JP2001524803A - インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）のＮｕｃＡタンパク質およびそのタンパク質をコードする遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ＮｕｃＡと称される、インフルエンザ菌(H．influenzae)からのタンパク質が単離されかつ精製される。ＮｕｃＡタンパク質は配列番号２のアミノ酸26〜603のアミノ酸配列もしくはその生物学的に同等なアミノ酸配列を有する。配列番号２のアミノ酸１〜25はシグナルペプチドであり、これは成熟タンパク質のプロセシングの間に切断される。ＮｕｃＡタンパク質は、12％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で測定されるようなおよそ63,000ダルトンの分子量を有し、かつ、５’−ヌクレオチダーゼ活性を保有する。ＮｕｃＡタンパク質は、インフルエンザ菌(H．influenzae)生物体からの単離および精製、化学合成、もしくはＮｕｃＡタンパク質をコードする単離されかつ精製されたｎｕｃＡのＤＮＡ配列による組み換え発現により得られる。こうしたＤＮＡ配列は、標準的な高緊縮サザンハイブリダイゼーション条件下で、配列番号２のアミノ酸26〜603のアミノ酸配列もしくはその生物学的に同等なアミノ酸配列を有するインフルエンザ菌(H．influenzae)のＮｕｃＡタンパク質をコードするＤＮＡ配列とハイブリダイゼーションする。ＮｕｃＡタンパク質は、哺乳動物宿主において防御免疫応答を導き出してインフルエンザ菌(H．influenzae)により引き起こされる疾患に対し当該宿主を防御するワクチン組成物を調製するのに使用される。

Description

【発明の詳細な説明】 インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)のＮｕｃＡタンパク質およびそのタ ンパク質をコードする遺伝子 発明の分野 本発明は、ＮｕｃＡと称されるインフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)に より産生される63,000ダルトンのタンパク質、およびそのタンパク質をコードす るｎｕｃＡ遺伝子に関する。 発明の背景 分類できないインフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)（ＮＴＨｉ）は、健 康成人の80％までの上部気道で見出される、厳密にヒト共生の生物体である（引 用文献登録１）。それは中耳炎ならびに肺炎および副鼻腔炎を包含する小児での 呼吸器感染症の第１位の原因である（２）。ＮＴＨｉ株は非被包性であるため、 タイプｂ（Ｈｉｂ）の莢膜構造に基づくインフルエンザ菌(H．influenzae)のた めの現存のワクチンは無効である。これ故に、ＮＴＨｉ生物体に特異的なワクチ ンが必要とされ、そして、潜在的なワクチン成分は外層膜タンパク質のような表 面露出抗原に焦点を合わせている。 発明の概要 従って、インフルエンザ菌(H．influenzae)から付加的なタンパク質を単離し かつ精製すること、および、当該タンパク質が適切なモデル系での実行可能なワ クチン候補かどうかを試験することが、本発明の目的である。 こうしたタンパク質をコードする遺伝子を単離しかつクローニングすること、 および、当該タンパク質を組み換え的に発現することが、本発 明のさらなる目的である。 これら、および、下に論考されるような本発明の他の目的は、ＮｕｃＡと称さ れるインフルエンザ菌(H．influenzae)からのタンパク質、ならびにそのエピト ープ（１個もしくは複数）を含んで成るＮｕｃＡタンパク質のペプチドの単離お よび精製により達成される。単離されかつ精製された、インフルエンザ菌(H．in fluenzae)のＮｕｃＡタンパク質は、配列番号２のアミノ酸26〜603のアミノ酸配 列、もしくは、その生物学的に同等なアミノ酸配列を有する。配列番号２のアミ ノ酸１〜25はシグナルペプチドであり、これは成熟タンパク質のプロセシングの 間に切断される。ＮｕｃＡタンパク質は、12％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で測定さ れるようなおよそ63,000ダルトンの分子量を有し、また、５’−ヌクレオチダー ゼ活性を保有する。 本発明の一態様において、ＮｕｃＡタンパク質はインフルエンザ菌(H．influe nzae)生物体からの単離および精製により得られる。本発明の好ましい態様にお いて、ＮｕｃＡタンパク質は、そのタンパク質をコードする、単離されかつ精製 されたｎｕｃＡのＤＮＡ配列により組み換え的に発現される。 本発明は、標準的な高緊縮(high stringency)サザンハイブリダイゼーション 条件下で、配列番号２のアミノ酸26〜603のアミノ酸配列、もしくは、その生物 学的に同等なアミノ酸配列を有するインフルエンザ菌(H．influenzae)のＮｕｃ Ａタンパク質をコードするＤＮＡ配列とハイブリダイゼーションするＤＮＡ配列 を含んで成る、単離されかつ精製されたＤＮＡ配列を包含する。 こうした生物学的に同等なＮｕｃＡ配列の例は、配列番号２のアミノ 酸26〜603のアミノ酸配列が、Ｋ７９Ｅ、Ｎ１８６Ｋ、Ｓ２６２Ｇ、Ｖ２９４Ａ 、Ｅ３０５Ｑ、Ｋ３２７Ｒ、Ｔ３３７Ａ、Ｄ３６０Ｙ、Ｒ３７６ＨもしくはＶ４ ３６Ｉから成る群から選択される、アミノ酸残基変化の１個もしくはそれ以上に より改変されるものである。 本発明は、さらに、標準的な高緊縮サザンハイブリダイゼーション条件下で、 配列番号１のヌクレオチド304〜2037のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ配列と ハイブリダイゼーションするようなＤＮＡ配列を包含する。 ＮｕｃＡタンパク質の発現を得るため、当該ＤＮＡ配列はまず適するプラスミ ドベクター中に挿入される。適する宿主細胞が、その後、当該プラスミドで形質 転換もしくはトランスフェクションされる。本発明の一態様において、宿主細胞 は大腸菌(Escherichia coli)株ＩｎｖαＦ’である。宿主細胞はその後、宿主細 胞による前記ＮｕｃＡタンパク質の発現を許す条件下て培養される。 本発明の別の態様において、単離されかつ精製されたＮｕｃＡタンパク質また はそのエピトープ（１個もしくは複数）を含んで成るＮｕｃＡタンパク質のペプ チドが、哺乳動物宿主での防御免疫応答を導き出すワクチン組成物を調製するの に使用される。当該ワクチン組成物は、さらに、アジュバント、希釈剤もしくは 担体を含んで成りうる。こうしたアジュバントの例は、水酸化アルミニウム、リ ン酸アルミニウム、ＭＰＬ（商標）、スティミュロン［Stimulon］（商標）ＱＳ −２１、およびＩＬ−１２を包含する。当該ワクチン組成物は、インフルエンザ 菌(H．influenzae)により引き起こされる疾患に対して宿主を防御するのに十分 な免疫原性の量で哺乳動物宿主に投与される。 図面の簡単な説明 図１は、12％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動された、ＮＴＨｉ株Ｐ８６０２９ ５のチオシアン酸カリウム抽出物およびバイオゲル［Bio-Gel]（商標）ＨＴヒド ロキシルアパタイトカラムからのその溶出物を描く。レーン１−バイオラッド(B ioRad)の低分子量標準品（97、66、45、31および22kDの見かけの分子量）；レー ン２−カラム前の３Mチオシアン酸カリウム抽出物；レーン３−カラム通過物(fl owthrough)；レーン４−0.3Mリン酸ナトリウム、pH7.0の溶出物；レーン５−0.4 Mリン酸ナトリウム、pH7.0の溶出物。 図２は、それがおよそ63kDであることを示す、さらに精製されたＮｕｃＡタン パク質の12％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを描く。レーン１−バイオラッドの低分子量 標準品（図１でと同じ）；レーン２−エタノール沈殿前の濃縮されたＮｕｃＡ。 図３は、ＮＴＨｉのλ Ｚａｐライブラリーから増幅された、提案されたｎｕ ｃＡ特異的ＰＣＲ産物を描く。λ Ｚａｐライブラリーの概略図は、λ Ｚａｐ （商標）IIファージのpBluescript（商標）領域へのＰ８６０２９５のゲノムＤ ＮＡ断片の挿入部位、および、これらの部位を含有する可能なゲノムＤＮＡ断片 上のｎｕｃＡ特異的縮重プライマーＰ１およびＰ２の相対的方向を示す。ファー ジ特異的なＴ３およびＴ７プライマー部位は、λ Ｚａｐ（商標）II ＤＮＡ上 に固定されて示される。 図４（上）は、成熟ｎｕｃＡ配列の大部分を含有した２個のＰＣＲクローンを 描く。これらの配列から、Ｐ８６０２９５の染色体ＤＮＡでのサザンで使用され た420bpのプローブを構築した。図４（下）は、ｎｕ ｃＡ遺伝子の限られたゲノム制限酵素地図を描く。 図５は、予測されたｎｕｃＡ特異的逆ＰＣＲ反応および産物の概略図を描く。 Ｐ８６０２９５のゲノムＤＮＡを、NsiI（上）もしくはEcoRI（中央および下） のいずれかで切断した。ＤＮＡを希釈し、そして連結して「自己連結」環を形成 した。ｎｕｃＡのＤＮＡを含有するＤＮＡ環が示される。 上−およそ３kbのNsiI環がＰ１ ｎｕｃＡ領域の上流に配列情報を含んでいた 。プライマー対４３１３ｅｘｔおよび４１０２ｅｘｔを使用するＰＣＲ増幅はお よそ２kbのＤＮＡ断片を産生した。 中央−およそ4.3kbのEcoRI環は、Ｐ１ ｎｕｃＡ領域の上流に配列情報を含有 することができた。プライマー対４１２１ｆｗｄおよび４１２２ｅｘｔを使用す るＰＣＲ増幅はおよそ４kbのＤＮＡ断片を産生するはずであった。この大きさの ＤＮＡ断片は観察されなかった。 下−およそ1.6kbのEcoRI環はｎｕｃＡコーディング領域の下流に配列情報を含 有することができた。プライマー対４１０２ｅｘｔおよび４３１３ｅｘｔを使用 するＰＣＲ増幅はおよそ0.7kbのＤＮＡ断片を産生するはずであった。実際には 、およそ1.3kbの断片が得られた。 図６は、遺伝子１０のＴ７プロモーター（Ｐ_T7）の下流のクローニング部位を 囲むＤＮＡ配列を包含するｐＲＳＥＴＣ発現ベクターを描く。制限酵素のＤＮＡ 認識部位、すなわちNdeI、NheI、BamHIおよびHindIIIに下線が付けられている。 タンパク質の開始および読み取り枠、ならびにエンテロキナーゼ切断部位（ＥＫ 切断）がＤＮＡ配列の下に示される。 図７は、ウサギポリクローナル抗体をプローブとしたｐＰＸ６４４の発現産物 からの細胞ライセートでのウェスタンブロットを描く。レーン １：予め染色された高分子量タンパク質標準品（200、97.4、68、43、29、18.4 および14.3kD）（ギブコ(Gibco)ＢＲＬ）；レーン２：ＮｕｃＡの精製された天 然のタンパク質標準品；レーン３および４：それぞれ誘導されないおよび誘導さ れたＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ／ｐＰＸ６４４の単離物１；レーン５および ６：それぞれ誘導されないおよび誘導されたＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ／ｐ ＰＸ６４４の単離物５；レーン７および８：それぞれ誘導されないおよび誘導さ れたＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ／ｐＰＸ６４４の単離物７；レーン９および １０：それぞれ誘導されないおよび誘導されたＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ／ ｐＲＳＥＴＣ。矢印はＮｕｃＡの移動を示す。 図８（上）はクマシー染色された12％ゲルを描き、また、図８（下）は、ウサ ギポリクローナル抗体をプローブとして誘導されないおよび誘導されたライセー トを示すｐＰＸ６９３のｎｕｃＡ成熟配列融合クローン１〜３からの細胞ライセ ートでのウェスタンブロットを描く。ｐＰＸ７０７（ｏｍｐＴシグナル配列）の 第二のクローンもまた描かれる。レーン１−図に示されるような見かけの分子量 をもつＢＲＬの高分子量タンパク質標準品；レーン２−ｎＮｕｃＡ；レーン３− 誘導されないｐＰＸ７０７のクローン２；レーン４−誘導されたｐＰＸ７０７の クローン２；レーン５−誘導されないｐＰＸ６９３のクローン１；レーン６−誘 導されたｐＰＸ６９３のクローン１；レーン７−誘導されないｐＰＸ６９３のク ローン２；レーン８−誘導されたｐＰＸ６９３のクローン２；レーン９−ｐＰＸ ６９３のクローン３（間違った方向のｎｕｃＡ）；レーン１０−およそ68kDのバ ンドの誘導がないことを示す、誘導されたｐＰＸ６９３のクローン３；レーン１ １−しかし1.0の代わりに1.7の０． Ｄ．₆₀₀で誘導されたｐＰＸ６９３のクローン３；レーン１２−誘導されたベク ター単独（ｐＲＳＥＴＣ）の培養系からのライセート、陰性対照；レーン１３− ｐＰＸ６４４からのｒＮｕｃＡの精製された調製物；レーン１４−ブランク；レ ーン１５−ＢＲＬの低分子量標準品。 図９は、ｐＰＸ６９１の構築におけるベクターへの挿入部位を示す、ｎｕｃＡ のシグナル配列および部分的成熟配列と一緒になったｐＴｒｃＨｉｓＣベクター の特徴を描く。図９の配列の最初の３本の線は、シグナル配列（配列番号２２） の最初のＡＴＧで開始しそして成熟配列中に78塩基連続する部分的な天然のｎｕ ｃＡ配列を表す。配列の次の２本の線は、ベクター中のNcoI制限酵素切断部位（ ＡＴＧ開始部位を含有する）、ポリヒスチジン領域、エンテロキナーゼ切断部位 およびマルチクローニング領域のBamHI切断部位を包含する、当該ベクターのコ ーディング配列（配列番号２３）を表す。当該プラスミドは、発現が誘導まで止 められる（漏出(leak through)からの低い基礎レベルが存在する）ように強力な 誘導可能なｔｒｃプロモーターを抑制するため、ｌａｃＩ^qを含有する。 図１０（上）はクマシー染色されたゲルを描き、そして、図１０（下）は、異 なるベクターおよび宿主株での天然の（ｐＰＸ６９１および６９２）もしくはｏ ｍｐＴ（ｐＰＸ７０７）シグナル配列のいずれかをもつ構築物であるｐＰＸ６９ １、ｐＰＸ６９２およびｐＰＸ７０７からの細胞ライセートでのウェスタンブロ ットを描く。ｐＰＸ６９２のベクターであるｐＲＳＥＴＣの陰性対照が包含され る。ｐＰＸ６９２での付加的な誘導されたレーン（左から９番目）は、Ｏ．Ｄ．₆₀₀ が1.0の代わりに1.5で誘導された培養系からであり、ＮｕｃＡタンパク質発 現での減少 を示す。レーン１０および１１の誘導されないおよび誘導されたｐＲＳＥＴＣラ イセートは挿入されたｎｕｃＡをもたないクローン由来である一方、レーン１４ の誘導されたｐＲＳＥＴＣライセートは類似の宿主株へ形質転換されたベクター 由来である。レーン１および１５−見かけの分子量標準品は図上で列挙されるよ うである（200、97、68、43および29kD）；レーン２−天然のＮｕｃＡタンパク 質（しかしクマシー染色で可視化されるのに十分でないタンパク質が存在した） ；レーン３および５−それぞれｐＰＸ６９１のクローン１４および１５からの誘 導されない細胞ライセート；レーン４および６−同じｐＰＸ６９１クローンの誘 導された細胞ライセート；レーン７−ｐＰＸ６９２のクローン１１からの誘導さ れない細胞ライセート；レーン８および９−同じ培養系のしかしそれぞれ0.9お よび1.5のＯ．Ｄ．₆₀₀で誘導された細胞ライセート；レーン１２−誘導されない ｐＰＸ７０７のクローン１；レーン１３−誘導されたｐＰＸ７０７のクローン１ 。 図１１は、ＰｅｌＢおよびＯｍｐＴのＮｕｃＡ融合タンパク質の発現のクマシ ーゲルを描く。レーン０−図に示されるような見かけの分子量をもつ、予め染色 された高分子量タンパク質標準品；レーン１、３、５および７−上清のサンプル ；レーン２、４、６および８−細胞ペレットのサンプル；レーン１〜４−ＢＬ２ １（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ／ｐＰＸ７０７（ＯｍｐＴ−ＮｕｃＡ）から；レーン５ 〜８−ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ／ｐＰＸ７０８（ＰｅｌＢ−ＮｕｃＡ）か ら。矢印はＮｕｃＡの移動を示す。 図１２は、異なるシグナル配列をもつ構築物からの細胞ライセートでのクマシ ー染色された12％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを描く。至適化された ＴＩＲをもつ成熟クローンｐＰＸ７０７およびＮＴＨｉのＰ８６０２９５のライ セートもまた包含される。陰性対照は誘導されたベクター（ｐＴｒｃＨｉｓＣ） 単独である。ここで、当該ベクターはいずれかのＮｕｃＡ配列を含有しない。レ ーン１および１０−上のような分子量標準品；レーン２−ｐＰＸ６９１からのｒ ＮｕｃＡの精製された調製物(prep)；レーン３−ｐＰＸ６９１からの誘導されな いライセート；レーン４−ｐＰＸ６９１からの誘導されたライセート；レーン５ −ｐＰＸ７０７からの誘導されたライセート；レーン６−ｐＰＸ７０８からの誘 導されたライセート；レーン７−ｐＰＸ７０９からの誘導されたライセート；レ ーン８−Ｐ８６０２９５からのライセート；レーン９−誘導されたｐＴｒｃＨｉ ｓＣ。 図１３は、ＴＬＣプレート上での５’−ヌクレオチダーゼアッセイの結果を描 く。ヌクレオチダーゼ活性は全細胞で測定し、また、天然もしくは組み換えＮｕ ｃＡタンパク質を精製した。反応は以下の添加を含有した。すなわち、レーン１ ：10μlのＰ８６０２９５細胞；レーン２：５μlのｒＮｕｃＡ；レーン３：１μ lのｒＮｕｃＡ；レーン４：５μlのｎＮｕｃＡ；レーン５：１μlのｎＮｕｃＡ ；レーン６：添加されたヌクレオチダーゼなし；レーンＣ：21.5mMアデノシン１ μlおよびレーン６からの反応１μl（Ａとして示されるアデノシンの移動につい ての対照）。溶媒先端が示される。 図１４は抗ｎＮｕｃＡ Ｍａｂ Ｎｔ−６３−３４−２５によるｒＮｕｃＡ（ ｐＰＸ６９１）の５’−ヌクレオチダーゼ活性の阻害を描く。酵素活性の阻害が プロテインＡビーズの非存在（黒四角）もしくは存在（白丸）で描かれる。 図１５は、ｎｕｃＡの420bpのｄｉｇ標識されたプローブで探られた(probed) 、いくつかのＮＴＨｉおよびタイプｂイーガン(Eagan)株ならびにその他の種の ドットブロットハイブリダイゼーションを描く。数字１〜22は下の実施例８に示 されるとおりである。 