JP2002355054A - ヘリコバクター・フェリス・ワクチン - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】本発明は、ヘリコバクター・フェリス由来の抗
原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供
する。さらにヘリコバクター・フェリスに対するワクチ
ン、その感染診断法なども提供する。 【解決手段】新規なヘリコバクター・フェリス・ウレア
ーゼ・サブユニット・ポリペプチド、これらのサブユニ
ット・ポリペプチドをコードする核酸配列、これらのサ
ブユニット・ポリペプチドをコードする核酸配列を含む
ＤＮＡ断片及び組換えＤＮＡ分子、組換え生キャリア
ー、並びにこれらのサブユニット・ポリペプチドをコー
ドする核酸配列を含む宿主細胞に関する。また、本発明
は、ワクチンにおいて使用するためのサブユニット・ポ
リペプチド、それらの製造における使用、該サブユニッ
ト・ポリペプチドを含むワクチン、及びそのようなワク
チンの調製のための方法に関する。
原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供
する。さらにヘリコバクター・フェリスに対するワクチ
ン、その感染診断法なども提供する。 【解決手段】新規なヘリコバクター・フェリス・ウレア
ーゼ・サブユニット・ポリペプチド、これらのサブユニ
ット・ポリペプチドをコードする核酸配列、これらのサ
ブユニット・ポリペプチドをコードする核酸配列を含む
ＤＮＡ断片及び組換えＤＮＡ分子、組換え生キャリア
ー、並びにこれらのサブユニット・ポリペプチドをコー
ドする核酸配列を含む宿主細胞に関する。また、本発明
は、ワクチンにおいて使用するためのサブユニット・ポ
リペプチド、それらの製造における使用、該サブユニッ
ト・ポリペプチドを含むワクチン、及びそのようなワク
チンの調製のための方法に関する。
Description
【０００１】本発明は、新規なヘリコバクター（Ｈｅｌ
ｉｃｏｂａｃｔｅｒ）ウレアーゼ・サブユニット・ポリ
ペプチド、これらのポリペプチドをコードする核酸配
列、ワクチンにおいて使用するためのポリペプチド、そ
れらの製造における使用、該ポリペプチドを含むワクチ
ン、及びそのようなワクチンの調製のための方法に関す
る。さらに、本発明は、核酸配列、ポリペプチド、及び
ポリペプチドに対する抗体の検出のための診断法に関す
る。
ｉｃｏｂａｃｔｅｒ）ウレアーゼ・サブユニット・ポリ
ペプチド、これらのポリペプチドをコードする核酸配
列、ワクチンにおいて使用するためのポリペプチド、そ
れらの製造における使用、該ポリペプチドを含むワクチ
ン、及びそのようなワクチンの調製のための方法に関す
る。さらに、本発明は、核酸配列、ポリペプチド、及び
ポリペプチドに対する抗体の検出のための診断法に関す
る。
【０００２】いくつかのヘリコバクター種が、胃上皮の
病因となる。ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂ
ａｃｔｅｒ ｐｉｒｏｌｉ）、そして程度は低いがＨ．
ヘイルマンニ（ｈｅｉｌｍａｎｎｉ）が、ヒトにおける
消化性潰瘍及び胃リンパ腫の発生における主要な要因で
ある胃炎を引き起こすことが知られている。ヘリコバク
ター・フェリス（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｌｉ
ｓ）は、ネコ及びイヌの両方における胃感染の最も多い
原因である。高度に酸性の胃環境で生存するため、ヘリ
コバクター科の細菌は、胃液中に存在する尿素を加水分
解することができるウレアーゼを産生する。この加水分
解は、細菌の環境を中和するために十分な量のＮＨ４Ｏ
Ｈを放出させる。ウレアーゼは、細菌のコロニー形成に
おいても、その病原においても役割を果たすことが知ら
れている。ウレアーゼをコードする遺伝子は、ヘリコバ
クター・ピロリ（Ｌａｂｉｇｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３：１９２０−１９３１（１
９９１））及びヘリコバクター・フェリス（Ｆｅｒｒｅ
ｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．９，３２３−３３３（１９９３））の両方について
記載され、配列決定されている。ウレアーゼの発現及び
分泌に関与している７つの遺伝子のうち、２つの遺伝子
のみが、ウレアーゼ酵素の２つの構造サブユニット、ウ
レアーゼＡ及びＢ；ｕｒｅＡ及びｕｒｅＢをコードして
いる。これら２つのポリペプチドは、ウレアーゼ活性を
有するポリペプチド複合体を形成する。
病因となる。ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂ
ａｃｔｅｒ ｐｉｒｏｌｉ）、そして程度は低いがＨ．
ヘイルマンニ（ｈｅｉｌｍａｎｎｉ）が、ヒトにおける
消化性潰瘍及び胃リンパ腫の発生における主要な要因で
ある胃炎を引き起こすことが知られている。ヘリコバク
ター・フェリス（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｌｉ
ｓ）は、ネコ及びイヌの両方における胃感染の最も多い
原因である。高度に酸性の胃環境で生存するため、ヘリ
コバクター科の細菌は、胃液中に存在する尿素を加水分
解することができるウレアーゼを産生する。この加水分
解は、細菌の環境を中和するために十分な量のＮＨ４Ｏ
Ｈを放出させる。ウレアーゼは、細菌のコロニー形成に
おいても、その病原においても役割を果たすことが知ら
れている。ウレアーゼをコードする遺伝子は、ヘリコバ
クター・ピロリ（Ｌａｂｉｇｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３：１９２０−１９３１（１
９９１））及びヘリコバクター・フェリス（Ｆｅｒｒｅ
ｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．９，３２３−３３３（１９９３））の両方について
記載され、配列決定されている。ウレアーゼの発現及び
分泌に関与している７つの遺伝子のうち、２つの遺伝子
のみが、ウレアーゼ酵素の２つの構造サブユニット、ウ
レアーゼＡ及びＢ；ｕｒｅＡ及びｕｒｅＢをコードして
いる。これら２つのポリペプチドは、ウレアーゼ活性を
有するポリペプチド複合体を形成する。
【０００３】Ｈ．ピロリ及びフェリスの両方により引き
起こされる感染に対するワクチンが製造されており、特
に、国際特許出願ＷＯ９４／０９８２３及びＷＯ９６／
３４６２４の主題となっている。Ｈ．フェリス感染から
ネコを防御するためのワクチン成分としてＨ．ピロリの
ウレアーゼを使用しようとする試みが、いくつかなされ
ている。実際、ある程度の防御は得られるが、結果は、
望ましいであろう１００％防御にはほど遠い。これまで
に発表された動物実験から、Ｈ．ピロリで予防接種され
た動物の相当数が、その後のＨ．フェリス接種から全く
防御されないことは明らかである。Ｈ．フェリス又はピ
ロリのいずれかから精製されたウレアーゼで予防接種さ
れたネコの防御は、記載されていない。Ｈ．フェリス完
全細胞溶解物によるネコの予防接種は、理論的には可能
であるが、実用的には選択されていない。これは、改良
のための多くの試みにも関わらず、Ｈ．フェリスを増殖
させることが困難なためである。明らかに、同種成分に
基づく有効なワクチンの必要性が存在しており、そして
既知のＨ．フェリス・ウレアーゼが完全な防御を与えな
いことは明らかである。
起こされる感染に対するワクチンが製造されており、特
に、国際特許出願ＷＯ９４／０９８２３及びＷＯ９６／
３４６２４の主題となっている。Ｈ．フェリス感染から
ネコを防御するためのワクチン成分としてＨ．ピロリの
ウレアーゼを使用しようとする試みが、いくつかなされ
ている。実際、ある程度の防御は得られるが、結果は、
望ましいであろう１００％防御にはほど遠い。これまで
に発表された動物実験から、Ｈ．ピロリで予防接種され
た動物の相当数が、その後のＨ．フェリス接種から全く
防御されないことは明らかである。Ｈ．フェリス又はピ
ロリのいずれかから精製されたウレアーゼで予防接種さ
れたネコの防御は、記載されていない。Ｈ．フェリス完
全細胞溶解物によるネコの予防接種は、理論的には可能
であるが、実用的には選択されていない。これは、改良
のための多くの試みにも関わらず、Ｈ．フェリスを増殖
させることが困難なためである。明らかに、同種成分に
基づく有効なワクチンの必要性が存在しており、そして
既知のＨ．フェリス・ウレアーゼが完全な防御を与えな
いことは明らかである。
【０００４】イヌ及びネコにおけるヘリコバクター・フ
ェリス感染からの防御を誘導することができるＨ．フェ
リス・ウレアーゼを提供することが、特に、本発明の目
的である。驚くべきことに、Ｈ．フェリスには第２のウ
レアーゼが存在し、その構造サブユニットをコードする
遺伝子は、既知のＨ．フェリスのｕｒｅＡ及びＢ遺伝子
と低い相同性しか有しないことが本発明において見出さ
れた。新規なウレアーゼは、既知のウレアーゼＡＢと区
別するため、ウレアーゼＸＹと命名されている。新規に
見出されたウレアーゼは、Ｈ．フェリスにおいて発見さ
れ、Ｈ．ピロリには存在しない。２つの構造ウレアーゼ
・サブユニットＵｒｅＸ及びＵｒｅＹをコードする遺伝
子の全体的な遺伝子構造は、Ｈ．フェリス及びＨ．ピロ
リにおける既知のＵｒｅＡ及びＢのそれと比較可能であ
る。しかしながら、配列相同性は、驚くほど低い。さら
に驚くべきことに、ある単一のＨ．フェリス株における
ｕｒｅＡ及びＢ遺伝子と新規ｕｒｅＸ及びＹ遺伝子との
間の相同性は、様々なヘリコバクター種由来の様々なｕ
ｒｅＡ及びＢ遺伝子の間の相同性よりも顕著に低い。
ェリス感染からの防御を誘導することができるＨ．フェ
リス・ウレアーゼを提供することが、特に、本発明の目
的である。驚くべきことに、Ｈ．フェリスには第２のウ
レアーゼが存在し、その構造サブユニットをコードする
遺伝子は、既知のＨ．フェリスのｕｒｅＡ及びＢ遺伝子
と低い相同性しか有しないことが本発明において見出さ
れた。新規なウレアーゼは、既知のウレアーゼＡＢと区
別するため、ウレアーゼＸＹと命名されている。新規に
見出されたウレアーゼは、Ｈ．フェリスにおいて発見さ
れ、Ｈ．ピロリには存在しない。２つの構造ウレアーゼ
・サブユニットＵｒｅＸ及びＵｒｅＹをコードする遺伝
子の全体的な遺伝子構造は、Ｈ．フェリス及びＨ．ピロ
リにおける既知のＵｒｅＡ及びＢのそれと比較可能であ
る。しかしながら、配列相同性は、驚くほど低い。さら
に驚くべきことに、ある単一のＨ．フェリス株における
ｕｒｅＡ及びＢ遺伝子と新規ｕｒｅＸ及びＹ遺伝子との
間の相同性は、様々なヘリコバクター種由来の様々なｕ
ｒｅＡ及びＢ遺伝子の間の相同性よりも顕著に低い。
【０００５】表１ａ、１ｂ、及び１ｃは、５つの異なる
ヘリコバクター・フェリス種に由来するｕｒｅＸ及びＹ
遺伝子並びにそれらがコードするポリペプチドと、ヘリ
コバクター・フェリス、ピロリ及びヘイルマンニに由来
するｕｒｅＡ及びＢ並びにポリペプチドとの比較を示し
ている。
ヘリコバクター・フェリス種に由来するｕｒｅＸ及びＹ
遺伝子並びにそれらがコードするポリペプチドと、ヘリ
コバクター・フェリス、ピロリ及びヘイルマンニに由来
するｕｒｅＡ及びＢ並びにポリペプチドとの比較を示し
ている。
【０００６】既知のｕｒｅＡ及びＢ遺伝子並びにポリペ
プチド・サブユニットのものと比較した、新規な構造ウ
レアーゼ・サブユニットＸ及びＹをコードする遺伝子並
びにそれらがコードするポリペプチドの相同性のレベル
を、表１ａ、ｂ及びｃに提示する。
プチド・サブユニットのものと比較した、新規な構造ウ
レアーゼ・サブユニットＸ及びＹをコードする遺伝子並
びにそれらがコードするポリペプチドの相同性のレベル
を、表１ａ、ｂ及びｃに提示する。
【０００７】
【表１】
【０００８】
【表２】
【０００９】
【表３】
【００１０】従って、本発明の一つの実施形態は、新規
なウレアーゼＸ及びＹサブユニットをコードする核酸配
列に関する。
なウレアーゼＸ及びＹサブユニットをコードする核酸配
列に関する。
【００１１】第一に、本発明のこの実施形態は、配列番
号１と少なくとも８５％の相同性を有する、ヘリコバク
ター・フェリスにより発現されるようなウレアーゼ複合
体の２つのサブユニットをコードする核酸配列、又は該
サブユニットのうちの一つの免疫原性断片を少なくとも
コードする、少なくとも４０ヌクレオチド、好ましくは
４５ヌクレオチド、より好ましくは５０ヌクレオチドの
長さを有するその一部に関する。少なくとも５５核酸、
６０核酸又は７０核酸の長さを有する、さらに長い断片
は、その順にさらに好ましい。
号１と少なくとも８５％の相同性を有する、ヘリコバク
ター・フェリスにより発現されるようなウレアーゼ複合
体の２つのサブユニットをコードする核酸配列、又は該
サブユニットのうちの一つの免疫原性断片を少なくとも
コードする、少なくとも４０ヌクレオチド、好ましくは
４５ヌクレオチド、より好ましくは５０ヌクレオチドの
長さを有するその一部に関する。少なくとも５５核酸、
６０核酸又は７０核酸の長さを有する、さらに長い断片
は、その順にさらに好ましい。
【００１２】この実施形態の好ましい形態は、ウレアー
ゼＸサブユニット・ポリペプチドもしくはウレアーゼＹ
サブユニット・ポリペプチドをコードし、かつ配列番号
１と少なくとも８５％の相同性を有する核酸配列、又は
ウレアーゼＸサブユニット・ポリペプチドもしくはウレ
アーゼＹサブユニット・ポリペプチドの免疫原性断片を
少なくともコードする、少なくとも４０ヌクレオチド、
好ましくは４５ヌクレオチド、より好ましくは５０ヌク
レオチドの長さを有するそれらの一部に関する。単なる
例として、ヘリコバクター・フェリスＣＳ１株のウレア
ーゼＸサブユニットをコードする核酸配列は、２０６／
２０７／２０８位（ＧＴＧ）（図１ａ（１）参照）で開
始し、８８４／８８５／８８６位（ＴＡＡ）で終止す
る。ヘリコバクター・フェリスＣＳ１株のウレアーゼＹ
サブユニットをコードする核酸配列は、８９７／８９８
／８９９位（ＡＴＧ）で開始し、２６０１／２６０２／
２６０３位（ＴＡＧ）で終止する。少なくとも５５核
酸、６０核酸又は７０核酸の長さを有する、さらに長い
断片は、その順にさらに好ましい。
ゼＸサブユニット・ポリペプチドもしくはウレアーゼＹ
サブユニット・ポリペプチドをコードし、かつ配列番号
１と少なくとも８５％の相同性を有する核酸配列、又は
ウレアーゼＸサブユニット・ポリペプチドもしくはウレ
アーゼＹサブユニット・ポリペプチドの免疫原性断片を
少なくともコードする、少なくとも４０ヌクレオチド、
好ましくは４５ヌクレオチド、より好ましくは５０ヌク
レオチドの長さを有するそれらの一部に関する。単なる
例として、ヘリコバクター・フェリスＣＳ１株のウレア
ーゼＸサブユニットをコードする核酸配列は、２０６／
２０７／２０８位（ＧＴＧ）（図１ａ（１）参照）で開
始し、８８４／８８５／８８６位（ＴＡＡ）で終止す
る。ヘリコバクター・フェリスＣＳ１株のウレアーゼＹ
サブユニットをコードする核酸配列は、８９７／８９８
／８９９位（ＡＴＧ）で開始し、２６０１／２６０２／
２６０３位（ＴＡＧ）で終止する。少なくとも５５核
酸、６０核酸又は７０核酸の長さを有する、さらに長い
断片は、その順にさらに好ましい。
【００１３】この実施形態のさらに好ましい形態は、配
列番号１と少なくとも９０％、好ましくは９４％、より
好ましくは９７％の相同性を有する核酸配列に関する。
列番号１と少なくとも９０％、好ましくは９４％、より
