DE60100879T2

DE60100879T2 - Helicobacter felis Impfstoff

Info

Publication number: DE60100879T2
Application number: DE60100879T
Authority: DE
Inventors: Johannes Gerardus Kusters; Giovanni Cattoli
Original assignee: Akzo Nobel NV
Current assignee: Intervet International BV
Priority date: 2000-07-17
Filing date: 2001-07-11
Publication date: 2004-05-19
Anticipated expiration: 2021-07-12
Also published as: EP1176192B1; US20040005325A1; ES2208519T3; DE60100879D1; EP1176192A3; US7514547B2; ATE251215T1; CA2351110A1; DK1176192T3; EP1176192A2; AU782172B2; AU5432101A; PT1176192E; JP2002355054A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Heliobacter felis Urease Polypeptid Untereinheiten, Nukleinsäuresequenzen, die diese Polypeptid Untereinheiten kodieren, die Verwendung der Polypeptid Untereinheiten in Impfstoffen und die Verwendung in deren Herstellung, Impfstoffe umfassend die besagten Polypeptid Untereinheiten und Verfahren zur Herstellung solcher Impfstoffe. Ferner betrifft die Erfindung diagnostische Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuresequenzen, Polypeptid Untereinheiten und Antikörper gegen die Polypeptid Untereinheiten.
Mehrere Heliobacter Arten stellen die Ursache für eine Pathogenese des gastrischen Epithels dar. Es ist bekannt, dass Heliobacter pylori und zu einem geringeren Ausmass H. heilmannii Gastritis verursachen, ein bedeutender Faktor in der Entwicklung von Magengeschwüren und Magenlymphomen in Menschen. Heliobacter felis ist am wahrscheinlichsten die Ursache für Mageninfektionen in sowohl Katzen wie auch Hunden. Um die stark saure Umgebung des Magens zu überleben, produzieren die Mitglieder der Heliobacter Familie eine Urease, die fähig ist den im Magensaft vorhandenen Harnstoff zu hydrolysieren. Die Hydrolyse setzt eine Menge an NH₄OH frei, die ausreicht, um die Umgebung des Bakteriums zu neutralisieren. Es ist bekannt, dass die Urease eine Rolle in der Kolonisierung des Bakteriums wie auch in dessen Pathogenese spielt.
Urease-kodierende Gene wurden für sowohl Heliobacter pylori (Labigne et al., J. Bacteriol. 173: 1920–1931 (1991)) wie auch Heliobacter felis (Ferrero et al., Molec. Microbiol. 9, 323–333 (1993) beschrieben und sequenziert. von den sieben in der Expression und Sekretion von Urease beteiligten Genen, kodieren lediglich zwei Gene die strukturellen Untereinheiten Urease A und B des Urease-Enzyms; ureA und ureB. Diese zwei Polypeptide bilden einen Polypeptidkomplex, der Urease-Aktivität besitzt. Impfstoffe gegen durch sowohl H. pylori wie auch felis verursachte Infektionen sind hergestellt worden und sind Gegenstand von unter anderem den Internationalen Patentanmeldungen WO 94/09823 und WO 96/34624. Mehrere Versuche wurden unternommen H. pylori Urease als eine Impfstoffkomponente zum Schutz von Katzen gegen H. felis Infektionen zu verwenden. Obwohl tatsächlich ein gewisser Grad an Schutz erreicht werden kann, liegen die Resultate fern von einem 100%igen Schutz, der wünschenswert wäre. Von bis jetzt publizierten Tierversuchen geht klar hervor, dass eine beträchtliche Anzahl an mit H. pylori geimpften Tieren gar nicht gegen einen anschliessenden Challenge mit H. felis geschützt ist. Ein Schutz von Katzen, die mit gereinigter Urease von entweder H. felis oder pylori geimpft wurden, wurde nicht beschrieben. Eine Impfung von Katzen mit ganzen H. felis Zelllysaten ist theoretisch durchführbar aber keine praktische Alternative. Dies, da H. felis trotz vieler Verbesserungsversuche schwer heranzuzüchten ist.
Es besteht eindeutig ein Bedarf für einen effizienten Impfstoff basierend auf homologen Komponenten und es ist offensichtlich, dass die bekannte H. felis Urease keinen vollen Schutz verleiht.
Es ist unter anderem ein Ziel der vorliegenden Erfindung eine H. felis Urease bereitzustellen, die fähig ist, einen Schutz gegen Heliobacter felis Infektionen in Hunden und Katzen zu induzieren. Es wurde nun überraschenderweise gefunden, dass in H. felis eine zweite Urease existiert, von welcher die die strukturellen Untereinheiten kodierenden Gene nur in geringem Masse homolog zu den bekannten H. felis ureA und B Genen sind. Die neue Urease wird UreaseXY benannt, um sie von der bekannten UreaseAB zu unterscheiden. Die neu entdeckte Urease wurde in H. felis entdeckt und ist in H. pylori nicht vorhanden.
Die gesamte genetische Struktur der Gene, die die zwei strukturellen Urease Untereinheiten UreX und UreY kodieren ist mit der der bekannten UreA und UreB in H. felis und H. pylori vergleichbar. Die Sequenzhomologie ist jedoch überraschend niedrig. Es kam als noch grössere Überraschung, dass die Homologie zwischen den ureA und B Genen und den neuen ureX und Y Genen in einem einzigen H. felis Stamm sogar noch auffallend geringer als die Homologie zwischen den verschiedenen ureA und B Genen der verschiedenen Heliobacter Spezies ist.
Tabellen 1a, 1b und 1c zeigen den Vergleich des ureX und Y Gens und der Polypeptide, die sie von fünf verschiedenen Heliobacter felis Spezies kodieren, mit den ureA und B Genen und den Poly– peptiden von Heliobacter felis, pylori und heilmannii.
In Tabellen 1a, b und c wird der Grad an Homologie der Gene, die die neuen strukturellen Urease Untereinheiten X und Y kodieren, und der Polypeptide, die sie kodieren, im Vergleich zu den der bekannten ureA und B Genen und Polypeptid Untereinheiten dargestellt.
Tabelle 1a: Aminosäuren und Nukleinsäurehomologie zwischen den H. felis ureX und verschiedenen ureA Untereinheiten
Tabelle 1b: Aminosäuren und Nukleinsäurehomologie zwischen den H. felis ureY und verschiedenen ureB Untereinheiten
Tabelle 1c: Nukleinsäurehomologie zwischen H. felis ureXY und verschiedenen ureAB Genen Eine Variante der vorliegenden Erfindung betrifft demzufolge Nukleinsäuren, die die neuen Urease X und Y Untereinheiten kodieren.
In erster Linie betrifft diese Variante der Erfindung Nukleinsäuren, die zwei zum Beispiel durch Heliobacter felis exprimierte Untereinheiten eines Urease Komplexes kodieren, die zu mindestens 85% homolog zu SEQ ID NO: 1 sind, oder Teile davon von einer Länge von mindestens 40, vorzugsweise 45, mehr bevorzugt 50 Nukleotiden, die mindestens ein immunogenes Fragment einer der Untereinheiten kodieren. Noch mehr bevorzugt sind sogar noch längere Fragmente, mit einer Länge von mindestens 55, 60 oder 70 Nukleinsäuren in dieser Reihenfolge.
Eine bevorzugte Ausführung dieser Variante betrifft Nukleinsäuren, die die Urease X Polypeptid Untereinheit oder die Urease Y Polypeptid Untereinheit kodieren und die mindestens zu 85% homolog zu SEQ ID NO: 1 sind, oder Teile davon mit einer Länge von mindestens 40, vorzugsweise 45, mehr bevorzugt 50 Nukleotiden, die mindestens ein immunogenes Fragment der Urease X Polypeptid Untereinheit oder der Urease Y Polypeptid Untereinheit kodieren. Lediglich als Beispiel: die Nukleinsäuresequenz, die die Urease X Untereinheit des Heliobacter felis Stammes CS1 kodiert, beginnt bei Position 206/207/208 (GTG) (siehe 1a(1)) und endet bei Position 884/885/886 (TAA), die Nukleinsäuresequenz, die die Urease Y Untereinheit des Heliobacter felis Stammes CS1 kodiert, beginnt bei Position 897/898/899 (ATG) und endet bei Position 2601/2602/2603 (TAG).
