ES2227709T3 - Proteina nuca de haemophilus innfluenzae y gen que codifica dicha proteina. - Google Patents
Proteina nuca de haemophilus innfluenzae y gen que codifica dicha proteina.Info
- Publication number
- ES2227709T3 ES2227709T3 ES97935048T ES97935048T ES2227709T3 ES 2227709 T3 ES2227709 T3 ES 2227709T3 ES 97935048 T ES97935048 T ES 97935048T ES 97935048 T ES97935048 T ES 97935048T ES 2227709 T3 ES2227709 T3 ES 2227709T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- protein
- baselineskip
- nuca
- sequence
- dna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 266
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 227
- 241000606790 Haemophilus Species 0.000 title description 9
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims abstract description 48
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 claims abstract description 40
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 32
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 31
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 20
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 claims abstract description 8
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 124
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 47
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 41
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 25
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 18
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 18
- DRHZYJAUECRAJM-DWSYSWFDSA-N (2s,3s,4s,5r,6r)-6-[[(3s,4s,4ar,6ar,6bs,8r,8ar,12as,14ar,14br)-8a-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3-[(2s,3r,4s,5r,6s)-5-[(2s,3r,4s,5r)-4-[(2s,3r,4r)-3,4-dihydroxy-4-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxyoxan-2-yl]oxy-3,4-dihydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy-5-[(3s,5s, Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@H](O[C@H]([C@@H]1O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1)O)O[C@H]1CC[C@]2(C)[C@H]3CC=C4[C@@H]5CC(C)(C)CC[C@@]5([C@@H](C[C@@]4(C)[C@]3(C)CC[C@H]2[C@@]1(C=O)C)O)C(=O)O[C@@H]1O[C@H](C)[C@@H]([C@@H]([C@H]1O[C@H]1[C@@H]([C@H](O)[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@](O)(CO)CO3)O)[C@H](O)CO2)O)[C@H](C)O1)O)O)OC(=O)C[C@@H](O)C[C@H](OC(=O)C[C@@H](O)C[C@@H]([C@@H](C)CC)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](CO)O1)O)[C@@H](C)CC)C(O)=O)[C@@H]1OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O DRHZYJAUECRAJM-DWSYSWFDSA-N 0.000 claims description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 12
- 229940047650 haemophilus influenzae Drugs 0.000 claims description 10
- 102220346653 c.235A>G Human genes 0.000 claims description 7
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 4
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 3
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 3
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 claims description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims 3
- 229940124855 Haemophilus influenzae vaccine Drugs 0.000 claims 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 32
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 abstract description 25
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 abstract description 23
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 16
- 108010028584 nucleotidase Proteins 0.000 abstract description 13
- 230000004044 response Effects 0.000 abstract description 10
- 238000002955 isolation Methods 0.000 abstract description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 abstract description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 2
- NVKAWKQGWWIWPM-ABEVXSGRSA-N 17-β-hydroxy-5-α-Androstan-3-one Chemical compound C1C(=O)CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CC[C@H]21 NVKAWKQGWWIWPM-ABEVXSGRSA-N 0.000 abstract 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 192
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 68
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 53
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 42
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 42
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 40
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 33
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 33
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 33
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 33
- 108010043671 prostatic acid phosphatase Proteins 0.000 description 31
- 102000004008 5'-Nucleotidase Human genes 0.000 description 29
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 28
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 27
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 23
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 21
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 21
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 21
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 21
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 20
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 20
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 20
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 19
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 19
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 18
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 18
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 18
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 description 17
- 239000000047 product Substances 0.000 description 17
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 17
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 16
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 16
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 16
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 15
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 15
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 15
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 14
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 14
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 14
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 14
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 14
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 14
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 13
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 13
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 13
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 13
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 13
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 12
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 12
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 12
- 101150032913 nucA gene Proteins 0.000 description 12
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 12
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 11
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 11
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 11
- 241001460678 Napo <wasp> Species 0.000 description 10
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 10
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 10
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 10
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 10
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N adenosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 9
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 9
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 9
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 9
- ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M potassium thiocyanate Chemical compound [K+].[S-]C#N ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 9
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- UDMBCSSLTHHNCD-UHFFFAOYSA-N Coenzym Q(11) Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(O)=O)C(O)C1O UDMBCSSLTHHNCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 8
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 8
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 8
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 8
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 7
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 7
- 239000003899 bactericide agent Substances 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 7
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 7
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 7
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 description 7
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 6
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 6
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 6
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 6
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 6
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 6
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 6
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 6
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 5
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 4
- 208000031729 Bacteremia Diseases 0.000 description 4
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 4
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 description 4
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 description 4
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 206010033078 Otitis media Diseases 0.000 description 4
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- BTIJJDXEELBZFS-QDUVMHSLSA-K hemin Chemical compound CC1=C(CCC(O)=O)C(C=C2C(CCC(O)=O)=C(C)\C(N2[Fe](Cl)N23)=C\4)=N\C1=C/C2=C(C)C(C=C)=C3\C=C/1C(C)=C(C=C)C/4=N\1 BTIJJDXEELBZFS-QDUVMHSLSA-K 0.000 description 4
- 229940025294 hemin Drugs 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- AEOBEOJCBAYXBA-UHFFFAOYSA-N A2P5P Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(O)=O)C(O)C1OP(O)(O)=O AEOBEOJCBAYXBA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 3
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 3
- 102100033640 Bromodomain-containing protein 1 Human genes 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 3
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 description 3
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 3
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- LNQVTSROQXJCDD-UHFFFAOYSA-N adenosine monophosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(CO)C(OP(O)(O)=O)C1O LNQVTSROQXJCDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 3
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 3
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 3
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 3
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 3
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- BCOSEZGCLGPUSL-UHFFFAOYSA-N 2,3,3-trichloroprop-2-enoyl chloride Chemical compound ClC(Cl)=C(Cl)C(Cl)=O BCOSEZGCLGPUSL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 5'-adenylphosphoric acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- -1 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- Chemical group 0.000 description 2
- XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N Adenosine diphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 241000700112 Chinchilla Species 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 2
- 241000206672 Gelidium Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000588655 Moraxella catarrhalis Species 0.000 description 2
- 101800000135 N-terminal protein Proteins 0.000 description 2
- 101150008132 NDE1 gene Proteins 0.000 description 2
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000588652 Neisseria gonorrhoeae Species 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101800001452 P1 proteinase Proteins 0.000 description 2
- 206010072369 Pharyngeal exudate Diseases 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150052859 Slc9a1 gene Proteins 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000003277 amino acid sequence analysis Methods 0.000 description 2
- 239000011609 ammonium molybdate Substances 0.000 description 2
- 235000018660 ammonium molybdate Nutrition 0.000 description 2
- APUPEJJSWDHEBO-UHFFFAOYSA-P ammonium molybdate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-][Mo]([O-])(=O)=O APUPEJJSWDHEBO-UHFFFAOYSA-P 0.000 description 2
- 229940010552 ammonium molybdate Drugs 0.000 description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 2
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 2
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- FSVCQIDHPKZJSO-UHFFFAOYSA-L nitro blue tetrazolium dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].COC1=CC(C=2C=C(OC)C(=CC=2)[N+]=2N(N=C(N=2)C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC(=CC=2)[N+]([O-])=O)=CC=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 FSVCQIDHPKZJSO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 101150100211 nutA gene Proteins 0.000 description 2
- 101150093139 ompT gene Proteins 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- PZSNLKGFIPUIHX-KUFNSSOESA-N (2R,3R,4R)-1-[(3R,4S,5R)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]pentane-1,2,3,4,5-pentol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C(O)C1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O PZSNLKGFIPUIHX-KUFNSSOESA-N 0.000 description 1
- NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 20-hydroxyecdysone Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@](C)(O)[C@H](O)CCC(C)(O)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 0.000 description 1
- LNQVTSROQXJCDD-KQYNXXCUSA-N 3'-AMP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H]1O LNQVTSROQXJCDD-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 108010037497 3'-nucleotidase Proteins 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- WJWWDONJARAUPN-UHFFFAOYSA-N 4-anilino-5h-1,3-thiazol-2-one Chemical class O=C1SCC(NC=2C=CC=CC=2)=N1 WJWWDONJARAUPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-L 4-nitrophenyl phosphate(2-) Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=C(OP([O-])([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 1
- XZMCDFZZKTWFGF-UHFFFAOYSA-N Cyanamide Chemical compound NC#N XZMCDFZZKTWFGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 101100364969 Dictyostelium discoideum scai gene Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000590002 Helicobacter pylori Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 1
- 206010027241 Meningitis haemophilus Diseases 0.000 description 1
- 101100364971 Mus musculus Scai gene Proteins 0.000 description 1
- BACYUWVYYTXETD-UHFFFAOYSA-N N-Lauroylsarcosine Chemical compound CCCCCCCCCCCC(=O)N(C)CC(O)=O BACYUWVYYTXETD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000607568 Photobacterium Species 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- 101000678231 Rattus norvegicus 5'-nucleotidase Proteins 0.000 description 1
- 101001001270 Rattus norvegicus Prostatic acid phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 1
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 description 1
- 241000607272 Vibrio parahaemolyticus Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- LPQOADBMXVRBNX-UHFFFAOYSA-N ac1ldcw0 Chemical compound Cl.C1CN(C)CCN1C1=C(F)C=C2C(=O)C(C(O)=O)=CN3CCSC1=C32 LPQOADBMXVRBNX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010306 acid treatment Methods 0.000 description 1
- 229950006790 adenosine phosphate Drugs 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 1
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical class N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- JJWKPURADFRFRB-UHFFFAOYSA-N carbonyl sulfide Chemical compound O=C=S JJWKPURADFRFRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000007330 chocolate agar Substances 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000013578 denaturing buffer Substances 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 229940037467 helicobacter pylori Drugs 0.000 description 1
- 150000002411 histidines Chemical class 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 210000004201 immune sera Anatomy 0.000 description 1
- 229940042743 immune sera Drugs 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 229940124452 immunizing agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 229910052816 inorganic phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000007852 inverse PCR Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012913 medium supplement Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000018791 negative regulation of catalytic activity Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000013618 particulate matter Substances 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229940093430 polyethylene glycol 1500 Drugs 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000000734 protein sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 108700004121 sarkosyl Proteins 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 201000009890 sinusitis Diseases 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000013595 supernatant sample Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical class OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 1
- 101150047507 ushA gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/285—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pasteurellaceae (F), e.g. Haemophilus influenza
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Virology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
SE AISLA Y SE PURIFICA UNA PROTEINA PROCEDENTE DE H. INFLUENZAE DENOMINADA NUCA. LA PROTEINA NUCA PRESENTA LA SECUENCIA DE AMINOACIDOS DE LOS AMINOACIDOS 26 - 603 DE LA SEC ID N 2 O UNA SECUENCIA DE AMINOACIDOS BIOLOGICAMENTE EQUIVALENTE A ESTA. LOS AMINOACIDOS 1 - 25 DE LA SEC ID N 2 SON EL PEPTIDO SEÑAL, QUE SE ESCINDE DURANTE EL PROCESAMIENTO DE LA PROTEINA MADURA. LA PROTEINA NUCA PRESENTA UN PESO MOLECULAR DE APROXIMADAMENTE 63.000 DALTONS, SEGUN SE MIDE MEDIANTE UN GEL DE SDS - PAGE AL 12 % Y POSEE UNA ACTIVIDAD 5 - NUCLEOTIDASA. LA PROTEINA NUCA SE OBTIENE MEDIANTE EL AISLAMIENTO Y LA PURIFICACION DE UN ORGANISMO DE H. INFLUENZAE, MEDIANTE UNA SINTESIS QUIMICA O MEDIANTE LA EXPRESION RECOMBINANTE DE UNA SECUENCIA DE ADN DE NUCA AISLADA Y PURIFICADA QUE CODIFICA LA PROTEINA NUCA. ESTA SECUENCIA DE ADN SE HIBRIDA BAJO CONDICIONES DE HIBRIDACION SOUTHERN DE ELEVADA SEVERIDAD CONVENCIONALES, CON UNA SECUENCIA DE ADN QUE CODIFICA LA PROTEINA NUCA DE H. INFLUENZAE QUE PRESENTA LA SECUENCIADE AMINOACIDOS DE LOS AMINOACIDOS 26 - 603 DE LA SEC ID N 2 O UNA SECUENCIA DE AMINOACIDOS BIOLOGICAMENTE EQUIVALENTE A ESTA. LA PROTEINA NUCA SE UTILIZA PARA PREPARAR UNA COMPOSICION DE VACUNA QUE PROVOCA UNA RESPUESTA INMUNE PROTECTORA EN UN HUESPED MAMIFERO PARA PROTEGER AL HUESPED CONTRA UNA ENFERMEDAD PROVOCADA POR H. INFLUENZAE.
Description
Proteína NucA de Haemophilus influenzae y
gen que codifica dicha proteína.
La presente invención se refiere a una proteína
de 63.000 Daltons producida por Haemophilus influenzae
denominada NucA y al gen nucA que codifica dicha
proteína.
Haemophilus influenzae no tipificable
(NTHi) es un organismo comensal estrictamente humano que se
encuentra en el aparato respiratorio superior de hasta el 80% de
los adultos sanos (cita bibliográfica 1). Es la causa principal de
la otitis media y de las infecciones respiratorias en los niños,
incluyendo la neumonía y la sinusitis (2). Como las cepas de NTHi
no están encapsuladas, las vacunas existentes para H.
influenzae, que están basadas en la estructura capsular de tipo
b (Hib) son ineficaces. Por consiguiente, se necesita una vacuna
específica para organismos NTHi y los componentes potenciales de la
vacuna se han centrado en los antígenos expuestos en la superficie,
similares a las proteínas de la membrana externa.
Por consiguiente, un objetivo de la presente
invención consiste en aislar y purificar una proteína adicional a
partir de H. influenzae y en probar si la proteína es una
vacuna experimental viable en los sistemas de modelo apropiado.
Otro objetivo de la presente invención consiste
en aislar y clonar el gen que codifica dicha proteína y en expresar
la proteína de forma recombinante.
Estos y otros objetivos de la invención expuestos
más adelante se alcanzan mediante el aislamiento y purificación de
una proteína de H. influenzae que se denomina NucA, así como
los péptidos de la proteína NucA que comprenden un epítopo o
epítopos de ésta. La proteína NucA aislada y purificada de H.
influenzae tiene la secuencia de aminoácido de los aminoácidos
26 a 603 de la SEC. ID nº: 2 o una secuencia de aminoácidos
biológicamente equivalente de la misma. Los aminoácidos 1 a 25 de
la SEC. ID nº: 2 son el péptido con señal, que se escinde durante
el tratamiento de la proteína madura. La proteína NucA tiene un
peso molecular de aproximadamente 63.000 Daltons medido en un gel de
SDS-PAGE al 12% y posee actividad de
5'-nucleotidasa.
En una forma de realización de la invención, la
proteína NucA se obtiene por aislamiento y purificación del
organismo H. influenzae. En una forma de realización
preferida de la invención, la proteína NucA es expresada de forma
recombinante por una secuencia de ADN de nucA aislada y
purificada que codifica esta proteína.
La invención comprende una secuencia de ADN
aislada y purificada que comprende una secuencia de ADN que se
hibrida en condiciones estándar de hibridación de Southern de gran
restricción con una secuencia de ADN que codifica la proteína NucA
de H. influenzae que tiene la secuencia de aminoácido de los
aminoácidos 26 a 603 de la SEC. ID nº: 2 o una secuencia de
aminoácidos biológicamente equivalente de la misma.
Ejemplos de dichas secuencias de NucA
biológicamente equivalente son aquéllos en los que las secuencias de
aminoácidos de los aminoácidos 26 a 603 de la SEC. ID nº: 2 está
modificada por uno o más de los siguientes cambios de restos de
aminoácidos seleccionados de entre el grupo constituido por K79E,
N186K, S262G, V294A, E305Q, K327R, T337A, D360Y, R376H ó V436I.
La invención comprende además dicha secuencia de
ADN que se hibrida en las condiciones de hibridación estándar de
Southern de gran restricción con una secuencia de ADN que tiene la
secuencia de nucleótido de los nucleótidos 304 a 2037 de la SEC. ID
nº: 1.
Para obtener la expresión de una proteína NucA,
se inserta en primer lugar la secuencia de ADN en un vector del
plásmido adecuado. Se transforma o transfecta a continuación una
célula huésped adecuada con el plásmido. En una forma de
realización de la presente invención, la célula huésped es la cepa y
Inv\alphaF' de Escherichia coli. Se cultiva a continuación
la célula huésped en condiciones que permitan la expresión de dicha
proteína NucA por la célula huésped.
En otra forma de realización de la presente
invención, se utiliza la proteína NucA aislada y purificada o un
péptido de la proteína NucA que comprende un epítopo o epítopos de
la misma, para preparar una composición de vacuna que produce una
respuesta inmunitaria protectora en un huésped mamífero. La
composición de vacuna puede comprender además un adyuvante,
diluyente o vehículo. Ejemplos de dichos adyuvantes comprenden el
hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, MPL™, Stimulon™
QS-21 e IL-12. La composición de
vacuna se administra a un huésped mamífero en una cantidad
inmunógena suficiente para proteger al huésped de la enfermedad
producida por H. influenzae.
La Figura 1 representa el extracto KSCN de la
cepa P860295 de NTHi y sus eluidos de una columna con
Bio-Gel™ HT hidroxilapatito introducida en un gel de
SDS-PAGE al 12%. Banda 1 - patrones de peso
molecular bajo de BioRad (pesos moleculares aparentes de 97, 66,
45, 31 y 22 kD); Banda 2 - extracto de KSCN 3 M de la
pre-columna; Banda 3 - flujo descendente de la
columna; Banda 4 - NaPO_{4} 0,3 M, pH 7,0, eluido; Banda 5 -
NaPO_{4} 0,4M, pH 7,0, eluido.
La Figura 2 representa un gel
SDS-PAGE al 12% de la proteína NucA más purificada,
demostrando ser aproximadamente de 63 kD. Banda 1 - patrones de peso
molecular bajo de BioRad (iguales a las de la Figura 1); Banda 2 -
NucA concentrada antes de la precipitación con etanol.
La Figura 3 representa los productos de PCR
específicos para nucA propuestos amplificados procedentes del
banco \lambda Zap de NTHi. El esquema del banco \lambda Zap
presenta el punto de inserción de los fragmentos de ADN genómico
p860295 en la zona pBluescript™ del fago \lambda Zap™II y la
orientación relativa de los cebadores degenerados específicos de
nucA, P_{1} y P_{2}, en los fragmentos de ADN genómico
potencial que contienen estos puntos. Los puntos del cebador T3 y
T7 específicos del fago se presentan fijados sobre el ADN del
\lambda Zap™II.
La Figura 4 (arriba) representa los dos clones de
PCR que contenían la mayor parte de la secuencia de nucA
maduro. A partir de estas secuencias, se construyó una sonda de 420
bp que se utilizó en las transferencias de Southern en el ADN
cromosómico p860295. La Figura 4 (abajo) representa una cartografía
de restricción genómica limitada del gen nucA.
La Figura 5 representa un esquema de las
reacciones y productos de la PCR inversa específica para
nucA previstos. Se digerió el ADN genómico de p860295 con
NsiI (arriba) o EcoRI (en medio y abajo). Se diluyeron los ADN y se
ligaron formando círculos "autoligados". Se presentan los
círculos de ADN que contienen ADN de nucA.
Arriba - El círculo de NsiI de aproximadamente 3
kb contenía la información de la secuencia corriente arriba de la
zona P1 de nucA. La amplificación por PCR utilizando las
parejas de cebadores 4313ext y 4102ext produjo un fragmento de ADN
de aproximadamente 2 kb.
En medio - El círculo de EcoRI de aproximadamente
4,3 kb contenía la información de la secuencia corriente arriba de
la zona P1 de nucA. La amplificación por PCR utilizando las
parejas de cebadores 4121fwd y 4122ext debería producir un
fragmento de ADN de aproximadamente 4 kb. No se observó ningún
fragmento de este tamaño.
Abajo - El círculo de EcoRI de aproximadamente
1,6 kb contenía la información de la secuencia corriente abajo de la
zona de codificación de nucA. La amplificación por PCR
utilizando las parejas de cebadores 4102ext y 4313ext debería
producir un fragmento de ADN de aproximadamente 0,7 kb. Realmente,
se obtuvo un fragmento de aproximadamente 1,3 kb.
La Figura 6 representa el vector de expresión del
pRSETC, incluyendo la secuencia de ADN que rodea los puntos de
clonación corriente abajo del activador (P_{T7}) del gen 10 T7.