発明の詳細な記述 本発明は、単離されかつ精製された、インフルエンザ菌(H．influenzae)のＮ ｕｃＡタンパク質に関する。ＮｕｃＡタンパク質は、配列番号２のアミノ酸１〜 603のアミノ酸配列を有する。アミノ酸１〜25はシグナルペプチドを含んで成る 。正常のプロセシングの後、成熟ＮｕｃＡタンパク質は、配列番号２のアミノ酸 26〜603のアミノ酸配列を有する。ＮｕｃＡタンパク質は、12％ＳＤＳ−ＰＡＧ Ｅゲル上で測定されるようなおよそ63,000ダルトン（63kD）の分子量を有する。 ＮｕｃＡタンパク質はまた、抗天然ＮｕｃＡモノクローナル抗体により阻害され る（実施例６）５’−ヌクレオチダーゼ活性（実施例５を参照）も有する。 ＮｕｃＡタンパク質はインフルエンザ菌(H．influenzae)の細胞表面上に非常 に少量で存在する。ＮｕｃＡは膜結合タンパク質である。このタンパク質は、試 験された全てのインフルエンザ菌(H．influenzae)の株で高度に保存されている 。本発明は、さらに、そのエピトープ（１個もしくは複数）を含んで成るＮｕｃ Ａタンパク質のペプチドに関する。こうしたペプチド類は、ＮｕｃＡタンパク質 の１種もしくはそれ以上のエピトープと免疫学的に交差反応性である１個もしく はそれ以上のエピトープを組込む。こうしたペプチドが最初に産出され、そして その後、交差反応性について試験される。 ＮｕｃＡタンパク質は、インフルエンザ菌(H．influenzae)生物体か らの単離、組み換えＤＮＡ発現、もしくは化学合成により得られる。化学合成は 、固相および液相合成、具体的にはそのエピトープ（１個もしくは複数）を含ん で成るＮｕｃＡタンパク質のペプチドの産生のための標準的な化学的現象を使用 することを必要とする。 インフルエンザ菌(H．influenzae)生物体からのＮｕｃＡタンパク質の単離方 法が下の実施例１に詳述される。要約すれば、生物体をチオシアン酸カリウムで 抽出し、この抽出物を２個のヒドロキシルアパタイトカラムを通過させ、そして ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかける。ゲル上の63kDのバンドを切り抜いて精製されたＮｕ ｃＡタンパク質を得る。実施例４は２個の代替の精製法を詳述する。第二のヒド ロキシルアパタイトカラムはモノＱ(MonoQ)カラムにより置き換えられうる。あ るいは、チオシアン酸カリウム抽出段階は塩化ナトリウム抽出段階により置き換 えられる。 ＮｕｃＡタンパク質をコードする遺伝子のクローニングは簡単でなかった。下 の実施例２は、不成功に試みられたいくつかの戦略、ならびに、ＮｕｃＡタンパ ク質をコードするＤＮＡ配列を含有するｎｕｃＡ遺伝子の最後に成功したクロー ニングを述べる。成功したクローニングの後にＮｕｃＡタンパク質の発現および ｎｕｃＡ遺伝子の配列決定を行った。完全なｎｕｃＡ遺伝子配列は、配列番号１ のヌクレオチド229〜2037に述べられる。シグナルペプチドはヌクレオチド229〜 303によりコードされる。成熟ＮｕｃＡタンパク質はヌクレオチド304〜2037によ りコードされる。 下の実施例３は、ＮｕｃＡタンパク質の発現を詳述する。完全長のｎｕｃＡ遺 伝子を、大腸菌(E．coli)の発現ベクターｐＴｒｃＨｉｓＣ中にクローニングし 、そしてｐＰＸ６９１と称した。このｎｕｃＡ遺伝子 を、そのシグナル配列がプロセシングされた成熟ＮｕｃＡタンパク質として大腸 菌(E．coli)中で発現させた。培養系を、ＮｕｃＡタンパク質の発現のためＩＰ ＴＧで誘導した。発現は、ウェスタン分析およびクマシーゲル分析の双方により 確認した。 本発明は、さらに、インフルエンザ菌(H．influenzae)のＮｕｃＡタンパク質 をコードするＤＮＡ配列を含んで成る単離されかつ精製されたＤＮＡ配列、なら びに、そのエピトープ（１個もしくは複数）を含んで成るＮｕｃＡタンパク質の ペプチドをコードする付随するＤＮＡ配列に関する。 多様な宿主細胞−ベクター系が、実施例３で詳述されたものに加え、本発明の ＮｕｃＡタンパク質およびペプチドを発現するのに使用される。ベクター系は使 用される宿主細胞と適合性である。適する宿主細胞は、プラスミドＤＮＡ、コス ミドＤＮＡもしくはバクテリオファージＤＮＡで形質転換された細菌；ワクシニ アウイルスおよびアデノウイルスのようなウイルス；ピキア属(Pichia)の細胞の ような酵母；Ｓｆ９もしくはＳｆ２１細胞のような昆虫細胞；またはチャイニー ズハムスター卵巣細胞のような哺乳動物細胞系；ならびに他の慣習的な生物体を 包含する。 多様な慣習的な転写および翻訳要素が当該宿主細胞−ベクター系に使用され得 る。ｎｕｃＡのＤＮＡは発現系に挿入され、そして、当該プラスミドベクターが 宿主細胞に挿入される場合にｎｕｃＡのＤＮＡが当該宿主細胞により発現され得 るように、プロモーターおよび他の制御要素がベクター内の特定の部位に連結さ れる。 異種性シグナルペプチドが、細胞膜を横切って組み換えＮｕｃＡタンパク質を トランスロケーションするために使用される。実施例３はＯｍ ｐＴおよびＰｅｌＢシグナル配列の成熟ｎｕｃＡ遺伝子の上流の別個のクローニ ングを詳述する。ＮｕｃＡタンパク質の発現はこれらのシグナル配列のそれぞれ で成功した。 プラスミドは、使用される宿主細胞−ベクター系に依存して、形質転換、形質 導入もしくはトランスフェクションにより宿主細胞に導入される。宿主細胞は、 その後、宿主細胞によるＮｕｃＡタンパク質の発現を許す条件下で培養される。 ＮｕｃＡタンパク質（配列番号１）をコードするＮＴＨｉ株Ｐ８６０２９５か ら得られるＤＮＡ配列に加え、本発明は、さらに、遺伝暗号の冗長性によってＮ ｕｃＡタンパク質をコードする配列に生物学的に同等であるＤＮＡ配列を含んで 成る。すなわち、これらの他のＤＮＡ配列は本明細書で述べられるものと異なる がしかし配列番号１のＤＮＡ配列によりコードされるものと同じアミノ酸配列を 有するタンパク質もしくはペプチドをコードするヌクレオチド配列により特徴づ けられる。 とりわけ、本発明は、サンブルック(Sambrook)ら（３）に記述されるもののよ うな標準的な高緊縮サザンハイブリダイゼーション条件下でそれらとのハイブリ ダイゼーションを許すように配列番号１の配列を十分に複製するＤＮＡ配列、な らびにそれにより産生される生物学的に活性な酵素を企図する。 本発明はまた、ＮｕｃＡタンパク質のもとの異なるがしかしそのタンパク質（ 配列番号２）について記述されたものと生物学的に同等であるアミノ酸配列をコ ードするＤＮＡ配列も含んで成る。こうしたアミノ酸配列は、それらの配列が、 当該配列の三次元配置がＮｕｃＡタンパク質のもとの本質的に変化していないよ うにＮｕｃＡの配列からの小さな欠 失もしくはそれに対する保存的置換によってのみ異なる場合に、ＮｕｃＡタンパ ク質のものと生物学的に同等であると言われることができる。 例えば、疎水性アミノ酸であるアミノ酸アラニンのコドンは、グリシンのよう な別の疎水性のより小さい残基、または、バリン、ロイシンもしくはイソロイシ ンのような疎水性のより大きい残基をコードするコドンにより置換されうる。同 様に、グルタミン酸の代わりにアスパラギン酸のような、１個の負に荷電した残 基の別のものとの置換、もしくは、アルギニンの代わりにリシンのような、１個 の正に荷電した残基の別のものとの置換をもたらす変化、ならびに、それらのハ イドロパシーインデックスの残基の類似性に基づく変化もまた、生物学的に同等 な産物を産生すると期待され得る。タンパク質分子のＮ末端もしくはＣ末端部分 の変化をもたらすヌクレオチド変化はまた、タンパク質の活性を変えると期待で きないともみなされる。提案された改変のそれぞれは、十分に、当該技術分野の 慣例技能内にあり、それはコードされた産物の生物学的活性の保持の決定である ようである。従って、「ｎｕｃＡのＤＮＡ」もしくは「ＮｕｃＡタンパク質」と いう用語が本明細書もしくは請求の範囲のいずれかで使用される場合、それぞれ は、生物学的に同等なタンパク質の産生をもたらす全てのそうした改変および変 動を包含すると理解されることができる。 とりわけ、下の実施例９で述べられるように、本発明のＮｕｃＡタンパク質は 、配列番号２のアミノ酸配列に対する以下の変化、すなわちＫ７９Ｅ、Ｎ１８６ Ｋ、Ｓ２６２Ｇ、Ｖ２９４Ａ、Ｅ３０５Ｑ、Ｋ３２７Ｒ、Ｔ３３７Ａ、Ｄ３６０ Ｙ、Ｒ３７６ＨもしくはＶ４３６Ｉの１個もしくはそれ以上を有しうる。これら のアミノ酸の変化の１個もしくはそ れ以上は、他のＮＴＨｉゲノムおよびタイプｂイーガン株に存在する。 ＮｕｃＡタンパク質、およびそのエピトープ（１個もしくは複数）を含んで成 るＮｕｃＡタンパク質のペプチドは、インフルエンザ菌(H．influenzae)により 引き起こされる中耳炎および肺炎に対して温血動物に防御を賦与するワクチンの 調製で有用である。 これらのワクチン組成物は、単離されかつ精製された、インフルエンザ菌(H． influenzae)のＮｕｃＡタンパク質、またはそのエピトープ（１個もしくは複数 ）を含んで成るＮｕｃＡタンパク質のペプチドを含んで成り、当該ワクチン組成 物は哺乳動物宿主で防御免疫応答を導き出す。 ＮｕｃＡタンパク質もしくはペプチドを含有するワクチンは、注入可能な液体 の溶液もしくは懸濁液を調製するための慣習的様式で、免疫学的に許容できる希 釈剤もしくは担体と混合されうる。加えて、当該ワクチンは、水酸化アルミニウ ム、リン酸アルミニウム（アルム）、もしくは、スティミュロン［Stimulon］（ 商標）ＱＳ−２１（ケンブリッジ バイオテク コーポレーション(Cambridge B iotech Corporation)、マサチューセッツ州ウォーセスター）、ＭＰＬ（商標） （３−Ｏ−デアシル化モノホスホリルリピドＡ、ＲＩＢＩ イミュノケム リサ ーチ インク(RIBI ImmunoChem Research，Inc.)、モンタナ州ハミルトン）、お よびＩＬ−１２（ジェネティクス インスティテュート（Genetics Institute) 、マサチューセッツ州ケンブリッジ）のような他の製薬学的に許容できるアジュ バントを包含しうる。 本発明のワクチンはまた、当該技術分野でよく知られる付加的なインフルエン ザ菌(H．influenzae)のタンパク質も包含しうる。こうしたタンパク質の例はＰ ６およびＰ４と称されるものである（後者はタンパク 質「ｅ」としてもまた知られる）。 本発明のワクチンは、ＮＴＨｉにより引き起こされる中耳炎に対する防御のた めの能動免疫応答を誘導するために、皮下、腹腔内もしくは筋肉内注入のような 慣習的様式の注入により温血動物に、ならびに、経口投与および鼻内投与により 投与される。投与されるべき投薬量は当業者に既知の手段により決定される。保 護はワクチンの単一用量により賦与されうるか、もしくは、数回の追加抗原用量 の投与を必要としうる。 通常は、ヒトの臨床データの非存在下では、認められた動物モデルでの能動免 疫はヒトにおけるワクチンの有効性を予測する上で頼みにされる。チンチラはＮ ＴＨｉに対する能動免疫の動物モデルを提供することが提案されている（４）。 しかしながら、候補のＮＴＨｉタンパク質での後の能動免疫実験は、チンチラ は許容できるモデルでないことを立証した（未発表データ、レーダール・プラク シス バイオロジカルズ(Lederle-Praxis Biologicals)、ニューヨーク州ウェス トヘンリエッタ）。 Ｈｉｂの許容できる動物モデルは、インビトロ殺菌アッセイ（６）と一緒にな った仔ラットの受動免疫（５）から成る。能動免疫は仔ラットで可能でない。仔 ラットは４〜５日間のみＨｉｂに感受性であり、その後それは感受性でない。こ の短い期間のため、仔ラットを能動的に免疫することは可能でない。なぜなら、 当該細菌での攻撃は免疫後５日以上起こらなくてはならないとみられ、また、当 該動物はその時点で攻撃に応答しないからである。従って、仔ラットでの受動免 疫は、殺菌アッセイのデータとひとまとめにされる場合、ヘモフィルス属(Haemo philus)に関する唯一の可能な動物モデルを提供する。 本発明において、ＮｕｃＡタンパク質は、仔ラット受動免疫試験および殺菌ア ッセイの双方でのその活性の理由で、実行可能なワクチン候補であることが示さ れる（下の実施例７で詳述されるように）。その仔ラットの試験では、タイプｂ イーガンが攻撃株として使用された。その結果は、抗組み換えＮｕｃＡタンパク 質血清で受動的に免疫されたラットでの菌血症の抑制を立証した。 ワクチン投与の前述の方式に加え、遺伝免疫、ポリヌクレオチド免疫もしくは 裸の(naked)ＤＮＡ技術として様々に知られる技術が使用されうる。ＤＮＡでの 免疫はＡ型インフルエンザでの攻撃から動物を保護するのに使用されている（７ ）。この技術では、ｎｕｃＡのＤＮＡはプラスミドＤＮＡおよび裸のＤＮＡのよ うな形態で使用され、そして、ファイナン(Fynan)ら（８）による例について記 述されるように、非経口、粘膜および遺伝子ガン接種(gene gun inoculation)に よるを包含する多様な方法で哺乳動物宿主に投与される。ブピビカインのような 促進剤がこの技術で使用されうる。 ｎｕｃＡのＤＮＡはまた、選択された臨床サンプル中のインフルエンザ菌(H． influenzae)もしくは検査室の株の検出における診断法としての使用のためのプ ローブを生じさせるのにも使用される。分析される臨床サンプルは、臨床単離物 、耳の単離物、および喉の培養系を包含する。当該プローブは、それぞれＨｉｂ およびＮＴＨｉにより引き起こされる髄膜炎、中耳炎および肺炎の診断で使用さ れる。 １種のこうしたプローブは、配列番号１のヌクレオチド416〜835に及ぶ420bp のプローブである。下の実施例８に記述されるように、この420bpのプローブは ドットブロットハイブリダイゼーションアッセイで使用 された。当該プローブは、全てのＮＴＨｉ株およびタィプｂイーガン株を包含す る試験された全てのヘモフィルス属(Haemophilus)の株に関して陽性であった。 当該プローブは、大腸菌(E．coli)、淋菌(Neisseria gonorrhoeae)、ヘリコバク ター ピロリ(Helicobacter pylori)、モラクセラ カタラリス(Moraxella cata rrhalis)およびネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)を包含する他の細菌株 に関して陰性であった。期待されたように、当該プローブは、ｒｎｕｃＡプラス ミドを含有する大腸菌(E．coli)株に関して陽性であった。かように、ｎｕｃＡ プローブはｎｕｃＡ配列に特異的であり、また、インフルエンザ菌(H．influenz ae)の株の存在の診断に有用である。 組み換えプラスミドｐＰＸ６９１をもつ大腸菌(E．coli)株ＩｎｖαＦ’のサ ンプルは、発明者により、アメリカン タイプ カルチャーコレクション(Ameri can Type Culture Collection)、12301 Parklawn Drive、メリーランド州ロック ヴィル、20852、米国、に寄託され、そしてＡＴＣＣ受託番号９８１０４を割り 当てられている。プラスミドｐＰＸ６９１は、配列番号２の残基26〜603のアミ ノ酸配列を有するＮｕｃＡタンパク質をコードするｎｕｃＡ挿入物を含有する。 ＡＴＣＣに寄託された素材はまた、配列番号２のアミノ酸26〜603のアミノ酸 配列が、Ｋ７９Ｅ、Ｎ１８６Ｋ、Ｓ２６２Ｇ、Ｖ２９４Ａ、Ｅ３０５Ｑ、Ｋ３２ ７Ｒ、Ｔ３３７Ａ、Ｄ３６０Ｙ、Ｒ３７６ＨもしくはＶ４３６Ｉから成る群から 選択されたアミノ酸残基の変化の１個もしくはそれ以上により改変されるものを 包含するがしかしそれらに制限されないＮｕｃＡタンパク質に生物学的に同様な 配列を生じさせるために、慣習的な遺伝子工学技術と共にも使用され得る。 本発明がよりよく理解されうるために、以下の実施例が述べられる。この実施 例は、例証のみの目的のためであり、また、本発明の範囲を制限するように解釈 されるべきでない。 実施例 以下のインフルエンザ菌(H．influenzae)の株を使用した。すなわちＮＴＨｉ株 Ｐ８６０２９５ フィラデルフィア州ピッツバーグの小児病院からの耳の単離物 Ｐ８１０３８４ フィラデルフィア州ピッツバーグの小児病院からの耳の単離物 Ｐ８１０５６８ フィラデルフィア州ピッツバーグの小児病院からの臨床単離物 Ｐ８６１４５４ フィラデルフィア州ピッツバーグの小児病院からの喉の培養系 Ｐ８８０８５９ フィラデルフィア州ピッツバーグの小児病院からの耳の単離物 Ｎ１９５５ ダラスのテキサス大学サウスウェスタンメディカルセンターか らの臨床単離物 ＴＮ１０６ ダラスのテキサス大学サウスウェスタンメディカルセンターか らの臨床単離物 ＳＨ１０１３ テキサス州からの耳の単離物 ＳＨ１０１４ オハイオ州からの耳の単離物 ＳＨ１０１５ テキサス州からの血液単離物 ＤＬ２０８ ダラスのテキサス大学サウスウェスタンメディカルセ ンターからの臨床単離物 Ｎ８３０１６１Ｅ ダラスのテキサス大学サウスウェスタンメディカルセンター からの臨床単離物 Ｈ３０５ フィラデルフィア州ピッツバーグからの臨床単離物タイプｂ イーガン アメリカン タイプ カルチャー コレクション(American Ty pe Culture Collection)、例えばＡＴＣＣ３１，４４１もしくは５３，７６３ ホイッティア(Whittier)マサチューセッツ州ボストンの小児病院からの非被包性 タイプｂ 標準的な分子生物学技術が、サンブルック(Sambrook)ら（３）に記述されたプ ロトコールに従って利用される。 実施例１ ＮｕｃＡタンパク質の同定 全てのＮＴＨｉ株、ならびにタイプｂのイーガンおよびホイッティア株を、10 μg/mlのヘミンストック（100mlの溶液あたり0.1gのヘミン、0.1gのヒスチジン 、４mlのトリエタノールアミン）および40μg/mlのＮＡＤ、もしくは、２％フィ ルズ(Fildes)強化(enrichment)（レメル(Remel)、カンサス州レネクサ）および2 0μg/mlのＮＡＤで補充されたＢＨＩ（脳心注入）培地中で増殖させた。培養系 は振とうしながら37℃でインキュベーションした。 ＮＴＨｉｎＰ８６０２９５からの細胞培養系をペレットにし、ＰＢＳもしくは 生理的食塩水で洗浄し、そして培養系１リットルあたり10mlの３Mチオシアン酸 カリウム−0.1Mリン酸、pH6.0中で再懸濁し、そして室 温（ＲＴ）で30分間揺らした。特有のバンド（外層膜タンパク質（ＯＭＰ）と異 なる）が、チオシアン酸カリウム抽出物を12％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で流した 場合に見られた。