Noch mehr bevorzugt sind sogar noch längere Fragmente, mit einer Länge von mindestens 55, 60 oder 70 Nukleotiden in dieser Reihenfolge.
Eine noch mehr bevorzugte Ausführung dieser Variante betrifft Nukleinsäuren die mindestens zu 90%, vorzugsweise zu 94%, noch mehr bevorzugt zu 97% homolog zu SEQ ID NO: 1 sind.
Die Bestimmung der Prozentanteile an Homologie wurde mit dem Computerprogramm Align Plus für Windows, erhältlich von Scientific and Educational Software, P. O. Box 72045 Durham, NC 277222045, USA durchgeführt. Die für die Vergleiche der Nukleinsäuren verwendeten Einstellungen sind in 1a, 1b und 1c angegeben.
Da die vorliegende Erfindung Nukleinsäuren, die neue, struturelle Heliobacter felis Urease Untereinheiten kodieren, offenbart, ist es nun erstmals möglich, solche Polypeptide in ausreichenden Mengen zu erhalten. Dies kann zum Beispiel unter Verwendung von Expressionsystemen zur Expression von Genen, die die UreX und UreY Untereinheiten kodieren, durchgeführt werden.
Demzufolge betrifft die Erfindung in einer noch mehr bevorzugten Variante DNA-Fragmente, die eine erfindungsgemässe Nukleinsäurensequenz umfassen. Solche DNA Fragmente können zum Beispiel Plasmide darstellen, in welche eine Nukleinsäure der vorliegenden Erfindung kloniert wurde. Solche DNA Fragmente sind zum Beispiel nützlich, um eine grössere Menge an DNA zur Verwendung als Sonde zu erhalten, wie im nachfolgenden beschrieben ist.
Eine wesentliche Voraussetzung zur Expression der Nukleinsäurensequenz ist ein angemessener Promotor, der mit der Nukleinsäure funktionell verknüpft ist. Für einen Fachmann ist es naheliegend, dass die Wahl eines Promotors sich auf jeglichen eukaryotischen, prokaryotischen oder viralen Promotor ausdehnt, der fähig ist, Gentranskription in als Wirtszellen zur Proteinsynthese verwendeten Zellen zu regulieren.
Demzufolge betrifft eine sogar noch mehr bevorzugte Ausführung dieser Variante ein rekombinantes DNA Molekül umfassend ein DNA Fragment oder eine Nukleinsäuresequenz gemäss der Erfindung, welche unter die Kontrolle eines funktionell verknüpften Promotors gestellt ist. Dies kann mithilfe von zum Beispiel Standard molekularbiologischen Methoden (Maniatis/Sambrook, Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual, 1989. ISBN 0-87969-309-6) durchgeführt werden.
Funktionell verknüpfte Promotoren sind Promotoren, die fähig sind, die Transkription von Nukleinsäuresequenzen mit denen sie verknüpft sind, zu kontrollieren.
Wenn die Wirtszellen Bakterien sind, umfassen nützliche Expressions-Kontrollsequenzen, die verwendet werden können zum Beispiel den Trp-Promotor und Operator (Goeddel, et al., Nucl. Acids Res., 8, 4057, 1980); den lac Promotor und Operator (Chang, et al., Nature, 275, 615, 1978); den äusseren Membranproteinpromotor (Nakamura, K. Uns Inogue, M., EMBO J., 1, 771-775, 1982); die Bacteriophagen Lambda Promotoren und Operatoren (Remaut, E. et al., Nucl. Acids Res., 11, 4677–4688, 1983); den α-Amylase (B. Subtilits) Promotor und Operator, Terminationssequenzen und andere Expressionssteigerungs- und Kontrollsequenzen, die mit der ausgewählten Wirtszelle vereinbar sind.
Wenn die Wirtszelle Hefe ist, umfassen nützliche Expressions-Kontrollsequenzen z. Bsp. den α-mating Faktor. Für Insektenzellen können die Polyhedrin oder p10 Promotoren der Baculoviren verwendet werden (Smith, G. E. et al., Mol. Cell. Biol. 3, 2156-65, 1983). Wenn die Wirtszelle von säugetierartiger Herkunft ist, umfassen illustrative, nützliche Expressions-Kontrollsequenzen den SV-40 Promotor (Berman, P. W. et al., Science, 222, 524–527, 1983) oder den Metallothionein Promotor (Brinster, R. L., Nature, 296, 39–42, 1982) oder einen Hitzeschock Promotor (Voellmy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4949–53, 1985).
Bakterielle, Hefe-, Pilz-, Insekten- und Säugetierzell- Expressionssysteme sind sehr häufig verwendete Systeme. Solche Systeme sind in der Fachwelt wohlbekannt und generell, zum Beispiel kommerziell durch Clontech Laboratories, Inc. 4030 Fabian Way, Palo Alto, California 94303–4607, USA erhältlich. Neben diesen Expressionssystemen sind auf Parasiten basierende Expressionssystme äusserst attraktive Expressionssysteme. Solche Systeme sind z. Bsp. in der französischen Patentanmeldung mit Publikationsnummer 2 714 074 und in der US NTIS Publikation No. US 08/043109 (Hoffmann, S. und Rogers, W.: Publikationsdatum 1. Dezember 1993) beschrieben.
Demzufolge betrifft eine sogar noch mehr bevorzugte Ausführung dieser Variante der Erfindung lebend rekombinante Träger-Mikroorganismen (Live Recombinant Carrier, LRCs) umfassend ein Gen, das das UreX oder UreY Polypeptid kodiert oder ein immunogenes Fragment davon gemäss der Erfindung. Solche Mikroorganismen sind z. Bsp. Bakterien oder Viren. Diese LRC-Mikroorganismen sind Mikroorganismen, in welche zusätzliche genetische Information, in diesem Fall ein Gen, das das UreX oder UreY Polypeptid kodiert oder ein immunogenes Fragment davon gemäss der Erfindung, kloniert wurde. Mit solchen LRCs infizierte Tiere werden eine immunogene Antwort nicht nur gegen die Immunogene des Vektors, sondern auch gegen die immunogenen Teile des (der) Polypeptids (Polypeptide), für welche der genetische Code zusätzlich in den LRC kloniert wurde, z. Bsp. das ureX oder Y Gen, hervorrufen.
Als Beispiel für bakterielle LRCs können in der Fachwelt wohlbekannte, abgeschwächte Salmonella Stämme günstig verwendet werden.
Lebend rekombinante Träger-Parasiten wurden unter anderem von Vermeulen, A. N. (Int. Journ. Parasitol. 28: 1121–1130 (1998)) beschrieben.
LRC-Viren können ebenso als Transportmittel für die Nukleinsäure in die Zielzelle verwendet werden. Lebend rekombinante Träger-Viren werden ebenfalls Vektor-Viren genannt. Die Integrationsstelle des Gens, das ein UreX oder Y Polypeptid kodiert, kann eine Stelle in einem viralen Gen sein, die nicht wesentlich für das Virus ist, oder eine Stelle in einer intergenen Region. Viren, die oft als Vektoren verwendet werden, sind Vaccinia Viren (Panicali et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 4927 (1982), Herpesviren (E. P. A. 0 473 210 A2) und Retroviren (Valerio, D. Et al., in Baum, S. J., Dicke, K. A., Lotzova, E. und Pluznik, D. H. (Eds.), Experimental Haematology today – 1988. Springer Verlag, New York: pp. 92–99 (1989)).
Das Verfahren der in der Fachwelt wohlbekannten in vivo homologen Rekombination kann verwendet werden, um eine rekombinante Nukleinsäuresequenz in das Genom des Bakteriums, Parasiten oder Virus nach Wahl, das fähig ist, die Expression der eingeschobenen Nukleinsäuresequenz gemäss der Erfindung im Wirtstier zu induzieren, einzuführen.