Los puntos de reconocimiento del ADN de la enzima de restricción,
Nde1, Nhe1, BamH1 y HindIII, están subrayados. El comienzo de la
proteína y el marco de lectura se muestra a continuación de la
secuencia de ADN, así como el punto de escisión de la enterocinasa
(escisión de EK).
La Figura 7 representa una transferencia Western
en lisados celulares en los productos de expresión del pPX644
sondados con anticuerpos policlonales de conejo. Banda 1: patrones
de proteína de alto peso molecular coloreados previamente (200,
97,4, 68, 43, 29, 18,4 y 14,3 kD) (Gibco BRL); Banda 2: patrón de
proteína NucA natural purificada; Bandas 3 y 4: BL21 (DE3)
pLysS/pPX644, cepa nº 1, no inducida e inducida, respectivamente.
Bandas 5 y 6: BL21 (DE3) pLysS/pPX644, cepa nº 5, no inducida e
inducida, respectivamente. Bandas 7 y 8: BL21 (DE3) pLysS/pPX644,
cepa nº 7, no inducida e inducida, respectivamente. Bandas 9 y 10:
BL21 (DE3) pLysS/pRSETC, cepa nº 1, no inducida e inducida,
respectivamente. La flecha muestra la migración de NucA.
La Figura 8 (arriba) representa un gel al 12%
teñido con Coomassie y la Figura 8 (abajo) representa una
transferencia Western en los lisados celulares de los clones de
fusión nº 1 a 3 con secuencia madura de nucA de pPX693
mostrando los lisados no inducidos e inducidos, sondados con
anticuerpos policlonales de conejo. Se representa también un
segundo clon de pPX707 (secuencia con señal ompT). Banda 1-
patrones de proteína BRL de alto peso molecular con pesos
moleculares aparentes mostrados en la Figura; Banda 2 - nNucA; Banda
3 - pPX707, clon nº 2, no inducido; Banda 4 - pPX707, clon nº 2,
inducido; Banda 5 - pPX693, clon nº 1, no inducido; Banda 6 -
pPX693, clon nº 1, inducido; Banda 7 - pPX693, clon nº 2, no
inducido; Banda 8 - pPX693, clon nº 2, inducido; Banda 9 - pPX693,
clon nº 3 (nucA en orientación errónea); Banda 10 - pPX693,
clon nº 3, inducido, no mostrando ninguna inducción de la banda de
aproximadamente 68 kD; Banda 11 - pPX693, clon nº 3, inducido,
menos a una D.O._{600} de 1,7 en lugar de 1,0; Banda 12 - lisado
procedente de un cultivo de vector inducido solo (pRSETC),
referencia negativa; Banda 13 - preparación purificada de rNucA de
pPX644; Banda 14 - blanco; Banda 15 - patrones de BRL de bajo peso
molecular.
La Figura 9 representa las características del
vector pTrcHisC, junto con la señal de nucA y las secuencias
maduras parciales para mostrar los puntos de inserción en el vector
en la construcción de pPX691. Las primeras tres líneas de secuencia
en la Figura 9 representan una secuencia de nucA natural
parcial empezando en el primer ATG de la secuencia de señal (SEC.
ID nº: 22) y continuando en la secuencia madura para 78 bases. Las
dos líneas siguientes de la secuencia representan la secuencia de
codificación del vector (SEC. ID nº: 23) que abarca el punto de
restricción NcoI (que contiene el punto de iniciación ATG), la zona
poliHis, el punto de escisión de la enterocinasa y el punto BamHI
de la zona de clonación múltiple, en el vector. El plásmido contiene
lacI^{q} para reducir el activador de trc muy inducible, de modo
que la expresión se desvía (existe un nivel de referencia bajo de
fuga) hasta la inducción.
La Figura 10 (arriba) representa un gel teñido
con Coomassie y la Figura 10 (abajo) representa una transferencia
Western en lisados celulares de pPX691, pPX692 y pPX707 que son
construcciones con la secuencia con señal natural (pPX691 y 692) o
de ompT (pPX707) en diferentes vectores y cepas huésped. Se
incluyen las referencias negativas de pRSETC que es el vector para
pPX692. La banda inducida adicional (nº 9 de la izquierda) debajo
de pPX692 procede de un cultivo inducido a una D.O._{600} = 1,5
en lugar de 1,0, mostrando una disminución de la expresión de la
proteína NucA. Los lisados de pRSETC no inducidos e inducidos en
las bandas 10 y 11 proceden de un clon con nucA no
insertado, mientras que el lisado de pRSETC inducido en la banda 14
es del vector transformado en una cepa huésped similar. Bandas 1 y
15 - los patrones de peso molecular aparente son como los
relacionados en la Figura (200, 97, 68, 43 y 29 kD); Banda 2 -
proteína NucA natural (pero no estaba presente suficiente proteína
para ser observada con la coloración de Coomassie); Bandas 3 y 5 -
lisados celulares no inducidos de los clones nº 14 y nº 15 de
pPX691, respectivamente; Bandas 4 y 6 - lisados celulares inducidos
de los mismos clones de pPX691; Banda 7 - lisados celulares no
inducidos de los clones nº 11 de pPX692; Bandas 8 y 9 - lisados
celulares de los mismos cultivos pero inducidos a una D.O._{600}
de 0,9 y 1,5, respectivamente; Banda 12 - clon nº 1 de pPX707, no
inducido; Banda 13 - pPX707, clon nº 1, inducido.
La Figura 11 representa un gel Coomassie de la
expresión de las proteínas de fusión NucA PelB y OmpT. Banda 0 -
patrones de proteína de alto peso molecular coloreados previamente
con pesos moleculares aparentes como se muestra en la Figura; Bandas
1, 3, 5 y 7 - muestras de sobrenadante; Bandas 2, 4, 6 y 8 -
muestras del sedimento celular; Bandas 1 a 4 - de BL21 (DE3)
pLysS/pPX707 (OmpT-NucA); Bandas 5 a 8 - de BL21
(DE3) pLysS/pPX708 (PelB-NucA). La flecha muestra la
migración de NucA.
La Figura 12 representa un gel de
SDS-PAGE al 12% coloreado con Coomassie en los
lisados celulares de las construcciones con diferentes secuencias
con señal. Se incluye también el clon de pPX709 maduro con un TIR
optimizado y el lisado de P860295 de NTHi. El vector (pTrcHisC)
inducido solo es una referencia negativa. En esta figura el vector
no contiene ninguna secuencia de NucA. Bandas 1 y 10 - patrones de
peso molecular como anteriormente; Banda 2 - preparación purificada
de rNucA de pPX691; Banda 3 - lisado no inducido de pPX691; Banda 4
- lisado inducido de pPX691; Banda 5 - lisado inducido de pPX707;
Banda 6 - lisado inducido de pPX708; Banda 7 - lisado inducido de
pPX709; Banda 8 - lisado de P860295; Banda 9 - pTrcHisC
inducido.
La Figura 13 representa los resultados de un
ensayo con 5'-nucleotidasa en una placa TLC. Se
determinó la actividad de la nucleotidasa con células completas y
proteína NucA natural o recombinante purificada. Las reacciones
contenían las siguientes adiciones: Banda 1: 10 \mul de células
p860295; Banda 2: 5 \mul de rNucA; Banda 3: 1 \mul de rNucA;
Banda 4: 5 \mul de nNucA; Banda 5: 1 \mul de nNucA; Banda 6: no
se añadió nucleotidasa; Banda C: 1 \mul de adenosina 21,5 mM más
1 \mul de la reacción de la banda 6 (referencia para la migración
de la adenosina mostrada como A). Se muestra el frente de
disolvente.
La Figura 14 representa la inhibición de la
actividad de 5'-nucleotidasa rNucA (pPX691) por la
anti-nNucA Mab
Nt-63-34-25. La
inhibición de la actividad enzimática se representa en ausencia
(cuadrados negros) o presencia (círculos blancos) de bolas de
proteína A.
La Figura 15 representa la hibridación de la
transferencia de manchas de varios NTHi y cepas Eagan de tipo b,
así como otras especies, sondadas con una sonda marcada con dig de
420 bp de nucA. Los números 1 a 22 son los indicados en el
Ejemplo 8 más adelante.
La presente invención se refiere a una cepa y a
una proteína NucA de H. influenzae purificada. La proteína
NucA tiene la secuencia de aminoácido de los aminoácidos 1 a 603 de
la SEC. ID nº: 2. Los aminoácidos 1 a 25 comprenden el péptido con
señal. Después del tratamiento normal, la proteína NucA madura
tiene la secuencia de aminoácido de los aminoácidos 26 a 603 de la
SEC. ID nº: 2. La proteína NucA tiene un peso molecular de
aproximadamente 63.000 Daltons (63 kD) medida en un gel de
SDS-PAGE al 12%. La proteína NucA también tiene
actividad para 5'-nucleotidasa (véase Ejemplo 5) que
está inhibida por un anticuerpo monoclonal de NucA
anti-natural (Ejemplo 6).
La proteína NucA está presente en cantidades muy
pequeñas en la superficie celular de H. influenzae. NucA es
una proteína asociada a la membrana. Esta proteína se conserva muy
bien entre todas las cepas de H. influenzae ensayadas. La
invención se refiere además a péptidos de la proteína NucA que
comprenden un epítopo o epítopos de la misma. Dichos péptidos
incorporan uno o más epítopos que son inmunológicamente
inter-reactivos con uno o más epítopos de la
proteína NucA. Dichos péptidos se generan en primer lugar y a
continuación se determina la inter-reactividad.
La proteína NucA se obtiene por aislamiento del
organismo H. influenzae, por expresión del ADN recombinante o
por síntesis química. La síntesis química implica la utilización de
las químicas habituales para la síntesis en fase sólida y líquida,
en particular para la producción de péptidos de la proteína NucA
que comprende un epítopo o epítopos de la misma.
En el Ejemplo 1 más adelante se detalla un
procedimiento para el aislamiento de la proteína NucA a partir del
organismo H. influenzae. En resumen, el organismo se extrae
con KSCN, el extracto se pasa a través de dos columnas de
hidroxilapatito y se somete a SDS-PAGE. Se corta la
banda a 63 kD en el gel para obtener la proteína NucA purificada.
El Ejemplo 4 detalla dos procedimientos de purificación
alternativos. La segunda columna de hidroxilapatito se puede
sustituir por una columna MonoQ. Como alternativa, la etapa de
extracción de KSCN se sustituye por una etapa de extracción con
NaCl.
La clonación del gen que codifica la proteína
NucA no fue sencilla. El Ejemplo 2 más adelante indica las diversas
estrategias que se probaron sin éxito, así como la eventual
clonación con éxito del gen nucA que contiene la secuencia de
ADN que codifica a la proteína NucA. La clonación con éxito fue
seguida de la expresión de la proteína NucA y del secuenciado del
gen nucA. La secuencia completa de gen nucA se indica
en la SEC. ID nº: 1, nucleótidos 229 a 2037. El péptido con señal
está codificado por los nucleótidos 229 a 303. La proteína NucA
madura está codificada por los nucleótido 304 a 2037.
El Ejemplo 3 más adelante detalla la expresión de
la proteína NucA. El gen nucA completo se clonó en un vector
de expresión, pTrcHisC, de E. coli y se denominó pPX691. El
gen nucA se expresó en E. coli como proteína NucA
madura con su secuencia con señal procesada. Se produjo un cultivo
con IPTG para la expresión de la proteína NucA. Se confirmó la
expresión tanto por análisis Western como por análisis con gel
Coomassie.
La presente invención se refiere además a una
secuencia de ADN aislada y purificada que comprende una secuencia de
ADN que codifica la proteína NucA de H. influenzae, así como
a las correspondientes secuencias de ADN que codifican los péptidos
de la proteína NucA que comprende un epítopo o epítopos de la
misma.
Se utilizan una variedad de sistemas célula
huésped-vector para expresar la proteína NucA y los
péptidos de la presente invención además de los detallados en el
Ejemplo 3. El sistema vector es compatible con la célula huésped
utilizada. Las células huésped adecuadas incluyen las bacterias
transformadas con ADN de plásmido, ADN de cósmido o ADN de
bacteriófago; virus tales como los virus de vacuna y adenovirus;
levaduras tales como las células Pichia; células de insectos tales
como las células Sf9 o Sf21; o líneas celulares de mamífero tales
como las líneas de ovario de hámster chino; así como otros
organismos convencionales.
Se pueden utilizar una variedad de elementos de
transcripción y de traducción convencionales para el sistema célula
huésped-vector. El ADN de nucA se inserta en
un sistema de expresión y el activador y los demás elementos de
control están ligados en puntos específicos dentro del vector, con
el fin de que cuando el vector del plásmido se inserta en una
célula huésped, el ADN de nucA pueda ser expresado por la
célula huésped.
Se utilizan péptidos con señal heterólogos para
transportar la proteína NucA recombinante a través de la membrana
celular. El Ejemplo 3 detalla la clonación por separado corriente
arriba del gen nucA maduro de las secuencias con señal OmpT
y PelB. La expresión de la proteína NucA fue exitosa en cada una de
estas secuencias con señal.
El plásmido se introduce en la célula huésped por
transformación, transducción o transfección dependiendo del sistema
célula huésped-vector utilizado. Se cultiva a
continuación la célula huésped en condiciones que permitan la
expresión de la proteína NucA por la célula huésped.
Además de la secuencia de ADN obtenida de la cepa
P860295 de NTHi que codifica la proteína NucA (SEC. ID nº: 1), la
presente invención comprende además secuencias de ADN que, en
virtud de la redundancia del código genético, son biológicamente
equivalentes a las secuencias que codifican la proteína NucA, esto
es, estas otras secuencias de ADN se caracterizan por secuencias de
nucleótido que se diferencian de las indicadas en esta memoria, pero
que codifican una proteína o péptidos que tienen las mismas
secuencias de aminoácidos que las codificadas por la secuencia de
ADN de la SEC. ID nº: 1.
En particular, la invención contempla aquellas
secuencias de ADN que están suficientemente duplicadas de la
secuencia de SEC. ID nº: 1 de modo que permiten la hibridación con
ésta en las condiciones de hibridación de Southern estándar de gran
restricción, tales como las descritas en Sambrook et al. (3),
así como las enzimas biológicamente activas producidas por
ésta.
La presente invención comprende también
secuencias de ADN que codifican secuencias de aminoácidos que se
diferencian de los de la proteína NucA, pero que son biológicamente
equivalentes a los descritos para esta proteína (SEC. ID nº: 2). Se
puede decir que dichas secuencias de aminoácidos son biológicamente
equivalentes a las de la proteína NucA si sus secuencias se
diferencian únicamente en deleciones menores o en sustituciones
conservadoras en la secuencia de NucA, de modo que las
configuraciones terciarias de las secuencias están esencialmente
inalteradas con respecto a las de la proteína NucA.
Por ejemplo, se puede sustituir un codón para el
aminoácido alanina, un aminoácido hidrófobo, mediante un codón que
codifica otro resto menos hidrófobo, tal como glicina, o un resto
más hidrófobo, tal como valina, leucina o isoleucina. Asimismo,
pueden producirse cambios en la sustitución de un resto cargado
negativamente por otro, tal como ácido aspártico por ácido
glutámico, o un resto cargado positivamente por otro, tal como
lisina por arginina, así como los cambios basados en similitudes de
restos en su índice hidropático, puede también esperarse que
produzcan un producto biológicamente equivalente. Los cambios de
nucleótido que producen la alteración de las partes
N-terminal o C-terminal de la
molécula de proteína tampoco es de esperar que alteren la actividad
de la proteína. Cada una de las modificaciones propuestas está muy
dentro de la rutina de la experiencia en la técnica, como es la
determinación de la retención de la actividad biológica de los
productos codificados. Por lo tanto, cuando se utilizan los términos
"ADN de nucA" o "proteína NucA" en la memoria o en
las reivindicaciones, cada uno entenderá que abarca todas las
modificaciones y variaciones dichas que dan como resultado la
producción de una proteína biológicamente equivalente.
Específicamente, como se indica en el Ejemplo 9
más adelante, la proteína NucA de la presente invención puede tener
uno o más de los cambios siguientes en la secuencia de aminoácidos
de la SEC. ID nº: 2: K79E, N186K, S262G, V294A, E305Q, K327R, T337A,
D360Y, R376H ó V436I. Uno o más de estos cambios de aminoácidos
están presentes en otros genomas NTHi y en la cepa Eagan de tipo
b.
La proteína NucA y los péptidos de la proteína
NucA que comprenden un epítopo o epítopos de la misma son útiles
para la preparación de vacunas para comunicar protección a los
animales de sangre caliente contra la otitis media y la neumonía
producida por H. influenzae.
Estas composiciones de vacuna comprenden una
proteína NucA aislada y purificada de H. influenzae o un
péptido de la proteína NucA que comprende un epítopo o epítopos de
la misma, en la que la composición de vacuna produce una respuesta
inmunitaria protectora en un huésped mamífero
Las vacunas que contienen la proteína o péptidos
de NucA se pueden mezclar con diluyentes o vehículos
inmunológicamente aceptables de manera convencional para preparar
soluciones o suspensiones líquidas inyectables. Además, las vacunas
pueden incluir hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio (alumbre)
u otros adyuvantes farmacéuticamente aceptables, tales como
Stimulon™ QS-21 (Cambridge Biotech Corporation,
Worcester, MA), MPL™ (monofosforil lípido A
3-O-desacilado; RIBI ImmunoChem
Research, Inc., Hamilton, Montana), e IL-12
(Genetics Institute, Cambridge, MA).
Las vacunas de la presente invención pueden
también incluir otras proteínas de H. influenzae que son
bien conocidas en la técnica. Ejemplos de dichas proteínas son las
denominadas P6 y P4 (la última es también conocida como proteína
"e").
Las vacunas de la presente invención se
administran por inyección de manera convencional, tales como por
inyección subcutánea, intraperitoneal o intramuscular en animales
de sangre caliente, así como por administración oral y
administración intranasal, para producir una respuesta inmunitaria
activa para la protección contra la otitis media producida por
NTHi. La dosis que se ha de administrar se determina por los medios
conocidos por los expertos en la técnica. La protección puede ser
comunicada por una sola dosis de vacuna, o puede necesitar la
administración de varias dosis de refuerzo.
Normalmente, en ausencia de datos clínicos en el
hombre, la inmunización activa en un modelo de animal reconocido se
basa en predecir la eficacia de una vacuna en el hombre. Se ha
propuesto que la chinchilla proporcione un modelo animal para la
inmunización activa contra NTHi (4).
Sin embargo, los experimentos de inmunización
activa posteriores con proteínas NTHi experimentales demostraron que
la chinchilla no es un modelo aceptable (datos no publicados,
Lederle-Praxis Biologicals, West Henrietta,
N.Y.).
El modelo animal aceptado para Hib consiste en la
inmunización pasiva de ratas recién nacidas (5) junto con ensayos
con bactericidas in vitro (6). La inmunización activa no es
posible con la rata recién nacida. La rata recién nacida es
sensible a Hib durante sólo 4 a 5 días; después no es sensible.
Debido a este breve periodo de tiempo, no es posible inmunizar de
forma activa la rata recién nacida, porque la prueba con la
bacteria tendría que tener lugar más de 5 días después de la
inmunización y el animal no responde a la prueba en este periodo.
Por consiguiente, la inmunización pasiva en la rata recién nacida
proporciona el único modelo animal factible para Haemophilus,
cuando se considera conjuntamente con los datos del ensayo con
bactericida.
En la presente invención, la proteína NucA
demuestra ser una vacuna experimental viable en razón de su
actividad tanto en los estudios de inmunización pasiva en ratas
recién nacidas como en los ensayos con bactericida (tal como se
detalla en el Ejemplo 7 más adelante). En este estudio en ratas
recién nacidas, se utilizó Eagan de tipo b como cepa de prueba. Los
resultados demostraron una reducción en bacteremia en las ratas
inmunizadas pasivamente con suero de proteína NucA
anti-recombinante.
Además de las anteriores formas de administración
de la vacuna, se puede utilizar una técnica conocida de varios
modos como inmunización genética, inmunización con polinucleótido o
tecnología del ADN desnudo. La inmunización con ADN ha sido
utilizada para proteger animales de ensayo con Influenzae A
(7). En esta técnica, el ADN de nucA se utiliza en formas
tales como ADN de plásmido y ADN desnudo, y se administra al
huésped mamífero en varias formas, incluyendo por vía parenteral,
por las mucosas y mediante inoculación con cañón génico, como se
describe por ejemplo en Fynan et al. (8). En esta técnica se
pueden utilizar agentes facilitadores, tal como bupivicaína.