これらのタンパク質の１種は約63kDで動き（図１を参照）、そ して下述のようにさらに精製した。 チオシアン酸カリウム抽出物を、ソルブオール(Sorvall)遠心分離器で8000rpm で20分間、その後ＳＳ−３４ローターで10,000rpmで15分間の遠心分離により透 明にした。上清を0.22μmのフィルターを通過させ、そして、0.05Mリン酸ナトリ ウム、pH7.0のそれぞれ２リットルの２回交換に対して透析した。透析された抽 出物を、バイオゲル［Bio-Gel］（商標）ＨＴヒドロキシルアパタイト（ＨＡ） カラム（抽出物1mlあたり0.2〜0.3mlのＨＡ）に負荷し、そして0.05Mリン酸、pH 7.0で平衡化した。このカラムを約10カラム体積の0.05Mリン酸、pH7.0で洗浄し た。63kDのタンパク質を、約５〜６カラム体積の0.3Mリン酸、pH7.0、次いで同 様の体積の0.4Mリン酸、pH7.0で段階溶出した。当該タンパク質を含有するフラ クションをプールし、そしてＹＭ３０メンブレンを使用してアミコン(Amicon)攪 拌セル(stir cell)中で濃縮し、そして粒状物質を3000rpmで10分間、ペレットに した(pelleted)。上清を、第二のＨＡカラム（第一のカラムの約半分の体積）で のさらなる精製のため、0.05Mリン酸、pH7.0に対して透析し、そして0.05Mリン 酸、pH7.0で平衡化した。サンプルを負荷した後、カラムをまず0.05Mリン酸、pH 7.0、その後0.3Mリン酸、pH7.0（約２カラム体積）で洗浄した。タンパク質を、 0.3M−0.4Mリン酸、pH7.0の濃度勾配（約３カラム体積）で溶出した。フラクシ ョンを収集し、そして本質的に純粋な63kDのバンドを含有するもの全て（ＳＤＳ −ＰＡＧＥゲルによる大きさを基にして同定される）をプールしそし て濃縮した。 最後に、第三のＨＡカラムから溶出された100μgのタンパク質を繰り返してセ ントリコン(Centricon)３０中で限外濾過してリン酸を滅菌水で置き換え、エタ ノール沈殿し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた（図２を参照）。濃度はピータ ーソン−ロウリー(Peterson-Lowry)法により測定し、また、Ｎ末端アミノ酸配列 決定分析を実行した。最初の26アミノ末端残基は、配列番号２の残基26〜51に述 べられた配列を有する。同質性までの精製を、ゲル上でタンパク質を電気泳動す ること、およびその後に63kDのバンドを切り抜くことにより果たした。このタン パク質をゲル薄片から電気溶出し、エタノール沈殿し、定量し、ＳＤＳ−ＰＡＧ Ｅ上でチェックし、そして免疫原性試験１で使用した。下の実施例７を参照。 動物試験（試験１）を、ＮｕｃＡタンパク質の免疫原性を決定するために実行 した。動物試験のデータについて下の表３、５および６を参照。このタンパク質 に対する抗体力価を測定した。全細胞（ＷＣ）および殺菌（ＢＣ）アッセイを血 清で測定した。「ＮｕｃＡ」と称される天然のタンパク質が、ＷＣ酵素免疫測定 法（ＥＬＩＳΛ）で試験された全ての株で抗原性かつ交差反応性であることが見 出された。加えて、当該血清は、試験された４個の異種株のうち２個に殺菌活性 を有した。従って、ＮｕｃＡタンパク質は潜在的なワクチン候補であるとみなさ れた。より大量のＮｕｃＡタンパク質を生じさせるためには、このタンパク質を コードする遺伝子をまず同定し、そして、組み換え的に発現させるためにクロー ニングしなければならないことができた。 実施例２ ｎｕｃＡ遺伝子のクローニング 予備段階 この作業を実施することにおいて、以下の試薬および株を使用した。すなわち 、ニューイングランド バイオラブス(New England Biolabs)（マサチューセッ ツ州ビバリー）もしくはベーリンガー マンハイム(Boehringer Mannheim）（イ ンジアナ州インジアナポリス）からのＤＮＡ改変酵素；ベーリンガー マンハイ ムからのアガロースＬＥ；ＦＭＣ（メーン州ロックランド）からのシープラーク ［Sea Plaque］（商標）低温溶融アガロース；シグマ(Sigma)（ミズーリ州セン トルイス）からのアデノシン５’−モノリン酸およびアデノシン；Ｊ．Ｔ．ベイ カー ケミカル カンパニー(J.T．Baker Chemical Co.)（ニュージャージー州 フィリップスバーグ）からのＳｉ２５０Ｆ ＴＬＣプレート；インビトロジェン (Invitrogen)（カリフォルニア州サンディエゴ）からのＴＡクローニングキット 、ＩＮＶαＦ’、ならびにｐＲＳＥＴＣおよびｐＴｒｃＨｉｓＣ発現ベクター； ノヴァジェン(Novagen)（ウィスコンシン州マディソン）からのＢＬ２１（ＤＥ ３）ｐＬｙｓＳ、ｐＥＴ１２ａおよびｐＥＴ２０ｂ；ストラタジーン(Stratagen e)（カリフォルニア州ラホヤ）からのλ Ｚａｐ（商標）IIベクターおよびＸＬ Ｉ−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’宿主株。 使用された標準的分子生物学の方法は、サンブルック(Sambrook)ら（３）によ り報告されたものと同様であった。 全てのＮＴＨｉ株、ならびにタイプｂのイーガンおよびホイッティア株を、10 μg/mlのヘミンストック（100mlの溶液あたり0.1gのヘミン、0.1gのヒスチジン 、４mlのトリエタノールアミン）および40μg/mlのＮＡ Ｄ、もしくは、２％フィルズ強化および20μg/mlのＮＡＤで補充されたＢＨＩ（ 脳心注入）培地中で増殖させた。培養系は振とうしながら37℃でインキュベーシ ョンした。λ Ｚａｐ（商標）IIベクター中でのＰ８６０２９５ライブラリーの構築 およそ50μg（100μl）のＰ８６０２９５の染色体ＤＮＡを、10×緩衝液４（ ニューイングランド バイオラブス［ＮＥＢ］）中、65℃で50分間、20単位のTs p509I制限酵素（ＮＥＢ）で切断した。断片（４〜10kb）を、40Vで約14時間流さ れた0.7％シープラーク（ＦＭＣ）アガロースゲル上でゲル単離した。適切な大 きさのバンドをゲルから切り抜き、70℃で融解し、１体積の１×ＴＥ、pH7.5で 希釈しそして等体積の温（ＲＴ〜37℃）フェノールで抽出した。上清をクロロホ ルム抽出してフェノールを除去し、1/10体積の３M酢酸ナトリウムを添加し、そ してＤＮＡを２体積の冷無水エタノールで沈殿させた。ＤＮＡをペレットにし、 70％エタノール中で洗浄し、乾燥しそして10μlの滅菌水中に再懸濁した。異な る量のＤＮＡを、EcoRI切断されかつ脱リン酸化されたλ Ｚａｐ（商標）IIベ クターのアーム(arm)（ストラタジーン）に12℃で一夜連結した。λ Ｚａｐ（ 商標）IIベクターは、そのベクター内に含有されるクローニングされた挿入物の インビボでの削除および再環化を可能にしてクローニングされた挿入物を含有す るファージミドを形成するようデザインされている。ライゲーションを、ストラ タジーンの抽出物を使用してパッケージングし、そしてＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲ Ｆ’細胞でプレートで培養した。挿入の効率は、Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４− クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）プレート上での青 色プラークに対する白色プラークに基づき、90％から95％まで変動した。白色プ ラークは約４〜６kbの挿入物を含有した。 ライブラリーからのプラークを、ジゴキシゲニン−11−ｄＵＴＰ（ｄｉｇ−ｄ ＵＴＰ）プローブ（ベーリンガー マンハイム）でのハイブリダイゼーションに よるかもしくはＰＣＲ反応（下を参照）でかのいずれかにより、モノクローナル およびポリクローナル抗体もしくはＤＮＡプローブでスクリーニングした。 λ Ｚａｐ（商標）IIライブラリーのイムノブロットスクリーニング λプラーク約500pfuを、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（Ｉ ＰＴＧ）を加えた100mmのＴＹ（水酸化ナトリウムでpH7.5に調節された培地１リ ットルあたり５gの塩化ナトリウム、２gの硫酸マグネシウム７水和物、５gの酵 母抽出物、10gのトリプトンに、15gのディフコ(Difco)アガーを加える）プレー ト上で培養し、そして37℃で一夜インキュベーションした。このプレートを最低 ２時間４℃で冷却した。プラークを、５〜10分間、乾燥したシュライヒャー ア ンド シュエル(Schleicher & Schuell)（ニューハンプシャー州キーン）ＮＣ（ 商標）ニトロセルロースメンブレンでブロットした。このフィルターを、100mm ペトリ皿中の15mlの５％ブロット(BLOTTO)（１×ＰＢＳ中）中でブロックした。 トゥイーン［Tween］（商標）−２０（0.1〜0.3％）をときどき添加してバック グラウンドを0.1〜0.3％に低下させた。フィルターをＲＴで４〜６時間もしくは 37℃で１時間揺らした。ブロット(BLOTTO)を除去し、そして５％ブロット中の一 次抗体をフィルターとともに４℃で一夜インキュベーションした。使用された一 次抗体は、モノクローナル抗体Ｎｔ６３−３４−２５、Ｎｔ６３−６０−１４、 Ｎｔ６３／２−１ −４５およびＮｔ６３／２−１３−４２（実施例７で記述されるように生じさせ た）、もしくはこれらの４種のモノクローナル抗体の混合物、または、ＸＬ１− Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’、Ｙ１０９０Ｒ^-、Ｙ１０８９Ｒ^-およびＹ１０８８細胞培養 系ならびにλ Ｚａｐ（商標）IIライセートに吸収されていたポリクローナルウ サギ血清であった。洗浄を、各５〜10分間、15mlの５％ブロットでＲＴで行い、 ３回繰り返した。その後、フィルターを、0.1〜0.3％のトゥイーン［Tween］（ 商標）−２０を加えたもしくは加えない５％ブロット中で1000倍に希釈された二 次抗体（ホスファターゼを結合されたＫＰＬ抗マウスＩｇＧ＋Ｍ ＱＪ０８−１ ）とともにインキュベーションし、そしてＲＴで１時間揺らした。再度、フィル ターを、0.1〜0.3％のトゥイーン［Tween］（商標）−２０を加えた１×ＰＢＳ の各15mlでＲＴで５〜10分間３回洗浄した。１回の追加の洗浄を１×ＰＢＳ中で 実行した。フィルターをその後、展開(developing)緩衝液（0.1Mトリス、pH9.5 、0.1M塩化ナトリウム、５mM塩化マグネシウム）中でＲＴで５分間平衡化した。 フィルターをその後、45μlのＮＢＴ（ニトロブルーテトラゾリウム）および35 μlのＢＣＩＰ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸）を加えた10m lの展開緩衝液を含有するペトリ皿中に置き、そして揺らして、フィルターを展 開剤に確実に浸した。それをその後、スポットが十分に濃くなるまで暗所で平坦 な面上に留めた。反応を、フィルターを脱イオン水中で数回すすぐことにより停 止し、そして暗所で３ＭＭワットマン紙上で乾燥した。 λ Ｚａｐ（商標）IIプラークに対する高バックグラウンド反応性の問題が存 在するようであった。二次抗体がバックグラウンド結合の主要原因であることが 見出された。アルカリホスファターゼを結合されたヤ ギ抗マウスＩｇＧ＋Ｍのロット番号ＱＪ０８−１（カーキーガード アンド ペ リー ラブス(Kirkegaard & Perry Labs)、メリーランド州ゲイタースバーグ） は、試験されたもののうち、1000倍希釈で使用された場合に最低のバックグラウ ンドを有した。イムノブロットスクリーニングは、ＮｕｃＡについてのいずれか の陽性クローンを生じなかった。バックグラウンドの非特異的結合により、この 方向でのさらなる研究は有望と思われなかった。従って、別の戦略を採用してｎ ｕｃＡクローンおよび配列を引き出そうと試みた。λ Ｚａｐ（商標）IIライブラリーでのプラークハイブリダイゼーション ２個の24merの縮重オリゴヌクレオチドプローブを、ＮｕｃＡタンパク質のＮ 末端配列から（下の実施例４を参照）、およびこの目的のために編集されたイン フルエンザ菌(H．influenzae)のコドン使用頻度表を利用してデザインした。当 該プローブは成熟タンパク質のＮ末端のアミノ酸１〜８および14〜21を包含し、 そしてそれぞれＰ１およびＰ２と命名した。 Ｐ１ ＡＡＡＧＡＡＧＣＡＣＣＡＣＡＡＧＣＡＣＡＴＡＡＡ（配列番号３） Ｐ２ ＡＴＴＴＴＡＣＡＴＡＴＴＡＡＴＧＡＴＣＡＴＣＡＴ（配列番号４） Ｐ１およびＰ２はそれぞれ４塩基で揺らいだ(wobbled)。Ｐ１については、残基 ９のＡはＴであることがあり、残基12のＡはＴであることがあり、残基18のＡは Ｔであることがあり、そして残基21のＴはＣであることがある。Ｐ２については 、残基３のＴはＣであることがあり、残基９ のＴはＣであることがあり、残基12のＴはＣであることがあり、そして残基21の ＴはＣであることがある。プライマーＰ１は、ヌクレオチド309のＧがこのプラ イマーでＡであることを除いては配列番号１のヌクレオチド304〜327に対応する 。プライマーＰ２は、ヌクレオチド348のＧがこのプライマーでＡであることを 除いては配列番号１のヌクレオチド343〜366に対応する。当該オリゴヌクレオチ ド類(oligos)を、供給元の推奨に従ってｄｉｇ−ｄＵＴＰで３’末端標識した。 Ｐ１およびＰ２のプローブを、EcoRIおよびBamHIで切断されたＰ８６０２９５ の染色体ＤＮＡならびにEcoRIで切断されたＸｌ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’の染色 体ＤＮＡでのサザンハイブリダイゼーションによりゲノムＤＮＡでチェックした 。Ｐ８６０２９５のＤＮＡでは、唯一のバンドがEcoRI切断物のおよそ４kbにＰ １プローブでみられた一方、Ｐ２プローブでおよそ４kbおよび1.8kbに２個のバ ンドがみられた。Ｐ８６０２９５のＤＮＡのBamHI切断物はおよそ30kbのバンド を示した。ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’のＤＮＡは当該プローブと交差反応しな かった。プローブとしてのＰ１とのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリ ダイゼーションのインキュベーションを53℃で実行し、Ｐ２プローブについては それらは45℃で実行した。Ｐ１ハイブリダイゼーションの洗浄は48℃で実行し、 Ｐ２についての洗浄は標準的プロトコールに従って40℃で実行した。 プラークの取り上げ(lift)を、ハイボンド(Hybond)-Ｎ（アマーシャム(Amersh am)）のプロトコール小冊子の方法に従って実行した。プレハイブリダイゼーシ ョンおよびハイブリダイゼーションを42℃で実行した一方、洗浄はＰ１について 45℃およびＰ２について38℃で実行した。10 0mmプレートあたり約1000pfuのライブラリーのライセートの10枚のプレートを、 Ｐ１もしくはＰ２をプローブとして使用してスクリーニングした。フィルター９ （Ｐ２プローブ）から５個およびフィルター５（Ｐ１プローブ）から１個の６個 の推定陽性を選んだ。これらを取っておき、そしてＰＣＲによりさらにスクリー ニングした。ＰＣＲスクリーニングの項の下を参照。ファージライブラリーＤＮＡの精製 −およそ５mlのＰ８６０２９５のλ Ｚａｐ （商標）IIライブラリーファージを、グリセロール段階濃度勾配（９）により精 製した。ファージＤＮＡをおよそ1ng/μLで20μLのＴＥ（10mMトリスー塩酸、pH 8.0、１mMＥＤＴＡ）で再懸濁した。ＤＮＡの精製 −ＤＮＡは、直接、または、製造元により記述されたように塩化リ チウムプロトコール（10）もしくはジーンクリーン(GeneClean)キット（バイオ １０１インク(Bio 101 Inc.)）を使用するアガロースゲルからかのいずれかで精 製した。プラスミドのミニプレップＤＮＡを、ウィザード(Wizard)ミニプラスミ ドＤＮＡキット（プロメガ(Promega)）もしくは標準的なアルカリ溶解−フェノ ール抽出法を使用して１mLの一夜培養系から単離した。大スケールのプラスミド ＤＮＡは、キアゲン(Qiagen)マキシプラスミドＤＮＡキット（キアゲン インク (QIAGEN Inc.)を使用して100〜500mLの−夜培養系から単離した。ｎｕｃＡの部分的ＤＮＡ配列 −以下の実験を行う理論的根拠は２つの面を有した 。すなわち、（１）ＮＴＨｉのλ Ｚａｐ（商標）IIライブラリーは部分的なTs p509Iのゲノム切断物から構築し、従って、別個の大きさのＰＣＲのバンドは、 図３に図解されるように、ファージ特異的プライマーＴ３（配列番号１６）およ びＴ７（配列番号８）ならびにｎｕ ｃＡ特異的プライマーＰ１（配列番号３）およびＰ２（配列番号４）の組み合わ せを使用してＮＴＨｉのλ Ｚａｐ（商標）IIライブラリーを増幅することによ り生じられるはずである；および、（２）ＰＣＲは、より緊縮が小さくされ得、 そして従ってプライマーのアニーリングとのヌクレオチドのミスマッチにより耐 性にされ得る。プライマーＴ３は以下の配列を有する（ｎｕｃＡに対応しない） ： Ｔ３ ＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡ（配列番号１６） ２個のＤＮＡ増幅反応を行った。一方はＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ベーリ ンガー マンハイム）と、そして他方はＰＦＵ ＤＡＮポリメラーゼ（ストラタ ジーン）とであった。増幅サイクルは以下のようであった。すなわち、変性、95 ℃50秒間；アニーリング、58℃60秒間；伸長、72℃４分間、30サイクル、そして その後72℃10分間。反応のアリコートをアガロースゲルで電気泳動した。およそ 2,000bpおよび600bpのＤＮＡ断片を、それぞれＴ３＋Ｐ１プライマーおよびＴ７ ＋Ｐ１プライマーを使用して観察した。プライマーＴ７（配列番号８）は以下の 配列を有する（ｎｕｃＡに対応しない）： Ｔ７ ＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＣ（配列番号８） およそ600bpおよび2,000bpの双方のＤＮＡをゲル単離した。これらのＤＮＡを再 増幅するため、ならびに、ＮＴＨｉのλ Ｚａｐ（商標）IIライブラリーのＤＮ Ａとの以前のＰＣＲ反応を再現するための試みがなされた。