KR19990007828A - 헬리코박터 감염 방어 항원 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 감염 방어 헬리코박터 항원, 구체적으로 헬리코박터 피롤리 항원, 및 이 항원을 헬리코박터 피롤리 감염과 관련 있는 위십이지장 질환의 치료 또는 예방에 사용하는 방법에 관한 것이다.
Description
헬리코박터 피롤리는 인체 위의 내막을 감염시키는 그람 음성의 나선상 박테리아이다. 이 박테리아는 널리 전파되어 있어, 아마도 세계 인구의 절반을 만성적으로 감염시키고 있다. 이 박테리아는 구강-구강 또는 분변-구강 전달로 사람간에 전파되는 것이지만, 알려진 환경 저장소는 없다.
이 박테리아가 감염되면 위점막 또는 위내막에 염증을 일으킨다. 이러한 문제는 일반적으로 해결되지 않고 있고, 따라서 수십년동안 감염과 염증이 지속되는 것으로 생각된다. 종종, 이러한 염증은 여러 증상들에 관계하지는 않지만, 만성 감염은 위험성이 증가된 많은 후유증과 관련이 있다. 감염된 사람들의 상당수는 감염이 진행되면서 위가 자신의 소화 생성물에 대하여 갖고 있는 일반적인 방어 기작을 파괴하는 경우 십이지장이나 위의 소화성 궤양을 일으킨다. 또한, 장기간동안 감염되어 있으면 위벽의 선암이나 림프종을 발생시킬 위험성을 증가시킨다.
따라서, 에이치. 피롤리 감염을 예방이나 치료하므로써 만성 감염의 후유증으로부터 초래되는 상당한 치사율과 이환율을 억제할 수 있는 가능성이 있다.
초기 실험에서, 에이치.피롤리는 통상적으로 이용되는 실험용 동물을 감염시키지 않았다. 그러나, 에이치.피롤리와 상관성이 매우 큰 미생물인 헬리코박터 펠리스를 사용하여 에이치. 피롤리 감염의 실험실용 마우스 모델을 개발하였다(Lee et al., 1990; Dick-Hegedus and Lee, 1991). 이 모델은 새로운 항미생물 치료 양생법을 선별하는데 매우 유용한 것으로 입증되었다.
에이치. 펠리스는 에이치. 피롤리와 매우 유사한 DNA 상동성을 공유하는 나선형 박테리아이다. 이 박테리아는 에이치. 피롤리가 인체 위에서 집락을 형성하는 방식과 유사한 방식으로 마우스 위에서 집락을 형성한다. 주요 생태학적 적소는 위 점막이고, 집락형성은 유문동에서 주로 관찰된다. 무배아 마우스에 있어서, 에이치. 펠리스 감염은 인체 에이치. 피롤리 감염시와 매우 유사한 위염을 유도하며, 단핵 세포의 만성 염증은 다형핵성 백혈구 침윤을 동반한다. 에이치.피롤리 또는 에이치. 펠리스중 어느 한 미생물에 의해 감염되든지 에이치. 피롤리와 에이치. 펠리스 각각에 대하여 전신 체액성 면역 응답 반응의 상승이 유사한 정도로 유도되었다(Lee et al. 1990).
에이치. 펠리스 모델은 인체중의 항-에이치. 피롤리 치료시의 효능에 대한 예견성이 높은 것으로 입증되었다. 이에 따라, 에리쓰로마이신과 같은 시험관내 활성이 높은 제제로의 단독치료는, 에리쓰로마이신이 시험관내에서의 항미생물 효과는 높은데도 불구하고 인체내의 항-에이치. 피롤리 효과는 없는 것처럼 마우스내의 에이치. 펠리스에 대하여 생체내 효과를 거의 나타내지 않았다. 이와 반대로, 비스무스 화합물, 메트로니다졸 및 테트라사이클린이나 아목시실린으로의 3중 치료 양생법은 에이치. 펠리스 감염 마우스에 있어서의 매우 높은 근절율을 유도하였다(Dick-Hegedus and Lee, 1991). 이러한 치료법이 가장 성공적인 인체 항-에이치. 피롤리 양생법중의 하나이다.
또한, 에이치. 펠리스 모델은 마우스들이 감염되지 않도록 마우스를 예방하거나(Chen et al., 1992) 또는 마우스가 이미 감염되었을 때 감염이 근절되도록 마우스를 치료하기 위해(Doidge et al., 1994), 마우스에게 헬리코박터 항원을 경구 투여하여 면역화시킬 수 있다는 것을 증명하기 위해 사용되었었다. 이러한 백신중에 사용된 항원으로는 에이치. 펠리스 또는 에이치. 피롤리 유래의 붕괴된 세포 제조물 및 에이치. 피롤리 우레아제 분자 전체 또는 일부분을 발현하는 이.콜리 클론에서 생성된 에이치. 펠리스나 에이치.피롤리 유래의 박테리아 효소인 우레아제 또는 이의 서브유니트를 포함한다(Michetti et al., 1994; 국제 특허 공개 번호 WO90/04030, WO 93/07273 및 WO94/09823를 참조하라). 또한, 에이치. 피롤리의 열 쇼크 단백질(Hsp 및 HSP)은 예방적 항원인 것으로 밝혀진 바 있다(Ferrero et al. 1995).
국제 특허 공개 번호 WO 93/18150(출원 번호 PCT/EP93/00472)은 1종 이상의 재조합 에이치. 피롤리 세포독소(CT 또는 VacA), 에이치. 피롤리 세포독소-관련 면역우성 항원(CAI 또는 CagA) 또는 에이치. 피롤리 열 쇼크 단백질을, 임의적으로 에이치. 피롤리 우레아제와 함께 함유하는 백신 또는 치료용 조성물을 개시하고 있다. 국제 특허 공개 번호 WO 95/27506(출원번호 PCT/FR95/00383)은 활성성분으로서 본질적으로 정제된 에이치. 피롤리 카탈라제를 함유하는 항-에이치. 피롤리 면역 조성물을 개시하고 있고; 국제 특허 공개 번호 WO 95/14093(출원 번호 PCT/EP93/03259)은 에이치. 피롤리 또는 에이치. 펠리스 유래의 1종 이상의 우레아제 구조 폴리펩티드 및 임의적으로 헬리코박터 유래의 우레아제-관련 열 쇼크 단백질 또는 샤페로닌을 포함하는, 헬리코박터 감염에 대하여 감염 방어 항체를 유도할 수 있는 면역원성 조성물을 개시하고 있다.
에이치. 피롤리 유래의 항원을 사용하여 마우스를 에이치. 펠리스 감염으로부터 방어할 수 있다는 사실은 상기 2 종간에 교차 반응성과 교차 방어성이 있는 항원이 존재한다는 것을 제시하는 것이다. 즉, 에이치. 피롤리중에 존재하는 분자는 에이치. 펠리스상의 표적을 인식하는 마우스내에서 면역 반응을 유도할 수 있고, 이에 따라 마우스를 에이치. 펠리스 감염에 대하여 방어할 수 있다. 이러한 에이치. 피롤리 분자에 대한 면역 반응이 에이치. 펠리스 감염으로부터 마우스를 보호한다면, 이와 유사한 면역 반응으로 인간을 에이치. 피롤리 감염에 대하여 방어할 수 있을 것이거나, 이미 감염되었다면 감염을 치료할 수 있을 것이다. 우레아제는 에이치. 펠리스 마우스 모델중에서 상기와 같은 교차-방어적 분자인 것으로 입증되었다(Michetti et al. 1994).
본 발명을 진행시켜온 연구중에서 또다른 교차-반응성 및 교차-방어성 항원을 동정하기 위하여, 에이치. 피롤리 균주 유래의 DNA 라이브러리를 작제하고, 붕괴된 에이치. 펠리스 세포와 점막성 보조제로 제조된 백신을 사용하여 경구 면역시킨 마우스에서 채취한 혈청을 사용하여 선별하였고, 이로써 항-에이치. 펠리스 항체에 의해 인식되는 에이치. 피롤리 단백질을 발현하는 이.콜리 클론을 동정하고, 이어서 방어용 에이치. 피롤리 항원 단백질을 동정하고자 한다.
본 발명은 헬리코박터 감염 방어 항원, 구체적으로 에이치.피롤리 항원, 및 특히 에이치.피롤리 감염과 관련된 위십이지장 질환을 치료 또는 예방하기 위해 상기 항원을 사용하는 방법에 관한 것이다.
도 1A 및 1B와 도 2A 및 2B는 이. 콜리 XLOLR에서 발현된 클로닝된 에이치. 피롤리 단백질을 도시한 것이다;
도 1A : 4 내지 20% 구배의 SDS-폴리아크릴아미드 겔상에서 분석하고 CBB 염색으로 가시화함. 레인 M, 분자량 표준물질(kDa); 레인 1, A군; 레인 2, B군; 레인 3, C군; 레인 5, F군; 레인 6, G군; 레인 7, H군; 레인 8, 음성 대조군인 이. 콜리 XLOLR; 레인 9, 양성 대조군인 헬리코박터 피롤리 총 세포 단백질.
도 1B : 상응하는 웨스턴 블롯 샘플, 레인 순서는 패널 A에서와 동일함.
도 2A : 4 내지 20% 구배의 SDS-폴리아크릴아미드 겔상에서 분석하고 CBB 염색으로 가시화함. 레인 M, 분자량 표준물질(kDa); 레인 2, E군.
도 2B : 상응하는 웨스턴 블롯 샘플, 레인 순서는 패널 A에서와 동일함.
제 1 양태로서, 본 발명은
(i) 분자량이 약 17 kDa인 성숙한 형태로 가공되는 분자량이 약 19 kDa인 항원;
(ii) 분자량이 약 13 kDa인 항원;
(iii) 분자량이 약 36 kDa인 항원;
(iv) 분자량이 약 50 kDa인 항원;
(v) 분자량이 약 29 kDa인 항원; 및
(vi) 포유류 숙주내에서 특이적인 감염 방어 면역 반응을 유도할 수 있는 상기 항원 (i) 내지 (v) 중 어느 하나의 면역원성 단편으로 구성된 군중에서 선택된 1종 이상의 헬리코박터 항원을 적어도 부분 정제한 제조물을 함유하는, 포유류 숙주내의 헬리코박터 감염의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 항원 제조물을 제공한다.
제 2 양태로서, 본 발명은
(i) 분자량이 약 17 kDa인 성숙한 형태로 가공되는 분자량이 약 19 kDa인 항원;
(ii) 분자량이 약 13 kDa인 항원;
(iii) 분자량이 약 36 kDa인 항원;
(iv) 분자량이 약 50 kDa인 항원;
(v) 분자량이 약 29 kDa인 항원; 및
(vi) 포유류 숙주내에서 특이적인 감염 방어 면역 반응을 유도할 수 있는 상기 항원 (i) 내지 (v) 중 어느 하나의 면역원성 단편으로 구성된 군중에서 선택되는, 포유류 숙주에 있어서의 헬리코박터 감염을 치료 또는 방어하는데 사용하기 위한 분리된 헬리코박터 항원을 제공한다.
상기 항원들은 각각 항-에이치. 펠리스 항체와 반응성인 것을 추가 특징으로 한다.
바람직하게는, 상기 항원 (i)은 이후 기술되는 클론 B4.6의 추론 서열에 본질적으로 상응하는 아미노산 서열(서열 번호 10) 또는 이의 대립 유전자나 다른 변이체를 포함하고; 상기 항원 (ii)는 이후 기술되는 클론 C3.5의 추론 서열에 본질적으로 상응하는 아미노산 서열(서열 번호 2) 또는 이의 대립 유전자나 다른 변이체를 포함하며; 상기 항원 (iii)은 이후 기술되는 클론 E2.5의 추론 서열에 본질적으로 상응하는 아미노산 서열(서열 번호 4) 또는 이의 대립 유전자나 다른 변이체를 포함하고; 상기 항원 (iv)는 이후 기술되는 클론 G3.8의 추론 서열에 본질적으로 상응하는 아미노산 서열(서열 번호 6), 이의 대립 유전자나 다른 변이체를 포함하며; 상기 항원 (v)는 이후 기술되는 클론 H5.1의 추론 서열에 본질적으로 상응하는 아미노산 서열(서열 번호 8), 또는 이의 대립 유전자나 다른 변이체를 포함한다.
적합한 변이체는 그 변이체가 포유류 숙주내에서 특이적인 감염 방어 면역 반응을 유도할 수만 있다면, 상기 언급한 바와 같은 아미노산 서열중 어느 하나의 서열이나 그 서열의 한 영역이나 일부와 유사성이 50 내지 60% 이상, 보다 바람직하게는 70 내지 80% 이상, 가장 바람직하게는 90% 이상 가질 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 적어도 부분적으로 정제된이란 용어는 특정 항원의 함량이 헬리코박터 박테리아의 총 세포 초음파 처리물중의 항원 함량보다 많은 것, 바람직하게는 30% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상 많은 제조물을 의미한다. 바람직하게는, 제조물은 항원이 본질적으로 순수한 것, 즉 특정 항원의 함량이 제조물중의 총 헬리코박터 항원의 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상인 것이다.
본원에 사용된 분리된이란 용어는 항원이 1회 이상의 정제 또는 분리 단계로 처리되는 것, 바람직하게는 항원이 백신 조성물에 사용하기에 적합한 형태인 것을 의미한다.