好ましくは９７％の相同性を有する核酸配列に関する。
【００１４】相同率の決定は、サイエンティフィックア
ンドエデュケーショナルソフトウェア（Ｓｃｉｅｎｔｉ
ｆｉｃ ａｎｄ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｆｔｗ
ａｒｅ）（Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ７２０４５ Ｄｕｒｈａｍ，
ＮＣ２７７２２−２０４５，ＵＳＡ）から入手可能なコ
ンピュータプログラム、アラインプラスフォーウィンド
ウズ（登録商標）（Ａｌｉｇｎ Ｐｌｕｓ ｆｏｒ Ｗ
ｉｎｄｏｗｓ（登録商標））を用いて実施された。核酸
比較に使用された設定は、図１ａ、１ｂ及び１ｃに示さ
れている。
ンドエデュケーショナルソフトウェア（Ｓｃｉｅｎｔｉ
ｆｉｃ ａｎｄ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｆｔｗ
ａｒｅ）（Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ７２０４５ Ｄｕｒｈａｍ，
ＮＣ２７７２２−２０４５，ＵＳＡ）から入手可能なコ
ンピュータプログラム、アラインプラスフォーウィンド
ウズ（登録商標）（Ａｌｉｇｎ Ｐｌｕｓ ｆｏｒ Ｗ
ｉｎｄｏｗｓ（登録商標））を用いて実施された。核酸
比較に使用された設定は、図１ａ、１ｂ及び１ｃに示さ
れている。
【００１５】本発明は、新規な構造ヘリコバクター・フ
ェリス・ウレアーゼ・サブユニットをコードする核酸配
列を開示しているため、そのようなポリペプチドを十分
な量で入手することが初めて可能となった。これは、例
えば、ＵｒｅＸ及びＵｒｅＹサブユニットをコードする
遺伝子を発現させるため発現系を使用することにより実
施されうる。従って、より好ましい実施形態において、
本発明は、本発明に係る核酸配列を含むＤＮＡ断片に関
する。そのようなＤＮＡ断片は、例えば、本発明に係る
核酸がクローニングされているプラスミドでありうる。
そのようなＤＮＡ断片は、例えば、下記のように、プロ
ーブとして使用するためＤＮＡの量を増強するために有
用である。
ェリス・ウレアーゼ・サブユニットをコードする核酸配
列を開示しているため、そのようなポリペプチドを十分
な量で入手することが初めて可能となった。これは、例
えば、ＵｒｅＸ及びＵｒｅＹサブユニットをコードする
遺伝子を発現させるため発現系を使用することにより実
施されうる。従って、より好ましい実施形態において、
本発明は、本発明に係る核酸配列を含むＤＮＡ断片に関
する。そのようなＤＮＡ断片は、例えば、本発明に係る
核酸がクローニングされているプラスミドでありうる。
そのようなＤＮＡ断片は、例えば、下記のように、プロ
ーブとして使用するためＤＮＡの量を増強するために有
用である。
【００１６】核酸配列の発現のための必須の要件は、核
酸配列と機能的に連結した適切なプロモーターである。
プロモーターの選択が、タンパク質発現のため宿主細胞
として使用される細胞において遺伝子転写を指図するこ
とができる任意の真核生物、原核生物又はウイルスのプ
ロモーターに及ぶことは、当業者には明らかである。従
って、この実施形態のさらに好ましい形態は、機能的に
連結したプロモーターの調節下に置かれた本発明に係る
ＤＮＡ断片又は核酸配列を含む組換えＤＮＡ分子に関す
る。これは、例えば標準的な分子生物学的技術により入
手可能である。（Ｍａｎｉａｔｉｓ／Ｓａｍｂｒｏｏｋ
（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏ
ｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，
１９８９．ＩＳＢＮ０−８７９６９−３０９−６）。
酸配列と機能的に連結した適切なプロモーターである。
プロモーターの選択が、タンパク質発現のため宿主細胞
として使用される細胞において遺伝子転写を指図するこ
とができる任意の真核生物、原核生物又はウイルスのプ
ロモーターに及ぶことは、当業者には明らかである。従
って、この実施形態のさらに好ましい形態は、機能的に
連結したプロモーターの調節下に置かれた本発明に係る
ＤＮＡ断片又は核酸配列を含む組換えＤＮＡ分子に関す
る。これは、例えば標準的な分子生物学的技術により入
手可能である。（Ｍａｎｉａｔｉｓ／Ｓａｍｂｒｏｏｋ
（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏ
ｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，
１９８９．ＩＳＢＮ０−８７９６９−３０９−６）。
【００１７】機能的に連結したプロモーターとは、それ
らが連結している核酸配列の転写を調節することができ
るプロモーターである。宿主細胞が細菌である場合、使
用されうる有用な発現調節配列には、Ｔｒｐプロモータ
ー及びオペレーター（Ｇｏｅｄｄｅｌ，ｅｔ ａｌ．，
Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，８，４０５７，１９
８０）、ｌａｃプロモーター及びオペレーター（Ｃｈａ
ｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２７５，６１５，
１９７８）、アウターメンブレンプロテイン・プロモー
ター（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｋ．，ａｎｄ Ｉｎｏｕｇ
ｅ，Ｍ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１，７７１−７７５，１９
８２）、バクテリオファージラムダ・プロモーター及び
オペレーター（Ｒｅｍａｕｔ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕ
ｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１１，４６７７−４６８
８，１９８３）、α−アミラーゼ（Ｂ．ズブチリス）プ
ロモーター及びオペレーター、終結配列、並びに選択さ
れた宿主細胞と適合性のその他の発現増強調節配列が含
まれる。宿主細胞が酵母である場合、有用な発現調節配
列には、例えばα−接合因子が含まれる。昆虫細胞の場
合、バキュロウイルスのポリヘドリン・プロモーター又
はｐ１０プロモーターが使用されうる（Ｓｍｉｔｈ，
Ｇ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．
３，２１５６−６５，１９８３）。宿主細胞が哺乳動物
起源である場合、例示的な有用な発現調節配列には、Ｓ
Ｖ−４０プロモーター（Ｂｅｒｍａｎ，Ｐ．Ｗ．ｅｔ
ａｌ．，Ｓｉｅｎｃｅ，２２２，５２４−５２７，１９
８３）又はメタロチオネイン・プロモーター（Ｂｒｉｎ
ｓｔｅｒ，Ｒ．Ｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２９６，３９−４
２，１９８２）又は熱ショック・プロモーター（Ｖｏｅ
ｌｌｍｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４９４９−５３，１９８
５）が含まれる。
らが連結している核酸配列の転写を調節することができ
るプロモーターである。宿主細胞が細菌である場合、使
用されうる有用な発現調節配列には、Ｔｒｐプロモータ
ー及びオペレーター（Ｇｏｅｄｄｅｌ，ｅｔ ａｌ．，
Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，８，４０５７，１９
８０）、ｌａｃプロモーター及びオペレーター（Ｃｈａ
ｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２７５，６１５，
１９７８）、アウターメンブレンプロテイン・プロモー
ター（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｋ．，ａｎｄ Ｉｎｏｕｇ
ｅ，Ｍ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１，７７１−７７５，１９
８２）、バクテリオファージラムダ・プロモーター及び
オペレーター（Ｒｅｍａｕｔ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕ
ｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１１，４６７７−４６８
８，１９８３）、α−アミラーゼ（Ｂ．ズブチリス）プ
ロモーター及びオペレーター、終結配列、並びに選択さ
れた宿主細胞と適合性のその他の発現増強調節配列が含
まれる。宿主細胞が酵母である場合、有用な発現調節配
列には、例えばα−接合因子が含まれる。昆虫細胞の場
合、バキュロウイルスのポリヘドリン・プロモーター又
はｐ１０プロモーターが使用されうる（Ｓｍｉｔｈ，
Ｇ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．
３，２１５６−６５，１９８３）。宿主細胞が哺乳動物
起源である場合、例示的な有用な発現調節配列には、Ｓ
Ｖ−４０プロモーター（Ｂｅｒｍａｎ，Ｐ．Ｗ．ｅｔ
ａｌ．，Ｓｉｅｎｃｅ，２２２，５２４−５２７，１９
８３）又はメタロチオネイン・プロモーター（Ｂｒｉｎ
ｓｔｅｒ，Ｒ．Ｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２９６，３９−４
２，１９８２）又は熱ショック・プロモーター（Ｖｏｅ
ｌｌｍｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４９４９−５３，１９８
５）が含まれる。
【００１８】細菌、酵母、真菌、昆虫及び哺乳動物の細
胞発現系は、極めて頻繁に使用されている系である。そ
のような系は、当分野において周知であり、一般的に、
例えばクロンテックラボラトリーズ社（Ｃｌｏｎｔｅｃ
ｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）（４０３
０Ｆａｂｉａｎ Ｗａｙ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌ
ｉｆｏｒｎｉａ ９４３０３−４６０７，ＵＳＡ）から
市販されている。これらの発現系の次に、寄生虫に基づ
く発現系が、極めて魅力的な発現系である。そのような
系は、例えば、公開第２７１４０７４号のフランス特許
出願及びＵＳＮＴＩＳ公開第０８／０４３１０９号（Ｈ
ｏｆｆｍａｎ，Ｓ．ａｎｄ Ｒｏｇｅｒｓ，Ｗ．：公開
日１９９３年１２月１日）に記載されている。
胞発現系は、極めて頻繁に使用されている系である。そ
のような系は、当分野において周知であり、一般的に、
例えばクロンテックラボラトリーズ社（Ｃｌｏｎｔｅｃ
ｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）（４０３
０Ｆａｂｉａｎ Ｗａｙ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌ
ｉｆｏｒｎｉａ ９４３０３−４６０７，ＵＳＡ）から
市販されている。これらの発現系の次に、寄生虫に基づ
く発現系が、極めて魅力的な発現系である。そのような
系は、例えば、公開第２７１４０７４号のフランス特許
出願及びＵＳＮＴＩＳ公開第０８／０４３１０９号（Ｈ
ｏｆｆｍａｎ，Ｓ．ａｎｄ Ｒｏｇｅｒｓ，Ｗ．：公開
日１９９３年１２月１日）に記載されている。
【００１９】従って、本発明のこの実施形態のさらに好
ましい形態は、本発明に係るＵｒｅＸもしくはＵｒｅＹ
ポリペプチド又はそれらの免疫原性断片をコードする遺
伝子を含む組換え生キャリアー（Ｌｉｖｅ Ｒｅｃｏｍ
ｂｉｎａｎｔ Ｃａｒｒｉｅｒ）微生物（ＬＲＣ）に関
する。そのような微生物は、例えば、細菌及びウイルス
である。これらのＬＲＣ微生物は、付加的な遺伝情報、
この場合には、本発明に係るＵｒｅＸもしくはＵｒｅＹ
ポリペプチド又はそれらの免疫原性断片をコードする遺
伝子がクローニングされている微生物である。そのよう
なＬＲＣに感染した動物は、ベクターの免疫原に対して
のみならず、遺伝暗号、例えばＵｒｅＸ又はＹ遺伝子が
ＬＲＣにクローニングされている（一つ又は複数の）ポ
リペプチドの免疫原性部分に対しても免疫原性応答を生
じるであろう。細菌ＬＲＣの例として、当分野において
既知の弱毒化サルモネラ株が、魅力的に使用されうる。
組換え生キャリアー寄生虫は、特に、バーメウレン（Ｖ
ｅｒｍｅｕｌｅｎ）Ａ．Ｎ．（Ｉｎｔ．Ｊｏｕｒｎ．Ｐ
ａｒａｓｉｔｏｌ．２８：１１２１−１１３０（１９９
８））により記載されている。また、ＬＲＣウイルス
は、核酸配列を標的細胞に輸送するための手段として使
用されうる。組換え生キャリアーウイルスは、ベクター
ウイルスとも呼ばれる。ＵｒｅＸ又はＹポリペプチドを
コードする遺伝子の組み込み部位は、ウイルスにとって
必須ではないウイルス遺伝子内の部位、又は遺伝子間領
域内の部位でありうる。ベクターとしてしばしば使用さ
れるウイルスは、ワクシニアウイルス（Ｅ．Ｐ．Ａ．０
４７３２１０Ａ２）及びレトロウイルス（Ｖａｌｅｒｉ
ｏ，Ｄ．ｅｔ ａｌ：ｉｎ Ｂａｕｍ，Ｓ．Ｊ．，Ｄｉ
ｃｋｅ，Ｋ．Ａ．，Ｌｏｔｚｏｖａ，Ｅ．ａｎｄ Ｐｌ
ｕｚｎｉｋ，Ｄ．Ｈ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈ
ａｅｍａｔｏｌｏｇｙ ｔｏｄａｙ−１９８８，Ｓｐｒ
ｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：９２〜
９９頁（１９８９））である。
ましい形態は、本発明に係るＵｒｅＸもしくはＵｒｅＹ
ポリペプチド又はそれらの免疫原性断片をコードする遺
伝子を含む組換え生キャリアー（Ｌｉｖｅ Ｒｅｃｏｍ
ｂｉｎａｎｔ Ｃａｒｒｉｅｒ）微生物（ＬＲＣ）に関
する。そのような微生物は、例えば、細菌及びウイルス
である。これらのＬＲＣ微生物は、付加的な遺伝情報、
この場合には、本発明に係るＵｒｅＸもしくはＵｒｅＹ
ポリペプチド又はそれらの免疫原性断片をコードする遺
伝子がクローニングされている微生物である。そのよう
なＬＲＣに感染した動物は、ベクターの免疫原に対して
のみならず、遺伝暗号、例えばＵｒｅＸ又はＹ遺伝子が
ＬＲＣにクローニングされている（一つ又は複数の）ポ
リペプチドの免疫原性部分に対しても免疫原性応答を生
じるであろう。細菌ＬＲＣの例として、当分野において
既知の弱毒化サルモネラ株が、魅力的に使用されうる。
組換え生キャリアー寄生虫は、特に、バーメウレン（Ｖ
ｅｒｍｅｕｌｅｎ）Ａ．Ｎ．（Ｉｎｔ．Ｊｏｕｒｎ．Ｐ
ａｒａｓｉｔｏｌ．２８：１１２１−１１３０（１９９
８））により記載されている。また、ＬＲＣウイルス
は、核酸配列を標的細胞に輸送するための手段として使
用されうる。組換え生キャリアーウイルスは、ベクター
ウイルスとも呼ばれる。ＵｒｅＸ又はＹポリペプチドを
コードする遺伝子の組み込み部位は、ウイルスにとって
必須ではないウイルス遺伝子内の部位、又は遺伝子間領
域内の部位でありうる。ベクターとしてしばしば使用さ
れるウイルスは、ワクシニアウイルス（Ｅ．Ｐ．Ａ．０
４７３２１０Ａ２）及びレトロウイルス（Ｖａｌｅｒｉ
ｏ，Ｄ．ｅｔ ａｌ：ｉｎ Ｂａｕｍ，Ｓ．Ｊ．，Ｄｉ
ｃｋｅ，Ｋ．Ａ．，Ｌｏｔｚｏｖａ，Ｅ．ａｎｄ Ｐｌ
ｕｚｎｉｋ，Ｄ．Ｈ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈ
ａｅｍａｔｏｌｏｇｙ ｔｏｄａｙ−１９８８，Ｓｐｒ
ｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：９２〜
９９頁（１９８９））である。
【００２０】挿入された本発明に係る核酸配列の宿主動
物における発現を誘導することができる、選択された細
菌、寄生虫又はウイルスのゲノムへ、組換え核酸配列を
導入するためには、当分野において周知のインビボ相同
的組換え技術が使用されうる。
物における発現を誘導することができる、選択された細
菌、寄生虫又はウイルスのゲノムへ、組換え核酸配列を
導入するためには、当分野において周知のインビボ相同
的組換え技術が使用されうる。
【００２１】本発明のこの実施形態の最後のもう一つの
形態は、本発明に係るポリペプチドをコードする核酸配
列、そのような核酸配列を含むＤＮＡ断片、又は機能的
に連結したプロモーターの調節下でそのような核酸配列
を含む組換えＤＮＡ分子を含む宿主細胞に関する。この
形態は、本発明に係るＵｒｅＸもしくはＹポリペプチド
又はそれらの免疫原性断片をコードする核酸分子を含有
する組換え生キャリアーを含有する宿主細胞にも関す
る。宿主細胞は、ｐＢＲ３２２のような細菌プラスミド
又はｐＧＥＸのような細菌発現ベクター、又はバクテリ
オファージと組み合わせられた、細菌起源、例えば大腸
菌、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂ
ｔｉｌｉｓ）、及びラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃ
ｉｌｌｕｓ）種の細胞でありうる。宿主細胞は、真核生
物起源のもの、例えば酵母特異的ベクター分子と組み合
わせられた酵母細胞、又はベクターもしくは組換えバキ
ュロウイルスと組み合わせられた昆虫細胞（Ｌｕｃｋｏ
ｗ ｅｔ ａｌ；Ｂｉｏ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：
４７−５５（１９８８））、例えばＴｉプラスミド型ベ
クターもしくは植物ウイルスベクター（Ｂａｒｔｏｎ，
Ｋ．Ａ．ｅｔ ａｌ；Ｃｅｌｌ ３２：１０３３（１９
８３））と組み合わせられた植物細胞、やはり適切なベ
クターもしくは組換えウイルスと組み合わせられたＨｅ
ｌａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）
もしくはクランデル（Ｃｒａｎｄｅｌｌ）ネコ腎細胞の
ような哺乳動物細胞のような高等真核細胞であってもよ
い。
形態は、本発明に係るポリペプチドをコードする核酸配
列、そのような核酸配列を含むＤＮＡ断片、又は機能的
に連結したプロモーターの調節下でそのような核酸配列
を含む組換えＤＮＡ分子を含む宿主細胞に関する。この
形態は、本発明に係るＵｒｅＸもしくはＹポリペプチド
又はそれらの免疫原性断片をコードする核酸分子を含有
する組換え生キャリアーを含有する宿主細胞にも関す
る。宿主細胞は、ｐＢＲ３２２のような細菌プラスミド
又はｐＧＥＸのような細菌発現ベクター、又はバクテリ
オファージと組み合わせられた、細菌起源、例えば大腸
菌、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂ
ｔｉｌｉｓ）、及びラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃ
ｉｌｌｕｓ）種の細胞でありうる。宿主細胞は、真核生
物起源のもの、例えば酵母特異的ベクター分子と組み合
わせられた酵母細胞、又はベクターもしくは組換えバキ
ュロウイルスと組み合わせられた昆虫細胞（Ｌｕｃｋｏ
ｗ ｅｔ ａｌ；Ｂｉｏ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：
４７−５５（１９８８））、例えばＴｉプラスミド型ベ
クターもしくは植物ウイルスベクター（Ｂａｒｔｏｎ，
Ｋ．Ａ．ｅｔ ａｌ；Ｃｅｌｌ ３２：１０３３（１９
８３））と組み合わせられた植物細胞、やはり適切なベ
クターもしくは組換えウイルスと組み合わせられたＨｅ
ｌａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）
もしくはクランデル（Ｃｒａｎｄｅｌｌ）ネコ腎細胞の
ような哺乳動物細胞のような高等真核細胞であってもよ
い。
【００２２】本発明のもう一つの実施形態は、核酸配列
によりコードされるポリペプチド、即ち、ウレアーゼＸ
サブユニット及びウレアーゼＹサブユニットに関し、そ
して本発明に係るそれらの免疫原性断片に関する。
によりコードされるポリペプチド、即ち、ウレアーゼＸ
サブユニット及びウレアーゼＹサブユニットに関し、そ
して本発明に係るそれらの免疫原性断片に関する。
【００２３】従って、本発明のこの実施形態は、配列番
号２と少なくとも８５％相同なアミノ酸配列を有する、
ヘリコバクター・フェリス・ウレアーゼＸポリペプチ
ド、又はウレアーゼＸＹに対する免疫応答を誘導する能
力を有する、少なくとも４０アミノ酸の長さを有する、
該ポリペプチドの免疫原性断片に関する。好ましくは、
該断片の長さは４０アミノ酸超であり、少なくとも４５
アミノ酸、５０アミノ酸、５５アミノ酸、６０アミノ酸
又は７０アミノ酸が、この順に、より好ましい。
号２と少なくとも８５％相同なアミノ酸配列を有する、
ヘリコバクター・フェリス・ウレアーゼＸポリペプチ
ド、又はウレアーゼＸＹに対する免疫応答を誘導する能
力を有する、少なくとも４０アミノ酸の長さを有する、
該ポリペプチドの免疫原性断片に関する。好ましくは、
該断片の長さは４０アミノ酸超であり、少なくとも４５
アミノ酸、５０アミノ酸、５５アミノ酸、６０アミノ酸
又は７０アミノ酸が、この順に、より好ましい。
【００２４】好ましくは、この実施形態は、配列番号２
と少なくとも９０％、より好ましくは９４％、さらに好
ましくは９７％の配列相同性を有するそのようなポリペ
プチド、又はウレアーゼＸＹに対する免疫応答を誘導す
る能力を有する、少なくとも４０アミノ酸、より好まし
くは少なくとも４５アミノ酸、５０アミノ酸、５５アミ
ノ酸、６０アミノ酸もしくは７０アミノ酸（この順に、
より好ましい）の長さを有する、該ポリペプチドの免疫
原性断片に関する。
と少なくとも９０％、より好ましくは９４％、さらに好
ましくは９７％の配列相同性を有するそのようなポリペ
プチド、又はウレアーゼＸＹに対する免疫応答を誘導す
る能力を有する、少なくとも４０アミノ酸、より好まし
くは少なくとも４５アミノ酸、５０アミノ酸、５５アミ
ノ酸、６０アミノ酸もしくは７０アミノ酸（この順に、
より好ましい）の長さを有する、該ポリペプチドの免疫
原性断片に関する。
【００２５】本発明のこの実施形態は、配列番号３と少
なくとも８５％相同なアミノ酸配列を有する、ヘリコバ
クター・フェリス・ウレアーゼＹポリペプチド、又はウ
レアーゼＸＹに対する免疫応答を誘導する能力を有す
る、少なくとも４０アミノ酸の長さを有する、該ポリペ
プチドの免疫原性断片に関する。好ましくは、該断片の
長さは４０アミノ酸超であり、少なくとも４５アミノ
酸、５０アミノ酸、５５アミノ酸、６０アミノ酸又は７
０アミノ酸が、この順に、より好ましい。
なくとも８５％相同なアミノ酸配列を有する、ヘリコバ
クター・フェリス・ウレアーゼＹポリペプチド、又はウ
レアーゼＸＹに対する免疫応答を誘導する能力を有す
る、少なくとも４０アミノ酸の長さを有する、該ポリペ
プチドの免疫原性断片に関する。好ましくは、該断片の
長さは４０アミノ酸超であり、少なくとも４５アミノ
酸、５０アミノ酸、５５アミノ酸、６０アミノ酸又は７
０アミノ酸が、この順に、より好ましい。
【００２６】好ましくは、この実施形態は、配列番号３
と少なくとも９０％、より好ましくは９４％、さらに好
ましくは９７％の配列相同性を有するそのようなポリペ
プチド、又はウレアーゼＸＹに対する免疫応答を誘導す
る能力を有する、少なくとも４０アミノ酸、より好まし
くは少なくとも４５アミノ酸、５０アミノ酸、５５アミ
ノ酸、６０アミノ酸もしくは７０アミノ酸（この順に、
より好ましい）の長さを有する、該ポリペプチドの免疫
原性断片に関する。
と少なくとも９０％、より好ましくは９４％、さらに好
ましくは９７％の配列相同性を有するそのようなポリペ
プチド、又はウレアーゼＸＹに対する免疫応答を誘導す
る能力を有する、少なくとも４０アミノ酸、より好まし
くは少なくとも４５アミノ酸、５０アミノ酸、５５アミ
ノ酸、６０アミノ酸もしくは７０アミノ酸（この順に、
より好ましい）の長さを有する、該ポリペプチドの免疫
原性断片に関する。
【００２７】ヌクレオチド配列比較の場合と同様に、サ
イエンティフィックアンドエデュケーショナルソフトウ
ェア（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ａｎｄ Ｅｄｕｃａｔｉ
ｏｎａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）（Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ７２０
４５ Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ２７７２２−２０４５，ＵＳ
Ａ）から入手可能なアラインプラスフォーウィンドウズ
（Ａｌｉｇｎ Ｐｌｕｓ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ）を
使用して様々なアミノ酸配列間の比較を実施した。アミ
ノ酸比較に使用された設定は、図１ａ、１ｂ及び１ｃに
示されている。
イエンティフィックアンドエデュケーショナルソフトウ
ェア（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ａｎｄ Ｅｄｕｃａｔｉ
ｏｎａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）（Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ７２０
４５ Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ２７７２２−２０４５，ＵＳ
Ａ）から入手可能なアラインプラスフォーウィンドウズ
（Ａｌｉｇｎ Ｐｌｕｓ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ）を
使用して様々なアミノ酸配列間の比較を実施した。アミ
ノ酸比較に使用された設定は、図１ａ、１ｂ及び１ｃに
示されている。
【００２８】本明細書に包含されている特定のポリペプ
チドについて、個々のヘリコバクター・フェリス株の間
には天然の差異が存在しうることが理解されよう。これ
らの差異は、全体的な配列における（一つ又は複数の）
アミノ酸の違い、又は該配列内の（一つ又は複数の）ア
ミノ酸の欠失、置換、挿入、逆位もしくは付加により示
されうる。生物学的活性及び免疫学的活性を本質的に改
変しないアミノ酸置換は、例えば「タンパク質（ｔｈｅ
Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７９）においてニューラス
（Ｎｅｕｒａｔｈ）らにより記載されている。関連アミ
ノ酸間のアミノ酸交換、又は進化において高頻度に起こ
っている交換は、特に、Ｓｅｒ／Ａｌａ、Ｓｅｒ／Ｇｌ
ｙ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｉｌｅ／Ｖａｌ
である（Ｄａｙｈｏｆ，Ｍ．Ｄ．，Ａｔｌａｓ ｏｆ
ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｓｔｒｕ
ｃｔｕｒｅ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎ
ｄ．，ＷａｓｈｉｎｇｔｏｎＤ．Ｃ．，１９７８年、第
５巻増補３参照）。その他のアミノ酸置換には、Ａｓｐ
／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／
Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｔｈｒ／Ｐ
ｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ｌｅｕ／Ｉｌ
ｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ及びＡｌａ／Ｇｌｕが含まれる。こ
の情報に基づき、リップマン（Ｌｉｐｍａｎ）及びピア
ソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）は、迅速かつ高感度にタンパク
質を比較し（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５−１４
４１，１９８５）、相同タンパク質間の機能的類似性を
決定する方法を開発した。本発明の例示的な実施形態の
そのようなアミノ酸置換も、欠失及び／又は挿入を有す
る差異も、得られたポリペプチドが免疫応答性を保持し
ている限りにおいて、本発明の範囲に含まれる。従っ
て、配列番号２又は３に示されたような野生型ポリペプ
チドと比較した場合の、ポリペプチドの免疫原性に本質
的に影響を与えない差異は、本発明の範囲に包含される
と見なされる。Ｈ．フェリス感染、又は少なくとも感染
の臨床的発現に対する免疫応答を誘導する能力を有する
ポリペプチドを提供する、本発明に係るいくつかの構造
サブユニットＸ又はＹのアミノ酸配列のこれらの差異
は、「免疫原性に本質的に影響を与えない」と見なされ
る。
チドについて、個々のヘリコバクター・フェリス株の間
には天然の差異が存在しうることが理解されよう。これ
らの差異は、全体的な配列における（一つ又は複数の）
アミノ酸の違い、又は該配列内の（一つ又は複数の）ア
ミノ酸の欠失、置換、挿入、逆位もしくは付加により示
されうる。生物学的活性及び免疫学的活性を本質的に改
変しないアミノ酸置換は、例えば「タンパク質（ｔｈｅ
Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７９）においてニューラス
（Ｎｅｕｒａｔｈ）らにより記載されている。関連アミ
ノ酸間のアミノ酸交換、又は進化において高頻度に起こ
っている交換は、特に、Ｓｅｒ／Ａｌａ、Ｓｅｒ／Ｇｌ
ｙ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｉｌｅ／Ｖａｌ
である（Ｄａｙｈｏｆ，Ｍ．Ｄ．，Ａｔｌａｓ ｏｆ
ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｓｔｒｕ
ｃｔｕｒｅ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎ
ｄ．，ＷａｓｈｉｎｇｔｏｎＤ．Ｃ．，１９７８年、第
５巻増補３参照）。その他のアミノ酸置換には、Ａｓｐ
／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／
Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｔｈｒ／Ｐ
ｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ｌｅｕ／Ｉｌ
ｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ及びＡｌａ／Ｇｌｕが含まれる。こ