Se utiliza ADN de nucA para generar sondas
para su utilización como diagnóstico en la detección de H.
influenzae en muestras clínicas seleccionadas o cepas de
laboratorio. Las muestras clínicas que se analizan incluyen las
cepas clínicas, las cepas óticas y los cultivos de exudado
faríngeo. Se utilizan sondas para el diagnóstico de la meningitis,
la otitis media y la neumonía producida por Hib y NTHi,
respectivamente.
Dicha sonda es la sonda de 420 bp que abarca los
nucleótidos 416 a 835 de la SEC. ID nº: 1. Como se describe en el
Ejemplo 8 más adelante, esta sonda de 420 bp se utilizó en un ensayo
de hibridación de transferencia de manchas. La sonda era positiva
para todas las cepas de Haemophilus ensayadas, incluyendo
todas las cepas de NTHi y la cepa Eagan de tipo b. La sonda era
negativa para otras cepas bacterianas, incluyendo E. coli,
Neisseria gonorrhoeae, Helicobacter pylori, Moraxella
catarrhalis y Salmonella typhimurium. Como era de
esperar, la sonda fue positiva para la cepa E. coli que
contiene un plásmido rnucA. De este modo, las sondas de
nucA son específicas para las secuencias de nucA y
son útiles para el diagnóstico de la presencia de las cepas de H.
influenzae.
Los solicitantes depositaron muestras de la cepa
Inv\alphaF' de E. coli que hospeda el plásmido pPX691
recombinante en la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn
Drive, Rockville, Maryland 20852, U.S.A., y se le ha asignado el
número de registro 98104 de la ATCC. El plásmido pPX691 contiene una
inserción de nucA que codifica la proteína NucA que tiene la
secuencia de aminoácidos de los restos 26 a 603 de la SEC. ID nº:
2.
El material depositado en la ATCC se puede
utilizar también conjuntamente con la tecnología de modificación
genética convencional para generar secuencias biológicamente
equivalentes a la proteína NucA, incluyendo pero sin limitarse a
aquellas en las que la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos
26 a 603 de la SEC. ID nº: 2 está modificada por uno o más de los
siguientes cambios de restos de aminoácidos de los grupos
constituidos por K79E, N186K, S262G, V294A, E305Q, K327R, T337A,
D360Y, R376H ó V436I.
Los siguientes ejemplos están indicados para que
esta invención pueda ser entendida mejor. Los ejemplos son
únicamente a título de ilustración y no deben considerarse
limitativos del alcance de la invención.
Se utilizaron las siguientes cepas de H.
influenzae:
| P860295 | Cepa ótica del Children's Hospital, Pittsburgh, PA |
| P810384 | Cepa ótica del Children's Hospital, Pittsburgh, PA |
| P810568 | Cepa clínica del Children's Hospital, Pittsburgh, PA |
| P861454 | Cultivo de exudado faríngeo del Children's Hospital, Pittsburgh, PA |
| P880859 | Cepa ótica del Children's Hospital, Pittsburgh, PA |
| N1955 | Cepa clínica del Southwestern Medical Center de la Universidad de Tejas en Dallas |
| TN106 | Cepa clínica del Southwestern Medical Center de la Universidad de Tejas en Dallas |
| SH1013 | Cepa del oído de Tejas |
| SH1014 | Cepa del oído de Ohio |
| SH1015 | Cepa de sangre de Tejas |
| DL208 | Cepa clínica del Southwestern Medical Center de la Universidad de Tejas en Dallas |
| N830161E | Cepa clínica del Southwestern Medical Center de la Universidad de Tejas en Dallas |
| H305 | Cepa clínica de Pittsburgh, PA |
| Eagan | American Type Culture Collection, p. ej., 31.441 ó 53.763 de ATCC. |
| Whittier | Tipo b no encapsulado de Children's Hospital, Boston, MA |
Se utilizan las técnicas habituales de biología
molecular según los protocolos descritos en Sambrook et al.
(3).
Todas las cepas de NTHi y las cepas Eagan de tipo
b y de Whittier se cultivaron en caldo de cultivo BHI (infusión de
cerebro y corazón), se enriquecieron con 10 \mug/ml de solución
madre de hemin (0,1 g de hemin - 0,1 g de histidina -
4 ml de trietinolamina por 100 ml de solución) y 40 \mug/ml de NAD o con enriquecimiento de Fildes al 2% (Remel, Lenexa, Kansas) y 20 \mug/ml de NAD. Se incubaron los cultivos a 37ºC en agitación.
4 ml de trietinolamina por 100 ml de solución) y 40 \mug/ml de NAD o con enriquecimiento de Fildes al 2% (Remel, Lenexa, Kansas) y 20 \mug/ml de NAD. Se incubaron los cultivos a 37ºC en agitación.
Se sedimentó un cultivo celular de la cepa
P860295 de NTHi, se lavó con PBS o solución salina y se volvió a
poner en suspensión en 10 ml de KSCN 3 M - PO_{4} 0,1 M, pH 6,0,
por litro de cultivo y se agitó a temperatura ambiente (RT) durante
30 minutos. Se observaron bandas únicas (diferentes a las de las
proteínas de la membrana exterior (OMP)) cuando se introdujo el
extracto de KSCN en un gel de SDS-PAGE al 12%. Una
de estas proteínas se introdujo a aproximadamente 63 kD (véase la
Figura 1) y se purificó posteriormente como se describe más
adelante.
Se clarificó el extracto de KSCN por
centrifugación en una centrifugadora Sorvall a 8000 rpm durante 20
minutos, a continuación a 10.000 rpm durante 15 minutos en una
centrifugadora SS-34. Se pasó el sobrenadante a
través de un filtro de 0,22 \mum y se dializó frente a dos
cambios de dos litros cada uno de fosfato de sodio 0,05 M, pH 7,0.
Se cargó el extracto dializado en una columna de hidroxilapatito
(HA) de Bio-Gel™ HT (0,2 a 0,3 ml de HA por ml de
extracto) y se equilibró con fosfato 0,05 M, pH 7,0. Se lavó la
columna con aproximadamente 10 volúmenes de columna de fosfato 0,05
M, pH 7,0. Se eluyó paso a paso la proteína de 63 kD con
aproximadamente 5 a 6 volúmenes de columna de fosfato 0,3 M, pH 7,0,
seguido de un volumen similar de fosfato 0,4 M, pH 7,0. Se
agruparon las fracciones que contienen la proteína y se
concentraron en una celda con agitador Amicon utilizando la membrana
YM30 y se sedimentó la materia en partículas a 3000 rpm durante 10
minutos. Se dializó el sobrenadante frente a fosfato 0,05 M, pH
7,0, para purificación posterior sobre una segunda columna HA
(aproximadamente la mitad del volumen de la primera columna) y se
equilibró con fosfato 0,05 M, pH 7,0. Después de cargar la muestra,
se lavó la columna en primer lugar con fosfato 0,05 M, pH 7,0, a
continuación fosfato 0,3 M, pH 7,0 (aproximadamente 2 volúmenes de
columna). Se eluyó la proteína con un fosfato 0,3 M a 0,4 M,
gradiente de pH 7,0 (aproximadamente 3 volúmenes de columna). Se
recogieron las fracciones y se agruparon y concentraron todas las
que contenían la banda de 63 kD prácticamente pura (identificadas
basándose en el tamaño por un gel de SDS-PAGE).
Por último, se ultrafiltró repetidas veces 100
\mug de proteína eluida procedente de una tercera columna HA en
un Centricon 30 para sustituir el fosfato por agua esterilizada, se
precipitó con etanol y se sometió a SDS-PAGE (véase
Figura 2). Se determinó la concentración por el método de
Peterson-Lowry y se realizó el análisis de
secuenciado del aminoácido terminal. Los primeros 26 restos con
amino-terminal tienen la secuencia indicada en los
restos 26 a 51 de la SEC. ID nº: 2. Se llevó a cabo la purificación
hasta homogeneidad realizando la electroforesis de la proteína en
un gel y a continuación suprimiendo la banda de 63kD. Se
electroeluyó la proteína en la sección de gel, se precipitó con
etanol, se cuantificó, se comprobó en una SDS-PAGE y
se utilizó en el estudio de inmunogenicidad nº 1. Véase el Ejemplo
7 más adelante.
Se realizó un estudio del animal (estudio nº 1)
para determinar la inmunogenicidad de la proteína NucA. Para los
datos del estudio en el animal, véanse las Tablas 3, 5 y 6 más
adelante. Se determinaron los títulos de anticuerpo en esta
proteína. Se determinaron los análisis de la célula completa (WC) y
de bactericida (BC) en el suero. Se observó que la proteína natural,
denominada "NucA", era antigénica e
inter-reactiva entre todas las cepas analizadas por
el ensayo inmunoabsorbente con enzima ligada (ELISA) de WC. Además,
el suero tenía actividad bactericida en dos de cada cuatro cepas
heterólogas ensayadas. Por consiguiente, se consideró que la
proteína NucA era una vacuna potencial experimental. Con el fin de
generar cantidades mayores de la proteína NucA, el gen que codifica
la proteína tendría que ser identificado y clonado en primer lugar
para ser expresado de forma recombinante.
Para realizar este trabajo, se utilizaron los
siguientes reactivos y cepas: enzimas modificadoras de ADN de New
England Biolabs (Beverly, MA) o Boehringer Mannheim (Indianápolis,
IN); agarosa LE de Boehringer Mannheim; agarosa Sea Plaque™ de
punto de fusión bajo de FMC (Rockland, ME);
5'-monofosfato de adenosina y adenosina de Sigma
(St. Louis, MO); placas para TLC Si250F de J.T. Baker Chemical Co.
(Phillipsburg, NJ); kit de clonación TA, INV\alphaF' y vectores
de expresión de pRSETC y PTrcHisC de Invitrogen (San Diego, CA);
BL21 (DE3) pLysS, pET12a y pET20b de Novagen (Madison, WI); el
vector \lambda Zap™II y la cepa huésped MRF' de
XL1-Blue de Stratagene (LaJolla, CA).
Se utilizaron procedimientos normalizados de
biología molecular similares a los descritos por Sambrook et
al. (3).
Todas las cepas de NTHi y las cepas Eagan de tipo
b y de Whittier se cultivaron en caldo de cultivo BHI (infusión de
cerebro y corazón), se enriquecieron con 10 \mug/ml de solución
madre de hemin (0,1 g de hemin - 0,1 g de histidina -
4 ml de trietanolamina por 100 ml de solución) y 40 \mug/ml de NAD o con enriquecimiento de Fildes al 2% y 20 \mug/ml de NAD. Se incubaron los cultivos a 37ºC en agitación.
4 ml de trietanolamina por 100 ml de solución) y 40 \mug/ml de NAD o con enriquecimiento de Fildes al 2% y 20 \mug/ml de NAD. Se incubaron los cultivos a 37ºC en agitación.
Se digerió aproximadamente 50 \mug (100 \mul)
de P860295 con 20 unidades de enzima de restricción Tsp509I (New
England Biolabs [NEB]) en 10 \times tampón 4 (NEB) a 65ºC durante
50 minutos. Se aislaron fragmentos (4 a 10 kb) de gel en una placa
Sea (FMC) al 0,7%, se introdujo gel de agarosa a 40 V durante
aproximadamente 14 horas. Se suprimieron del gel las bandas de
tamaño apropiado, se mezclaron a 70ºC, se diluyeron con un volumen
de 1 \times TE, pH 7,5 y se extrajo con un volumen igual de fenol
caliente (entre la temperatura ambiente y 37ºC). El sobrenadante
fue cloroformo extraído para eliminar el fenol, se añadió un décimo
de volumen de acetato de sodio 3 M y se precipitó el ADN con dos
volúmenes de etanol absoluto frío. Se sedimentó el ADN, se lavó con
etanol al 70%, se secó y se volvió a poner en suspensión en 10
\mul de agua esterilizada. Diferentes cantidades de ADN se
ligaron a EcoRI digerido y se desfosforiló las ramas del vector
Zap™II de \lambda (Stratagene) a 12ºC toda la noche. El vector
\lambda Zap™II se ha diseñado para permitir la escisión in
vivo y la recirculación de las inserciones clonadas contenidas
dentro del vector para formar un fagómido que contiene la inserción
clonada. Se rellenaron las ligaduras utilizando extractos de
Stratagene y se colocaron en placas en celdas MRF' de XL1 Blue. La
eficacia de la inserción osciló entre el 90% y 95% en relación con
las placas blancas frente a las placas azules en
X-gal
(5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactopiranosido).
Las placas blancas contenían inserciones de aproximadamente 4 a 6
kb.
Se identificaron las placas del banco con
anticuerpos monoclonales y policlonales o con sondas de ADN, por
hibridación con sondas de
digoxigenina-11-dUTP
(dig-dUTP) (Boehringer Mannheim) o en reacciones de
PCR (véase más adelante).
Se colocaron en placas \lambda, aproximadamente
500 pfu, en 100 mm de TY (5 g de NaCl, 2 g de MgSO_{4}\cdot7
H_{2}O, 5 g de extracto de levadura, 10 g de Tryptona, por litro
de caldo de cultivo ajustado a pH 7,5 con NaOH, más 15 g de
agar-agar Difco) más placas de
isopropil-beta-D-tiogalactopiranosido
(IPTG) y se incubaron a 37ºC toda la noche. Se enfriaron las placas
a 4ºC durante al menos dos horas. Se hizo la transferencia de las
placas con membranas de nitrocelulosa NC™ de Schleicher &
Schuell anhidras (Keene, NH) durante 5 a 10 minutos. Se bloqueó el
filtro en 15 ml de BLOTTO al 5% (en 1 \times PBS) en placas de
Petri de 100 mm. Se añadió a veces Tween™ - 20 (0,1 - 0,3%) para
reducir el fondo a 0,1 - 0,3%. Se agitó el filtro a temperatura
ambiente durante 4 a 6 horas o a 37ºC durante una hora. Se eliminó
BLOTTO y se incubó el anticuerpo primario en BLOTTO al 5% con el
filtro a 4ºC toda la noche. Los anticuerpos primarios utilizados
fueron anticuerpos monoclonales
Nt63-34-25,
Nt63-60-14,
Nt63/2-1-45 y
Nt63/2-13-42 (generados como se
describe en el Ejemplo 7) o una mezcla de estos cuatro anticuerpos
monoclonales o suero policlonal de conejo que había sido absorbido
en cultivos celulares MRF' de XL1-Blue,
Y1090R^{-}, Y1089R^{-} e Y1088 y lisado \lambda Zap™II. Se
hicieron lavados a temperatura ambiente con 15 ml de BLOTTO al 5%
durante 5 a 10 minutos cada uno, se repitieron tres veces. Se
incubó a continuación el filtrado con anticuerpo secundario
(fosfatasa conjugada con KPL anti-ratón IgG+M nº
QJ08-1) se diluyó 1:1000 en BLOTTO al 5% \pm 0,1
- 0,3% Tween™-20 y se agitó durante una hora a temperatura
ambiente. Se lavó el filtro otra vez 3 \times 15 ml de cada 1
\times PBS + 0,1 - 0,3% Tween™-20 a temperatura ambiente durante 5
a 10 minutos. Se realizó otro lavado en 1 \times PBS. Se
equilibró el filtro a continuación en tampón de revelado (Tris 0,1
M, pH 9,5, NaCl 0,1 M, MgCl_{2} 5 mM) durante cinco minutos a
temperatura ambiente. Se colocó el filtro a continuación en la placa
de Petri conteniendo 10 ml de tampón de revelado más 45 \mul de
NBT (azul de nitro tetrazolio) y 35 \mul de BCIP (fosfato de
5-bromo-4-cloro-3-indolilo)
y se agitó para asegurarse de que el filtro se había sumergido en
el revelador. Se mantuvo a continuación en la oscuridad sobre una
superficie plana hasta que las manchas fueron lo suficiente oscuras.
Se interrumpió la reacción enjuagando el filtro en agua desionizada
varias veces y se secó en papel Whatman 3MM en la oscuridad.
Parecía existir un problema de gran reactividad
de fondo en las placas con \lambda Zap™II. Se observó que el
anticuerpo secundario era la causa principal de la fijación del
fondo. El lote nº QJ08-1 de IgG+M
anti-ratón de cabra (Kirkegaard & Perry Labs,
Gaithersburg, MD), fosfatasa alcalina conjugada, tenía el fondo más
bajo cuando se utilizó a la dilución 1:1000, entre las ensayadas.
La identificación por inmunotransferencia no proporcionó clones
positivos para NucA. Debido a la fijación no específica al fondo,
no parece prometedor más trabajo en esta dirección. Por lo tanto,
se empleó otra estrategia para tratar de retirar los clones y la
secuencia de nucA.
Se diseñaron dos sondas de oligonucleótidos
degenerados de 24 unidades a partir de la secuencia
N-terminal de la proteína NucA (véase Ejemplo 4 más
adelante) y utilizando una tabla de uso del codón de H.
influenzae recopilada con este fin. Las sondas abarcan los
aminoácidos 1 a 8 y 14 a 21 del terminal N de la proteína madura y
se denominaron P1 y P2 respectivamente:
| P1 | AAAGAAGCACCACAAGCACATAAA | (SEC. ID nº: 3) |
| P2 | ATTTTACATATTAATGATCATCAT | (SEC. ID nº: 4) |
P1 y P2 oscilaban cada uno en cuatro bases. En
P1, la A en el resto 9 puede ser una T, la A en el resto 12 puede
ser una T, la A en el resto 18 puede ser una T y la T en el resto
21 puede ser una C. En P2, la T en el resto 3 puede ser una C, la T
en el resto 9 puede ser una C, la T en el resto 12 puede ser una C y
la T en el resto 21 puede ser una C. El cebador P1 corresponde a
los nucleótidos 304 a 327 de la SEC. ID nº: 1, excepto que la G en
el nucleótido 309 es una A en este cebador. El cebador P2
corresponde a los nucleótidos 343 a 366 de la SEC. ID nº: 1,
excepto que la G en el nucleótido 348 es una A en este cebador. Los
oligos estaban marcados en el extremo 3' con
dig-dUTP según las recomendaciones del
proveedor.
Se verificaron las sondas P1 y P2 con ADN
genómico mediante hibridaciones de Southern en ADN cromosómico
P860295 digerido con EcoRI y BamHI y ADN cromosómico
XL1-BlueMRF' digerido con EcoRI. Con ADN de P860295,
solo se observó una banda con la sonda P1 aproximadamente 4 kb en el
digesto de EcoRI, mientras que se observaron dos bandas con la
sonda P2 a aproximadamente 4 kb y 1,8 kb. El digesto en BamHI del
ADN de P860295 presentaba una banda de aproximadamente 30 kb. El
ADN de XL1-BlueMRF' no
inter-reaccionó con las sondas. Se realizaron
incubaciones de prehibridación e hibridación con P1 como sonda a
53ºC; para la sonda P2, se realizaron a 45ºC. Los lavados para la
hibridación de P1 se realizaron a 48ºC; los lavados para P2 se
realizaron a 40ºC siguiendo los protocolos habituales.
Se hicieron extracciones de la placa según el
procedimiento en el manual de protocolo de Hybond-N
(Amersham). La prehibridación y la hibridación se realizaron a
42ºC, mientras que los lavados se realizaron a 45ºC para P1 y a
38ºC para P2. Se identificaron diez placas de lisado del banco,
aproximadamente 1000 pfu por placa de 100 mm utilizando P1 ó P2
como sondas. Se extrajeron 6 positivos supuestos, cinco del filtro
nº 9 (sonda P2) y uno del filtro nº 5 (sonda P1). Se guardaron
éstas y se identificaron posteriormente por PCR. Véase más adelante
en la sección de identificación por PCR.
Purificación del ADN del banco del fagos -
Se purificaron aproximadamente 5 ml de fago P860295 del banco
\lambda Zap™II a través de un gradiente en la etapa con glicerol
(9). El ADN del fago se volvió a poner en suspensión con 20 \muL
de TE (Tris-HCl, 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM) a
aproximadamente 1 ng/\muL.
Purificación del ADN - Se purificaron los
ADN directamente o a partir de geles de agarosa utilizando el
protocolo de LiCl (10) o el kit GeneClean (Bio 101 Inc.) tal como
describe el fabricante. Se aislaron mini preparaciones de ADN de
plásmido a partir de 1 ml de cultivos toda la noche utilizando el
kit Wizard mini plasmid DNA (Promega) o los procedimientos
normalizados de lisis alcalina-extracción con fenol.
Se aisló el ADN del plásmido a gran escala a partir de 100 a 500 ml
de cultivos toda la noche utilizando el kit Qiagen maxi plasmid DNA
(QIAGEN Inc.).
