DE69128095T2

DE69128095T2 - Azelluläre impfstoffe

Info

Publication number: DE69128095T2
Application number: DE69128095T
Authority: DE
Inventors: Ian George Charles; Gordon Dept Of Biochemi Dougan; Jing Li Dept Of Biochemistr Li
Original assignee: Evans Medical Ltd
Current assignee: UCB Pharma Ltd
Priority date: 1990-12-21
Filing date: 1991-12-23
Publication date: 1998-02-26
Anticipated expiration: 2011-12-24
Also published as: EP0573435A1; EP0573435B1; DE69128095D1; EP0789031A2; ES2112311T3; ATE159758T1; WO1992011292A1; EP0789031A3; GB9027901D0

Description

Die Erfindung betrifft die Isolierung und Charakterisierung eines Antigens von Bordetella parapertussis, das Antigen codierende DNA-Sequenzen, Expressionsvektoren mit solchen DNA-Sequenzen und mit solchen Expressionsvektoren transformierte Wirtszellen. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des Antigens in einem Impfstoff zur Verhinderung von Infektionen mit B. parapertussis.
B. pertussis verursacht eine ernste und schwächende Krankheit beim Menschen, besonders bei Kindern. Sie wurde in den entwickelten Ländern durch Immunisierungsprogramme im großen Maßstab unter Kontrolle gehalten. Herkömmlicherweise ist die Immunisierung unter Verwendung eines Ganzzell-Impfstoffs durchgeführt worden, der aus Zellkulturen von B. pertussis abgeleitet wurde, und man stellte fest, daß sie zur Verhinderung der Erkrankung verhältnismäßig wirksam gewesen ist.
Die Besorgnis uber nachteilige Reaktionen, wie Fieber, örtliche Reaktionen und andauerndes Schreien, hat in den letzten Jahren zu einer verminderten Akzeptanz des B. pertussis-Ganzzell-Impfstoffs und zu einer Auseinandersetzung über seine fortgesetzte Anwendung geführt. Die Forschung hat sich deshalb auf die Entwicldung von Impfstoffen hin gerichtet, denen die für die nachteiligen Wirkungen der Ganzzell-Impfstoffe verantwortlichen Komponenten fehlen, während die Komponenten beibehalten werden, welche notwendig sind, um Schutz gegen die Erkrankung zu vermitteln.
Die Suche nach sicheren und wirksamen Impfstoffen wurde durch die Informationsknappheit hinsichtlich der Identität und der Wirkungsmechanismen der pathogenen, toxischen und schützenden Untereinheiten des bakteriellen Organismus, welche in Ganzzell-Impfstoffen enthalten sind, behindert. Die Suche nach wirksamen Impfstoffen hat sich deswegen auf die Isolierung und Charakterisierung von Oberflächenantigenen des Organismus und auf ihre Wirksamkeit bei der Hervorrufung einer Immunreaktion konzentriert (J.Am.Med.Soc., 1982, 248(1), 22-23). Beispiele von B. pertussis-Antigenen, welche untersucht worden sind, schließen den Lymphocytose-fördernden Faktor (LPF, anderweitig bekannt als Pertussis-Toxin (PT)), filamentöses Hämaglutinin (FHA), Lipopolysaccharid (LPS), Agglutinogene, dermonekrotisches Toxin (DNT), wärmelabile und wärmestabile Toxine, Polymorphonukleäre Leukocyten-Inhibitorfaktor, Adenylatcyclase, das 69 kDa große Antigen der äußeren Membran (P.69, Pertactin) und andere Oberflächenkomponenten ein.
B. parapertussis ist nahe verwandt mit B. pertussis und ist ebenfalls für Keuchhustenausbrüche beim Menschen verantwortlich (Zeulzer et al J.Pediatr. 9: 493-497 (1946); Linneman et al., J.Pediatr. 19: 229-240 (1977); Novotny, J.Infect.Dis. 161: 581-582, (1990)). Bis heute ist allerdings kein für B. parapertussis spezifischer Impfstoff entwickelt worden.
B. parapertussis erzeugt ebenfalls bekanntermaßen eine Anzahl von Virulenzfaktoren (Pitmann, Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Band 1, S.388-393, Hrsg.: Kreig & Hoft, 1984), einschließlich FHA und Adenylatcyclase(Adecase)-Toxin. Aufgrund der immunologischen Kreuzreaktivität dieser Virulenzfaktoren kann eine Impfüng gegen Keuchhusten mit einem Ganzzell-Impfstoff einen gewissen Schutz gegen B. parapertussis bereitstellen. B. parapertussis stellt jedoch nicht das gut charakterisierte Pertussis-Toxin (PT) her. Daher ist es unwahrscheinlich, daß Ausbrüche von durch B. parapertussis vermitteltem Keuchhusten von azellulären Impfstoffen verhindert werden, die hauptsächlich aus detoxifiziertem Pertussis-Toxin (PT) bestehen.
