaben kein Band und das T3/T7 Primer-Paar ergab sehr verschmierte, annähernd 550 und 300 bp Bänder. Die drei verschmierten PCT-Produkte aus den nucA P1 Rev/T7 und 4122ext/T7 PCR-Umsetzungen wurden durch eine QIAquickTM Säule (Qiagen, Chatsworth, CA) gereinigt, eluiert mit 50 μl Wasser, und 2 μl davon wurden in den pCRTMII Vektor kloniert. Vier der sechs Klone hatten Inserts, wobei drei unterschiedliche Inserts für das nucA P1 Rev/T7 PCR-Produkt erhalten wurden. Jedoch wurde nur das annähernd 350 bp Insert mit dem 4122ext/T7 PCR-Produkt erhalten (sieben von acht hatten das Insert). Die Sequenz für den 4122ext/T7 Klon entspricht der nucA-Sequenz, beginnend bei der Sau3AI-Stelle, 55 Basen hierin von dem 5'-Ende der reifen Sequenz, welche dem oben beschriebenen Cosmid-Klon ähnlich war.
  • Zusammensetzung der vollständigen nucA-Sequenz
  • Die vollständige nucA-Sequenz wurde aus den überlappenden Klonen zusammengesetzt, welche 5' obere Sequenz, 3' untere Sequenz und die oben beschriebene partielle reife Sequenz enthielten. Die vollständige nucA Gensequenz wird in SEQ ID Nr. 1, Nukleotide 229–2037 dargestellt. Das Signalpeptid wird durch Nukleotide 229–303 kodiert. Das reife NucA-Protein wird durch Nukleotide 304–2037 kodiert.
  • Beispiel 3
  • Expression von NucA-Protein
  • Das nucA-Gen wurde dann in E. coli entweder als Fusionsprotein oder als NucA-Protein in voller Länge (mit einem Signalpeptid) kloniert und exprimiert. Das nucA-Gen wurde in verschiedene E. coli Expressionsvektoren ligiert, wie in Tabelle 1 aufgeführt, und die Kulturen wurden für Expression des NucA-Proteins angemessen induziert. Ganzzellen-Lysate wurden normalisiert und an einem SDS-PAGE Gel laufen gelassen und entweder mit Coomassie gefärbt oder auf eine Nitrocellulosemembran übertragen und mit Kaninchen Anti-NucA polyklonalen Antikörpern bei einer 1 : 500 Verdünnung in 5% BLOTTO sondiert. Die Klone werden in Tabelle 1 aufgelistet und wurden wie unten beschrieben konstruiert.
  • Ein Fusionsprotein, welches das NucA-Protein plus heterologe Reste enthält, wurde durch Klonieren des nucA-Gens aus Plasmid pPX643 in den pRSET-Expressionsvektor exprimiert (siehe Figur 6). Plasmid pPX643 enthält die vollständige reife nucA-Sequenz, kloniert in pCRTMII Vektor, wie in Beispiel 2 beschrieben. Die gewählte Version von pRSET war die mit dem Leserahmen mit der Bezeichnung „C" durch den Hersteller. Der Vektor enthält den Gen 10 T7 Promotor, das Ampicillin-Resistenzgen und hat den ColE1 DNA Replikationsursprung.
  • pPX644 Konstruktion
  • Plasmide pPX643 und pRSETC wurden mit Asp718 Restriktionsenzym verdaut, durch GENECLEAN-Verfahren gereinigt, wieder mit XhoI-Enzym verdaut, und die DNAs an einem Agarosegel elekrophoretisch behandelt. Das annähernd 1,9 kb nucA-enthaltende DNA-Fragment wurde isoliert und an die pRSETC isolierte DNA ligiert. Der sich ergebende Klon wurde pPX644 genannt. BL21(DE3)pLysS-Transformanten wurden RZ1034 genannt.
  • Der rekombinante Klon, pPX644, enthält 51 zusätzliche Aminosäuren, kondensiert an die N-terminale Region des reifen nucA-Proteins. Diese zusätzlichen Aminosäuren werden durch den Vektor vorgesehen und schließen sechs Histidine in Folge direkt unterhalb des anfänglichen Methionins ein, welche bei der Reinigung des Fusionsproteins helfen. Ganzzellen-Extrakte von induzierten Kulturen, welche dieses Plasmid enthielten, wurden an einem SDS-PAGE und einem Western-Blot elektrophoretisch behandelt, durchgeführt unter Verwendung von Kaninchen polyklonalen Antiseren gegen das NucA-Protein. Über Nacht Kulturen von RZ1034 Isolaten und BL21(DE3)pLysS/pRSETC wurden in 10 ml modifizierte SOB inokuliert (20 g Trypton, 5 g Hefe, 0,6 g NaCl, 0,2 g KCl, angepasst an pH 7,0 mit 5 N NaOH) plus Ampicillin (100 μg/ml) in einem 125 ml Kolben und wachsen gelassen bei 37°C zu einer Klett Colorimeter-Ablesung von 126–155. Ein ml Aliquote von nicht induzierten Zellen wurde entfernt, zentrifugiert und mit TE Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) zu dem gleichen Volumen in Mikrolitern (μl) wie die Klett-Ablesung resuspendiert, also eine Klett-Ablesung von 126 mittleren Zellen wurden unter Verwendung von 126 μl TE-Puffer resuspendiert. Zur Induktion wurde IPTG zu der wachsenden Kultur zu einer Endkonzentration von 1 mM zugegeben und die Inkubation setzte sich für zwei Stunden fort, mit einer End-Klett-Ablesung bestimmt. Ein Milliliter wurde entfernt und in einem 1,5 ml Eppendorf-Rohr zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in TE-Puffer resuspendiert, wieder basiert auf seiner jeweiligen End-Klett-Ablesung. Neunzig μl von jeweils nicht-induzierten und induzierten Zellen wurden auf ein anderes Eppendorf-Rohr entfernt, 30 μl eines 4 × Cracking-Puffers wurden zugegeben und das Rohr in einem siedenden Wasserbad für 10 Minuten vor Laufenlassen von 20 μl an einem 4–15% Gradienten SDS-PAGE Gel (Bio-Rad Laboratories) erhitzt. Die Proteinbänder wurden auf Nitrozellulose-Filterpapier übertragen und ein Western-Blot wurde unter Verwendung von polyklonalen NucA-Antiseren von Kaninchen und Anti-Kaninchen Ig-Peroxidase (Tago Inc.) durchgeführt. Die Bänder wurden unter Verwendung von TMB-Reagens (Promega, Madison, WI) visualisiert. Ein vorhergesehenes 69 kD großes Proteinprodukt wurde in dem Blot deutlich nachgewiesen, wie in 7 gezeigt. Dies bestätigte die korrekte Klonierung des nucA-Gens. In diesem Beispiel war der Mangel an beobachteter Induzierbarkeit von NucA vermutlich Folge der Abwesenheit des Antibiotikums Chloramphenicol im Wachstumsmedium, welches für den stabilen Erhalt des pLysS-Plasmids (welches das Chloramphenicol-Resistenzgen trägt) erforderlich ist. Somit würde Verlust des pLysS-Plasmids einen hohen basalen (nicht-induzierten) Expressi onsgrad von NucA ergeben. In einem getrennten Versuch wurde vom 69 kD NucA-Protein gezeigt, dass es in einem Western-Blot induzierbar ist, wenn Chloramphenicol in das Wachstumsmedium eingeschlossen wurde (Daten werden nicht gezeigt). Obwohl das 69 kD Proteinband in einem Western-Blot nachgewiesen werden kann, wurde es nicht in einem ähnlichen SDS-PAGE Gel, gefärbt mit Coomassie nachgewiesen (Daten werden nicht gezeigt). Ohne durch das Folgende gebunden zu sein, kann ein möglicher Grund für Nicht-Nachweis des rekombinanten Proteins im Coomassie-Gel Folge der 51 zusätzlichen, Vektor-kodierten Aminosäurereste am N-terminalen Ende des klonierten nucA-Gens in pPX644 sein.
  • Ein reifer Klon, der einen Expressionsgrad zeigte, der in einem Coomassie-Gel sichtbar war, wurde unter Verwendung einer etwas anderen Fusionsherangehensweise konstruiert. Dieser Klon mit der Bezeichnung pPX693 wurde wie folgt konstruiert:
  • pPX682 Konstruktion
  • Das nucA-Gen wurde aus P860295 Genom-DNA unter Verwendung von RSET-5 Primer (SEQ ID Nr. 15) PCR-amplifiziert, welcher die folgende Sequenz hat, deren letzte 17 Basen einigermaßen den Nukleotiden 304–320 von SEQ ID Nr. 1 entsprechen (der Primer basierte auf der pPX643-Sequenz, welche unter Verwendung des degenerierten-Primers P1 erzeugt wurde):
    RSET-5 GCTACGGCTAGCAAAGAAGCACCTCAAGC (SEQ ID Nr. 15)
    und dem 63K RBam-Primer (SEQ ID Nr. 13). (RSET-5 wurde entworfen, um eine BamHI-Stelle am 5'-Ende zum Erleichtern des Transfers des nucA-Fragments zum pRSET-Expressionsvektor einzuschließen; siehe unten). Das amplifizierte DNA-Fragment wurde in den pCRTMII Vektor kloniert und wurde als pPX682 bezeichnet. Dieses Konstrukt kodiert für NucA mit reifer Länge.
  • pPX693 Konstruktion
  • Das nucA BamHI Fragment von pPX682 wurde in die BamHI-Stelle des Expressionsvektors pRSETC ligiert und das sich ergebende Plasmid wurde pPX693 genannt. Dies ergab einen Klon, welcher ein Fusions-NucA mit zusätzlichen 38 Aminosäuren an seinem N-Terminus exprimierte. Nach Spaltung mit Enterokinase wurden alle bis auf fünf Aminosäuren entfernt. Der pRSETC-Vektor enthält ebenfalls eine polyHis-Region, welche die Reinigung des Fusionspro teins über einer Nickelsäule vor der Spaltung durch Enterokinase ermöglicht. Der Klon pPX693 zeigte, wenn er in den E. coli BL21 (DE3)pLysS Stamm tranformiert und mit IPTG induziert wurde, einen signifikanten Expressionsgrad, der an mit Coomassie gefärbten Gels nachweisbar war. 8 zeigt, dass er das Hauptproteinband im Zelllysat war. Jedoch war nach Ziehen einer größeren Kultur für Proteinreinigung die Expression durch Coomassie-Färbung nicht nachweisbar. Es wurde gefunden, dass das Plasmid im Expressionsstamm nicht stabil gehalten wurde. Nachfolgend wurden weitere Klone mit annehmbaren Expressionsgraden erhalten, so wurde weitere Arbeit, um pPX693 zu stabilisieren, nicht unternommen.