Schlussendlich betrifft eine weitere Ausführung dieser Variante der Erfindung eine Wirtszelle umfassend eine Nukleinsäure, die ein erfindungsgemässes Polypeptid kodiert, ein DNA Fragment, das solch eine Nukleinsäuresequenz umfasst oder ein rekombinantes DNA Molekül, das solch eine Nukleinsäuresequenz unter der Kontrolle eines funktionell verknüpften Promotors umfasst. Diese Ausführung betrifft ebenfalls eine Wirtszelle enthaltend einen lebend rekombinanten Träger, der ein Nukleinsäuremolekül, das ein UreX oder Y Polypeptid kodiert, oder ein immunogenes Fragment davon gemäss der Erfindung, umfasst.
Eine Wirtszelle kann eine Zelle bakteriellen Ursprungs sein, z. Bsp. Escherichia coli, Bacillus subtilis und die Lactobacillus Spezies, in Kombination mit auf Bakterien basierenden Plasmiden wie pBR322, oder bakteriellen Expressionsvektoren, wie pGEX, oder mit Bacteriophagen. Die Wirtszelle kann ebenso eukaryotischen Ursprungs sein, z. Bsp. Hefezellen in Kombination mit Hefe spezifischen Vektormolekülen oder höhere eukaryotische Zellen wie Insektenzellen (Luckow et al; Bio-technology 6 : 47 : 55 (1988)) in Kombination mit Vektoren oder rekombinanten Baculoviren, Pflanzenzellen in Kombination mit z. Bsp. Ti-Plasmid basierenden Vektoren oder pflanzlichen, viralen Vektoren (Barton K. A. et al; Cell 32: 1033 (1983)), Säugetierzellen wie HeLa Zellen, Chinese Hamster Ovary Zellen (CHO) oder Crandell Feline Nierenzellen, ebenso mit geeigneten Vektoren oder rekombinanten Viren.
Eine weitere Variante der Erfindung betrifft die durch die Nukleinsäuresequenzen kodierten Polypeptide, d. h. die Urease X Untereinheit und die Urease Y Untereinheit und zu immunogenen Fragmenten davon gemäss der Erfindung.
Demzufolge betrifft diese Variante der Erfindung das Heliobacter felis urease X Polypeptid, wobei das besagte Polypeptid eine Aminosäurensequenz besitzt, die zu mindestens 85% homolog zu SEQ ID NO: 2 ist, oder ein immunogenes Fragment dieses Polypeptids mit einer Länge von mindestens 40 Aminosäuren, das fähig ist, eine Immunantwort gegen ureaseXY zu induzieren. Die Länge des Fragmentes beträgt vorzugsweise mehr als 40 Aminosäuren, mehr bevorzugt mindestens 45, 50, 55, 60 oder 70 Aminosäuren in dieser Reihenfolge.
Diese Variante betrifft vorzugsweise solche Polypeptide mit einer Sequenzhomologie von mindestens 90%, mehr bevorzugt 94%, sogar noch mehr bevorzugt 97% Homologie zu SEQ ID NO: 2, oder ein immunogenes Fragment dieses Polypeptids mit einer Länge von mindestens 40 Aminosäuren, mehr bevorzugt mindestens 45, 50, 55, 60 oder 70 Aminosäuren in dieser Reihenfolge, das fähig ist, eine Immunantwort gegen UreaseXY zu induzieren.
Diese Variante der Erfindung betrifft ebenfalls das Heliobacter felis Urease Y Polypeptid, wobei das besagte Polypeptid eine Aminosäurensequenz besitzt, die zu mindestens 85% homolog zu SEQ ID NO: 3 ist, oder ein immunogenes Fragment dieses Polypeptids mit einer Länge von mindestens 40 Aminosäuren, das fähig ist, eine Immunantwort gegen UreaseXY zu induzieren. Die Länge des Fragmentes beträgt vorzugsweise mehr als 40 Aminosäuren, mehr bevorzugt mindestens 45, 50, 55, 60 oder 70 Aminosäuren in dieser Reihenfolge.
Diese Variante betrifft vorzugsweise solche Polypeptide mit einer Sequenzhomologie von mindestens 90%, mehr bevorzugt 94%, sogar noch mehr bevorzugt 97% Homologie zu SEQ ID NO: 3, oder ein immunogenes Fragment dieses Polypeptids mit einer Länge von mindestens 40 Aminosäuren, mehr bevorzugt mindestens 45, 50, 55, 60 oder 70 Aminosäuren in dieser Reihenfolge, das fähig ist, eine Immunantwort gegen UreaseXY zu induzieren.
Was den Vergleich der Nukleotidsequenzen anbetrifft, wurde der Vergleich zwischen den verschiedenen Aminosäurensequenzen mittels Align Plus für Windows, erhältlich von Scientific and Educational Software, P. O. Box 72045 Durham, NC 27722-2045, USA, vorgenommen. Die für die Vergleiche der Aminosäuren verwendeten Einstellungen sind in 1a, 1b und 1c angegeben.
Es versteht sich, dass für die besonderen, hierin eingeschlossenen Polypeptide natürliche Variationen zwischen individuellen Heliobacter felis Stämmen bestehen können. Diese Variationen können sich durch (einen) Unterschied(e) in Aminosäuren in der Gesamtsequenz oder durch Deletionen, Substitutionen, Insertionen, Inversionen oder Additionen von (einer) Aminosäure(n) in der besagten Sequenz offenbaren. Aminosäurensubstitutionen, die die biologischen und immunologischen Aktivitäten nicht wesentlich ändern, wurden z. Bsp. von Neurath et al in „The Proteins" Academic Press New York (1979) beschrieben. Ersetzungen von Aminosäuren zwischen verwandten Aminosäuren oder Ersetzungen, die in der Evolution oft vorkamen, sind unter anderem Ser/Ala, Ser/Gly, Asp/Gly, Asp/Asn, Ile/Val (siehe Dayhof, M. D., Atlas of protein sequence and structure, Nat. Biomed. Res. Found., 1978, vol.5, suppl. 3). Andere Aminosäurensubstitutionen umfassen Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/val, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Leu/Ile, Leu/Val und Ala/Glu. Lipman und Pearson entwickelten basierend auf dieser Information eine Methode für einen raschen und sensitiven Vergleich von Proteinen (Science, 227, 435–144, 1985) und zur Bestimmung der funktionellen Ähnlichkeit zwischen homologen Proteinen. Solche Aminosäurensubstitutionen der. exemplarischen Varianten der Erfindung sowie Variationen mit Deletionen und/oder Insertionen liegen innerhalb des Rahmens der Erfindung solange die entstehenden Polypeptide deren Immunoreaktivität beibehalten. Variationen, die die Immunogenität des Polypeptides im Vergleich zum Wildtyp Polypeptid, wie in SEQ ID NO: 2 oder 3 dargestellt, nicht wesentlich beeinflussen, gelten demzufolge als innerhalb des Rahmens der Erfindung liegend. Diejenigen Variationen innerhalb der Aminosäuren-sequenz einer bestimmten, erfindungsgemässen, strukturellen Untereinheit X oder Y, die nach wie vor ein Polypeptid bereitstellen, das fähig ist, eine Immunantwort gegen eine Infektion mit H. felis oder zumindest gegen die klinischen Erscheinungsformen der Infektion zu induzieren, gelten als Polypeptide, die „die Immunogenität nicht wesentlich beeinflussen".