Wenn Impfungsprogramme gegen B. pertussis erfolgreich zur Verringerung des Auftretens des bakteriellen Organismus in der menschlichen Population, oder sogar bei der Auslöschung des Organismus auf vollständige Weise, so wie die Pocken durch rigorose Impfprogramme ausgelöscht wurden, sind, besteht darüber hinaus eine Gefahr, daß B.parapertussis Infektionen an Zahl zunehmen werden und B.parapertussis die Hauptursache des Keuchhustens werden wird. Es ist deshalb wunschenswert, in jeglichem Keuchhusten-Impfprogramm einen für B.parapertussis spezifischen Impfstoff; vorzugsweise einen azellulären Impfstoff; einzuschließen.
I.G.Charles et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 80, S.3554-3558 (1989), behaupten, homologe Proteine in B. pertussis bzw. B. parapertussis mit Molekularmassen von 69 bzw. 70 kDa zu identifizieren. Die Behauptung der Homologie basiert auf der Beobachtung, daß diese Antigene an den Antikörper BB05 binden, der gegen B. bronchiseptica herangezogen wurde. Diese Proteine besitzen, obwohl deutlich miteinander in ihrer Fähigkeit, den Antikörper BB05 zu binden, verwandt, unterschiedliche immunogene Eigenschaften. Es wurde nicht dargelegt, ob das Antigen von B. parapertussis erwartetermaßen irgendein immunogenes Potential in vivo aufiveist, was notwendig für die Verwendung als wirksamer Impfstoff ist.
Die Erfinder haben ein hier nachstehend beschriebenes Antigen von B. parapertussis identifiziert, isoliert und charakterisiert, welches als Grundlage für einen azellulären, für B. parapertussis spezifischen Impfstoff oder als Teil eines azellulären Keuchhustenimpfstoffs verwendbar ist.
Die Erfindung stellt ein Protein bereit, das nicht durch Komponenten von B. parapertussis verunreinigt ist, das fänig zur Bindung an einen Antikörper ist, der ebenfalls das native P.70-Antigen von B. parapertussis bindet, und das (a) die in Figur 1 gezeigte Aininosäuresequenz vom Aminosäurerest Asp 35 bis Asn 643 oder (b) eine Aminosäuresequenz, welche eine Homologie von mehr als 98 % mit der Aminosäuresequenz (a) aufweist, besitzt.
Die Erfindung stellt auch eine DNA-Sequenz, welche dieses Protein codiert, zur Verfügung. Eine derartige DNA-Sequenz besteht typischerweise im wesentlichen aus der in Figur 1 gezeigten Nucleotidsequenz von Nucleotid 247 bis Nucleotid 2073. Die DNA-Sequenz kann eine Sequenz sein, weiche sich von der in Figur 1 gezeigten Nucleotidsequenz von Nucleotid 247 bis Nucleotid 2073 an nicht mehr als zwölf Positionen unterscheidet.
Die Erfindung stellt ferner ein Protein bereit, welches die in der Figur 1 gezeigte Aminosäuresequenz oder eine Aminosauresequenz besitzt, welche eine Homologie von mehr als 98 % mit der in Figur 1 gezeigten Aminosäuresequenz aufweist.
Es wird ebenfalls eine DNA-Sequenz zur Verfügung gestellt, welche dieses Protein codiert. Eine solche DNA-Sequenz besteht typischerweise im wesentlichen aus der in Figur 1 gezeigten Nucleotidsequenz von Nucleotid 145 bis Nucleotid 2910. Die DNA-Sequenz kann auch eine Sequenz sein, welche sich von der in Figur 1 gezeigten Nucleotidsequenz von Nucleotid 145 bis Nucleotid 2910 an nicht mehr als zwölf Positionen unterscheidet.
Die Aminosauresequenz von Figur 1 zeigt das Vorläuferprotein mit einem Molekulargewicht von etwa 95000 Dalton (P.95), das 922 Aminosäuren umfaßt. Die in vivo-Prozessierung dieses Vorläufers ergibt ein Protein mit einem geschätzten Molekulargewicht von 70000 Dalton (P.70), wie mittels SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese bestimmt wurde, das tatsächliche Gewicht beträgt aber etwa 61 kDa.