본 발명은 전술한 바와 같이 헬리코박터 박테리아의 특정 항원 뿐만 아니라 특정 항원(들)의 면역원성 단편들, 즉 포유류 숙주내에서 특이적인 감염 방어 면역 반응을 유도할 수 있는 항원(들)의 단편들도 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 면역원성 단편은 특정 항원(들)의 인접 아미노산 잔기를 적합하게는 5개 이상, 보다 바람직하게는 10개 이상 함유할 것이다. 이러한 면역원성 단편은 또한 헬리코박터-특이적인 항체, 특히 헬리코박터 감염과 관련하여 방어적 또는 치료적 효과를 나타내는 항체에 의해 인지될 수 있다.
제 3 양태로서, 본 발명은 상기 포괄적으로 기재한 바와 같은 분리된 헬리코박터 항원이나 항원성 제조물의 면역학적 유효량과, 임의적으로 보조제와 함께, 1종 이상의 약학적 허용성 담체 및/또는 희석제를 함유하는, 포유류 숙주내의 헬리코박터 감염을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 백신 조성물을 제공한다.
제 4 양태로서, 본 발명은 상기 포괄적으로 기재한 바와 같은 분리된 헬리코박터 항원이나 항원성 제조물의 면역학적 유효량을, 임의적으로 보조제와 함께 포유류 숙주에 투여하는 것으로 구성되는, 포유류 숙주내의 헬리코박터 감염을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
제 5 양태로서, 본 발명은 상기 포괄적으로 기재한 바와 같은 분리된 헬리코박터 항원이나 항원성 제조물의 면역학적 유효량과, 임의적으로 보조제를 함께 함유하는 백신 조성물을 포유류 숙주에 있어서의 헬리코박터 감염을 치료 또는 예방하는데 사용하는 방법을 제공한다.
본원에서, 면역학적 유효량이란 용어는 단독 투여량이나 또는 연속 투여량의 일부량으로서, 이 양을 포유류 숙주에 투여했을 때 헬리코박터 감염의 치료 또는 예방에 효과적이라는 것을 의미한다. 이 양은 치료받는 개체의 건강과 신체 조건에 따라, 치료받는 개체의 분류학상 군, 항체를 합성하는 개체 면역계의 용량, 목적하는 예방 정도, 백신의 조성, 의학적 상태 평가, 및 다른 관련 요인에 따라 달라진다. 그 양은 일정 시험을 통해 결정할 수 있는 비교적 광범위한 범위에 속할 것으로 예상된다.
본 발명의 항원 제조물은 바람직하게는, 필수적인 것은 아니지만, 숙주에게 경구 투여되며, 점막성 보조제와 함께 투여된다. 하지만, 본 발명은 또한 이러한 항원 제조물의 비경구 투여도 포함한다.
또한, 본 발명은 상기 포괄적으로 전술한 바와 같은 항원 제조물 또는 분리된 헬리코박터 항원에 특이적인 모노클로날 또는 폴리클로날 항체일 수 있는 항체를 포함한다. 이러한 항체는 당해 기술분야의 전문가들에게 공지된 방법으로 제조할 수 있다.
이 양태에 있어서, 본 발명은 상기 포괄적으로 기재한 바와 같은 분리된 헬리코박터 항원이나 항원성 제조물에 특이적인 항체, 구체적으로 모노클로날 항체의 유효량을 투여하여 포유류 숙주를 수동 면역하는 것으로 구성되는, 포유류 숙주내의 헬리코박터 감염을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
본 발명의 헬리코박터 항원 제조물이나 분리된 항원은 헬리코박터 박테리아의 전체 세포 초음파처리물과 같이 천연원으로부터 정제 또는 분리시켜 제조할 수 있다. 그러나, 대안적으로 항원 제조물이나 분리된 항원은 합성 기법, 바람직하게는 재조합 기법으로 제조할 수 있다. 재조합 기법으로 제조할 때, 항원은 자연 발생 서열과 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖거나, 또는 그 서열에 1개 이상의 아미노산 치환, 결실 및/또는 첨가를 포함할 수 있는데, 단 이와 같은 서열의 변화 이후에도 그 분자가 자연 발생의 헬리코박터 항원에 대하여 특이적인 감염 방어 면역 반응을 유도할 수 있어야 한다. 재조합 분자 또는 자연 발생 분자로 제조된 것이든지 항원의 모든 단편이나 유도체들에는 유사한 면역원성 요구조건이 필요로 된다. 따라서, 본원에 있어서의 헬리코박터 항원이란 자연 발생 분자, 이의 재조합 형태 및 모든 돌연변이체, 유도체, 단편, 동족체 또는 유사체를 의미하는 것으로 간주되어야 하며, 단 이들 분자는 자연 발생의 헬리코박터 항원에 대해 특이적인 감염 방어 면역 반응을 유도해야만 한다. 또한, 2개 이상의 헬리코박터 항원들의 융합 분자나, 글루타치온-S-트란스퍼라제(GST) 또는 β-갈락토시다제와 같은 다른 분자와의 융합 분자를 포함하는 다른 분자와의 융합 분자도 포함한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 헬리코박터 항원을 암호하는 분리된 핵산 분자, 및 바람직하게는 서열 번호 1, 3, 5, 7 또는 9중 어느 하나에 기재한 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자 또는 이 전체물이나 일부분과 본질적으로 유사한 핵산 분자도 포함한다. 본질적으로 유사한이란 용어는 40 내지 50% 이상, 보다 바람직하게는 60 내지 70% 이상, 가장 바람직하게는 80% 이상의 동질성을 갖는 것을 의미한다. 본원에서 일부분이란 용어는 15개 이상, 보다 바람직하게는 25개 이상의 뉴클레오티드로 된 인접 서열들을 의미한다.
이러한 양태에 따라, 본 발명은 상기 포괄적으로 기재한 바와 같은 헬리코박터 항원을 암호하고 낮은 스트린젠시(stringency) 조건하에서 서열 번호 1, 3, 5, 7 또는 9의 서열중 어느 한 서열에 기재된 핵산 서열 전체 또는 일부, 또는 이의 상보 형태에 하이브리드하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 서열 번호 1, 3, 5, 7 또는 9에 기재된 바와 본질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열, 또는 그 일부분을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.
이 핵산 분자는 1본쇄 또는 2본쇄이고, 직선형 또는 공유 폐쇄된 환상 형태의 RNA 또는 DNA일 수 있다. 스트린젠시의 정도를 한정하려면, 본원에 참고문헌으로 포함되는 문헌[Sambrook et al.(1989), pp 387-389]을 통해 편리하게 찾을 수 있으며, 여기에서 11번째 문단의 세정 단계는 높은 스트린젠시인 것으로 간주된다. 본원에서 사용된 낮은 스트린젠시는 0.1 내지 0.5 w/v SDS중에서 37 내지 45℃하에 2 내지 3시간으로 정의된다. 하이브리드화와 관련된 핵산의 농도와 공급원에 따라, 문헌[Sambrook et al. 1989]에 기재된 바와 같은 높은 스트린젠트 조건이나 본원에서 제시된 ≥45℃에서 2 내지 3시간 동안 0.25 내지 0.5 w/v%의 SDS로 규정하고 있는 중간 스트린젠트 조건과 같은 스트린젠시 조건을 대안적으로 이용할 수 있다.
이러한 양태의 본 발명의 뉴클레오티드 서열은 천연원, 합성원 또는 반합성원으로 부터 수득할 수 있고, 또한, 이 뉴클레오티드 서열은 자연-발생 서열이거나, 이러한 자연 발생 서열에 단일 염기 치환이나 다중 염기 치환, 결실, 삽입 및 역위를 비롯한 돌연변이가 관계할 수 있으며, 단 이러한 서열을 포함하는 핵산 분자는 항상 상기 포괄적으로 기재한 바와 같은 헬리코박터 항원으로서 발현될 수 있어야만 한다.
뉴클레오티드 서열은 그 인접부위에 발현 조절 서열이 위치할 수 있으며, 이러한 조절 서열은 일반적으로 이종의 공급원으로부터 유래된다.
또한, 본 발명은 프로모터 서열과 개시인자 서열을 갖는 발현 조절 서열 및 헬리코박터 항원을 암호하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 제공하며, 이 뉴클레오티드 서열은 프로모터와 개시인자 서열의 3' 부위에 위치한다. 또 다른 양태로서, 본 발명은 프로모터 서열과 개시인자 서열을 가진 발현 조절 서열 및 헬리코박터 항원을 암호하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 헬리코박터 항원을 발현할 수 있는 재조합 DNA 클로닝 전파자를 제공하며, 상기 뉴클레오티드 서열은 프로모터 서열과 개시 인자 서열의 3' 부위에 위치해 있다. 또 다른 양태로서, 본 발명은 전술한 바와 같은 재조합 DNA 클로닝 전파자 및/또는 재조합 DNA 분자를 함유하는 숙주 세포를 제공한다.
적합한 발현 조절 서열과 숙주 세포/클로닝 전파자의 조합은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 문헌[Sambrook et al. 1989]에 예시적으로 기재되어 있다.
다른 양태로서, 본 발명은 본 발명의 헬리코박터 항원과 여기에 융합된 부가적인 폴리펩티드, 예컨대 클로닝 전파자의 DNA에 의해 암호된 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드를 제공한다. 이러한 융합 폴리펩티드는 전술한 바와 같은 재조합 DNA 클로닝 전파자로 형질전환되거나 감염된 숙주 세포에 의해 생성된 뒤, 숙주 세포로부터 분리하여 숙주 세포의 다른 단백질은 본질적으로 없는 융합 폴리펩티드를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 헬리코박터 항원의 항원성을 나타내는 합성 폴리펩티드도 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 합성이란 용어는 화학적 또는 생물학적 수단, 예컨대, 화학 합성이나 생물학적 합성을 유도하는 재조합 DNA 기법에 의해 폴리펩티드가 생성된다는 것을 의미한다. 이와 같은 폴리펩티드는 물론 전술한 바와 같이 융합 폴리펩티드를 절단하고 당해 기술분야에 공지된 방법으로 클로닝 전파자의 DNA에 의해 암호된 부가적인 폴리펩티드로부터 목적 폴리펩티드를 분리하여 수득할 수 있다. 또는, 목적 폴리펩티드의 아미노산 서열이, 예컨대 목적 폴리펩티드를 암호하는 뉴클레오티드의 서열 결정에 의해 일단 제시되면, 이 폴리펩티드는 예컨대 공지의 메리필드 고상 합성법에 의해 합성할 수 있다.
본 발명의 헬리코박터 항원을 발현하는 재조합 DNA 클로닝 전파자 및/또는 숙주 세포가 일단 동정되면, 숙주 세포에 의해 합성된 발현된 폴리펩티드는 예컨대, 융합 단백질로서 당해 기술분야에 공지된 기법에 의해 숙주 세포 성분으로 본질적으로 오염됨이 없이 분리될 수 있다.
헬리코박터 항원에 상응하는 아미노산 서열 또는 그 일부를 함유하는 분리된 폴리펩티드는 공지의 절차를 사용하여 래빗, 마우스 또는 다른 동물들을 면역화시켜 폴리클로날 항혈청을 생성시키는데 사용할 수 있다. 대안적으로, 이러한 폴리펩티드는 당해 기술분야에 공지된 기법을 사용하여 모노클로날 항체를 제조하는데 사용할 수 있다.
또한, 융합 폴리펩티드를 포함하는 본 발명에 따른 폴리펩티드는 포유류 숙주내의 헬리코박터 감염의 치료 또는 예방에 사용하기 위하여 백신 제조 기술 분야에 공지된 방법에 의해 단독 백신이나 다중 백신의 제조에 활성 면역원으로서 사용할 수 있다.
대안적으로, 융합 폴리펩티드를 비롯하여 본 발명에 따른 폴리펩티드는 시료, 예컨대, 인간이나 다른 포유류 환자 유래의 혈청 시료중에 존재하는 헬리코박터에 대한 항체를 검출하기 위한 진단 면역분석법에 항원으로서 사용할 수 있다. 이러한 면역분석법은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 그 예로는 방사능면역분석법(RIA) 및 효소 결합된 면역흡착 분석법(ELISA)을 포함한다.
본원을 통해 사용된 포함한다 또는 포함하는과 같은 용어는 별다른 표시가 없는 한, 제시된 정수나 정수들의 군을 포함하지만, 다른 정수나 정수군을 배제시키기 위한 것으로 이해해서는 안된다.
상세한 설명
바람직하게는, 본 발명의 항원 제조물이나 분리된 항원은 에이치. 피롤리 또는 에이치. 펠리스 항원(들)을 포함한다. 또한, 이러한 항원 제조물이나 분리된 항원은 점막 보조제를 포함하는 경구 투여용 백신 조성물에 사용되는 것이 바람직하다.
본 발명의 특히 바람직한 양태에 있어서, 상기 포괄적으로 기재한 바와 같은 에이치. 피롤리 항원(들)을 포함하는 항원 제조물이나 분리된 항원과 함께 점막 보조제를 함유하는 경구용 백신 조성물은 인간 숙주중의 에이치. 피롤리 감염을 치료 또는 방어하는데 사용한다.