Secuencia del ADN parcial de nucA -
La justificación para hacer el siguiente experimento fue doble: (1)
Se construyó la librería \lambda Zap™II de NTHi a partir de un
digesto genómico parcial de Tsp509I, por consiguiente, deberían
generarse bandas por PCR de tamaño discreto al amplificar el banco
\lambda Zap™II de NTHi utilizando combinaciones de los cebadores
T3 específicos del fago (SEC. ID nº: 16) y T7 (SEC. ID nº: 8) y
cebadores P1 específicos de nucA (SEC. ID nº: 3) y P2 (SEC.
ID nº: 4) tal como se ilustra en la Figura 3; y (2) se puede hacer
que la PCR sea menos restrictiva y por lo tanto más tolerante de
los nucleótidos incompatibles con la hibridación de los cebadores.
El cebador T3 tiene la siguiente secuencia (que no corresponde a
nucA):
| T3 | ATTAACCCTCACTAAAGGGA | (SEC. ID nº: 16) |
Se realizaron dos reacciones de amplificación de
ADN, una con ADN-polimerasa de Taq (Boehringer
Mannheim) y la otra con ADN-polimerasa de PFU
(Stratagene). Los ciclos de amplificación fueron los siguientes:
desnaturalización, 95ºC durante 50 segundos; hibridación, 58ºC
durante 60 segundos; extensión, 72ºC durante 4 minutos, 30 ciclos,
y a continuación 72ºC durante 10 minutos. Se realizó la
electroforesis en una alícuota de la reacción en gel de agarosa. Se
observaron fragmentos de ADN de aproximadamente 2.000 bp y 600 bp
utilizando cebadores T3+P1 y cebadores T7+P1, respectivamente. El
cebador T7 (SEC. ID nº: 8) tiene la siguiente secuencia (que no
correspondiente a nucA):
| T7 | CGACTCACTATAGGGAGACC | (SEC. ID nº: 8) |
Se aislaron en gel los ADN tanto de
aproximadamente 600 bp como de 2.000 bp. Se intentó volver a
amplificar estos ADN, así como repetir la reacción de PCR anterior
con el ADN del banco \lambda Zap™II de NTHi. El periodo de
extensión en la reacción de PCR se redujo a dos minutos a 72ºC.
Solamente se produjo un producto por PCR, de aproximadamente 600
bp.
Se aisló en gel el ADN amplificado de
aproximadamente 600 bp, se clonó en el vector pCR™II utilizando el
kit de clonación TA tal como recomienda el suministrador
(Invitrogen); el plásmido resultante se denominó pPX640. Se
determinó la secuencia de ADN de la inserción por PCR en un
secuenciador de ADN ABI 370A utilizando trifosfatos de
didesoxinucleótidos fluorescentes y corresponde a los nucleótidos
304 a aproximadamente 840 de la SEC. ID nº: 1, con dos diferencias
de base en las posiciones dudosas de la zona P1. El nucleótido 309
es una A y el nucleótido 315 es una T. La secuencia de aminoácidos
deducida del extremo 5' de la inserción de ADN fue idéntica a la
secuencia de la proteína N-terminal de la proteína
NucA madura natural, descrita en el Ejemplo 1. Esto confirmó la
correcta clonación del gen nucA parcial.
Se obtuvieron bandas similares por PCR como
anteriormente cuando se realizó la reacción por PCR con los pares P2
y la temperatura de hibridación se redujo a 48ºC. Se amplificó una
banda de aproximadamente 1,7 kb con el par cebador de T3 y se
observó una banda de aproximadamente 600 bp con el par cebador de
T7. Estos fragmentos amplificados se clonaron igualmente en el
vector pCR™II. Se escogieron seis colonias blancas de cada una de
las ligaduras P2/T3 y P2/T7. Todas tenían inserciones cuando se
comprobaron por digestión con EcoRI. Se obtuvieron aproximadamente
600 bases y aproximadamente 1,7 kb de las secuencias a partir del
clon P1/T7 y del clon P2/T3 respectivamente. Las secuencias de
solapamiento de los dos clones eran similares, con los cambios
esperados en la zona de P2 debido a que el cebador P2 es un
oligonucleótido degenerado. El clon P1/T7 contenía las bases 5' a
536 de nucA y el clon P2/T3 empezaba corriente abajo de P1 y
continuaba durante aproximadamente 1600 bases. Las secuencias
corriente arriba y corriente abajo completas no estaban incluidas en
estos clones.
Identificación por PCR - Positivos
supuestos procedentes de inmunotransferencias (de identificación
por inmunotransferencia del banco \lambda Zap™II, véase
anteriormente) y transferencias de hibridación del oligonucleótido
(de hibridación en placa, véase anteriormente) se sometieron a
amplificación por PCR utilizando los cebadores 4101ext y 4102ext de
nucA, SEC. ID nº: 5 y 6, respectivamente. Estos cebadores se
generaron durante el secuenciado de la zona de nucA de
pPX640 y tienen las secuencias siguientes:
| 4101ext | CCAAAGTGGATATTGGTG | SEC. ID nº: 5 |
| 4102ext | CATCATAGAACTTCACATC | SEC. ID nº: 6 |
El cebador 4101ext corresponde a los nucleótidos
416 a 433 de la SEC. ID nº: 1. El cebador 4102ext corresponde al
complemento de los nucleótidos 817 a 835 de la SEC. ID nº: 1 en la
dirección opuesta.
Ninguno de los positivos supuestos de las
inmunotransferencias o de la hibridación del oligonucleótido dio la
banda de 420 bp prevista cuando se amplificó con estos dos
cebadores de nucA.
Se utilizaron los mismos cebadores de
secuenciado, 4101ext (SEC. ID nº: 5) y 4102ext (SEC. ID nº: 6) para
generar una sonda de 420 bp (véase la parte superior de la Figura
4). Inicialmente, se generaron las sondas a partir de pPX640.
Después, se prepararon todas las sondas marcadas a partir de ADN
genómico P860295. La utilización de ADN P860295 cromosómico redujo
el fondo durante la identificación de los clones de \lambda
Zap™II. Se marcó la sonda de 420 bp con dig-dUTP
utilizando una mezcla de nucleótidos no marcados y concentraciones
variables del nucleótido marcado con dig-dUTP en una
reacción de PCR con Taq ADN-polimerasa (Boehringer
Mannheim). Se utilizó ADN P860295 cromosómico como plantilla, el
cual proporcionó un fondo de cepa \lambda Zap™II reducido. Se
realizó la amplificación por PCR durante 30 ciclos, realizado cada
una a 95ºC durante 30 a 45 segundos (etapa de desnaturalización),
42 a 52ºC durante 40 a 50 segundos (etapa de hibridación) y 72ºC
durante 55 a 60 segundos (etapa de extensión). Se realizó un
comienzo en caliente en el ADN genómico a 95-98ºC
durante 2 a 5 minutos. Estas sondas de PCR se precipitaron con
LiCl-etanol y se volvieron a poner en suspensión en
SDS al 0,1%, en un volumen la mitad o igual al original, se calentó
a 37ºC durante 10 minutos para una mejor resuspensión y se almacenó
a -20ºC. Se utilizó una dilución entre 1:500 y 1:1000 de la sonda
de 420 bp en la hibridación. Se hizo una estimación de la
concentración extrayendo 1 \mul de cada dilución, 10^{-2} a
10^{-6} en una tira de membrana Hybond-N junto
con cantidades conocidas de patrón marcado e igualando las
intensidades después del revelado.
Hibridación en placa con sonda de 420 bp
Se realizaron también hibridaciones en placa utilizando una sonda
de 420 bp marcada con dig-dUTP procedente del ADN
del plásmido pPX640 (véase anteriormente) según las recomendaciones
del fabricante (membrana Hybond-N de Amersham,
dig-dUTP para marcado de sondas de Boehringer
Mannheim) y utilizando los protocolos habituales (3). Sin embargo,
esta sonda produjo mucho fondo cuando se ensayó con placas con
vector solo (\lambda Zap™II). Se identificaron y analizaron las
placas positivas potenciales procedentes del banco \lambda
Zap™II, pero no proporcionaron bandas de tamaño correcto en un
experimento de hibridación Southern.
Se sondaron más filtros del banco y un filtro de
referencia de \lambda Zap™II con una sonda de 420 bp marcada con
dig-dUTP procedente del ADN cromosómico P860295
(véase anteriormente). Se identificaron dos positivos supuestos,
junto con varios positivos cuestionables. Se seleccionaron placas y
se colocaron en placas para la identificación secundaria. El
resondado presentó unas pocas placas borrosas. Se produjeron
fagómidos y se realizaron las digestiones en los ADN. Se realizó la
hibridación Southern en los digestos y los dos positivos supuestos
presentaron alguna homología en la secuencia supuesta de nucA
(procedente de pPX643; véase más adelante). Cuando se sometieron a
amplificación por PCR con cebadores 4101ext (SEC. ID nº: 5) y
4102ext (SEC. ID nº: 6), los dos positivos no presentaron la
amplificación de la banda de 420 bp esperada. Parecía que los
clones habían limitado la homología a nucA y presentaban un
modelo de restricción diferente comparado con el clon pPX643 por
PCR.
ADN de nucA con terminal 3' - Con
el fin de obtener la secuencia de ADN tanto de los terminales 5'
como 3' del gen nucA (que no está presente en el constructo
pPX640 inicial), se utilizó la metodología de PCR inversa como se
muestra esquemáticamente en la Figura 5. El análisis de Southern del
ADN genómico de NTHi, digerido con EcoRI o EcoRV e hibridizado con
la sonda de ADN de 420 bp específica de nucA, dio los
siguientes resultados: en el ADN genómico digerido con EcoRI, se
detectaron dos bandas a aproximadamente 4,5 kb y 1,6 kb; para el
ADN digerido con EcoRV, se detectó una banda a aproximadamente 7
kb. Diluciones a la décima parte de estos ADN genómicos P860295
digeridos con EcoRI y EcoRV se ligaron a continuación utilizando T4
ADN-ligasa (NEB). Se amplificaron estos ADN
utilizando la metodología de PCR inversa con
ADN-polimerasa de Taq. Los ciclos de amplificación
fueron los siguientes: 95ºC durante 50 segundos, 52ºC durante 90
segundos, 72ºC durante 4 minutos, 30 ciclos y a continuación 72ºC
durante 10 minutos. Se hizo la electroforesis de una alícuota de la
reacción en gel de agarosa. Con el ADN ligado a EcoRI, se
utilizaron cebadores 4121fwd (SEC. ID nº: 17) GCTTTCAGCTAATGTGATTCC
y 4122ext (SEC. ID nº: 18) CATCACAGCTGCATCTGCAG para la reacción de
amplificación de ADN de nucA corriente arriba y se utilizaron
cebadores 4313ext (SEC. ID nº: 7) y 4102ext (SEC. ID nº: 6) para la
reacción de amplificación del ADN de nucA corriente abajo.
El cebador 4121fwd corresponde a los nucleótidos 669 a 689 de la
SEC. ID nº: 1. El cebador 4122ext corresponde al complemento de los
nucleótidos 551 a 570 de la SEC. ID nº: 1 en dirección opuesta. Se
utilizaron los cebadores 4122ext y 4313ext con el ADN ligado a
EcoRV tanto para la amplificación de ADN de nucA corriente
arriba como corriente abajo. Se observó un fragmento de
aproximadamente 1,3 kb para la zona corriente abajo de EcoRI de
nucA. Se observó un fragmento borroso de aproximadamente 2 kb
para el ADN digerido con EcoRV. No se observó producto de ADN por
PCR para la zona corriente arriba de EcoRI de nucA. Otros
intentos para ampliar el extremo 5' del gen nucA del ADN
genómico o del ADN del banco \lambda Zap™II de NTHi fracasaron
para producir algún producto de ADN o la secuencia de ADN que
iguale a la secuencia de nucA obtenida por otros medios. El
producto aguas abajo por PCR de aproximadamente 1,3 kb se secuenció
directamente así como se clonó en el vector pCR™II y en el plásmido
denominado pPX800. A partir de los datos de la secuencia de ADN, se
obtuvieron la secuencia del extremo 3' completa, el clon de
terminación TAA y la secuencia no codificante corriente abajo
adicional del gen nucA.
Clonación genómica del nucA
"maduro" - Para confirmar y obtener la secuencia completa
del gen nucA maduro, se realizó una reacción por PCR
utilizando cebadores de P1 degenerado (SEC. ID nº: 3) e inverso
(Rev) de 63 K (SEC. ID nº: 9) en ADN genómico P86295 no digerido.
El cebador Rev de 63 K tiene la siguiente secuencia, que es el
complemento de los nucleótidos 2095 a 2114 de la SEC. ID nº: 1 en
la dirección opuesta:
| Rev de 63K | GAAGTCTTCAAACCTAGGAC | (SEC. ID nº: 9) |
Se utilizó aproximadamente 1 \mug de ADN
genómico P860295 en una reacción de PCR que consta de Taq
DNA-polimerasa y estos dos cebadores. Se hizo la
electroforesis de una alícuota de la reacción en gel de agarosa. Se
observó el fragmento de ADN del tamaño previsto de aproximadamente
1,8 kb. Este fragmento de ADN se purificó en gel y se clonó en
pCR™II y en el plásmido denominado pPX643. Se determinó la
secuencia de ADN de nucA en pPX643 y se igualó a la
secuencia de las series de datos parciales iniciales. Este clon
contiene la secuencia de nucA maduro completa, pero está
perdiendo la zona de activador aguas arribas y la secuencia con
señal.
Secuencia corriente arriba de 5' de
nucA utilizando PCR Se hicieron varios intentos para
amplificar la zona activadora del ADN preparado a partir del banco
\lambda de P860295 utilizando los cebadores T3 y T7 acoplados a
varios cebadores de nucA diferentes de los que se habían
sintetizado durante el secuenciado de los clones P1/T7 y P2/T3.
Ninguna de estas reacciones generó el fragmento requerido. Los
intentos para amplificar esta zona por PCR inversa a partir del
fragmento de 4,3 kb de EcoRI no tuvieron tampoco éxito (véase
anteriormente). Para la PCR inversa se consideraron por lo tanto
otros fragmentos de restricción, preferentemente menores que el
fragmento de 4,3 kb,. Se realizaron transferencias de Southern en
ADN genómico P860295 utilizando la sonda cromosómica de 420 bp
marcada con dig-dUTP y las enzimas de restricción
PstI, SalI, EcoRV, BamHI, ApaI, AvaI, KpnI, SacI, SmaI, XbaI, XhoI y
enzimas ricas en AT, BglII, HindIII, NsiI, SnaBI, SspI y PacI. A
partir de estas hibridaciones, se obtuvo una cartografía de
restricción genómica limitada (véase la Figura 4).
El digesto de NsiI dio una banda aproximadamente
de 3 kb que se hibridó con la sonda de 420 bp de nucA; ésta
es una de las piezas más pequeñas identificadas. Por consiguiente,
este fragmento de 3 kb se aisló en gel a partir del digesto
genómico, se ligó y se ajustó para la PCR inversa. Se obtuvo un
fragmento de aproximadamente 2 kb en la amplificación del fragmento
de NsiI autoligado con los cebadores 4102ext (SEC. ID nº: 6) y
4313ext (SEC. ID nº: 7). El cebador 4313ext (SEC. ID nº: 7) tiene
la siguiente secuencia, que corresponde a los nucleótidos 1762 a
1779 de la SEC. ID nº: 1:
| 4313ext | GTGAGTGTTGAAGTCTTG | (SEC. ID nº: 7) |
Se secuenció el fragmento y se clonó en el vector
pCR™II. Once de cada doce colonias tenían inserciones; diez estaban
en una orientación (y se denominaron pPX679) y una estaba en la
orientación opuesta (y se denominó pPX680). El secuenciado de ADN
de la inserción en pPX680 produjo aproximadamente 1.020 bases de la
secuencia adicional corriente arriba del gen nucA maduro.
Por consiguiente, el clon contiene la zona activadora y la secuencia
con señal del gen nucA. La secuencia en la zona solapante es
compatible con la secuencia de los clones anteriores (pPX640, el
clon P2/T3 y pPX643, descritos anteriormente), confirmando que el
clon es nucA. Véase también la SEC. ID nº: 1.
Construcción de un banco de cósmidos Se
construyó también un banco de cósmidos de la forma siguiente: se
digerió parcialmente ADN genómico de P810384 y P860295 con Sau3AI
para generar fragmentos de 30 a 50 kb que se ligaron en un punto
BamHI del vector SuperCosI, plásmido construido a partir del ADN
\lambda que contiene dos puntos de integración (Stratagene). La
cepa huésped utilizada fue NM554 (Stratagene). Se identificaron las
colonias con un anticuerpo monoclonal anti-NucA
(Mab Nt63/2-13-42), anticuerpo
policlonal y sondas de ADN marcadas con dig.
Identificación por inmunotransferencia del
banco de cósmidos Mab
Nt63/2-13-42 no reaccionó bien con
la cepa P810384 en las transferencias de colonias. Por
consiguiente, se interrumpió la identificación en el banco P810384.
Se identificaron varios positivos supuestos del banco P860295. Los
positivos supuestos se listaron y se volvieron a identificar pero
eran de intensidad media. Se realizó una transferencia Western de
estos positivos (cultivos de toda la noche) y se sondaron con Mab
Nt63-34-25 que reacciona
fuertemente con NucA desnaturalizado. Sin embargo, no se observaron
bandas de NucA en las transferencias Western. Por consiguiente,
como con el banco \lambda Zap™II, se interrumpió la
identificación por inmunotransferencia del banco de cósmidos.
Hibridación de colonias en el banco de
cósmidos Asimismo, se identificó el banco de cósmidos P860295
utilizando la sonda marcada con dig de 420 bp. Esta identificación
produjo 26 positivos supuestos que se identificaron en cinco
filtros del banco. Se volvieron a identificar y solamente cuatro
eran positivos, de los cuales dos eran muy positivos. Se
seleccionaron cuatro colonias aisladas de uno de los muy positivos
y los se realizaron preparados de ADN para el análisis de Southern.
El ADN de dos colonias dio modelos de restricción de hibridación
similares con digestos de EcoRI, HindIII y ScaI&EspI, mientras
que las otras dos colonias dieron ADN de diferentes tamaños, uno
con un tamaño de inserción mayor y el otro más pequeño. Cuando se
lavó el filtro a 70ºC, las dos colonias similares dieron solamente
unión de fondo. Los otros dos clones presentaban hibridación
positiva a 70ºC y se analizaron además por PCR. Solo uno, el clon de
mayor tamaño, contenía la mayor parte del extremo 5' del gen
nucA. Durante el secuenciado de este clon de cósmido, se
observó la inserción de nucA que empieza en el punto Sau3AI,
55 bases desde el comienzo de la secuencia madura y se procedió
corriente debajo de este punto; por lo tanto, se estaba perdiendo
la secuencia de señal y 55 bases adicionales desde el extremo 5'
del gen maduro.
PCR en el banco de cósmidos Asimismo, se
amplificó el fago envasado procedente del banco de cósmido
utilizando Rev de P1 de 63 K (SEC. ID nº: 19)
CTTAATTCCACAGCTTTGTGAGC (en la que la base 18ª también podía ser A y
la base 21ª puede ser también T) y los cebadores T3 (SEC. ID nº: 7)
ó T7 (SEC. ID nº: 8) para extraer la secuencia corriente arriba. El
cebador Rev de P1 corresponde al complemento de los nucleótidos 319
a 341 de la SEC. ID nº: 1 en la dirección opuesta. Se realizaron
las reacciones con el cebador 4122ext (SEC. ID nº: 18) y los
cebadores T3 ó T7. A 42ºC, se observaron tres bandas manchadas a
aproximadamente 250, 400 y 550 bp, con los pares Rev de P1 de nucA/
T3 ó T7, todos los cuales se hibridaron con la sonda de 420 bp. No
se obtuvieron bandas con el par cebador 4122ext/T3. Se observaron
bandas similares manchadas con los cebadores 4122ext/T7. A 50ºC,
solo se obtuvo la banda de 250 bp en las cuatro reacciones. T3 ó T7
solos no dieron bandas, y el par cebador T3/T7 dio bandas muy
manchadas de aproximadamente 550 y 300 bp. Los tres productos de PCR
manchados procedentes de las reacciones de PCR de Rev de P1 de
nucA/T7 y 4122ext/T7 se purificaron a través de una columna
QIAquick™ (Qiagen, Chatsworth, CA), se eluyó con 50 \mul de agua
y 2 \mul de esto se clonó con el vector pCR™II. Cuatro de los
seis clones tenía inserciones, con tres inserciones diferentes
obtenidas del producto por PCR Rev de P1 de nucA/T7. Sin
embargo, solo se obtuvo la inserción de aproximadamente 350 bp con
el producto de PCR 4122ext/T7 (siete de cada ocho tenían la
inserción). La secuencia para el clon 4122ext/T7 corresponde a la
secuencia de nucA que comienza en el punto Sau3AI, 55 bases
desde el extremo 5' de la secuencia madura, que era similar al clon
del cósmico descrito anteriormente.