Wenn ein Polypeptid z. Bsp. für Impfungszwecke oder um Antikörper hervorzurufen verwendet wird, ist es jedoch nicht notwendig, das ganze Polypeptid zu verwenden. Es ist ebenso möglich, ein Fragment, ein sogenanntes immunogenes Fragment, zu verwenden, welches als solches oder gekoppelt an einen Träger, wie zum Beispiel KLH, fähig ist, eine Immunantwort gegen das Polypeptid zu induzieren: Unter einem „immunogenen Fragment" versteht man ein Fragment eines Polypeptides in voller Länge der strukturellen Untereinheit X oder Y, welches nach wie vor seine Fähigkeit, eine Immunantwort im Wirt zu induzieren, beibehalten hat, d. h. ein B- oder T-Zell Epitop umfasst. Gegenwärtig ist eine Vielfalt von Methoden erhältlich, um auf einfache Weise DNA Fragmente, die antigene Fragmente (Determinanten) kodieren, zu identifizieren. Das von Geysen et al beschriebene Verfahren (Patentanmeldung WO 84/03564, Patentanmeldung WO 86/06487, US Patent Nr. 4,833,092, Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 3998–4002, (1984), J. Imm. Meth. 102, 259–274 (1987)), das sogenannte PEPSCAN Verfahren ist ein einfach durchführbares, schnelles und gut erprobtes Verfahren zum Nachweis von Epitopen; den immunogen wichtigen Regionen des Polypeptides. Das Verfahren wird weltweit angewendet und ist als solches in der Fachwelt wohlbekannt. Dieses (empirische) Verfahren ist besonders zum Nachweis von B-Zellepitopen geeignet. Zudem können Computeralgorithmen bei gegebener Sequenz eines Gens, das irgendein Protein kodiert, spezifische Po lypeptidfragmente basierend auf deren sequentiellen und/oder strukturellen Übereinstimmung mit jetzt bekannten Epitopen als die immunologisch wichtigen Epitope bezeichnen. Die Bestimmung dieser Regionen basiert auf einer Kombination von Hydrophilie-Kriterien gemäss Hopp und Woods (Proc. Natl. Acad. Sci. 78: 38248–3828 (1981)) und den Sekundärstrukturaspekten gemäss Chou und Fasman (Advances in Enzymology 47: 45–148 (1987) und US Patent 4,554,101). T-Zellepitope können gleichermassen ausgehend von der Sequenz mittels Computer mit Hilfe des Amphiphiliekriteriums von Berzofsky (Science 235, 1059–1062 (1987) und US Patentanmeldung NTIS US 07/005, 885) vorhergesagt werden. Eine zusammengefasste Übersicht kann in Shan Lu bezüglich allgemeiner Grundsätze: Tibtech 9: 238–242 (199), Good et al bezüglich Mala ria Epitope; Science 235: 1059–1062 (1987), Lu für eine Zusammenfassung; Vaccine 10: 3–7 (1992), Berzowsky bezüglich HIV-Epitope; The FASEB Journal 5: 2412–2418 (1991) gefunden werden.
Impfstoffe gegen z. Bsp. Heliobacter pylori, welches nur eine Urease hat, können basierend auf dieser Urease wie hierin zuvor beschrieben hergestellt werden. Im speziellen Fall von Heliobacter felis kann jedoch ein Impfstoff basierend auf den bekannten Heliobacter felis strukturellen Untereinheiten ureA und B keinen ausreichenden Schutz gegen eine Heliobacter felis Infektion bereitstellen: Eine Immunität gegen die strukturellen Untereineheiten ureA und B neutralisiert die Urease Aktivität der neu entdeckten, heterologen, strukturellen Untereinheiten UreX und Y angeblich nicht.
Demzufolge sollten Impfstoffe zum Schutz von Tieren gegen eine Heliobacter felis Infektion zumindest gegen die neue. Urease XY gerichtet sein.
Demzufolge betrifft eine Ausführung einer noch weiteren Variante der Erfindung Impfstopffe, die fähig sind, Säugetiere wie Hunde und Katzen gegen eine Heliobacter felis Infektion zu schützen, und die die strukturelle Untereineheit X oder Y, vorzugsweise X und Y, mehr bevorzugt X, Y, A und B oder ein immunogenes Fragment von X und/oder Y gemäss der Erfindung zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfassen.
Noch eine weitere Variante der vorliegenden Erfindung betrifft Polypeptide gemäss der Erfindung zur Verwendung in einem Impfstoff.
Noch eine weitere Variante betrifft die Verwendung des Polypeptids gemäss der Erfindung in der Herstellung eines Impfstoffes zur Bekämpfung von Heliobacter felis Infektionen.
Ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes gemäss der Erfindung besteht in der biochemischen Reinigung des UreaseXY Polypeptids oder dessen Untereinheiten von einer Bakterienkultur. Dies kann z. Bsp. mittels Zentrifugation der Bakterien und der Verwendung von Gelfiltrationssäulen zur Trennung des Urease Polypeptids oder dessen Untereinheiten von anderen Komponenten durchgeführt werden. Eine weitere Reinigung kann durch selektive Fällung in Ammoniumsulfat, gefolgt von Zentrifugation, Gelelektrophorese und falls erwünscht Trennung von den Urease AB Untereinheiten und Lösen des Pellets in einem geeigneten Puffer durchgeführt werden. Dies ist jedoch ein zeitraubendes Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes, vor allem unter Umständen, unter denen Heliobacter felis schwierig zu züchten ist.
Es ist demzufolge viel geeigneter, die Expressionsprodukte der Gene, die die Urease X und Y Untereinheiten gemäss der Erfindung kodieren, in den Impfstoffen zu verwenden. Solche Impfstoffe können einfach durch Mischen von ureaseXY oder einer UreX oder Y Untereinheit oder eines immunologischen Fragmentes davon gemäss der Erfindung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger wie im folgenden beschrieben hergestellt werden.
Zudem können Impfstoffe lebend rekombinante Träger wie hierin zuvor beschrieben, die fähig sind, ureaseXY oder eine UreX oder UreY Untereinheit oder immunologische Fragmente davon gemäss der Erfindung zu exprimieren, umfassen. Solche Impfstoffe, z. Bsp. basierend auf einem Salmonella Träger oder einem das Magenepithel infizierenden viralen Träger, haben den Vorteil gegenüber Untereinheit-Impfstoffen, dass sie den natürlichen Weg der Infektion von Heliobacter felis besser nachahmen.
Zudem ist die Eigenpropagation vorteilhaft, da nur geringe Men gen des rekombinanten Trägers für eine Immunisation notwendig sind.
Die hierin zuvor beschriebenen Impfstoffe tragen alle zur aktiven Impfung bei, d. h. das Immunsystem des Wirts wird durch das UreX und/oder Y Polypeptid oder immunogene Fragmente davon ausgelöst, um Antikörper gegen diese Polypeptide herzustellen.
Andrerseits können solche Antikörper z. Bsp. in Hasen hervorgerufen werden oder von Antikörper-produzierenden Zelllinien wie im nachfolgenden beschrieben erhalten werden. Solche Antikörper können dann dem Wirtstier verabreicht werden. Dieses Verfahren der Impfung, die passive Impfung, ist die Impfung der Wahl wenn ein Tier bereits infiziert ist und keine. Zeit mehr bleibt, die natürliche Immunreaktion auszulösen. Es ist ebenso das bevorzugte Verfahren zur Impfung von immunkompromittierten Tieren. Verabreichte Antikörper gegen Heliobacter UreX oder UreY können in diesen Fällen direkt an die von den Bakterien ausgeschiedene Urease binden. Dies hat den Vorteil, dass die Ureaseaktivität direkt eliminiert wird, was zu einer Ansäuerung der Umgebung und einem vermindertem oder unterbundenem Heliobacter Wachstum führt.
Demzufolge betrifft eine weitere Ausführung dieser Variante der Erfindung Impfstoffe umfassend Antikörper gegen Heliobacter felis Urease X Polypeptide, die eine Aminosäurensequenz besitzen, die zu mindestens 85% homolog zu SEQ ID NO: 2 ist, oder immunogene Fragmente dieses Polypeptids mit einer Länge von mindestens 40 Aminosäuren, die fähig sind eine Immunantwort gegen UreaseXY zu induzieren oder Antikörper gegen Heliobacter felis Uresse Y Polypeptide, die eine Aminosäurensequenz besitzen, die zu mindestens 85% homolog zu SEQ ID NO: 3 ist, oder immunogene Fragmente dieses Polypeptids mit einer Länge von mindestens 40 Aminosäuren, die fähig sind eine Immunantwort gegen UreaseXY zu induzieren.