の情報に基づき、リップマン（Ｌｉｐｍａｎ）及びピア
ソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）は、迅速かつ高感度にタンパク
質を比較し（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５−１４
４１，１９８５）、相同タンパク質間の機能的類似性を
決定する方法を開発した。本発明の例示的な実施形態の
そのようなアミノ酸置換も、欠失及び／又は挿入を有す
る差異も、得られたポリペプチドが免疫応答性を保持し
ている限りにおいて、本発明の範囲に含まれる。従っ
て、配列番号２又は３に示されたような野生型ポリペプ
チドと比較した場合の、ポリペプチドの免疫原性に本質
的に影響を与えない差異は、本発明の範囲に包含される
と見なされる。Ｈ．フェリス感染、又は少なくとも感染
の臨床的発現に対する免疫応答を誘導する能力を有する
ポリペプチドを提供する、本発明に係るいくつかの構造
サブユニットＸ又はＹのアミノ酸配列のこれらの差異
は、「免疫原性に本質的に影響を与えない」と見なされ
る。
【００２９】例えばワクチン目的又は抗体の惹起のため
ポリペプチドを使用する場合、完全なポリペプチドを使
用する必要はない。そのままで、又は例えばＫＬＨのよ
うな担体とカップリングして、ポリペプチドに対する免
疫応答を有する能力を有するポリペプチドの断片、いわ
ゆる免疫原性断片を使用することも可能である。「免疫
原性断片」とは、宿主において免疫応答を誘導する能力
を保持している、即ちＢ細胞エピトープ又はＴ細胞エピ
トープを含む、構造サブユニットＸ又はＹの全長ポリペ
プチドの断片と理解される。現時点で、抗原性断片（決
定基）をコードするＤＮＡ断片を容易に同定するための
多様な技術が利用可能である。ゲイセン（Ｇｅｙｓｅ
ｎ）ら（特許出願ＷＯ８４／０３５６４、特許出願ＷＯ
８６／０６４８７、米国特許第ＮＲ．４，８３３，０９
２号、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，８１：３９９８−４００２（１９８４）、Ｊ．Ｉｍ
ｍ．Ｍｅｔｈ．１０２，２５９−２７４（１９８７））
により記載された方法、いわゆるＰＥＰＳＣＡＮ法は、
エピトープ、ポリペプチドの免疫学的に重要な領域を検
出するための、実施が容易で、迅速で、かつ十分に確立
されている方法である。この方法は世界中で使用されて
おり、当業者に自体周知である。この（経験的な）方法
は、Ｂ細胞エピトープの検出に特に適している。また、
任意のタンパク質をコードする遺伝子の配列が与えられ
れば、コンピュータアルゴリズムが、現在既知であるエ
ピトープとの配列及び／又は構造の一致性に基づき、免
疫学的に重要なエピトープとして特定のポリペプチド断
片を指定することができる。これらの領域の決定は、ホ
ップ（Ｈｏｐｐ）及びウッズ（Ｗｏｏｄｓ）（Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：３８
２４８−３８２８（１９８１））による親水性基準と、
チョウ（Ｃｈｏｕ）及びファスマン（Ｆａｓｍａｎ）
（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ４
７：４５−１４８（１９８７）及び米国特許第４，５５
４，１０１号）による二次構造面との組み合わせに基づ
いている。Ｔ細胞エピトープは、同様に、バーゾフスキ
ー（Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ）の両親媒性基準（Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２３５，１０５９−１０６２（１９８７）及び米
国特許出願ＮＴＩＳ ＵＳ ０７／００５，８８５）を
利用して、コンピュータにより配列から予測されうる。
要約された概要が、一般原理についてはＳｈａｎ Ｌ
ｕ：Ｔｉｂｔｅｃｈ ９：２３８−２４２（１９９１）
に、マラリア・エピトープについてはＧｏｏｄ ｅｔ
ａｌ；Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：１０５９−１０６２
（１９８７）に、概説についてはＬｕ；Ｖａｃｃｉｎｅ
１０：３−７（１９９２）に、ＨＩＶエピトープにつ
いてはＢｅｒｚｏｗｓｋｙ；Ｔｈｅ ＦＡＳＥＢ Ｊｏ
ｕｒｎａｌ ５：２４１２−２４１８（１９９１）に見
出される。
ポリペプチドを使用する場合、完全なポリペプチドを使
用する必要はない。そのままで、又は例えばＫＬＨのよ
うな担体とカップリングして、ポリペプチドに対する免
疫応答を有する能力を有するポリペプチドの断片、いわ
ゆる免疫原性断片を使用することも可能である。「免疫
原性断片」とは、宿主において免疫応答を誘導する能力
を保持している、即ちＢ細胞エピトープ又はＴ細胞エピ
トープを含む、構造サブユニットＸ又はＹの全長ポリペ
プチドの断片と理解される。現時点で、抗原性断片（決
定基）をコードするＤＮＡ断片を容易に同定するための
多様な技術が利用可能である。ゲイセン（Ｇｅｙｓｅ
ｎ）ら（特許出願ＷＯ８４／０３５６４、特許出願ＷＯ
８６／０６４８７、米国特許第ＮＲ．４，８３３，０９
２号、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，８１：３９９８−４００２（１９８４）、Ｊ．Ｉｍ
ｍ．Ｍｅｔｈ．１０２，２５９−２７４（１９８７））
により記載された方法、いわゆるＰＥＰＳＣＡＮ法は、
エピトープ、ポリペプチドの免疫学的に重要な領域を検
出するための、実施が容易で、迅速で、かつ十分に確立
されている方法である。この方法は世界中で使用されて
おり、当業者に自体周知である。この（経験的な）方法
は、Ｂ細胞エピトープの検出に特に適している。また、
任意のタンパク質をコードする遺伝子の配列が与えられ
れば、コンピュータアルゴリズムが、現在既知であるエ
ピトープとの配列及び／又は構造の一致性に基づき、免
疫学的に重要なエピトープとして特定のポリペプチド断
片を指定することができる。これらの領域の決定は、ホ
ップ（Ｈｏｐｐ）及びウッズ（Ｗｏｏｄｓ）（Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：３８
２４８−３８２８（１９８１））による親水性基準と、
チョウ（Ｃｈｏｕ）及びファスマン（Ｆａｓｍａｎ）
（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ４
７：４５−１４８（１９８７）及び米国特許第４，５５
４，１０１号）による二次構造面との組み合わせに基づ
いている。Ｔ細胞エピトープは、同様に、バーゾフスキ
ー（Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ）の両親媒性基準（Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２３５，１０５９−１０６２（１９８７）及び米
国特許出願ＮＴＩＳ ＵＳ ０７／００５，８８５）を
利用して、コンピュータにより配列から予測されうる。
要約された概要が、一般原理についてはＳｈａｎ Ｌ
ｕ：Ｔｉｂｔｅｃｈ ９：２３８−２４２（１９９１）
に、マラリア・エピトープについてはＧｏｏｄ ｅｔ
ａｌ；Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：１０５９−１０６２
（１９８７）に、概説についてはＬｕ；Ｖａｃｃｉｎｅ
１０：３−７（１９９２）に、ＨＩＶエピトープにつ
いてはＢｅｒｚｏｗｓｋｙ；Ｔｈｅ ＦＡＳＥＢ Ｊｏ
ｕｒｎａｌ ５：２４１２−２４１８（１９９１）に見
出される。
【００３０】例えば、唯１つのウレアーゼを有するヘリ
コバクター・ピロリに対するワクチンが、前記のよう
に、このウレアーゼに基づき製造されうる。しかしなが
ら、ヘリコバクター・フェリスの特定の場合、既知のヘ
リコバクター・フェリス構造サブユニットｕｒｅＡ及び
Ｂに基づくワクチンは、ヘリコバクター・フェリス感染
に対する十分な防御を提供することができない。報告に
よると、構造サブユニットｕｒｅＡ及びＢに対する免疫
は、新たに見出された異種構造サブユニットＵｒｅＸ及
びＹのウレアーゼ活性を中和しない。
コバクター・ピロリに対するワクチンが、前記のよう
に、このウレアーゼに基づき製造されうる。しかしなが
ら、ヘリコバクター・フェリスの特定の場合、既知のヘ
リコバクター・フェリス構造サブユニットｕｒｅＡ及び
Ｂに基づくワクチンは、ヘリコバクター・フェリス感染
に対する十分な防御を提供することができない。報告に
よると、構造サブユニットｕｒｅＡ及びＢに対する免疫
は、新たに見出された異種構造サブユニットＵｒｅＸ及
びＹのウレアーゼ活性を中和しない。
【００３１】従って、ヘリコバクター・フェリス感染か
らの動物の防御のためのワクチンは、少なくとも、新規
なウレアーゼＸＹに対するものでなければならない。従
って、本発明のさらにもう一つの実施形態の一つの形態
は、本発明に係る構造サブユニットＸもしくはＹ、好ま
しくはＸ及びＹ、より好ましくはＸ、Ｙ、Ａ及びＢ、又
はＸ及び／もしくはＹの免疫原性断片を、薬学的に許容
される担体と共に含む、ヘリコバクター・フェリス感染
からイヌ及びネコのような動物を防御することができる
ワクチンに関する。
らの動物の防御のためのワクチンは、少なくとも、新規
なウレアーゼＸＹに対するものでなければならない。従
って、本発明のさらにもう一つの実施形態の一つの形態
は、本発明に係る構造サブユニットＸもしくはＹ、好ま
しくはＸ及びＹ、より好ましくはＸ、Ｙ、Ａ及びＢ、又
はＸ及び／もしくはＹの免疫原性断片を、薬学的に許容
される担体と共に含む、ヘリコバクター・フェリス感染
からイヌ及びネコのような動物を防御することができる
ワクチンに関する。
【００３２】本発明のさらにもう一つの実施形態は、ワ
クチンにおいて使用するための本発明に係るポリペプチ
ドに関する。
クチンにおいて使用するための本発明に係るポリペプチ
ドに関する。
【００３３】さらにもう一つの実施形態は、ヘリコバク
ター・フェリス感染に対抗するためのワクチンの製造に
おける本発明に係るポリペプチドの使用に関する。
ター・フェリス感染に対抗するためのワクチンの製造に
おける本発明に係るポリペプチドの使用に関する。
【００３４】本発明に係るワクチンを製造する一つの方
法は、ウレアーゼＸＹポリペプチド又はそのサブユニッ
トの細菌培養物からの生化学的な精製による。これは、
例えば、細菌の遠心分離、及びウレアーゼポリペプチド
又はそのサブユニットの他の成分からの分離のためのゲ
ル濾過カラムの使用により実施されうる。さらなる精製
は、例えば、硫酸アンモニウムで選択的に沈殿させ、続
いて遠心分離、ゲル電気泳動を行い、そして、所望によ
り、ウレアーゼＡＢサブユニットからの分離を行い、そ
して適当な緩衝液にペレットを溶解させることにより実
施されうる。しかしながら、これは、ヘリコバクター・
フェリスを増殖させることが困難である場合には特に、
多大の時間を要するワクチン製造法である。
法は、ウレアーゼＸＹポリペプチド又はそのサブユニッ
トの細菌培養物からの生化学的な精製による。これは、
例えば、細菌の遠心分離、及びウレアーゼポリペプチド
又はそのサブユニットの他の成分からの分離のためのゲ
ル濾過カラムの使用により実施されうる。さらなる精製
は、例えば、硫酸アンモニウムで選択的に沈殿させ、続
いて遠心分離、ゲル電気泳動を行い、そして、所望によ
り、ウレアーゼＡＢサブユニットからの分離を行い、そ
して適当な緩衝液にペレットを溶解させることにより実
施されうる。しかしながら、これは、ヘリコバクター・
フェリスを増殖させることが困難である場合には特に、
多大の時間を要するワクチン製造法である。
【００３５】従って、本発明に係るウレアーゼＸ及びＹ
サブユニットをコードする遺伝子の発現産物をワクチン
において使用する方が、はるかに便利である。そのよう
なワクチンは、本発明に係るウレアーゼＸＹ又はＵｒｅ
ＸもしくはＹサブユニット又はそれらの免疫原性断片
と、下記のような薬学的に許容される担体とを混合する
ことにより、容易に製造されうる。
サブユニットをコードする遺伝子の発現産物をワクチン
において使用する方が、はるかに便利である。そのよう
なワクチンは、本発明に係るウレアーゼＸＹ又はＵｒｅ
ＸもしくはＹサブユニット又はそれらの免疫原性断片
と、下記のような薬学的に許容される担体とを混合する
ことにより、容易に製造されうる。
【００３６】さらに、ワクチンは、本発明に係るウレア
ーゼＸＹ、ＵｒｅＸもしくはＵｒｅＹサブユニット、又
はそれらの免疫原性断片を発現することができる、前記
のような組換え生キャリアーを含んでいてもよい。例え
ば、胃上皮に感染するサルモネラキヤリアー又はウイル
スキャリアーに基づく、そのようなワクチンは、天然の
ヘリコバクター・フェリス感染様式を、よりよく模倣す
るという、他のサブユニットワクチンより優れた利点を
有する。さらに、それらの自己繁殖は、少量の組換えキ
ャリアーのみが免疫感作に必要となるため、有利であ
る。
ーゼＸＹ、ＵｒｅＸもしくはＵｒｅＹサブユニット、又
はそれらの免疫原性断片を発現することができる、前記
のような組換え生キャリアーを含んでいてもよい。例え
ば、胃上皮に感染するサルモネラキヤリアー又はウイル
スキャリアーに基づく、そのようなワクチンは、天然の
ヘリコバクター・フェリス感染様式を、よりよく模倣す
るという、他のサブユニットワクチンより優れた利点を
有する。さらに、それらの自己繁殖は、少量の組換えキ
ャリアーのみが免疫感作に必要となるため、有利であ
る。
【００３７】前記のワクチンは、全て、能動予防接種に
寄与する、即ち宿主の免疫系が、これらのポリペプチド
に対する抗体を作るよう、ＵｒｅＸ及び／もしくはＹポ
リペプチド、又はそれらの免疫原性断片により誘発され
る。又は、そのような抗体を、例えばウサギにおいて惹
起させることもできるし、又は下記のような抗体産生細
胞系から入手することもできる。次いで、そのような抗
体は、宿主動物へ投与されうる。この予防接種法、受動
予防接種は、動物が既に感染しており、天然の免疫応答
が誘発されるのを待つ時間が存在しない場合に、選択さ
れる予防接種である。また、免疫不全動物を予防接種す
るための好ましい方法でもある。投与されたヘリコバク
ターＵｒｅＸ又はＵｒｅＹに対する抗体は、これらの場
合、細菌により分泌されたウレアーゼと直接結合するこ
とができる。これは、ウレアーゼ活性が直接的に排除さ
れ、従って、環境が酸性化され、ヘリコバクター増殖が
減少又は停止するという利点を有する。従って、本発明
のこの実施形態のもう一つの形態は、配列番号２と少な
くとも８５％相同なアミノ酸配列を有するヘリコバクタ
ー・フェリス・ウレアーゼＸポリペプチド、もしくはウ
レアーゼＸＹに対する免疫応答を誘導する能力を有する
少なくとも４０アミノ酸長を有するポリペプチドの免疫
原性断片に対する抗体、又は配列番号３と少なくとも８
５％相同なアミノ酸配列を有するヘリコバクター・フェ
リス・ウレアーゼＹポリペプチド、もしくはウレアーゼ
ＸＹに対する免疫応答を誘導する能力を有する少なくと
も４０アミノ酸長を有するポリペプチドの免疫原性断片
に対する抗体を含むワクチンに関する。
寄与する、即ち宿主の免疫系が、これらのポリペプチド
に対する抗体を作るよう、ＵｒｅＸ及び／もしくはＹポ
リペプチド、又はそれらの免疫原性断片により誘発され
る。又は、そのような抗体を、例えばウサギにおいて惹
起させることもできるし、又は下記のような抗体産生細
胞系から入手することもできる。次いで、そのような抗