Montaje de la secuencia de nucA completa
Se montó la secuencia de nucA completa en los clones solapantes que
contienen la secuencia 5' corriente arriba, la secuencia 3'
corriente abajo y la secuencia madura parcial descrita
anteriormente. La secuencia del gen nucA completo se indica en la
SEC. ID nº: 1, nucleótidos 229 a 2037. El péptido con señal se
codifica por los nucleótidos 229-303. Los
nucleótidos 304-2037 codifican la proteína NucA
madura.
Se clonó a continuación el gen nucA y se expresó
en E. coli, ya sea como una proteína de fusión o como una
proteína NucA completa (con un péptido con señal). El gen
nucA estaba ligado en varios vectores de expresión de E.
coli como se relaciona en la Tabla 1 y los cultivos se
indujeron de forma apropiada para la expresión de la proteína NucA.
Se normalizaron los lisados celulares completos e introdujeron en
un gel de SDS-PAGE, y se tiñeron con Coomassie o se
transfierieron a una membrana de nitrocelulosa y se sondaron con
anticuerpos policlonales anti-NucA de conejo a una
dilución 1:500 en BLOTTO al 5%. Los clones se relacionan en la
Tabla 1 y se construyeron como se describe más adelante.
Se expresó una proteína de fusión que contiene la
proteína NucA más restos heterólogos clonando el gen nucA del
plásmido pPX643 en el vector de expresión pRSET (véase la Figura
6). El plásmido pPX643 contiene la secuencia completa de
nucA maduro clonada en el vector pCR™II, tal como se
describió en el Ejemplo 2. La versión seleccionada de pRSET era la
que tiene el marco de lectura denominado "C" por el
fabricante. El vector contiene el gen 10 del activador T7, el gen
de resistencia a la ampicilina y tiene el origen del ADN de ColE1
de replicación.
Construcción pPX644 - Los plásmidos pPX643
y pRSETC se digerieron con la enzima de restricción Asp718,
purificada por el método GENECLEAN, se volvieron a digerir con la
enzima XhoI y se hizo la electroforesis de los ADN en un gel de
agarosa. El fragmento de ADN que contiene el nucA de
aproximadamente 1,9 kb se aisló y se ligó al ADN aislado de pRSETC.
El clon resultante se denominó pPX644. Los transformantes de BL21
(DE3)pLysS se denominaron RZ1034.
El clon recombinante, pPX644, contiene 51
aminoácidos adicionales fusionados a la zona
N-terminal de la proteína de nucA maduro.
Estos aminoácidos adicionales son proporcionados por el vector e
incluyen seis histidinas en serie corriente abajo inmediatamente de
la metionina inicial, que ayuda a la purificación de la proteína de
fusión. Se hizo la electroforesis de los extractos celulares
completos procedentes de los cultivos inducidos que contienen este
plásmido en un SDS-PAGE y se realizó una
transferencia Western utilizando antisuero policlonal de conejo
frente a la proteína NucA. Los cultivos de toda la noche de las
cepas RZ1034 y BL21 (DE3) pLysS/pRSETC se inocularon en 10 ml de SOB
modificado (20 g de triptona, 5 g de levadura, 0,6 g de NaCl, 0,2 g
de KCl, ajustado a pH 7,0 con NaOH 5 N) más ampicilina (100
\mug/ml) en un matraz de 125 ml y se cultivaron a 37ºC hasta una
lectura del colorímetro Klett entre 126 y 155. Se extrajo una
alícuota de 1 ml de las células no inducidas, se centrifugó y se
volvió a poner en suspensión con tampón TE
(Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM) en el mismo
volumen en microlitros (\mul) como lectura Klett, es decir, una
lectura Klett de 126 significa que las células se volvieron a poner
en suspensión utilizando 126 \mul de tampón TE. Para la
inducción, se añadió IPTG al cultivo en desarrollo hasta una
concentración final de 1 mM y se continuó la incubación durante dos
horas con una lectura Klett final determinada. Se extrajo 1
mililitro y se centrifugó en un tubo Eppendorf de 1,5 ml. Se volvió
a poner en suspensión el sedimento celular en tampón TE, de nuevo
se basó en su respectiva lectura final de Klett. Se extrajeron 90
\mul de células no inducidas e inducidas en otro tubo Eppendorf,
30 \mul de 4 \times tampón de craqueo se añadió al tubo
calentado en un baño de agua hirviendo durante 10 minutos antes de
introducir 20 \mul en un gel SDS-PAGE con
gradiente 4 a 15% (Laboratorios Bio-Rad). Se
transfirieron las bandas de proteína a un papel de filtro de
nitrocelulosa y se realizó una transferencia Western utilizando
antisueros de NucA policlonal de conejo e
Ingrediente-peroxidasa anti-conejo
(Tago Inc.). Se observaron las bandas utilizando reactivo TMB
(Promega, Madison, WI). Se detectó claramente un producto de
proteína de 69 kD de tamaño previsto en la transferencia como se
muestra en la Figura 7. Esto confirmó la correcta clonación del gen
nucA. En este ejemplo, la falta de inductibilidad observada
de NucA fue supuestamente debida a la ausencia de antibiótico,
cloroamfenicol, en el medio de cultivo que se necesita para el
mantenimiento estable del plásmido pLysS (que lleva el gen de
resistencia al cloroamfenicol). Por consiguiente, la pérdida del
plásmido pLysS produce un nivel basal (no inducido) elevado de la
expresión de NucA. En un experimento por separado, la proteína NucA
de 69 kD demostró ser inducible en una transferencia Western cuando
se incluyó cloroamfenicol en el medio de cultivo (datos no
mostrados). Aunque se puede detectar la banda de proteína de 69 kD
en una transferencia Western, no se detectó en un gel de
SDS-PAGE similar teñido con Coomassie (datos no
mostrados). Sin estar ligado por lo siguiente, una posible razón
para no detectar la proteína recombinante en el gel Coomassie puede
ser debida a los 51 restos de aminoácido adicionales, codificados
por el vector en el extremo N-terminal del gen
nucA clonado en pPX644.
Se construyó un clon maduro que no mostró un
nivel de expresión visible en un gel Coomassie utilizando un
enfoque de fusión ligeramente diferente. Este clon, denominado
pPX693, se construyó de la forma siguiente:
Construcción de pPX682 - Se amplificó por
PCR el gen nucA procedente del ADN genómico P860295 utilizando
cebador RSET-5 (SEC. ID nº: 15), que tiene la
siguiente secuencia cuyas 17 últimas bases corresponden algo a los
nucleótidos 304 a 320 de la SEC. ID nº: 1 (el cebador se basó en la
secuencia de pPX643 que se generó utilizando el cebador P1
degenerado):
| RSET-5 | GCTACGGCTAGCAAAGAAGCACCTCAAGC (SEC. ID nº: 15) |
y el cebador de RBam de 63 K (SEC.
ID nº: 13). (RSET-5 se diseñó para incluir un punto
BamHI en el extremo 5' para facilitar la transferencia del fragmento
nucA, al vector de expresión pRSET; véase más adelante). El
fragmento de ADN amplificado se clonó en el vector pCR™II y se
denominó pPX682. Esta construcción codifica la NucA de longitud
madura.
Construcción de pPX693 - El fragmento
BamHI de nucA de pPX682 se ligó en el punto BamHI del vector
de expresión pRSETC y el plásmido resultante se denominó pPX693.
Esto produjo un clon que expresó una fusión de NucA con 38
aminoácidos adicionales en su N-terminal. Durante la
escisión con enterocinasa, se eliminaron todos los aminoácidos
menos cinco. El vector pRSETC contiene también una zona poliHis que
permitió la purificación de la proteína de fusión sobre una columna
de níquel antes de la escisión por la enterocinasa. Cuando se
transformó el clon pPX693 en la cepa BL21 (DE3)pLysS de E.
coli y produjo IPTG, presentaba un nivel de expresión
significativo que fue detectable en los geles coloreados con
Coomassie. La Figura 8 demuestra que fue la banda de proteína
principal en el lisado celular. Sin embargo, durante el crecimiento
de un cultivo mayor para purificación de proteínas, la expresión fue
indetectable mediante tinción con Coomassie. Se observó que el
plásmido no se mantenía estable en la cepa de expresión.
Posteriormente se obtuvieron otros clones con niveles de expresión
aceptables, por eso no se emprendió más trabajo para estabilizar
pPX693.
Secuencia con señal natural Una vez
obtenida la secuencia corriente arriba del clon pPX680 (producto de
PCR inversa NsiI de aproximadamente 2 kb clonado en el vector
pCR™II, mencionado en el Ejemplo 2), se utilizaron los cebadores
NdeF63K y NcoF63K para amplificar el gen nucA natural
completo procedente del ADN P860295 genómico. El producto de PCR se
clonó en dos vectores de expresión diferentes, pRSETC y pTrcHisC
(Figura 9). Estos vectores se han maximizado para la expresión
utilizando activadores fuertes que son inducibles por IPTG. Los
plásmidos pPX685, pPX688, pPX691 y pPX692, mencionados en la Tabla
1, se construyeron de la forma siguien-
te:
te:
Construcción de pPX685 - Se clonó el gen
nucA completo por amplificación por PCR en el genoma de P860295. Los
cebadores utilizados fueron NdeF63K y RBam de 63 K. El cebador
NdeF63K es la SEC. ID nº: 1, nucleótidos 229 a 255 con un punto NdeI
unido al extremo 5' para transferir este último en pRSETC. El
producto de la PCR, clonado en el vector pCR™II, se denomina
pPX685.
Construcción de pPX692 - La subclonación
de la secuencia completa de nucA procedente de pPX685 en
pRSETC produjo pPX692. Específicamente, se digerió pPX685 con NdeI
y BamHI, se aisló el fragmento de nucA completo y se ligó en
pRSETC que también se había digerido con NdeI y BamHI. El plásmido
resultante se denominó pPX692. Cuando pPX692 se transformó en la
cepa BL21 (DE3)pLysS de E. coli y se indujo con IPTG
1 mM, se obtuvo un nivel de Coomassie similar de proteína NucA
(véase Figura 10) en comparación con pPX693 (véase Figura 8).
Construcción de pPX688 - Se clonó el gen
nucA completo del ADN P860295 genómico utilizando PCR y los
cebadores NcoF63K y RBam de 63 K. El cebador NcoF63K es la SEC. ID
nº: 1, los nucleótidos 229 a 255 con un punto NcoI y una pocas bases
más para el ajuste del marco de traducción se unieron al extremo 5',
específicamente las bases ACCATGGGT, para la subclonación posterior
en pTrcHisC. El producto de PCR se clonó en el vector pCR™II y el
plásmido resultante se denominó pPX688. El conectador NcoI añadió
dos aminoácidos a la zona de partida N-terminal de
la secuencia con señal.
Construcción de pPX691 - La subclonación
de la secuencia completa de nucA procedente de pPX688 en
pTrcHisC (véase la Figura 9) produjo pPX691. Específicamente, se
digerió pPX688 con NcoI y BamHI, se aisló el fragmento de
nucA completo y se ligó a continuación en pTrcHisC que
también se había digerido con NcoI y BamHI. Cuando pPX691 se
transformó en la cepa Inv\alphaF' de E. coli y se indujo
con IPTG +1 mM, se obtuvo un nivel de Coomassie similar de proteína
NucA (véase Figura 10) en comparación con pPX693 (véase Figura 8).
El punto de restricción NcoI añadió dos restos al comienzo de la
secuencia de señal natural, que pareció no afectar el tratamiento de
la secuencia de señal de NucA, como se muestra en la Figura 10. El
peso molecular aparente de la proteína expresada parece ser
aproximadamente 63 kD para una proteína tratada, en lugar de 66 kD
para una proteína sin tratar. La banda a aproximadamente 63 kD
parece ser la banda de la proteína principal en el gel teñido con
Coomassie. Durante la purificación y el análisis de la secuencia de
aminoácidos, se demostró que estaba tratado. Véase el Ejemplo 4 en
el secuenciado de la proteína.
Se cultivó el plásmido pPX691 en un cultivo de 2
L para la purificación junto con pPX693 (proteína de fusión). Sin
embargo, se observó que pPX693 no se mantenía estable en el huésped
BL21 (DE3)pLysS, mientras que pPX691 se mantenía estable en
los huéspedes DH5\alpha ó Inv\alphaF'. Se seleccionó el plásmido
pPX691 por ser el clon de selección para la purificación de la
proteína de rNucA. El estudio de estabilidad en pPX692 no se
realizó, ya que su expresión no fue mejor que la de pPX691. Véase
la Figura 10.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Aunque la secuencia de la señal de nucA
codificada por Haemophilus parecía permitir una buena
expresión de rNucA en E. coli, así como procesarse
correctamente (es decir, la eliminación de la secuencia con señal),
se probaron dos vectores de expresión de E. coli disponibles
en el comercio, que contienen diferentes secuencias de señal. PelB
(pPX708 [preparado a partir de pPX705] en el vector pET20b,
Novagen) y OmpT (pPX707 [preparado a partir de pPX706] en el vector
pET12a, Novagen) se clonaron por separado corriente arriba del gen
nucA maduro de la forma siguiente:
Construcción de PelB - Se amplificó por
PCR el gen nucA procedente de pPX643 utilizando cebadores
PelB de 63 K (SEC. ID nº: 12), que tiene la siguiente secuencia
cuyas 17 últimas bases corresponden algo a los nucleótidos
304-320 de la SEC. ID nº: 1 (el cebador estaba
basado en la secuencia de pPX643 que se generó utilizando el
cebador P1 degenerado):
| PelB de 63 K | GATATCAAAGAAGCTCCTCAAGC | (SEC. ID nº: 12) |
y RBam de 63 K (SEC. ID nº: 13),
que tiene la secuencia siguiente, cuyas 21 bases últimas son el
complemento de los nucleótidos 2095 a 2115 de la SEC. ID nº: 1 en
dirección
inversa:
| RBam de 63 K | CGCGGATCCTGAAGTCTTCAAACCTAGGAC | (SEC. ID nº: 13) |
La banda de ADN de la PCR que contiene
nucA de aproximadamente 1,8 kb, se aisló en gel, se clonó en
pCR™II y el plásmido resultante se denominó pPX705.
Construcción de pPX708 - Se digerieron
ambos plásmidos pPX705 y pET20b con EcoRV y BamHI, se hizo la
electroforesis de los ADN en un gel de agarosa y se aislaron las
bandas de ADN correctas. Se ligaron conjuntamente los ADN y el
plásmido resultante se denominó pPX708. Los transformantes BL21
(DE3)pLysS se denominaron RZ1070.
Construcción de OmpT - Se amplificó por
PCR el gen nucA procedente de pPX643 utilizando cebadores
OmpT de 63 K (SEC. ID nº: 14), que tiene la siguiente secuencia
cuyas 17 últimas bases corresponden algo a los nucleótidos
304-320 de la SEC. ID nº: 1 (el cebador estaba
basado en la secuencia de pPX643 que se generó utilizando el
cebador P1 degenerado):
| OmpT de 63 K | GGATCCAAAGAAGCTCCTCAAGC | (SEC. ID nº: 14) |
y RBam de 63 K (SEC. ID nº: 13). La
banda de ADN de la PCR que contiene nucA de aproximadamente
1,8 kb, se aisló en gel, se clonó en pCR™II y el plásmido
resultante se denominó
pPX706.
Construcción de pPX707 - Se digerió el ADN
del vector pET12a con enzima BamHI, se trató con fosfatasa alcalina
del intestino de ternero (Boehringer Mannheim), se realizó la
electroforesis en un gel de agarosa y se aisló el ADN. Se digerió
el plásmido pPX706 con enzima BamHI, se realizó la electroforesis en
gel de agarosa y se aisló en gel el fragmento de ADN que contiene
nucA de aproximadamente 1,8 kb. Se ligaron conjuntamente los
ADN aislados en gel tanto del pET12a como del pPX706 y el plásmido
resultante se denominó pPX707. Los transformantes de BL21
(DE3)pLysS se denominaron RZ1065.
Expresión de PelB-NucA y
OmpT-NucA Se inoculó 1 ml de cada uno de los
cultivos de toda la noche de RZ1065 (pPX707: clon OmpT-nucA)
y RZ1070 (pPX708: clon PelB-nucA) en 20 ml de SOB más
cloroamfenicol (30 \mug/ml) más ampicilina (100 \mug/ml) en un
matraz de 125 ml y se cultivaron a 37ºC hasta D.O._{600} = 1,0 -
1,3. Se transfirieron 10 ml del cultivo a otro matraz de 125 ml y
se añadió IPTG hasta una concentración final de 1 mM. Ambos cultivos
no inducido e inducido se cultivaron a 37ºC durante otras dos
horas. Se extrajo 1 ml de cada uno de los cultivos y se centrifugó
en un tubo Eppendorf de 1,5 ml para sedimentar las células. Se
recogieron los sobrenadantes de los cultivos inducidos. Se
volvieron a poner en suspensión los sedimentos celulares con 0,6 a
1,6 ml de PBS hasta D.O._{600} de aproximadamente 1,0. Se volvió a
centrifugar 1 ml de las células resuspendidas y se volvió a poner
en suspensión con 60 \mul de H_{2}O. A 60 \mul de las células
resuspendidas o 60 \mul de sobrenadante se añadió 20 \mul de 4
\times tampón de craqueo y se calentó el tubo en un baño de agua
hirviendo durante cinco minutos. Se realizó la electroforesis de
veinte \mul de cada muestra en gel SDS-PAGE al 12%
y se tiñó con azul de Coomassie. Se detectaron ambas proteínas de
fusión NucA OmpT y PelB y eran de tamaño correcto para una proteína
procesada (Figura 11). El rendimiento de la expresión de la
proteína de fusión NucA de PelB fue aproximadamente 30% de la
proteína celular total, que era comparable con la expresión de NucA
completa (pPX691 con señal natural; véase la Figura 12 más
adelante).
La Figura 12 presenta una comparación de la
expresión de varios clones con secuencia de señal y también de un
clon de fusión maduro, pPX709, con una secuencia (11) con la zona
de iniciación de la traducción (TIR) optimizada. Se construyó el
clon pPX709 a partir del clon pPX677 de la forma siguiente:
Construcción de pPX677 - Se digerió el
plásmido pRSETC con la enzima NheI, se extrajo con fenol, se
precipitó con etanol y se volvió a digerir con la enzima de NdeI.
Se realizó la electroforesis del ADN en un gel de agarosa y se
aisló el gel con la banda de ADN. Se construyó el conectador
Nhe1+Nde1 hibridando el oligo de cabeza RSET.TIR (SEC. ID nº: 10),
que tiene la secuencia siguiente (que no se corresponde con
nucA):
| parte superior de RSET.TIR | TATGGCTATGTCTAACATGACTTACAAACATCATCAT | |
| CATCATCATGGTATGG | (SEC. ID nº: 10) |
hasta el oligo de la parte inferior
de RSE.TIR (SEC. ID nº: 11) que tiene la siguiente secuencia (que
no se corresponde con
nucA):
| parte inferior de RSET.TIR | CTAGCCATACCATGATGATGATGATGATGTTTGTA | |
| AGTCATGTTAGACATAGCCA | (SEC. ID nº: 11) |
Este conectador se ligó al ADN purificado en
pRSETC y digerido con NheI+NdeI y el plásmido resultante se denominó
pPX677.
Construcción de pPX709 - Se digerió el
plásmido pPX677 con BamHI, se trató con fosfatasa alcalina del
intestino de ternero (Boehringer Mannheim), se realizó la
electroforesis en un gel de agarosa y se aisló el ADN. Se digerió el
plásmido pPX693 con BamHI, se realizó la electroforesis en gel de
agarosa y se aisló el ADN. Se ligaron conjuntamente los ADN
aislados y el plásmido resultante se denominó pPX709. Los
transformantes de BL21 (DE3)pLysS se denominaron RZ1076.