Die Impfstoffe können ebenso auf den hierin zuvor beschriebenen Wirtszellen basieren, die ureaseXY, eine UreX oder UreY Untereinheit oder immunogene Fragmente davon gemäss der Erfindung umfassen.
Ein alternatives und effizientes Verfahren zur Impfung ist die direkte Impfung mit DNA, die das relevante Antigen kodiert. Eine direkte Impfung mit DNA, die Polypeptide kodieren, erwies sich für viele Polypeptide erfolgreich (wie z. Bsp. in Donnelly et al., The Immunologist 2: 20–26 (1993) zusammengefasst).
Dieses Impfungsverfahren ist äusserst attraktiv für Impfungen von sowohl Katzen wie auch Hunden gegen eine Heliobacter felis Infektion.
Demzufolge betreffen noch weitere Ausführungen dieser Variante der Erfindung Impfstoffe umfassend Nukleinsäuren, die ein erfindungsgemässes Polypeptid kodieren oder erfindungsgemässe immunogene Fragmente davon sowie Impfstoffe umfassend DNA Fragmente, die solche Nukleinsäurensequenzen umfassen.
Weitere, andere Ausführungen dieser Variante betreffen Impfstoffe, die erfindungsgemässe, rekombinante DNA Moleküle umfassen. DNA Impfstoffe können einfach mittels intradermaler Anwendung verabreicht werden, z. Bsp. mithilfe eines nadellosen Injektors. Diese Art der Verabreichung liefert die DNA direkt in die Zellen des Tieres, das geimpft werden soll. Äusserst gute Resultate werden mit DNA Mengen im Mikrogramm Bereich zwischen 1 und 100 μg erzielt.
In einer weiteren Variante umfasst der Impfstoff gemäss der vorliegenden Erfindung ebenso Antigene von anderen Hund- oder Katzen-pathogenen Organismen und Viren oder genetische Information, die solche Antigene kodieren. Solche Organismen und Viren sind z. Bsp. der Feline Infektiöse Peritonitis-Virus, Feline Immunde fizienz-Virus, Canine oder Feline Parvovirus, Distemper Virus, Adenovirus, Calicivirus, Bordetella bronchiseptica, Borrelia burgdorferi, Leptospira interrogans, Chlamydia und Bartonella henseli.
Die, vorliegende Erfindung betrifft ebenso erfindungsgemässe Polypeptide zur Verwendung in der Herstellung eines Impfstoffes zur Bekämpfung von Heliobacter felis Infektionen.
Alle erfindungsgemässen Impfstoffe umfassen einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Ein pharmazeutisch verträglicher Träger kann z. Bsp. steriles Wasser oder eine sterile, physiologische Salzlösung sein. In komplexerer Form kann der Träger z. Bsp. einen Puffer darstellen.
Impfstoffe gemäss der vorliegenden Erfindung können in einer bevorzugten Darreichungsform auch ein Adjuvans enthalten. Adjuvantien umfassen im allgemeinen Substanzen, die die Immunantwort des Wirts auf unspezifische weise verstärken. Eine Anzahl verschiedener Adjuvantien sind in Fachkreisen bekannt. Beispiele von Adjuvantien sind das Freunds Komplette und Inkomplette Adjuvans, Vitamin E, nichtionische Blockcopolymere, Muramyldipeptide, Quill A^®, Mineralöl, z. Bsp. Bayol^® oder Markol^®, Pflanzenöl und Carbopol^® (ein Homopolymer) oder Diluvac^® Forte. Der Impfstoff kann ebenso ein sogenanntes „Vehikel" umfassen. Ein Vehikel ist eine Verbindung, an welche die Polypeptide haften, ohne kovalent daran gebunden zu sein. Oft verwendete Vehikel Verbindungen sind z. Bsp. Aluminiumhydroxid, -phosphat oder -oxid, Silica, Kaolin und Bentonit.
Eine spezielle Form solch eines Vehikels, in welchem das Antigen partiell im Vehikel eingebettet ist, ist das sogenannte ISCOM (EP 109 942, EP 180 564 , EP 242 380 ).
Zusätzlich kann der Impfstoff eine oder mehrere, geeignete ober flächenaktive Verbindungen oder Emulgatoren, z. Bsp. Span oder Tween, umfassen.
Oft ist der Impfstoff vermischt mit Stabilisatoren, z. Bsp. um Abbau anfällige Polypeptide vor einem Abbau zu schützen, um die Lagerbeständigkeit des Impfstoffs zu fördern oder um die Effizienz der Gefriertrocknung zu verbesseren. Nützliche Stabilisatoren sind unter anderem SPGA (Bovarnik et al; J. Bacteriology 59: 509 (1950)), Kohlenhydrate, wie z. Bsp. Sorbitol, Mannitol, Trehalose, Stärke, Sukrose, Dextran oder Glukose, Proteine wie zum Beispiel Albumin oder Casein oder Abbauprodukte davon und Puffer, wie zum Beispiel Alkalimetallphosphate.
Zusätzlich kann der Impfstoff in einem physiologisch verträglichen Verdünnungsmittel suspendiert werden. Es versteht sich. von selbst, dass andere Arten von Unterstützung durch Adjuvantien, die Zugabe von Vehikel Verbindungen oder Verdünnungsmitteln, das Emulgieren und Stabilisieren eines Polypeptids ebenfalls in der vorliegenden Erfindung enthalten sind.
Erfindungsgemässe Impfstoffe, die die UreX oder UreY Polypeptid Untereinheit umfassen, können äusserst zweckmässig in Mengen von 1 bis 100 Mikrogramm verabreicht werden, obwohl geringere Dosen prinzipiell verwendet werden können. Eine 100 Mikrogramm übersteigende Dosis ist, obwohl immunologisch gesehen äusserst zweckmässig, aus kommerziellen Gründen weniger attraktiv.
Auf lebend abgeschwächten rekombinanten Trägern basierende Impfstoffe, wie zum Beispiel die LRC-Viren und hierin zuvor beschriebenen Bakterien können in viel geringeren Dosen verabreicht werden, da diese sich während der Infektion multiplizieren. Demzufolge würden sich äusserst zweckmässige Mengen zwischen 10³ und 10⁹ CFU/PFU für Bakterien, beziehungsweise Viren bewegen.
Viele Verabreichungswege können angewendet werden. Die intranasale Anwendung ist ein oft verwendeter Weg zur Verabreichung von Impfstoffen. Die orale Anwendung ist ebenso eine attraktive Art der Verabreichung, da sich die Infektion oft im oberen Verdauungstrakt befandet. Eine bevozugte Art der oralen Verabreichung ist das Verkapseln des Impfstoffes in Kapseln, die in Fachkreisen wohlbekannt und oft angewendet werden und die nur in der höchst sauren Umgebung des Magens zerfallen. Zudem kann der Impfstoff mit Verbindungen, die dafür bekannt sind, den pH im Magen vorübergehend zu erhöhen, vermischt werden.
Eine systemische Anwendung ist ebenso geeignet, z. Bsp. mittels intramuskulärer Anwendung des Impfstoffs. Falls diese Route angewendet wird, sind in Fachkreisen für eine systemische Anwendung wohlbekannte Standardverfahren gut geeignet.
Eine, andere Variante der Erfindung betrifft diagnostische Tests zum Nachweis von H. felis Infektionen. Es ist bekannt, dass einige Heliobacter Spezies, wie zum Beispiel H. bizzozeronii, H. felis und H. salomonis, fähig sind, sowohl Katzen wie auch Hunde zu infizieren. Von diesen drei ist H. felis die Spezies, die unter Verdacht steht, den grössten Anteil der Pathologie zu verursachen, obwohl sie an Zahl oft durch H. bizzozeronii und H. salomonis übertroffen wird. Demnach ist eine rasche und korrekte Diagnose der durch Heliobacter felis verursachten Krankheit in sowohl Katzen wie auch Hunden wichtig. Es erwies sich jedoch als schwierig zwischen den drei Spezies zu. unterscheiden aufgrund der Tatsache, dass sie so nahe verwandt. sind.