Antigene Stellen der in Figur 1 dargestellten Aminosäuresequenz können unter Verwendung von Standardverfahren identifiziert werden. Diese können das Fragmentieren des Polypeptids selbst unter Verwendung proteolytischer Enzyme oder chemischer Mittel und danach das Bestimmen der Fähigkeit jedes Fragments, an Antikörper zu binden oder eine Immunantwort bei Einimpfüng in ein Tier oder ein geeignetes in vitro-Modellsystem (Strohmauer et al J.Gen.Virol., 1982, 59, 205-306) bereitzustellen, beinhalten. Alternativ dazu kann die tür das Polypeptid codierende DNA durch Restriktionsenzymverdau oder andere gut bekannte Techniken fragmentiert und dann in ein Expressionssystem eingetührt werden, um Fragmente herzustellen (gegebenenfalls füsioniert an ein Polypeptid von gewöhnlich bakteriellem Ursprung). Die resultierenden Fragmente werden wie früher beschrieben untersucht (Spence et al J Genvirol., 1989 70 2843-51; Smith et al Gene 1984 29 263-9). Ein anderes Vorgehen besteht darin, kurze Peptidfragmente (3-20 Aminosäuren lang; herkömmlicherweise 6 Aminosäuren lang) chemisch zu synthetisieren, welche die gesamte Sequenz des Vollängen-Polypeptids überspannen, wobei jedes Peptid mit dem benachbarten Peptid überlappt. (Diese Überlappung kann 1-10 Aminosäuren betragen, ist aber idealerweise n-1 Aminosäuren lang, wobei n die Länge des Peptids ist; Geysen et al Proc. Natl. Acad. Sci. 1984 81, 3998-4002). Jedes Peptid wird dann, wie zuvor beschrieben, untersucht, mit der Ausnahme daß das Peptid gewöhnlich zuerst an ein Trägermolekül gekoppelt wird, um das Hervorrufen einer Immunantwort zu erleichtern. Schließlich gibt es Vorhersageverfahren, welche die Analyse der Sequenz hinsichtlich besonderer Merkmale, z.B. Hydrophihe, von denen man annimmt, daß sie mit immunologisch bedeutsamen Stellen assoziiert sind, beinhalten (Hopp und Woods, Proc. Natl. Acad. Sci., 1981, 78 3824-8; Berzofsky, Science, 1985, 229 932- 40). Diese Vorhersagen können dann unter Verwendung der zuvor beschriebenen rekombinanten Polypeptid- oder Peptid-Vorgehensweisen getestet werden.
Das Antigen der vorliegenden Erfindung ist auf der Oberfläche von B. parapertussis lokalisiert und kann aus B. parapertussis-Kulturen mittels herkömmlicher Verfahren isoliert werden, wie zum Beispiel beschrieben von Novotny et al. (1985), Infection and Immunity 50 199-206, und der Europäischen Veröffentlichung Nr.0 162 639. Alternativ dazu kann es unter Verwendung rekombinanter DNA-Technologie erhalten werden. In dieser Hinsicht kann die das Antigen codierende DNA, zum Beispiel wie von Makoff et al. (Bio-Technology, November 1990) beschrieben, kloniert und in einen Expressionsvektor inseriert werden, welcher verwendet wird, um die Expression in einem geeigneten Wirt zu ermöglichen. Eine DNA-Sequenz der Erfindung kann somit eine klonierte Sequenz sein.
Die Erfindung stellt auch eine DNA-Sequenz bereit, welche im wesentlichen aus der in Figur 1 gezeigten Sequenz oder einer Sequenz besteht, welche mit der in Figur 1 gezeigten Sequenz eine Homologie von mehr als 98 % aufweist. Die das Vorläuferprotein codierende DNA-Sequenz ist die Sequenz von Nucleotid 145 bis Nucleotid 2910. Die das P.70-Protein codierende DNA-Sequenz ist die Sequenz von Nucleotid 247 bis Nucleotid 2073.
Das Antigen wird vorzugsweise in einer reinen Form bereitgestellt, d.h. zu mehr als 90 %, am stärksten bevorzugt zu mehr als 95 % rein, aber mindestens zu einem Grad, welcher konsistent mit seiner Verwendung in einem Impfstoff für Menschen ist.