본 발명의 헬리코박터 항원 제조물과 함께 감염된 숙주에 임의적으로, 그리고 바람직하게 투여되는 점막 보조제는 바람직하게는 콜레라 독소이다. 본 발명에 따라 사용할 수 있는 콜레라 독소이외의 다른 점막 보조제로는 B 서브유니트(CTB)와 같은 콜레라 독소의 비독성 유도체, 화학적으로 변화된 콜레라 독소 또는 콜레라 독소의 아미노산 서열을 수사시켜 생성한 관련 단백질을 포함한다. 이것은 헬리코박터 항원 제조물에 첨가하거나 결합시킬 수 있다. 이와 동일한 기법을 점막 보조제를 가진 다른 분자나 또는 에세리히아 콜리 열불안정 독소와 같은 전달성을 가진 다른 분자에도 적용할 수 있다. 점막 보조제 또는 전달 활성을 가진 다른 화합물로는 담즙; DEAE-덱스트란 및 폴리오르니틴과 같은 다가양이온; 소듐 도데실 벤젠 설페이트와 같은 세정제; 지질-결합된 물질; 스트렙토마이신과 같은 항생제; 비타민 A; 및 점막 표면의 구조적 또는 기능적 보존성을 변화시키는 기타 다른 화합물을 사용할 수 있다. 다른 점막 활성 화합물로는 MDP와 같은 미생물 구조물의 유도체, 즉 아크리딘과 시메티딘을 포함한다.
본 발명의 헬리코박터 항원 제조물이나 분리된 항원은 ISCOMSTM(면역 자극 복합체), CTB를 함유하는 ISCOMSTM, 리포좀중에서 본 발명에 따라 전달되거나 또는 M 세포에 의한 흡착에 적합한 크기의 미소구를 형성하도록 아크릴레이트 또는 폴리(DL-락타이드-코글리코사이드)와 같은 화합물중에 캡슐화할 수 있다. 대안적으로, 마이크로 또는 나노입자는 특이적인 장 수용체를 갖고 있는 비타민 B12와 같은 분자에 공유적으로 결합할 수 있다. 또한, 헬리코박터 항원 제조물이나 분리된 항원은 오일 유탁액중에 첨가하여 경구 투여할 수 있다. 포괄적으로 기재된 보조제 목록은 문헌[Cox and Coulter(1992)]으로부터 입수할 수 있다.
통상적인 약학적 허용성 담체, 부형제, 완충액 또는 희석제 뿐만 아니라 다른 보조제도 본 발명의 예방적 또는 치료적 백신 조성물중에 함유될 수 있다. 이 백신 조성물은, 예컨대 헬리코박터 항원 제조물이나 분리된 항원 및 콜레라 독소 점막 보조제와 함께 중탄산 나트륨 완충액을 포함하는 장피용 젤라틴 캡슐로 제조할 수 있다.
이러한 예방적 또는 치료적 백신 조성물의 조제는 당해 기술분야의 전문가에게 공지된 것이다. 적합한 약학적 허용성 담체 및/또는 희석제로는 모든 통상의 용매, 분산매, 충전제, 고형 담체, 수용액, 코팅물, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제등을 포함한다. 이러한 약학적 활성 물질에 대한 매질과 제제의 사용은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 예컨대, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Mack Publishing Company, Pennsylvania, USA]에 기재되어 있다. 임의의 통상적인 매질이나 제제는 활성 성분과 불화합성이지 않는 한, 본 발명의 백신 조성물중에 사용될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 또한 보강용 활성 성분도 본 발명의 조성물에 첨가될 수 있다.
본 발명의 헬리코박터 항원 제조물이나 분리된 항원은 백신 조성물중에 유일한 활성 면역원으로서 투여할 수 있다. 또한, 대안적으로 상기 백신 조성물은 우레아제, 리포폴리사카라이드, Hsp60, VacA, CagA 또는 카탈라제와 같은 기타 다른 헬리코박터 항원, 뿐만 아니라 다른 병원균에 대한 면역학적 활성 항원을 비롯하여 기타 다른 활성 면역원을 함유할 수 있다.
치료용 또는 예방용 백신 조성물 형태로 헬리코박터 항원 제조물이나 분리된 항원을 전달할 수 있는 대안적인 양태로서, 상기 항원이나 그 면역원성 단편은 이종 폴리펩티드로서 면역원성 단편의 항원을 발현하는데 필요한 유전자 물질을 함유하는 생 백신 벡터, 특히 생 재조합 박테리아, 비루스 또는 다른 생물제를 사용하여 포유류 숙주로 전달할 수 있다. 구체적으로서, 위장관에서 집락을 형성하는 세균인 살모넬라, 시겔라, 예르시니아, 비브리오, 에세리히아 및 BCG등은 백신 벡터로서 개발되어 있고, 그 예와 다른 예들이 문헌[Holmgren et al.(1992) and McGhee et al.(1992)]에 기술되어 있다.
따라서, 본 발명은 또한 상기 포괄적으로 기재된 바와 같은 분리된 헬리코박터 항원이나 그 면역원성 단편을 발현하는 백신 벡터를 사용하여 숙주에 전달하는 방법도 포함한다. 이에 따라, 본 발명은 또다른 양태로서, 상기 포괄적으로 기재한 바와 같은 분리된 헬리코박터 항원이나 이것의 면역원성 단편을 발현하는 백신 백터를 포함하는, 포유류 숙주내의 헬리코박터 감염을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 제조물을 제공한다.
이러한 양태에 있어서, 또한 본 발명은 상기 포괄적으로 기재한 바와 같은 분리된 헬리코박터 항원이나 이것의 면역원성 단편을 발현하는 백신 벡터를 포유류 숙주에 투여하는 것을 포함하는, 포유류 숙주내의 헬리코박터 감염을 치료 또는 예방하는 방법을 포함한다.
또한, 본 발명은 상기 포괄적으로 기재한 바와 같은 분리된 헬리코박터 항원이나 이것의 면역원성 단편을 발현하는 백신 벡터를 포유류 숙주내의 헬리코박터 감염의 치료 또는 예방에 사용하는 방법도 포함한다.
본 발명의 또다른 특징은 하기 실시예를 통해 상세하게 기재한다. 하지만, 이러한 상세한 설명은 본 발명을 예시하기 위함이지, 전술한 바와 같은 본 발명의 포괄적인 설명을 한정하기 위한 것이 아님을 이해해야 한다.
실시예 1
항-에이치. 펠리스 항체에 의해 인식되는 에이치. 피롤리 단백질을 발현하는 이.콜리 클론의 동정
A. 재료 및 방법
박테리아 균주
유전자 라이브러리를 제조하기 위해 DNA 공여체로서 헬리코박터 피롤리 균주 HP921023을 사용하였다. 파지 감염과 람다 ZAP 발현물(Lambda ZAP Express)의 평판 배양에 사용된 숙주는 에세리히아 콜리 균주 ER1793(New England Biolabs)이다. 파지미드 pBK-CMV의 절단과 클로닝된 유전자의 단백질 발현에는 이.콜리 균주 XLI-Blue MRF' 및 XLOLR(Stratagene)을 사용하였다.
에이치. 피롤리 염색체 DNA의 분리
에이치. 피롤리 유래의 총 세포 DNA는 주로 문헌[Majewski and Goodwin(1988)]에 보고된 바와 같이 제조하였다.
항-혈청 제조물
헬리코박터 펠리스를 1 주마다 4회 경구-위 투여로 면역화하여 마우스 항-혈청을 생성시켰다. 각 백신의 투여량은 초음파처리된 에이치. 펠리스 세포 1mg(단백질)과 콜레라 독소 10㎍으로 구성되어 있다. 혈액을 채취하여 혈청을 저장하였다. 이 혈청을 TBS 중에 5 w/v% 탈지분유와 0.05 v/v% 트윈 20을 함유하는 50 v/v% 이.콜리 추출물(Promega)에 최종 희석율을 1:100으로 하여 흡착시켰다. 이 제조물을 실온에서 4시간동안 항온배양한 다음, 숙주 단백질을 사용하여 항혈청의 비특이적인 반응성을 제거하거나 감소시키기 위해 면역선별하였다. 이 혈청의 특이성은 양성 대조군으로서 에이치. 피롤리 총 세포의 희석물과 음성 대조군으로서 이.콜리 XLOLR의 총 세포의 희석물을 사용하여 점 블롯 및 웨스턴 블롯팅으로 확인하였다.
박테리아 성장 조건
람다 ZAP 발현물로 감염시키기 위하여, 균주 ER1793 세포를 먼저 0.2% w/v 말토즈와 10mM MgSO4로 보강된 루리아-버타니(LB) 배지중에서 30℃하에 증식시켰다. 감염시킨 다음, 이 세포를 37℃의 LB 배지중에서 15분동안 유지시킨 후, NZY 한천 배지상에 평판배양하고 42℃에서 4시간동안, 그 다음 37℃에서 하룻밤동안 항온배양하였다. 파지미드 절단과 플라스미드 분리를 위해서는 이.콜리 균주 XL1-Blue와 XLOLR를 37℃의 LB 배지중에서 증식시킨 다음, 형질전환된 XLOLR 세포를 37℃의 LB/가나마이신 평판(50㎍/㎖)상에서 선택하였다.
에이치. 피롤리 유전자 라이브러리의 작제
BamH I으로 예비절단하고 말단 5' 인산기를 송아지 장 포스파타제로 제거한 람다 ZAP 발현 벡터(Stratagene)중에서 표준 절차(Sambrook etal, 1989)를 사용하여 에이치. 피롤리 발현 라이브러리를 작제하였다. Sau3AI으로 부분 절단한 게놈 DNA를 겔 전기영동으로 분별화하고 6 내지 12 kb 사이의 DNA 단편을 분리하였다. 이 DNA를 BamHI-절단된 람다 아암 1.0㎍에 결찰시켰다. 이와 같이 제조된 재조합 파지 DNA를 Gigapack II 추출물(Stratagene)을 사용하여 시험관내에서 포장하였다. 포장된 파지 일정량을 사용하여 이.콜리 균주 ER1793 또는 XL1-Blue MRF' 세포를 감염시키고 IPTG 및 X-Gal을 함유하는 지시제 함유 평판상에서 평판배양하여 라이브러리의 역가를 측정하였다. 비재조합 파지 대 재조합 파지의 비율은 1:5였다. 재조합 라이브러리의 역가는 람다 DNA 1㎍ 당 1 x 106pfu였다.
에이치. 피롤리 게놈 라이브러리의 항체 선별
일부 라이브러리를 플라크 면역블롯 분석법으로 선별하였다. 총 10,000개의 플라크를 평판배양하고(평판당 2,000개의 박테리오파지 플라크), 문헌[Sambrook et al(1989)]에 따라 처리될 Hybond-C 엑스트라 니트로셀룰로스 필터(Amersham)상에 전이시켰다. 이 필터를 항-에이치.펠리스 마우스 혈청의 1:100 희석물을 사용하여 실온에서 하룻밤동안 처리하여 선별하였다. 이 필터를 TBS중의 0.05 v/v% Tween 20으로 세정한 후, 1:2000의 결합된 염소 항-마우스 면역글로불린 G-결합된 양고추냉이 퍼옥시다제중에서 1.5 시간동안 항온처리하였다. 이 필터를 전술한 바와 같이 세정하고 TMB 기질(KPL Inc.)을 사용하여 발색 반응을 전개시켰다. 양성 파지 클론을 동정한 후, 플라크가 있는 한천 플러그를 채취하여 파지를 SM 완충액내로 용출시켰다. 플라크의 순도를 증가시키기 위해, 박테리아를 감염시키고, 재평판배양시킨 뒤 면역선별하는 공정을 반복하였다.
람다 ZAP 발현 벡터 유래의 플라스미드 pBK-CMV의 생체내 절단
삽입 DNA를 함유하는 람다 ZAP 발현물과 ExAssist 헬퍼 파지 M13을 사용하여 이.콜리 균주 XL1-Blue MRF'를 동시에 감염시켜 람다 ZAP 발현물로부터 에이치.피롤리 DNA를 함유하는 pBK-CMV를 생체내 절단시켰다. 절단된 파지미드를 사상의 파지 입자로서 포장하고 숙주 세포로부터 분비시킨 뒤, 이어서 가열 사멸시켰다. 이 파지미드는 XLOLR 세포를 감염시킨 뒤 LB/가나마이신(50㎍/㎖) 평판상에 도말하여 분리했다. 평판상에 나타나는 박테리아 콜로니는 에이치. 피롤리 유래의 클로닝된 DNA 삽입물을 가진 pBK-CMV 이본쇄 파지미드를 함유하고 있었다. 그 다음 이 콜로니를 단백질 발현에 대해 분석하였다.