ＰＣＲ反応での伸長 時間を72℃で２分間に短縮した。ＮＴＨｉのλ Ｚａｐ（商標）IIライブラリー のＤＮＡとのＰＣＲ反応のみが、およそ600bpのＰＣＲ産物を産生した。 およそ600bpの増幅されたＤＮＡをゲル単離し、供給元（インヴィト ロジェン）により推奨されたようにＴＡクローニングキットを使用してｐＣＲ（ 商標）IIベクター中にクローニングした。生じたプラスミドをｐＰＸ６４０と呼 称した。ＰＣＲ挿入物のＤＮＡ配列は、蛍光ジデオキシヌクレオチド三リン酸を 使用するＡＢＩ ３７０Ａ ＤＮＡシークェンサーで決定され、そして、Ｐ１領 域の揺らぎ位置に２塩基の差異をもつ、配列番号１のヌクレオチド304ないし約8 40に対応する。ヌクレオチド309はＡでありかつヌクレオチド315はＴである。挿 入物ＤＮＡの５’−末端から推定されるアミノ酸配列は、実施例１に記述された 天然の成熟ＮｕｃＡタンパク質のＮ末端タンパク質配列と同一であった。これは 部分的ｎｕｃＡ遺伝子の適正なクローニングを確認した。 上と類似のＰＣＲのバンドを、ＰＣＲ反応をＰ２の対で行いかつアニーリング 温度を48℃に低下させた場合に得た。およそ1.7kbのバンドをＴ３プライマー対 で増幅し、また、およそ600bpのバンドがＴ７プライマー対とで見られた。これ らの増幅された断片をｐＣＲ（商標）IIベクターに同様にクローニングした。６ 個の白色コロニーを、Ｐ２／Ｔ３およびＰ２／Ｔ７ライゲーションのそれぞれか ら選んだ。全てはEcoRI切断によりチェックされた場合に挿入物を有した。約600 塩基およびおよそ1.7kbの配列を、それぞれＰ１／Ｔ７クローンおよびＰ２／Ｔ ３クローンから得た。２個のクローンのオーバーラップ配列は、Ｐ２プライマー が縮重オリゴヌクレオチドであるため、Ｐ２領域に期待された変化を伴い、同様 であった。Ｐ１／Ｔ７クローンはｎｕｃＡの５’の536塩基を含有し、また、Ｐ ２／Ｔ３クローンはＰ１の下流で開始しかつ約1600塩基連続した。完全な上流お よび下流の配列はこれらのクローンに包含されなかった。ＰＣＲスクリーニング イムノブロット（λ Ｚａｐ（商標）IIライブラリーの イムノブロットスクリーニングから、上を参照）およびオリゴヌクレオチドハイ ブリダイゼーションブロット（プラークハイブリダイゼーションから、上を参照 ）からの推定陽性を、それぞれ配列番号５および６のｎｕｃＡプライマー４１０ １ｅｘｔおよび４１０２ｅｘｔを使用するＰＣＲ増幅にかけた。これらのプライ マーはｐＰＸ６４０のｎｕｃＡ領域の配列決定の間に生じられ、そして以下の配 列を有する： ４１０１ｅｘｔ ＣＣＡＡＡＧＴＧＧＡＴＡＴＴＧＧＴＧ 配列番号５ ４１０２ｅｘｔ ＣＡＴＣＡＴＡＧＡＡＣＴＴＣＡＣＡＴＣ 配列番号６ プライマー４１０１ｅｘｔは配列番号１のヌクレオチド416〜433に対応する。プ ライマー４１０２ｅｘｔは配列番号１のヌクレオチド817〜835の相補物に逆方向 で対応する。 イムノブロットもしくはオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションからの推 定陽性のいずれも、これら２個のｎｕｃＡプライマーで増幅された場合に予測さ れた420bpのバンドを与えなかった。ｎｕｃＡの420bpのプローブの産出と標識 同じ配列決定プライマー、４１０１ｅｘｔ（配列番号５）および４１０２ｅｘ ｔ（配列番号６）を、420bpのプローブを生じさせるのに使用した（図４の上を 参照）。当初は、当該プローブをｐＰＸ６４０から生じさせた。後に、全ての標 識されたプローブをＰ８６０２９５のゲノムＤＮＡから作成した。染色体のＰ８ ６０２９５ＤＮＡの使用は、λ Ｚａｐ（商標）IIクローンのスクリーニングの バックグラウンドを低下さ せた。この420bpのプローブを、標識されないヌクレオチドの混合物を使用し、 かっ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ベーリンガー マンハイム）とのＰＣＲ反 応での標識されたｄｉｇ−ｄＵＴＰヌクレオチドの濃度を変動させてｄｉｇ−ｄ ＵＴＰ標識した。染色体のＰ８６０２９５ＤＮＡを鋳型として使用し、これは低 下されたλ Ｚａｐ（商標）IIのバックグラウンドを提供した。ＰＣＲ増幅を30 サイクル行い、それぞれを95℃30〜45秒間（変性段階）、42〜52℃40〜50秒間（ アニーリング段階）そして72℃55〜60秒間（伸長段階）で行った。熱開始はゲノ ムＤＮＡで95〜98℃で２〜５分間行った。これらのＰＣＲプローブを、塩化リチ ウム−エタノール沈殿し、そして、最初の体積の半分ないし等量の0.1％ＳＤＳ 中に再懸濁し、よりよい再懸濁のため37℃で10分間加熱しそして−20℃で保存し た。420bpのプローブの500〜1000倍希釈をハイブリダイゼーションで使用した。 濃度の推定を、各希釈の１μlすなわち10^-2ないし10^-6を既知量の標識された標 準品と一緒にハイボンド−Ｎメンブレンの細片にスポットすること、および展開 後に強度を合わせることにより行った。420bp のプローブでのプラークハイブリダイゼーション プラークハイブリダイ ゼーションもまた、製造元の推奨（アマーシャムからのハイボンド−Ｎメンブレ ン、ベーリンガー マンハイムからのプローブ標識のためのｄｉｇ−ｄＵＴＰ） に従い、ｐＰＸ６４０プラスミドＤＮＡ（上を参照）からのｄｉｇ−ｄＵＴＰ標 識された420bpのプローブを使用し、かつ標準的プロトコール（３）を使用して 行った。しかしながら、このプローブは、ベクター単独（λ Ｚａｐ（商標）II ）のプラークで試験された場合に高いバックグラウンドを生じた。λ Ｚａｐ（ 商標）IIラ イブラリーからの潜在的な陽性プラークを同定しかつ分析したが、しかし、サザ ンハイブリダイゼーション実験で適正な大きさのバンドを生じなかった。 より多くのライブラリーのフィルターおよびλ Ｚａｐ（商標）II対照フィル ターを、Ｐ８６０２９５の染色体ＤＡＮから生じさせたｄｉｇ−ｄＵＴＰ標識し た420bpのプローブで探った(probed)（上を参照）。２個の推定陽性が数個の疑 わしい陽性と一緒に同定された。プラークを選び、そして二次スクリーニングの ためプレート培養した。再度の探り(reprobing)はいくつかのかすかなプラーク を示した。ファージミドを誘導し、そして切断をＤＮＡで行った。サザンハイブ リダイゼーションを切断物で実行し、そして２個の推定陽性が推定のｎｕｃＡ配 列（ｐＰＸ６４３から；下を参照）に若干の相同性を示した。４１０１ｅｘｔ（ 配列番号５）および４１０２ｅｘｔ（配列番号６）プライマーでのＰＣＲ増幅に かけた場合、２個の陽性は期待された420bpのバンドの増幅を示さなかった。こ れらのクローンはｎｕｃＡへの限られた相同性を有すると思われ、そして、ＰＣ ＲクローンｐＰＸ６４３と比較された場合に異なる制限酵素切断パターンを示し た。３’末端のｎｕｃＡのＤＮＡ −ｎｕｃＡ遺伝子の５’および３’の双方の末端の ＤＮＡ配列（最初のｐＰＸ６４０構築物に存在しない）を得るため、逆ＰＣＲの 方法論を図５に図解的に示されるように使用した。EcoRIもしくはEcoRVで切断さ れそしてｎｕｃＡ特異的な420bpのＤＮＡプローブでハイブリダイゼーションさ れたＮＴＨｉのゲノムＤＮＡのサザン分析は、以下の結果を生じた。すなわち、 EcoRI切断されたゲノムＤＮＡについては、２個のバンドをおよそ4.5kbおよび1. 6kbに検出した。 EcoRV切断されたＤＮＡについては、１個のバンドをおよそ７kbに検出した。こ れらのEcoRIおよびEcoRV切断されたＰ８６０２９５のゲノムＤＮＡの10倍希釈を 、その後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を使用して自己連結した。これらの ＤＮＡをＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼで逆ＰＣＲの方法論を使用して増幅した。 増幅サイクルは以下のようであった。すなわち、95℃50秒間、52℃90秒間、72℃ ４分間、30サイクル、そしてその後72℃10分間。反応のアリコートをアガロース ゲルで電気泳動した。EcoRI連結されたＤＮＡとともに、プライマー４１２１ｆ ｗｄ（配列番号１７）ＧＣＴＴＴＣＡＧＣＴＡＡＴＧＴＧＡＴＴＣＣおよび４１ ２２ｅｘｔ（配列番号１８）ＣＡＴＣＡＣＡＧＣＴＧＣＡＴＣＴＧＣＡＧを、上 流のｎｕｃＡのＤＮＡの増幅反応に使用し、また、プライマー４３１３ｅｘｔ（ 配列番号７）および４１０２ｅｘｔ（配列番号６）を下流のｎｕｃＡのＤＮＡの 増幅反応に使用した。プライマー４１２１ｆｗｄは配列番号１のヌクレオチド66 9〜689に対応する。プライマー４１２２ｅｘｔは、配列番号１のヌクレオチド55 1〜570の相補物に逆方向で対応する。プライマー４１２２ｅｘｔおよび４３１３ ｅｘｔを、上流および下流双方のｎｕｃＡのＤＮＡの増幅のために、EcoRV連結 されたＤＮＡとともに使用した。およそ1.3kbの断片がｎｕｃＡのEcoRIの下流領 域について観察された。かすかなおよそ２kbの断片がEcoRV切断されたＤＮＡに ついて観察された。ｎｕｃＡのEcoRIの上流領域についてはＤＮＡのＰＣＲ産物 は観察されなかった。ゲノムＤＮＡもしくはＮＴＨｉのλ Ｚａｐ（商標）IIラ イブラリーＤＮＡのいずれかからｎｕｃＡ遺伝子の５’末端を増幅する他の試み は、他の手段により得られたｎｕｃＡ配列に合ったいかなるＤＮＡ産物もしくは ＤＮＡ配列のいずれも産生できな かった。およそ1.3kbのＰＣＲの下流の産物を直接に配列決定し、ならびにｐＣ Ｒ（商標）IIベクターにクローニングし、そしてこのプラスミドをｐＰＸ８００ と命名した。ＤＮＡ配列データから、ｎｕｃＡ遺伝子の完全な３’末端配列、Ｔ ＡＡ終止コドンおよび付加的な下流の非翻訳配列を得た。ゲノムの「成熟」ｎｕｃＡのクローニング −成熟ｎｕｃＡ遺伝子の完全な配列を 確認しかつ得るため、ＰＣＲ反応を、酵素切断されないＰ８６０２９５のゲノム ＤＮＡにＰ１縮重（配列番号３）および６３Ｋ逆(Reverse)（Ｒｅｖ）（配列番 号９）プライマーを使用して行った。６３Ｋ Ｒｅｖプライマーは以下の配列を 有し、これは逆方向の配列番号１のヌクレオチド2095〜2114の相補物である： ６３Ｋ Ｒｅｖ ＧＡＡＧＴＣＴＴＣＡＡＡＣＣＴＡＧＧＡＣ（配列番号９） Ｐ８６０２９５のゲノムＤＮＡのおよそ１μgを、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ およびこれら２種のプライマーから成るＰＣＲ反応で使用した。反応のアリコー トをアガロースゲルで電気泳動した。およそ1.8kbの予測された大きさのＤＮＡ 断片が観察された。このＤＮＡ断片をゲル精製し、そしてｐＣＲ（商標）IIにク ローニングし、そしてこのプラスミドをｐＰＸ６４３と命名した。ｐＰＸ６４３ 中のｎｕｃＡのＤＮＡ配列を決定し、そしてこれはより早期の一連の部分的デー タからの配列と合った。このクローンは完全な成熟ｎｕｃＡ配列を含有するが、 しかし上流のプロモーター領域およびシグナル配列を失っている。ＰＣＲを使用するｎｕｃＡの５’上流の配列 Ｐ１／Ｔ７およびＰ２／Ｔ３クロ ーンの配列決定の間に合成されていたいくつかの異なるｎｕｃ Ａプライマーに結合されたＴ３およびＴ７プライマーを使用して、Ｐ８６０２９ ５のλライブラリーから作成されたＤＮＡからのプロモーター領域を増幅するい くつかの試みがなされた。これらの反応のどれも必要とされた断片を生じなかっ た。EcoRIの4.3kbの断片からの逆ＰＣＲによりこの領域を増幅する試みもまた不 成功であった（上を参照）。従って、好ましくは4.3kbの断片より小さな他の制 限酵素切断断片を逆ＰＣＲに考慮した。サザンを、ｄｉｇ−ｄＵＴＰ標識された 420bpの染色体プローブ、ならびに、制限酵素PstI、SalI、EcoRV、BamHI、ApaI 、AvaI、KpnI、SaCI、SmaI、XbaI、XhoI、ならびにＡＴ豊富な酵素BglII、HindI II、NsiI、SnaBI、SspIおよびPacIを使用して、Ｐ８６０２９５のゲノムＤＮＡ で実行した。これらのハイブリダイゼーションから、限られたゲノム制限酵素地 図を得た（図４を参照）。 NsiI切断物はｎｕｃＡの420bpのプローブとハイブリダイゼーションしたおよ そ３kbのバンドを与えた。これは、同定された、より小さな片の１種である。従 って、この３kbの断片をゲノム切断物からゲル単離し、自己連結しそして逆ＰＣ Ｒに支給した。およそ２kbの断片を、４１０２ｅｘｔ（配列番号６）および４３ １３ｅｘｔ（配列番号７）プライマーでの、自己連結されたNsiI断片の増幅で得 た。プライマー４３１３ｅｘｔ（配列番号７）は以下の配列を有し、これは配列 番号１のヌクレオチド1762〜1779に対応する： ４３１３ｅｘｔ ＧＴＧＡＧＴＧＴＴＧＡＡＧＴＣＴＴＧ（配列番号７） この断片を配列決定しそしてｐＣＲ（商標）IIベクターにクローニングした。12 個のコロニーのうち11個が挿入物を有し、10個は一方向であり （そしてｐＰＸ６７９と命名された）また１個は反対方向であった（そしてｐＰ Ｘ６８０と命名された）。ｐＰＸ６８０中の挿入物のＤＮＡ配列決定は、成熟ｎ ｕｃＡ遺伝子の上流の約1,020塩基の付加的配列を生じた。これ故に、このクロ ーンはｎｕｃＡ遺伝子のプロモーター領域およびシグナル配列を含有する。オー バーラップ領域の配列は以前のクローン（上述のｐＰＸ６４０、Ｐ２／Ｔ３クロ ーンおよびｐＰＸ６４３）からの配列と合致し、このクローンがｎｕｃＡである ことを確認した。配列番号１もまた参照。コスミドライブラリーの構築 コスミドライブラリーもまた以下のように構築し た。すなわち、Ｐ８１０３８４およびＰ８６０２９５からのゲノムＤＮＡをSau3 AIで部分的に切断して、30〜50kbの断片を生じさせた。これを、２個の組込み部 位を含有するλ ＤＮＡから構築されたプラスミド、ＳｕｐｅｒＣｏｓＩベクタ ー（ストラタジーン）のBamHI切断部位に連結した。使用された宿主株はＮＭ５ ５４（ストラタジーン）であった。コロニーを、抗ＮｕｃＡモノクローナル抗体 （Ｍａｂ Ｎｔ６３／２−１３−４２）、ポリクローナル抗体およびｄｉｇ標識 されたＤＮＡプローブでスクリーニングした。コスミドライブラリーのイムノブロットスクリーニング Ｍａｂ Ｎｔ６３／２ −１３−４２は、コロニーブロットでＰ８１０３８４株に十分反応しなかった。 従って、Ｐ８１０３８４ライブラリーでのスクリーニングを停止した。数個の推 定陽性をＰ８６０２９５ライブラリーから同定した。推定陽性を画線培養し、そ して再スクリーニングしたが、しかしそれらは中程度の強度のものであった。ウ ェスタンをこれらの陽性（一夜培養系）で行い、そして変性されたＮｕｃＡに強 く反応するＭａｂ Ｎｔ６３−３４−２５で探った(probed)。しかしながら、ＮｕｃＡのバンドはウ ェスタンで見られなかった。従って、λ Ｚａｐ（商標）IIライブラリーでのよ うに、コスミドライブラリーのイムノブロットスクリーニングを中断した。コスミドライブラリーのコロニーハイブリダイゼーション 同様に、Ｐ８６０２ ９５のコスミドライブラリーを420bpのｄｉｇ標識されたプローブを使用してス クリーニングした。このスクリーニングは、５個のライブラリーフィルターから 同定された26個の推定陽性を生じた。それらを再スクリーニングし、そして４個 のみが陽性であり、その２個は強く陽性であった。４個の単離されたコロニーを 、強い陽性の１個から選び、そしてＤＮＡ調製物をサザン分析のため作成した。 ２個のコロニーからのＤＮＡは、EcoRI、HindIIIならびにScaIおよびEspIの切断 物との類似のハイブリダイゼーション制限酵素切断パターンを与えた一方、他の ２個のコロニーは異なる大きさにされたＤＮＡを与え、１個はより大きい、そし て１個はより小さい全体の挿入物の大きさであった。フィルターを70℃で洗浄し た場合は、２個の類似のコロニーはバックグラウンドの結合のみを与えた。他の ２個のクローンは70℃で陽性のハイブリダイゼーションを示し、そしてＰＣＲに よりさらに分析した。より大きな大きさにされたクローン１個のみがｎｕｃＡ遺 伝子の５’末端の大部分を含有した。このコスミドクローンの配列決定に際して 、ｎｕｃＡ挿入物は、成熟配列の開始から55塩基中側のSau3AI切断部位で開始す ることが見出され、また、その部位から下流に進行した。従って、それは成熟遺 伝子の５’末端からシグナル配列および付加的な55塩基を失っていた。コスミドライブラリーでのＰＣＲ 同様に、コスミドライブラリーから のパッケージングされたファージを、６３Ｋ Ｐ１ Ｒｅｖ（配列番号１９）Ｃ ＴＴＡＡＴＴＣＣＡＣＡＧＣＴＴＴＧＴＧＡＧＣ（18番目の塩基はまたＡであっ てもよく、また、21番目の塩基はまたＴであってもよい）およびＴ３（配列番号 ７）もしくはＴ７（配列番号８）プライマーを使用して増幅して、上流配列を引 き出した。プライマーＰ１ Ｒｅｖは、配列番号１のヌクレオチド319〜341の相 補物に逆方向で対応する。反応を、４１２２ｅｘｔ（配列番号１８）プライマー およびＴ３もしくはＴ７プライマーでもまた行った。42℃で、３個のスメアなバ ンドが、ｎｕｃＡ Ｐ１ Ｒｅｖ／Ｔ３もしくはＴ７の対で、およそ250、400お よび550bpに見られ、その全ては420bpのプローブとハイブリダイゼーションした 。４１２２ｅｘｔ／Ｔ３プライマー対ではバンドは得られなかった。類似のスメ アなバンドは４１２２ｅｘｔ／Ｔ７プライマーで見られた。50℃では、250bpの バンドのみが全４反応で得られた。Ｔ３もしくはＴ７単独はバンドを与えず、ま た、Ｔ３／Ｔ７プライマー対は非常にスメアなおよそ550および300bpのバンドを 与えた。ｎｕｃＡ Ｐ１ Ｒｅｖ／Ｔ７および４１２２ｅｘｔ／Ｔ７のＰＣＲ反 応からの３個のスメアなＰＣＲ産物を、キアクイック［QIAquick］（商標）カラ ム（キアゲン、カリフォルニア州チャッツワース）を通して精製し、50μlの水 で溶出し、そしてその２μlをｐＣＲ（商標）IIベクターにクローニングした。 ６個のクローンの４個が挿入物を有し、３個の異なる挿入物をｎｕｃＡ Ｐ１ Ｒｅｖ／Ｔ７のＰＣＲ産物について得た。しかしながら、およそ350bpの挿入物 のみを、４１２２ｅｘｔ／Ｔ７のＰＣＲ産物で得た（８個中７個が挿入物を有し た）。４１２２ｅｘｔ／Ｔ７クローンの配列は、成熟配列の５’末端から55塩基 中側のSau3AI切断部位で開始す るｎｕｃＡ配列に対応し、これは、上述のコスミドクローンに類似であった。完全なｎｕｃＡ配列の集成 完全なｎｕｃＡ配列を、５’上流配列、３’下流配 列および上述の部分的成熟配列を含有するオーバーラップクローンから集成した 。