体は、宿主動物へ投与されうる。この予防接種法、受動
予防接種は、動物が既に感染しており、天然の免疫応答
が誘発されるのを待つ時間が存在しない場合に、選択さ
れる予防接種である。また、免疫不全動物を予防接種す
るための好ましい方法でもある。投与されたヘリコバク
ターＵｒｅＸ又はＵｒｅＹに対する抗体は、これらの場
合、細菌により分泌されたウレアーゼと直接結合するこ
とができる。これは、ウレアーゼ活性が直接的に排除さ
れ、従って、環境が酸性化され、ヘリコバクター増殖が
減少又は停止するという利点を有する。従って、本発明
のこの実施形態のもう一つの形態は、配列番号２と少な
くとも８５％相同なアミノ酸配列を有するヘリコバクタ
ー・フェリス・ウレアーゼＸポリペプチド、もしくはウ
レアーゼＸＹに対する免疫応答を誘導する能力を有する
少なくとも４０アミノ酸長を有するポリペプチドの免疫
原性断片に対する抗体、又は配列番号３と少なくとも８
５％相同なアミノ酸配列を有するヘリコバクター・フェ
リス・ウレアーゼＹポリペプチド、もしくはウレアーゼ
ＸＹに対する免疫応答を誘導する能力を有する少なくと
も４０アミノ酸長を有するポリペプチドの免疫原性断片
に対する抗体を含むワクチンに関する。
【００３８】ワクチンは、本発明に係るウレアーゼＸ
Ｙ、ＵｒｅＸもしくはＵｒｅＹサブユニット、又はそれ
らの免疫原性断片を含む、前記のような宿主細胞に基づ
いていてもよい。
Ｙ、ＵｒｅＸもしくはＵｒｅＹサブユニット、又はそれ
らの免疫原性断片を含む、前記のような宿主細胞に基づ
いていてもよい。
【００３９】別の効率的な予防接種法は、関連抗原をコ
ードするＤＮＡによる直接予防接種である。ポリペプチ
ドをコードするＤＮＡによる直接予防接種は、多くの異
なるポリペプチドについて成功している（例えば、Ｄｏ
ｎｎｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｉｓｔ ２：２０−２６（１９９３）に概説されて
いる）。この予防接種法は、ヘリコバクター・フェリス
感染に対するネコ及びイヌ両方の予防接種にとって極め
て魅力的である。従って、本発明のこの実施形態のさら
に他の形態は、本発明に係るポリペプチド又は本発明に
係るそれらの免疫原性断片をコードする核酸配列を含む
ワクチンに関し、そしてそのような核酸配列を含むＤＮ
Ａ断片を含むワクチンに関する。この実施形態のさらに
他の形態は、本発明に係る組換えＤＮＡ分子を含むワク
チンに関する。ＤＮＡワクチンは、例えば針なしの注射
器を使用して、経皮的適用により容易に投与されうる。
この投与法は、予防接種すべき動物の細胞へＤＮＡを直
接輸送する。１〜１００μｇのマイクログラム範囲の量
のＤＮＡが、極めて良好な結果を提供する。
ードするＤＮＡによる直接予防接種である。ポリペプチ
ドをコードするＤＮＡによる直接予防接種は、多くの異
なるポリペプチドについて成功している（例えば、Ｄｏ
ｎｎｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｉｓｔ ２：２０−２６（１９９３）に概説されて
いる）。この予防接種法は、ヘリコバクター・フェリス
感染に対するネコ及びイヌ両方の予防接種にとって極め
て魅力的である。従って、本発明のこの実施形態のさら
に他の形態は、本発明に係るポリペプチド又は本発明に
係るそれらの免疫原性断片をコードする核酸配列を含む
ワクチンに関し、そしてそのような核酸配列を含むＤＮ
Ａ断片を含むワクチンに関する。この実施形態のさらに
他の形態は、本発明に係る組換えＤＮＡ分子を含むワク
チンに関する。ＤＮＡワクチンは、例えば針なしの注射
器を使用して、経皮的適用により容易に投与されうる。
この投与法は、予防接種すべき動物の細胞へＤＮＡを直
接輸送する。１〜１００μｇのマイクログラム範囲の量
のＤＮＡが、極めて良好な結果を提供する。
【００４０】さらなる実施形態において、本発明に係る
ワクチンは、イヌもしくはネコにとって病原性の生物及
びウイルスに由来する抗原、又はそのような抗原をコー
ドする遺伝情報を含んでいてもよい。そのような生物及
びウイルスは、例えば、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（Ｆ
ｅｌｉｎｅ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｐｅｒｉｔｏｎｉ
ｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、ネコ免疫不全ウイルス（Ｆｅｌ
ｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｅｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕ
ｓ）、イヌ及びネコのパルボウイルス（Ｃａｎｉｎｅ
ａｎｄ Ｆｅｌｉｎｅ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、ジス
テンパーウイルス（Ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ ｖｉｒｕ
ｓ）、アデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、カリ
シウイルス（Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｕｓ）、ボーデテラ・
ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃ
ｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、ボレリア・ブルグドルフェリ
（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、レプ
トスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉ
ｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄ
ｉａ）及びバートネラ・ヘンセリ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌ
ａ ｈｅｎｓｅｌｉ）である。
ワクチンは、イヌもしくはネコにとって病原性の生物及
びウイルスに由来する抗原、又はそのような抗原をコー
ドする遺伝情報を含んでいてもよい。そのような生物及
びウイルスは、例えば、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（Ｆ
ｅｌｉｎｅ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｐｅｒｉｔｏｎｉ
ｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、ネコ免疫不全ウイルス（Ｆｅｌ
ｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｅｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕ
ｓ）、イヌ及びネコのパルボウイルス（Ｃａｎｉｎｅ
ａｎｄ Ｆｅｌｉｎｅ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、ジス
テンパーウイルス（Ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ ｖｉｒｕ
ｓ）、アデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、カリ
シウイルス（Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｕｓ）、ボーデテラ・
ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃ
ｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、ボレリア・ブルグドルフェリ
（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、レプ
トスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉ
ｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄ
ｉａ）及びバートネラ・ヘンセリ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌ
ａ ｈｅｎｓｅｌｉ）である。
【００４１】また、本発明は、ヘリコバクター・フェリ
ス感染に対抗するためのワクチンの製造において使用す
るための、本発明に係るポリペプチドに関する。
ス感染に対抗するためのワクチンの製造において使用す
るための、本発明に係るポリペプチドに関する。
【００４２】本発明に係るワクチンは、全て、薬学的に
許容される担体を含む。薬学的に許容される担体は、例
えば、無菌水又は無菌生理的塩溶液である。より複雑な
形態において、担体は、例えば緩衝液であってもよい。
許容される担体を含む。薬学的に許容される担体は、例
えば、無菌水又は無菌生理的塩溶液である。より複雑な
形態において、担体は、例えば緩衝液であってもよい。
【００４３】本発明に係るワクチンは、好ましくは、ア
ジュバントも含有していてもよい。アジュバントは、一
般的に、非特異的に宿主の免疫応答を強化する物質を含
む。多数の異なるアジュバントが、当分野において既知
である。アジュバントの例は、フロイント完全アジュバ
ント及び不完全アジュバント、ビタミンＥ、非イオン性
ブロック重合体、ムラミルジペプチド、Ｑｕｉｌｌ Ａ
（登録商標）、鉱油、例えばＢａｙｏｌ（登録商標）又
はＭａｒｋｏｌ（登録商標）、植物油、及びＣａｒｂｏ
ｐｏｌ（登録商標）（同種重合体）又はＤｉｌｕｖａｃ
（登録商標）Ｆｏｒｔｅである。ワクチンは、いわゆる
「媒体」を含んでいてもよい。媒体とは、ポリペプチド
が、共有結合することなく接着する化合物である。しば
しば使用される媒体化合物は、例えばアルミニウムの水
酸化物、リン酸塩、又は酸化物、シリカ、カオリン及び
ベントナイトである。抗原が媒体に部分的に埋め込まれ
ている特別な形態のそのような媒体は、いわゆるＩＳＣ
ＯＭである（ＥＰ１０９，９４２、ＥＰ１８０，５６
４、ＥＰ２４２，３８０）。さらに、ワクチンは、一つ
又は複数の適当な界面活性化合物又は乳化剤、例えばス
パン（Ｓｐａｎ）又はトウィーン（Ｔｗｅｅｎ）を含み
うる。しばしば、ワクチンは、例えば分解傾向のあるポ
リペプチドを分解から防御するため、ワクチンの貯蔵寿
命を増強するため、又は凍結乾燥効率を改善するため、
安定化剤と混合される。有用な安定化剤は、特に、ＳＰ
ＧＡ（Ｂｏｖａｒｎｉｋ ｅｔ ａｌ；Ｊ．Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌｏｇｙ ５９：５０９（１９５０））、炭水化
物、例えばソルビトール、マンニトール、トレハロー
ス、デンプン、ショ糖、デキストラン又はグルコース、
アルブミンもしくはカゼインのようなタンパク質又はそ
れらの分解産物、並びにアルカリ金属リン酸塩のような
緩衝剤である。さらに、生理学的に許容される希釈剤に
ワクチンを懸濁させてもよい。言及するまでもなく、ア
ジュバントによる強化、媒体化合物又は希釈剤の添加、
ポリペプチドの乳化又は安定化のその他の方法も、本発
明に包含される。
ジュバントも含有していてもよい。アジュバントは、一
般的に、非特異的に宿主の免疫応答を強化する物質を含
む。多数の異なるアジュバントが、当分野において既知
である。アジュバントの例は、フロイント完全アジュバ
ント及び不完全アジュバント、ビタミンＥ、非イオン性
ブロック重合体、ムラミルジペプチド、Ｑｕｉｌｌ Ａ
（登録商標）、鉱油、例えばＢａｙｏｌ（登録商標）又
はＭａｒｋｏｌ（登録商標）、植物油、及びＣａｒｂｏ
ｐｏｌ（登録商標）（同種重合体）又はＤｉｌｕｖａｃ
（登録商標）Ｆｏｒｔｅである。ワクチンは、いわゆる
「媒体」を含んでいてもよい。媒体とは、ポリペプチド
が、共有結合することなく接着する化合物である。しば
しば使用される媒体化合物は、例えばアルミニウムの水
酸化物、リン酸塩、又は酸化物、シリカ、カオリン及び
ベントナイトである。抗原が媒体に部分的に埋め込まれ
ている特別な形態のそのような媒体は、いわゆるＩＳＣ
ＯＭである（ＥＰ１０９，９４２、ＥＰ１８０，５６
４、ＥＰ２４２，３８０）。さらに、ワクチンは、一つ
又は複数の適当な界面活性化合物又は乳化剤、例えばス
パン（Ｓｐａｎ）又はトウィーン（Ｔｗｅｅｎ）を含み
うる。しばしば、ワクチンは、例えば分解傾向のあるポ
リペプチドを分解から防御するため、ワクチンの貯蔵寿
命を増強するため、又は凍結乾燥効率を改善するため、
安定化剤と混合される。有用な安定化剤は、特に、ＳＰ
ＧＡ（Ｂｏｖａｒｎｉｋ ｅｔ ａｌ；Ｊ．Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌｏｇｙ ５９：５０９（１９５０））、炭水化
物、例えばソルビトール、マンニトール、トレハロー
ス、デンプン、ショ糖、デキストラン又はグルコース、
アルブミンもしくはカゼインのようなタンパク質又はそ
れらの分解産物、並びにアルカリ金属リン酸塩のような
緩衝剤である。さらに、生理学的に許容される希釈剤に
ワクチンを懸濁させてもよい。言及するまでもなく、ア
ジュバントによる強化、媒体化合物又は希釈剤の添加、
ポリペプチドの乳化又は安定化のその他の方法も、本発
明に包含される。
【００４４】ＵｒｅＸ又はＵｒｅＹサブユニット・ポリ
ペプチドを含む本発明に係るワクチンは、１〜１００マ
イクログラムの範囲の量で、特に好適に投与されうる
が、それより少ない用量も、原則的には使用されうる。
１００マイクログラムを越える量は、免疫学的には極め
て適当であるが、商業的な理由からは魅力的ではない。
ペプチドを含む本発明に係るワクチンは、１〜１００マ
イクログラムの範囲の量で、特に好適に投与されうる
が、それより少ない用量も、原則的には使用されうる。
１００マイクログラムを越える量は、免疫学的には極め
て適当であるが、商業的な理由からは魅力的ではない。
【００４５】前記のＬＲＣウイルス及びＬＲＣ細菌のよ
うな生弱毒化組換えキャリアーに基づくワクチンは、感
染中に自己複製するため、はるかに少ない用量で投与さ
れうる。従って、極めて適当な量は、それぞれ細菌及び
ウイルスについて１０３〜１０９ＣＦＵ／ＰＦＵの間で
あろう。
うな生弱毒化組換えキャリアーに基づくワクチンは、感
染中に自己複製するため、はるかに少ない用量で投与さ
れうる。従って、極めて適当な量は、それぞれ細菌及び
ウイルスについて１０３〜１０９ＣＦＵ／ＰＦＵの間で
あろう。
【００４６】多くの投与法が適用されうる。鼻腔内適用
は、ワクチンを投与するための高頻度に使用されている
方法である。感染はしばしば消化管上部に位置している
ため、経口投与も魅力的な投与法である。経口投与の好
ましい方法は、高度に酸性の胃環境においてのみ崩壊す
る、当分野において既知であり高頻度に使用されている
カプセル内へのワクチンのパッケージングである。ま
た、ワクチンを胃のｐＨを一時的に増強するための、当
分野において既知の化合物と混合してもよい。例えば、
ワクチンの筋肉内適用による全身適用も適当である。こ
の経路による場合、全身適用のための当分野において既
知の標準的な手法が、非常に適している。