Die Klonierung der DNA-Sequenz kann unter Anwendung von im Fachgebiet bekannten Standardverfahren durchgeflihrt werden. Allerdings ist es bei derartigen Verfahren besonders vorteilhaft, die hier beschriebenen Sequenzdaten anzuwenden, so daß die Identifizierung und Isolierung der gewunschten klonierten DNA-Sequenzen erleichtert wird. Vorzugsweise wird die DNA mittels des Verfahrens, beschrieben von Hull et al Infect. Immun. 33: 933-938 (1981), wie modifiziert von Maskell et al., J.Bacteriol. 170: 2467-2471 (1988), isoliert. Die DNA wird dann mit einem Restriktionsenzym verdaut, um kürzere Fragmente zu erzeugen, welche danach in einen Klonierungsvektor, wie das Cosmid PHC79 oder einen Abkömmling davon, eingefügt werden, und die resultierenden rekombinanten DNA- Moleküle werden verwendet, um E. coli zu transformieren und somit die gewunschte Genbank bzw. -bibliothek zu erzeugen.
Die Bibliothek kann unter Verwendung einer Standard-Screeningstrategie durchsucht werden. Zum Beispiel kann man als Hybridisierungssonden ein oder mehrere markierte(s) Oligonucleotid(e) verwenden, welche unter Anwendung der hierin beschriebenen DNA- Sequenzinformation synthetisiert werden. Es können eine oder mehrere zusätzliche Screening- Runden der einen oder anderen Art durchgeführt werden, um positive Klone zu charakterisieren und zu identifizieren.
Sobald ein erster positiver Klon identifiziert worden ist, kann die Bibliothek erneut nach zusätzlichen positiven Klonen unter Verwendung des ersten Klons als Hybridisierungsonde durchsucht werden. Alternativ dazu oder zusätzlich können weitere Bibliotheken hergestellt werden, und diese können unter Verwendung von Hybridisierungssonden gescreent werden. Auf diese Weise können weitere DNA-Sequenzen erhalten werden.
Alternativ dazu kann die für das Antigen der vorliegenden Erfindung codierende DNA- Sequenz unter Anwendung von Standardverfahren synthetisiert werden, und dies kann unter manchen Umständen der Klonierung der DNA vorgezogen werden.
So kloniert oder synthetisiert, kann die gewunschte DNA-Sequenz unter Verwendung von bekannten und Standard-Techniken in einen Expressionsvektor eingefügt werden. Der Expressionsvektor wird normalerweise unter Verwendung von Restriktionsenzymen geschnitten und die DNA-Sequenz wird unter Verwendung von Ligation mit glatten Enden oder überhängenden Enden inseriert. Der Schnitt wird gewöhnlich an einer Restriktionsstelle an einer passenden Position in dem Expressionsvektor vorgenommen, so daß die DNA-Sequenz, sobald inseriert, unter der Steuerung der DNA-Elemente steht, die ihre Expression bewirken.
Diese Elemente können gemaß dem Wirt variieren, aber schließen gewöhnlich einen Promotor, eine Ribosomenbindungsstelle, Start- und Stopstellen der Translation und eine Transkriptionsterminationsstelle ein. Beispiele solcher Vektoren schließen Plasmide und Cosmide ein. Expressionsvektoren der vorliegenden Erfindung umfassen sowohl extrachromosomale Vektoren als auch Vektoren, welche in das Chromosom der Wirtszelle integriert werden.
Die Erfindung stellt daher einen Expressionsvektor bereit, welcher eine DNA-Sequenz der Erfindung enthält und welcher, wenn er in einem geeigneten Wirt vorliegt, in der Lage ist, ein Protein der Erfindung zu exprimieren.
Der Vektor ist typischerweise ein Plasmid. Die Erfindung sieht ebenfalls einen Wirt, welcher mit einem Expressionsvektor der Erfindung transformiert ist, vor.
Beispiele von Wirtszellen zur Anwendung in der Erfindung schließen prokaryotische und eukaryotische Zellen ein, wie Bakterien-, Hefe-, Säuger- und Insektenzellen. Besondere Beispiele derartiger Zellen sind E.coli, S.cerevisiae, P.pastoris, chinesische Hamstereierstock- und Maus-Zellen, und Spodoptera frugiperda und Tricoplusia ni. Die Wahl der Wirtszelle kann von einer Anzahl von Faktoren abhängen, aber wenn die posttranslationale Modifikation des Antigens bedeutsam ist, dann wird ein prokaryotischer Wirt bevorzugt.