Demzufolge ist es ein weiteres Ziel der. Erfindung solche diagnostischen Hilfsmittel, die geeignet sind, H. felis von den anderen Heliobacter Spezies zu unterscheiden, bereitzustellen.
Basierend auf den neuen Urease Polypeptiden und den Genen, die die Urease Polypeptide kodieren, wurden mindestens drei ver schiedene, diagnostische Tests, die speziell dazu geeignet sind, H. felis von den anderen Mitgliedern der Heliobacter Familie zu unterscheiden, entwickelt:

1) ein diagnostischer Test basierend auf der Anwesenheit oder Abwesenheit von DNA, die die spezifischen UreX und UreY strukturellen Untereinheiten kodieren
2) ein diagnostischer Test basierend auf dem Nachweis von Antikörpern gegen die spezifischen UreX und UreY strukturellen Untereinheiten
3) ein diagnostischer Test basierend auf dem Nachweis von antigenem Material der spezifischen UreX und UreY strukturellen Untereinheiten.

Ein diagnostischer Test gemäss 1) basiert zum Beispiel auf der Reaktion bakterieller DNA, die vom zu testenden Tier isoliert würde, mit spezifischen Sonden oder PCR-Primer basierend auf der Sequenz der ureX oder Y Genen. Falls H. felis DNA im Tier vorhanden ist, wird diese z. Bsp. spezifisch an UreX oder Y spezifische PCR-Primer binden und anschliessend mittels PCR-Reaktion amplifiziert werden. Das PCR-Reaktionsprodukt kann dann einfach mittels DNA-Gelelektrophorese nachgewiesen werden.
Die DNA kann am einfachsten von Mikroorganismen, die in Tupfern des oberen Verdauungstraktes oder im Speichel des zu testenden Tieres vorhanden sind, isoliert werden. Spezifische Primer können einfach aus den vielen Regionen der UreX und UreY Kodierungssequenzen und den nicht-kodierenden, intergenen Sequenz, die sich in der Sequenz von den vergleichbaren Regionen in den UreAB Kodierungssequenzen unterscheiden, ausgewählt werden. Einer der vielen Algorithmen, der zur Bestimmung des Grades an Homologie zwischen den Nukleinsäuren und zum Vergleich von Nukleotidsequenzen geeignet ist, ist als „Clustal W" bekannt. Dieser wurde von Thompson et al., in Nucleic Acids Research 22: 4673-4680 (1994) beschrieben. Das Programm kann in mehreren Inter netseiten vorgefunden werden. Eine Alternative jüngeren Datums für dieses Programm ist z. Bsp. Align Plus für Windows, erhältlich von Scientific and Eductaional Software, P. O. Box 72045 Durham, NC 27722-2045, USA.
Wie sich von 1 ergibt, gibt es eine grosse Anzahl von möglichen PCR-Primern, die für UreX oder UreY spezifisch sind. Ein äusserst spezifisches Paar von PCR-Sonden wird z. Bsp. durch die 5'-gelegene Sequenz CATGCACTTTTTGAAAAAAGA (SEQ ID NO: 16) und die 3'-gelegene Sequenz TATGGTGGTCTTCTCT (SEQ ID NO: 17) gebildet. Natürlich sind viele andere Sequenzen, die für UreX oder die intergene Region spezifisch sind, geeignet. Standard PCR-Lehrbücher geben Verfahren zur Bestimmung der Eignung der Sonden für selektive PCR-Reaktionen mit UreX oder UreY an. PCR-Methoden werden ausgiebig in Dieffenbach & Dreksler, PCR-Primer, a laboratory manual. ISBN 0-87969-447-5 (1995) beschrieben.
Ein weiterer, auf DNA basierender Test basiert auf dem Wachstum von vom Tupfer erhaltenem, bakteriellem Material, gefolgt von klassischer DNA-Reinigung, gefolgt von klassischer Hybridisation mit radioaktiv oder mit Farbe markierten UreXY-spezifischen DNA Fragmenten. Aufgrund der sehr geringen Homologie zwischen den UreXY-kodierenden Regionen und den UreAB kodierenden Regionen von sowohl H. felis wie auch anderen Heliobacter Spezies, deutet eine Hybridisation eindeutig auf die Anwesenheit oder Abwesenheit von H. felis hin. Sowohl PCR-Reaktionen wie auch Hybridisationsreaktionen sind Fachleuten wohlbekannt und sind unter anderem in Maniatis/Sambrook (Sambrook, J. Et al. Molecular cloning, a laboratory manual. ISBN 0-87969-309-6) beschrieben.
Ein selektiver Nachweis mittels PCR-Primern oder mittels klassischer Hybridisation mit UreXY-spezifischen DNA Fragmenten kann mittels Fragmenten, die vorzugsweise kurz sind aber aus praktischen Gründen vorzugsweise aus einem Abschnitt von mindestens 10 aufeinanderfolgenden Nukleotiden der SEQ ID NO: 1 bestehen, durchgeführt werden. Es versteht sich, dass für Hybridisationsexperimente eine Sonde ausgewählt werden muss, die eine grössere Homologie zur SEQ ID NO: 1 besitzt, als zu den Sequenzen, die die Heliobacter UreA oder UreB Untereinheit kodieren. Solch eine Sonde kann einfach mithilfe des hierin zuvor beschriebenen Align Plus für Windows Programm oder dem Clustal W Programm ausgewählt werden. In einem vergleichbaren Hybridisationsexperiment kann die DNA, die diagnostiziert werden soll, neben z. Bsp. H. pylori getestet werden. Die erfindungsgemässe Sonde mit einer grösseren Homologie zu SEQ ID NO: 1 als zum UreAB kodierenden Gen, würde besser an H. felis DNA binden (falls in der Probe vorhanden) als an DNA anderer Heliobacter Spezies und demzufolge spezifisch das Vorhandensein von H, felis DNA in der zu testenden Probe offenbaren. Die hierin zuvor erwähnten Sequenzen SEQ ID NO: 16 oder 17 sind lediglich Beispiele von Sonden, die zur Markierung und anschliessender Anwendung in den beschriebenen H. felis spezifischen Hybridisationsassays äusserst geeignet sind.
Demzufolge betrifft eine Variante der Erfindung einen diagnostischen Test zum Nachweis von DNA, die die spezifischen Heliobacter UreX und UreY Polypeptid Untereinheiten kodieren. Solch ein Test umfasst eine Nukleinsäuresequenz der Erfindung oder ein Fragment davon, das spezifisch für die UreX und UreY kodierende DNA oder die intergene Region zwischen UreX und UreY ist. Ein Fragment, das spezifisch für diese DNA ist, ist ein Fragment, das besser an die UreX und UreY kodierende DNA oder die intergene Region zwischen UreX und UreY bindet, als an die UreA und UreB kodierende DNA oder die intergene Region zwischen UreA und UreB.
Verfahren zum Nachweis von Heliobacter felis DNA umfassen Hybridisation der zu testenden DNA mit ureX oder Y DNA, oder PCR-Reaktion der zu testenden DNA mit ureX oder Y DNA spezifischen Sonden.
Ein diagnostischer Test gemäss 2) zum Nachweis von Heliobacter felis Antikörpern in Seren kann zum Beispiel ein einfacher Sandwich-ELISA-Test sein, in welchem die Wände der Vertiefungen einer ELISA-Platte mit gereinigten UreX oder UreY Polypeptid Untereinheiten oder antigenen Fragmenten davon gemäss der Erfindung beschichtet werden. Ein Verfahren zum Nachweis solcher Antikörper ist z. Bsp. die Inkubation von gereinigtem UreX oder Y Polypeptid mit Serum von zu testenden Säugetieren gefolgt von z. Bsp. Inkubation mit einem markierten Antikörper gegen den relevanten Säugetier-Antikörper. Eine Farbreaktion kann dann die Anwesenheit oder Abwesenheit von Antikörpern gegen Heliobacter felis ureaseXY offenbaren. Je nach den markierten Antikörpern, die verwendet werden, kann die Selektivität dieses Systems mittels Präinkubation des zu testenden Serums mit Urease AB, gefolgt von Zentrifugieren des Niederschlags, um nicht-XY-spezifische Reaktionen zu vermeiden, verbessert. werden.