  • Native Signalsequenz
  • Nachdem die obere Sequenz vom Klon pPX680 erhalten wurde (ein annähernd 2 kb NsiI inverses PCR-Produkt, kloniert in pCRTMII Vektor, wie in Beispiel 2 erwähnt), wurden Primer NdeF63K und NcoF63K verwendet, um das native nucA-Gen von Genom P860295 DNA in voller Länge zu amplifizieren. Das PCR-Produkt wurde in zwei unterschiedliche Expressionsvektoren, pRSETC und pTrcHisC kloniert (9). Diese Vektoren sind für die Expression unter Verwendung von starken Promotoren maximiert worden, die durch IPTG induzierbar sind. Plasmide pPX685, pPX688, pPX691 und pPX692, auf die in Tabelle 1 verwiesen wird, wurden wie folgt konstruiert:
  • pPX685 Konstruktion
  • Das nucA-Gen in voller Länge wurde durch PCR-Amplifizierung aus dem Genom von P860295 kloniert. Die verwendeten Primer waren NdeF63K und 63K RBam. Primer NdeF63K ist SEQ ID Nr. 1, Nukleotide 229–255 mit einer NdeI-Stelle, gebunden an das 5'-Ende für späteren Transfer in pRSETC. Das PCR-Produkt, kloniert in pCRTMII Vektor, wird pPX685 genannt.
  • pPX692 Konstruktion
  • Subklonieren der vollständigen nucA-Sequenz von pPX685 in pRSETC erzeugte pPX692. Speziell wurde pPX685 mit NdeI und BamHI verdaut, das nucA-Fragment in voller Länge wurde isoliert und in pRSETC ligiert, welches ebenfalls mit NdeI und BamHI verdaut worden war. Das sich ergebende Plasmid wurde pPX692 genannt. Wenn pPX692 in den E. coli BL21(DE3)pLysS Stamm transformiert und mit 1 mM IPTG induziert worden war, wurde ein ähnlicher Coo massie-Grad an NucA-Protein erhalten (siehe 10), wie verglichen mit pPX693 (siehe 8).
  • pPX688 Konstruktion
  • Das nucA-Gen in voller Länge wurde unter Verwendung von PCR und Primern NcoF63K und 63K RBam aus Genom P860295 DNA kloniert. Primer NcoF63K ist SEQ ID Nr. 1, Nukleotide 229–255 mit einer NcoI-Stelle und ein paar extra Basen zur translationalen Rahmenanpassung, gebunden an das 5'-Ende, insbesondere Basen ACCATGGGT für nachfolgende Subklonierung in pTrcHisC. Das PCR-Produkt wurde in den pCRTMII Vektor kloniert und das sich ergebende Plasmid wurde pPX688 genannt. Der NcoI-Linker fügte zwei Aminosäuren der N-terminalen Startregion der Signalsequenz hinzu.
  • pPX691 Konstruktion
  • Subklonieren der vollständigen nucA-Sequenz aus pPX688 in pTrcHisC (siehe 9) erzeugte pPX691. Speziell wurde pPX688 mit NcoI und BamHI verdaut, das nucA-Fragment in voller Länge wurde isoliert und dann in pTrcHisC ligiert, welches ebenfalls mit NcoI und BamHI verdaut worden war. Wenn pPX691 in den E. coli InvαF' Stamm transformiert und mit 1 mM IPTG induziert wurde, wurde ein ähnlicher Coomassie-Grad an NucA-Protein erhalten (siehe 10), wie verglichen mit pPX693 (siehe 8). Die NcoI-Restriktionsstelle fügte zwei Reste zum Anfang der nativen Signalsequenz hinzu, welche die Verarbeitung der NucA-Signalsequenz nicht zu beeinflussen schienen, wie in 10 gezeigt. Das ersichtliche Molekulargewicht des exprimierten Proteins schien etwa 63 kD für ein verarbeitetes Protein zu sein, statt 66 kD für ein nicht verarbeitetes Protein. Das Band bei etwa 63 kD schien das Hauptproteinband im Coomassie-gefärbten Gel zu sein. Nach Reinigung und Aminosäuresequenzanalyse wurde davon gezeigt, dass es verarbeitet war. Siehe Beispiel 4 bezüglich Proteinsequenzierung.
  • Das Plasmid pPX691 wurde in einer 2 l Kultur zur Reinigung zusammen mit pPX693 (Fusionsprotein) gezogen. Jedoch wurde befunden, dass pPX693 im BL21(DE3)pLysS-Wirt nicht stabil gehalten wurde, während pPX691 in DH5α oder InvαF' Wirten stabil gehalten wurde. Plasmid pPX691 wurde als der Klon der Wahl für Proteinreinigung von rNucA gewählt. Eine Stabilitätsstudie für pPX692 wurde nicht durchgeführt, da seine Expression nicht besser als pPX691 war. Siehe 10.
  • Figure 00340001
  • Obwohl die Haemophilus-kodierte nucA-Signalsequenz gute Expression von rNucA in E. coli zu ermöglichen schien, als auch korrekte Verarbeitung (also Entfernung der Signalsequenz), wurden zwei im Handel erhältliche E. coli Expressionsvektoren versucht, welche unterschiedliche Signalsequenzen enthielten. PelB (pPX708 [hergestellt aus pPX705] in pET20b Vektor, Novagen) und OmpT (pPX707 [hergestellt aus pPX706] in pET12a Vektor, Novagen) wurden getrennt oberhalb des reifen nucA-Gens wie folgt kloniert:
  • PelB-Konstruktion
  • Das nucA-Gen wurde aus pPX643 unter Verwendung von Primern 63K PelB (SEQ ID Nr. 12) PCR-amplifiziert, welcher die folgende Sequenz hat, deren letzte 17 Basen einigermaßen Nukleotiden 304–320 von SEQ ID Nr. 1 entsprechen (der Primer basierte auf der pPX643 Sequenz, welche unter Verwendung des degenerierten Primers P1 erzeugt wurde):
    63K PelB GATATCAAAGAAGCTCCTCAAGC (SEQ ID Nr. 12)
    und 63K RBam (SEQ ID Nr. 13), welches die folgende Sequenz hat, deren letzte 21 Basen das Komplement von Nukleotiden 2095–2115 von SEQ ID Nr. 1 in umgekehrter Richtung sind:
    63K RBam CGCGGATCCTGAAGTCTTCAAACCTAGGAC (SEQ ID Nr. 13)
  • Das annähernd 1,8 kb nucA-enthaltende PCR-DNA Band wurde in Gel isoliert, in pCRTMII kloniert und das sich ergebende Plasmid wurde pPX705 genannt.
  • pPX708 Konstruktion
  • Beide Plasmide pPX705 und pET20b wurden mit EcoRV und BamHI verdaut, DNAs wurden an einem Agarosegel elektrophoretisch behandelt und die korrekten DNA-Bänder wurden isoliert. Die DNAs wurden zusammen ligiert und das sich ergebende Plasmid wurde pPX708 genannt. BL21(DE3)pLysS Transformanten wurden RZ1070 genannt.
  • OmpT Kontruktion
  • Das nucA-Gen wurde aus pPX643 unter Verwendung des Primers 63K OmpT (SEQ ID Nr. 14) amplifiziert, welcher die folgende Sequenz hat, deren letzte 17 Basen einigermaßen Nukleotiden 304– 320 von SEQ ID Nr. 1 entsprechen (der Primer basierte auf der pPX643 Sequenz, welche unter Verwendung des Degenerat-Primers P1 erzeugt wurde):
    63K OmpT GGATCCAAAGAAGCTCCTCAAGC (SEQ ID Nr. 14)
    und 63K RBam (SEQ ID Nr. 13). Das annähernd 1,8 kb nucA-enthaltende PCR DNA Band wurde in Gel isoliert, in pCRTMII kloniert und das sich ergebende Plasmid wurde pPX706 genannt.
  • pPX707 Konstruktion
  • pET12a Vektor DNA wurde mit BamHI Enzym verdaut, mit Kalbdarm Alkali-Phosphatase (Boehringer Mannheim) behandelt, an Agarosegel elektrophoretisch behandelt und die DNA wurde isoliert. Das Plasmid pPX706 wurde mit BamHI-Enzym verdaut, an einem Agarosegel elektrophoretisch behandelt und das annähernd 1,8 kb nucA-enthaltende DNA-Fragment wurde in Gel isoliert. Sowohl die pET12a, als auch pPX706 Gel-isolierten DNAs wurden zusammen ligiert und das sich ergebende Plasmid wurde pPX707 genannt. BL21 (DE3)pLysS Transformanten wurden RZ1065 genannt.