Die Transformation einer Wirtszelle kann unter Anwendung von Standardtechniken durchgeführt werden. Gewöhnlich wird ein phänotypischer Marker verwendet, um zwischen den Transformanten, die den Expressionsvektor erfolgreich aufgenommen haben, und denjenigen, bei denen dies nicht der Fall ist, zu unterscheiden. Die Kultivierung der transformierten Wirtszelle und die Isolierung des Antigens können auch unter Anwendung von Standardtechniken durchgeführt werden.
Die Erfindung stellt somit ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins der Erfindung bereit, wobei das Verfahren das Halten eines Wirtes, der mit einem Expressionsvektor, welcher eine DNA-Sequenz, die das Protein codiert, enthält und in der Lage ist, das Protein in dem Wirt zu exprimieren, transformiert ist, unter solchen Bedingungen, daß das Protein exprimiert wird, umfaßt. Eine Austührungsform des Verfahrens umfaßt das Klonieren oder Synthetisieren einer das Protein codierenden DNA-Sequenz, das Eintügen der DNA-Sequenz in einen Expressionsvektor, so daß sie in der Lage ist, in einem geeigneten Wirt exprimiert zu werden, das Transformieren einer Wirtszelle mit dem Expressionsvektor, das Kultivieren der transformierten Wirtszelle und das Isolieren des Antigens.
Das auf diese Weise erhaltene Antigen kann unlöslich sein und muß daher im Anschluß an die Verwendung von Guanidiniumhydrochlorid als Denaturierungsmittel auf herkömmliche Weise rückgefaltet werden und wird in jedem Fall vorzugsweise gereinigt.
Die Erfindung stellt zusätzlich eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die einen/ein pharmazeutisch annehmbaren(s) Träger oder Verdünnungsmittel und, als aktiven Bestandteil, ein Protein der Erfindung umfaßt. Somit wird ein Impfstoff, enthaltend ein Antigen von B. parapertussis, zur Verfügung gestellt. Der Impfstoff der Erfindung kann gegebenenfalls zusätzliche Antigene von B. parapertussis oder anderen Bakterien, wie B. pertussis, Tetanus und Diphtherie, enthalten.
Der Impfstoff der Erfindung ist somit normalerweise mit einem pharmazeutisch annehmbaren Vehikel assoziiert, welches die Verabreichung des Antigens an den Patienten erlaubt. Die Verabreichung wird gewöhnlicherweise über den oralen, intranasalen oder vorzugsweise den parenteralen Weg durchgeführt. Im Falle des parenteralen Wegs ist das Vehikel im allgemeinen flüssig und das Antigen ist im allgemeinen darin gelöst oder suspendiert. Ein Beispiel eines flüssigen Vehikels ist physiologische Kochsalzlösung
Der Impfstoff kann auch ein Adjuvans zur Stimulierung der Immunantwort und somit zur Erhöhung der Wirksamkeit des Antigens enthalten. Passende Adjuvanzien zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung schließen zum Beispiel Aluminiumhydroxid und Aluminiumphosphat ein.
Angemessenerweise enthält der Impfstoff eine Antigenendkonzentration im Bereich von 0,01 bis 5 mg/ml, vorzugsweise 0,03 bis 2 mg/ml, am stärksten bevorzugt 0,3 mg/ml. Nach der Zubereitung kann der Impfstoff in einen sterilen Behälter eingebracht werden, welcher dann verschlossen und bei einer niedrigen Temperatur, zum Beispiel 4ºC, gelagert oder gefriergetrocknet wird.
Ein Verfähren zur Erzeugung von Immunität gegen Keuchhusten beim Menschen wird somit zur Verfügung gestellt, wobei das Verfahren die Verabreichung einer wirksamen Menge des Impfstoffs der vorliegenden Erfindung an den Patienten umfaßt. Um beim Menschen Immunität gegen Keuchhusten hervorzurufen, werden normalerweise eine oder mehrere Dosierungen des Impfstoffs verabreicht. Jede Dosis des Impfstoffs beläuft sich auf 0,1 bis 2 ml, vorzugsweise 0,2 bis 1 ml, am stärksten bevorzugt 0,5 ml.
Die Erfindung wird nun unter Bezug auf die begleitenden Figuren und Beispiele weiter beispielhaft erläutert.