El clon de pPX691 (secuencia natural con señal) y
la referencia con vector solo se indujeron a una D.O._{600} de
0,8 a 0,9 con IPTG 1 mM durante una hora. Los clones de pPX707
(señal de OmpT), pPX708 (señal de PelB) y pPX709 (TIR) se indujeron
a una D.O. de aproximadamente 1,0 durante dos horas. Todos los
cultivos se normalizaron a una D.O. de aproximadamente 1,0 y se
cargaron volúmenes iguales en el gel. Se cultivó P860295 durante
aproximadamente 3,5 horas a una D.O. de aproximadamente 1,6, a
continuación se normalizaron a aproximadamente 1,0. El pPX691
inducido y el pPX708 inducido presentaban definitivamente una banda
de NucA intensa; de hecho, parecía que era la banda de la proteína
principal. Sin embargo, pPX707 y pPX709 no produjeron una banda
inducida de NucA clara. Esto demuestra que no todas las secuencias
con señal o los vectores de expresión "optimizados" producen
un alto nivel de proteína NucA inducida.
Preparación del extracto celular completo
Se pusieron en suspensión bacterias completas (aproximadamente 70 g
de peso húmedo de NTHi) en 200 ml de fosfato de potasio (KPO_{4})
0,1 M/KSCN 3,0 M (pH 6,0) y se agitó a temperatura ambiente durante
60 minutos hasta la extracción de la proteína nNucA. Se eliminaron
los residuos celulares por centrifugación a 8.000 rpm utilizando
una centrifugadora GS-3 de Sorvall durante 20
minutos a 4ºC. Se recogió el sobrenadante y se clarificó
posteriormente por centrifugación a 60.000 rpm utilizando una
centrifugadora 70Ti de Beckman durante 60 minutos a 4ºC. Se recogió
el sobrenadante y se dializó toda la noche la 4ºC frente a
NaPO_{4} 50 mM (pH 8,0).
Cromatografía en columna Se cargó el
extracto celular completo dializado en una columna cerámica de
hidroxiapatito (HA) de 25 ml (80 \mum de Bio-Rad)
equilibrada en NaPO_{4} 50 mM (pH 8,0). Se eluyó la proteína
ligada en una etapa con NaPO_{4} 0,2 M, seguida de un gradiente
lineal de NaPO_{4} (NaPO_{4} 0,2 a 0,5 M). Se identificaron las
fracciones para nNucA mediante SDS-PAGE y análisis
Western y se agruparon las fracciones positivas. Se realizó la
etapa HA tres veces con tres preparaciones de extracto celular
completo independientes. La NucA natural de cada una de las tres
series de HA se agrupó y se concentró aproximadamente siete veces
utilizando una celda agitada Amicon con una membrana PM10. Se
dializó el concentrado de HA toda la noche a 4ºC frente a dos
cambios de 2 L de Tris-HCl 50 mM/EDTA 1 mM (pH 9,0).
Se cargó el material en una columna MonoQ HR5/5 (Pharmacia)
equilibrada en Tris-HCl 50 mM/EDTA 1 mM (pH 9,0).
Se eluyó la proteína ligada con un gradiente lineal de NaCl (NaCl 0
a 1,0 M en Tris-HCl 50 mM/EDTA 1 mM (pH 9,0)). Se
identificaron las fracciones para nNucA mediante
SDS-PAGE y se agruparon. Se aisló un total de 2,5 mg
de nNucA purificada procedente de aproximadamente 70 g de peso
húmedo de células NTHi. La proteína NucA natural purificada
utilizando este protocolo presenta una sola banda en un gel de
SDS-PAGE correspondiente a una masa molecular de
aproximadamente 63.000 Daltons.
Extracción en NaCl de nNucA Se utilizó el
protocolo de extracción siguiente para la proteína nNucA como
alternativa a la extracción por KSCN. Se pusieron en suspensión
bacterias (aproximadamente 37,5 g de peso húmedo de NTHi) en 150 ml
de NaPO_{4} 50 mM (pH 7,0) y se destruyeron mediante tres pasos a
través de una celda de presión French a 1.000 psi. Los desechos
celulares y las membranas se sedimentaron por centrifugación a
55.000 rpm utilizando una centrifugadora 70Ti de Beckman durante 20
minutos a 4ºC. Se volvió a poner en suspensión el sedimento en 132
ml de HEPES 10 mM, NaCl 1,0 M (pH 7,5) y se agitó a 4ºC durante 20
minutos para extraer la proteína nNucA. Los residuos celulares y las
membranas se eliminaron por centrifugación a 60.000 rpm utilizando
una centrifugadora 70Ti de Beckman durante 60 minutos a 4ºC. Se
recogió el sobrenadante y se dializó toda la noche a 4ºC frente a
NaPO_{4} 50 mM (pH 8,0). Se realizaron las etapas posteriores de
cromatografía de HA y MonoQ descritas anteriormente para la
proteína natural NucA. Los rendimientos de nNucA utilizando la
extracción con NaCl fueron comparables a los obtenidos por el otro
procedimiento descrito anteriormente.
Preparación del extracto en bruto Para la
purificación de la proteína rNucA se desarrolló un procedimiento
utilizando la lisis celular mediante el paso a través de una celda
de presión French y dos etapas cromatográficas. Se pusieron en
suspensión bacterias (aproximadamente 30 g de peso húmedo de
Inv\alphaF'/pPX691 de E. coli) en 80 ml de
Tris-HCl 50 mM/EDTA 1 mM (pH 8,0) y se destruyeron
mediante tres pasos a través de una celda de presión French a 1.000
psi. Los desechos celulares y las membranas se sedimentaron por
centrifugación a 55.000 rpm utilizando una centrifugadora 70Ti de
Beckman durante 20 minutos a 4ºC. Se recogió el sobrenadante y se
dializó toda la noche a 4ºC frente a dos cambios de 4 L de
Tris-HCl 50 mM/EDTA 1 mM (pH 8,0).
Cromatografía en columna Se cargó el
sobrenadante del extracto en bruto dializado en una columna de
intercambio iónico Fractogel™ con 50 ml de trimetilaminoetilo
(TMAE) (EM Separations Technology) equilibrada en
Tris-HCl 50 mM/EDTA 1 mM (pH 8,0) a temperatura
ambiente. La mayoría de las proteínas contaminantes se ligaron en
la columna. Se recogió el flujo a través de la columna, conteniendo
proteína rNucA así como varias proteínas contaminantes y se dializó
toda la noche a 4ºC frente a HEPES 20 mM/EDTA 1 mM (pH 7,0). Se
cargó el material a continuación en una columna de intercambio
iónico MonoS HR10/10 (Pharmacia) equilibrada en HEPES 20 mM/EDTA 1
mM (pH 7,0) que se une a la proteína NucA. Se eluyó la proteína
ligada con un gradiente lineal de NaCl (NaCl 0 a 1,0 N en HEPES 20
mM/EDTA 1 mM (pH 7,0)). La mayoría de rNucA se eluyó a
aproximadamente NaCl 0,4 M. Se identificaron las fracciones para
rNucA por SDS-PAGE y se agruparon. Se aisló un total
de 80 mg de rNucA purificada de aproximadamente 30 g de peso húmedo
de células. La proteína rNucA purificada utilizando este protocolo
presentaba una sola banda en un gel de SDS-PAGE
correspondiente a una masa molecular de aproximadamente 63.000
Daltons.
Para el análisis de la secuencia de aminoácidos
de la proteína natural, se precipitaron aproximadamente 250 \mul
de la muestra que contiene 100 \mug de proteína purificada con
etanol al 90% durante 30 minutos a 0ºC, seguido de centrifugación en
una microcentrifugadora. Se volvió a poner en suspensión el
sedimento en ácido acético al 20% y se sometió al análisis de la
secuencia de aminoácido con terminal amino. Para la proteína
recombinante, se añadió 80 \mul de la muestra que contiene 80
\mug de rNucA a un cartucho de ProSpin (Applied Biosystems,
Foster City, CA) y se centrifugó. Se eliminó la membrana de
difluoruro de polivinilideno (PVDF) que contiene la muestra y se
lavó con metanol al 20%. Se sometió la membrana al análisis de la
secuencia de aminoácidos con terminal amino.
Se realizó el análisis de la secuencia de
aminoácidos con terminal amino utilizando un secuenciador de
proteína/péptido modelo 477A de Applied Biosystems equipado con un
analizador en línea modelo 120A PTH (Applied Biosystems). Después
de la escisión de cada terminal amino sucesivo, el derivado de
anilinotiazolinona formado se transformó en el derivado de
feniltiohidantiona (PTH) más estable por tratamiento con ácido
trifluoracético al 25% (TFA) a 64ºC durante 20 minutos. Se
separaron los derivados de PTH y se identificaron en un analizador
PTH por HPLC en fase inversa utilizando una columna Brownlee PTH
C-18 (tamaño de partícula 5 mm, diámetro interno
2,1 mm \times 22 cm de longitud; Applied Biosystems) con un
sistema de gradiente de dos disolventes según las instrucciones del
fabricante.
Para la proteína natural, se identificaron de
forma no ambigua los primeros 26 residuos (SEC. ID nº: 2, restos 26
a 51) excepto para un pico adicional no identificado en el resto 1.
Para la proteína recombinante, 18 de los primeros 19 restos (SEC.
ID nº: 2, restos 26 a 44), se identificaron de forma no ambigua.
Ambos restos 1 y 2 contenían un pico adicional no identificado y el
resto 13 (SEC. ID nº: 2, resto 38) no se pudo identificar. La
coincidencia de la secuencia con terminal amino de la proteína NucA
recombinante con la de la proteína natural indicó idéntico
tratamiento después de la traducción de la secuencia de señal en la
proteína expresada en E. coli a éste en
Haemophilus.
Las ectoenzimas se definen como proteínas con
membrana intrínseca con sus puntos catalíticos en la superficie
extracelular de la membrana (12). Una clase de ectoenzimas es la
ecto-fosfohidrolasa
(5'-nucleotidasa). Existen muchos artículos que
tratan de las 5'-nucleotidasas tanto bacterianas
como de mamíferos, presentando cada uno diferentes reactividades
del sustrato. La enzima 5'-nucleotidasa de mamífero
utiliza AMP (nucleótido de monofosfato de adenosina) como un
sustrato que produce A (nucleósido de adenosina) y P (fosfato)
mientras que las enzimas bacterianas pueden utilizar ATP
(nucleótido de trifosfato de adenosina), ADP (nucleótido de
difosfato de adenosina) y AMP, así como también otros
nucleótidos.
Uno de los primeros informes que estudia la
proteína 5'-nucleotidasa de E. coli sugirió
que estaba situada en el espacio periplasmático de la membrana
celular y que esta proteína era única porque tenía actividad tanto
de azúcar hidrolasa como de mononucleotidasa (13; 14). Un estudio
posterior de Burns y Beacham (15) presentó un análisis de la
secuencia de nucleótido y la secuencia de la proteína
N-terminal del gen de
5'-nucleotidasa de E. coli maduro, ushA.
Basándose en la secuencia de la proteína y en la secuencia del gen
de ADN, la proteína UshA contiene una secuencia con señal que se
elimina proteolíticamente en la proteína madura. El peso molecular
de la proteína madura previsto es de 58 kD.
Las cepas de Vibrio y
Photobacterium luminosas marinas contienen una membrana
ligada a la enzima 5'-nucleotidasa específica (16).
La bacteria Vibrio parahaemolyticus marina holófila codifica
un gen de 5'-nucleotidasa denominado nutA (17). El
gen nutA se ha clonado, secuenciado y expresado en E. coli.
La enzima 5'-nucleotidasa puede ser una lipoproteína
insertada en la membrana externa. La actividad de
5'-nucleotidasa se ha detectado también en la
bacteria gram positiva Bacillus subtilis (18).
Una comparación de aminoácidos de
5'-nucleotidasa del hígado de rata,
5'-nucleotidasa de E. coli (UshA) y 2',
3'-fosfodiesterasa cíclica presentó una zona de
homología notable, lo que sugiere que este dominio puede estar
implicado en la actividad catalítica y/o en la unión del sustrato
(19). Otra comparación de varias secuencias de
5'-nucleotidasa, de rata, humana, UshA, NutA y
NucA, pusieron de manifiesto dos zonas homólogas muy fuertes. Estas
zonas se extienden a los aminoácidos 119 a 152 de la secuencia de
NucA de la SEC. ID nº: 2. Por ejemplo, la homología completa de la
secuencia de aminoácidos de NucA con la secuencia de aminoácidos de
la nucleotidasa humana está presente en los restos 124 a 130 y 148
a 151 de la SEC. ID nº: 2. Aunque el grado general de homología
entre NucA y las proteínas de la nucleotidasa humana es muy pequeño
y se limita principalmente a estas zonas descritas anteriormente
con cuatro o más aminoácidos homólogos consecutivos, la delección
de una de las dos o de ambas zonas debería reducir cualquier
interreactividad inmunitaria potencial de una vacuna que contiene la
proteína NucA.
Se realizó una investigación en una proteína
mediante el servicio por E-mail NCBI BLAST
utilizando la secuencia del gen nucA. La investigación
sugiere alguna homología limitada de aminoácidos con los conocidos
precursores de 5'-nucleotidasa en todas las
especies, es decir, humano, de rata y E. coli. Se efectuó la
alineación de la proteína de Lipman-Pearson
(ADNStar) comparando la proteína NucA con una proteína de
nucleotidasa de rata. Se determinó un índice de similitud de 33,0
comparando NucA (aminoácidos 36 a 333) con la nucleotidasa de rata
(aminoácidos 30 a 329). Se realizó un ensayo de liberación de
5'-nucleósido inicial utilizando las condiciones de
la reacción de 5'-nucleotidasa de rata como describe
Ikehara et al. (20) para determinar si la proteína NucA
posee la actividad de 5'-nucleotidasa.
Un 5'-nucleótido tal como AMP es
un sustrato polar que no migrará a una placa de TLC cuando se añada
un disolvente tal como metanol/cloroformo. Una nucleotidasa
escindirá el grupo fosfato, dejando la adenosina que es menos polar.
La adenosina migrará a la placa en presencia de metanol/cloroformo.
De este modo, una mancha de TLC que haya migrado significa que una
nucleotidasa ha escindido el AMP.
Se centrifugó una décima de ml de células P860295
de NTHi, se lavó con tampón PBS y se volvió a poner en suspensión
con 10 \mul de PBS. Las concentraciones de proteína rNucA y nNucA
purificadas fueron de 200 \mug/ml. Se realizaron reacciones con
5'-nucleotidasa (100 \mul) en tubos Eppendorf de
1,5 ml, conteniendo cada uno Tris-HCl 0,1 M, pH
7,5, MgCl_{2} 5 mM, KCl 0,1 M, AMP 5 mM, con o sin células o
proteínas añadidas. Se incubó cada tubo a 37ºC durante 60 minutos.
Se salpicó 2 \mul de la reacción en una placa fluorescente de TLC
con sílice y se eluyó con metanol al 20% en cloroformo. Se observó a
continuación la placa utilizando una onda corta, 254 nm, fuente de
UV. Como se muestra en la Figura 13, tanto la proteína NucA
recombinante como la natural purificada, así como las células
P860295, presentaban actividad de
5'-nucleotidasa.
Análisis de liberación de fosfato En un
análisis con 5-nucleotidasa más cuantitativo, se
determinó colorimétricamente el fosfato inorgánico liberado en la
hidrólisis de 5'-nucleótidos utilizando una
modificación del método de Chen et al.(21). Las mezclas de
reacción contenían Tris-HCl 100 mM (pH 9,0),
MgCl_{2} 6,6 mM, 5'-AMP 1,65 mM (u otro sustrato
de nucleótido) y enzima en un volumen final de 750 \mul. Se
incubó la mezcla de reacción a 37ºC durante 30 minutos y se
interrumpió la reacción con adición de 250 \mul de TCA al 20%. Se
realizaron controles para cada reacción en los que se añadió enzima
después de la adición de TCA al 20%. Se separó la proteína
precipitada por centrifugación y se extrajeron 200 \mul de
sobrenadante en un tubo de ensayo reciente. Se añadió 100
microlitros de HCl 1,0 M, seguido de la adición de 750 \mul de
reactivo de molibdato amónico (3,0 ml de ácido ascórbico al 10% más
18 ml de molibdato amónico 3,4 mM en H_{2}SO_{4} 1 N) y se
incubó la mezcla a 37ºC durante 30 minutos. Después de dejar
enfriar los tubos a temperatura ambiente, se determinó la
absorbancia a 650 nm. Una unidad de actividad de
5'-nucleotidasa se define como la cantidad de
enzima que produce un cambio de absorbancia de 1,0 a 650 nm
min^{-1} a 37ºC.
pH óptimo El pH óptimo para la hidrólisis
de 5'-AMP se observó que estaba comprendido entre
8,5 y 9,0 (datos no mostrados); sin embargo, no se examinaron pHs
por encima de 9,0.
Efecto del Mg^{++} Se ha demostrado que
los cationes divalentes, en particular Mg^{++}, estimulan o en
algunos casos son un requisito absoluto para la actividad de
5'-nucleotidasa tanto en los sistemas procarióticos
como eucarióticos (16). Se demostró también que la proteína rNucA
se estimulaba por adición de MgCl_{2}. La adición de MgCl_{2}
hasta 6,6 mM, produce una estimulación aproximadamente doble de la
actividad enzimática (datos no mostrados).
Especificidad del sustrato Se demostró que
la 5'-nucleotidasa de rNucA presenta un perfil de
especificidad del sustrato relativamente amplio. Se demostró que la
enzima hidroliza una variedad de nucleótidos de
5'-mono, di y tri-fosfato además de
5'-AMP. Para todos los nucleótidos examinados, el
nucleótido de monofosfato parece ser el sustrato preferido, excepto
en el caso de uridina, en el que se prefirió UTP sobre UMP ó UDP.
La 5'-nucleotidasa de rNucA pareció ser específica
para 5'-nucleótidos ya que no presenta actividad
con 3'-AMP (datos no mostrados).
Se realizó un ensayo con fosfatasa para
determinar si la proteína NucA posee actividad hidrolizante no
específica además de su actividad de 5'-nucleotidasa
específica. La fosfatasa se ensayó utilizando fosfato de
p-nitrofenilo (PNPP) como sustrato. Las mezclas de
reacción (volumen final 750 \mul) contenían
Tris-HCl 100 mM (pH 9,0), PNPP 25 mM y rNucA. Se
incubó la mezcla de reacción a 37ºC durante 30 minutos y se
interrumpió la reacción colocando los tubos en hielo. Se determinó
la absorbancia a 410 nm. NucA recombinante no tenía actividad
detectable con PNPP (datos no mostrados). Esto sugiere que NucA es
una nucleotidasa sin actividad de fosfatasa. En cambio, UshA de
E. coli tiene actividad de fosfatasa además de su conocida
actividad de nucleotidasa (13; 14).
Se determinó la capacidad para inhibir y/o
precipitar la actividad enzimática de rNucA del anticuerpo
monoclonal (MAb) Nt63-34-25,
producido para purificar la proteína nNucA como se describe en el
Ejemplo 7 a continuación. Se ha demostrado que MAb
Nt63-34-25 interreacciona con rNucA
así como con nNucA (datos no mostrados). La inhibición o
precipitación de la actividad de la enzima por MAb
anti-nNucA confirmaría que la proteína rNucA es
realmente una 5'-nucleotidasa. Concentraciones
crecientes de MAb (0, 2,5, 5, 10 y 20 \mul) se incubaron toda la
noche a 4ºC con proteína rNucA purificada. Se colocó una serie
idéntica que contenía también 50 \mul de bolas de proteína A
(Pierce) además de la proteína rNucA y MAb para facilitar la
inmunoprecipitación. Se centrifugaron las mezclas y se determinó
posteriormente la actividad de la nucleotidasa en los sobrenadantes
utilizando el ensayo de liberación de fosfato tal como se describió
anteriormente. Se calculó el porcentaje de actividad, comparado con
la referencia que no contiene MAb. La Figura 14 demuestra que se
inhibió la actividad de 5'-nucleotidasa ya que
aumentó la concentración de MAb
Nt63-34-25. La adición de 10 \mul
de MAb produjo aproximadamente 25% de inhibición de la actividad
enzimática mientras que la adición de 20 \mul presentaba
aproximadamente 45% de inhibición. El efecto de MAb aumenta si se
añaden bolas de proteína A para facilitar la inmunoprecipitación de
la proteína rNucA. En presencia de bolas de proteína A, la adición
de 10 \mul de MAb produjo aproximadamente 60% de reducción en la
actividad de 5'-nucleotidasa en tanto de la adición
de 20 \mul presentaba aproximadamente el 80% de inhibición. La
inhibición completa de la actividad de
5'-nucleotidasa se consiguió con concentraciones
mayores de MAb Nt63-34-25 (datos no
mostrados). Estos datos confirman que la proteína rNucA es
realmente una 5'-nucleotidasa.