단백질의 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석
이.콜리 XLOLR중에서 클로닝된 에이치. 피롤리 DNA에 의해 생성된 총 단백질은 표준 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 기법으로 분석하였다(Sambrook et al, 1989; Towbin et al, 1979). 발현 플라스미드를 함유하는 XLOLR 10㎖ 배양물을 37℃의 상부배지중에서 하룻밤동안 증식시켰다. 배양물을 둘로 나누고 하나의 배양물은 최종 농도 1mM로 IPTG를 유도시켜 2 내지 4 시간동안 연속 항온배양하였다. 1㎖의 일정량을 수거하여, 세포를 원심분리로 펠릿화하고 이것을 10mM Tris-HCl(pH 8)중에 재현탁시켰다. 세포를 동량의 SDS 시료 환원성 완충액과 혼합하고 10분동안 가열하였다. 단백질을 4 내지 20% 구배의 Tris-글리신 겔(Novex) 상에서 전기영동하여 분리하고 쿠마시 브릴리언트 블루(CBB)로 염색하였다. 평행하게 진행되는 겔을 니트로셀룰로스 막(BioRad)으로 전기전이시킨 뒤, 전술한 바와 같은 항-에이치. 펠리스 마우스 혈청을 사용하여 에이치. 피롤리의 면역반응 단백질을 검출하였다.
분자량을 추정하기 위하여, 쿠마시 블루 염색된 습윤 겔을 Molecular Dynamics 모델 300A 농도계를 사용하여 스캐닝하고 겉보기 분자량을 Image Quant 버전 3.3 소프트웨어를 사용하여 표준 단백질에 대하여 상대적으로 측정하였다.
단백질 N-말단 서열 결정
N-말단을 서열결정할 단백질을 SDS-PAGE로 분리하고 1 x CAPS 전기블롯팅 완충액중에서 PVDF 막(Novex)상으로 전이시킨 다음 50 v/v% 메탄올중의 0.1 w/v% CBB로 염색시키고 단백질 밴드가 가시화될 때까지 50 v/v% 메탄올로 탈색시켰다. 웨스턴 블롯에 의해 동정된 면역양성 단백질에 상응하는 밴드를 절단하고 서열결정하였다. 아미노산 서열결정을 미국 멜보른 대학의 수의학과 동물 바이오테크놀로지 센터에 있는 Applied Biosystems Inc., 모델 473A 서열결정기를 사용하여 수행하였다. 또다른 서열 결정은 Auspep Pty. Ltd.에 의해 제공되었다.
DNA 제조 및 클론의 동족화 분석
플라스미드 DNA는 알칼리 용균법(Sambrook et al, 1989)을 사용하여 여러 에이치. 피롤리 DNA 삽입물을 운반하는 이.콜리 XLOLR 클론의 배양물로부터 분리하였다. 제한 효소 분해는 효소 제조자(Promega Inc.)의 추천에 따라 수행하였다. 프로브로서 사용되는 클로닝된 에이치. 피롤리 DNA의 제한 단편은 0.8% 아가로스에서 겔 전기영동하고 에티디움 브로마이드로 염색한 다음 겔을 절단한 뒤 핵산 정제용 Bresaclean 키트(Bresatec Ltd.)를 사용하여 정제하였다. 크기가 2.5 내지 7.0 kb의 SalI/NotI 단편을 Random Primers DNA 표지 키트(Gibco BRL)를 사용하여 (32P)d-ATP로 표지시켰다.
관련 클론을 찾기 위한 교차-하이브리드화 분석에서는, XLOLR 클론의 세포 현탁액을 니트로셀룰로스 상에 점적하고 제조자의 프로토콜(Amersham)에 따라 처리하였다. 필터를 2 x PE, 1 w/v% 탈지 분유 및 7 w/v% SDS를 함유하는 용액중에서 65℃하에 하룻밤동안 하이브리드하였다. 하이브리드화 후, 필터를 2 x SSC, 0.1 w/v% SDS중에서 실온하에 15분간 1회 세정하고, 2 x SSC, 0.1 w/v% SDS중에서 65℃하에 30분간 2회 세정하였다. 하이브리드화 결과는 Kodak Biomax 필름상에서 자동방사능사진으로 가시화하였다.
B. 결과 및 토론
헬리코박터 피롤리의 가능한 방어적 항원을 클론하기 위해, 균주 HP921023의 게놈 라이브러리를 람다 발현 벡터 Lambda ZAP Express중에서 작제하였다. 이 라이브러리를 에이치. 펠리스 항원과 교차-반응성인 에이치. 피롤리 항원을 발현하는 클론을 검출하기 위한 시도로서 헬리코박터 펠리스를 백신접종한 마우스로부터 채취한 혈청을 사용하여 면역반응성에 대해 선별하였다. 항-에이치. 펠리스 마우스 혈청을 사용하여 약 10,000개의 플라크를 선별하였다. 마우스 혈청에 의해, 신호 강도가 다양한 50개의 면역양성 클론을 인식하였다. 이것을 취하여 정제한 뒤, 발현 플라스미드 pBK-CMV를 절단하여 클로닝된 DNA와 암호된 단백질의 특성을 추가 규명하였다. 이러한 재조합 플라스미드에 의해 발현된 단백질을 SDS-PAGE(도 1A 및 도 2A) 및 웨스턴 블롯팅(도 1B 및 도 2B)에 의해 분석하였다.
마우스 혈청에 의해 인식된 클로닝된 단백질의 분자량은 약 13 kDa 내지 약 62 kDa 범위였다. 클론들에 의해 단백질 프로파일과 단백질 크기를 기초로 하여 군으로 분류할 수 있는 패턴이 나타났다(표 1). 군들을 알파벳순으로 편리하게 명명하였다(예, A군, B군, C군등). A군은 5가지 성분으로 구성되며, 주로 약 62 kDa 및 약 33 kDa의 2개의 주요 단백질을 나타냈다(도 1B, 레인 1). B군은 약 19kDa 및 약 17kDa의 2가지 단백질을 발현하는 14개의 관련 클론을 갖고 있다(도 1B, 레인 2). 2 가지 단백질중 보다 작은 것은 약 19kDa 단백질보다 보다 다량으로 생성되는 경향이 있다. 배양 조건에 따라, 약 19 kDa의 단백질은 약 17 kDa의 단백질과 동량으로 존재하거나 현저하게는 보다 적은 양으로 존재할 수 있다. 이것은 웨스턴 블롯팅에 의해 가시화되었을 때 약 17 kDa의 단백질이 약 19kDa 단백질보다 강한 면역양성 밴드인 것으로서 관찰되는 이유를 설명하는 것이다. C군은 CBB 염색된 겔에서 보다 웨스턴 블롯상에서 보다 쉽게 구별되는 크기가 약 13kDa(도 1B, 레인 3)인 작은 단백질을 특징으로 하는 10개의 성분을 갖고 있다. 단백질의 발현율은 클론마다 변화하고 블롯상의 신호도 약한 정도에서 부터 강한 정도까지 다양할 수 있다. E군은 약 36kDa(도 2, 레인 2)의 단백질을 암호하는 하나의 클론을 갖고 있다. F군도 또한 약 55kDa의 단백질을 풍부한 양으로 발현하는 하나의 클론을 갖고 있다(도 1B, 레인 5). 모든 클로닝된 단백질중에서, 이 단백질이 웨스턴 블롯으로 관찰했을 때 항-에이치. 펠리스 마우스 혈청에 의해 가장 강하게 인식된다. G군은 CBB 염색된 겔 상에서 등가 크기인 숙주 이.콜리 단백질(도 1A, 레인 6)외에도 쉽게 가시화될 수 있는 양으로는 생산되지 않는 약 50kDa 단백질(도 1B, 레인 6)을 발현하는 2 성분을 갖고 있다. 그러나, 마우스 혈청중의 항체들은 이 단백질에 대해서는 결합하지만, 레인 8중의 이.콜리 단백질에 대해서는 결합하지 않는 것으로 나타났다. 이와 같이 클로닝된 에이치. 피롤리 단백질이 다량으로 발현되지는 않지만 꽤 면역양성이라면, 이것 또한 헬리코박터 피롤리 감염에 대하여 강한 면역 반응을 유도하는 주요 항원이라는 것은 자명한 것이다. 레인 7(도 1A 및 도 1B)은 H군의 유일한 대표 성분인, 웨스턴 블롯상에서 다른 군의 단백질보다 약한 신호를 제공하고 발현율이 낮은 약 29 kDa 단백질을 포함한다. 도 1의 레인 8과 도2의 레인 4는 음성 대조군인, 에이치. 피롤리의 삽입체 없이 발현 플라스미드 pBK-CMV를 함유하는 이.콜리 XLOLR을 포함한다. 이. 콜리 추출물로 마우스 혈청을 흡착시키면, 숙주 세포 단백질에 대한 비특이적인 결합이 대부분 방지된다. 기질의 전개 시간의 길이에 따라, 비흡착형 마우스 혈청으로 프로브된 블롯상에서 나타나는 과량의 숙주 세포 단백질과 비교하여 모든 레인을 통해 최대 6개의 이.콜리 단백질이 인식되었다(데이타는 도시하지 않음). 주요 숙주 세포 단백질은 37kDa에서 인식되었다. 레인 9는 양성 대조군으로서 크기 범위가 11 내지 95 kDa인 ∼10개의 면역양성 밴드를 가진 헬리코박터 피롤리의 총 세포 단백질을 포함한다. 동족 DNA 분석 결과(도시되지 않음), 7가지 군의 클로닝된 에이치. 피롤리 단백질이 존재하는 웨스턴 블롯 데이타를 확인하였다.
에이치. 피롤리의 Ure B 양성 균주로부터 라이브러리의 생성에 사용된 게놈 DNA를 수득하였고, 우레아제는 클로닝된 바 있는 공지의 방어용 항원(Michetti et al, 1994)이므로, 클론들을 우레아제의 존재에 대해 선별하였다. Ure A 및 Ure B 유전자에 대하여 올리고뉴클레오티드 프로브로 하이브리드한 결과, 5개의 클론이 우레아제 A 및 우레아제 B DNA 서열에 대해 양성인 것으로 나타났다(표 1). 우레아제 양성 클론들은 모두 A군에 속한다. A군 이외의 다른 어떤 클론들은 우레아제 양성이 아니었다. 약 62 kDa 및 약 33 kDa 단백질을 N-말단 서열결정으로 분석하였다. 데이타베이스 Swiss-Prot/GenPeptide를 사용하여 단백질 상동성을 연구한 결과 헬리코박터 피롤리의 우레아제 B 서브유니트와 약 62 kDa 단백질의 15개 아미노산 잔기의 상동성이 100% 인 것으로 확인되었다. 약 33kDa 단백질의 18개의 아미노산 서열은 우레아제 A 서브유니트와 94.4%의 상동성을 갖고 있는 것으로 밝혀졌고, 단지 하나의 부정합 아미노산 잔기가 존재하였다.
또한, B군, C군, F군 및 G군에 대해서도 예비 N-말단 서열을 결정하였다. B군인 약 19kDa 단백질의 단백질 서열은 헬리코박터 피롤리의 막결합된 지단백질 항원(Lpp20)에 상응하는 것으로 발견되었다(Kostrzynska et al., 1994).
C군의 약 13 kDa 단백질이나 G군의 약 36 kDa 단백질에 대하여 현저한 상동성을 가진 서열은 데이타 베이스중에서는 찾을 수 없었다.
F군에 속하는 55 kDa 단백질의 단백질 서열 데이타는 단지 3개의 잔기가 부정합 상태이고 헬리코박터 피롤리의 열 쇼크 단백질 60(Hsp60) 서열의 처음 15개 N-말단 아미노산과 80%의 상동성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 이러한 발견은 웨스턴 블롯팅 결과를 지지하는 것으로, Hsp60이 강한 항체 반응을 유도하는 것으로 공지된 바와 같이, 이 면역반응성 밴드의 높은 신호 강도를 설명해 준다.
| 군 | 클론수 | 우레아제 하이브리드화 올리고 A 및 B | 단백질 분자량(kDa) | 단백질 N-말단 서열 | 서열번호 | 단백질 동질성(데이타베이스와 비교) |
| A | 5 | 예 | ∼62 | MKKISRKEYV | 11 | 우레아제 B 서브유니트 |
| ∼33 | MKLTPKELDKLMLHRAGE | 12 | 우레아제 A 서브유니트 | |||
| B | 14 | 아니오 | ∼19∼17 | MLNQVLLKLGMSVKAAMV결정 안됨 | 13 | Lpp20성숙 Lpp20 |
| C | 10 | 아니오 | ∼13 | MISKEEVLEYIGSLS | 14 | 미공지 |
| E | 1 | 아니오 | ∼36 | 결정 안됨 | 미공지 | |
| F | 1 | 아니오 | ∼55 | AKEIKFVDAARNLFF | 15 | Hsp60 |
| G | 2 | 아니오 | ∼50 | MFGFKQLQLQFSQKV | 16 | 미지 |
| H | 1 | 아니오 | ∼29 | 결정 안됨 | 미지 |
이어서, DNA 서열결정으로 상기 서열 결정된 N-말단 아미노산 서열이 일부 오류가 있는지 확인하였다.
실시예 2
클로닝된 에이치. 피롤리 항원 C군, E군, G군, H군 및 B군(표 1)으로 부터 선택된 대표적인 클론을 다음과 같이 서열결정하였다:
(i) 클론 C3.5(서열 번호 1 및 2)
하기 개략적으로 나타낸 절차들을 조합하여 클론 C3.5중에 존재하는 4423bp 삽입체를 서열결정하는데 사용되는 전략을 만들었다.
1. 플라스미드 DNA는 변형된 알칼리 용균 절차를 사용하여 제조하였다.
2. 네스트(nest)형 결실부는 ExoIII 및 S1 누클레아제를 사용하여 T7 및 T3 말단으로부터 생성하였다.