完全なｎｕｃＡ遺伝子配列は配列番号１のヌクレオチド229〜2037に述べられ る。シグナルペプチドはヌクレオチド229〜303によりコードされる。成熟Ｎｕｃ Ａタンパク質はヌクレオチド304〜2037によりコードされる。 実施例３ ＮｕｃＡタンパク質の発現 ｎｕｃＡ遺伝子をその後、クローニングし、そして、融合タンパク質もしくは 完全長のＮｕｃＡタンパク質（シグナルペプチドを伴う）のいずれかとして大腸 菌(E．coli)中で発現した。ｎｕｃＡ遺伝子を、表１に列挙されるような多様な 大腸菌(E．coli)発現ベクターに連結し、そして、それらの培養系を、ＮｕｃＡ タンパク質の発現について適切に誘導した。全細胞ライセートを正規化し(norma lized)そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上を流し、そして、クマシーで染色するか、 もしくは、ニトロセルロースメンブレンに転写しそして５％ブロット中500倍希 釈のウサギ抗ＮｕｃＡポリクローナル抗体で探る(probe)かのいずれかとした。 クローンを表１に列挙し、また、下述のように構築した。 ＮｕｃＡタンパク質および異種残基を含有する融合タンパク質を、ｐＲＳＥＴ 発現ベクター中にプラスミドｐＰＸ６４３からのｎｕｃＡ遺伝子をクローニング することにより発現した（図６を参照）。プラスミドｐＰＸ６４３は、実施例２ に記述されるように、ｐＣＲ（商標）IIベク ター中にクローニングされた完全な成熟ｎｕｃＡ配列を含有する。選ばれたｐＲ ＳＥＴの作り替え(version)は、製造元により「Ｃ」と称される読み取り枠を有 するものであった。このベクターは遺伝子１０のＴ７プロモーターすなわちアン ピシリン耐性遺伝子を含有し、かつ、ＣｏｌＥ１ ＤＮＡ複製開始点を有する。ｐＰＸ６４４の構築 −プラスミドｐＰＸ６４３およびｐＲＳＥＴＣを、Asp718制 限酵素で切断し、ジーンクリーン(GENECLEAN)法で精製し、XhoI酵素で再切断し 、そしてＤＮＡをアガロースゲル上で電気泳動した。およそ1.9kbのｎｕｃＡ含 有ＤＮＡ断片を単離し、そしてｐＲＳＥＴＣの単離されたＤＮＡに連結した。生 じるクローンをｐＰＸ６４４と呼称した。ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ形質転 換体をＲＺ１０３４と呼称した。 組み換えクローンｐＰＸ６４４は成熟ｎｕｃＡタンパク質のＮ末端領域に融合 された51個の付加的なアミノ酸を含有する。これらの付加的なアミノ酸はベクタ ーにより提供され、また、最初のメチオニンのすぐ下流に６個のヒスチジンを連 続して包含する。これは融合タンパク質の精製で援助する。このプラスミドを含 有する、誘導された培養系からの全細胞ライセートを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で電 気泳動し、そして、ウェスタンブロットを、ＮｕｃＡタンパク質に対するウサギ ポリクローナル抗血清を使用して実行した。ＲＺ１０３４単離物およびＢＬ２１ （ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ／ｐＲＳＥＴＣの一夜培養系を、125mlフラスコ中のアン ピシリン（100μg/ml）を加えた10mlの改変ＳＯＢ（５Ｎ水酸化ナトリウムでpH7 .0に調節された、20gのトリプトン、５gの酵母、0.6gの塩化ナトリウム、0.2gの 塩化カリウム）に接種し、そして37℃で126〜155のクレッ ト(Klett)比色計の示度まで増殖させた。誘導されない細胞の1mlのアリコートを 取り出し、遠心分離し、そしてクレット示度と同じマイクロリットル（μl）で の体積までＴＥ緩衝液（10mMトリス−塩酸、pH8.0、１mMＥＤＴＡ）で再懸濁し た。すなわち126のクレット示度は細胞を126μlのＴＥ緩衝液を使用して再懸濁 したことを意味する。誘導のため、ＩＰＴＧを増殖中の培養系に１mMの最終濃度 まで添加し、そして、インキュベーションを２時間継続して、最終的なクレット 示度を測定した。１ミリリットルを取り出し、そして1.5mlエッペンドルフチュ ーブ中で遠心分離した。細胞ペレットを、再びそのそれぞれの最終のクレット示 度に基づきＴＥ緩衝液中に再懸濁した。誘導されないおよび誘導された細胞のそ れぞれ90μlを、別のエッペンドルフチューブに取り出し、４×クラッキング(Cr acking)緩衝液30μlを添加し、そして、このチューブを、４−15％勾配ＳＤＳ− ＰＡＧＥゲル（バイオラッド ラボラトリーズ(Bio-Rad Laboratories)）上で20 μ1流す前に沸騰水浴中で10分間加熱した。タンパク質のバンドをニトロセルロ ース濾紙に転写し、そして、ウェスタンブロットを、ウサギポリクローナルＮｕ ｃＡ抗血清および抗ウサギＩｇペルオキシダーゼ（タゴ インク(Tago Inc.)） を使用して実行した。バンドを、ＴＭＢ試薬（プロメガ、ウィスコンシン州マデ ィソン）を使用して可視化した。予測された69kDの大きさのタンパク質産物が、 図７で示されるように、ブロットで明瞭に検出された。これはｎｕｃＡ遺伝子の 適正なクローニングを確認した。このサンプルでは、観察されたＮｕｃＡの誘導 性の欠如は、おそらく、増殖培地中の抗生物質クロラムフェニコールの非存在に よった。クロラムフェニコールはｐＬｙｓＳプラスミド（クロラムフェニコール 耐性遺伝子をもつ）の安定 な維持に必要とされる。これ故に、ｐＬｙｓＳプラスミドの消失は、ＮｕｃＡ発 現の高い基本（誘導されない）レベルをもたらすことができた。別個の実験で、 69kDのＮｕｃＡタンパク質は、クロラムフェニコールが増殖培地に包含された場 合に誘導可能であることがウェスタンブロットで示された（データは示されない ）。69kDのタンパク質のバンドはウェスタンブロットで検出され得るとは言え、 それはクマシーで染色された類似のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで検出されなかった（ データは示されない）。以下により拘束されることなく、クマシーゲルで組み換 えタンパク質を検出しないことの１個の可能性のある理由は、ｐＰＸ６４４中の クローニングされたｎｕｃＡ遺伝子のＮ末端の、51個の付加的な、ベクターにコ ードされるアミノ酸残基によることができる。 クマシーゲルで可視的な発現レベルを示した成熟クローンは、わずかに異なる 融合のアプローチを使用して構築した。ｐＰＸ６９３と呼称されるこのクローン を以下のように構築した。ｐＰＸ６８２の構築 −ｎｕｃＡ遺伝子を、その最後の17塩基が配列番号１のヌク レオチド304〜320に幾分対応する以下の配列を有するＲＳＥＴ−５プライマー（ 配列番号１５）（このプライマーは、縮重プライマーＰ１を使用して生じさせた ｐＰＸ６４３配列に基づいた）： ＲＳＥＴ−５ ＧＣＴＡＣＧＧＣＴＡＧＣＡＡＡＧＡＡＧＣＡＣＣＴＣＡＡＧ Ｃ（配列番号１５） および６３Ｋ ＲＢａｍプライマー（配列番号１３）を使用して、Ｐ８６０２９ ５のゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。(ＲＳＥＴ−５は、ｎｕｃＡ断片のｐＲ ＳＥＴ発現ベクターへの移動を促進するために５’末端にBamHI切断部位を包含 するようデザインした。下を参照）。増幅さ れたＤＮＡ断片をｐＣＲ（商標）IIベクターにクローニングし、そしてｐＰＸ６ ８２と称した。この構築物は成熟長のＮｕｃＡをコードする。ｐＰＸ６９３の構築 −ｐＰＸ６８２からのｎｕｃＡのBamHI断片を、発現ベクタ ーｐＲＳＥＴＣのBamHI切断部位に連結し、そして生じるプラスミドをｐＰＸ６ ９３と呼称した。これは、そのＮ末端に付加的な38アミノ酸をもつ融合ＮｕｃＡ を発現したクローンをもたらした。エンテロキナーゼでの切断に際して、ほとん ど５個のアミノ酸が除去されることができた。ｐＲＳＥＴＣベクターはまた、エ ンテロキナーゼによる切断の前にニッケルカラムでの融合タンパク質の精製を可 能にしたポリヒスチジン領域も含有する。クローンｐＰＸ６９３は、大腸菌(E． coli)ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株に形質転換されかつＩＰＴＧで誘導され た場合に、クマシー染色されたゲルで検出可能であったかなりのレベルの発現を 示した。図８は、それが細胞ライセートの主要なタンパク質バンドであったこと を示す。しかしながら、タンパク質精製のためのより大きな培養系を生じる際に 、この発現はクマシー染色により検出できなかった。このプラスミドが発現株で 安定に維持されなかったことが見出された。結果として、他のクローンは許容で きるレベルの発現をもって得られ、従って、ｐＰＸ６９３を安定化させるさらな る作業に着手しなかった。天然のシグナル配列 −上流の配列をクローンｐＰＸ６８０（実施例２で挙げられ たように、ｐＣＲ（商標）IIベクターにクローニングされた、およそ２kbのNsiI 逆ＰＣＲ産物）から得た後で、プライマーＮｄｅＦ６３ＫおよびＮｃｏＦ６３Ｋ を使用してゲノムのＰ８６０２９５ＤＮＡから完全長の天然のｎｕｃＡ遺伝子を 増幅した。このＰＣＲ産物を、２個 の異なる発現ベクターｐＲＳＥＴＣおよびｐＴｒｃＨｉｓＣにクローニングした （図９）。これらのベクターは、ＩＰＴＧにより誘導可能である強力なプロモー ターを使用する発現に最大限に活用されている。表１で引用されるプラスミドｐ ＰＸ６８５、ｐＰＸ６８８、ｐＰＸ６９１およびｐＰＸ６９２を以下のように構 築した：ｐＰＸ６８５の構築 −完全長のｎｕｃＡ遺伝子を、ＰＣＲ増幅によりＰ８６０２ ９５のゲノムからクローニングした。使用されたプライマーはＮｄｅＦ６３Ｋお よび６３Ｋ ＲＢａｍであった。プライマーＮｄｅＦ６３Ｋは、ｐＲＳＥＴＣへ の後の移動のために５’末端に取りつけられたNdeI切断部位をもつ、配列番号１ のヌクレオチド229〜255である。ｐＣＲ（商標）IIベクターにクローニングされ たＰＣＲ産物をｐＰＸ６８５と呼称する。ｐＰＸ６９２の構築 −ｐＰＸ６８５からの完全なｎｕｃＡ配列のｐＲＳＥＴＣへ のサブクローニングがｐＰＸ６９２を生じた。すなわち、ｐＰＸ６８５をNdeIお よびBamHIで切断し、完全長のｎｕｃＡ断片を単離し、そして、またNdeIおよびB amHIで切断されていたｐＲＳＥＴＣに連結した。生じるプラスミドをｐＰＸ６９ ２と呼称した。ｐＰＸ６９２を大腸菌(E．coli)ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ 株に形質転換しかつ１mMＩＰＴＧで誘導した場合、ｐＰＸ６９３（図８を参照） と比較して、ＮｕｃＡタンパク質の類似のクマシーレベルを得た（図１０を参照 ）。ｐＰＸ６８８の構築 −完全長のｎｕｃＡ遺伝子を、ＰＣＲならびにプライマーＮ ｃｏＦ６３Ｋおよび６３Ｋ ＲＢａｍを使用して、ゲノムのＰ８６０２９５ＤＮ Ａからクローニングした。プライマーＮｃｏＦ６３Ｋは、NcoI切断部位、および 、ｐＴｒｃＨｉｓＣへのその後のサブクロー ニングのために５’末端に取りつけられた翻訳の読み枠の調節のための数個の余 分な塩基、すなわち塩基ＡＣＣＡＴＧＧＧＴをもつ、配列番号１のヌクレオチド 229〜255である。ＰＣＲ産物をｐＣＲ（商標）IIベクターにクローニングし、そ して生じるプラスミドをｐＰＸ６８８と呼称した。NcoIリンカーが、シグナル配 列のＮ末端開始領域に２アミノ酸を付加した。ｐＰＸ６９１構築物 −ｐＰＸ６８８からの完全なｎｕｃＡ配列のｐＴｒｃＨｉｓ Ｃへのサブクローニング（図９を参照）はｐＰＸ６９１を生じた。すなわち、ｐ ＰＸ６８８をNcoIおよびBamHIで切断し、完全長のｎｕｃＡ断片を単離し、そし てその後、またNcoIおよびBamHIで切断されていたｐＴｒｃＨｉｓＣに連結した 。ｐＰＸ６９１を大腸菌(E．coli)ＩｎｖαＦ’株に形質転換しかつ１mMＩＰＴ Ｇで誘導した場合、ｐＰＸ６９３（図８を参照）と比較して、ＮｕｃＡタンパク 質の類似のクマシーレベルを得た（図１０を参照）。NcoI制限酵素切断部位は天 然のシグナル配列の極めて初めに２残基を付加し、これは、図１０に示されるよ うに、ＮｕｃＡシグナル配列のプロセシングに影響を与えないと思われた。発現 されたタンパク質の見かけの分子量は、プロセシングされないタンパク質の66kD よりむしろプロセシングされたタンパク質の約63kDであるようであった。約63kD のバンドはクマシー染色されたゲルの主要なタンパク質のバンドであるようであ った。精製およびアミノ酸配列分析に際してそれがプロセシングされることが示 された。タンパク質の配列決定についての実施例４を参照。 プラスミドｐＰＸ６９１を、ｐＰＸ６９３（融合タンパク質）と一緒になって 精製のため２L培養系中で生じた。しかしながら、ｐＰＸ６９ ３はＢｌ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ宿主中で安定に維持されなかったことが見出 された一方、ｐＰＸ６９１はＤＨ５αもしくはＩｎｖαＦ’宿主で安定に維持さ れた。プラスミドｐＰＸ６９１を、ｒＮｕｃＡのタンパク質精製のための選ぶべ きクローンとなるよう選んだ。ｐＰＸ６９２に対する安定性試験は行わなかった 。なぜなら、その発現はｐＰＸ６９１より少しもよくなかったからである。図１ ０を参照。 ヘモフィルス属(Haemophilus)をコードされるｎｕｃＡシグナル配列は、大腸 菌(E．coli)でのｒＮｕｃＡの良好な発現ならびに適正にプロセシングされるこ と（すなわちシグナル配列の除去）を可能にするようであったとは言え、異なる シグナル配列を含有する２個の商業的に入手可能な大腸菌(E．coli)発現ベクタ ーを試みた。ＰｅｌＢ（ｐＥＴ２０ｂベクター中のｐＰＸ７０８［ｐＰＸ７０５ から作成された］、ノヴァジェン）およびＯｍｐＴ（ｐＥＴ１２ａベクター中の ｐＰＸ７０７［ｐＰＸ７０６から作成された］、ノヴァジェン）を、以下のよう に成熟ｎｕｃＡ遺伝子の上流に別個にクローニングした。ＰｅｌＢの構築 −ｎｕｃＡ遺伝子を、その最後の17塩基が配列番号１のヌクレオ チド304〜320に幾分対応する以下の配列すなわち ６３Ｋ ＰｅｌＢ ＧＡＴＡＴＣＡＡＡＧＡＡＧＣＴＣＣＴＣＡＡＧＣ（配列 番号１２） を有するプライマー６３Ｋ ＰｅｌＢ（配列番号１２）（このプライマーは、縮 重プライマーＰ１を使用して生じさせたｐＰＸ６４３配列に基づいた）、および 、その最後の21塩基が逆方向の配列番号１のヌクレオチド2095〜2115の相補物で ある以下の配列すなわち ６３Ｋ ＲＢａｍ ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＧＡＡＧＴＣＴＴＣＡＡＡＣＣＴＡ ＧＧＡＣ（配列番号１３） を有する６３Ｋ ＲＢａｍ（配列番号１３）を使用して、ｐＰＸ６４３からＰＣ Ｒ増幅した。およそ1.8kbのｎｕｃＡ含有のＰＣＲのＤＮＡバンドをゲル単離し 、ｐＣＲ（商標）IIにクローニングし、そして生じるプラスミドをｐＰＸ７０５ と呼称した。ｐＰＸ７０８の構築 −プラスミドｐＰＸ７０５およびｐＥＴ２０ｂの双 方をEcoRVおよびBamHIで切断し、ＤＮＡをアガロースゲル上で電気泳動し、そし て適正なＤＮＡバンドを単離した。ＤＮＡを一緒に連結し、そして生じるプラス ミドをｐＰＸ７０８と呼称した。ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ形質転換体をＲ Ｚ１０７０と呼称した。ＯｍｐＴの構築 −ｎｕｃＡ遺伝子を、その最後の17塩基が配列番号１のヌクレオ チド304〜320に幾分対応する以下の配列すなわち ６３Ｋ ＯｍｐＴ ＧＧＡＴＣＣＡＡＡＧＡＡＧＣＴＣＣＴＣＡＡＧＣ（配列 番号１４） を有するプライマー６３Ｋ ＯｍｐＴ（配列番号１４）（このプライマーは縮重 プライマーＰ１を使用して生じさせたｐＰＸ６４３配列に基づいた）、および６ ３Ｋ ＲＢａｍ（配列番号１３）を使用してｐＰＸ６４３からＰＣＲ増幅した。 およそ1.8kbのｎｕｃＡ含有のＰＣＲのＤＮＡバンドをゲル単離し、ｐＣＲ（商 標）IIにクローニングし、そして生じるプラスミドをｐＰＸ７０６と呼称した。ｐＰＸ７０７の構築 −ｐＥＴ１２ａベクターＤＮＡをBamHI酵素で切断し、仔ウ シ腸アルカリホスファターゼ（ベーリンガー マンハイム）で処理し、アガロー スゲル上で電気泳動し、そしてＤＮＡを単離した。プラスミドｐＰＸ７０６をBa mHI酵素で切断し、アガロースゲル上で電気泳動し、そしておよそ1.8kbのｎｕｃ Ａ含有ＤＮＡ断片をゲル単離した。ｐＥＴ１２ａおよびｐＰＸ７０６の双方のゲ ル単離されたＤＮＡを一緒に連結し、そして生じるプラスミドをｐＰＸ７０７と 呼称した。ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ形質転換体をＲＺ１０６５と呼称した 。ＰｅｌＢ−ＮｕｃＡおよびＯｍｐＴ−ＮｕｃＡの発現 ＲＺ１０６５（ｐＰＸ７ ０７：ＯｍｐＴ−ｎｕｃＡクローン）およびＲＺ１０７０（ｐＰ Ｘ７０８：ＰｅｌＢ−ｎｕｃＡクローン）の一夜培養系の1mlを、それぞれ、125 mlフラスコ中のクロラムフェニコール（30μg/ml）およびアンピシリン（100μg /ml）を加えた20mlのＳＯＢ中に接種し、そして37℃で０．Ｄ．600が1.0〜1.3ま で増殖させた。培養系の10mlを別の125mlフラスコに移し、そしてＩＰＴＧを１m Mの最終濃度まで添加した。誘導されないおよび誘導された双方の培養系を37℃ で追加の２時間増殖させた。培養系のそれぞれの1mlを取り出し、そして1.5mlエ ッペンドルフチューブ中で遠心分離して細胞をペレットにした。誘導された培養 系からの上清を取っておいた。細胞ペレットを、およそ1.0のＯ．Ｄ．₆₀₀に0.6 〜1.6mlのＰＢＳで再懸濁した。再懸濁された細胞の1mlを再遠心分離し、そして 60μlの水で再懸濁した。60μlの再懸濁された細胞もしくは60μlの上清に、20 μlの４×クラッキング緩衝液を添加し、そしてチューブを沸騰水浴中で５分間 加熱した。各サンプルの20μlを12％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で電気泳動しかつ クマシーブルーで染色した。ＯｍｐＴおよびＰｅｌＢの双方のＮｕｃＡ融合タン パク質が検出され、そしてプロセシングされたタンパク質について適正な大きさ のものであった（図１１）。ＰｅｌＢ−ＮｕｃＡ融合タンパク質発現の収率は総 細胞タンパク質のおよそ30％であり、これは完全長のＮｕｃＡ（天然のシグナル をもつｐＰＸ６９１；下の図１２を参照）の発現に匹敵した。 