は、ワクチンを投与するための高頻度に使用されている
方法である。感染はしばしば消化管上部に位置している
ため、経口投与も魅力的な投与法である。経口投与の好
ましい方法は、高度に酸性の胃環境においてのみ崩壊す
る、当分野において既知であり高頻度に使用されている
カプセル内へのワクチンのパッケージングである。ま
た、ワクチンを胃のｐＨを一時的に増強するための、当
分野において既知の化合物と混合してもよい。例えば、
ワクチンの筋肉内適用による全身適用も適当である。こ
の経路による場合、全身適用のための当分野において既
知の標準的な手法が、非常に適している。
【００４７】本発明のもう一つの実施形態は、Ｈ．フェ
リス感染の検出のための診断テストに関する。Ｈ．ビッ
ゾゼロニー（ｂｉｚｚｏｚｅｒｏｎｉｉ）、Ｈ．フェリ
ス及びＨ．サロモニス（ｓａｌｏｍｏｎｉｓ）のような
いくつかのヘリコバクター種が、ネコ及びイヌの両方に
感染する能力を有する。これらの３種のうち、Ｈ．ビッ
ゾゼロニー及びＨ．サロモニスはしばしば数で勝るが、
病理の大部分を引き起こしていると推測される種は、
Ｈ．フェリスである。従って、ヘリコバクター・フェリ
スにより引き起こされたネコ及びイヌの両方における疾
患の迅速かつ正確な診断は、重要である。しかしなが
ら、これらの３種は極めて密接に関連しているため、区
別することが極めて困難であった。従って、他のヘリコ
バクター種からＨ．フェリスを区別するために適した診
断道具を提供することが、本発明のもう一つの目的であ
る。
リス感染の検出のための診断テストに関する。Ｈ．ビッ
ゾゼロニー（ｂｉｚｚｏｚｅｒｏｎｉｉ）、Ｈ．フェリ
ス及びＨ．サロモニス（ｓａｌｏｍｏｎｉｓ）のような
いくつかのヘリコバクター種が、ネコ及びイヌの両方に
感染する能力を有する。これらの３種のうち、Ｈ．ビッ
ゾゼロニー及びＨ．サロモニスはしばしば数で勝るが、
病理の大部分を引き起こしていると推測される種は、
Ｈ．フェリスである。従って、ヘリコバクター・フェリ
スにより引き起こされたネコ及びイヌの両方における疾
患の迅速かつ正確な診断は、重要である。しかしなが
ら、これらの３種は極めて密接に関連しているため、区
別することが極めて困難であった。従って、他のヘリコ
バクター種からＨ．フェリスを区別するために適した診
断道具を提供することが、本発明のもう一つの目的であ
る。
【００４８】新規なウレアーゼポリペプチド及びウレア
ーゼポリペプチドをコードする遺伝子に基づき、ヘリコ
バクター科の他の細菌からＨ．フェリスを区別するため
に特に適した少なくとも３つの異なる診断テストが開発
された。１）特異的なＵｒｅＸ及びＵｒｅＹ構造サブユ
ニットをコードするＤＮＡの存在又は欠如に基づく診断
テスト。２）特異的なＵｒｅＸ及びＵｒｅＹ構造サブユ
ニットに対する抗体の検出に基づく診断テスト。３）特
異的なＵｒｅＸ及びＵｒｅＹ構造サブユニットの抗原性
物質の検出に基づく診断テスト。
ーゼポリペプチドをコードする遺伝子に基づき、ヘリコ
バクター科の他の細菌からＨ．フェリスを区別するため
に特に適した少なくとも３つの異なる診断テストが開発
された。１）特異的なＵｒｅＸ及びＵｒｅＹ構造サブユ
ニットをコードするＤＮＡの存在又は欠如に基づく診断
テスト。２）特異的なＵｒｅＸ及びＵｒｅＹ構造サブユ
ニットに対する抗体の検出に基づく診断テスト。３）特
異的なＵｒｅＸ及びＵｒｅＹ構造サブユニットの抗原性
物質の検出に基づく診断テスト。
【００４９】１）の診断テストは、例えば、試験すべき
動物から単離された細菌ＤＮＡと、ｕｒｅＸ又はＹ遺伝
子の配列に基づく特異的なプローブ又はＰＣＲプライマ
ーとの反応に基づいている。Ｈ．フェリスＤＮＡが動物
に存在する場合には、これは、例えばｕｒｅＸ又はＹ特
異的ＰＣＲプライマーと特異的に結合し、その後、ＰＣ
Ｒ反応において増幅されるであろう。次いで、ＰＣＲ反
応産物は、ＤＮＡゲル電気泳動において容易に検出され
うる。ＤＮＡは、試験すべき動物の消化管上部のスワブ
又は唾液に存在する微生物から最も容易に単離されう
る。特異的プライマーは、ｕｒｅＡＢコーディング配列
内の比較可能な領域とは配列が異なる、ｕｒｅＸ及びｕ
ｒｅＹコーディング配列並びに非コーディング遺伝子間
配列の多くの領域から容易に選択されうる。一般的な核
酸相同性レベルの決定及びヌクレオチド配列の比較に適
した多くのアルゴリズムのうちの一つは、「クラスタル
（Ｃｌｕｓｔａｌ）Ｗ」として既知である。それは、Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２２：４
６７３−４６８０（１９９４）にトンプソン（Ｔｈｏｍ
ｐｓｏｎ）らにより記載されている。このプログラム
は、インターネット上のいくつかのサイトに見出され
る。このプログラムのより最近の代替物は、例えば、サ
イエンティフィックアンドエデュケーショナルソフトウ
ェア（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ａｎｄ Ｅｄｕｃａｔｉ
ｏｎａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）（Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ７２０
４５ Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ２７７２２−２０４５，ＵＳ
Ａ）から入手可能なアラインプラスフォーウィンドウズ
（Ａｌｉｇｎ Ｐｌｕｓ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ）で
ある。図１の通り、ｕｒｅＸ又はｕｒｅＹに特異的な可
能性のあるＰＣＲプライマーを、極めて多数見出すこと
ができる。極めて特異的なＰＣＲプローブ対は、例え
ば、５’に位置する配列ＣＡＴＧＣＡＣＴＴＴＴＴＧＡ
ＡＡＡＡＡＧＡ（配列番号１６）及び３’に位置する配
列ＴＡＴＧＧＴＧＧＴＣＴＴＣＴＣＴ（配列番号１７）
である。当然、ｕｒｅＸもしくはＹ又は遺伝子間領域に
特異的なその他の多くの配列が適している。標準的なＰ
ＣＲ参考書は、ｕｒｅＸ又はｕｒｅＹとの選択的なＰＣ
Ｒ反応のためのプローブの妥当性を決定するための方法
を与えている。ＰＣＲ技術は、（Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃ
ｈ＆Ｄｒｅｋｓｌｅｒ；ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒｓ，ａ
ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，ＩＳＢＮ０−８
７９６９−４４７−５（１９９５））に詳細に記載され
ている。
動物から単離された細菌ＤＮＡと、ｕｒｅＸ又はＹ遺伝
子の配列に基づく特異的なプローブ又はＰＣＲプライマ
ーとの反応に基づいている。Ｈ．フェリスＤＮＡが動物
に存在する場合には、これは、例えばｕｒｅＸ又はＹ特
異的ＰＣＲプライマーと特異的に結合し、その後、ＰＣ
Ｒ反応において増幅されるであろう。次いで、ＰＣＲ反
応産物は、ＤＮＡゲル電気泳動において容易に検出され
うる。ＤＮＡは、試験すべき動物の消化管上部のスワブ
又は唾液に存在する微生物から最も容易に単離されう
る。特異的プライマーは、ｕｒｅＡＢコーディング配列
内の比較可能な領域とは配列が異なる、ｕｒｅＸ及びｕ
ｒｅＹコーディング配列並びに非コーディング遺伝子間
配列の多くの領域から容易に選択されうる。一般的な核
酸相同性レベルの決定及びヌクレオチド配列の比較に適
した多くのアルゴリズムのうちの一つは、「クラスタル
（Ｃｌｕｓｔａｌ）Ｗ」として既知である。それは、Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２２：４
６７３−４６８０（１９９４）にトンプソン（Ｔｈｏｍ
ｐｓｏｎ）らにより記載されている。このプログラム
は、インターネット上のいくつかのサイトに見出され
る。このプログラムのより最近の代替物は、例えば、サ
イエンティフィックアンドエデュケーショナルソフトウ
ェア（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ａｎｄ Ｅｄｕｃａｔｉ
ｏｎａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）（Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ７２０
４５ Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ２７７２２−２０４５，ＵＳ
Ａ）から入手可能なアラインプラスフォーウィンドウズ
（Ａｌｉｇｎ Ｐｌｕｓ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ）で
ある。図１の通り、ｕｒｅＸ又はｕｒｅＹに特異的な可
能性のあるＰＣＲプライマーを、極めて多数見出すこと
ができる。極めて特異的なＰＣＲプローブ対は、例え
ば、５’に位置する配列ＣＡＴＧＣＡＣＴＴＴＴＴＧＡ
ＡＡＡＡＡＧＡ（配列番号１６）及び３’に位置する配
列ＴＡＴＧＧＴＧＧＴＣＴＴＣＴＣＴ（配列番号１７）
である。当然、ｕｒｅＸもしくはＹ又は遺伝子間領域に
特異的なその他の多くの配列が適している。標準的なＰ
ＣＲ参考書は、ｕｒｅＸ又はｕｒｅＹとの選択的なＰＣ
Ｒ反応のためのプローブの妥当性を決定するための方法
を与えている。ＰＣＲ技術は、（Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃ
ｈ＆Ｄｒｅｋｓｌｅｒ；ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒｓ，ａ
ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，ＩＳＢＮ０−８
７９６９−４４７−５（１９９５））に詳細に記載され
ている。
【００５０】もう一つのＤＮＡ型テストは、スワブから
得られた細菌物質の増殖、それに続く古典的なＤＮＡ精
製、それに続く放射性又は色素で標識されたｕｒｅＸＹ
特異的ＤＮＡ断片との古典的ハイブリダイゼーションに
基づく。Ｈ．フェリス及びその他のヘリコバクター種、
両方のｕｒｅＸＹコーディング領域とｕｒｅＡＢコーデ
ィング領域との間の相同性は極めて低いため、ハイブリ
ダイゼーションは、Ｈ．フェリスの存在又は欠如を明確
に示す。ＰＣＲ反応及びハイブリダイゼーション反応
は、いずれも、当分野において周知であり、特に、Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ／Ｓａｍｂｒｏｏｋ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，
Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎ
ｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，ＩＳＢ
Ｎ０−８７９６９−３０９−６）に記載されている。Ｐ
ＣＲプライマーによる選択的検出又はｕｒｅＸＹ特異的
ＤＮＡ断片との古典的ハイブリダイゼーションは、好ま
しくは短い断片を用いて実施されるが、実用的な理由か
ら、好ましくは配列番号１の少なくとも１０連続ヌクレ
オチドのストレッチからなる断片を用いて実施されう
る。ハイブリダイゼーション実験には、ヘリコバクター
ｕｒｅＡ又はｕｒｅＢサブユニットをコードする配列と
の相同性よりも、配列番号１との相同性の方が高いプロ
ーブを選択する必要がある。そのようなプローブは、前
記のようなアラインプラスフォーウィンドウズ（Ａｌｉ
ｇｎ Ｐｌｕｓ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ）プログラム
又はクラスタルＷプログラムを利用して、極めて容易に
選択されうる。比較ハイブリダイゼーション実験におい
て、診断すべきＤＮＡは、例えばＨ．ピロリＤＮＡの隣
でテストされうる。ｕｒｅＡＢをコードする遺伝子との
相同性よりも配列番号１との相同性の方が高い、本発明
に係るプローブは、他のヘリコバクター種のＤＮＡより
も、Ｈ．フェリスＤＮＡ（試料中に存在する場合）と強
く結合し、従って、テストすべき試料中のＨ．フェリス
ＤＮＡの存在を特異的に示すであろう。前記の配列番号
１６又は１７の配列は、標識し、その後、記載されたよ
うなＨ．フェリス特異的ハイブリダイゼーション・アッ
セイにおいて使用するために極めて適しているプローブ
の例にすぎない。
得られた細菌物質の増殖、それに続く古典的なＤＮＡ精
製、それに続く放射性又は色素で標識されたｕｒｅＸＹ
特異的ＤＮＡ断片との古典的ハイブリダイゼーションに
基づく。Ｈ．フェリス及びその他のヘリコバクター種、
両方のｕｒｅＸＹコーディング領域とｕｒｅＡＢコーデ
ィング領域との間の相同性は極めて低いため、ハイブリ
ダイゼーションは、Ｈ．フェリスの存在又は欠如を明確
に示す。ＰＣＲ反応及びハイブリダイゼーション反応
は、いずれも、当分野において周知であり、特に、Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ／Ｓａｍｂｒｏｏｋ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，
Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎ
ｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，ＩＳＢ
Ｎ０−８７９６９−３０９−６）に記載されている。Ｐ
ＣＲプライマーによる選択的検出又はｕｒｅＸＹ特異的
ＤＮＡ断片との古典的ハイブリダイゼーションは、好ま
しくは短い断片を用いて実施されるが、実用的な理由か
ら、好ましくは配列番号１の少なくとも１０連続ヌクレ
オチドのストレッチからなる断片を用いて実施されう
る。ハイブリダイゼーション実験には、ヘリコバクター
ｕｒｅＡ又はｕｒｅＢサブユニットをコードする配列と
の相同性よりも、配列番号１との相同性の方が高いプロ
ーブを選択する必要がある。そのようなプローブは、前
記のようなアラインプラスフォーウィンドウズ（Ａｌｉ
ｇｎ Ｐｌｕｓ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ）プログラム
又はクラスタルＷプログラムを利用して、極めて容易に
選択されうる。比較ハイブリダイゼーション実験におい
て、診断すべきＤＮＡは、例えばＨ．ピロリＤＮＡの隣
でテストされうる。ｕｒｅＡＢをコードする遺伝子との
相同性よりも配列番号１との相同性の方が高い、本発明
に係るプローブは、他のヘリコバクター種のＤＮＡより
も、Ｈ．フェリスＤＮＡ（試料中に存在する場合）と強
く結合し、従って、テストすべき試料中のＨ．フェリス
ＤＮＡの存在を特異的に示すであろう。前記の配列番号
１６又は１７の配列は、標識し、その後、記載されたよ
うなＨ．フェリス特異的ハイブリダイゼーション・アッ
セイにおいて使用するために極めて適しているプローブ
の例にすぎない。
【００５１】従って、本発明の一つの実施形態は、特異
的なヘリコバクターＵｒｅＸ及びＵｒｅＹサブユニット
・ポリペプチドをコードするＤＮＡの検出のための診断
テストに関する。そのようなテストは、ＵｒｅＸ及びＵ
ｒｅＹをコードするＤＮＡ、又はＵｒｅＸとＵｒｅＹと
の間の遺伝子間領域に特異的な、本発明に係る核酸配列
又はそれらの断片を含む。そのＤＮＡに特異的な断片