  • PelB-NucA & OmpT-NucA Expression
  • Ein ml von über Nacht Kulturen von RZ1065 (pPX707: OmpT-nucA Klon) und RZ1070 (pPX708: PelB-nucA Klon) wurden jeweils in 20 ml SOB plus Chloramphenicol (30 μg/ml) plus Ampicillin (100 μg/ ml) in einem 125 ml Kolben inokuliert und bei 37°C zu O. D.600 = 1,0–1,3 wachsen gelassen. Zehn ml der Kultur wurden auf einen anderen 125 ml Kolben übertragen und IPTG zu einer Endkonzentration von 1 mM zugegeben. Sowohl nicht induzierte, als auch induzierte Kulturen wurden bei 37°C für zusätzliche zwei Stunden wachsen gelassen. Ein ml von jeder der Kulturen wurde entfernt und in einem 1,5 ml Eppendorf-Rohr zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren. Die Flüssigkeitsüberstände von den induzierten Kulturen wurden bewahrt. Die Zellpellets wurden mit 0,6–1,6 ml PBS zu O. D.600 von annähernd 1,0 resuspendiert. Ein ml der resuspendierten Zellen wurde rezentrifugiert und mit 60 μl H2O resuspendiert. Zu 60 μl der resuspendierten Zellen oder 60 μl des Flüssigkeitsüberstands wurden 20 μl eines 4 × Cracking-Puffers zugegeben und das Rohr wurde in einem siedenden Wasserbad für fünf Minuten erhitzt. Zwanzig μl von jeder Probe wurden an einem 12% SDS-PAGE Gel elektrophoretisch behandelt und mit Coomassie- Blau gefärbt. Sowohl die OmpT, als auch PelB NucA-Fusionsprotein wurden nachgewiesen und waren von der richtigen Größe für ein verarbeitetes Protein (11). Die Ausbeute der PelB NucA-Fusionsprotein Expression betrug annähernd 30% des gesamten zellulären Proteins, was mit der Expression von NucA in voller Länge (mit nativem Signal, pPX691; siehe 12 unten) vergleichbar war.
  • 12 zeigt einen Vergleich von Expression von mehreren Signalsequenz-Klonen und auch von einem reifen Fusionsklon mit einer optimierten Translations-Initiationsregion (TIR) Sequenz (11), pPX709. Der Klon pPX709 wurde aus Klon pPX677 wie folgt konstruiert:
  • pPX677 Konstruktion
  • Plasmid pRSETC wurde mit NheI-Enzym verdaut, mit Phenol extrahiert, mit Ethanol ausgefällt und wieder mit NdeI-Enzym verdaut. Die DNA wurde an einem Agarosegel elektrophoretisch behandelt und das DNA-Band in Gel isoliert. Ein NheI + NdeI Linker wurde durch Verglühen des RSET.TIR oberen Oligo konstruiert (SEQ ID Nr. 10), welcher die folgende Sequenz hat (welche nicht nucA entspricht):
    RSET.TIR oben TATGGCTATGTCTAACATGACTTACAAACATCATCATCATCATCATGG-TATGG (SEQ ID Nr. 10)
    zum RSET.TIR unteren Oligo (SEQ ID Nr. 11), welches die folgende Sequenz hat (welche nicht nucA entspricht):
    RSET.TIR unten CTAGCCATRCCATGATGATGATGATGATGTTTGTAAGTCATGTTAGACA-TAGCCA (SEQ ID Nr. 11)
  • Dieser Linker wurde an die NheI + NdeI verdaute pRSETC gereinigte DNA ligiert und das sich ergebende Plasmid wurde pPX677 genannt.
  • pPX709 Konstruktion
  • Plasmid pPX677 wurde mit BamHI verdaut, mit Kalbdarm Alkali-Phosphatase (Boehringer Mannheim) behandelt, an einen Agarosegel elektrophoretisch behandelt und die DNA wurde isoliert. Plasmid pPX693 wurde mit BamHI verdaut, an einem Agarosegel elektrophoretisch behandelt und die DNA wurde isoliert. Die isolierten DNAs wurden zusammen ligiert und das sich ergebende Plasmid wurde pPX709 genannt.
  • BL21(DE3)pLysS-Transformanten wurden RZ1076 genannt.
  • Der pPX691 (native Signalsequenz) Klon und Vektor-allein Kontrolle wurden bei O.D.600 von 0,8–0,9 mit 1 mM IPTG für eine Stunde induziert. Die pPX707 (OmpT Signal), pPX708 (PelB Signal) und pPX709 (TIR) Klone wurden bei einem O. D. von etwa 1,0 für zwei Stunden induziert. Alle Kulturen wurden zu einem O. D. von etwa 1,0 normalisiert und gleiche Volumina wurden auf das Gel geladen. P860295 wurde für etwa 3,5 Stunden zu einem O. D. von etwa 1,6 wachsen gelassen, dann zu etwa 1,0 normalisiert. Induziertes pPX691 und induziertes pPX708 zeigten definitiv ein intensives NucA-Band; tatsächlich schien es das Hauptproteinband zu sein. Jedoch erzeugten pPX707 und pPX709 kein offensichtliches NucA-induziertes Band. Diese zeigt, dass nicht alle Signalsequenzen oder „optimierten" Expressionsvektoren einen hohen Grad an induziertem NucA-Protein erzeugen.
  • Beispiel 4
  • NucA-Protein Reinigung und Kennzeichnung
  • Reinigung von nNucA-Protein von NTHi Ganzzellen Extraktpräparat
  • Ganze bakterielle Zellen (etwa 70 g Nassgewicht von NTHi) wurden in 200 ml von 0,1 M Kaliumphosphat (KPO4)/3,0 M KSCN (pH 6,0) suspendiert und bei Raumtemperatur für 60 Minuten gerührt, um nNucA-Protein zu extrahieren. Zelldebris wurde durch Zentrifugation bei 8000 U/Min. unter Verwendung eines Sorvall GS-3 Rotors für 20 Minuten bei 4°C entfernt. Der Flüssigkeitsüberstand wurde gesammelt und durch Zentrifugation bei 60000 U/Min. unter Verwendung eines Beckman 70Ti Rotors für 60 Minuten bei 4°C weiter geklärt. Der Flüssigkeitsüberstand wurde gesammelt und über Nacht bei 4°C gegen 50 mM NaPO4 (pH 8,0) dialysiert.
  • Säulenchromatographie
  • Das dialysierte Ganzzellenextrakt wurde auf eine 25 ml Keramik Hydroxyapatit (HA) Säule (80 um Bio-Rad) geladen, äquilibriert in 50 mM NaPO4 (pH 8,0). Gebundenes Protein wurde mit einem 0,2 M NaPO4 Schritt eluiert, gefolgt von einem linearen NaPO4 Gradienten (0,2–0,5 M NaPO4). Fraktionen wurden bezüglich nNucA durch SDS-PAGE und Western Analyse gescreent und positive Fraktionen wurden gepoolt. Der HA-Schritt wurde drei Mal mit drei unabhängigen Ganzzellenextrakt-Präparaten durchgeführt. Native NucA von jedem der drei HA Durchläufe wurde zusammen gepoolt und etwa 7-fach unter Verwendung einer Amicon-gerührten Zelle mit einer PM10 Membran konzentriert. Das HA-Konzentrat wurde über Nacht bei 4°C gegen 2 L Ladungen von 50 mM Tris-HCl/1 mM EDTA (pH 9,0) dialysiert. Das Material wurde auf eine MonoQ HR5/5 Säule (Pharmacia) geladen, äquilibriert in 50 mM Tris-HCl/1 mM EDTA (pH 9,0). Gebundenes Protein wurde mit einem linearen NaCl-Gradienten (0–1,0 M NaCl in 50 mM Tris-HCl/1 mM EDTA (pH 9,0)) eluiert. Fraktionen wurden bezüglich nNucA durch SDS-PAGE gescreent und gepoolt. Insgesamt 2,5 mg gereinigtes nNucA wurden aus etwa 70 g Nassgewicht von NTHi-Zellen isoliert. Natives NucA-Protein, gereinigt unter Verwendung dieses Protokolls, wies ein einzelnes Band an einem SDS-PAGE Gel auf, welches einer Molekülmasse von etwa 63000 Dalton entspricht.
  • NaCl-Extraktion von nNucA
  • Das folgende Extraktionsprotokoll für nNucA-Protein wurde als Alternative zu Extraktion durch KSCN verwendet. Bakterielle Zellen (etwa 37,5 g Nassgewicht von NTHi) wurden in 150 ml 50 mM NaPO4 (pH 7,0) suspendiert und durch drei Passagen durch eine French-Druckzelle bei 1000 psi zerrissen. Zelldebris und Membranen wurden durch Zentrifugation bei 55000 U/Min. unter Verwendung eines Beckman 70Ti Rotors für 20 Minuten bei 4°C pelletiert. Das Pellet wurde in 132 ml 10 mM HEPES/1,0 M NaCl (pH 7,5) resuspendiert und bei 4°C für 20 Minuten gerührt, um das nNucA-Protein zu extrahieren. Zelldebris und Membranen wurden durch Zentrifugation bei 60000 U/Min. unter Verwendung eines Beckman 70Ti Rotors für 60 Minuten bei 4°C entfernt. Der Flüssigkeitsüberstand wurde gesammelt und über Nacht bei 4°C gegen 50 mM NaPO4 (pH 8,0) dialysiert. Nachfolgende HA und MonoQ Chromatographieschritte wurden wie oben für das native NucA-Protein beschrieben durchgeführt. Ausbeuten an nNucA unter Verwendung von NaCl-Extraktion waren vergleichbar mit jenen, welche mit dem anderen, oben beschriebenen Verfahren erhalten wurden.
  • Reinigung von rNucA-Protein
  • Rohes Extraktpräparat
  • Ein Verfahren unter Nutzung von Zelllysis durch Passage durch eine French-Druckzelle und zwei Chromatographieschritten wurde für die Reinigung von rNucA-Protein entwickelt. Bakteriel le Zellen, welche rNucA exprimieren (etwa 30 g Nassgewicht von E. coli InvαF'/pPX691) wurden in 80 ml 50 mM Tris-HCl/1 mM EDTA (pH 8,0) suspendiert und durch drei Passagen durch eine French-Druckzelle bei 1000 psi zerrissen. Zelldebris und Membranen wurden durch Zentrifugation bei 55000 U/Min. unter Verwendung eines Beckman 70Ti Rotors für 20 Minuten bei 4°C entfernt. Der Flüssigkeitsüberstand wurde gesammelt und über Nacht bei 4°C gegen zwei 4 l Wechsel von 50 mM Tris-HCl/1 mM EDTA (pH 8,0) dialysiert.