3. 결실 클론들은 아가로스 겔상에서 전기영동하여 DNA 서열결정으로 크기 선별하였다.
4. DNA 서열결정은 7-deaza dGTP를 함유하는 표준 디데옥시뉴클레오티드 종지 반응을 사용하여 수행하였다. 상당한 GC 밴드의 압축 상태를 풀기 위해, 필요한 경우 7-데아자 dITP를 사용하였다. 표지로서 [35S]dATP를 사용하였다.
5. 서열 결정 반응은 8M 우레아를 함유하는 6% 폴리아크릴아미드 V자형 겔상에서 분석하였다. 모든 시료는 G-A-T-C의 순서로 장입하였다.
6. 내부 서열결정용 프라이머를 필요한 경우 합성하였다.
(ii) 클론 E2.5(서열 번호 3 및 4)
하기 개략된 절차를 조합하여 클론 E2.5중에 존재하는 2435 bp 삽입체를 서열결정하는데 사용되는 전략을 만들었다.
1. NotI/SalI 단편을 평활말단화하고 pBluescript II SK+(Stratagene)의 EcoRV 부위에 클로닝한 뒤, XL1-Blue 세포를 형질전환하는데 사용하였다.
2. 플라스미드 DNA를 변형된 알칼리 용균 절차를 사용하여 제조하였다. 초기클론과 EcoRV 서브클론으로부터 결실 클론을 만들었다.
3. 플라스미드 DNA는 변형된 알칼리 용균 절차를 사용하여 제조하였다.
4. 결실 클론은 DNA 서열결정하기 위해 아가로스 겔상에서 전기영동하여 크기 선별하였다.
5. DNA 서열결정은 7-데아자 dGTP를 함유하는 표준 디데옥시뉴클레오티드 종지 반응을 사용하여 수행하였다. 상당한 GC 밴드의 압축 상태를 풀기 위해, 필요한 경우 7-데아자 dITP를 사용하였다. 표지로서 [35S]dATP 또는 [33P]dATP를 사용하였다.
6. 서열 결정 반응은 8M 우레아를 함유하는 6% 폴리아크릴아미드 V자형 겔상에서 분석하였다. 모든 시료는 G-A-T-C의 순서로 장입하였다.
7. 내부 서열결정용 프라이머를 필요한 경우 합성하였다.
(iii) 클론 G3.8(서열 번호 5 및 6)
하기 개략적으로 나타낸 절차들을 조합하여 클론 G3.8중에 존재하는 6081bp BamHI 삽입체를 서열결정하는데 사용되는 전략을 만들었다.
1. 네스트(nest)형 결실부는 ExoIII 및 S1 누클레아제를 사용하여 T7 및 T3 말단으로부터 생성하였다.
2. 플라스미드 DNA를 변형된 알칼리 용균 절차를 사용하여 제조하였다.
3. 결실 클론들은 아가로스 겔상에서 전기영동하여 DNA 서열결정으로 크기 선별하였다.
4. DNA 서열결정은 7-deaza dGTP를 함유하는 표준 디데옥시뉴클레오티드 종지 반응을 사용하여 수행하였다. 상당한 GC 밴드의 압축 상태를 풀기 위해, 필요한 경우 7-데아자 dITP를 사용하였다. 표지로서 [35S]dATP를 사용하였다.
5. 서열 결정 반응은 8M 우레아를 함유하는 6% 폴리아크릴아미드 V자형 겔상에서 분석하였다. 모든 시료는 G-A-T-C의 순서로 장입하였다.
6. 내부 서열결정용 프라이머를 필요한 경우 합성하였다.
(iv) 클론 H5.1(서열 번호 7 및 8)
하기 개략적으로 나타낸 절차들을 조합하여 클론 H5.1중에 존재하는 1199bp 삽입체를 서열결정하는데 사용되는 전략을 만들었다.
1. SalI/NotI 단편을 평활말단화하고 pBluescript II SK+(Stratagene)의 EcoRV 부위에 클로닝한 뒤, XL1-Blue 세포를 형질전환하는데 사용하였다.
2. 네스트(nest)형 결실부는 ExoIII 및 S1 누클레아제를 사용하여 T7 및 T3 말단으로부터 생성하였다.
3. 플라스미드 DNA는 변형된 알칼리 용균 절차를 사용하여 제조하였다.
4. 결실 클론들은 아가로스 겔상에서 전기영동하여 DNA 서열결정으로 크기 선별하였다.
5. DNA 서열결정은 7-deaza dGTP를 함유하는 표준 디데옥시뉴클레오티드 종지 반응을 사용하여 수행하였다. 상당한 GC 밴드의 압축 상태를 풀기 위해, 필요한 경우 7-데아자 dITP를 사용하였다. 표지로서 [35S]dATP를 사용하였다.
6. 서열 결정 반응은 8M 우레아를 함유하는 6% 폴리아크릴아미드 V자형 겔상에서 분석하였다. 모든 시료는 G-A-T-C의 순서로 장입하였다.
7. 내부 서열결정용 프라이머를 필요한 경우 합성하였다.
(v) 클론 B4.6(서열 번호 9 및 10)
하기 개략적으로 나타낸 절차들을 조합하여 클론 B4.6중에 존재하는 4518bp 삽입체를 서열결정하는데 사용되는 전략을 만들었다.
1. 플라스미드 DNA는 변형된 알칼리 용균 절차를 사용하여 제조하였다.
2. 네스트(nest)형 결실부는 ExoIII 및 S1 누클레아제를 사용하여 T7 및 T3 말단으로부터 생성하였다.
3. 결실 클론들은 아가로스 겔상에서 전기영동하여 DNA 서열결정으로 크기 선별하였다.
4. DNA 서열결정은 7-deaza dGTP를 함유하는 표준 디데옥시뉴클레오티드 종지 반응을 사용하여 수행하였다. 상당한 GC 밴드의 압축 상태를 풀기 위해, 필요한 경우 7-데아자 dITP를 사용하였다. 표지로서 [35S]dATP를 사용하였다.
5. 서열 결정 반응은 8M 우레아를 함유하는 6% 폴리아크릴아미드 V자형 겔상에서 분석하였다. 모든 시료는 G-A-T-C의 순서로 장입하였다.
6. 내부 서열결정용 프라이머는 필요한 경우 합성하였다.
실시예 3
에이치. 피롤리 마우스 모델에 있어서 재조합 에이치. 피롤리 항원의 서브클로닝, 발현, 정제 및 시험
1. 에이치. 피롤리 마우스 모델의 제조
1.1 서론
인체중의 에이치. 피롤리 균주를 마우스 위점막에서 생존할 수 있도록 개질시켜 에이치. 피롤리 감염의 유용한 모델을 만들었다. 이 모델을 백신 연구에 사용하였다. 이하에는 이 균주의 유도체화 방법, 마우스 모델의 특성 규명 및 본 발명의 재조합 항원의 유효성을 입증하는데 사용된 방법을 상세히 기술한다.
1.2 마우스 개질
환자에게서 다수의 에이치. 피롤리의 새로운 임상 분리물과 생검 재료를 수득하였다. 생검재료 및/또는 새로운 임상 분리물의 분쇄물을 특정 병원균이 없는(SPF) BALB/c 마우스에게 경구적으로 접종하였다. 감염된 마우스에게서 채취한 위 시료를 직접 위상 현미경법 및 우레아제 분석법으로 조사하였다. 4가지 임상 분리물의 혼합물을 접종한 1군의 동물들에게서 양성의 우레아제 결과를 산출하는 나선형 박테리아가 군집을 형성하는 것으로 발견되었다. 집락을 형성하고 있는 동물 유래의 위 점액을 5% 말 혈액과 반코마이신(100㎍/㎖), 폴리믹신 B(3.3㎍/㎖), 바시트라신(200㎍/㎖), 날리딕산(10.7㎍/㎖) 및 암포테리신 B(50㎍/㎖)를 함유하는 혈액 한천 기제상에서 배양하였다. 대표적인 콜로니를 위상차 현미경으로 조사하고 우레아제 및 카탈라제 활성을 측정하였다. 그 결과 에이치. 피롤리의 특징, 즉 나선형, 우레아제 및 카탈라제 활성이 양성인 것으로 나타난 콜로니로부터 DNA를 추출하였다. 분리물들은 헬리코박터 특이적인 PCR로 검사한 결과 헬리코박터 속에 속하는 것으로서 확인되었다. 4가지 임상 분리물중에서 마우스에서 집락을 형성하는 것을 동정하기 위해, RAPD를 수행하였다. 결과적으로 얻어진 인체 임상 분리물 모액과 마우스 분리물의 핑거프린트를 비교하였다. 비교 결과는 마우스에게 접종했던 4가지 임상 분리물중 한 분리물만이 모든 마우스내에서 집락을 형성하는 것으로 나타났다. 또한, 인체 분리물과 마우스 분리물은 PCR에 의해 vacA 및 cagA 양성인 것으로 발견되었다. 이어서, 마우스 분리물을 마우스에게로 추가 3회 계대배양했다.
본 발명에 따른 표준 마우스 개질 배양물로서, 배양물 모액과 감염된 마우스 유래의 분쇄물을 집락 형성시킨 SJL 마우스에게서 수득한 HpM8로 명명한 한 분리물을 선택했다. 이 분리물을 에이치. 피롤리의 시드니 균주(Sydney Strain)라고 한다[이 균주는 Syd1으로 다시 명명하였고 뉴 사우스 웨일즈 대학의 미생물 및 면역학과 배양 수집소에 기탁되어 있다(World Directory of Collections of Cultures of Microorganisms. 기탁 번호 248)].
1.3 마우스 균주 특이성
분리물인 Syd1은 BALB/c, DBA, SJL, C3H/He, C3H/HeJ, C57BL/6 및 Quackenbush/Swiss를 비롯한 다수의 마우스 균주중에서 집락을 형성하는 것으로 발견되었다. 이 박테리아는 마우스 위의 모든 영역, 즉 동, 체 및 분문구 해당 영역에서 집락을 형성하는 것으로 발견되었고, 일부 마우스 균주에서는 동과 체의 점막사이에 있는 연 부위에서 주로 집락을 형성하였다. 집락화 패턴은 접종된 마우스 종에 따라 다른 것으로 발견되었다. 본 연구에는 BALB/c 마우스를 선택하였다. 전자현미경으로 관찰한 결과, 인체 감염시 관찰되는 바와 같이, 때로 유착 기저를 형성하는 상피 표면에 박테리아가 밀착하여 결합되어 있는 것을 발견하였다. 일반적인 집락화 분석법에 있어서, 우레아제 반응성은 박테리아수와 상관관련이 많은 것으로 나타났고, 이에 따라 에이치. 피롤리 집락화의 분석법으로서 사용되었다.
2. 이.콜리 발현 벡터내로 항원 암호 영역의 서브클로닝
특정 발현 벡터에 클로닝하기 위해 적당한 제한 효소 부위를 포함하도록 디자인된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 대표 클론들을 PCR 증폭하므로써 에이치. 피롤리 클로닝된 B군, C군, E군, G군 및 H군 유래의 특정 항원 암호 서열을 분리하였다(표 2).
B군, C군 및 E군의 증폭 생성물을 pGEX-STOP 벡터(종지 코돈이 GST의 N-말단에 가깝게 삽입되어 있고, 리보좀-결합 부위, 초과의 제한 부위들 및 6개의 히스티딘 태그가 다중 클로닝 부위내에 삽입되어 있는 pGEX-4T-1(Pharmacia)의 변형체)의 XmaI/BglII 부위에 클로닝하였다. 이로써 C-말단 헥사-히스티딘 태그를 함유하는 비융합 단백질(헥사-HIS)을 생산할 수 있었다. C군 및 B군의 작제물은 이.콜리 균주 ER1793중에서 형질발현시키고, E군은 이.콜리 BL21중에서 형질발현시켰다.
G군의 증폭 생성물은 pSE420(Invitrogen)의 NcoI/EcoRI 부위에 클로닝하고 이.콜리 균주 JM109중에서 발현시켜 정제용 태그를 함유하지 않는 비융합 단백질을 생성하였다.
천연 단백질을 생성하는 것이 어려운 것으로 밝혀진 H군의 경우에는 증폭 생성물을 pGEX-3X의 BamHI/EcoRI 부위내로 클로닝시켜 이.콜리 균주 JM109중에서 GST 융합 단백질을 생성하였다.
| 군 | 순방향 | 역방향 |
| B | 5'CGCCCGGGATGAAAAATCAAGTTAAAAAAATT3'(서열번호 17) | 5'GCAGATCTAACCTACTTTTAACCATGCCCAA3'(서열번호 18) |
| 군 | 순방향 | 역방향 |
| C | 5'GGGCCCGGGATGGCAATTTCAAAAGAAG3'(서열 번호 19) | 5'GGGGTCGACTAAGATCTCTTGACTTCAACCTAGCG3'(서열번호 20) |
| E | 5'GCGCCCCGGGATGTCAAATAGCATGTTGGATAAAAATAAA3'(서열번호 21) | 5'GCGCAGATCTAGGTTTAATGGTAACTAACACGCTCATCCG3'(서열번호 22) |
| G | 5'CATGCCATGGGCTTTGGGAATAAGCAGTTGCAAC3'(서열번호 23) | 5'CGGAATTCTCATTCGCCTTTTTGAATTTTTTCAATG3'(서열번호 24) |
| H | 5'CATGCCATGGGATACGCAAGCAAATTAGCC3'(서열번호 25) | 5'CGGAATTCTTATCGGCTTGAAGTGTTCTTTTTC3'(서열번호 26) |
3. 증식 조건 및 재조합 단백질의 생산
상기 재조합 클론을 Terrific 배지(Tartof and Hobbs(1987))중에서 37℃ 하에 증식시키고, 최종 농도가 1mM이 되도록 IPTG를 첨가하여 재조합 단백질의 생성을 유도하면서 항온배양을 하룻밤동안 계속하였다. 세포를 수거하고 이후의 단백질 정제나 초음파처리에 사용하거나 총세포 면역원으로서 사용하기 위해 동결시켜 저장하였다.