Se utilizaron preparaciones de proteína NucA
purificadas como se describió anteriormente en ratones inmunizados
para la generación de anticuerpos monoclonales. Se inocularon por
vía intraperitoneal ratones hembra de ocho semanas BALB/c tres
veces en un periodo de cuatro semanas (semanas 0, 2 y 4) con 5
\mug de proteína NucA purificada a partir de la cepa P860295 de
NTHi y 25 \mug de adyuvante MPL™ a una dosis de 0,1 ml. Se
realizaron dos procedimientos de fusión independientes. La primera
fusión tuvo lugar después un periodo de descanso de tres meses
utilizando una dosis de refuerzo por vía intraperitoneal (IP) de
0,5 \mug de proteína NucA. La segunda fusión tuvo lugar después
de un periodo de descanso de cuatro meses utilizando una dosis de
refuerzo IP de 5 \mug de proteína NucA por la misma vía. Durante
la inmunización y el periodo de descanso, se extrajo suero a los
ratones (semanas 0 y 6) y se determinó la actividad del anticuerpo
por ELISA utilizando proteína NucA como antígeno de
recubrimiento.
Para ambas fusiones, se extrajeron los bazos de
dos ratones inmunizados aproximadamente 72 horas después de la
última inyección, y se combinaron con células de mieloma de ratón
(BALB/c) X63Ag8.653 no segregante en las proporciones 7:1 ó 5:1
(esplenocitos:mieloma), respectivamente, para la primera y segunda
fusión. Se fusionaron las células durante cuatro minutos en
polietilenglicol 1500 al 50% (p/p) y sulfóxido de dimetilo al 10% en
medio Eagle modificado por Dulbecco (D-MEM). Las
células fusionadas se diluyeron en medio de selección,
D-MEM enriquecido con hipoxantina, aminopterina,
timidina, suero bovino fetal al 10% y suplemento del medio
NCTC-109 al 10% (Gibco-BRL). Las
eficacias de fusión (pocillos con cultivos de colonias frente al
número de pocillos sembrados) fueron 26,4% (119/450) y 76,4%
(346/450), respectivamente. Se evaluó la reactividad por
transferencias Western con SDS-PAGE, transferencias
de manchas y análisis ELISA utilizando la proteína NucA y las
células completas. Se identificaron reactores positivos, se
denominaron del 1 al 25, se codificaron Nt63 (primera fusión) ó
Nt63/2 (segunda fusión) y se guardaron para conservación
posterior.
Se subclonaron los hibridomas de interés
seleccionados una vez por procedimiento de dilución limitante. Los
anticuerpos monoclonales fueron proporcionados como sobrenadante de
cultivo de tejido (TCS), se concentraron
por precipitación en sulfato amónico saturado al 50% (SAS-TCS) o ascitis.
por precipitación en sulfato amónico saturado al 50% (SAS-TCS) o ascitis.
Generación de sueros policlonales Se
generaron sueros policlonales en conejos blancos de Nueva Zelanda.
Se identificaron títulos de fondo en seis conejos utilizando ELISA
en células completas de P860295. Se seleccionaron dos conejos con
los títulos más bajos para inmunización con la proteína nNucA a
razón de 25 \mug por dosis más 25 \mug de MPL™ en solución
salina las semanas 0, 4 y 8. Se extrajo sangre a los conejos la
semana 10. Se purificó la proteína tal como se describió
anteriormente y se introdujo en un gel de SDS- PAGE al 12% para
aumentar la pureza desde su nivel de aproximadamente 90%. Se cortó
la banda de 63 kD del gel teñido con Coomassie y se pasó en serie
mediante agujas de 18G, 20G y 22G. Se añadió adyuvante MPL™ en
solución salina al 0,9% y se inyectó 0,2 ml en los conejos. El
suero policlonal dio un fondo alto en las transferencias de las
colonias incluso de la absorción en células XL1-Blue
MRF', Y1090R', Y1089R' e Y1088.
Estudios de inmunogenicidad En las Tablas
2 a 6 a continuación se resumen los estudios de inmunogenicidad
realizados en nNucA y rNucA. Se determinaron los títulos de
anticuerpo de sueros agrupados para nNucA y/o rNucA, los títulos de
células completas en diversas cepas NTHi heterólogas y también los
títulos de bactericida contra P861454 principalmente.
La Tabla 2 indica las dosis utilizadas en los
estudios de inmunogenicidad.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
La Tabla 3 representa una recopilación de los
datos del ELISA de las células completas (WC) de los estudios nº 1 y
nº 3.
La Tabla 4 representa los datos del ELISA de WC
del estudio nº 2, incluyendo la subtipificación de la clase IgG de
anticuerpos.
La Tabla 5 presenta los datos de bactericida de
los estudios nº 1, nº 2 y nº 3. Los títulos de bactericida para el
estudio nº 3 fueron un promedio de dos ensayos excepto para el
grupo N755. El estudio nº 1 de inmunogenicidad demostró que la
proteína nNucA tiene potencial para ser una vacuna experimental.
Véase las Tablas 3 y 5. Se presentan títulos de células completas
elevados para todas las cepas heterólogas ensayadas en el periodo.
De forma más importante, se presenta la actividad de bactericida
para dos de cada cuatro cepas heterólogas ensayadas (Tabla 5). Los
estudios nº 2 y nº 3 repitieron los datos de las células completas.
Véase las Tablas 3 y 4. Se presenta la actividad bactericida de
estos sueros para dos cepas heterólogas (en la Tabla 5 se muestran
los datos para la cepa P861454). Se intentaron otras tres cepas,
pero debido a dificultades técnicas no se pudo publicar ningún
dato.
La Tabla 6 presenta títulos por ELISA del
anticuerpo de estos tres estudios.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Estudio nº 2 ELISA para
IgG Punto final = 0,1
Subtipo IgG para
TN106
En las Tablas 2 a 6 se presentan a continuación
los resultados de los datos indicados.
Estudio nº
1
Se realizó el estudio nº 1 con proteína nNucA,
aislada y purificada tal como se describió en el Ejemplo 1. Se
inmunizaron cuatro grupos de ratones Swiss-Webster,
cinco ratones por grupo, con 1, 5, 10 ó 20 \mug de nNucA por
ratón las semanas 0, 4, 6 y 8. El adyuvante utilizado fue MPL™, 50
\mug por dosis. El anticuerpo contra nNucA y los valores de las
células completas para la cepa homóloga de NTHi de P860295 se
obtuvieron en los sueros mezclados de todas las extracciones de
sangre. Se muestran los datos para las semanas 0 y 8 (Tablas 3 y
6). Se obtuvieron los títulos de las células completas en las cepas
heterólogas y los títulos de bactericida en el grupo E548, el grupo
con dosis de 5 \mug, que dio los títulos más altos de las células
completas en la cepa de P860295 homóloga tanto en la semana 6
(datos no mostrados) como en la 8 (Tabla 3). Después de la segunda
inmunización, tanto los títulos de ELISA de las células completas
como de la proteína purificada se reforzaron en comparación con las
extracciones de sangre iniciales (datos no mostrados). Se observaron
asimismo dosis de refuerzo dobles a triples después de la tercera
inmunización, excepto para la dosis de 10 \mug, que presentaba un
aumento de 13 veces del título de ELISA. La proteína nNucA produjo
títulos de ELISA de las células completas elevados frente a ocho
cepas clínicas de NTHi heterólogas (Tabla 3), que demuestran los
epítopos expuestos en la superficie, conservados. A partir de este
estudio, se seleccionaron 5 \mug como dosis de inmunización
preferida para experimentos posteriores. Se realizó un ensayo
bactericida utilizando los sueros desde la dosis de 5 \mug (E548)
en cuatro cepas de NTHi heterólogas. Se considera un título
bactericida significativo un aumento al cuádruple de los niveles
preinmunitarios. Se detectó actividad bactericida significativa
contra la cepa P860295 homóloga, así como para las cepas P810384 y
N830161E de NTHi heterólogas. El título contra la cepa P861454 puede
ser significativo, pero no se pudo determinar en este ensayo, ya
que la dilución más baja ensayada fue 1:5 y el suero preinmunitario
no tenía actividad a este nivel (Tabla 5).
Estudio nº
2
Se realizó el estudio nº 2 para comparar la
inmunogenicidad de nNucA con la de rNucA, tanto con como sin
adyuvantes. Se compararon dos adyuvantes: MPL™ y Stimulon™
QS-21. Se utilizaron cinco ratones Balb/c por grupo
para estos estudios. Las proteínas NucA utilizadas para estos
estudios se purificaron como se describió en el Ejemplo 4 con la
proteína nNucA extraída con KSCN del P860295. Se inmunizaron ratones
las semanas 0 y 4 y se extrajo sangre las semanas 0, 4 y 6. Se
analizaron por ELISA anticuerpos reactivos en los sueros de la
semana 0 y 6 extracciones de sangre tanto contra nNucA y rNucA
purificadas como contra células NTHi completas.
Los resultados se presentan en las Tablas 4 y 6.
Las proteínas nNucA y rNucA no fueron muy inmunogénicas en ausencia
de adyuvantes. Ambas proteínas produjeron títulos de ELISA elevados
contra sí mismas o contra otra forma de la proteína cuando se
utilizó con uno de los dos adyuvantes (Tabla 6). No se detectó
ninguna diferencia cuando se utilizó nNucA o rNucA como agente
inmunizante y el suero reaccionó contra cada proteína. Por lo tanto
parece que rNucA produce anticuerpos indistinguibles de los
producidos por nNucA. En la Tabla 4 se presentan los títulos de
ELISA de las células completas para estos antisueros. Se examinaron
un total de 16 cepas clínicas de H. influenzae utilizando
estos antisueros. Sólo aquellos grupos que contienen adyuvantes
produjeron antisueros reactivos de células completas con título
elevado. Los antisueros fueron muy interreactivos en todas las cepas
demostrando que tanto NucA natural purificada como recombinante
contienen epítopos expuestos en la superficie, conservados que
producen anticuerpos cuando se inyectan en ratones. No se observaron
diferencias significativas entre el adyuvante o la combinación de
proteínas con capacidad para producir anticuerpos reactivos en la
superficie. Grupos sin adyuvante presentaban niveles de fondo de
anticuerpos reactivos en superficie. Se determinó la distribución
en subclases de la respuesta del anticuerpo a una cepa y los
resultados se presentan en la Tabla 4. Los grupos de MPL™ parecen
tener una respuesta a IgG1 e IgG2a/b mixta, mientras que la
proteína natural con adyuvante Stimulon™ QS-21 era
una respuesta a IgG1 en su mayor parte. En cambio, el grupo de
rNucA con Stimulon™ QS-21 era una respuesta a IgG1
e IgG2a/b mixta. Sin embargo, estas respuestas son únicamente para
un experimento y no pueden representar el perfil de subclase
esperado para estos adyuvantes en otros experimentos.
Estudio nº
3
El estudio nº 3 se realizó para observar la
respuesta a la dosis de rNucA cuando se formula con 50 \mug de
MPL™ por dosis y para extraer sueros para el estudio de protección
mostrado a continuación en la Tabla 7. Las rNucA y nNucA eran las
mismas preparaciones que para el estudio nº 2. Se inmunizaron tres
grupos de diez ratones cada uno con rNucA en cantidades de 1 \mug
por dosis (grupo N710), 5 \mug (grupo 711) ó 10 \mug (grupo
N71). A otro grupo de 20 ratones, se añadió N755 (aproximadamente
de 10 semanas de edad en lugar de 6 a 8 semanas) después del
estudio para proporcionar más suero para el estudio de protección.
Un quinto grupo de 10 ratones, N713, se inmunizó con 5 \mug de
nNucA. Todas las dosis contenían 50 \mug de MPL™ por dosis y los
ratones se inmunizaron las semanas 0, 4 y 8. Se extrajo sangre las
semanas 0, 4, 6 (solo a N755), 8 y 10. Véase la Tabla 2 para
dosis.
La respuesta primaria tal como se demuestra por
los títulos de IgG por ELISA para los sueros de la 4ª semana (datos
no mostrados) está afectada por la dosis de rNucA. El título más
bajo se obtuvo con el grupo de dosis de rNucA más bajo. Se obtuvo
un título mayor del doble al triple a partir del grupo de dosis de 5
\mug. A su vez, el título para el grupo de dosis de 10 \mug fue
aproximadamente el doble que para la dosis de 5 \mug. Se
obtuvieron títulos similares tanto para los grupos de nNucA como
para los de rNucA a una dosis de 5 \mug. N755 dio la respuesta
primaria mayor, pero la dosis de refuerzo más baja, aproximadamente
45 veces después de la segunda dosis. Todos los demás grupos se
reforzaron aproximadamente 200 veces después de la segunda dosis.
Los grupos N710 y N755 se reforzaron aproximadamente dos a tres
veces después de la tercera dosis; los grupos N711, N712 y N713
disminuyeron en realidad ligeramente. Todos los títulos eran
comparables después de tres inmunizaciones. Véase la Tabla 6.
Todas las cepas dieron a una dosis de 10 \mug
una respuesta pequeña a WC primaria. DL208 y P861454 fueron las
únicas dos cepas que dieron una respuesta primaria pequeña en todos
los grupos. Todos los títulos fueron comparables después de la
segunda y tercera inmunizaciones. N755 dio una respuesta primaria
mayor con DL208, P810384 y P861454 (que también tenía un fondo
alto), pero los títulos fueron de nuevo comparables después de la
segunda y tercera inmunizaciones. Sin embargo, la extracción de
sangre la 6ª semana presentaba títulos mayores y en algunas cepas
los mayores, durante las semanas 8ª y 10ª para los grupos N755.
Véase la Tabla 3 para los resultados de las semanas 0 y 10ª.
En este caso, de nuevo, se repitieron los
resultados de los estudios anteriores que presentaban la
interreactividad de los sueros de todas las cepas ensayadas,
incluso en la cepa de Eagan de tipo b encapsulada. Sin embargo, no
se obtuvo un título definitivo para Eagan, debido probablemente
debido a la presencia de la cápsula, que podía tener inhibida la
accesibilidad del antígeno a la superficie celular.
Se determinó la actividad bactericida de los
antisueros del estudio nº 2 contra dos cepas de NTHi, TN106 y
P861454, ambas cepas heterólogas en comparación con la fuente del
gen nucA. Todos los sueros excepto el del grupo con Stimulon™
QS-21-rNucA presentaban actividad
bactericida contra TN106. Los resultados del ensayo BC contra
P861454 se presentan en la Tabla 5. Los únicos grupos que presentan
un título bactericida significativo (> aumento al cuádruple)
contra P861454 eran los grupos MPL™, N091 y N087. De este modo, la
proteína NucA natural o recombinante con adyuvante con MPL™ fue
capaz de producir una respuesta de ELISA en la célula completa muy
interreactiva, títulos de ELISA elevados contra una de las dos
proteínas y actividad bactericida contra las cepas de NTHi
heterólogas.
Estudio de protección de rata recién
nacida Se colocaron al azar ratas
Sprague-Dawley de cuatro días en 10 grupos con una
madre en cada grupo de 10 recién nacidos. Se inmunizaron los recién
nacidos por vía intraperitoneal (IP) tal como se muestra en la
Tabla 7.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Los grupos P174 y P175 recibieron
anti-suero de conejos inmunizados con una proteína
de NTHi de 16 kD denominada P6 (también conocida como HiPAL ó
PBOMP-1 (22)). El grupo P176 recibió un anticuerpo
monoclonal producido contra fosfato de poli-ribosil
ribitol (PRP) de NTHi. El grupo P177 recibió tampón PCM (NaPO_{4}
10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, MgCl_{2} 0,5 mM, CaCl_{2} 0,15 mM)
como tampón de referencia. Todas las diluciones de suero y las
células se realizaron en tampón PCM. Aproximadamente 23 horas
después, se probó IP con 49,5 organismos (0,1 ml) de la cepa Eagan
virulenta de H. influenzae de tipo b. A continuación, 20 a
24 horas después de la prueba, se extrajo sangre a las ratas recién
nacidas y se colocaron en placas para recuentos bacterianos. Se
pincharon las colas y se extrajo 10 \mul de sangre con Rainin
Pipetman P20 y se diluyó en 90 \mul de tampón PCM a temperatura
ambiente. Se agitaron las diluciones y se mantuvieron a 4ºC hasta
que se hicieron diluciones posteriores y se colocó en placas 10
\mul de cada dilución en agar-agar con chocolate
por duplicado. Se incubaron las placas en un incubador con CO_{2}
al 5% a 36,5ºC toda la noche. En la Tabla 8 se indican los
resultados del estudio de protección.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
- 1
- Los títulos geométricos medios (GMT) se basaron en todas las placas contables que pesan lo mismo.
- 2
- Los GMT se basaron en el peso mayor que se coloca en las diluciones menores contables.
- Las placas contables fueron < 500 cfu/placa.
- El límite de detección era 100 cfu/ml, colocando en las placas 10 \mul de la dilución.
- Las placas para los grupos P175 y P176 eran 0 a la dilución más baja así que puede existir en cualquier parte desde 0 a 99 cfu/ml. Aquí se asignó un número, 50 cfu/ml, con el fin de calcular la media geométrica (GMT).
- Las placas que tenían muchos recuentos incluso a la dilución más alta se les asignó números basados en las estimaciones: > = 1000 cfu/placa
\hskip3cm>> = 2000 cfu/placa
\hskip3cminferior = 6000 cfu/placa
- valor p: Kruskal-Wallis es un ensayo con valor P conservador utilizado cuando los valores de la muestra abarcan un intervalo grande. No es sensible a valores muy grandes. Los valores P <0,05 son estadísticamente significativos en este ensayo.
El modelo animal de rata recién nacida para
meningitis por Hib demuestra la capacidad de los anticuerpos para
reducir la bacteremia (y posterior muerte) debido a Hib. El suero
de conejo en general proporciona alguna inmunidad no específica a
Hib en la sangre de las ratas recién nacidas, como se puede
observar cuando se compara los cfu de la semana 0 de los antisueros
de ratón y conejo. El modelo utiliza de este modo sueros de conejo
preinmunitarios como referencia negativa para los sueros
inmunitarios de conejo. Como era de esperar, el antisuero de
referencia de conejo contra la proteína P6 disminuyó el GMT de Hib
en la sangre de ratas desde 300 a 0,5, mostrando de este modo
bacteremia reducida, como hizo el anticuerpo monoclonal de ratón
contra la cápsula PRP de Hib (grupo P176). Los sueros
anti-rNucA de ratón, a una dilución 1:2, redujeron
de forma significativa los niveles de bacteremia comparado con los
sueros (preinmunitarios) de la semana 0, mostrando un resultado
positivo en este modelo animal y la capacidad para opsonizar el Hib
encapsulado. Estos resultados demuestran la eficacia de los sueros
anti-rNucA en este modelo y su vacuna potencial
contra H. influenzae.
Se determinó la especificidad de la sonda de ADN
de 420 bp en la identificación de la especie Haemophilus. Se
utilizó la sonda en hibridaciones de Southern para generar una
cartografía restricción parcial del gen nucA y en la
hibridación por transferencia de manchas para la identificación de
la especie Haemophilus. Se cultivaron los cultivos a
D.O._{600} de aproximadamente 1,0 y se almacenaron a -20ºC. Se
salpicaron 5 \mul de cultivo en una membrana
Hybond-N seca un papel Whatman de 3 mm debajo para
transferir el exceso de fluido. Se secó la membrana con aire
durante aproximadamente 10 minutos. Se lisó en SDS al 10%, a
continuación se desnaturalizó en un tampón desnaturalizador (NaCl
1,5 M, NaOH 0,5 M) durante 7 minutos a temperatura ambiente. Se
transfirió el exceso de tampón con papel Whatman 3 mm. Se
neutralizó la membrana en tampón neutralizante (NaCl 1,5 M,
Tris-HCl 0,5 M, pH 7,2, EDTA 1 mM) durante 3 minutos
a temperatura ambiente. Se colocó la membrana sobre papel Whatman 3
mm para transferir el tampón en exceso y se repitió el tratamiento
de neutralización. Se enjuagó la membrana en 2 \times SSC y se
secó con aire sobre papel Whatman 3 mm. Se reticuló el ADN en la
membrana utilizando un reticulador Stratagene UV en modo automático.