  • Säulenchromatographie
  • Der dialysierte rohe Extrakt-Flüssigkeitsüberstand wurde auf eine 50 ml Trimethylaminoethyl (TMAE) FractogelTM Anion-Austausch-Säule (EM Separations Technology) geladen, äquilibriert in 50 mM Tris-HCl/1 mM EDTA (pH 8,0) bei Raumtemperatur. Die meisten der verunreinigenden Proteine banden an die Säule. Der Säulendurchfluss, welcher rNucA-Protein, als auch mehrere Verunreinigungsproteine enthielt, wurde gesammelt und über Nacht bei 4°C gegen 20 mM HEPES/1 mM EDTA (pH 7,0) dialysiert. Das Material wurde dann auf eine MonoS HR10/10 Kation-Austausch-Säule (Pharmacia) geladen, äquilibriert in 20 mM HEPES/1 mM EDTA (pH 7,0), welche das NucA-Protein bindet. Gebundenes Protein wurde mit einem linearen NaCl-Gradienten (0–1,0 M NaCl in 20 mM HEPES/1 mM EDTA (pH 7,0)) eluiert. Das meiste des rNucA eluierte bei etwa 0,4 M NaCl. Fraktionen wurden bezüglich rNucA durch SDS-PAGE gescreent und gepoolt. Insgesamt 80 mg gereinigtes rNucA wurden aus etwa 30 g Nassgewicht von Zellen isoliert. Das rNucA-Protein, welches unter Verwendung dieses Protokolls gereinigt wurde, wies ein einzelnes Band an einem SDS-PAGE Gel auf, welches einer Molekularmasse von etwa 63000 Dalton entspricht.
  • Aminosäuresequenzanalyse
  • Für Aminosäuresequenzanalyse des nativen Proteins wurden etwa 250 μl der Probe, welche 100 μg gereinigtes Protein enthielt, mit 90% Ethanol für 30 Minuten bei 0°C ausgefällt, gefolgt von Zentrifugation in einer Mikrozentrifuge. Das Pellet wurde in 20% Essigsäure resuspendiert und Amino-terminaler Aminosäuresequenzanalyse unterworfen. Für das rekombinante Protein wurden 80 μl der Probe, welche 80 μg rNucA enthielt, zu einer ProSpin-Kartusche (Applied Biosystems, Foster City, CA) zugegeben und zentrifugiert. Die Polyvinylidendifluorid (PVDF) Mem bran, welche die Probe enthielt, wurde entfernt und mit 20% Methanol gewaschen. Die Membran wurde Amino-terminaler Aminosäuresequenzanalyse unterworfen.
  • Amino-terminale Aminosäuresequenzanalyse wurde unter Verwendung eines Applied Biosystems Model 477A Protein/Peptid Sequenzers, ausgestattet mit einem On-line Modell 120A PTH Analyzer (Applied Biosystems) durchgeführt. Nach der Spaltung von jedem aufeinander folgenden Amino-Terminus wurde das gebildete Anilinothiazolinon-Derivat in das stabilere Phenylthiohydantion (PTH)-Derivat durch Behandlung mit 25% Trifluoressigsäure (TFA) bei 64°C für 20 Minuten umgewandelt. Die PTH-Derivate wurden abgetrennt und am PTH-Analysator durch Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung einer Brownlee PTH C-18 Säule (Partikelgröße 5 mm, 2,1 mm innerer Durchmesser × 22 cm Länge; Applied Biosystems) mit einem Zwei-Lösungsmittel Gradientsystem gemäß den Anweisungen des Herstellers identifiziert.
  • Für das native Protein wurden die ersten 26 Reste (SEQ ID Nr. 2, Reste 26–51) eindeutig identifiziert, mit Ausnahme eines zusätzlichen nicht-identifizierten Peaks bei Rest 1. Für das rekombinante Protein wurden 18 der ersten 19 Reste (SEQ ID Nr. 2, Reste 26–44) eindeutig identifiziert. Beide Reste 1 und 2 enthielten einen zusätzlichen nicht-identifizierten Peak und Rest 13 (SEQ ID Nr. 2, Rest 38) konnte nicht identifiziert werden. Gleichzeitigkeit der Amino-terminalen Sequenz des rekombinanten NucA-Proteins mit der des nativen Proteins zeigte identische post-translationale Verarbeitung der Signalsequenz im Protein, exprimiert in E. coli mit der in Haemophilus an.
  • Beispiel 5
  • Nukleotidasewirskamkeit von NucA-Protein
  • Ektoenzyme werden als intrinsische Membran-Proteine mit ihren katalytischen Stellen an der extrazellulären Oberfläche der Membran definiert (12). Eine Klasse der Ektoenzyme ist die Ekto-Phosphohydrolase (5'-Nukleotidase). Es gibt viele Berichte, die von sowohl bakteriellen, als auch Säuger 5'-Nukleotidasen handeln, welche jeweils unterschiedliche Substrat-Reaktivitäten zeigen. Säuger 5'-Nukleotidase-Enzym verwendet AMP (Adenosin-Monophosphat-Nukleotid) als Substrat und erzeugt A (Adenosin-Nukleosid) und P (Phosphat), während bakterielle Enzyme ATP (Ade nosin-Triphosphat-Nukleotid), ADP (Adenosin-Diphosphat-Nukleotid) und AMP, als auch andere Nukleotide verwenden können.
  • Einer der frühen Berichte, die das E. coli 5'-Nukleotidaseprotein untersuchen, schlagen vor, dass es sich in dem periplasmischen Raum der zellulären Membran befand und dass dieses Protein einzigartig war, weil es sowohl Zuckerhydrolase-, als auch Mononukleotidasewirksamkeit hat (13; 14). Eine spätere Studie durch Burns und Beacham (15) zeigte eine Nukleotidsequenzanalyse und N-terminale Proteinsequenz des reifen E. coli 5'-Nukleotidasegens ushA. Basierend auf der Proteinsequenz und der DNA-Gensequenz enthält das UshA-Protein eine Signalsequenz, welche in dem reifen Protein proteolytisch entfernt wird. Das vorhergesehene Molekulargewicht des reifen Proteins beträgt 58 kD.
  • Marine leuchtende Vibrio und Photobacterium Stämme enthalten ein Membran-gebundenes spezifisches 5'-Nukleotidaseenzym (16). Das halophile marine Bakterium Vibrio parahaemolyticus kodiert für ein 5'-Nukleotidasegen mit der Bezeichnung nutA (17). Das nutA-Gen ist kloniert, sequenziert und in E. coli exprimiert worden. Das 5'-Nukleotidaseenzym kann ein Lipoprotein, insertiert in die äußere Membran sein. 5'-Nukleotidasewirksamkeit ist auch in gram-positivem Bakterium Bacillus subtilis nachgewiesen worden (18).
  • Aminosäurevergleich
  • Ein Aminosäurevergleich von Rattenleber 5'-Nukleotidase, E. coli 5'-Nukleotidase (UshA) und 2',3'-zyklischer Phosphodiesterase zeigte eine Region von auffallender Homologie, was darauf hinwies, dass diese Domaine bei der katalytischen Wirksamkeit und/oder Bindung von Substrat einbezogen sein kann (19). Ein weiterer Vergleich von verschiedenen 5'-Nukleotidasesequenzen, Ratte, Mensch, UshA, NutA und NucA offenbarte zwei sehr stark homologe Regionen. Diese Regionen erstrecken sich über Aminosäuren 119–152 der NucA-Sequenz von SEQ ID Nr. 2. Zum Beispiel ist die vollständige Homologie der NucA Aminosäuresequenz mit der humanen Nukleotidase-Aminosäuresequenz bei Resten 124–130 und 148–151 von SEQ ID Nr. 2 vorhanden. Obwohl der Gesamtgrad der Homologie zwischen NucA und humanen Nukleotidaseproteinen sehr klein und hauptsächlich auf diese oben beschriebenen Regionen mit vier oder mehr aufeinander folgenden homologen Aminosäuren beschränkt ist, sollte Deletion von einer oder beider dieser Re gionen jede potentielle immune Kreuz-Reaktivität eines Impfstoffs verringern, der das NucA-Protein enthält.
  • 5'-Nukleosid-Abgabetest
  • Eine Proteinsuche wurde durch den NCBI BLAST E-mail Service unter Verwendung der nucA Gensequenz durchgeführt. Die Suche wies auf etwas begrenzte Aminosäure-Homologie mit bekannten 5'-Nukleotidase-Vorläufern quer durch Arten hin, also Mensch, Ratte und E. coli. Ein Lipman-Pearson Protein-Abgleich (DNAStars) wurde durch Vergleichen von NucA-Protein mit Nukleotidaseprotein von Ratten durchgeführt. Ein 33,0 Ähnlichkeitsindex wurde bestimmt, welcher NucA (Aminosäuren 36–333) mit Ratten-Nukleotidase (Aminosäuren 30–329) verglich. Ein anfänglicher 5'-Nukleosid-Abgabetest wurde unter Verwendung von Ratten 5'-Nukleotidase-Umsetzungsbedingungen wie durch Ikehara et al. beschrieben (20) durchgeführt, um zu bestimmen, ob das NucA-Protein 5'-Nukleotidasewirksamkeit besitzt.
  • Ein 5'-Nukleotid wie AMP ist ein polares Substrat, welches nicht an einer TLC-Platte migrieren wird, wenn ein Lösungsmittel wie Methanol/Chloroform zugegeben wird. Eine Nukleotidase wird sich von der Phosphatgruppe abspalten und das Adenosin hinterlassen, welches weniger polar ist. Adenosin wird auf der Platte in Gegenwart von Methanol/Chloroform migrieren. So bedeutet ein TLC-Fleck, welcher migrierte, dass das AMP durch eine Nukleotidase gespalten worden ist.
  • Ein Zehntel eines ml von NTHi P860295 Zellen wurde zentrifugiert, mit PBS-Puffer gewaschen und mit 10 μl PBS resuspendiert. Gereinigte rNucA und nNucA-Proteinkonzentrationen waren bei 200 μg/ml. 5'-Nukleotidaseumsetzungen (100 μl) wurden in 1,5 ml Eppendorf-Röhren durchgeführt, welche jeweils 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl2, 0,1 M KCl, 5 mM AMP mit oder ohne zugegebene Zellen oder Protein enthielten. Jede Röhre wurde bei 37°C für 60 Minuten inkubiert. Zwei μl der Umsetzung wurden auf eine Silica-TLC Fluoreszenzplatte gekleckst und mit 20% Methanol in Chloroform eluiert. Die Platte wurde dann unter Verwendung einer Kurzwellen 254 nm UV-Quelle betrachtet. Wie in 13 gezeigt, wiesen sowohl das rekombinante und native gereinigte NucA-Protein, als auch P860295 Zellen 5'-Nukleotidasewirksamkeit auf.