Legenden der Figuren

Figur 1: Aminosäuresequenz von P.70 und DNA-Sequenz des prn-Gens, welches das P.70-Antigen aus B. parapertussis codiert.
Figur 2: Restriktionskarte und Sequenzstrategie für das prn-Gen, welches das P.70- Antigen aus B. parapertussis codiert. Die kleinen Pfeile repräsentieren die Richtung und das Ausmaß der DNA-Sequenzierung, abgeleitet bzw. ausgehend von Restriktionsstellen oder als spezifischen Primern verwendeten Oligonucleotiden. Der große Pfeil zeigt die Transkriptionsrichtung des offenen Leserahmens (ORF) für das Gen.
Figur 3: Linienzeichnung, welche die zur Erzeugung des P.70-Antigen-Expressionsplasmids PBD845 angewandte Strategie zeigt.

Experimentelle Verfahren

Bakterienstämme, Plasmide und Phagen

Der B. parapertussis-Stamm CN2992 und der B. parapertussis-Stamm CN2591 stammten aus der Wellcome Culture Collection. E. coli K12 TG1 [Δ(lac-pro) supE, thi, hsdD5/F' traD36 proA&spplus;B&spplus; lacIq lacZ M15] war wie beschrieben beschaffen (Carter et al (1985)), ebenso wie E. coli K12 HB101 F&supmin;, hsdS20 (r&supmin;B m&supmin;B) recA13, ara-14, proA2, lacY1, galK2, rpsL20, xyl-5, mtl-1, supE44 (Boyer & Roulland-Dussoix, J.Mol.Biol. 41: 459-465, 1969).
Das Cosmid pHC79 (Hohn & Collins, Gene 11:29-298, 1980) stammte von Amersham International, Little Chalfort, Buckinghamshire; das Plasmid PKK223-2 (Amman & Brosius, Gene 40:183-90, 1985) und M13mp18 und M13mp19 (Yanisch-Perron et al Gene 33:103- 119, 1985) wurden von Pharmacia Ltd., Milton Keynes, Buckinghamshire, bezogen.

Medien und Reagenzien

E. coli-Stämme wurden auf Luria-Nährbrühe (LB) oder auf mit 1,6 % (w/v) Agar verfestigtem LB (Miller, Experiments in Mol. Gene., Cold Spring Harbor N.Y., 1972) (Difco Address) herangezogen. Minimalmedium (MM) wurde wie von Miller (1972) beschrieben hergestellt und mit 2 % (wiv) Noble-Agar (Difco) verfestigt. B. pertussis und B. parapertussis wurden in Stainer-Scholter-Nährbrühe bei 37ºC (Stamer & Scholte, J.Gen.Microbiol. 63: 211- 220, 1962) oder auf mit 2 % (w/v) Noble-Agar verfestigten Stainer-Scholte-Platten herangezogen. Desoxynucleotide, Ampicillin, Tetracyclin und Dithiothreitol stammten von Sigma. Restriktionsendonucleasen und T4-DNA-Ligase waren von BRL, Paisley, Schottland.

Klonierung von chromosomaler B. parapertussis-DNA in das Cosmid pHC79 und Identifizierung des P.70 codierenden Gens

Chromosomale B. parapertussis-DNA (hergestellt durch das Verfahren von Hull et al., Infect. Immun. 33: 933-938, 1981, wie modifiziert von Maskell et al J Bacteriol. 170: 2467- 2471, 1988) wurde teilweise mit Sau3A verdaut, und Fragmente im Größenbereich von 40-50 kb wurden in die BamHI-Stelle (Maniatis et al. Molecular Cloning: Cold Spring Harbor N.Y., 1982) des Cosmids pHC79 (Hohn & Collins, Gene 11: 291-298, 1980) ligiert. Rekombinante Cosmide in E. coli HB101 wurden auspiattiert und unter Befolgen des von Charles et al. (J.Gen.Microbiol. 136: 353-358, 1990) beschriebenen Verfahrens auf Mikrotiterplatten überftihrt und auf hybridisierte "Gene Screen Plus" -Membranen (Du Pont, Stevenage, Hertfordshire) transferiert. Die Cosmide wurden danach hinsichtlich der Gegenwart des für P.70 codierenden prn-Gens mittels DNA:DNA-Hybridisierung unter Verwendung eines radioaktiv markierten 1,8 kb großen ClaI-Restriktionsfragments, das aus dem verwandten prn-Gen von B.pertussis isoliert wurde, gescreent. Das ClaI-Fragment wurde im Anschluß an einen Verdau des Cosmids pI69 (Charles et al Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3554-3558, 1989) über ein Gel gereinigt (Tautz & Renz, Anal. Biochem. 132:14-19, 1983). Das Fragment wurde mit einem von BCL, Mannheim, bezogenen Kit und [α-³²P]-ATP (Amersham) nick-translatiert und mit den B.parapertussis-Genbankfiltern, wie zuvor beschrieben (Charles et al., J.Gen. Microbiol. 136: 353-358 (1990)) hybridisiert. Es wurden drei positive Kolonien identifiziert und eine, welche das Cosmid pBD811 beinhaltete, wurde für die weitere Analyse ausgewählt.