Se hibridó previamente la membrana en tampón de prehibridación (5
\times SSC, reactivo de bloqueo al 1%,
N-lauroilsarcosina al 0,1%, SDS al 0,02%) a 65ºC
durante 2 a 4 horas. La hibridación se realizó en tampón de
prehibridación más sonda (ADN cromosómico P860295 marcado con
dig-dUTP por PCR con cebadores específicos dando el
mismo fragmento de 420 bp descrito anteriormente) a 65ºC toda la
noche. Se realizaron dos lavados en 2 \times
SSC-SDS al 0,1% a 65ºC durante 5 a 15 minutos. Se
realizaron otros dos lavados en 0,1 \times
SSC-SDS al 0,1% a 65ºC durante 15 minutos. Se reveló
la membrana según el protocolo del kit Genius™ (Boehringer
Mannheim).
A continuación se relacionan las especies y cepas
de los cultivos celulares que se sembraron para hibridación por
mancha con esta sonda nucA. Todas las cepas de
Haemophilus eran positivas a simple vista incluyendo la cepa
Eagan de tipo b. La única especie no-Haemophilus que fue
positiva fue el cultivo de E. coli que contenía el plásmido
pPX691 de rnucA. Las demás especies fueron negativas para la sonda.
Véase la Figura 15.
\newpage
| 1. | Inv\alphaF' de E. coli | 12. | N830161E de NTHi |
| 2. | pTrcHisC en Inv\alphaF' | 13. | SH1013 de NTHi |
| 3. | pPX691 en Inv\alphaF' | 14. | SH1014 de NTHi |
| 4. | P810384 de NTHi | 15. | SH1015 de NTHi |
| 5. | P810568 de NTHi | 16. | TN106 de NTHi |
| 6. | P860295 de NTHi | 17. | Eagan de Hib |
| 7. | P861454 de NTHi | 18. | GC LB2 |
| 8. | P880859 de NTHi | 19. | GC Pgh3-2 |
| 9. | DL208 de NTHi | 20. | H. pylori |
| 10. | H305 de NTHi | 21. | M. catarrhalis 035e |
| 11. | N1955 de NTHi | 22. | S. typhimurium 3261 |
GC para 18. y 19. es Neisseria
gonorrhoeae. Estos resultados demostraron la especificidad de la
sonda para las secuencias de
nucA.
Se analizaron lisados de células totales de
varias cepas de NTHi y de la cepa Eagan de tipo b en Westerns
sondados con Mab Nt63-34-25 o
policlonales de conejo, ambos en nNucA. Todas las cepas analizadas
presentaban una banda de 63 kD conservada (por tamaño en un gel de
SDS-PAGE) con el antisuero de nNucA (datos no
mostrados). Se cultivaron varias cepas de NTHi y de Eagan tipo b y
cepas de Whittier, también a D.O._{490} de aproximadamente 1,0,
fijadas con formaldehído al 0,4%, diluidas a D.O._{620} de
aproximadamente 0,2 en PBS y recubiertas en placas secando para
ELISA WC. Véase las Tablas 3 y 4. Todas las cepas ensayadas
presentaban un título elevado en el ELISA WC.
Como se describió anteriormente, se obtuvo la
secuencia de la proteína NucA a partir de la cepa P860295 (SEC. ID
nº: 2). A continuación, se amplificó el fragmento de nucA (con o
sin secuencia con señal) de otros ocho genomas de NTHi y de la cepa
Eagan de tipo b, utilizando cebadores preparados en el secuenciado
de la zona de nucA del genoma P860295. Se clonaron los fragmentos
por PCR en pCR™II y se secuenciaron. Se obtuvieron las secuencias
completas de la zona del gen nucA madura para las cepas P810384,
P810568, P861454, P880859, N1955, TN106, SH1014, SH1015 y Eagan. Se
generó una alineación de la proteína a partir de las secuencias de
aminoácidos deducidas de la proteína NucA madura, incluyendo la del
P860295. Cuatro de las cepas (P880859, TN106, SH1015 y Eagan) son
idénticas al 100% a P860295. Las demás cepas se diferencian de
P860295 en uno a siete restos de aminoácido (véase Tabla 9). Esto
demuestra la considerable medida en que se conserva el gen
nucA entre las cepas de H. influenzae analizadas.
- 1.
- Moxon, E.R., J. Antimicrob. Chemother., 18 Supl. A, 17-24 (1986).
- 2.
- Murphy, T.F., y Apicella, M.A., Rev. Infect. Dis., 9, 1-15 (1987).
- 3.
- Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989).
- 4.
- Barenkamp, S. J., et al., Infect. Immun., 52, 572-578 (1986).
- 5.
- Moxon, E.R., et al., J. Infect. Dis., 136, S186-190 (1977).
- 6.
- Lam, J.S., et al., Current Microbiol., 3, 359-364 (1980).
- 7.
- Ulmer, J.B., et al., Science, 259, 1745-1749 (1993).
- 8.
- Fynan, E.F., et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci., U.S.A., 90, 11478-11482 (1993).
- 9.
- Silhavy, T., et al., Experiments with Gene Fusions, páginas 95-96, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1984).
- 10.
- Faure, D., BioTechniques, 13, 22-26 (1992).
- 11.
- Sprengart, M.L., et al., Nuc. Acids Res., 18, 1719-1723 (1990).
- 12.
- Luzio, J.P., et al., páginas 111-138, Kenny, A. J., y Turner, A.J., eds., en Mammalian Ectoenzymes, (Elsevier, Amsterdam (1987)).
- 13.
- Glaser, L., et al., J. Biol. Chem., 242, 1944-1945 (1967).
- 14.
- Neu, H.C., J. Biol. Chem., 242, 3896-3904 (1967).
- 15.
- Burns, D.M., y Beacham, I.R., Nuc. Acids Res., 14, 3425-4342 (1986).
- 16.
- Bengis-Garber, C., Can J. Microbiol., 31, 543-548 (1985).
- 17.
- Tamao, Y., et al., J. Biochem., 109, 24-29 (1991).
- 18.
- Maznitsa. I.I., et al., FEMS Microbiology Letters, 72, 173-176 (1990).
- 19.
- Misumi, Y., et al., J. Biol. Chem, 265, 2178-2183 (1990).
- 20.
- Ikehara, Y. et al., Biochimica et Biophysica Acta, 470, 202-211 (1977).
- 21.
- Chen, P.S., et al., Analytical Chem., 28, 1756-1758 (1956).
- 22.
- Patente US nº 5.110.908.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Jones, Kevin F.
\hskip3.9cmZagursky, Robert J.
\hskip3.9cmOoi, Peggy
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Proteína NucA de Haemophilus influenzae y gen que codifica dicha proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 23
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE LA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- REMITENTE: American Cyanamid Company
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Five Giralda Farms
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Madison
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Nueva Jersey
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: U.S.A.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- Código postal: 07940
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- LISTADO DESCIFRABLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA INFORMÁTICO: Patentin Release nº 1.0, Versión nº 1.30
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- APODERADO / AGENTE DE INFORMACIÓN
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Gordon, Alan M.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 30.637
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- REFERENCIA / NÚMERO DE ETIQUETA: 33.250-00/PCT
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 973-683-2157
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: 973-683-4117
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2263 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- PROPIEDADES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DENOMINACIÓN/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 229..2037
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID nº: 1:
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 603 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAAGAAGCAC CACAAGCACA TAAA
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATTTTACATA TTAATGATCA TCAT
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCAAAGTGGA TATTGGTG
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID nº 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCATCATAGAA CTTCACATC
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID nº 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGAGTGTTG AAGTCTTG
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID nº 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: SIMPLE
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGACTCACTA TAGGGAGACC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID nº 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAAGTCTTCA AACCTAGGAC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID nº 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 53 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID nº: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTATGGCTATG TCTAACATGA CTTACAAACA TCATCATCAT CATCATGGTA TGG
\hfill53
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID nº 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 55 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID nº: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTAGCCATAC CATGATGATGT TTGTAAGTCA TGTTAGACAT AGCCA
\hfill55
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID nº 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID nº: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATATCAAAG AAGCTCCTCA AGC
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID nº 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID nº: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGCGGATCCTGAAGTCTTCAAACCTAGGAC
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID nº 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID nº: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGATCCAAAG AAGCTCCTCA AGC
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID nº 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID nº: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTA GCAAAGAAGC ACCTCAAGC
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID nº 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID nº: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATTAACCCTC ACTAAAGGGA
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID nº 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID nº: 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCTTTCAGCT AATGTGATTC C
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID nº 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID nº: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCATCACAGCT GCATCTGCAG
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID nº 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID nº: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTTAATTCCA CAGCTTTGTG AGC
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID nº 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 234 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DENOMINACIÓN/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 21...227
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID nº: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID nº 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 69 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID nº: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID nº 22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 153 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID nº: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID nº 23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 105 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID nº: 23:
Claims (12)
1. Composición de vacuna que comprende una
proteína aislada y purificada de Haemophilus influenzae, en
la que dicha proteína comprende la secuencia de aminoácido de los
aminoácidos 26 a 603 de la SEC. ID nº: 2 o un epítopo o epítopos de
la misma, en la que dicha composición de vacuna produce una
respuesta inmunitaria protectora en un huésped mamífero.
2. Composición de vacuna según la reivindicación
1, en la que dicha proteína comprende la secuencia de aminoácidos
codificada por los nucleótidos 229 a 2037 de la SEC. ID nº: 1.
3. Composición de vacuna según la reivindicación
1, en la que la secuencia de aminoácido de los aminoácidos 26 a 603
de la SEC. ID nº: 2 está modificada por uno o más de los cambios de
restos de aminoácidos siguientes seleccionados de entre el grupo
constituido por K79E, N186K, S262G, V294A, E305Q, K327R, T337A,
D360Y, R376H y V436I.
4. Composición de vacuna según la reivindicación
1, que comprende además un adyuvante, diluyente o vehículo.
5. Composición de vacuna según la reivindicación
4, en la que el adyuvante se selecciona de entre el grupo
constituido por hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio,
QS-21, monofosforil lípido A
3-0-desacilado e
IL-12.
6. Secuencia de ADN aislada y purificada que
comprende una secuencia de ADN que codifica una proteína de
Haemophilus influenzae o un péptido de dicha proteína que
comprende un epítopo o epítopos de la misma para su utilización
como medicamento, en la que dicha proteína tiene una secuencia de
aminoácidos seleccionada de entre:
- (i)
- los aminoácidos 26 a 603 de la SEC. ID nº: 2;
- (ii)
- los aminoácidos 26 a 603 de la SEC. ID nº: 2 modificada por uno o más de los siguientes cambios de restos seleccionados de entre el grupo constituido por K79E, N186K, S262G, V294A, E305Q, K327R, T337A, D360Y, R376H y V436I.
7. Secuencia de ADN aislada y purificada según la
reivindicación 6, para su utilización como medicamento, en la que
dicha secuencia de ADN comprende los nucleótidos 304 a 2037 de la
SEC. ID nº: 1 o una secuencia de ADN que se hibrida con ésta en las
condiciones habituales de hibridación de Southern muy
restrictivas.
8. Secuencia de ADN aislada y purificada según la
reivindicación 6 ó la reivindicación 7, para su utilización en una
composición de vacuna de Haemophilus influenzae para su
administración a un huésped mamífero.
9. Utilización de una secuencia de ADN aislada y
purificada que codifica una proteína de Haemophilus
influenzae o un péptido de dicha proteína que comprende un
epítopo o epítopos de la misma, para la preparación de una
composición de vacuna para producir una respuesta inmunitaria
protectora a Haemophilus influenzae en un huésped mamífero,
en la que dicha proteína presenta una secuencia de aminoácidos
seleccionada de entre:
- (i)
- los aminoácidos 26 a 603 de la SEC. ID nº: 2;
- (ii)
- los aminoácidos 26 a 603 de la SEC. ID nº: 2 modificada por uno o más de los siguientes cambios de restos seleccionados de entre el grupo constituido por K79E, N186K, S262G, V294A, E305Q, K327R, T337A, D360Y, R376H y V436I.
10. Proteína de Haemophilus influenzae
aislada y purificada o un péptido de dicha proteína que comprende
un epítopo o epítopos de la misma, para su utilización como
medicamento, en la que dicha proteína presenta una secuencia de
aminoácidos seleccionada de entre:
- (i)
- los aminoácidos 26 a 603 de la SEC. ID nº: 2;
- (ii)
- los aminoácidos 26 a 603 de la SEC. ID nº: 2 modificada por uno o más de los siguientes cambios de restos seleccionados de entre el grupo constituido por K79E, N186K, S262G, V294A, E305Q, K327R, T337A, D360Y, R376H y V436I.
11. Proteína aislada y purificada según la
reivindicación 10, o un péptido de dicha proteína que comprende un
epítopo o epítopos de la misma, para su utilización en una
composición de vacuna de Haemophilus influenzae para su
administración a un huésped mamífero.
12. Utilización de una proteína aislada y
purificada según la reivindicación 10, o de un péptido de dicha
proteína que comprende un epítopo o epítopos de la misma, para la
preparación de una composición de vacuna para producir una
respuesta inmunitaria protectora a Haemophilus influenzae en
un huésped mamífero.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US2261996P | 1996-07-26 | 1996-07-26 | |
| US22619 | 1996-07-26 | ||
| US08/687,865 US5955596A (en) | 1996-07-26 | 1996-07-26 | NucA protein of Haemophilus influenzae and the gene encoding that protein |
| US687865 | 1996-07-26 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2227709T3 true ES2227709T3 (es) | 2005-04-01 |
Family
ID=26696143
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES97935048T Expired - Lifetime ES2227709T3 (es) | 1996-07-26 | 1997-07-23 | Proteina nuca de haemophilus innfluenzae y gen que codifica dicha proteina. |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6221365B1 (es) |
| EP (1) | EP0854925B1 (es) |
| JP (1) | JP2001524803A (es) |
| AT (1) | ATE277182T1 (es) |
| AU (1) | AU729684B2 (es) |
| CA (1) | CA2232975A1 (es) |
| DE (1) | DE69730814T2 (es) |
| ES (1) | ES2227709T3 (es) |
| PT (1) | PT854925E (es) |
| WO (1) | WO1998004703A1 (es) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE515258T1 (de) * | 1999-02-05 | 2011-07-15 | Alk Abello As | Mukosales verabreichungssytem |
| US7722861B2 (en) * | 2002-02-19 | 2010-05-25 | Svetoslav Bardarov, legal representative | Attenuated Mycobacterium tuberculosis vaccines |
| US7758874B2 (en) * | 2002-02-19 | 2010-07-20 | Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University | Attenuated Mycobacterium tuberculosis vaccines |
| US8084041B2 (en) * | 2003-01-24 | 2011-12-27 | Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University | Use of mycrobacterial vaccines in CD4+ or CD8+ lymphocyte-deficient mammals |
| US7428497B2 (en) * | 2003-10-06 | 2008-09-23 | Utbk, Inc. | Methods and apparatuses for pay-per-call advertising in mobile/wireless applications |
| US7709001B2 (en) | 2005-04-08 | 2010-05-04 | Wyeth Llc | Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition |
| TWI445545B (zh) | 2005-04-08 | 2014-07-21 | Wyeth Corp | 多價肺炎球菌多醣-蛋白質共軛物組合物 |
| WO2010038719A1 (ja) * | 2008-09-30 | 2010-04-08 | デンカ生研株式会社 | 精製インフルエンザウイルス抗原の製造方法 |
-
1997
- 1997-07-23 ES ES97935048T patent/ES2227709T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-07-23 DE DE69730814T patent/DE69730814T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-07-23 JP JP50892398A patent/JP2001524803A/ja active Pending
- 1997-07-23 AU AU38077/97A patent/AU729684B2/en not_active Ceased
- 1997-07-23 AT AT97935048T patent/ATE277182T1/de not_active IP Right Cessation
- 1997-07-23 US US09/043,711 patent/US6221365B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-07-23 PT PT97935048T patent/PT854925E/pt unknown
- 1997-07-23 EP EP97935048A patent/EP0854925B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-07-23 WO PCT/US1997/012790 patent/WO1998004703A1/en active IP Right Grant
- 1997-07-23 CA CA002232975A patent/CA2232975A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0854925A1 (en) | 1998-07-29 |
| DE69730814T2 (de) | 2005-09-29 |
| WO1998004703A1 (en) | 1998-02-05 |
| PT854925E (pt) | 2004-12-31 |
| AU729684B2 (en) | 2001-02-08 |
| US6221365B1 (en) | 2001-04-24 |
| CA2232975A1 (en) | 1998-02-05 |
| AU3807797A (en) | 1998-02-20 |
| ATE277182T1 (de) | 2004-10-15 |
| JP2001524803A (ja) | 2001-12-04 |
| EP0854925B1 (en) | 2004-09-22 |
| DE69730814D1 (de) | 2004-10-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2568895T3 (es) | Nuevas composiciones inmunogénicas para la prevención y tratamiento de enfermedad meningocócica | |
| AU2017201193B2 (en) | Compositions and methods relating to a mutant clostridium difficile toxin | |
| ES2389719T3 (es) | Proteínas que comprenden regiones conservadas del antígeno de superficie de Neisseria meningitidis NhhA | |
| US6607728B2 (en) | Compounds and methods for the diagnosis and treatment of ehrlichia infection | |
| JP4260879B2 (ja) | モラクセラ・カタルハリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）に対するワクチン | |
| KR20130140206A (ko) | 돌연변이체 클로스트리듐 디피실레 독소에 관련된 조성물 및 그의 방법 | |
| WO1998042740A9 (en) | Compounds and methods for the diagnosis and treatment of ehrlichia infection | |
| JP2001510039A (ja) | 診断および治療に有用な呼吸器多核体ウイルスエピトープならびにそれらを含んでなる抗体 | |
| ES2227709T3 (es) | Proteina nuca de haemophilus innfluenzae y gen que codifica dicha proteina. | |
| US5955596A (en) | NucA protein of Haemophilus influenzae and the gene encoding that protein | |
| JP3920271B2 (ja) | システイン・プロテアーゼあるいはその断片を含む連鎖球菌を識別するための方法および組成物 | |
| KR0170752B1 (ko) | 혈호균속 인플루엔자용 백신과 진단검사법 | |
| KR100537993B1 (ko) | 헤모필러스인플루엔자의엔유씨에이단백질및이단백질을암호화하는유전자 | |
| US6218147B1 (en) | Haemophilus adhesin protein | |
| RU2453599C1 (ru) | НУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА, КОДИРУЮЩАЯ ФУНКЦИОНАЛЬНО АКТИВНУЮ РЕКОМБИНАНТНУЮ IgA1 ПРОТЕАЗУ NEISSERIA MENINGITIDIS СЕРОГРУППЫ B, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК, СОДЕРЖАЩАЯ НУКЛЕОТИДНУЮ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ, КОДИРУЮЩУЮ АКТИВНУЮ IgA1 ПРОТЕАЗУ, ШТАММ-ПРОДУЦЕНТ, СОДЕРЖАЩИЙ ПЛАЗМИДНУЮ ДНК, ПРОДУЦИРУЮЩИЙ ЗРЕЛУЮ ФОРМУ IgA1 ПРОТЕАЗЫ, РЕКОМБИНАНТНАЯ Ig ПРОТЕАЗА NEISSERIA MENINGITIDIS СЕРОГРУППЫ В, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЗРЕЛОЙ ФОРМЫ IgA1 ПРОТЕАЗЫ, ОБЛАДАЮЩЕЙ ИММУНОГЕННЫМИ И ПРОТЕКТИВНЫМИ СВОЙСТВАМИ | |
| RU2773880C1 (ru) | Композиции, относящиеся к мутантному токсину CLOSTRIDIUM DIFFICILE, и способы их применения | |
| CA2182046A1 (en) | Haemophilus adhesin protein | |
| KR100461710B1 (ko) | 신규한 녹농균 세포 외막 단백질 유전자 및 이를 이용한 녹농균 감염 예방용 백신 및 녹농균 감염증 치료제 | |
| KR20050099517A (ko) | 모락셀라 카타랄리스의 교차-보호성 에피토프 및 이의 용도 | |
| JP2005535350A (ja) | ストレプトコッカス・ユベリス蛋白質、前記蛋白質をコードする核酸配列及び乳腺炎ワクチンにおけるその使用 | |
| Spike | Mucosal Immunization with | |
| JPH09504962A (ja) | ストレプトコッカスピオジェンスから誘導される組換えｄｎアーゼｂ | |
| AU5432101A (en) | Helicobacter felis vaccine | |
| Simmons | Variation of the Mycoplasma pulmonis V-1 antigen: A model for the mechanism of phase switching between phenotypes | |
| AU2013205807A1 (en) | Protective proteins of S. agalactiae combinations thereof and methods of using the same |