  • Phosphat-Abgabetest
  • In einem quantitativeren 5-Nukleotidasetest wurde anorgani sche Phosphatase, abgegeben bei Hydrolyse von 5'-Nukleotiden, kolorimetrisch unter Verwendung einer Modifikation des Verfahrens von Chen et al. (21) bestimmt. Umsetzungsgemische enthielten 100 mM Tris-HCl (pH 9,0), 6,6 mM MgCl2, 1,65 mM 5'-AMP (oder anderes Nukleotidsubstrat) und Enzym in einem Endvolumen von 750 μl. Das Umsetzungsgemisch wurde bei 37°C für 30 Minuten inkubiert und die Umsetzung mit der Zugabe von 250 μl von 20% TCA gestoppt. Kontrollen wurden für jede Umsetzung laufen gelassen, bei welcher Enzym nach der Zugabe von 20% TCA zugegeben wurde. Ausgefälltes Protein wurde durch Zentrifugation entfernt und 200 μl Flüssigkeitsüberstand wurden in eine frische Teströhre abgezogen. Einhundert Mikroliter von 1,0 N HCl wurden zugegeben, gefolgt von der Zugabe von 750 μl Ammoniummolybdat-Reagens (3,0 ml 10% Ascorbinsäure plus 18 ml 3, 4 mM Ammoniummolybdat in 1 N H2SO4) und das Gemisch wurde bei 37°C für 30 Minuten inkubiert. Nach Erlauben der Röhren, sich auf Raumtemperatur abzukühlen, wurde die Extinktion bei 650 nm bestimmt. Eine Einheit aus 5'-Nukleotidasewirksamkeit wird als die Menge an Enzym definiert, welche eine Extinktionsveränderung von 1,0 bei 650 nm Min–1 bei 37°C ergibt.
  • PH Optimum
  • Der optimale pH für die Hydrolyse von 5'-AMP wurde zwischen 8,5 und 9,0 gefunden (Daten werden nicht gezeigt); jedoch wurden pHs über 9,0 nicht untersucht.
  • Wirkung von Mg++
  • Von zweiwertigen Kationen, insbesondere Mg++, ist gezeigt worden, dass sie stimulieren oder in einigen Fällen eine absolute Anforderung für 5'-Nukleotidasewirksamkeit in sowohl prokaryotischen, als auch eukaryotischen Systemen sind (16). Vom rNucA-Protein wurde ebenfalls gezeigt, dass es durch die Zugabe von MgCl2 stimuliert wurde. Die Zugabe von bis zu 6,6 mM MgCl2 ergibt eine annähernd 2-fache Stimulation von enzymatischer Wirksamkeit (Daten werden nicht gezeigt).
  • Substrat-Spezifizität
  • Von der rNucA 5'-Nukleotidase wurde gezeigt, dass sie ein relativ breites Substrat-spezifisches Profil aufweist. Vom Enzym wurde gezeigt, dass es eine Vielfalt an 5'-Mono-, Di- und Triphosphat-Nukleotiden zusätzlich zu 5'-AMP hydrolysiert. Bei allen untersuchten Nukleotiden schien das Monophosphat-Nukleotid das bevorzugte Substrat zu sein, außer im Fall von Uridin, wo UTP gegenüber UMP oder UDP bevorzugt wurde. Die rNucA 5'-Nukleotidase schien für 5'-Nukleotide spezifisch zu sein, da sie keine Wirksamkeit bei 3'-AMP zeigte (Daten werden nicht gezeigt).
  • Phosphatase-Test
  • Ein Phosphatase-Test wurde durchgeführt, um zu bestimmen, ob das NucA-Protein nicht-spezifische hydrolysierende Wirksamkeit zusätzlich zu seiner spezifischen 5'-Nukleotidasewirksamkeit besitzt. Phosphatase wurde unter Verwendung von p-Nitrophenylphosphat (PNPP) als Substrat getestet. Umsetzungsgemische (Endvolumen 750 μl) enthielten 100 mM Tris-HCl (pH 9,0), 25 mM PNPP und rNucA. Das Umsetzungsgemisch wurde bei 37°C für 30 Minuten inkubiert und die Umsetzung durch Platzieren der Röhren auf Eis gestoppt. Die Extinktion bei 410 nm wurde bestimmt. Rekombinante NucA hatte keine nachweisbare Wirksamkeit bei PNPP (Daten werden nicht gezeigt). Dies weist darauf hin, dass NucA eine Nukleotidase ohne Phosphatasewirksamkeit ist. Im Gegensatz dazu hat E. coli UshA Phosphatasewirksamkeit zusätzlich zu seiner bekannten Nukleotidasewirksamkeit (13; 14).
  • Beispiel 6
  • Monoklonale Antikörperhemmung von rNucA 5'-Nukleotidase
  • Monoklonale Antikörper (MAb) Nt63-34-25, gezogen zu gereinigtem nNucA-Protein, wie in Beispiel 7 unten gezeigt, wurde bezüglich seiner Fähigkeit getestet, die enzymatische Wirksamkeit von rNucA zu hemmen und/oder auszufällen. Von MAb Nt63-34-25 ist gezeigt worden, dass es mit rNucA, als auch nNucA kreuz-reagiert (Daten werden nicht gezeigt). Hemmung oder Ausfällung von Enzymwirksamkeit durch das Anti-nNucA MAb würde bestätigen, dass das rNucA-Protein tatsächlich eine 5'-Nukleotidase ist. Steigende Konzentrationen an MAb (0, 2,5, 5, 10 und 20 μl) wurden über Nacht bei 4°C mit gereinigtem rNucA-Protein inkubiert. Eine identische Folge wurde aufgestellt, welche ebenfalls 50 μl an Protein-A Perlen (Pierce) zusätzlich zu rNucA-Protein und MAb enthielt, um Immunausfällung zu erleichtern. Die Gemische wurden zentrifugiert und die Flüssigkeitsüberstände wurden nachfolgend auf 5'-Nukleotidasewirksamkeit unter Verwendung des Phosphat-Abgabetests wie oben beschrieben getestet. Prozentuale Wirksamkeit, bezogen auf die Kontrolle, welche kein MAb enthielt, wurde errechnet. 14 zeigt, dass die 5'-Nukleotidasewirksamkeit gehemmt wurde, als die Konzentration von MAb Nt63-34-25 erhöht wurde. Die Zugabe von 10 μl MAb ergab etwa 25% Hemmung von Enzymwirksamkeit, während die Zugabe von 20 μl etwa 45% Hemmung aufwies. Die Wirkung des MAb wird verstärkt, falls Protein-A Perlen zugegeben werden, um Immunausfällung des rNucA-Proteins zu erleichtern. In Gegenwart von Protein-A Perlen ergab die Zugabe von 10 μl MAb eine etwa 60% Abnahme der 5'-Nukleotidasewirksamkeit, während die Zugabe von 20 μl etwa 80% Hemmung aufwies. Vollständige Hemmung von 5'-Nukleotidasewirksamkeit wurde mit höheren Konzentrationen von MAb NT63-34-25 erreicht (Daten werden nicht gezeigt). Diese Daten bestätigen, dass das rNucA-Protein tatsächlich eine 5'-Nukleotidase ist.
  • Beispiel 7
  • Erzeugung von Antikörpern und Tierstudien-Herstellung von Hybridomen für monoklonale Antikörper
  • Gereinigte NucA-Proteinpräparate wie oben beschrieben wurden beim Immunisieren von Mäusen zur Erzeugung von monoklonalen Antikörpern verwendet. Weibliche, acht Wochen alte BALB/c Mäuse wurden intraperitoneal drei Mal in einem Zeitraum von vier Wochen (Woche 0, 2, 4) mit 5 μg NucA-Protein, gereinigt aus dem NTHi-Stamm P860295 und 25 μg von MPLTM Adjuvans in 0,1 ml Dosis inokuliert. Zwei getrennte Fusionsverfahren wurden durchgeführt. Die erste Fusion fand nach einer Ruhezeit von drei Monaten unter Verwendung einer intraperitonealen (IP) Verstärker-Dosis von 0,5 μg NucA-Protein statt; die zweite Fusion fand nach einer Ruhezeit von vier Monaten unter Verwendung einer IP Verstärker-Dosis von 5 μg NucA-Protein auf gleichem Weg statt. Während der Immunisierung und der Ruhezeit wurden Mausseren erhalten (Woche 0, 6) und bezüglich Antikörperwirksamkeit durch ELISA unter Verwendung von NucA-Protein als das auftragende Antigen getestet.
  • Für beide Fusionen wurde die Milz von zwei immunisierten Mäusen etwa 72 Stunden nach der letzten Injektion gewonnen und wurde mit nicht-sekretierenden X63Ag8.653 Maus (BALB/c) Myelom-Zellen in 7 : 1 oder 5 : 1 Verhältnissen (Splenocyten : Myelom) jeweils für erste und zweite Fusion kombiniert. Die Zellen wurden für vier Minuten in 50% (Gew./Gew.) Polyethylenglycol 1500 und 10% Dimethylsulfoxid in Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium (D-MEM) fusioniert. Die fusionierten Zellen wurden in Selekti onsmedium, D-MEM, ergänzt durch Hypoxanthin, Aminopterin, Thymidin, 10% fötales Rinderserum und 10% NCTC-109 Medienergänzung (Gibco-BRL) verdünnt. Die Fusionswirksamkeiten (Mulden mit Koloniewachstum gegenüber Anzahl an besäten Mulden) betrugen 26,4% (119/450), bzw. 76,4% (346/450). Die Reaktivität wurde durch SDS-PAGE Western-Blot, Dot-Blots und ELISAs unter Verwendung des NucA-Proteins und ganzer Zellen bewertet. Positive Reaktoren wurden identifiziert, als 1–25 bezeichnet, als Nt63 (erste Fusion) oder Nt63/2 (zweite Fusion) kodiert und für weitere Kennzeichnung aufbewahrt.