4. 재조합 단백질의 정제
4.1 헬리코박터 피롤리 재조합 단백질 B의 분리 및 정제
4.1.1 서론
고정화된 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC)를 정제 과정에 사용할 수 있도록 Hexa-HIS 태그를 사용하여 단백질 B를 발현시켰다.
4.1.2 이.콜리 세포 펠릿으로부터 단백질 B의 분리
단백질 B를 발현하는 이.콜리 세포의 배양물(약 32L)로부터 세포 펠릿을 수득하였다. 이 펠릿을 50mM 인산염 / 50mM NaCl / 1mM EDTA / 5%(v/v) 글리세롤 / 0.05% NaN3, pH 7.5 용액 520㎖에 첨가하고 부드럽게 교반하면서 재현탁시켰다. 이 현탁액을 얼음상에서 총 3분동안 15㎛의 진폭으로, 초음파 처리 1분 마다 1분간의 정지 기간을 두고 초음파처리하였다. 완전한 세포 용균을 광학현미경으로 확인하였다.
초음파처리된 현탁액은 JA-10 로터(미국, 베크만)를 사용하여 3200 x g로 30분동안 원심분리하였다. 상청액 대부분은 버리고, 펠릿을 인산염/NaCl 완충액(50mM 인산염/0.5M NaCl/0.05% NaN3, pH 7.5) 400㎖중에 재현탁시키고 5000 x g로 원심분리시켰다. 이와같이 수득한 펠릿을 0.1% Tween을 함유하는 인산염/NaCl 완충액중에 재현탁시키고, 원심분리한 뒤, 마지막으로 펠릿을 7.5M 우레아를 함유하는 인산염/NaCl 완충액중에 첨가하여 하룻밤동안 얼음상에서 교반하면서 용해시켰다. 그 다음 상기 제조물을 10000 x g로 원심분리하고, 상청액을 수거한 뒤, 2회 이상 원심분리하고 수득되는 상청액(690㎖)을 수거하였다. 또한, 단백질 B의 부가량은 추가 32L의 배양물로부터 유래된 이.콜리 세포 펠릿으로부터 제조하였다.
4.1.3 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC)에 의한 단백질 B의 부분 정제
상기 단백질 B의 각각의 최종 제조물을, 제조자의 지시에 따라 니켈을 충전한 킬레이트화 세파로스 파스트 플로우(Chelating Sepharose Fast Flow(스웨덴에 소재하는 파마시아 제품, 50mm x 100mm 또는 26mm x 104mm)) 컬럼(유속, 2㎖/min)에 장입하였다. 컬럼에 결합하는 오염물은 10배 컬럼 부피량의 20mM 인산염/0.5M NaCl/0.05M 이미다졸/7.5M 우레아, pH 7.5를 사용하여 컬럼을 세정하여 용출시켰다. 단백질 B는 20mM 인산염/50mM NaCl/7.5M 우레아, pH 6.0을 사용하여 3㎖/min의 유속으로 컬럼으로부터 용출시켰다. 분획물을 수거하고 컬럼으로부터 용출된 피크를 280nm의 흡광도로 모니터하였다. 분획물을 헬리코박터 피롤리에 대하여 생성된 래빗 혈청을 사용하여 SDS-PAGE 및 웨스턴 전이로 조사하였다.
4.1.4 단백질 B의 리폴딩 및 추가 정제
부분-정제된 단백질 B를 리폴드하고 우레아를 제거하기 위해, 단백질 B를 함유하는 IMAC 컬럼으로부터 용출된 분획물을 모아서 20mM 인산염/500mM NaCl, pH 7.5(5L)에 대하여 투석하고 완충액을 1회 교환한 다음, 20mM 인산염/50mM NaCl, pH7.5에 대하여 투석하였다. 잔류물을 GPR 원심분리기(베크만)를 사용하여 3000 x g로 30분동안 원심분리하고, 상청액을 수거하여 추가 정제를 위해 보관해 두었다. 펠릿은 7.5M 우레아를 함유하는 20mM 인산염/50mM NaCl, pH7.5중에 재현탁시킨 다음, 단백질 리폴딩을 보조하고 우레아를 부분적으로 제거하기 위해 10배 부피의 0.8M 아르기닌에 대하여 투석하였다. 수득되는 잔류물중의 단백질 함량은 표준물질로서 소 혈청 알부민을 사용하여 제조자의 지시에 따라 DC 단백질 분석법(BioRad, USA)으로 측정하였다. 분획물의 순도는 SDS-PAGE하고 농도계(Molecular Dynamics)를 사용하여 분리된 시료를 스캐닝하여 분석하였다. 마지막으로, 잔류물에 슈크로스를 최종 농도 10%(w/v)로 첨가하고 일정량은 -20℃에서 저장하였다.
4.1.5 단백질 B의 가용성 분획의 추가 정제
상기 제조한 단백질 B의 가용성 분획을 우레아를 함유하지 않는 완충액을 사용하여 4.1.3에서와 같이 IMAC 컬럼(16mm x 136mm)을 통해 통과시켜 추가 정제하였다. 이 IMAC 컬럼으로부터, 0.5M 이미다졸을 0 내지 100% 함유하는 20mM 인산염/150mM NaCl, pH 7.5의 선형 구배를 사용하여 3㎖/분의 유속으로 45분 동안 단백질 B를 용출시켰다. 단백질 B를 함유하는 분획을 모아서 PBS에 대하여 철저하게 투석하였다. 마지막으로 잔류물의 순도와 단백질 함량을 평가하고 이 제조물에 전술한 바와 같이 슈크로스를 첨가하였다. 이 제조물의 일정량은 -20℃에서 저장하였다.
4.2 헬리코박터 피롤리 재조합 단백질 C의 분리 및 정제
4.2.1 서론
고정화된 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC)를 정제 과정에 사용할 수 있도록 Hexa-HIS 태그를 사용하여 단백질 C를 발현시켰다.
4.2.2 이.콜리 세포 펠릿으로부터 단백질 C의 분리
단백질 C를 발현하는 이.콜리 세포의 배양물(약 56L)로부터 세포 펠릿을 수득하였다. 이 펠릿에 50mM 인산염 / 50mM NaCl / 1mM EDTA / 5%(v/v) 글리세롤 / 0.05% NaN3, pH 7.5 용액 900㎖를 첨가하고 부드럽게 교반하면서 펠릿을 재현탁시켰다. 이 현탁액을 얼음상에서 총 3분동안 16㎛의 진폭으로, 초음파 처리 1분 마다 1분간의 정지 기간을 두고 초음파처리하였다. 완전한 세포 용균을 광학현미경으로 확인하였다.
초음파처리된 현탁액은 JA-10 로터(미국, 베크만)를 사용하여 5000 x g로 30분동안 원심분리하였다. 상청액을 수거하여 16000 x g로 원심분리하여 추가 정제하였다. 이와 같이 얻어진 상청액(1025㎖) 대부분은 수거하고, 부분 정제한 상청액 55㎖는 0.45㎛ 막(미국, 밀리포어 제품)을 통해 통과시켜 여과한뒤 수거해 두었다. 어떤 펠릿도 육안으로 관찰할 수 없을 때까지 상청액을 2회 이상 원심분리하였다. 최종 상청액(825㎖)을 여과물(45㎖)과 혼합하여 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피 컬럼에 장입하였다.
4.2.3 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC)에 의한 단백질 C의 정제
상기 단백질 C의 제조물은, 제조자의 지시에 따라 니켈을 충전한 킬레이트화 세파로스 파스트 플로우(Chelating Sepharose Fast Flow(스웨덴에 소재하는 파마시아 제품, 50mm x 100mm) 컬럼(유속, 3㎖/min)에 장입하였다. 컬럼에 결합하는 오염물은 10배 컬럼 부피량의 20mM 인산염/0.5M NaCl/0.05M 이미다졸, pH 7.5를 사용하여 컬럼을 세정하여 용출시켰다. 단백질 C는 0 내지 100%의 0.5M 이미다졸을 함유하는 20mM 인산염/50mM NaCl, pH 7.5의 선형 구배를 사용하여 10㎖/min의 유속으로 100분 동안 컬럼으로부터 용출시켰다. 분획물(15㎖)을 수거하고 컬럼으로부터 용출된 피크를 280nm의 흡광도로 모니터하였다. 분획물을 헬리코박터 펠리스에 대하여 생성된 마우스 혈청을 사용하여 SDS-PAGE 및 웨스턴 전이로 조사하였다.
4.3 헬리코박터 피롤리 재조합 단백질 E의 분리 및 정제
4.3.1 초음파처리
이.콜리 세포 발현 단백질 E를 펠릿화하고, 인산염 완충 식염수(PBS; 7.7mM Na2HPO4, 150mM NaCl, 2.25mM NaH2PO4)중에 재현탁시켰다. 세포를 얼음상에 방치하고 초음파 세포 파쇄기를 사용하여 3분(1분 간격을 두고 3 x 1분간 작동)동안 초음파처리하였다. 완전한 세포 파쇄를 위상차 현미경으로 확인하였다. 그 다음 초음파처리물을 10000g에서 20분동안 원심분리하고 펠릿을 수거하였다. 이 펠릿을 PBS로 세정하고 원심분리를 반복하였다.
초음파처리물의 펠릿을 25mM Tris, 7M 우레아, pH 9.5중에 2시간동안 실온에서 용해시켰다. 25000g에서 30분동안 3회 원심분리시켜 모든 남아있는 미립자를 제거하였다. 이와 같이 수득된 상청액을 크로마토그래피를 위해 보관해 두었다.
4.3.2 크로마토그래피
60 x 100mm의 Q 세파로스 고성능(음이온 교환) 컬럼(파마시아)을 3 컬럼 부피량의 25mM Tris, 7M 우레아, pH9.5를 사용하여 85 cm/hr(40㎖/분)의 유속으로 평형화시켰다. 용해된 물질을 컬럼상에 주입하고 동일한 완충액을 3 컬럼 부피량 통과시켜 세정하였다. 처음 2개의 컬럼 세정물과 함께 비결합된 물질을 수거하였다. 그 다음 결합된 물질을 추가로 3배의 컬럼 부피량의 25mM Tris, 7M 우레아, 1M NaCl, pH9.5를 통과시켜 컬럼으로부터 분리하였다.
크로마토그래피로부터 유출된 비결합된 물질은 질소하에 교반되는 셀중에서 YM10(10kDa 컷오프) 막을 사용하여 농축시켰다. 그 다음 농축물(25㎖)을 50mM Tris, 2M 우레아, pH8(5L) 용액에 대하여 4℃에서 36시간동안 투석하여, 시료중의 우레아 농도를 감소시켰다.
4.4 헬리코박터 피롤리 재조합 단백질 G의 분리 및 정제
이.콜리 세포 발현 단백질 G를 정제하기 위해 세포 펠릿으로서 얻었다. 이 세포를 약 2배 부피량의 50mM Tris-HCl, 5% 글리세롤, 1mM 디티오트레이톨, 1mM Pefabloc SC(독일, 뵈링거 맨하임)중에 현탁시키고 얼음상에서 초음파처리하여 용균시켰다(MSE). 용균물을 3000g에서 30분동안 원심분리시켰다. 상청액을 분리하여 10,000g에서 30분동안 원심분리하였다.
pH를 8.0으로 조정하고 전도도를 5.5mS로 조정한 후, 상청액을 Hiload Q 세파로스 HP XK 26/10(파마시아) 컬럼에 장입하였다. 결합된 단백질은 50mM Tris-HCl pH8.0중에 NaCl을 0 내지 1M 함유하는 선형 구배로 용출시켰다. 0.2M NaCl에서 용출된 피크는 SDS-PAGE로 확인한 결과 단백질 G를 포함하는 것으로 확인되었다. 이 피크의 분획을 모았다.
이것을 BioRad(미국) 단백질 분석법을 사용하여 단백질 농도를 측정하고 표준물질로서 소 혈청 알부민을 사용하였다.
4.5 헬리코박터 피롤리 재조합 단백질 H의 분리 및 정제
4.5.1 방법 개요
간단히 설명하면, 이 방법은 이.콜리 세포를 초음파처리하고, 세정제중에 불순물을 용해시킨 뒤, 원심분리하고, 원심분리 펠릿을 재초음파처리 한 뒤, 세정제중에 불순물을 용해시키고, 원심분리한 다음, 원심분리 펠릿을 7M 우레아중에 용해시키고, 여과한 후, 음이온 교환 컬럼을 사용하여 불순물을 흡착시키고, 흡착되지 않은 컬럼상의 물질을 한외여과막상에서 농축시킨 후, pH를 9.5로 조정하고, 다시 음이온 교환 컬럼을 사용하여 불순물을 흡착시키고, 흡착되지 않은 컬럼 물질을 한외여과막으로 농축시킨 뒤 부분 희석시켰다.