Falls antigene Fragmente der UreX oder UreY strukturellen Untereinheiten gemäss der Erfindung zur Beschichtung verwendet werden, kann der Präinkubationsschritt übersprungen werden.
Ein weiteres Beispiel eines diagnostischen Testsystems ist z. Bsp. die Inkubation eines Western Blot umfassend ein UreX oder UreY Polypeptid oder ein Fragment davon gemäss der Erfindung mit Serum der zu testenden Säugetieren gefolgt von einer Analyse des Blots. Die gereinigten UreX und UreY strukturellen Untereinheiten oder antigenen Fragmente davon gemäss der Erfindung, die zur Beschichtung der ELISA-Platten oder für Western blotting geeignet sind, können einfach mittels Expression des ureX und ureY Gens, wie es von Ferrero für ureA und B beschrieben wurde (Ferrero et al., Molec. Microbiol. 9, 323–333 (1993) erhalten werden.
Die Erfindung betrifft zudem Verfahren zum Nachweis von Antikörpern gegen Heliobacter felis Antikörper in Serum, wobei das Verfahren die Inkubation von Serum mit einem UreX oder UreY Polypeptid oder einem antigenen Fragment davon gemäss der Erfindung umfasst.
Ein diagnostischer Test gemäss 3), welcher auf dem Nachweis von antigenem Material der spezifischen UreX und UreY strukturellen Untereinheiten der Heliobacter felis Antigene basiert und demzufolge für den Nachweis von Heliobacter felis Infektionen geeignet ist, kann z. Bsp. ebenso ein Standard ELISA Test sein. In einem Beispiel solch eines Tests werden die Wände der Vertiefungen einer ELISA-Platte mit Antikörpern, die gegen die spezifischen UreX und UreY strukturellen Untereinheiten von Heliobacter felis gerichtet sind, beschichtet. Das antigene Material, das getestet werden soll, kann falls notwendig mit Antikörpern gegen UreA und B präinkubiert werden. Dies wird die UreX und Y Epitope unbedeckt lassen und somit wird die präinkubierte Heliobacter Spezies nur an die ELISA-Platten binden, falls sie UreX oder Y umfassen, d. h. falls es sich spezifisch um Heliobacter felis handelt.
Die Verwendung von monoklonalen Antikörpern, die spezifisch für UreX oder Y sind und nicht mit UreA oder B reagieren sind die bevorzugten Antikörper für solche Tests, da durch diese der Präinkubationsschritt überflüssig wird. Solche monoklonalen Antikörper können einfach durch Immunisieren von Inzucht-Mäusen mit immunisierenden Fragmenten von UreX oder Y gemäss der Erfindung mittels in Fachkreisen wohlbekannten Verfahren (siehe unten: Kohler und Milstein) erhalten werden.
Die Polypeptide oder immunogenen Fragmente davon gemäss der Erfindung, die wie oben beschrieben exprimiert wurden, können zur Herstellung von Antikörpern, die sowohl polyklonal, monospezifisch oder monoklonal (oder Derivate davon) sein können, verwendet werden. Falls polyklonale Antikörper erwünscht sind, sind Verfahren zur Herstellung und Aufbereitung polyklonaler Seren in Fachkreisen wohlbekannt ( z. Bsp. Walter und Mayer, Eds. Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology, Academic Press, London, 1987).
Monoklonale Antikörper, die gegen das Polypeptid gemäss der Erfindung (oder Variationen oder Fragmente davon gemäss der Erfindung) reaktiv sind, können durch Immunisieren von Inzucht-Mäusen mittels ebenso in Fachkreisen wohlbekannten Verfahren hergestellt werden (Köhler and Milstein, Nature, 256, 495–497, 1975).
Schliesslich betrifft die Erfindung Verfahren zum Nachweis von antigenem Material von Heliobacter felis, worin das Verfahren die Inkubation von Serum, Gewebe von Körperflüssigkeiten mit Antikörpern gegen das UreX oder UreY Polypeptid oder ein antigenes Fragment davon gemäss der Erfindung umfasst.
Beispiel 1
Die ureX und ureY Gene des Heliobacter felis Stammes CS1: Klonieren und Expression in Escherichia coli
Die ureX und ureY Gene des H. felis Stammes CS1 wurden wiefolgt als Operon in einen E. coli T7 Expressionsvektor, pET3a, kloniert:
Für eine angemessene Expression der UreX und Y Proteine in pET3a (Novagen, 601 Science Drive, Madison WI, USA) wurden die Gene in Form eines NdeI-BamHI DNA Fragment in die NdeI-BamHI Stelle dieses Vektors kloniert. Das ureaseXY Operon enthält eine interne NdeI Stelle, die durch eine PCR Überhang-Verlängerung von 2 PCR Fragmenten mutiert wurde. Zu diesem Zweck wurden zwei PCR Fragmente (die 5' und 3' Produkte) unter Verwendung von chromosomaler DNA von H. felis CS1 als Matrize amplifiziert. Das 5' PCR Produkt enthielt das gesamte ureX Gen und den ersten Teil des ureY Gens. Der Vorwärts-Primer enthielt eine NdeI-Restriktionsstelle und das Startcodon von ureX (GGAGTAACATATGAAACTCACA CCCAAAGAGC) (SEQ ID NO: 18) und der Rückwärts-Primer enthielt eine Punktmutation (CACACCCACGACCATGTGAGGGCTTAC) (SEQ ID NO: 19). Das zweite 3' PCR-Produkt bestand aus dem 3'-Ende des ureY Gens. Dieser Vorwärts-Primer ist komplementär zum Rückwärts-Primer des ersten PCR-Produktes und enthielt ebenfalls dieselbe Punktmutation (GTAAGCC CTCACATGGTCGTGGGTGTG (SEQ ID NO: 20), und der Rückwärts-Primer enthielt eine BamHI-Restriktionsstelle gerade downstream des Stopcodons des ureY Gens (CGAATT CGGATCCTAGAAGAAAGTGTAGCGCTGG) (SEQ ID NO: 21). Die Mutation in den komplementären Primern dient dazu, die interne NdeI-Stelle in ureY zu löschen; sie ersetzt das CATATG (His-Met) durch CACATG (His-Met).
Nach Amplifikation beider PCR Produkte, wurde das vollständige Operon mittels PCR-Überhangverlängerung mithilfe des Vorwärts-Primers von ureX und des Rückwärts-Primers von ureY unter Verwendung beider PCR-Produkte als Matrizen erhalten. Das erhaltene PCR Produkt wurde in PCR-bluntII-TOPO (Invitrogen, P. O. Box 2312, 9704 CH Groningen, Niederlande) kloniert und in E. coli TOP1OF' Zellen (Invitrogen) transformiert. Positive Klone wurden isoliert und die ureaseXY Gene wurden mittels NdeI-BamHI in pET3a subkloniert. Das erhaltene Plasmid wurde pUreXY-1 genannt und wurde in den Expressionsstamm HMS174(DE3)/pLysS (Invitrogen) transformiert.
Die ureX und ureY Gene von pUreXY-1 wurden in HMS174(DE3)/pLysS wiefolgt exprimiert: Eine über Nacht gezüchtete Kultur wurde 1/100 in TB Amp¹⁰⁰Cam²⁵ verdünnt; diese Kultur wurde für 3 Stunden bei 37°C und 200 rpm inkubiert; die Kultur wurde durch Zugabe von 1 mM IPTG induziert und für weitere 3 Stunden bei 37°C und 200 rpm inkubiert. Die Induktion wurde zweimal durchgeführt, einmal in einem kleinen Ansatz und einmal in einem grossen Ansatz.