  • Ausgewählte Hybridomen von Interesse wurden einmal durch limitierendes Verdünnungsverfahren subkloniert. Monoklonale Antikörper wurden als Gewebekultur-Flüssigkeitsüberstand (TCS) vorgesehen, durch 50% gesättigte Ammoniumsulfat-Ausfällung (SAS-TCS) oder Ascites konzentriert.
  • Erzeugung von polyklonalen Seren
  • Polyklonale Seren wurden in New Zealand weißen Kaninchen erzeugt. Sechs Kaninchen wurde bezüglich Hintergrund-Titer unter Verwendung von P860295 Ganzzellen ELISA gescreent. Zwei Kaninchen mit den niedrigsten Titern wurden für Immunisierung mit nNucA-Protein bei 25 μg pro Dosis plus 25 μg MPLTM in Kochsalzlösung bei Wochen 0, 4 und 8 ausgewählt. Die Kaninchen wurden bei Woche 10 ausgeblutet. Protein wurde wie oben beschrieben gereinigt und an einem 12% SDS-PAGE Gel laufen gelassen, um die Reinheit von seinen annähernd 90% Grad zu erhöhen. Das 63 kD Band wurde aus dem Coomasie-gefärbten Gel ausgeschnitten und in Folge durch 18G, 20G und 22G Nadeln passiert. Das Adjuvans MPLTM in 0,9% Kochsalzlösung wurde zugegeben und 0,2 ml wurden in Kaninchen injiziert. Die polyklonalen Seren ergaben einen hohen Hintergrund in Kolonie-Blots, selbst nach Absorption auf XL1-Blue MRF', Y1090R', Y1089R' und Y1088 Zellen.
  • Immunogenizitätsstudien
  • Immunogenizitätsstudien, durchgeführt an nNucA und rNucA werden in Tabellen 2–6 unten zusammengefasst. Gepoolte Seren wurden bezüglich Antikörper-Titer zu nNucA und/oder rNucA, Ganzzellen-Titer zu mehreren heterologen NTHi-Stämmen und ebenfalls bakterizide Titer zu hauptsächlich P861454 getestet.
  • Tabelle 2 stellt die Dosierungen dar, die in den Immunogenizitätsstudien verwendet wurden.
  • Figure 00480001
  • Figure 00490001
  • Tabelle 3 stellt eine Zusammenstellung von Ganzzellen (WC) ELISA Daten aus Studien Nr. 1 und 3 dar.
  • Tabelle 4 stellt WC ELISA Daten aus Studie Nr. 2 dar, einschließlich Subtypisierung der IgG-Antikörperklasse.
  • Tabelle 5 stellt bakterizide Daten aus Studien Nr. 1, 2 und 3 dar. Bakterizide Titer für Studie Nr. 3 waren ein Durchschnitt von zwei Tests, außer für Gruppe N755. Immunogenizitätsstudie Nr. 1 zeigte, dass das nNucA-Protein das Potential hat, ein Impfstoffkandidat zu sein. Siehe Tabellen 3 und 5. Es zeigte erhöhte Ganzzellen-Titer zu allen heterologen Stämmen, welche zu der Zeit getestet wurden. Noch wichtiger zeigte es bakterizide Wirksamkeit für zwei von vier getesteten heterologen Stämmen (Tabelle 5). Studien Nr. 2 und 3 wiederholten die Ganzzellen-Daten. Siehe Tabellen 3 und 4. Bakterielle Wirksamkeit von diesen Seren wurde für zwei heterologe Stämme gezeigt (Daten für Stamm P861454 werden in Tabelle 5 gezeigt). Drei weitere Stämme wurden versucht, aber aufgrund technischer Schwierigkeiten konnten keine Daten berichtet werden.
  • Tabelle 6 stellt Antikörper ELISA Titer aus diesen drei Studien dar.
  • Figure 00510001
  • Figure 00520001
  • Tabelle 4 Ganzzellen ELISA an Woche 6 Seren Studie Nr. 2 ELISA für IgG Endpunkt = 0,1
    Figure 00530001
  • Verwendeter Standard (std) waren gepoolte Woche 8 Mausseren von E951, immunisiert mit Gesamt-OMP von P8602955.
  • IgG-Subtyp für TN106
    Figure 00530002
  • Figure 00540001
  • Figure 00550001
  • Die Ergebnisse der in Tabellen 2–6 dargestellten Daten werden nun präsentiert werden.
  • Studie Nr. 1
  • Studie Nr. 1 wurde mit nNucA-Protein durchgeführt, isoliert und gereinigt wie in Beispiel 1 beschrieben. Vier Gruppen von Swiss-Webster Mäusen, fünf Mäuse pro Gruppe, wurden mit entweder 1, 5, 10 oder 20 μg nNucA pro Maus bei Wochen 0, 4, 6 und 8 immunisiert. Der verwendete Hilfsstoff war MPLTM, 50 μg pro Dosis. Antikörper zu nNucA und Ganzzellen-Titer zum homologen P860295 NTHi-Stamm wurden an gepoolten Seren aus allen Blutungen erhalten. Daten für Wochen 0 und 8 werden gezeigt (Tabellen 3 und 6). Ganzzellen-Titer an heterologen Stämmen und bakterizide Titer wurden an Gruppe E548 erhalten, die 5 μg Dosierungsgruppe, welche die höchsten Ganzzellen-Titer zum homologen P860295 Stamm an sowohl Wochen 6 (Daten nicht gezeigt), als auch 8 (Tabelle 3) ergaben. Nach der zweiten Immunisierung wurden sowohl Ganzzellen, als auch gereinigte Protein ELISA Titer verstärkt, verglichen mit den anfänglichen Blutungen (Daten nicht gezeigt). Zwei- bis dreifache Verstärkung wurden ebenfalls nach der dritten Immunisierung beobachtet, außer für die 10 μg Dosierung, welche eine 13-fache Erhöhung beim ELISA Titer zeigte. Das nNucA-Protein löste hohe Ganzzellen ELISA Titer gegenüber acht heterologen NTHi klinischen Isolaten aus (Tabelle 3), und zeigte bewahrte, Oberflächen-exponierte Epitope. Aus dieser Studie wurden 5 μg als die bevorzugte Immunisierungsdosis für weitere Versuche ausgewählt. Ein bakterizider Test wurde unter Verwendung von Seren aus der 5 μg Dosis (E548) an vier heterologen NTHi-Stämmen durchgeführt. Ein signifikanter bakterizider Titer wird als vierfacher Anstieg gegenüber Vor-Immungraden erwogen. Signifikante bakterizide Wirksamkeit wurde gegenüber dem homologen P860295 Stamm nachgewiesen, als auch für die heterologen NTHi-Isolate P810384 und N830161E. Der Titer gegen Stamm P861454 kann signifikant sein, konnte in diesem Test aber nicht bestimmt werden, da die niedrigste getestete Verdünnung 1 : 5 war und die Vor-Immun Seren keine Wirksamkeit bei diesem Grad hatten (Tabelle 5).
  • Studie Nr. 2
  • Studie Nr. 2 wurde durchgeführt, um die Immunogenizität von nNucA mit rNucA, sowohl mit, als auch ohne Hilfsstoffe zu vergleichen. Zwei Hilfsstoffe wurden verglichen: MPLTM und StimulonTM QS-21. Fünf Balb/c Mäuse pro Gruppe wurden für diese Studien verwendet. Die NucA-Proteine, welche für diese Studien verwendet wurden, wurden gereinigt wie in Beispiel 4 beschrieben mit dem nNucA-Protein KSCN extrahiert von P860295. Mäuse wurden bei Wochen 0 und 4 immunisiert und bei Wochen 0, 4 und 6 bluten gelassen. Seren von Woche 0 und 6 Blutungen wurden für ELISA reaktive Antikörper gegenüber sowohl gereinigter nNucA, rNucA und ganzen NTHi-Zellen analysiert.
  • Die Ergebnisse werden in Tabellen 4 und 6 gezeigt. Die nNucA- und rNucA-Proteine waren in Abwesenheit von Hilfsstoffen nicht hochgradig immunogen. Beide Proteine lösten hohe ELISA Titer gegen sie selbst oder gegen die andere Form des Proteins aus, wenn sie mit einem der Hilfsstoffe verwendet wurden (Tabelle 6). Kein Unterschied wurde nachgewiesen, wenn entweder nNucA oder rNucA als das immunisierende Antigen verwendet wurde und die Seren auf jedes Protein reagierten. Es scheint somit, dass das rNucA Antikörper auslöst, die von den durch nNucA ausgelösten nicht unterscheidbar sind. Ganzzellen ELISA Titer für diese Antiseren werden in Tabelle 4 gezeigt. Insgesamt 16 H. influenzae klinische Isolate wurden unter Verwendung dieser Antiseren untersucht. Nur jene Gruppen, welche Hilfsstoffe enthielten, lösten Ganzzellen reaktive Antiseren mit hohem Titer aus. Die Antiseren waren weit kreuz-reaktiv quer durch die Stämme, was zeigte, dass sowohl gereinigte native, als auch rekombinante NucA bewahrte, Oberflächen-exponierte Epitope enthalten, welche Antikörper auslösen, wenn sie in Mäuse injiziert werden. Es wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen entweder Hilfsstoff oder Proteinkombination bei der Fähigkeit beobachtet, Oberflächen-reaktive Antikörper auszulösen. Gruppen ohne Hilfsstoff zeigten Hintergrundgrade von Oberflächen-reaktiven Antikörpern. Die Unterklassenverteilung der Antikörperantwort auf ein Isolat wurde bestimmt und die Ergebnisse in Tabelle 4 gezeigt. Die MPLTM-Gruppen scheinen eine gemischte IgG1, IgG2a/b Antwort zu haben, während das StimulonTM QS-21 unterstützte, native Protein eine hauptsächliche IgG1-Antwort war. Im Gegensatz dazu war die StimulonTM QS-21 rNucA Gruppe eine gemischte IgG1, IgG2a/b Antwort. Jedoch sind diese Antworten nur für einen Versuch und mögen das erwartete Unterklassenprofil für diese Hilfsstoffe in zusätzlichen Versuchen nicht repräsentieren.