이것의 단백질 농도는 총단백질 측정법인 Bradford 염료 결합 분석법으로 측정하였다. 모든 단계는 별도의 표시가 없는 한 주위 온도에서 수행하였다.
4.5.2 초음파 처리에 의한 이.콜리 세포 붕괴
세포를 -70℃에 저장하였다. 동결된 세포를 37℃의 수조에서 해동시키고 배양물 1mL 당 초음파 처리 완충액(10mM 인산염 + 150mM NaCl, pH 7.2) 50㎕에 현탁시켰다. 이.콜리 세포를 35mL 로트중에서 1분동안 ∼10μ의 진폭으로 초음파처리한 다음, 1분간 정지시키고, 이것을 3회 반복하여 붕괴시켰다. 이 시료는 초음파처리하는 동안 빙수중에 담궈 두었다. 초음파 처리전 세포 및 초음파 처리후 세포는 초음파 처리 과정동안 분쇄 얼음중에 보관하였다.
4.5.3 세정제중에 불순물의 가용화
세정제 트리톤 X100 20 v/v%를 초음파처리된 이.콜리 세포 제조물에 최종 트리톤 X100 농도가 1 v/v%로 될 때까지 서서히 첨가하였다. 이것을 자기 플리(flea)를 사용하여 30분동안 서서히 교반하였다.
4.5.4 원심분리
트리톤 X100 처리된 초음파처리물을 34,000g의 RCF로 30분동안 원심분리하고 산출되는 펠릿을 -20%C에서 하룻밤동안 저장하였다.
4.5.5 원심분리 펠릿의 재초음파처리
원심분리 펠릿에 이것의 3배량의 초음파처리 완충액(10mM 인산염 + 150mM NaCl, pH 7.2)을 첨가하여 펠릿을 재현탁시키고 ∼2분동안 강력하게 교반하였다. 이것을 전술한 바와 같이 초음파처리하였다.
4.5.6 세정제중에 불순물의 가용화
세정제 트리톤 X100 20 v/v%를 상기 재초음파처리된 원심분리 펠릿 제조물에 최종 트리톤 X100 농도가 1 v/v%가 될 때까지 교반하에 서서히 첨가하였다. 이것을 자기 플리를 사용하여 30분동안 서서히 교반하였다.
4.5.7 원심분리
트리톤 X100 처리된 초음파처리물을 34,000g의 RCF로 30분동안 원심분리하였다.
4.5.8 우레아중의 가용화
세정제 처리된 재초음파처리물의 원심분리 펠릿에, 세포 배양물 5000mL당 20mM 트리스(히드록시메틸)메틸아민 + 7.5M 우레아 pH 8.0 용액 100mL를 첨가하여 용해시키고 이것을 자기 플리를 사용하여 10분동안 교반시켰다.
4.5.9 여과
가용화된 원심분리 펠릿을 일련의 필터를 통하여 여과시켰다. 제 1 필터는 밀리포어 예비-필터 AW이고, 제 2 필터는 밀리포어 필터 0.8㎛(AA 형)이며, 제 3 필터는 밀리포어 필터 0.45㎛(HVLP형)이다.
4.5.10 음이온 교환 크로마토그래피에 의한 불순물의 흡착
여과된 제조물 60mL를 파마시아 Q 세파로스 HP 컬럼(크기 2.6 x 10.9cm)상에 장입하였다. 이 컬럼을 3배의 컬럼 부피량의 30mM 트리스(히드록시메틸)메틸아민 + 7.5M 우레아, pH 8.0(완충액 A)을 사용하여 평형화시켰다. 이 시료를 컬럼에 50cm/hr의 속도로 장입하고, 장입후 완충액 A를 120cm/hr의 속도로 유입시켜 컬럼을 세정하였다. 이 컬럼에 흡착되지 않은 분획은 항원을 함유하고 있는 반면 대부분의 오염 물질은 컬럼에 결합하였다.
4.5.11 농축
흡착되지 않은 분획을 30kDa에서 컷 오프되는 한외여과막인 AMICON YM30을 사용하여 10배 농축시켰다.
4.5.12 음이온 교환 크로마토그래피에 의한 불순물의 흡착
흡착되지 않은 분획의 농축물 전체의 pH를 1M NaOH를 사용하여 8.0에서 9.5로 조정하였다. 이것을 파마시아 Q 세파로스 HP 컬럼(크기 2.6 x 10.9cm)상에 장입하였다. 이 컬럼을 3배 컬럼 부피량의 30mM 트리스(히드록시메틸)메틸아민 + 7.0M 우레아, pH 9.5(완충액 A)를 사용하여 평형화시켰다. 상기 시료를 이 컬럼상에 장입한 다음 완충액 A로 56cm/hr의 속도로 세정하였다. 컬럼에 흡착되지 않은 분획은 항원을 함유하고 있는 반면 대부분의 오염 물질은 컬럼에 결합하였다.
4.5.13 농축 및 희석
흡착되지 않은 물질을 30kDa에서 컷오프되는 한외여과막인 AMICON YM30을 사용하여 ∼10배 농축시켰다. 이 생성물을 10mM 인산염 + 150mM NaCl, pH7.2를 사용하여 희석하여 우레아의 농도를 감소시켰다.
5. 면역 프로토콜
5.1 방법
이 실험에서는 6 내지 8주령의 SPF BALB/c 암컷 마우스를 사용하였다. 이 마우스에게 단백질 200㎍ 이하 + 콜레라 독소(시그마) 10㎍을 경구-위로 투여하여 면역화시켰다.
시험 군은 단독 정제된 재조합 단백질 항원 및 일부 단백질의 복합물을 포함하고 있다. 또한, 정제 처리되지 않았지만 재조합 항원을 발현하는 초음파 처리된 이.콜리 세포 제조물도 시험하였다. 또, 초음파 처리물의 복합물도 시험하였다. 에이치.피롤리 초음파처리물 + CT로 구성된 양성 대조군도 포함한다. 또한, CT 단독물이나, PBS 단독물로 면역화된 동물(둘다 항원투여됨) 및 면역화되지 않고 항원투여되지 않은 동물을 음성 대조군으로 사용하였다. 대표적인 마우스 일부로부터 항원투여하기 전에 꼬리 정맥으로부터 채혈하였다. 마우스를 면역화시킨지 1주 후부터 마우스에게 에이치.피롤리 3배 투여량을 항원투여하였다. 에이치.피롤리 항원투여 후 3주 후에 마우스를 안락사시키고 감염도와 면역 반응을 평가하기 위해 위, 혈청, 타액 및 담즙을 수거하였다.
5.2 투여율
마우스에게 하기 계획표에 따라 각 부피량을 투여하였다.
100㎕/투여량/마우스
(a) HpCT : 에이치.피롤리 총세포 초음파처리물 1mg + CT 10㎍
(b) CT 단독물 : PBS중의 CT 10㎍
(c) 정제된 C : 단백질 200㎍ + CT 10㎍
(d) B, C, E, G, H의 초음파처리물: + CT 10㎍
150㎕/투여량/마우스
(e) 정제된 G : 단백질 200㎍ + CT 10㎍
250㎕/투여량/마우스
(f) 정제된 B : 단백질 ∼114㎍ + CT 10㎍
(g) 정제된 E : 단백질 50㎍ + CT 10㎍
(h) 복합물 A : 동등량의 정제된 단백질 B, C G + CT 10㎍
(i) 복합물 B : 동등량의 단백질 B, C, E, G H의 초음파 처리물 + CT 10㎍
350㎕/투여량/마우스
(j) 정제된 H : 단백질 ∼50㎍ + CT 10㎍
- 2회 투여량으로 제공하는 경우 - 1회에는 200㎕, 2회에는 150㎕
5.3 실험 개요
| 일 | 마우스 군 | ||||
| Hp + CT[10] | PBS단독물[10] | CT단독물[10] | 시험 Ag + CT*[10] | 정상군[10] | |
| 071421 | HpCTHpCTHpCTHpCT | PBSPBSPBSPBS | CTCTCTCT | Ag + CTAg + CTAg + CTAg + CT | 정상정상정상정상 |
| 28 | 예비-항원처리 혈액 | ||||
| 28 | 에이치. 피롤리(10/군) 항원투여 | - | |||
| 30 | 에이치. 피롤리(10/군) 항원투여 | - | |||
| 32 | 에이치. 피롤리(10/군) 항원투여 | - |
| 일 | 마우스 군 | ||||
| Hp + CT[10] | PBS 단독물 [10] | CT 단독물 [10] | 시험 Ag + CT*[10] | 정상군[10] | |
| 52 53 | 에이치.피롤리로 항원처리된 선택 군 | - | |||
| *각각 별도로 투여되고 다른 재조합 항원과 복합물로 투여되는 5개의 재조합 항원. 항원은 정제 단백질로서 또는 총세포 초음파처리물로 만들어 시험함. |
5.4 항원투여
에이치.피롤리 Syd 1을 미호기성 조건하에 2일동안 액체 배양물(5% 말 혈청과 Skirrow의 선택 보충물로 보충된 BH1 액체배지)중에서 증식시켰다. 이 세포를 9000 rpm하에 15분동안 원심분리하고 농도를 약 109세포/㎖로 조정하였다. 백신 계획표에 따라 백신접종을 완료한 후 1주후에 면역화된 마우스와 대조군에게 매일 새로 만든 상기 현탁액 0.1㎖를 항원투여하였다. 동물중의 집락형성을 검출하기 위한 우레아제 분석을 항원투여후 24일간 실시하였다.
6. 결과
| 군 | 감염된 에이치.피롤리(양성 우레아제 시험)감염된 동물수/총 동물수 |
| 정제된 재조합 항원 | |
| 단백질 B | 0/10 |
| 단백질 C | 1/10 |
| 단백질 E | 0/9 |
| 군 | 감염된 에이치.피롤리(양성 우레아제 시험)감염된 동물수/총 동물수 |
| 단백질 G | 3/8 |
| 단백질 H | 1/10 |
| 복합물 | 1/10 |
| 재조합 항원을 발현하는 초음파처리된 이.콜리 세포 | |
| 단백질 B 발현 세포 | 8/10 |
| 단백질 C 발현 세포 | 8/10 |
| 단백질 E 발현 세포 | 3/9 |
| 단백질 G 발현 세포 | 7/10 |
| 단백질 H 발현 세포 | 6/10 |
| 복합물 | 7/10 |
| 대조군 | |
| 에이치.피롤리 초음파처리된 세포 + CT 면역화(양성 대조군) | 0/10 |
| PBS 면역화(음성 대조군) | 8/9 |
| CT 면역화 | 9/10 |
| 면역화되지 않고, 항원 투여되지 않음 | 0/10 |
이 결과는 점막 보조제와 함께 사용한 5가지 정제된 재조합 단백질 모두를 마우스의 경구-위로 투여시 에이치.피롤리 감염을 예방할 수 있음을 보여주고 있다. 정제되지 않은 이.콜리 총세포 초음파처리물을 사용한 결과는 방어성을 입증하기 위해서는 보다 높은 발현율이나 정제율이 필요하다는 것을 나타내고 있다. 면역 마우스(에이치.펠리스 초음파처리물로 면역화됨) 유래의 혈청을 사용하는 유전자 검색 방법은 2개의 공지된 에이치.피롤리 예방용 항원인 우레아제와 열 쇼크 단백질, 및 5가지 기타 다른 단백질의 존재를 동정하였다. 여기에서 보고된 결과는 이러한 5가지 단백질이 또한 감염 방어 항원이라는 것을 예시하는 것이다. 5가지 항원중 하나는 이전에 공지된 화합물(Kostrzynska et al, 1994)이나, 이 화합물이 감염 방어 항원인지에 대해서는 이전에 밝혀진 바 없다.
감염 방어 면역원성 제조물이 감염 치료 뿐만 아니라 감염 방어할 때 사용할 수 있다고 밝힌 바와 같이, 이러한 감염 방어 항원은 인체중의 헬리코박터 감염을 치료 뿐만 아니라 예방하는데 사용할 수 있을 것으로 예상된다. 이러한 헬리코박터 피롤리 항원을 동정하는데 사용된 헬리코박터 펠리스 마우스 모델의 정당성은 최근 개발된 에이치. 피롤리 마우스 모델중에서 마우스를 감염 예방하는 상기 항원의 작용성에 의해 입증된 바 있다. 따라서, 상기 항원은 단독물이나 복합물로서 인체중의 헬리코박터 감염을 치료 또는 예방하는데 사용되는 제품중의 감염 방어 항원으로서 사용할 수 있을 것으로 기대된다.