図１２は、いくつかのシグナル配列のクローンおよびまた至適化された翻訳開 始領域（ＴＩＲ）配列（11）をもつ成熟融合クローンｐＰＸ７０９からの発現の 比較を示す。クローンｐＰＸ７０９を以下のようにクローンｐＰＸ６７７から構 築した：ｐＰＸ６７７の構築 −プラスミドｐＲＳＥＴＣをNheI酵素で切断し、フ ェノール抽出し、エタノール沈殿しそしてNdeI酵素で再切断した。ＤＮＡをアガ ロースゲル上で電気泳動し、そしてＤＮＡのバンドをゲル単離した。NheI＋NdeI リンカーを、以下の配列（ｎｕｃＡに対応しない）すなわち ＲＳＥＴ．ＴＩＲ ｔｏｐ ＴＡＴＧＧＣＴＡＴＧＴＣＴＡＡＣＡＴＧＡＣＴ ＴＡＣＡＡＡＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＧＧＴＡＴＧＧ（配列番号 １０） を有するＲＳＥＴ．ＴＩＲ ｔｏｐ ｏｌｉｇｏ（配列番号１０）を、以下の配 列（ｎｕｃＡに対応しない）すなわち ＲＳＥＴ．ＴＩＲ ｂｏｔｔｏｍ ＣＴＡＧＣＣＡＴＡＣＣＡＴＧＡＴＧＡＴ ＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＴＴＴＧＴＡＡＧＴＣＡＴＧＴＴＡＧＡＣＡＴＡＧＣＣＡ （配列番号１１） を有するＲＳＥＴ．ＴＩＲ ｂｏｔｔｏｍ ｏｌｉｇｏ（配列番号１１）にアニ ーリングすることにより構築した。このリンカーをNheIおよびNdeIで切断された ｐＲＳＥＴＣの精製されたＤＮＡに連結し、そして生じるプラスミドをｐＰＸ６ ７７と呼称した。ｐＰＸ７０９の構築 −プラスミドｐＰＸ６７７をBamHIで切断し、仔ウシ腸アル カリホスファターゼ（ベーリンガー マンハイム）で処理し、アガロースゲル上 で電気泳動し、そしてＤＮＡを単離した。プラスミドｐＰＸ６９３をBamHIで切 断し、アガロースゲル上で電気泳動し、そしてＤＮＡを単離した。単離されたＤ ＮＡを一緒に連結し、そして生じるプラスミドをｐＰＸ７０９と呼称した。ＢＬ ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ形質転換体をＲＺ１０７６と呼称した。 ｐＰＸ６９１（天然のシグナル配列）クローンおよびベクター単独の 対照を、0.8〜0.9のＯ．Ｄ．₆₀₀で１mMＩＰＴＧで１時間誘導した。ｐＰＸ７０ ７（ＯｍｐＴシグナル）、ｐＰＸ７０８（ＰｅｌＢシグナル）およびｐＰＸ７０ ９（ＴＩＲ）のクローンを、約1.0のＯ．Ｄ．で２時間誘導した。全ての培養系 を約1.0のＯ．Ｄ．に正規化し、そして等体積をゲルに負荷した。Ｐ８６０２９ ５を約1.6のＯ．Ｄ．まで約3.5時間増殖させ、その後、約1.0に正規化した。誘 導されたｐＰＸ６９１および誘導されたｐＰＸ７０８は、強いＮｕｃＡのバンド をはっきりと示した。実際、それは主要なタンパク質のバンドであるように見え た。しかしながら、ｐＰＸ７０７およびｐＰＸ７０９は明らかなＮｕｃＡの誘導 されたバンドを生じなかった。これは、全てのシグナル配列もしくは「至適化さ れた」発現ベクターが高レベルの誘導されたＮｕｃＡタンパク質を産生するわけ ではないことを示す。 実施例４ ＮｕｃＡタンパク質の精製および特徴づけ ＮＴＨｉからのｎＮｕｃＡタンパク質の精製 全細胞抽出物の調製 全細菌細胞（約70ｇの含水重量のＮＴＨｉ）を、200mlの0 .1Mリン酸カリウム（ＫＰＯ４）／3.0Mチオシアン酸カリウム（pH6.0）中に懸濁 し、そして室温で60分間攪拌してｎＮｕｃＡタンパク質を抽出した。細胞の破片 を、４℃で20分間ソルヴオールＧＳ−３ローターを使用する8,000rpmでの遠心分 離により除去した。上清を収集し、そして、４℃で60分間ベックマン(Beckman) ７０Ｔｉローターを使用する60,000rpmでの遠心分離によりさらに澄明にした。 上清を収集し、そして50mMリン酸ナトリウム（pH8.0）に対して４℃で一夜透析 した。カラムクロマトグラフィー 透析された全細胞抽出物を、50mMリン酸ナ トリウム（pH8.0）中で平衡化された25mLのセラミックヒドロキシアパタイト（ ＨＡ）カラム（80μm、バイオラッド）に負荷した。結合されたタンパク質を、0 .2Mリン酸ナトリウムの段階、次いで、直線状のリン酸ナトリウム濃度勾配（0.2 −0.5Mリン酸ナトリウム）で溶出した。フラクションを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよ びウェスタン分析を介してｎＮｕｃＡについてスクリーニングし、そして陽性フ ラクションをプールした。ＨＡ段階は３個の独立した全細胞抽出物調製で３回実 行した。３回のＨＡ実施のそれぞれからの天然のＮｕｃＡを一緒にプールし、そ してＰＭ１０メンブレンを伴うアミコン攪拌セル(stirred cell)を使用して約７ 倍濃縮した。ＨＡ濃縮物を、50mMトリス−塩酸／１mMＥＤＴＡ（pH9.0）の２回 の２L交換に対して４℃で一夜透析した。この素材を、50mMトリス−塩酸／１mM ＥＤＴＡ（pH9.0）中で平衡化されたモノＱ(MonoQ)ＨＲ５／５カラム（ファルマ シア(Pharmacia)）に負荷した。結合されたタンパク質を、直線状の塩化ナトリ ウム濃度勾配（50mMトリス−塩酸／１mMＥＤＴＡ（pH9.0）中０−1.0M塩化ナト リウム）で溶出した。フラクションを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを介してｎＮｕｃＡに ついてスクリーニングし、そしてプールした。全体で2.5mgの精製されたｎＮｕ ｃＡを、約70gの含水重量のＮＴＨｉ細胞から単離した。このプロトコールを使 用して精製された天然のＮｕｃＡタンパク質は、約63,000ダルトンの分子量に対 応するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の単一のバンドを表す。ｎＮｕｃＡの塩化ナトリウム抽出 ｎＮｕｃＡタンパク質のための以下の抽出プ ロトコールを、チオシアン酸カリウムによる抽出に対する代替として使用した。 細菌細胞（約37.5gの含水重量のＮＴＨｉ）を150mlの50mMリン酸ナトリウム（pH 7.0）中に懸濁し、そして1000psiでフレンチ 圧細胞(French pressure cell)を通す３回の通過により粉砕した。細胞の破片お よび膜を、４℃で20分間ベックマン７０Ｔｉローターを使用する55,000rpmでの 遠心分離によりペレットにした。このペレットを、132mlの10mMＨＥＰＥＳ／1.0 M塩化ナトリウム（pH7.5）中で再懸濁し、そして４℃で20分間攪拌して、ｎＮｕ ｃＡタンパク質を抽出した。細胞の破片および膜を、４℃で60分間ベックマン７ ０Ｔｉローターを使用する60,000rpmでの遠心分離により除去した。上清を収集 し、そして、50mMリン酸ナトリウム（pH8.0）に対して４℃で一夜透析した。そ の後のＨＡおよびモノＱ(MonoQ)クロマトグラフィー段階を、天然のＮｕｃＡタ ンパク質について上述されたように実行した。塩化ナトリウム抽出を使用するｎ ＮｕｃＡの収率は、上述の他の方法で得られたものに匹敵した。ｒＮｕｃＡタンパク質の精製 粗抽出物の調製 フレンチ圧細胞(French pressure cell)を通しての通過および ２個のクロマトグラフィー段階を介する細胞溶解を利用する方法を、ｒＮｕｃＡ タンパク質の精製のため開発した。ｒＮｕｃＡを発現する細菌細胞（約30gの含 水重量の大腸菌(E．coli)ＩｎｖαＦ’／ｐＰＸ６９１）を、80mlの50mMトリス −塩酸／１mMＥＤＴＡ（pH8.0）中に懸濁し、そして、1000psiでフレンチ圧細胞 (French pressure cell)を通す３回の通過により粉砕した。細胞の破片および膜 を、４℃で20分間ベックマン７０Ｔｉローターを使用する55,000rpmでの遠心分 離により除去した。上清を収集し、そして、50mMトリス−塩酸／１mMＥＤＴＡ（ pH8.0）の２回の４L交換に対して４℃で一夜透析した。カラムクロマトグラフィー 透析された粗抽出上清を、室温で50mMトリス−塩酸 ／１mMＥＤＴＡ（pH8.0）中で平衡化された50mlのトリメチル アミノエチル（ＴＭＡＥ）フラクトゲル［Fractogel］（商標）陰イオン交換カ ラム（ＥＭセパレーションズ テクノロジー(EM Separations Technology)）に 負荷した。汚染するタンパク質の大部分はカラムに結合した。ｒＮｕｃＡタンパ ク質ならびにいくつかの汚染タンパク質を含有するカラム通過分を収集し、そし て20mMＨＥＰＥＳ／１mMＥＤＴＡ（pH7.0）に対し４℃で一夜透析した。この素 材を、その後、ＮｕｃＡタンパク質を結合する、20mMＨＥＰＥＳ／１mMＥＤＴＡ （pH7.0）中で平衡化されたモノＳ(MonoS)ＨＲ１０／１０陽イオン交換カラム（ ファルマシア）に負荷した。結合されたタンパク質を直線状の塩化ナトリウム濃 度勾配（20mMＨＥＰＥＳ／１mMＥＤＴＡ（pH7.0）中０−1.0M塩化ナトリウム） で溶出した。ｒＮｕｃＡの大部分は約0.4M塩化ナトリウムで溶出した。フラクシ ョンを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを介してｒＮｕｃＡについてスクリーニングし、そし てプールした。全体で80mgの精製されたｒＮｕｃＡを、約30gの含水重量の細胞 から単離した。このプロトコールを使用して精製されたｒＮｕｃＡタンパク質は 、約63,000ダルトンの分子量に対応するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の単一のバンド を表した。アミノ酸配列分析 天然のタンパク質のアミノ酸配列分析のため、100μgの精製されたタンパク質 を含有する約250μlのサンプルを、90％エタノールで０℃で30分間沈殿させ、そ の後、微小遠心分離器での遠心分離が続いた。このペレットを20％酢酸中で再懸 濁し、そして、アミノ末端アミノ酸配列分析にかけた。組み換えタンパク質につ いては、80μgのｒＮｕｃＡを含有する80μlのサンプルを、プロスピン(ProSpin )カートリッジ（アプライド バイオシステムズ、カリフォルニア州フォスター シティ）に添加し かつ遠心分離した。そのサンプルを含有する二フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ ）メンブレンを取り出し、そして20％メタノールで洗浄した。このメンブレンを アミノ末端アミノ酸配列分析にかけた。 アミノ末端アミノ酸配列分析は、オンラインのモデル１２０Ａ ＰＴＨ分析器 （アプライド バイオシステムズ）を装備された、アプライドバイオシステムズ モデル４７７Ａタンパク質／ペプチドシークェンサーを使用して実施した。そ れぞれの連続するアミノ末端の切断後、形成されたアニリノチアゾリノン誘導体 を、64℃で20分間の25％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）での処理により、より安定 なフェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）誘導体に変換した。ＰＴＨ誘導体を分離 し、そして、製造元の説明書に従った２溶媒の濃度勾配系とともにブラウンリー (Brownlee)ＰＴＨ Ｃ−18カラム（粒子径５mm、内径2.1mm×長さ22cm；アプラ イド バイオシステムズ）を使用する逆相ＨＰＬＣにより、ＰＴＨ分析器で同定 した。 天然のタンパク質については、最初の26残基（配列番号２の残基26〜51）は、 残基１での付加的な同定されないピークを除いて明白に同定された。組み換えタ ンパク質については、最初の19残基（配列番号２の残基26〜44）のうち18個が明 白に同定された。残基１および２の双方が付加的な同定されないピークを含有し 、また、残基13（配列番号２の残基38）は同定され得なかった。組み換えＮｕｃ Ａタンパク質のアミノ末端配列の、天然のタンパク質のそれとの一致は、大腸菌 (E．coli)で発現されたタンパク質のシグナル配列の、ヘモフィルス属(Haemophi lus)のものと同一の翻訳後プロセシングを示した。 実施例５ ＮｕｃＡタンパク質のヌクレオチダーゼ活性 外酵素は、膜の細胞外表面上にそれらの触媒部位をもつ内在性膜タンパク質と 定義される（12）。外酵素の一分類は外ホスホヒドロラーゼ（５’−ヌクレオチ ダーゼ）である。細菌および噛乳動物双方の５’−ヌクレオチダーゼを扱う多く の報告が存在し、それぞれ異なる基質反応性を示す。哺乳動物の５’−ヌクレオ チダーゼ酵素は、Ａ（アデノシンヌクレオシド）およびＰ（リン酸）を産生する 基質としてＡＭＰ（アデノシン−リン酸ヌクレオチド）を使用する一方、細菌の 酵素はＡＴＰ（アデノシン三リン酸ヌクレオチド）、ＡＤＰ（アデノシン二リン 酸ヌクレオチド）およびＡＭＰ、ならびに他のヌクレオチドを使用しうる。 大腸菌(E．coli)の５’−ヌクレオチダーゼタンパク質を研究する初期の報告 の１個は、それが細胞膜の細胞周辺腔に配置されたこと、および、このタンパク 質は、それが糖ヒドロラーゼおよびモノヌクレオチダーゼの双方の活性を有した ために独特であったことを示唆した（13；14）。バーンズ（Burns）とビーチャ ム(Bescham)(15)による後者の研究は、成熟の大腸菌(E．coli)５’−ヌクレオチ ダーゼ遺伝子ｕｓｈＡのヌクレオチド配列分析およびＮ末端タンパク質配列を提 示した。タンパク質配列およびＤＮＡ遺伝子配列に基づけば、ＵｓｈＡタンパク 質は成熟タンパク質でタンパク質分解的に除去されるシグナル配列を含有する。 予測される成熟タンパク質の分子量は58kDである。 海生の発光性ビブリオ属(Vibrio)およびフォトバクテリウム属(Photobacteriu m)の株は、膜結合性の特異的５’−ヌクレオチダーゼ酵素を含有する（16）。ho lophilicの海生細菌ビブリオ パラヘモリチクス(Vibrio parahaemolyticus)は 、ｎｕｔＡと呼称される５’−ヌクレオチダ ーゼ遺伝子をコードする（17）。ｎｕｔＡ遺伝子はクローニングされ、配列決定 されそして大腸菌(E．coli)で発現されている。５’−ヌクレオチダーゼ酵素は 外層膜中に挿入されたリポタンパク質でありうる。５’−ヌクレオチダーゼ活性 は、グラム陽性細菌バチルス ズブチリス(Bacillus subtilis)でもまた検出さ れている（18）。アミノ酸比較 ラット肝５’−ヌクレオチダーゼ、大腸菌(E．coli)の５’−ヌクレオチダー ゼ（ＵｓｈＡ）および２’，３’−環状ホスホジエステラーゼのアミノ酸比較は 著しい相同性の一領域を示し、このドメインが触媒活性および／もしくは基質結 合に関与しうることを示唆した（19）。多様な５’−ヌクレオチダーゼ配列すな わちラット、ヒト、ＵｓｈＡ、ＮｕｔＡおよびＮｕｃＡのさらなる比較は、２個 の非常に強い相同領域を示した。これらの領域は配列番号２からのＮｕｃＡ配列 のアミノ酸119〜152に及ぶ。例えば、ＮｕｃＡアミノ酸配列の、ヒトヌクレオチ ダーゼのアミノ酸配列との完全な相同性が、配列番号２の残基124〜130および14 8〜151に存在する。ＮｕｃＡとヒトヌクレオチダーゼタンパク質との間の相同性 の全体の程度は非常に小さく、かつ、４個もしくはそれ以上の連続的相同アミノ 酸をもつ上述のこれらの領域に主として制限されるとは言え、これらの領域のい ずれかもしくは双方の欠失は、ＮｕｃＡタンパク質を含有するワクチンのいずれ かの潜在的な免疫交差反応性を低下させるはずである。５’−ヌクレオシド遊離アッセイ タンパク質検索を、ｎｕｃＡ遺伝子配列を使用して、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ電 子メールサービスを介して行った。この検索は、種を超えた、 すなわちヒト、ラットおよび大腸菌(E．coli)の既知の５’−ヌクレオチダーゼ 前駆体との若干限られたアミノ酸相同性を示唆した。ＮｕｃＡタンパク質をラッ トヌクレオチダーゼタンパク質を比較するリップマン−ピアソン(Lipman-Peason )のタンパク質整列（ＤＮＡＳｔａｒ）を実行した。33.0の類似性指標を、Ｎｕ ｃＡ（アミノ酸36〜333）をラットヌクレオチダーゼ（アミノ酸30〜329）と比較 して決定した。最初の５’−ヌクレオシド遊離アッセイを、イケハラ(Ikehara) ら（20）により記述されたようなラットの５’−ヌクレオチダーゼ反応条件を使 用して実行し、ＮｕｃＡタンパク質が５’−ヌクレオチダーゼ活性を保有するか どうかを決定した。 ＡＭＰのような５’−ヌクレオチドは、メタノール／クロロホルムのような溶 媒を添加した場合にＴＬＣプレート上で移動しないことができる極性基質である 。ヌクレオチダーゼはリン酸基を切断分離して極性のより小さいアデノシンを遊 離することができる。アデノシンはメタノール／クロロホルムの存在下にプレー ト上を移動することができる。かように、移動したＴＬＣスポットは、ＡＭＰが ヌクレオチダーゼにより切断されたことを意味する。 ＮＴＨｉのＰ８６０２９５細胞の1mlの1/10を遠心分離し、ＰＢＳ緩衝液で洗 浄し、そして10μlのＰＢＳで再懸濁した。精製されたｒＮｕｃＡおよびｎＮｕ ｃＡタンパク質濃度は200μg/mlであった。５’−ヌクレオチダーゼ反応（100μ l）を、添加された細胞もしくはタンパク質を含みもしくは含まず、それそれ0.1 Mトリス−塩酸、pH7.5、５mM塩化マグネシウム、0.1M塩化カリウム、５mMＡＭＰ を含有する1.5mlエッペンドルフチューブで実行した。各チューブを37℃で60分 間インキュベー ションした。反応の２μlをシリカＴＬＣ蛍光プレート上にスポットし、そして クロロホルム中20％メタノールで溶離した。プレートをその後、短波長すなわち 254nmのＵＶ光源を使用して検分した。図１３に示されるように、組み換えおよ び天然の双方の精製されたＮｕｃＡタンパク質、ならびにＰ８６０２９５細胞が 、５’−ヌクレオチダーゼ活性を示した。リン酸遊離アッセイ より定量的な５’−ヌクレオチダーゼアッセイにおいて、 ５’−ヌクレオチドの加水分解に際して遊離される無機リン酸を、チェン(Chen) ら（21）の方法の改変を使用して比色的に測定した。反応混合物は、750μlの最 終体積中に、100mMトリス−塩酸（pH9.0）、6.6mM塩化マグネシウム、1.65mM５ ’−ＡＭＰ（もしくは他のヌクレオチド基質）および酵素を含有した。反応混合 物を37℃で30分間インキュベーションし、そして、反応を、250μlの20％ＴＣＡ の添加で停止した。酵素を20％ＴＣＡの添加後に添加した対照を、各反応につい て行った。