  • Studie Nr. 3
  • Studie Nr. 3 wurde durchgeführt, um auf rNucA-Dosisantwort bei Formulierung mit 50 μg MPLTM pro Dosis zu blicken und Seren für die in Tabelle 7 unten gezeigte Schutzstudie zu sammeln. Das rNucA und nNucA waren die gleichen Präparate wie für Studie Nr. 2. Drei Gruppen von jeweils 10 Mäusen wurden mit rNucA bei pro Dosis Mengen von 1 μg (Gruppe N710), 5 μg (Gruppe N711) oder 10 μg (Gruppe N71) immunisiert. Eine zusätzliche Gruppe von 20 Mäusen, N755 (etwa 10 Wochen alt anstelle von 6–8 Wochen) wurde später zu der Studie zugegeben, um extra Seren für die Schutzstudie vorzusehen. Eine fünfte Gruppe von 10 Mäusen, N713, wurde mit 5 μg nNucA immunisiert. Alle Dosen enthielten 50 μg MPLTM pro Dosis und Mäuse wurden bei Wochen 0, 4 und 8 immunisiert. Blut wurde nach Wochen 0, 4, 6 (nur N755), 8 und 10 abgenommen. Siehe Tabelle 2 für Dosierungen.
  • Die primäre Antwort, wie durch die IgG ELISA Titer für Woche 4 Seren (Daten nicht gezeigt) gezeigt, wird durch die Dosis von rNucA beeinflusst. Der niedrigste Titer wurde mit der niedrigsten rNucA-Dosis Gruppe erhalten. Ein zwei- bis dreifach höherer Titer wurde aus der 5 μg Dosis Gruppe erhalten. Der Titer für die 10 μg Dosis Gruppe war wiederum etwa das Zweifache dessen für die 5 μg Dosis. Ähnliche Titer wurden für sowohl die nNucA, als auch rNucA-Gruppen bei 5 μg Dosen erhalten. N755 ergab die höchste primäre Antwort, aber die niedrigste Verstärkung, etwa 45-fach nach der zweiten Dosis. Alle anderen Gruppen verstärkten etwa 200-fach nach der zweiten Dosis. Gruppen N710 und N755 verstärkten etwa zwei- bis dreifach nach der dritten Dosis; Gruppen N711, N712 und N713 fielen tatsächlich leicht ab. Alle Titer waren nach drei Immunisierungen vergleichbar. Siehe Tabelle 6.
  • Alle Stämme bei einer 10 μg Dosis ergaben eine kleine primäre WC Antwort. DL208 und P861454 waren die einzigen beiden Stämme, die eine kleine primäre Antwort auf alle Gruppen ergaben. Alle Titer waren nach den zweiten und dritten Immunisierungen vergleichbar. N755 ergab eine höhere primäre Antwort bei DL208, P810384 und P861454 (was ebenfalls einen hohen Hintergrund hatte), aber die Titer waren wieder nach der zweiten und dritten Immunisierung vergleichbar. Jedoch zeigte das Bluten bei Woche 6 höhere und bei einigen Stämmen die höchsten Titer gegenüber Wochen 8 und 10 für Gruppe N755. Siehe Tabelle 3 für Ergeb nisse von Wochen 0 und 10.
  • Hier wiederholten die Ergebnisse wieder jene der vorhergehenden Studien, welche die Kreuz-Reaktivität der Seren gegenüber allen getesteten Stämmen zeigten, selbst gegenüber dem verkapselten Typ b Eagan Stamm. Jedoch wurde ein definitiver Titer für Eagan nicht erhalten, womöglich aufgrund der Gegenwart der Kapsel, welche Zugangsmöglichkeit des Antigens an der Zelloberfläche gehemmt haben kann.
  • Bakterizide Wirksamkeit der Antiseren von Studie Nr. 2 wurde gegenüber zwei NTHi-Stämmen, TN106 und P861454 bestimmt, beides heterologe Isolate bezogen auf die Quelle des nucA-Gens. Alle Seren außer der StimulonTM QS-21-rNucA Gruppe zeigten bakterizide Wirksamkeit gegenüber TN106. Ergebnisse des BC-Tests gegenüber P861454 werden in Tabelle 5 gezeigt. Die einzigen Gruppen, die einen signifikanten (> 4-fach Anstieg) bakteriziden Titer gegenüber P861451 zeigten, waren die MPLTM Gruppen N091 und N087. So waren entweder natives oder rekombinantes NucA-Protein, unterstützt durch MPLTM in der Lage, eine breit kreuz-reaktive Ganzzellen ELISA Antwort, hohe ELISA Titer gegen eines der Proteine und bakterizide Wirksamkeit gegen heterologe NTHi-Isolate auszulösen.
  • Rattenjunge Schutzstudie
  • Vier Tage alte Sprague-Dawley Ratten wurden zufällig in 10 Gruppen mit einer Mutter in jeder Gruppe von 10 Jungen aufgeteilt. Die Jungen wurden intraperitoneal (IP) wie in Tabelle 7 gezeigt immunisiert.
  • Figure 00600001
  • Gruppen P174 und P175 erhielten Anti-Seren von Kaninchen, immunisiert mit einem 16 kD NTHi-Protein mit der Bezeichnung P6 (auch bekannt als HiPAL oder PBOMP-1 (22)). Gruppe P176 erhielt einen monoklonalen Antikörper, gezogen gegen NTHi Polyribosyl-Ribitol-Phosphat (PRP). Gruppe P177 erhielt PCM-Puffer (10 mM NaPO4, pH 7,4, 150 mM NaCl 0,5 mM MgCl2, 0,15 mM CaCl2) als Pufferkontrolle. Alle Verdünnungen von Seren und Zellen wurden in PCM-Puffer durchgeführt. Etwa 23 Stunden später wurden sie IP mit 49,5 Organismen (0,1 ml) von virulentem H. influenzae Typ b, Eagan Stamm gechallenged. Dann, 20–24 Stunden Nach-Challenge, wurden die Rattenjungen bluten gelassen und für bakterielle Zählungen plattiert. Die Schwänze wurden eingeschnitten und 10 μl Blut mit einer P20 Rainin Pipetman aufgenommen und in 90 μl PCM-Puffer bei RT verdünnt. Verdünnungen wurden gewirbelt und bei 4°C gehalten, bis weitere Verdünnungen bereitet waren und 10 μl jeder Verdünnung wurden auf Schokolade-Agar doppelt plattiert. Platten wurden in 5% CO2 Inkubator bei 36,5°C über Nacht inkubiert. Die Ergebnisse der Schutzstudie werden in Tabelle 8 dargestellt:
    Figure 00620001
    • 1 Geometrische Mittel der Titer (GMTs) basierten auf gleicher Gewichtung an allen zählbaren Platten.
    • 2 GMTs basierten auf höherer Gewichtung auf zählbaren niedrigeren Verdünnungen. Zählbare Platten waren < 500 cfu/Platte. Die Nachweisgrenze betrug 100 cfu/ml mit Plattieren von 10 μl der Verdünnung.
  • Platten für Gruppen P175 und P176 waren 0 bei der niedrigsten Verdünnung und können so irgendwo von 0–99 cfu/ml sein. Hier wurde eine Zahl, 50 cfu/ml zum Zweck der Berechnung vom geometrischen Mittel (GMT) zugewiesen.
  • Platten, die zu zahlreich zum Zählen waren, selbst bei höchster Verdünnung, wurden ebenfalls Zahlen basierend auf
    Schätzungen zugewiesen: > = 1000 cfu/Platte
    >> = 2000 cfu/Platte
    Rasen = 6000 cfu/Platte
  • p-Wert: Kruskal-Wallis ist ein konservativer p-Wert Test, welcher verwendet wird, wenn Probenwerte eine große Bandbreite abdecken. Er ist nicht so empfindlich gegenüber sehr großen Werten. P-Werte < 0,05 sind bei diesem Test statistisch signifikant.
  • Das Rattenjungen Tiermodell für Hib Meningitis zeigt die Fähigkeit von Antikörpern, Bakteriämie (und nachfolgend Tod) aufgrund von Hib zu verringern. Kaninchenseren im Allgemeinen ergeben etwas nicht-spezifische Immunität gegenüber Hib im Blut von Rattenjungen, wie gesehen werden kann, wenn die Woche 0 cfus der Maus und Kaninchen Antiseren verglichen werden. Das Modell verwendet somit vor-immune Kaninchenseren als negative Kontrolle für die immunen Kaninchenseren. Wie erwartet verringerten Kaninchen Kontroll-Antiseren gegenüber dem P6-Protein den GMT von Hib im Blut von Ratten von 300 auf 0,5 und zeigten somit verringerte Bakteriämie, wie auch der Maus monoklonale Antikörper gegenüber der PRP-Kapsel von Hib (Gruppe P176). Maus anti-rNucA-Seren bei einer Verdünnung von 1 : 2 verringern signifikant die Grade von Bakteriämie im Vergleich mit Woche 0 (vor-immun) Seren und zeigten ein positives Ergebnis in diesem Tiermodell und die Fähigkeit, eingekapseltes Hib zu opponieren. Diese Ergebnisse zeigen die Wirksamkeit der anti-rNucA Seren in diesem Modell und sein Impfstoffpotential gegenüber Haemophilus influenzae.