は、ＵｒｅＡ及びＵｒｅＢをコードするＤＮＡ、又はＵ
ｒｅＡとＵｒｅＢとの間の遺伝子間領域よりも、Ｕｒｅ
Ｘ及びＵｒｅＹをコードするＤＮＡ、又はＵｒｅＸとＵ
ｒｅＹとの間の遺伝子間領域と、強く結合する断片であ
る。
的なヘリコバクターＵｒｅＸ及びＵｒｅＹサブユニット
・ポリペプチドをコードするＤＮＡの検出のための診断
テストに関する。そのようなテストは、ＵｒｅＸ及びＵ
ｒｅＹをコードするＤＮＡ、又はＵｒｅＸとＵｒｅＹと
の間の遺伝子間領域に特異的な、本発明に係る核酸配列
又はそれらの断片を含む。そのＤＮＡに特異的な断片
は、ＵｒｅＡ及びＵｒｅＢをコードするＤＮＡ、又はＵ
ｒｅＡとＵｒｅＢとの間の遺伝子間領域よりも、Ｕｒｅ
Ｘ及びＵｒｅＹをコードするＤＮＡ、又はＵｒｅＸとＵ
ｒｅＹとの間の遺伝子間領域と、強く結合する断片であ
る。
【００５２】ヘリコバクター・フェリスＤＮＡの検出法
は、テストすべきＤＮＡとＵｒｅＸ又はＹ ＤＮＡとの
ハイブリダイゼーション、又はテストすべきＤＮＡのＵ
ｒｅＸ又はＹ ＤＮＡ特異的プローブによるＰＣＲ反応
を含む。
は、テストすべきＤＮＡとＵｒｅＸ又はＹ ＤＮＡとの
ハイブリダイゼーション、又はテストすべきＤＮＡのＵ
ｒｅＸ又はＹ ＤＮＡ特異的プローブによるＰＣＲ反応
を含む。
【００５３】血清中のヘリコバクター・フェリス抗体の
検出のための２）の診断テストは、例えば、精製された
本発明に係るＵｒｅＸもしくはＵｒｅＹサブユニット・
ポリペプチド又はそれらの抗原性断片を、ＥＬＩＳＡプ
レートのウェルの壁にコーティングする、単純なサンド
イッチＥＬＩＳＡテストである。そのような抗体の検出
のための方法は、例えば、精製されたＵｒｅＸ又はＹポ
リペプチドを、試験すべき哺乳動物由来の血清と共にイ
ンキュベートし、それに続き、例えば関連哺乳動物抗体
に対する標識抗体と共にインキュベートする方法であ
る。次いで、呈色反応により、ヘリコバクター・フェリ
スウレアーゼＸＹに対する抗体の存在又は欠如を明らか
にすることができる。使用される標識抗体によっては、
この系の選択性は、非ＸＹ特異的反応を回避するため、
試験すべき血清をウレアーゼＡＢと共にプレインキュベ
ートし、それに続き、沈殿物の遠心分離を行うことによ
り改善されうる。本発明に係るＵｒｅＸ又はＵｒｅＹ構
造サブユニットの抗原性断片をコーティングに使用する
場合には、プレインキュベーション工程を省略すること
ができる。
検出のための２）の診断テストは、例えば、精製された
本発明に係るＵｒｅＸもしくはＵｒｅＹサブユニット・
ポリペプチド又はそれらの抗原性断片を、ＥＬＩＳＡプ
レートのウェルの壁にコーティングする、単純なサンド
イッチＥＬＩＳＡテストである。そのような抗体の検出
のための方法は、例えば、精製されたＵｒｅＸ又はＹポ
リペプチドを、試験すべき哺乳動物由来の血清と共にイ
ンキュベートし、それに続き、例えば関連哺乳動物抗体
に対する標識抗体と共にインキュベートする方法であ
る。次いで、呈色反応により、ヘリコバクター・フェリ
スウレアーゼＸＹに対する抗体の存在又は欠如を明らか
にすることができる。使用される標識抗体によっては、
この系の選択性は、非ＸＹ特異的反応を回避するため、
試験すべき血清をウレアーゼＡＢと共にプレインキュベ
ートし、それに続き、沈殿物の遠心分離を行うことによ
り改善されうる。本発明に係るＵｒｅＸ又はＵｒｅＹ構
造サブユニットの抗原性断片をコーティングに使用する
場合には、プレインキュベーション工程を省略すること
ができる。
【００５４】診断テスト系のもう一つの例は、例えば、
本発明に係るＵｒｅＸもしくはＵｒｅＹポリペプチド又
はそれらの抗原性断片を含むウェスタンブロットと、テ
ストすべき哺乳動物の血清とのインキュベーション、そ
れに続くブロットの分析である。ＥＬＩＳＡプレートの
コーティング又はウェスタンブロッティングに適した、
精製された本発明に係るＵｒｅＸもしくはＵｒｅＹ構造
サブユニット又はそれらの抗原性断片は、ｕｒｅＡ及び
Ｂについてフェレロ（Ｆｅｒｒｅｒｏ ｅｔａｌ．，Ｍ
ｏｌｅｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９，３２３−３３３
（１９９３））が記載したような、ｕｒｅＸ及びｕｒｅ
Ｙ遺伝子の発現により容易に入手されうる。
本発明に係るＵｒｅＸもしくはＵｒｅＹポリペプチド又
はそれらの抗原性断片を含むウェスタンブロットと、テ
ストすべき哺乳動物の血清とのインキュベーション、そ
れに続くブロットの分析である。ＥＬＩＳＡプレートの
コーティング又はウェスタンブロッティングに適した、
精製された本発明に係るＵｒｅＸもしくはＵｒｅＹ構造
サブユニット又はそれらの抗原性断片は、ｕｒｅＡ及び
Ｂについてフェレロ（Ｆｅｒｒｅｒｏ ｅｔａｌ．，Ｍ
ｏｌｅｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９，３２３−３３３
（１９９３））が記載したような、ｕｒｅＸ及びｕｒｅ
Ｙ遺伝子の発現により容易に入手されうる。
【００５５】又、本発明は、血清と、本発明に係るＵｒ
ｅＸもしくはＵｒｅＹポリペプチド又はそれらの抗原性
断片とのインキュベーションを含む、ヘリコバクター・
フェリス抗体に対する抗体の血清中の検出のための方法
に関する。
ｅＸもしくはＵｒｅＹポリペプチド又はそれらの抗原性
断片とのインキュベーションを含む、ヘリコバクター・
フェリス抗体に対する抗体の血清中の検出のための方法
に関する。
【００５６】ヘリコバクター・フェリス抗原の特異的Ｕ
ｒｅＸ及びＵｒｅＹ構造サブユニットの抗原性物質の検
出に基づいており、従って、ヘリコバクター・フェリス
感染の検出に適した３）の診断テストは、標準的なＥＬ
ＩＳＡテストでありうる。そのような試験の一つの例に
おいては、ＥＬＩＳＡプレートのウェルの壁に、ヘリコ
バクター・フェリスの特異的ＵｒｅＸ及びＵｒｅＹ構造
サブユニットに対する抗体をコーティングする。試験す
べき抗原性物質は、必要に応じて、ＵｒｅＡ及びＢに対
する抗体とプレインキュベートされうる。これにより、
ＵｒｅＸ及びＹ特異的エピトープはカバーされず、従っ
て、プレインキュベートされたヘリコバクター種は、Ｕ
ｒｅＸ又はＹを含む場合にのみ、即ち特異的にヘリコバ
クター・フェリスである場合にのみ、ＥＬＩＳＡプレー
トと結合するであろう。ＵｒｅＸ又はＹに特異的であ
り、ＵｒｅＡ又はＢとは反応しないモノクローナル抗体
の使用は、プレインキュベーション工程を不要とするた
め、そのようなテストにおける好ましい抗体である。そ
のようなモノクローナル抗体は、当分野において既知の
技術により、本発明に係るＵｒｅＸ又はＹの免疫感作断
片で、近交系マウスを免疫感作することにより容易に得
ることができる（下記Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄＭｉｌｓｔ
ｅｉｎ論文参照）。
ｒｅＸ及びＵｒｅＹ構造サブユニットの抗原性物質の検
出に基づいており、従って、ヘリコバクター・フェリス
感染の検出に適した３）の診断テストは、標準的なＥＬ
ＩＳＡテストでありうる。そのような試験の一つの例に
おいては、ＥＬＩＳＡプレートのウェルの壁に、ヘリコ
バクター・フェリスの特異的ＵｒｅＸ及びＵｒｅＹ構造
サブユニットに対する抗体をコーティングする。試験す
べき抗原性物質は、必要に応じて、ＵｒｅＡ及びＢに対
する抗体とプレインキュベートされうる。これにより、
ＵｒｅＸ及びＹ特異的エピトープはカバーされず、従っ
て、プレインキュベートされたヘリコバクター種は、Ｕ
ｒｅＸ又はＹを含む場合にのみ、即ち特異的にヘリコバ
クター・フェリスである場合にのみ、ＥＬＩＳＡプレー
トと結合するであろう。ＵｒｅＸ又はＹに特異的であ
り、ＵｒｅＡ又はＢとは反応しないモノクローナル抗体
の使用は、プレインキュベーション工程を不要とするた
め、そのようなテストにおける好ましい抗体である。そ
のようなモノクローナル抗体は、当分野において既知の
技術により、本発明に係るＵｒｅＸ又はＹの免疫感作断
片で、近交系マウスを免疫感作することにより容易に得
ることができる（下記Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄＭｉｌｓｔ
ｅｉｎ論文参照）。
【００５７】前記のようにして発現させた本発明に係る
ポリペプチド又はそれらの免疫原性断片は、ポリクロー
ナルであっても、単一特異的もしくはモノクローナルで
あってもよい抗体（又はそれらの誘導体）を製造するた
めに使用されうる。ポリクローナル抗体が望ましい場
合、ポリクローナル血清を製造し、加工する技術は、当
分野において周知である（例えば、Ｍａｙｅｒ ａｎｄ
Ｗａｌｔｅｒ，Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）。本発明に係るポリペプ
チド（又はそれらの異型又は断片）と反応する、本発明
に係るモノクローナル抗体は、やはり当分野において既
知の技術により近交系マウスを免疫感作することにより
調製されうる（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄＭｉｌｓｔｅｉ
ｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７，１９７
５）。
ポリペプチド又はそれらの免疫原性断片は、ポリクロー
ナルであっても、単一特異的もしくはモノクローナルで
あってもよい抗体（又はそれらの誘導体）を製造するた
めに使用されうる。ポリクローナル抗体が望ましい場
合、ポリクローナル血清を製造し、加工する技術は、当
分野において周知である（例えば、Ｍａｙｅｒ ａｎｄ
Ｗａｌｔｅｒ，Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）。本発明に係るポリペプ
チド（又はそれらの異型又は断片）と反応する、本発明
に係るモノクローナル抗体は、やはり当分野において既
知の技術により近交系マウスを免疫感作することにより
調製されうる（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄＭｉｌｓｔｅｉ
ｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７，１９７
５）。
【００５８】最後に、本発明は、血清、組織又は体液
を、本発明に係るＵｒｅＸもしくはＵｒｅＹポリペプチ
ド又はそれらの断片に対する抗体と共にインキュベート
することを含む、ヘリコバクター・フェリス由来の抗原
性物質の検出のための方法に関する。
を、本発明に係るＵｒｅＸもしくはＵｒｅＹポリペプチ
ド又はそれらの断片に対する抗体と共にインキュベート
することを含む、ヘリコバクター・フェリス由来の抗原
性物質の検出のための方法に関する。
【００５９】実施例１ ヘリコバクター・フェリスＣＳ１株のｕｒｅＸ及びｕｒ
ｅＹ遺伝子：大腸菌におけるクローニング及び発現 以下のようにして、Ｈ．フェリスＣＳ１株のｕｒｅＸ及
びｕｒｅＹ遺伝子を、大腸菌Ｔ７発現ベクターｐＥＴ３
ａにオペロンとしてクローニングした。ｐＥＴ３ａ（Ｎ
ｏｖａｇｅｎ、６０１ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，
ＭａｄｉｓｏｎＷＩ，ＵＳＡ）におけるＵｒｅＸ及びＹ
タンパク質の適切な発現のため、遺伝子をＮｄｅＩ−Ｂ
ａｍＨＩ ＤＮＡ断片として、このベクターのＮｄｅＩ
−ＢａｍＨＩにクローニングした。ウレアーゼＸＹオペ
ロンは、内部ＮｄｅＩ部位を含有しており、それに、２
つのＰＣＲ断片のオーバーラップ伸長ＰＣＲにより突然
変異を導入した。その目的のため、２つのＰＣＲ断片
（５’及び３’産物）を、Ｈ．フェリスＣＳ１の染色体
ＤＮＡを鋳型として使用して増幅した。５’ＰＣＲ産物
は、完全なｕｒｅＸ遺伝子及びｕｒｅＹ遺伝子の最初の
部分を含有していた。順向きプライマーは、ＮｄｅＩ制
限部位及びｕｒｅＸの開始コドンを含有しており（ＧＧ
ＡＧＴＡＡＣＡＴＡＴＧＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＣＣＡＡ
ＡＧＡＧＣ）（配列番号１８）、逆向きプライマーは、
点突然変異を含有している（ＣＡＣＡＣＣＣＡＣＧＡＣ
ＣＡＴＧＴＧＡＧＧＧＣＴＴＡＣ）（配列番号１９）。
第二の３’ＰＣＲ産物は、ｕｒｅＹ遺伝子の３’末から
なっていた。この順向きプライマーは、第一ＰＣＲ産物
の逆向きプライマーと相補的であり、同一の点突然変異
も含有しており（ＧＴＡＡＧＣＣＣＴＣＡＣＡＴＧＧＴ
ＣＧＴＧＧＧＴＧＴＧ）（配列番号２０）、逆向きプラ
イマーは、ｕｒｅＹ遺伝子の終止コドンの直下流にＢａ
ｍＨＩ制限部位を含有していた（ＣＧＡＡＴＴＣＧＧＡ
ＴＣＣＴＡＧＡＡＧＡＡＡＧＴＧＴＡＧＣＧＣＴＧＧ）
（配列番号２１）。ｕｒｅＹ内の内部ＮｄｅＩ部位を欠
失させるための突然変異を、相補的プライマー内に作成
し、それは、ＣＡＴＡＴＧ（Ｈｉｓ−Ｍｅｔ）をＣＡＣ
ＡＴＧ（Ｈｉｓ−Ｍｅｔ）に交換した。両ＰＣＲ産物の
増幅後、両ＰＣＲ産物を鋳型として使用した、ｕｒｅＸ
の順向きプライマー及びｕｒｅＹの逆向きプライマーに
よるオーバーラップ伸長ＰＣＲにより、完全なオペロン
を得た。得られたＰＣＲ産物を、ＰＣＲ−ｂｌｕｎｔｌ
ｌ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ
２３１２，９７０４ＣＨ Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ，Ｔｈｅ
Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄ）へクローニングし、大腸菌Ｔ
ＯＰ１０Ｆ’細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へ形質転換
した。陽性クローンを単離し、ウレアーゼＸＹ遺伝子を
ｐＥＴ３ａにＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩを用いてサブクロー
ニングした。得られたプラスミドをｐＵｒｅＸＹ−１と
命名し、発現株ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳ
（Ｎｏｖａｇｅｎ）へと形質転換した。
ｅＹ遺伝子：大腸菌におけるクローニング及び発現 以下のようにして、Ｈ．フェリスＣＳ１株のｕｒｅＸ及
びｕｒｅＹ遺伝子を、大腸菌Ｔ７発現ベクターｐＥＴ３
ａにオペロンとしてクローニングした。ｐＥＴ３ａ（Ｎ
ｏｖａｇｅｎ、６０１ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，
ＭａｄｉｓｏｎＷＩ，ＵＳＡ）におけるＵｒｅＸ及びＹ
タンパク質の適切な発現のため、遺伝子をＮｄｅＩ−Ｂ
ａｍＨＩ ＤＮＡ断片として、このベクターのＮｄｅＩ
−ＢａｍＨＩにクローニングした。ウレアーゼＸＹオペ
ロンは、内部ＮｄｅＩ部位を含有しており、それに、２
つのＰＣＲ断片のオーバーラップ伸長ＰＣＲにより突然
変異を導入した。その目的のため、２つのＰＣＲ断片
（５’及び３’産物）を、Ｈ．フェリスＣＳ１の染色体
ＤＮＡを鋳型として使用して増幅した。５’ＰＣＲ産物
は、完全なｕｒｅＸ遺伝子及びｕｒｅＹ遺伝子の最初の
部分を含有していた。順向きプライマーは、ＮｄｅＩ制
限部位及びｕｒｅＸの開始コドンを含有しており（ＧＧ
ＡＧＴＡＡＣＡＴＡＴＧＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＣＣＡＡ
ＡＧＡＧＣ）（配列番号１８）、逆向きプライマーは、
点突然変異を含有している（ＣＡＣＡＣＣＣＡＣＧＡＣ