Subkionierung und DNA-Sequenzierung

Restriktionsfragmente des Cosmids pBD811 wurden in M13mp 18 und M13mp19 (Yanisch-Perron et al., Gene 33: 103 - 119, 1985) einkloniert und unter Verwendung universeller Primer, [α-³&sup5;S]-DATP (Desoxyadenosin-5'-[α-³&sup5;S]-thiotriphosphat), Didesoxynucleotidtriphosphaten und sowohl Gradienten- als auch Keilgelen sequenziert (Biggin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3963-3965, 1983; Sanger et al Proc Natl. Acad. Sci. USA 71: 5463-5467, 1977). Um Kompressionsartefakte aufzulösen, wurden einige Klone mit modifizierter T7-DNA-Polymerase (Tabor & Richardson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 4767-4771, 1987) und 7-Deaza-2'-dGTP (Mizusawa et al Nucl. Acids Res. 14:1319-1324, 1986) unter Anwendung eines von Pharmacia bezogenen Kits sequenziert. Die Lücken in der Sequenz wurden unter Verwendung synthetischer Oligonudeotide als spezifischen Primem gefüllt (Charles et al Nucl. Acids Res. 14: 2201-2213, 1986)
Oligonudeotide zur Verwendung als spezifische Sequenzierungsprimer wurden auf einem SAM1-Oligonucleotidsynthesizer (Biolabs) hergestellt.
Die Computeranalyse der DNA-Sequenz enthüllte einen offenen Leserahmen, der fähig ist, ein Protein von 922 Aminosäuren mit einem berechneten Molekulargewicht von 95177 zu codieren.

Expression des P.70-Antigens aus B. parapertussis auf der Oberfläche von E. coli

Unter Anwendung von Western-Blots war es nicht möglich, die Expression von P.70 in das Cosmid PBDB 11 enthaltendem E. coli HB101 nachzuweisen, obwohl aus der DNA- Sequenzanalyse bekannt war, daß das Cosmid das gesamte Strukturgen enthält. Um das B.parapertussis-prn-Gen in E. coli zu exprimieren, wurde der Expressionsvektor PKK233-2 (Amann & Brosius, Gene 40: 183-90, 1985) verwendet, der eine Transkription auf hohem Niveau von einem trc-Promotor aus steuert.
Eine Dreiweg-Ligation unter Einsatz von NcoI-HindIII-verdautem pKK233-2, eines 1,6 kb großen AflIII-EcoRV-Fragments aus dem 5'-Ende von P.70-prn und eines 2,2 kb großen EcoRV-HindIII-Fragments, enthaltend das 3'-Ende von P.70-prn, wurde durchgeführt (siehe Fig. 3). Die Ligationsmischung wurde verwendet, um E. coli TG1 zu transformieren, und das P.70-Antigen exprimierende Transformanten wurden durch ihre Fähigkeit, mit dem Mab BB05 (Novotny et al Develop. Biol. Stand. 61: 27-41, 1985) in Protein-Dot-Blots kreuzzureagieren, identifiziert. Kolonien, die ein positives Signal abgaben, wurden dann isoliert, und es wurden Mini-Plasmidpräparationen (Maniatis et al Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor N.Y., 1982) durchgeführt, um zu bestätigen, daß ein Vollängen-Insert kloniert worden war. Eine der Kolonien, enthaltend das Plasmid pBD845, wurde für die weitere Untersuchung ausgewählt. An die SDS-PAGE-Elelektrophorese schloß sich ein Western-Blot an. Die Proben wurden mittels des Verfahrens von Towbin (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4350-4354, 1984) auf Nitrocellulose überführt. Bei dem verwendeten Nachweissystem handelte es sich um an Meerrettichperoxidase konjugiertes Ziege-Anti-Maus- IgG unter Verwendung von 4-Chlor-1-naphthol als Substrat (Fairweather et al., J Bacteriol. 165: 21-27, 1986). Ein Western-Blot von pBD845 (enthaltend das gesamte Strukturgen für P.95) beinhaltendem E.coli TG1 zeigt, daß ein Protein mit einem Molekulargewicht von 95 kDa (P.95) in E.coli schwach exprimiert wird, zusammen mit einer signifikanteren Bande von 70 kDa (P.70). Es ist auch ein große Anzahl von Spezies von geringerem Molekulargewicht, welche mit BB05 kreuzreagieren, ersichtlich, was nahelegt, daß P.70/P.95 in E.coli unstabil ist. Diese Beobachtungen legen nahe, daß die P.95-Form des Proteins anfänglich exprimiert und anschließend in die P.70-Form prozessiert wird.
Objektträger-Agglutinationsassays: Zu testende Proben von pBD845 beinhaltenden E.coli-Stämmen (10&sup6;-10&sup7;) wurden mit 30 µl IgG-gereinigtem polyklonalen Kaninchen-Anti- P.69-Antikörper auf einem Glas-Mikroskopobjektträger vermischt und nach 2 Minuten hinsichtlich der Verklumpung im Vergleich zu einer Negativkontrolle von entweder vir&supmin;-B. parapertussis oder E.coli TG1 visuell bewertet. Die pBD845 beinhaltenden E.coli-Stämme können agglutiniert werden, und diese Agglutination findet genauso rasch statt wie mit vir&spplus;-B.parapertussis, was nahelegt, daß das rekombinante P.70-Protein korrekt auf der Oberfläche von E.coli exprimiert wird.