  • Beispiel 8
  • Spezifität der nucA 420 bp Sonde
  • Die oben beschriebene 420 bp DNA-Sonde wurde bezüglich ihrer Spezifität beim Identifizieren von Haemophilus Arten getestet. Die Sonde wurde in Southern Hybridisierungen verwendet, um eine partielle Restriktionskarte des nucA-Gens zu erzeugen, und in Dot-Blot Hybridisierung zur Identifizierung der Haemophilus Arten. Die Kulturen wurden auf O. D.600 von etwa 1,0 wachsen gelassen und bei –20°C gelagert. Fünf μl Kultur wurden auf eine trockene Hybond-N Membran mit einem 3 mm Whatman Papier darunter zum Abtupfen von überschüssiger Flüssigkeit gekleckst. Die Membran wurde für etwa 10 Minuten luftgetrocknet. Sie wurde in 10% SDS lysiert, dann in denaturierendem Puffer (1,5 M NaCl, 0,5 M NaOH) für 7 Minuten bei RT denaturiert. Überschüssiger Puffer wurde mit 3 mm Whatman Papier abgetupft. Die Membran wurde in Neutralisierungspuffer (1,5 M NaCl, 0,5 M Tris-HCl, pH 7,2, 1 mM EDTA) für 3 Minuten bei RT neutralisiert. Die Membran wurde auf 3 mm Whatman Papier platziert, um überschüssigen Puffer abzutupfen, und die Neutralisierungsbehandlung wurde wiederholt. Die Membran wurde in 2 × SSC gespült und an 3 mm Whatman Papier luftgetrocknet. Die DNA wurde unter Verwendung eines Stratagene UV Querverbinders im Auto-Modus zur Membran quervernetzt. Die Membran wurde in Vorhybridisierungspuffer (5 × SSC, 1,0% Blockierungsreagens, 0,1% N-Lauroylsarcosin, 0,02% SDS) bei 65°C für 2–4 Stunden vorhybridisiert. Hybridisierung wurde in Vorhybridisierungspuffer plus Sonde (PCR dig-dUTP markierte P860295 chromosomale DNA mit spezifischen Primern, welche das gleiche 420 bp Fragment wie oben beschrieben ergeben) bei 65°C über Nacht durchgeführt. Zwei Wäschen wurden in 2 × SSC-0,1% SDS bei 65°C für 5–15 Minuten durchgeführt. Weitere zwei Wäschen wurden in 0,1 × SSC-0,1% SDS bei 65°C für 15 Minuten durchgeführt. Die Membran wurde gemäß dem Genius Kit Protokoll (Boehringer Mannheim) entwickelt.
  • Unten sind die Arten und Stämme von Zellkulturen aufgelistet, die für Punkt-Hybridisierung mit dieser nucA-Sonde gekleckst wurden. Alle Haemophilus-Stämme waren sichtbar positiv, einschließlich Tyb b, Eagan Stamm. Die einzige nicht-Haemophilus Art, die positiv war, war die E. coli Kultur, welche das rnucA-Plasmid pPX691 enthielt. Alle anderen Arten waren für diese Sonde negativ. Siehe 15.
    • 1. E. coli InvαF'
    • 2. pTrcHisC in InvαF'
    • 3. pPX691 in InvαF'
    • 4. NTHi P810384
    • 5. NTHi P810568
    • 6. NTHi P860295
    • 7. NTHi 861454
    • 8. NTHi P880859
    • 9. NTHi DL208
    • 10. NTHi H305
    • 11. NTHi N1955
    • 12. NTHi N830161E
    • 13. NTHi SH1013
    • 14. NTHi SH1014
    • 15. NTHi SH1015
    • 16. NTHi TN106
    • 17. Hib Eagan
    • 18. GC LB2
    • 19. GC Pgh3-2
    • 20. H. pylori
    • 21. M. catarrhalis 035e
    • 22. S. typhimurium 3261
  • GC für 18. und 19. ist Neisseria gonorrhoeae. Diese Ergebnisse zeigten die Spezifität der Sonde für nucA-Sequenzen.
  • Beispiel 9
  • Bewahrung der NucA-Sequenz unter H. Influenza
  • Ganzzellenlysate von mehreren NTHi-Stämmen und Typ b, Eagan Stamm, wurden an Westerns analysiert, sondiert mit Mab Nt63-34-25 oder Kaninchen Polyklonalen, beide zu nNucA. Alle getesteten Stämme zeigten ein bewahrtes 63 kD Band (nach Größe an einem SDS-PAGE Gel) mit den nNucA Antiseren (Daten werden nicht gezeigt). Mehrere NTHi-Stämme und Typ b, Eagan und Whittier Stämme, wurden ebenfalls zu O. D.490 von etwa 1,0 wachsen gelassen, mit 0,4% Formaldehyd fixiert zu O. D.620 von etwa 0,2 in PBS verdünnt und durch Trocknen für WC ELISA auf Platten gezogen. Siehe Tabellen 3 und 4. Alle getesteten Stämme zeigten einen erhöhten Titer am WC ELISA.
  • Wie oben beschrieben wurde die Sequenz des NucA-Proteins von Stamm P860295 (SEQ ID Nr. 2) erhalten. Als nächstes wurde das nucA-Fragment (mit oder ohne Signalsequenz) aus acht anderen NTHi-Genomen und dem Typ b, Eagan-Stamm unter Verwendung von Primern amplifiziert, bereitet durch Sequenzieren der nucA-Region vom P860295 Genom.
  • Die PCR-Fragmente wurden in pCRTMII kloniert und sequenziert. Vollständige Sequenzen der reifen nucA-Gen Region wurden für Stämme P810384, P810568, P861454, P880859, N1955, TN106, SH1014, SH1015 und Eagan erhalten. Eine Proteinanordnung wurde aus den abgeleiteten Aminosäuresequenzen des reifen NucA-Prote ins einschließlich dem von P860295 erzeugt. Vier der Stämme (P880859, TN106, SH1015 und Eagan) sind 100% identisch mit P860295. Die anderen Stämme unterscheiden sich von P860295 durch einen bis sieben Aminosäurereste (siehe Tabelle 9). Dies zeigt das beträchtliche Ausmaß, bis zu welchem das nucA-Gen unter den getesteten H. influenzae Stämmen bewahrt wird.
  • Tabelle 9 Reife NucA Aminosäurerest Unterschiede zwischen Stamm P860295 und anderen H. influenzae Stämmen
    Figure 00660001
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  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00680001
  • Figure 00690001
  • Figure 00700001
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  • Figure 00810001
  • Figure 00820001

Claims (12)

  1. Impfstoffzusammensetzung, welche ein isoliertes und gereinigtes Protein von Haemophilus influenzae umfasst, wobei besagtes Protein die Aminosäuresequenz von Aminosäuren 26–603 von SEQ ID Nr. 2 umfasst oder ein Epitop oder Epitope davon, wobei besagte Impfstoffzusammensetzung eine schützende Immunantwort in einem Säuger-Wirt auslöst.
  2. Impfstoffzusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei besagtes Protein die Aminosäuresequenz, kodiert durch Nukleotide 229 bis 2037 von SEQ ID Nr. 1 umfasst.
  3. Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Aminosäuresequenz von Aminosäuren 26–603 von SEQ ID Nr. 2 durch eine oder mehrere der folgenden Aminosäurerestveränderungen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus K79E, N186K, S262G, V294A, E305Q, K327R, T337A, D360Y, R376H und V436I modifiziert ist.
  4. Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 1, welche ferner einen Hilfsstoff, Verdünnungsmittel oder Träger umfasst.
  5. Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 4, wobei der Hilfsstoff ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat, QS-21, 3-O-deacyliertes Monophosphoryllipid A und IL-12.
  6. Isolierte und gereinigte DNA-Sequenz, welche eine DNA-Sequenz, kodierend für ein Protein von Haemophilus influenzae oder ein Peptid von besagtem Protein, umfassend ein Epitop oder Epitope davon umfasst, zur Verwendung als Medikament, wobei besagtes Protein eine Aminosäuresequenz hat, ausgewählt aus: (i) Aminosäuren 26–603 von SEQ ID Nr. 2; (ii) Aminosäuren 26–603 von SEQ ID Nr. 2, modifiziert durch eine oder mehrere Restveränderungen, ausgewählt aus der Gruppe K79E, N186K, S262G, V294A, E305Q, K327R, T337A, D360Y, R376H und V436I.
  7. Isolierte und gereinigte DNA-Sequenz gemäß Anspruch 6 zur Verwendung als Medikament, wobei besagte DNA-Sequenz Nukleotide 304–2037 von SEQ ID Nr. 1 umfasst, oder eine DNA-Sequenz, welche damit unter Hoch-Stringenz Southern-Hybridisierung Standardbedingungen hybridisiert wird.
  8. Isolierte und gereinigte DNA-Sequenz gemäß entweder Anspruch 6 oder Anspruch 7 zur Verwendung in einer Haemophilus influenzae Impfstoffzusammensetzung zur Verabreichung an einen Säuger-Wirt.
  9. Verwendung einer isolierten und gereinigten DNA-Sequenz, welche entweder für ein Protein von Haemophilus influenzae kodiert, oder ein Peptid von besagtem Protein, umfassend ein Epitop oder Epitope davon, bei der Herstellung einer Impfstoffzusammensetzung zum Auslösen einer schützenden Immunantwort gegenüber Haemophilus influenzae in einem Säuger-Wirt, wobei besagtes Protein eine Aminosäuresequenz hat, ausgewählt aus: (i) Aminosäuren 26–603 von SEQ ID Nr. 2; (ii) Aminosäuren 26–603 von SEQ ID Nr. 2, modifiziert durch eine oder mehrere Restveränderungen, ausgewählt aus der Gruppe K79E, N186K, S262G, V294A, E305Q, K327R, T337A, D360Y, R376H und V436I.
  10. Isoliertes und gereinigtes Protein von Haemophilus influenzae oder ein Peptid von besagtem Protein, umfassend ein Epitop oder Epitope davon, zur Verwendung als Medikament, wobei besagtes Protein eine Aminosäuresequenz hat, ausgewählt aus: (i) Aminosäuren 26–603 von SEQ ID Nr. 2; (ii) Aminosäuren 26–603 von SEQ ID Nr. 2, modifiziert durch eine oder mehrere Restveränderungen, ausgewählt aus der Gruppe K79E, N186K, S262G, V294A, E305Q, K327R, T337A, D360Y, R376H und V436I.
  11. Isoliertes und gereinigtes Protein gemäß Anspruch 10 oder ein Peptid von besagtem Protein, umfassend ein Epitop oder Epitope davon, zur Verwendung in einer Haemophilus influenzae Impfstoffzusammensetzung zur Verabreichung an einen Säuger-Wirt.
  12. Verwendung eines isolierten und gereinigten Proteins gemäß Anspruch 10 oder eines Peptids von besagtem Protein, umfassend ein Epitop oder Epitope davon, bei der Herstellung einer Impfstoffzusammensetzung zum Auslösen von schützender Immunantwort gegenüber Haemaphilus influenzae in einem Säuger-Wirt.
DE69730814T 1996-07-26 1997-07-23 Das NucA Protein von Haemophilus influenzae und dessen kodierendes Gen Expired - Lifetime DE69730814T2 (de)

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