Die induzierten Proben wurden an einem SDS-PAGE Gel (2) analysiert. Wie in Bahn 9 klar zu ersehen ist, ergab die Expression von UreX und UreY nach Induktion die zwei strukturellen Untereinheiten als Polypeptidbanden mit einem Molekulargewicht von 25 kDa für die UreX Untereinheit und 62 kDa für die UreY Untereinheit.
Legende zu den Abbildungen
1a: Vergleich der die UreX und Y kodierenden Nukleinsäurensequenz der Heliobacter felis. Spezies CS1, Kukka, Ds4, 2301 und 390, einschliesslich einer kurzen, nicht-kodierenden Region, die die zwei Kodierungssequenzen überbrückt, mit der die UreA und B kodierenden Nukleinsäurensequenz von Heliobacter felis, pylori und heilmannii, einschliesslich einer kurzen, nichtkodierenden Region, die die zwei Kodierungssequenzen überbrückt.
1b: Vergleich der Aminosäurensequenz von UreX der Heliobacter felis Spezies CS1, Kukka, Ds4, 2301 und 390, mit der Aminosäurensequenz kodierend UreA von Heliobacter felis, pylori und heilmannii.
1c: Vergleich der Aminosäurensequenz von UreY der Heliobacter felis Spezies CS1, Kukka, Ds4, 2301 und 390, mit der Aminosäurensequenz kodierend UreB von Heliobacter felis, pylori und heilmannii.
2: Polyacrylamidgel der Expressionsprodukte UreX und UreY
Bahn 7 : Biorad Broadrange-Marker
Bahn 8 : Vollständige Zellkultur vor Induktion (Kultur in kleinem Ansatz)
Bahn 9 : Vollständige Zellkultur nach Induktion (Kultur in kleinem Ansatz)
Bahn 10 : Vollständige Zellkultur nach Induktion (Kultur in grossem Ansatz)
Bahn 11 : Überstehende Lösung nach Induktion (Kultur in grossem Ansatz)
Bahn 12 : Biorad prestained Marker
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isolierte Nukleinsäure, die zwei, wie zum Beispiel durch Heliobacter felis exprimierte Polypeptid Untereinheiten eines Urease Komplexes kodiert, wobei die besagte Nukleinsäuresequenz zu mindestens 85% homolog zu SEQ ID NO: 1 ist, oder ein Teil davon, der wenigstens ein immunogenes Fragment einer der besagten Untereinheiten kodiert, wobei der besagte Teil eine Länge von mindestens 40, vorzugsweise 45, mehr bevorzugt 50 Nukleotiden aufweist.
Isolierte Nukleinsäure gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie die Urease X Polypeptid Untereinheit oder die Urease Y Polypeptid Untereinheit kodiert.
Isolierte Nukleinsäure gemäss Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz zu mindestens 90%, vorzugsweise 94%, mehr bevorzugt 97% homolog zu SEQ ID NO: 1 ist.
DNA Fragment umfassend eine Nukleinsäure gemäss Ansprüchen 1–3.
Rekombinantes DNA Molekül umfassend eine Nukleinsäure gemäss Ansprüchen 1–3 oder ein DNA Fragment gemäss Anspruch 4 unter der Kontrolle eines funktionell verknüpften Promotors.
Lebender, rekombinanter Träger umfassend ein rekombinantes DNA Molekül gemäss Anspruch 5.
Wirtszelle umfassend eine Nukleinsäure gemäss Ansprü chen 1–3, ein DNA Fragment gemäss Anspruch 4, ein rekombinantes DNA Molekül gemäss Anspruch 5 oder einen lebenden, rekombinanten Träger gemäss Anspruch 6.
Heliobacter felis Urease X Polypeptid Untereinheit, wobei die besagte Polypeptid Untereinheit eine Aminosäurensequenz besitzt, die zu mindestens 85% homolog zu SEQ ID NO: 2 ist, oder ein immunogenes Fragment der besagten Polypeptid Untereinheit mit einer Länge von mindestens 40, vorzugsweise 45, mehr bevorzugt 50 Aminosäuren, wobei das besagte immunogene Fragment eine Immunantwort gegen UreaseXY induzieren kann.
Polypeptid Untereinheit gemäss Anspruch 8 mit einer Sequenzhomologie von mindestens. 90%, vorzugsweise 94 %, mehr bevorzugt 97% Homologie zu SEQ ID NO: 2, oder ein immunogenes Fragment der besagten Polypeptid Untereinheit, das eine Immunantwort gegen UreaseXY induzieren kann.
Heliobacter felis Urease Y Polypeptid Untereinheit, wobei die besagte Polypeptid Untereinheit eine Aminosäurensequenz besitzt, die zu mindestens 85% homolog zu SEQ ID NO: 3 ist, oder ein immunogenes Fragment der besagten Polypeptid Untereinheit mit einer Länge von mindestens 40, vorzugsweise 45, mehr bevorzugt 50 Aminosäuren, wobei das besagte immunogene Fragment eine Immunantwort gegen UreaseXY induzieren kann.
Polypeptid Untereinheit gemäss Anspruch 10 mit einer Sequenzhomologie von mindestens 90%, vorzugsweise 94 %, mehr bevorzugt 97% Homologie zu SEQ ID NO: 3, oder ein immunogenes Fragment der besagten Polypeptid Untereinheit, das eine Immunantwort gegen UreaseXY induzieren kann.
Polypeptid Untereinheit gemäss Ansprüchen 8–11 zur Verwendung in einem Impfstoff.
Verwendung einer Polypeptid Untereinheit gemäss Ansprüchen 8–11 in der Herstellung eines Impfstoffes zur Bekämpfung von Heliobacter felis Infektionen.
Impfstoff zur Bekämpfung von Heliobacter felis Infektionen, dadurch gekennzeichnet, dass er eine Nukleinsäure gemäss Ansprüchen 1–3, ein DNA Fragment gemäss Anspruch 4, ein rekombinantes DNA Molekül gemäss Anspruch 5, einen lebenden, rekombinanten Träger gemäss Anspruch 6, eine Wirtszelle gemäss Anspruch 7 oder eine Polypeptid Untereinheit gemäss Ansprüchen 8–11 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
Impfstoff gemäss Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass er ein Adjuvans umfasst.
Impfstoff gemäss Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass er ein zusätzliches Antigen, hergeleitet von einem gegenüber Säugetieren pathogenen Virus oder Mikroorganismus, oder genetische Information, die das besagte Antigen kodiert, umfasst.
Impfstoff gemäss Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass das besagte, gegenüber Säugetieren pathogene Virus oder Mikroorganismus ausgewählt ist aus der Gruppe des Felinen infektiösen Peritonitis-Virus, Felinen Immundefizienz-Virus, Caninen oder Felinen Parvovirus, Distemper Virus, Adenovirus, Calicivirus, Bordetella bronchiseptica, Borrelia burgdorferi, Leptospira interrogans, Chlamydia und Bartonella henseli.
Impfstoff zur Bekämpfung von Heliobacter felis Infektionen, dadurch gekennzeichnet, dass er Antikörper ge gen eine Polypeptid Untereinheit gemäss Ansprüchen 8-11 umfasst.
Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes gemäss Ansprüchen 14–17, wobei das besagte Verfahren das Beimischen einer Polypeptid Untereinheit gemäss Ansprüchen 8–11 und eines pharmazeutisch verträglichen Trägers umfasst.
Diagnostischer Test zum Nachweis von Heliobacter felis spezifischer DNA, dadurch gekennzeichnet, dass der Test eine Nukleinsäure oder einen Teil davon gemäss Ansprüchen 1–3 umfasst.
Diagnostischer Test zum Nachweis von Antikörpern gegen Heliobacter felis, dadurch gekennzeichnet, dass der besagte Test eine Polypeptid Untereinheit oder ein Fragment davon gemäss Ansprüchen 8–11 umfasst.
Diagnostischer Test zum Nachweis von antigenem Material von Heliobacter felis, dadurch gekennzeichnet, dass der besagte Test Antikörper gegen eine Polypeptid Untereinheit oder ein Fragment davon gemäss Ansprüchen 8–11 umfasst.