Claims

1. Protein, welches nicht durch Komponenten von B. parapertussis verunreinigt ist, welches in der Lage ist, an einen Antikörper zu binden, der ebenfalls das native P.70-Antigen von B. parapertussis bindet, und welches (a) die in Figur 1 gezeigte Aminosäuresequenz vom Aminosäurerest Asp 35 bis Asn 643 oder (b) eine Aminosäuresequenz, welche eine Homologie von mehr als 98 % mit der Aminosäuresequenz (a) aufweist, besitzt.

2. DNA-Sequenz, welche ein gemaß Anspruch 1 definiertes Protein codiert.

3. DNA-Sequenz gemaß Anspruch 2, welche im wesentlichen aus der in Figur 1 gezeigten Nucleotidsequenz von Nucleotid 247 bis Nucleotid 2073 besteht.

4. DNA-Sequenz gemaß Anspruch 2, welche sich von der in Figur 1 gezeigten Nucleotid sequenz von Nucleotid 247 bis Nucleotid 2073 an nicht mehr als zwölf Positionen unterscheidet.

5. Protein, welches die in Figur 1 gezeigte Aminosäuresequenz oder eine Aminosäuresequenz besitzt, welche eine Romologie von mehr als 98 % mit der in Figur 1 gezeigten Aminosäuresequenz aufweist.

6. DNA-Sequenz, welche ein gemäß Anspruch 5 definiertes Protein codiert.

7 DNA-Sequenz gemaß Anspruch 6, welche im wesentlichen aus der in Figur 1 gezeigten Nucleotidsequenz von Nucleotid 145 bis Nucleotid 2910 besteht.

8. DNA-Sequenz gemaß Anspruch 6, welche sich von der in Figur 1 gezeigten Nucleotidsequenz von Nucleotid 145 bis Nucleotid 2910 an nicht mehr als zwölf Positionen unterscheidet.

9. DNA-Sequenz, welche im wesentlichen aus der in Fig. 1 gezeigten Sequenz oder aus einer Sequenz besteht, welche eine Homologie von mehr als 98 % mit der in Figur 1 gezeigten Sequenz aufweist.

10. Expressionsvektor, welcher eine DNA-Sequenz, wie sie nach einem der Ansprüche 2 bis 4 und 6 bis 9 definiert ist, enthält und welcher, wenn er in einem geeigneten Wirt vorliegt, in der Lage ist, ein gemäß Anspruch 1 oder 5 definiertes Protein zu exprimieren.

11. Vektor gemäß Anspruch 10, welcher ein Plasmid ist.

12. Wirt, welcher mit einem gemäß Anspruch 10 oder 11 definierten Expressionsvektor transformiert ist.

13. Wirt gemäß Anspruch 12, welcher ein E. coli-Stamm ist.

14. Verfahren zur Herstellung eines gemäß Anspruch 1 definierten Proteins, wobei das Verfahren das Halten eines Wirtes, der mit einem Expressionsvektor, welcher eine gemäß einem der Anspruche 2 bis 4 definierte DNA-Sequenz enthält und in der Lage ist, das Protein in dem Wirt zu exprimieren, transformiert ist, unter solchen Bedingungen, daß das Protein exprimiert wird, umfaßt.

15. Verfahren zur Herstellung eines gemäß Anspruch 5 definierten Proteins, wobei das Verfahren das Halten eines Wirtes, der mit einem Expressionsvektor, welcher eine gemaß einem der Ansprüche 6 bis 9 definierte DNA-Sequenz enthält und in der Lage ist, das Protein in dem Wirt zu exprimieren, transformiert ist, unter solchen Bedingungen, daß das Protein exprimiert wird, umfaßt.

16. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen/ein pharmazeutisch annehmbaren(s) Träger oder Verdünnungsmittel und, als aktiven Bestandteil, ein gemäß Anspruch 1 oder 5 definiertes Protein.