沈殿されたタンパク質を遠心分離を介して除去し、そして上清200μl を新しい試験管に回収した。100μlの1.0N塩酸を添加し、次いで750μlのモリブ デン酸アンモニウム試薬（3.0mlの10％アスコルビン酸および18mlの1N硫酸中3.4 mMモリブデン酸アンモニウム）の添加、そしてこの混合物を37℃で30分間インキ ュベーションした。試験管を室温に冷却させた後、650nmでの吸光度を測定した 。１単位の５’−ヌクレオチダーゼ活性を、37℃で650nm/分で1.0の吸光度変化 をもたらす酵素量と定義する。至適pH ５’−ＡＭＰの加水分解に至適のpHは8.５と9.0との間であることが見 出された（データは示されない）。しかしながら、9.0より上のpHは試験されな かった。マグネシウムイオンの影響 二価の陽イオンとりわけマグネシウムイオンは、原 核生物および真核生物の双方の系で５’−ヌクレオチダーゼ活性を刺激するもし くはいくつかの場合にはその絶対的必要条件となることが示されている（16）。 ｒＮｕｃＡタンパク質が塩化マグネシウムの添加により刺激されることもまた示 された。6.6mMまでの塩化マグネシウムの添加は、酵素活性のおよそ２倍の刺激 をもたらす（データは示されない）。基質特異性 ｒＮｕｃＡの５’−ヌクレオチダーゼは比較的幅広い基質特異性プ ロフィルを表すことが示された。この酵素は、５’−ＡＭＰに加え、多様な５’ −一、二および三リン酸ヌクレオチドを加水分解することが示された。試験され た全てのヌクレオチドについて、ＵＴＰがＵＭＰもしくはＵＴＰより好まれたウ リジンの場合を除き、―リン酸ヌクレオチドが好ましい基質であるように思われ た。ｒＮｕｃＡ５’−ヌクレオチダーゼは５’−ヌクレオチドに特異的であるよ うに思われた。というのは、それは３’−ＡＭＰで活性を表さなかったからであ る（データは示されない）。ホスファターゼアッセイ ホスファターゼアッセイを、ＮｕｃＡタンパク質がその特異的５’−ヌクレオ チダーゼ活性に加えて非特異的加水分解活性を保有するかどうかを決定するため に行った。ホスファターゼを、ｐ−ニトロフェニルリン酸（ＰＮＰＰ）を基質と して使用してアッセイした。反応混合物（最終体積750μl）は、100mMトリス− 塩酸（pH9.0）、25mMＰＮＰＰおよびｒＮｕｃＡを含有した。反応混合物を37℃ で30分間インキュベーションし、そして、反応を、チューブを氷上に置くことに より停止した。410n mでの吸光度を測定した。組み換えＮｕｃＡはＰＮＰＰで検出可能な活性を有し なかった（データは示されない）。これは、ＮｕｃＡがホスファターゼ活性をも たないヌクレオチダーゼであることを示唆する。対称的に、大腸菌(E．coli)の ＵｓｈＡは、その既知のヌクレオチダーゼ活性に加え、ホスファターゼ活性を有 する（13；14）。 実施例６ ｒＮｕｃＡの５’−ヌクレオチダーゼのモノクローナル抗体阻害 下の実施例７で記述されるように、精製されたｎＮｕｃＡタンパク質に対して 出現させたモノクローナル抗体（Ｍａｂ）Ｎｔ６３−３４−２５を、ｒＮｕｃＡ の酵素活性を阻害および／もしくは促進するその能力について試験した。Ｍａｂ Ｎｔ６３−３４−２５はｒＮｕｃＡならびにｎＮｕｃＡと交差反応することが 示されている（データは示されない）。抗ｎＮｕｃＡ Ｍａｂによる酵素活性の 阻害もしくは促進は、ｒＮｕｃＡタンパク質が本当に５’−ヌクレオチダーゼで あることを確認するとみられる。増加する濃度のＭａｂ（０、2.5、５、10およ び20μl）を、精製されたｒＮｕｃＡタンパク質とともに４℃で一夜インキュベ ーションした。ｒＮｕｃＡタンパク質およびＭａｂに加えて50μlのプロテイン Ａビーズ（ピアース(Pierce)）もまた含有した同一の連続物を、免疫沈降を促進 するために調製した。混合物を遠心分離し、そして上清をその後、上述のような リン酸遊離アッセイを使用して５’−ヌクレオチダーゼ活性についてアッセイし た。Ｍａｂを含有しない対照に関するパーセント活性を算出した。図１４は、５ ’−ヌクレオチダーゼ活性が、Ｍａｂ Ｎｔ６３−３４−２５の濃度が増大され るにつれて阻害されたことを示す。10μlのＭａｂの添加は酵素活性の約25％の 阻害をもたらし た一方、20μlの添加は約45％の阻害を表した。Ｍａｂの影響は、プロテインＡ ビーズがｒＮｕｃＡタンパク質の免疫沈降を促進するために添加される場合に高 められる。プロテインＡビーズの存在下で、10μlのＭａｂの添加は５’−ヌク レオチダーゼ活性の約60％の下落をもたらした一方、20μlの添加は約80％の阻 害を表した。５’−ヌクレオチダーゼ活性の完全な阻害は、より高濃度のＭａｂ Ｎｔ−６３−３４−２５で達成された（データは示されない）。これらのデー タは、ｒＮｕｃＡタンパク質が本当に５’−ヌクレオチダーゼであることを確証 する。 実施例７ 抗体の産出および動物試験 モノクローナル抗体のためのハイブリドーマの産生 上述のような精製されたＮｕｃＡタンパク質調製物を、モノクローナル抗体の 産出のためマウスを免疫するのに使用した。雌性の８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス に、４週の期間で３回（０、２、４週）、0.1ml用量中ＮＴＨｉ株Ｐ８６０２９ ５から精製された５μgのＮｕｃＡタンパク質および25μgのＭＰＬ（商標）アジ ュバントを腹腔内に接種した。２個の別個の融合処置を実行した。第一の融合は 、0.5μgのＮｕｃＡタンパク質の腹腔内（ＩＰ）追加抗原(boost)用量を使用し て、３ヶ月の休息期間後に行われた。第二の融合は、同じ経路による５μgのＮ ｕｃＡタンパク質のＩＰ追加抗原用量を使用して４ヶ月の休息期間後に行われた 。免疫および休息期間の間、マウス血清を得（０、６週）、そして被覆(coating )抗原としてＮｕｃＡタンパク質を使用することによるＥＬＩＳＡにより抗体活 性について試験した。 双方の融合について、牌を、最後の注入後約72時間に２匹の免疫され たマウスから回収し、そして、第一および第二の融合について、分泌しないＸ６ ３Ａｇ８．６５３マウス（ＢＡＬＢ／ｃ）骨髄腫細胞とそれぞれ７：１もしくは ５：１の比（脾細胞：骨髄腫）で組み合わせた。細胞を、ダルベッコの改変イー グル培地（Ｄ−ＭＥＭ）中50％（重量／重要）ポリエチレングリコール1500およ び10％ジメチルスルホキシド中で４分間融合させた。融合された細胞を、選択培 地すなわちヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン、10％ウシ胎児血清およ び10％ＮＣＴＣ−１０９培地補充物（ギブコ−ＢＲＬ）で補充されたＤ-ＭＥＭ 中で希釈した。融合効率（植えられたウェルの数に対するコロニー成長を伴うウ ェル）はそれぞれ26.4％（119／450）および76.4％（346／450）であった。反応 性を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロット、ドットブロットならびにＮｕｃ Ａタンパク質および全細胞を使用するＥＬＩＳＡにより評価した。１〜25と称さ れる陽性反応体を同定し、Ｎｔ６３（第一の融合）もしくはＮｔ６３／２（第二 の融合）と記号をつけ(code)、そしてさらなる特徴づけのため取っておいた。 目的の選択されたハイブリドーマを、限定希釈処置により一度サブクローニン グした。モノクローナル抗体を、組織培養上清（ＴＣＳ）、50％飽和硫酸アンモ ニウム沈殿により濃縮された（ＳＡＳ-ＴＣＳ）、もしくは腹水として提供した 。ポリクローナル血清の産出 ポリクローナル血清をニュージーランドホワイトラ ビットで産出させた。６匹のウサギを、Ｐ８６０２９５の全細胞ＥＬＩＳＡを使 用してバックグラウンドカ価についてスクリーニングした。最低の力価をもつ２ 匹のウサギを、０、４および８週の生理的食塩水中25μgのＭＰＬ（商標）を加 えた用量あたり25μgのｎＮｕｃＡタ ンパク質での免疫のため選んだ。ウサギは10週に全採血した。タンパク質を上述 のように精製し、そして12％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で流して、純度を、そのお よそ90％レベルから増大させた。63kDのバンドをクマシー染色されたゲルから切 り抜き、そして連続して18Ｇ、20Ｇおよび22Ｇの針を通過させた。0.9％生理的 食塩水中のアジュバントＭＰＬ（商標）を添加し、そして0.2mlをウサギに注入 した。ポリクローナル血清は、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’、Ｙ１０９０Ｒ^-、 Ｙ１０８９Ｒ^-およびＹ１０８８細胞への吸収後でさえ、コロニーブロットで高 いバックグラウンドを与えた。免疫原性試験 ｎＮｕｃＡおよびｒＮｕｃＡで行われた免疫原性試験を下の表２ 〜６に要約する。プールされた血清を、ｎＮｕｃＡおよび／もしくはｒＮｕｃＡ に対する抗体力価、いくつかの異種ＮＴＨｉ株に対する全細胞力価、ならびにま た主としてＰ８６１４５４に対する殺菌力価についてアッセイした。 表２は免疫原性試験で使用された投与量を述べる。 表３は試験１および３からの全細胞（ＷＣ）のＥＬＩＳＡのデータの編集を提 示する。 表４は抗体のＩｇＧクラスの亜分類を包含する試験２からのＷＣのＥＬＩＳＡ のデータを提示する。 表５は試験１、２および３からの殺菌データを提示する。試験３についての殺 菌力価は、Ｎ７５５群を除いて２回のアッセイの平均であった。免疫原性試験１ は、ｎＮｕｃＡタンパク質がワクチン候補となる可能性を有することを示した。 表３および５を参照。それはその時点での試験された全ての異種株に対する上昇 した全細胞力価を示した。より重要には、それは試験された４種の異種株のうち ２種について殺菌活性を示した（表５）。試験２および３は全細胞のデータを再 現した。表３および４を参照。これらの血清の殺菌活性が、２種の異種株につい て示された（株Ｐ８６１４５４についてのデータが表５に示される）。３種の他 の株を試みたが、しかし技術的困難のため、データは報告され得なかった。 表６はこれら３回の試験からの抗体のＥＬＩＳＡ力価を提示する。 表２〜６に述べられたデータの結果を今や提示することができる。試験１ 試験１は、実施例１に記述されるように単離されかつ精製されたｎＮｕ ｃＡタンパク質で実行した。１群あたり５匹のマウスの、スイス−ウェブスター (Swiss-Webster)マウスの４群を、０、４、６および８週に、マウスあたり１、 ５、10もしくは20μgのいずれかのｎＮｕｃＡで免疫した。使用されたアジュバ ントは、用量あたり50μgのＭＰＬ（商標）であった。ｎＮｕｃＡに対する抗体 および相同のＰ８６０２９５ＮＴＨｉ株に対する全細胞力価を、全ての採血から のプールされた血清で得た。０および８週についてのデータが示される（表３お よび６）。異種株での全細胞力価、および殺菌力価を、Ｅ５４８群すなわち５μ g投与量群で得た。これは６（データは示されない）および８週（表３）の双方 で同種Ｐ８６０２９５株に対する最高の全細胞力価を与えた。第二の免疫後、全 細胞および精製されたタンパク質の双方のＥＬＩＳＡ力価は、最初の採血に比較 して抗原刺激された(boosted)（データは示されない）。２ないし３倍の追加抗 原刺激(boost)が、10μg投与量を除き、第三の免疫後にもまた観察された。10μ g投与量はＥＬＩＳＡ力価の13倍の増大を示した。ｎＮｕｃＡタンパク質は、８ 種の異種ＮＴＨｉの臨床単離物に対して高い全細胞ＥＬＩＳＡ力価を導き出し（ 表３）、保存された、表面に露出したエピトープを立証した。この試験から、５ μｇを、さらなる実験のための好ましい免疫用量として選んだ。殺菌アッセイを 、４種の異種ＮＴＨｉ株で、５μg用量（Ｅ５４８）からの血清を使用して実行 した。有意の殺菌力価は免疫前レベルを上回る４倍の増加とみなされる。有意の 殺菌活性を、同種Ｐ８６０２９５株に対し、ならびに異種ＮＴＨｉの単離物Ｐ８ １０３８４およびＮ８３０１６１Ｅにつ いて検出した。株Ｐ８６１４５４に対する力価は有意でありうるが、しかしこの アッセイで決定し得なかった。なぜなら、試験された最小の希釈は５倍であり、 そして、免疫前血清はそのレベルで活性を有しなかったからである（表５）。試験２ 試験２は、アジュバントを伴うおよび伴わないの双方のｎＮｕｃＡの免 疫原性をｒＮｕｃＡと比較するために実行した。２種のアジュバントすなわちＭ ＰＬ（商標）およびスティミュロン［Stimulon］（商標）ＱＳ−２１を比較した 。１群あたり５匹のＢａｌｂ／ｃマウスをこれらの試験に使用した。これらの試 験に使用されたＮｕｃＡタンパク質は実施例４に記述されたように精製し、ｎＮ ｕｃＡタンパク質はＰ８６０２９５からチオシアン酸カリウム抽出した。マウス を０および４週に免疫し、そして０、４および６週に採血した。０および６週の 採血からの血清を、精製されたｎＮｕｃＡ、ｒＮｕｃＡおよび全ＮＴＨｉ細胞双 方に対するＥＬＩＳＡ反応性抗体について分析した。 結果は表４および６に示される。ｎＮｕｃＡおよびｒＮｕｃＡタンパク質はア ジュバント非存在下で高度には免疫原性でなかった。双方のタンパク質は、いず れかのアジュバントとともに使用された場合に、それ自身もしくは当該タンパク 質の他の形態に対する高いＥＬＩＳＡ力価を導き出した（表６）。ｎＮｕｃＡも しくはｒＮｕｃＡのいずれかを免疫抗原として使用しそして血清をそれぞれのタ ンパク質に対して反応させた場合には、差異は検出されなかった。かように、ｒ ＮｕｃＡはｎＮｕｃＡにより導き出されたものと区別できない抗体を導き出すよ うである。これらの抗血清についての全細胞ＥＬＩＳＡ力価が表４に示される。 全部で16種のインフルエンザ菌(H．influenzae)の臨床単離物を、これら の抗血清を使用して試験した。アジュバントを含有する群のみが高力価の全細胞 反応性抗血清を導き出した。この抗血清は株にわたって幅広く交差反応性であり 、精製された天然および組み換えの双方のＮｕｃＡが、マウスに注入された場合 に抗体を導き出す、保存された、表面に露出したエピトープを含有することを示 した。表面の反応性抗体を導き出す能力において、アジュバントもしくはタンパ ク質の組み合わせのいずれの間にも大きな差異は観察されなかった。アジュバン トを加えられない(unadjuvanted)群はバックグラウンドレベルの表面の反応性抗 体を示した。１種の単離物への抗体応答のサブクラス分布を決定し、そしてその 結果は表４に示される。ＭＰＬ（商標）群は混合したＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ／ｂ 応答をもつようである一方、スティミュロン［Stimulon］（商標）ＱＳ−２１の アジュバントを加えられた(adjuvanted)天然のタンパク質はほとんどＩｇＧ１応 答であった。対称的に、スティミュロン［Stimulon］（商標）ＱＳ−２１ ｒＮ ｕｃＡ群は、混合したＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ／ｂ応答であった。しかしながら、 これらの応答は１回の実験についてのみであり、また、付加的な実験でこれらの アジュバントについて期待されるサブクラスのプロフィルを代表しないとみられ る。試験３ 試験３は、用量あたり50μgのＭＰＬ（商標）とともに処方された場合 のｒＮｕｃＡの用量反応を見るため、および、下の表７に示される保護試験のた めの血清を収集するために実行した。ｒＮｕｃＡおよびｎＮｕｃＡは試験２につ いてと同じ調製物であった。それぞれ10匹のマウスの３群を、１μg（Ｎ７１０ 群）、５μg（Ｎ７１１群）もしくは10μg（Ｎ７１群）の用量あたりの量のｒＮ ｕｃＡで免疫した。20匹のマウスの付加的な群Ｎ７５５（６〜８週の代わりに約 10週齢）を後に試 験に付加して、保護試験のための余分の血清を準備した。10匹のマウスの５番目 の群Ｎ７１３を、５μgのｎＮｕｃＡで免疫した。全ての用量は、用量あたり50 μgのＭＰＬ（商標）を含有し、また、マウスは０、４および８週に免疫した。 採血は０、４、６（Ｎ７５５のみ）、８および10週に行った。投与量については 表２を参照。 ４週の血清についてのＩｇＧのＥＬＩＳＡ力価により示されるような一次応答 （データは示されない）は、ｒＮｕｃＡの用量により影響される。最低の力価は 最低のｒＮｕｃＡ用量群で得た。２ないし３倍の、より高力価を５μg用量群か ら得た。順に、10μg用量群についての力価は５μgの用量についてのものの約２ 倍であった。同様の力価を、ｎＮｕｃＡおよびｒＮｕｃＡ群の双方について５μ g用量で得た。Ｎ７５５は最高の一次応答、しかし最低の追加抗原刺激すなわち 第二の用量後に約45倍を与えた。全ての他の群は第二の用量後に約200倍、抗原 刺激された(boosted)。Ｎ７１ＯおよびＮ７５５群は第三の用量後に約２ないし ３倍、抗原刺激された(boosted)。Ｎ７１１、Ｎ７１２およびＮ７１３群は実際 にはわずかに下落した。全ての力価は３回の免疫後に同等であった。表６を参照 。 全ての株は10μg用量で小さな一次ＷＣ応答を与えた。ＤＬ２０８およびＰ８ ６１４５４は、全群に対し小さな一次応答を与えたただ２種の株であった。全て の力価は第二および第三の免疫後に同等であった。Ｎ７５５は、ＤＬ２０８、Ｐ ８１０３８４およびＰ８６１４５４（高バックグラウンドもまた有した）でより 高い一次応答を与えたが、しかし、力価は、再び、第二および第三の免疫後に同 等であった。しかしながら、６週での採血は、より高いそしていくつかの株では 最高の力価を示し、 Ｎ７５５群については８および10週を上回った。０および10週の結果については 表３を参照。 ここで、再び、この結果は、試験された全ての株、被包性タイプｂイーガン株 に対してさえ、血清の交差反応性を示した以前の試験のものを再現した。しかし ながら、明確な力価は、おそらく莢膜の存在により、イーガンについては得られ なかった。莢膜は細胞表面上の抗原の到達可能性を阻害していることができる。 試験２からの抗血清の殺菌活性を、ｎｕｃＡ遺伝子の供給源に関する双方の異 種単離物である２種のＮＴＨｉ株、ＴＮ１０６およびＰ８６１４５４に対して決 定した。スティミュロン［Stimulon］（商標）ＱＳ−２１ ｒＮｕｃＡ群を除い た全ての血清がＴＮ１０６に対する殺菌活性を示した。Ｐ８６１４５４に対する ＢＣアッセイの結果が表５に示される。Ｐ８６１４５４に対し有意の（＞４倍の 上昇）殺菌力価を示す唯一の群は、ＭＰＬ（商標）群すなわちＮ０９１およびＮ ０８７であった。