ＣＡＴＧＴＧＡＧＧＧＣＴＴＡＣ）（配列番号１９）。
第二の３’ＰＣＲ産物は、ｕｒｅＹ遺伝子の３’末から
なっていた。この順向きプライマーは、第一ＰＣＲ産物
の逆向きプライマーと相補的であり、同一の点突然変異
も含有しており（ＧＴＡＡＧＣＣＣＴＣＡＣＡＴＧＧＴ
ＣＧＴＧＧＧＴＧＴＧ）（配列番号２０）、逆向きプラ
イマーは、ｕｒｅＹ遺伝子の終止コドンの直下流にＢａ
ｍＨＩ制限部位を含有していた（ＣＧＡＡＴＴＣＧＧＡ
ＴＣＣＴＡＧＡＡＧＡＡＡＧＴＧＴＡＧＣＧＣＴＧＧ）
（配列番号２１）。ｕｒｅＹ内の内部ＮｄｅＩ部位を欠
失させるための突然変異を、相補的プライマー内に作成
し、それは、ＣＡＴＡＴＧ（Ｈｉｓ−Ｍｅｔ）をＣＡＣ
ＡＴＧ（Ｈｉｓ−Ｍｅｔ）に交換した。両ＰＣＲ産物の
増幅後、両ＰＣＲ産物を鋳型として使用した、ｕｒｅＸ
の順向きプライマー及びｕｒｅＹの逆向きプライマーに
よるオーバーラップ伸長ＰＣＲにより、完全なオペロン
を得た。得られたＰＣＲ産物を、ＰＣＲ−ｂｌｕｎｔｌ
ｌ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ
２３１２，９７０４ＣＨ Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ，Ｔｈｅ
Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄ）へクローニングし、大腸菌Ｔ
ＯＰ１０Ｆ’細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へ形質転換
した。陽性クローンを単離し、ウレアーゼＸＹ遺伝子を
ｐＥＴ３ａにＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩを用いてサブクロー
ニングした。得られたプラスミドをｐＵｒｅＸＹ−１と
命名し、発現株ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳ
（Ｎｏｖａｇｅｎ）へと形質転換した。
【００６０】以下のようにして、ｐＵｒｅＸＹ−１のｕ
ｒｅＸ遺伝子及びｕｒｅＹ遺伝子をＨＭＳ１７４（ＤＥ
３）／ｐＬｙｓＳにおいて発現させた。一夜培養物をＴ
ＢＡｍｐ１００Ｃａｍ２５で１／１００に希釈し、この
培養物を３７℃で２００ｒｐｍで３時間インキュベート
した。１ｍＭのＩＰＴＧを添加することにより培養物を
誘導し、２００ｒｐｍで３７℃でさらに３時間インキュ
ベートした。誘導を、小規模で１回、大規模で１回、計
２回実施した。誘導した試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル
で分析した（図２）。レーン９に明確に見られるよう
に、誘導した場合のＵｒｅＸ及びＵｒｅＹの発現は、２
つの構造サブユニットを、ＵｒｅＸサブユニットについ
ては２５ｋＤａ、ＵｒｅＹサブユニットについては６２
ｋＤａの分子量を有するポリペプチド・バンドとして提
供する。
ｒｅＸ遺伝子及びｕｒｅＹ遺伝子をＨＭＳ１７４（ＤＥ
３）／ｐＬｙｓＳにおいて発現させた。一夜培養物をＴ
ＢＡｍｐ１００Ｃａｍ２５で１／１００に希釈し、この
培養物を３７℃で２００ｒｐｍで３時間インキュベート
した。１ｍＭのＩＰＴＧを添加することにより培養物を
誘導し、２００ｒｐｍで３７℃でさらに３時間インキュ
ベートした。誘導を、小規模で１回、大規模で１回、計
２回実施した。誘導した試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル
で分析した（図２）。レーン９に明確に見られるよう
に、誘導した場合のＵｒｅＸ及びＵｒｅＹの発現は、２
つの構造サブユニットを、ＵｒｅＸサブユニットについ
ては２５ｋＤａ、ＵｒｅＹサブユニットについては６２
ｋＤａの分子量を有するポリペプチド・バンドとして提
供する。
【００６１】
【００６２】
【化１】
【図１ａ】図１ａ（１〜４）：ヘリコバクター・フェリ
ス種、ＣＳ１、Ｋｕｋｋａ、Ｄｓ４、２３０１及び３９
０に由来する、２つのコーディング配列をつなぐ短い非
コーディング領域を含むＵｒｅＸ及びＹをコードする核
酸配列と、ヘリコバクター・フェリス、ピロリ及びヘイ
ルマンニに由来する、２つのコーディング配列をつなぐ
短い非コーディング領域を含むＵｒｅＡ及びＢをコード
する核酸配列との比較を示す図である。
ス種、ＣＳ１、Ｋｕｋｋａ、Ｄｓ４、２３０１及び３９
０に由来する、２つのコーディング配列をつなぐ短い非
コーディング領域を含むＵｒｅＸ及びＹをコードする核
酸配列と、ヘリコバクター・フェリス、ピロリ及びヘイ
ルマンニに由来する、２つのコーディング配列をつなぐ
短い非コーディング領域を含むＵｒｅＡ及びＢをコード
する核酸配列との比較を示す図である。
【図１ｂ】図１ｂ：ヘリコバクター・フェリス種、ＣＳ
１、Ｋｕｋｋａ、Ｄｓ４、２３０１及び３９０に由来す
るＵｒｅＸのアミノ酸配列と、ヘリコバクター・フェリ
ス、ピロリ及びヘイルマンニに由来するＵｒｅＡをコー
ドするアミノ酸配列との比較を示す図である。
１、Ｋｕｋｋａ、Ｄｓ４、２３０１及び３９０に由来す
るＵｒｅＸのアミノ酸配列と、ヘリコバクター・フェリ
ス、ピロリ及びヘイルマンニに由来するＵｒｅＡをコー
ドするアミノ酸配列との比較を示す図である。
【図１ｃ】図１ｃ（１〜２）：ヘリコバクター・フェリ
ス種、ＣＳ１、Ｋｕｋｋａ、Ｄｓ４、２３０１及び３９
０に由来するＵｒｅＹのアミノ酸配列と、ヘリコバクタ
ー・フェリス、ピロリ及びヘイルマンニに由来するＵｒ
ｅＢをコードするアミノ酸配列との比較を示す図であ
る。
ス種、ＣＳ１、Ｋｕｋｋａ、Ｄｓ４、２３０１及び３９
０に由来するＵｒｅＹのアミノ酸配列と、ヘリコバクタ
ー・フェリス、ピロリ及びヘイルマンニに由来するＵｒ
ｅＢをコードするアミノ酸配列との比較を示す図であ
る。
【図２】発現産物ＵｒｅＸ及びＵｒｅＹのポリアクリル
アミドゲルを示す図である。レーン７：バイオラド（Ｂ
ｉｏｒａｄ）広域マーカーレーン８：誘導前の完全細胞
培養物（小規模培養物）レーン９：誘導後の完全細胞培
養物（小規模培養物）レーン１０：誘導後の完全細胞培
養物（大規模培養物）レーン１１：誘導後の上清（大規
模培養物）レーン１２：バイオラドプレ染色マーカー
アミドゲルを示す図である。レーン７：バイオラド（Ｂ
ｉｏｒａｄ）広域マーカーレーン８：誘導前の完全細胞
培養物（小規模培養物）レーン９：誘導後の完全細胞培
養物（小規模培養物）レーン１０：誘導後の完全細胞培
養物（大規模培養物）レーン１１：誘導後の上清（大規
模培養物）レーン１２：バイオラドプレ染色マーカー
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/175 Ａ６１Ｋ 39/235 ４Ｃ０８４ 39/23 39/39 ４Ｃ０８５ 39/235 39/395 Ｄ 39/39 Ａ６１Ｐ 1/04 39/395 31/04 Ａ６１Ｐ 1/04 Ｃ１２Ｎ 1/15 31/04 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 9/80 Ｚ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 9/80 33/50 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/68 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｍ 33/50 33/566 33/53 33/569 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:01 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/569 5/00 Ａ //(Ｃ１２Ｎ 9/80 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BA11 BB50 DA12 DA13 DA36 FB02 4B024 AA01 AA13 BA14 BA31 CA04 DA02 DA05 DA12 EA04 FA02 GA11 HA12 HA15 4B050 CC03 DD02 LL01 LL03 4B063 QA19 QQ44 QR08 QR42 QR56 QS25 QS34 QX02 4B065 AA01X AA01Y AA26X AA57X AA72X AA90X AB01 BA02 CA31 CA43 CA46 4C084 AA02 AA07 BA19 CA04 DC50 NA14 ZA68 ZB35 4C085 AA03 AA13 AA38 BA20 BA45 BA51 BA75 BA77 CC07 CC08 DD86 EE01 EE03 EE06
Claims (22)
- 【請求項１】 ヘリコバクター・フェリス（Ｈｅｌｉｃ
ｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｌｉｓ）により発現されるような
ウレアーゼ複合体の２つのサブユニット・ポリペプチド
をコードし、かつ配列番号１と少なくとも８５％の相同
性を有する核酸配列、又は該サブユニットのうちの一つ
の免疫原性断片を少なくともコードし、かつ少なくとも
４０ヌクレオチド、好ましくは４５ヌクレオチド、より
好ましくは５０ヌクレオチドの長さを有するその一部。 - 【請求項２】 ウレアーゼＸサブユニット・ポリペプチ
ド又はウレアーゼＹサブユニット・ポリペプチドをコー
ドすることを特徴とする、請求項１に記載の核酸配列。 - 【請求項３】 配列番号１と少なくとも９０％、好まし
くは９４％、より好ましくは９７％の相同性を有するこ
とを特徴とする、請求項１又は２に記載の核酸配列。 - 【請求項４】 請求項１〜３に記載の核酸配列を含むＤ
ＮＡ断片。 - 【請求項５】 機能的に連結したプロモーターの調節下
で、請求項１〜３に記載の核酸配列又は請求項４に記載
のＤＮＡ断片を含む組換えＤＮＡ分子。 - 【請求項６】 請求項５に記載の組換えＤＮＡ分子を含
む組換え生キャリアー。 - 【請求項７】 請求項１〜３に記載の核酸配列、請求項
４に記載のＤＮＡ断片、請求項５に記載の組換えＤＮＡ
分子、又は請求項６に記載の組換え生キャリアーを含む
宿主細胞。 - 【請求項８】 配列番号２と少なくとも８５％相同なア
ミノ酸配列を有するヘリコバクター・フェリス・ウレア
ーゼＸサブユニット・ポリペプチド、又は少なくとも４
０アミノ酸、好ましくは４５アミノ酸、より好ましくは
５０アミノ酸の長さを有し、かつウレアーゼＸＹに対す
る免疫応答を誘導する能力を有する該ポリペプチドの免
疫原性断片。 - 【請求項９】 配列番号２と少なくとも９０％、好まし
くは９４％、より好ましくは９７％の配列相同性を有す
る、請求項８に記載のポリペプチド、又はウレアーゼＸ
Ｙに対する免疫応答を誘導する能力を有する該ポリペプ
チドの免疫原性断片。 - 【請求項１０】 配列番号３と少なくとも８５％相同な
アミノ酸配列を有するヘリコバクター・フェリス・ウレ
アーゼＹサブユニット・ポリペプチド、又は少なくとも
４０アミノ酸、好ましくは４５アミノ酸、より好ましく
は５０アミノ酸の長さを有し、かつウレアーゼＸＹに対
する免疫応答を誘導する能力を有する、該ポリペプチド
の免疫原性断片。 - 【請求項１１】 配列番号３と少なくとも９０％、好ま
しくは９４％、より好ましくは９７％の配列相同性を有
する、請求項１０に記載のポリペプチド、又はウレアー
ゼＸＹに対する免疫応答を誘導する能力を有する該ポリ
ペプチドの免疫原性断片。 - 【請求項１２】 ワクチンにおいて使用するための、請
求項８〜１１に記載のポリペプチド。 - 【請求項１３】 ヘリコバクター・フェリス感染に対抗
するためのワクチンの製造における、請求項８〜１１に
記載のポリペプチドの使用。 - 【請求項１４】 請求項１〜３に記載の核酸配列、請求
項４に記載のＤＮＡ断片、請求項５に記載の組換えＤＮ
Ａ分子、請求項６に記載の組換え生キャリアー、請求項
７に記載の宿主細胞、又は請求項８〜１１記載のポリペ
プチドと、薬学的に許容される担体とを含むことを特徴
とする、ヘリコバクター・フェリス感染に対抗するため
のワクチン。 - 【請求項１５】 アジュバントを含むことを特徴とす
る、請求項１４に記載のワクチン。 - 【請求項１６】 哺乳動物にとって病原性のウイルスも
しくは微生物に由来する抗原、又は該抗原をコードする
遺伝情報を、さらに含むことを特徴とする、請求項１４
又は１５に記載のワクチン。 - 【請求項１７】 哺乳動物にとって病原性のウイルス又
は微生物が、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（Ｆｅｌｉｎｅ
Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｐｅｒｉｔｏｎｉｔｉｓ ｖ
ｉｒｕｓ）、ネコ免疫不全ウイルス（Ｆｅｌｉｎｅ Ｉ
ｍｍｕｎｅｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）、イヌ
及びネコのパルボウイルス（Ｃａｎｉｎｅ ａｎｄ Ｆ
ｅｌｉｎｅ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、ジステンパーウ
イルス（Ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ ｖｉｒｕｓ）、アデノウ
イルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、カリシウイルス（Ｃ
ａｌｉｃｉｖｉｒｕｓ）、ボーデテラ・ブロンキセプチ
カ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉ
ｃａ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉ
ａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、レプトスピラ・インテ
ロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａ
ｎｓ）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）及びバート
ネラ・ヘンセリ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａｈｅｎｓｅｌ
ｉ）からなる群より選択されることを特徴とする、請求
項１６に記載のワクチン。 - 【請求項１８】 請求項８〜１１に記載のポリペプチド
に対する抗体を含むことを特徴とする、ヘリコバクター
・フェリス感染に対抗するためのワクチン。 - 【請求項１９】 請求項８〜１１に記載のポリペプチド
と薬学的に許容される担体とを混合することを含む、請
求項１４〜１７に記載のワクチンを調製する方法。 - 【請求項２０】 請求項１〜３に記載の核酸配列又はそ
の断片を含むことを特徴とする、ヘリコバクター・フェ
リス特異的ＤＮＡの検出のための診断テスト。 - 【請求項２１】 請求項８〜１１に記載のポリペプチド
又はその断片を含むことを特徴とする、ヘリコバクター
・フェリスに対する抗体の検出のための診断テスト。 - 【請求項２２】 請求項８〜１１に記載のポリペプチド
又はその断片に対する抗体を含むことを特徴とする、ヘ
リコバクター・フェリスの抗原性物質の検出のための診
断テスト。
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