かように、ＭＰＬ（商標）でアジュバントを加えられた(adjva nted)天然もしくは組み換えのいずれかのＮｕｃＡタンパク質は、幅広く交差反 応性の全細胞ＥＬＩＳＡ応答、いずれかのタンパク質に対する高ＥＬＩＳＡ力価 、および異種ＮＴＨｉの単離物に対する殺菌活性を導き出すことが可能であった 。 仔ラット防御試験 ４日齢のシュプラグ−ドーレイ(Sprague-Dawley)ラットを 、10匹の仔の各群に１匹の母親を含む10群に無作為化した。仔は表７に示される ように腹腔内（ＩＰ）に免疫した。 Ｐ１７４およびＰ１７５群は、Ｐ６と称される16kDのＮＴＨｉタンパク質（Ｈ ｉＰＡＬもしくはＰＢＯＭＰ−１としてもまた知られる（22））で免疫されたウ サギからの抗血清を受けた。Ｐ１７６群はＮＴＨｉポリリボシルリビトールリン 酸（ＰＲＰ）に対して出現させたモノクローナル抗体を受けた。Ｐ１７７群は緩 衝液対照としてＰＣＭ緩衝液（10mMリン酸ナトリウム、pH7.4、150mM塩化ナトリ ウム、0.5mM塩化マグネシウム、0.15mM塩化カルシウム）を受けた。血清および 細胞の全ての希釈はＰＣＭ緩衝液中で行った。約23時間後、それらを、毒性のイ ンフルエンザ菌(H．influenzae)タイプｂイーガン株の49.5の生物体（0.1ml）で ＩＰに攻撃した。その後、攻撃後20〜24時間に、仔ラットを採血し、そして細菌 の計数のためプレート培養した。尾の根元を切開し、そして、Ｐ２０レイニン(R ainin)ピペットマンで10μlの血液を取り上げ、そしてＲＴで90μ1のＰＣＭ緩衝 液中に希釈した。希釈をボルテックス攪拌し、かつ、さらなる希釈を行うまで４ ℃に保持し、そして各希釈の10μlを、全く同一にチョコレートアガー上でプレ ート培養した。プレートを５％二酸化炭素インキュベーター中36.5℃で一夜イン キュベーションした。防御試験の結果は表８に述べられる。１ 幾何平均力価（ＧＭＴ）は全ての計数可能なプレートへの等しく加重値を加 えることに基づいた。 ２ ＧＭＴは計数可能なより低い希釈にかけられたより大きな加重値に基づいた 。 計数可能なプレートは＜500cfu/プレートであった。 検出限界は、希釈の10μlをプレート培養して100cfu/mlであった。 Ｐ１７５およびＰ１７６群のプレートは最低希釈で０であったため、０〜99cfu/ mlからのどこかであり得る。ここではある数すなわち50cfu/mlを、幾何平均（Ｇ ＭＴ）を算出する目的のために割り当てた。 最高の希釈でさえ計数するのに多すぎたプレートもまた、推定値に基づく数を割 り当てた。すなわち＞＝1000cfu/プレート ＞＞＝2000cfu/プレート 芝生様(1awn)＝6000cfu/プレート ｐ値：クルスカルーウォリス(Kruska1-Wallis)は、サンプルの値が大きな範囲に 及ぶ場合に使用される伝統的なＰ値検定である。非常に大きな値にっいてのよう に鋭敏でない。＜0.05のＰ値はこの検定で統計学的に有意である。 Ｈｉｂ髄膜炎の仔ラットの動物モデルは、Ｈｉｂによる菌血症（およびその後 の死亡）を抑制する抗体の能力を立証する。ウサギ血清は、一般に、仔ラットの 血液にＨｉｂに対する若干の非特異的免疫を与え、それはマウスおよびウサギ抗 血清の０週のcfuを比較する場合に見られ得るようである。このモデルは、かよ うに、免疫ウサギ血清の陰性対照として免疫前のウサギ血清を使用する。期待さ れるように、Ｐ６タンパク質に対するウサギ対照抗血清は、ラット血液中のＨｉ ｂのＧＭＴを300 から0.5まで低下させ、かように、ＨｉｂのＰＲＰ莢膜に対するマウスモノクロ ーナル抗体がしたように（Ｐ１７６群）、抑制された菌血症を示した。マウス抗 ｒＮｕｃＡ血清は、２倍希釈で、０週（免疫前）の血清に比較して菌血症のレベ ルを大きく低下させ、この動物モデルでの陽性の結果および被包性Ｈｉｂにオプ ソニン作用させる能力を示した。これらの結果は、このモデルでの抗ｒＮｕｃＡ 血清の有効性およびインフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)に対するそのワ クチンの可能性を立証する。 実施例８ ｎｕｃＡの420bpのプローブの特異性 上述の420bpのＤＮＡプローブを、ヘモフイルス属(Haemophilus)の種の同定で のその特異性について試験した。このプローブを、ｎｕｃＡ遺伝子の部分的制限 酵素地図を産出するためのサザンハイブリダイゼーションおよびヘモフィルス属 (Haemophilus)の種の同定のためのドットブロットハイブリダイゼーションで使 用した。培養系を、約1.0のＯ．Ｄ．₆₀₀まで増殖させ、そして−20℃で保存した 。培養系の５μlを、過剰の液体を吸い取るための下の３ｍｍワットマン紙を伴 う乾燥ハイボンド−Ｎメンブレンにスポットした。このメンブレンを約10分間風 乾した。それを10％ＳＤＳ中で溶解し、その後、変性緩衝液（1.5M塩化ナトリウ ム、0.5M水酸化ナトリウム）中ＲＴで７分間変性させた。過剰の緩衝液を３ｍｍ ワットマン紙で吸い取った。メンブレンを、中和緩衝液（1.5M塩化ナトリウム、 0.5Mトリス−塩酸、pH7.2、１mMＥＤＴＡ）中、ＲＴで３分間中和した。このメ ンブレンを３ｍｍワットマン紙上に置いて過剰の緩衝液を吸い取り、そして中和 処理を繰り返した。メンブレンを２×Ｓ ＳＣ中ですすぎ、そして３ｍｍワットマン紙上で風乾した。ＤＮＡを、ストラタ ジーンＵＶ架橋器(crosslinker)を自動モードで使用してメンブレンに架橋した 。メンブレンを65℃で２〜４時間、プレハイブリダイゼーション緩衝液（５×Ｓ ＳＣ、1.0％ブロッキング試薬、0.1％Ｎ−ラウロイルサルコシン、0.02％ＳＤＳ ）中でプレハイブリダイゼーションした。ハイブリダイゼーションは、プローブ （上述と同じ420bp断片を与える特異的プライマーでのＰＣＲでｄｉｇ−ｄＵＴ Ｐ標識されたＰ８６０２９５染色体ＤＮＡ）を加えたプレハイブリダイゼーショ ン緩衝液中で65℃で一夜実行した。２回の洗浄を、２×ＳＳＣ−0.1％ＳＤＳ中 、65℃で５〜15分実行した。もう２回の洗浄を、0.1×ＳＳＣ−0.1％ＳＤＳ中、 65℃で15分間実行した。メンブレンをジ−ニアス［Genius］（商標）キットのプ ロトコール（ベーリンガー マンハイム）に従って展開した。 このｎｕｃＡプローブでのドットハイブリダイゼーションのためにスポットし た細胞培養系の種および株を下に列挙する。タイプｂイーガン株を包含する全て のヘモフィルス属(Haemophilus)の株は事実上陽性であった。陽性であった唯一 の非ヘモフィルス属(Haemophilus)の種は、ｒｎｕｃＡプラスミドｐＰＸ６９１ を含有する大腸菌(E．coli)の培養系であった。全ての他の種はこのプローブに ついて陰性であった。図１５を参照。 １．大腸菌(E．coli)ＩｎｖαＦ’ ２．ＩｎｖａＦ’中のｐＴｒｃＨｉｓＣ ３．ＩｎｖａＦ'ｐＰＸ６９１ ４．ＮＴＨｉ Ｐ８１０３８４ ５．ＮＴＨｉ Ｐ８１０５６８ ６．ＮＴＨｉ Ｐ８６０２９５ ７．ＮＴＨｉ Ｐ８６１４５４ ８．ＮＴＨｉ Ｐ８８０８５９ ９．ＮＴＨｉ ＤＬ２０８ 10．ＮＴＨｉ Ｈ３０５ 11．ＮＴＨｉ Ｎ１９５５ 12．ＮＴＨｉ Ｎ８３０１６１Ｅ 13．ＮＴＨｉ ＳＨ１０１３ 14．ＮＴＨｉ ＳＨ１０１４ 15．ＮＴＨｉ ＳＨ１０１５ 16．ＮＴＨｉ ＴＮ１０６ 17．Ｈｉｂ イーガン 18．ＧＣ ＬＢ２ 19．ＧＣ Ｐｇｈ３−２ 20．Ｈ．ピロリ(H．pylori) 21．Ｍ．カタラリス(M．catarrhalis)０３５ｅ 22．ネズミチフス菌(S．typhimurium)３２６１ 18．および19．のＧＣは淋菌(Neisseria gonorrhoeae)である。これらの結果は ｎｕｃＡ配列についてのこのプローブの特異性を立証した。 実施例９ インフルエンザ菌(H．influenzae)でのＮｕｃＡ配列の保存 いくつかのＮＴＨｉ株およびタイプｂイーガン株からの全細胞ライセートを、 双方ともｎＮｕｃＡに対するＭａｂ Ｎｔ６３−３４−２５も しくはウサギポリクローナルで探られた(probed)ウェスタンで分析した。試験さ れた全ての株は、ｎＮｕｃＡ抗血清で、保存された63kDのバンド（ＳＤＳ−ＰＡ ＧＥゲル上の大きさによる）を示した（データは示されない）。いくつかのＮＴ Ｈｉ株ならびにタイプｂイーガンおよびホイッティア株をまた、約1.0のＯ．Ｄ ．₄₉₀に生じさせ、0.4％ホルムアルデヒドで固定し、約0.2のＯ．Ｄ．₆₂₀までＰ ＢＳ中で希釈し、そしてＷＣのＥＬＩＳＡのために乾燥によりプレートに被覆し た。表３および４を参照。試験された全ての株はＷＣのＥＬＩＳＡで上昇した力 価を示した。 上述のように、ＮｕｃＡタンパク質の配列を株Ｐ８６０２９５（配列番号２） から得た。次に、ｎｕｃＡ断片（シグナル配列を伴うもしくは伴わない）を、Ｐ ８６０２９５ゲノムからのｎｕｃＡ領域の配列決定で作成されたプライマーを使 用して、８種の他のＮＴＨｉゲノムおよびタイプｂイーガン株から増幅した。Ｐ ＣＲ断片をｐＣＲ（商標）IIにクローニングしそして配列決定した。成熟ｎｕｃ Ａ遺伝子領域の完全な配列を、株Ｐ８１０３８４、Ｐ８１０５６８、Ｐ８６１４ ５４、Ｐ８８０８５９、Ｎ１９５５、ＴＮ１０６、ＳＨ１０１４、ＳＨ１０１５ およびイーガンについて得た。タンパク質の整列を、Ｐ８６０２９５のものを包 含する成熟ＮｕｃＡタンパク質の推定されたアミノ酸配列から生じさせた。株の うち４種（Ｐ８８０８５９、ＴＮ１０６、ＳＨ１０１５およびイーガン）はＰ８ ６０２９５と100％同一である。他の株は、１ないし７アミノ酸残基がＰ８６０ ２９５と異なる（表９を参照）。これは、試験されたインフルエンザ菌(H．infl uenzae)の株でｎｕｃＡ遺伝子が保存される大きな程度を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 47/42 Ａ６１Ｐ 31/16 Ａ６１Ｐ 31/16 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 9/22 9/22 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，Ａ Ｚ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ， ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，Ｌ Ｔ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＺＷ (72)発明者 オーイ，ペギー アメリカ合衆国ニユーヨーク州14506メン ドン・メインストリートフイシヤーズ494 【要約の続き】 は、哺乳動物宿主において防御免疫応答を導き出してイ ンフルエンザ菌(H．influenzae)により引き起こされる 疾患に対し当該宿主を防御するワクチン組成物を調製す るのに使用される。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)(H．influenzae)のＮｕｃＡタ ンパク質またはそのエピトープ（１個もしくは複数）を含むＮｕｃＡタンパク質 のペプチドをコードするＤＮＡ配列を含んで成る、単離されかつ精製されたＤＮ Ａ配列。 ２．標準的な高緊縮サザンハイブリダイゼーション条件下で、配列番号２のアミ ノ酸26〜603のアミノ酸配列もしくはその生物学的に同等なアミノ酸配列を有す るインフルエンザ菌(H．influenzae)のＮｕｃＡタンパク質をコードするＤＮＡ 配列とハイブリダイゼーションするＤＮＡ配列を含んで成る、単離されかつ精製 されたＤＮＡ配列。 ３．前記ＤＮＡ配列が、標準的な高緊縮サザンハイブリダイゼーション条件下で 、配列番号１のヌクレオチド304〜2037のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ配列 とハイブリダイゼーションする、請求の範囲２の単離されかつ精製されたＤＮＡ 配列。 ４．ＤＮＡ配列が、標準的な高緊縮サザンハイブリダイゼーション条件下で、イ ンフルエンザ菌(H．influenzae)のＮｕｃＡタンパク質についての生物学的に同 等なアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列とハイブリダイゼーションする、請求 の範囲２の単離されかつ精製されたＤＮＡ配列であって、配列番号２のアミノ酸 26〜603のアミノ酸配列が、Ｋ７９Ｅ、Ｎ１８６Ｋ、Ｓ２６２Ｇ、Ｖ２９４Ａ、 Ｅ３０５Ｑ、Ｋ３２７Ｒ、Ｔ３３７Ａ、Ｄ３６０Ｙ、Ｒ３７６ＨもしくはＶ４３ ６Ｉから成る群から選択されるアミノ酸残基の変化の１個もしくはそれ以上によ り改変される配列。 ５．請求の範囲１のＤＮＡ配列を含んで成る、単離されかつ精製された、 インフルエンザ菌(H．influenzae)のＤＮＡ配列を含有するプラスミド。 ６．プラスミドが、標準的な高緊縮サザンハイブリダイゼーション条件下で、配 列番号２のアミノ酸26〜603のアミノ酸配列もしくはその生物学的に同等なアミ ノ酸配列を有するインフルエンザ菌(H．influenzae)のＮｕｃＡタンパク質をコ ードするＤＮＡ配列とハイブリダイゼーションするＤＮＡ配列を含有する、請求 の範囲５のプラスミド。 ７．プラスミドが、標準的な高緊縮サザンハイブリダイゼーション条件下で、配 列番号１のヌクレオチド304〜2037のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ配列とハ イブリダイゼーションするＤＮＡ配列を含有する、請求の範囲６のプラスミド。 ８．プラスミドが、標準的な高緊縮サザンハイブリダイゼーション条件下で、イ ンフルエンザ菌(H．influenzae)のＮｕｃＡタンパク質について生物学的に同等 なアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列とハイブリダイゼーションするＤＮＡ配 列を含有する、請求の範囲６のプラスミドであって、配列番号２のアミノ酸26〜 603のアミノ酸配列が、Ｋ７９Ｅ、Ｎ１８６Ｋ、Ｓ２６２Ｇ、Ｖ２９４Ａ、Ｅ３ ０５Ｑ、Ｋ３２７Ｒ、Ｔ３３７Ａ、Ｄ３６０Ｙ、Ｒ３７６ＨもしくはＶ４３６Ｉ から成る群から選択されるアミノ酸残基の変化の１個もしくはそれ以上により改 変されるプラスミド。 ９．プラスミドがｐＰＸ６９１と称されるものである、請求の範囲７のプラスミ ド。 １０．請求の範囲５のプラスミドで形質転換された宿主細胞。 １１．宿主細胞が大腸菌(Escherichia coli)株ＩｎｖａＦ’である、請求の範囲 １０の宿主細胞。 １２．プラスミドがｐＰＸ６９１（ＡＴＣＣ ９８１０４）と称されるものであ る、請求の範囲１１の宿主細胞。 １３．宿主細胞を請求の範囲５のプラスミドで形質転換もしくはトランスフェク ションすること、および、宿主細胞による前記ＮｕｃＡタンパク質の発現を許す 条件下で宿主細胞を培養することを含んで成る、インフルエンザ菌(H．influenz ae)のＮｕｃＡタンパク質の産生方法。 １４．単離されかつ精製された、インフルエンザ菌(H．influenzae)のＮｕｃＡ タンパク質、または、そのエピトープ（１個もしくは複数）を含んで成るＮｕｃ Ａタンパク質のペプチド。 １５．配列番号２のアミノ酸26〜603のアミノ酸配列もしくはその生物学的に同 等なアミノ酸配列を有する、請求の範囲１４の単離されかつ精製された、インフ ルエンザ菌(H．influenzae)のＮｕｃＡタンパク質。 １６．（ａ）12％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で測定されるようなおよそ63,000ダル トンの分子量；および （ｂ）５’−ヌクレオチダーゼ活性 を有する、請求の範囲１４の単離されかつ精製された、インフルエンザ菌(H．in fluenzae)のＮｕｃＡタンパク質。 １７．インフルエンザ菌(H．influenzae)のＮｕｃＡタンパク質について生物学 的に同等なアミノ酸配列を有する、請求の範囲１５の単離されかつ精製されたＮ ｕｃＡタンパク質であって、配列番号２のアミノ酸26〜603のアミノ酸配列が、 Ｋ７９Ｅ、Ｎ１８６Ｋ、Ｓ２６２Ｇ、Ｖ２９４Ａ、Ｅ３０５Ｑ、Ｋ３２７Ｒ、Ｔ ３３７Ａ、Ｄ３６０Ｙ、Ｒ３７６ＨもしくはＶ４３６Ｉから成る群から選択され るアミノ酸残基の変化の１個もしくはそれ以上により改変されるタンパク質。 １８．単離されかつ精製された、インフルエンザ菌(H．influenzae)のＮｕｃＡ タンパク質またはそのエピトープ（１個もしくは複数）を含んで成るＮｕｃＡタ ンパク質のペプチドを含んで成るワクチン組成物であって、前記ワクチン組成物 が噛乳動物宿主で防御免疫応答を導き出す組成物。 １９．ＮｕｃＡタンパク質が、配列番号２のアミノ酸26〜603のアミノ酸配列も しくはその生物学的に同等なアミノ酸配列を有する、請求の範囲１８のワクチン 組成物。 ２０．ＮｕｃＡタンパク質が、 （ａ）12％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で測定されるようなおよそ63,000ダルトンの 分子量；および （ｂ）５’−ヌクレオチダーゼ活性 を有する、請求の範囲１８のワクチン組成物。 ２１．ＮｕｃＡタンパク質が、インフルエンザ菌(H．influenzae)のＮｕｃＡタ ンパク質について生物学的に同等なアミノ酸配列を有する、請求の範囲１９のワ クチン組成物であって、配列番号２のアミノ酸26〜603のアミノ酸配列が、Ｋ７ ９Ｅ、Ｎ１８６Ｋ、Ｓ２６２Ｇ、Ｖ２９４Ａ、Ｅ３０５Ｑ、Ｋ３２７Ｒ、Ｔ３３ ７Ａ、Ｄ３６０Ｙ、Ｒ３７６ＨもしくはＶ４３６Ｉから成る群から選択されるア ミノ酸残基の変化の１個もしくはそれ以上により改変される組成物。 ２２．アジュバント、希釈剤もしくは担体をさらに含んで成る、請求の範囲１８ のワクチン組成物。 ２３．アジュバントが、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、ＱＳ−２１ 、３−Ｏ−デアシル化モノホスホリルリピドＡおよびＩＬ−１ ２から成る群から選択される、請求の範囲２２のワクチン組成物。 ２４．請求の範囲１８のワクチン組成物の免疫原性の量を哺乳動物宿主に投与す ることを含んで成る、インフルエンザ菌(H．influenzae)に対する免疫方法。 ２５．単離されかつ精製された、インフルエンザ菌(H．influenzae)のＮｕｃＡ タンパク質またはそのエピトープ（１個もしくは複数）を含んで成るＮｕｃＡタ ンパク質のペプチドを、ワクチン組成物が哺乳動物宿主で防御免疫応答を導き出 すように十分な量で包含することを含んで成る、前記ワクチン組成物の調製方法 。