참고문헌:
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서 열 목 록
(1) 일반 정보 :
(i) 출원인 : 씨에스엘 리미티드
(ii) 발명의 명칭 : 예방용 헬리코박터 항원
(iii) 서열의 수 : 26
(iv) 서신 주소:
(A) 수신인 : 데이비스 콜리슨 케이브 페이턴트 어토니스
(B) 스트리트 : 리틀 콜린스 스트리트 1
(C) 도시 : 멜보른
(D) 주 : 빅토리아
(E) 국가 : 오스트레일리아
(F) ZIP : 3000
(v) 컴퓨터 판독 형태 :
(A) 매체 유형 : 플로피 디스크
(B) 컴퓨터 : 아이비엠 피씨 호환성
(C) 작동 체계 : PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어 : PatentIn Release #1.0, Version #1.25
(vi) 선행 출원 자료 :
(A) 출원 번호 : PCT 국제 출원
(B) 출원 일자 : 1996. 4. 19
(vii) 우선권 출원 데이터:
(A) 출원 번호 : 오스트레일리아 PN2575/95
(B) 출원 일자 : 1995. 4. 21.
(vii) 우선권 출원 데이터:
(A) 출원 번호 : 오스트레일리아 PN3931/95
(B) 출원 일자 : 1995. 6. 3.
(vii) 우선권 출원 데이터:
(A) 출원 번호 : 오스트레일리아 PN7565/96
(B) 출원 일자 : 1996. 1. 16.
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(A) 성명 : 존 엠. 슬레터리
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(2) 서열 번호 1 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 378 염기쌍
(B) 서열형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 분자 종류 : cDNA
(vi) 기원 :
(A) 미생물 : 헬리코박터 피롤리
(vii) 직접적인 기원 :
(B) 클론명 : 클론 C 3.5
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : CDS
(B) 위치 : 1..375
(xi) 서열 번호 1의 서열:
(2) 서열 번호 2 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 125 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 분자 종류 : 단백질
(xi) 서열 번호 2 의 서열 :
(2) 서열 번호 3 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 990 염기쌍
(B) 서열형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 분자 종류 : cDNA
(vi) 기원 :
(A) 미생물 : 헬리코박터 피롤리
(vii) 직접적인 기원 :
(B) 클론명 : 클론 E2.5
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : CDS
(B) 위치 : 1..987
(xi) 서열 번호 3의 서열:
(2) 서열 번호 4 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 329 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 분자 종류 : 단백질
(xi) 서열 번호 4 의 서열 :
(2) 서열 번호 5 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 1302 염기쌍
(B) 서열형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
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(ii) 분자 종류 : cDNA
(vi) 기원 :
(A) 미생물 : 헬리코박터 피롤리
(vii) 직접적인 기원 :
(B) 클론명 : 클론 G3.8
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : CDS
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(xi) 서열 번호 5의 서열:
(2) 서열 번호 6 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 433 아미노산
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(2) 서열 번호 7 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 771 염기쌍
(B) 서열형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 분자 종류 : cDNA
(vi) 기원 :
(A) 미생물 : 헬리코박터 피롤리
(vii) 직접적인 기원 :
(A) 라이브러리 : 클론 H5.1
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : CDS
(B) 위치 : 1..768
(xi) 서열 번호 7의 서열:
(2) 서열 번호 8 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 256 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 분자 종류 : 단백질
(xi) 서열 번호 8 의 서열 :
(2) 서열 번호 9 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 528 염기쌍
(B) 서열형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 분자 종류 : cDNA
(vi) 기원 :
(A) 미생물 : 헬리코박터 피롤리
(vii) 직접적인 기원 :
(B) 클론명 : 클론 B4.6
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : CDS
(B) 위치 : 1..525
(xi) 서열 번호 9의 서열:
(2) 서열 번호 10 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 175 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 분자 종류 : 단백질
(xi) 서열 번호 10 의 서열 :
(2) 서열 번호 11 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 10 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 분자 종류 : 펩티드
(v) 단편 종류 : N-말단
(vi) 기원 :
(A) 미생물 : 헬리코박터 피롤리
(xi) 서열 번호 11 의 서열 :
(2) 서열 번호 12 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 18 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 분자 종류 : 펩티드
(v) 단편 종류 : N-말단
(vi) 기원 :
(A) 미생물 : 헬리코박터 피롤리
(xi) 서열 번호 12 의 서열 :
(2) 서열 번호 13 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 18 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 분자 종류 : 펩티드
(v) 단편 종류 : N-말단
(vi) 기원 :
(A) 미생물 : 헬리코박터 피롤리
(xi) 서열 번호 13 의 서열 :
(2) 서열 번호 14 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 15 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 분자 종류 : 펩티드
(v) 단편 종류 : N-말단
(vi) 기원 :
(A) 미생물 : 헬리코박터 피롤리
(xi) 서열 번호 14 의 서열 :
(2) 서열 번호 15 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 15 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 분자 종류 : 펩티드
(vi) 기원 :
(A) 미생물 : 헬리코박터 피롤리
(xi) 서열 번호 15 의 서열 :
(2) 서열 번호 16 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 15 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 분자 종류 : 펩티드
(v) 단편 종류 : N-말단
(vi) 기원 :
(A) 미생물 : 헬리코박터 피롤리
(xi) 서열 번호 16 의 서열 :
(2) 서열 번호 17 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 32 염기쌍
(B) 서열형 : 핵산
(C) 가닥수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 분자 종류 : DNA(게놈)
(iv) 앤티센스 : 아니오
(xi) 서열 번호 17 의 서열 :
(2) 서열 번호 18 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 31 염기쌍
(B) 서열형 : 핵산
(C) 가닥수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 분자 종류 : DNA(게놈)
(iv) 앤티센스 : 예
(xi) 서열 번호 18 의 서열 :
(2) 서열 번호 19 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 28 염기쌍
(B) 서열형 : 핵산
(C) 가닥수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 분자 종류 : DNA(게놈)
(iv) 앤티센스 : 아니오
(xi) 서열 번호 19 의 서열 :
(2) 서열 번호 20 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 36 염기쌍
(B) 서열형 : 핵산
(C) 가닥수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 분자 종류 : DNA(게놈)
(iv) 앤티센스 : 예
(xi) 서열 번호 20 의 서열 :
(2) 서열 번호 21 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 40 염기쌍
(B) 서열형 : 핵산
(C) 가닥수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 분자 종류 : DNA(게놈)
(iv) 앤티센스 : 아니오
(xi) 서열 번호 21 의 서열 :
(2) 서열 번호 22 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 40 염기쌍
(B) 서열형 : 핵산
(C) 가닥수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 분자 종류 : DNA(게놈)
(iv) 앤티센스 : 예
(xi) 서열 번호 22의 서열 :
(2) 서열 번호 23 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 34 염기쌍
(B) 서열형 : 핵산
(C) 가닥수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 분자 종류 : DNA(게놈)
(iv) 앤티센스 : 아니오
(xi) 서열 번호 23 의 서열 :
(2) 서열 번호 24 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 36 염기쌍
(B) 서열형 : 핵산
(C) 가닥수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 분자 종류 : DNA(게놈)
(iv) 앤티센스 : 예
(xi) 서열 번호 24 의 서열 :
(2) 서열 번호 25 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 30 염기쌍
(B) 서열형 : 핵산
(C) 가닥수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 분자 종류 : DNA(게놈)
(iv) 앤티센스 : 아니오
(xi) 서열 번호 25 의 서열 :
(2) 서열 번호 26 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 33 염기쌍
(B) 서열형 : 핵산
(C) 가닥수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 분자 종류 : DNA(게놈)
(iv) 앤티센스 : 예
(xi) 서열 번호 26 의 서열 :
Claims (43)
- (i) 분자량이 약 17 kDa인 성숙한 형태로 가공되는 분자량이 약 19 kDa인 항원;(ii) 분자량이 약 13 kDa인 항원;(iii) 분자량이 약 36 kDa인 항원;(iv) 분자량이 약 50 kDa인 항원;(v) 분자량이 약 29 kDa인 항원; 및(vi) 포유류 숙주내에서 특이적인 감염 방어 면역 반응을 유도할 수 있는 상기 항원 (i) 내지 (v) 중 어느 한 항원의 면역원성 단편들로 구성된 군중에서 선택된 1종 이상의 헬리코박터 항원을 적어도 부분 정제한 제조물을 함유하는, 헬리코박터 감염의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 항원 제조물.
- (i) 분자량이 약 17 kDa인 성숙한 형태로 가공되는 분자량이 약 19 kDa인 항원;(ii) 분자량이 약 13 kDa인 항원;(iii) 분자량이 약 36 kDa인 항원;(iv) 분자량이 약 50 kDa인 항원;(v) 분자량이 약 29 kDa인 항원; 및(vi) 포유류 숙주내에서 특이적인 감염 방어 면역 반응을 유도할 수 있는 상기 항원 (i) 내지 (v) 중 어느 한 항원의 면역원성 단편들로 구성된 군중에서 선택되는, 포유류 숙주내의 헬리코박터 감염의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 분리된 헬리코박터 항원.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 1종 이상의 헬리코박터 피롤리 또는 헬리코박터 펠리스 항원이나, 이의 면역원성 단편을 함유하는 항원 제조물 또는 분리된 항원.
- 제1항 내지 제3항중 어느 하나의 항에 있어서, 항원(i)은 클론 B4.6의 추론 서열에 본질적으로 상응하는 아미노산 서열(서열 번호 10)이나 이의 대립유전자 또는 다른 변이체를 포함하고; 항원(ii)는 클론 C3.5의 추론 서열에 본질적으로 상응하는 아미노산 서열(서열 번호 2)이나 이의 대립 유전자 또는 다른 변이체를 포함하며; 항원(iii)은 클론 E2.5의 추론 서열에 본질적으로 상응하는 아미노산 서열(서열 번호 4)이나, 이의 대립 유전자 또는 다른 변이체를 포함하고; 항원(iv)는 클론 G3.8의 추론 서열에 본질적으로 상응하는 아미노산 서열(서열 번호 6)이나, 이의 대립 유전자 또는 다른 변이체를 포함하며; 항원(v)는 클론 H5.1의 추론 서열에 본질적으로 상응하는 아미노산 서열(서열 번호 8)이나, 이의 대립 유전자 또는 이의 변이체를 포함하는 것을 특징으로 하는 항원 제조물 또는 분리된 항원.
- 면역학적 유효량의 제1항 내지 제4항중 어느 하나의 항에 기재된 항원 제조물이나 분리된 항원과 함께 1종 이상의 약학적 허용성 담체 및/또는 희석제를 함유하는, 포유류 숙주내의 헬리코박터 감염을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 백신 조성물.
- 제5항에 있어서, 1종 이상의 부가 활성 면역원을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
- 제6항에 있어서, 부가 면역원(들)이 1종 이상의 다른 헬리코박터 항원을 함유하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
- 제7항에 있어서, 다른 헬리코박터 항원이 헬리코박터 우레아제, 리포폴리사카라이드, Hsp60, VacA, CagA 및 카탈라제중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
- 제5항에 있어서, 보조제를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
- 제9항에 있어서, 보조제가 점막 보조제인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
- 제1항 내지 제4항중 어느 하나의 항에 기재된 항원 제조물 또는 분리된 항원을 면역학적 유효량으로 포유류 숙주에게 투여하는 것으로 구성되어, 포유류 숙주내의 헬리코박터 감염을 치료 또는 예방하는 방법.
- 제11항에 있어서, 항원 제조물이나 분리된 항원이 보조제와 함께 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제12항에 있어서, 보조제가 점막 보조제인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제11항 내지 제13항중 어느 하나의 항에 있어서, 항원 제조물이나 분리된 항원이 숙주에게 경구 투여되는 것인 방법.
- 제11항 내지 제13항중 어느 하나의 항에 있어서, 항원 제조물이나 분리된 항원이 숙주에게 비경구 투여되는 것인 방법.
- 제11항 내지 제15항중 어느 하나의 항에 있어서, 숙주가 인간인 방법.
- 포유류 숙주내의 헬리코박터 감염을 치료 또는 예방하기 위한, 제1항 내지 제4항중 어느 하나의 항에 기재된 면역학적 유효량의 항원 제조물이나 분리된 항원의 용도.
- 제17항에 있어서, 항원 제조물이나 분리된 항원이 보조제와 함께 투여되는 것인 용도.
- 제18항에 있어서, 보조제가 점막 보조제인 것을 특징으로 하는 용도.
- 제17항 내지 제19항중 어느 하나의 항에 있어서, 항원 제조물이나 분리된 항원이 숙주에게 경구 투여되는 것인 용도.
- 제17항 내지 제19항중 어느 하나의 항에 있어서, 항원 제조물이나 분리된 항원이 숙주에게 비경구 투여되는 것인 용도.
- 제17항 내지 제21항중 어느 하나의 항에 있어서, 숙주가 인간인 것을 특징으로 하는 용도.
- 포유류 숙주내의 헬리코박터 감염을 치료 또는 예방하기 위한 백신 조성물의 제조에 사용하기 위한, 임의적으로 보조제를 함유하는 제1항 내지 제4항중 어느 하나의 항에 기재된 항원 제조물이나 분리된 항원의 용도.
- 제1항 내지 제4항중 어느 하나의 항에 기재된 항원 제조물이나 분리된 항원에 특이적인 항체.
- 제24항에 있어서, 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
- 제24항 또는 제25항에 기재된 항체와 함께 1종 이상의 약학적 허용성 담체 및/또는 희석제를 함유하는, 포유류 숙주내의 헬리코박터 감염을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 백신 조성물.
- 제24항 또는 제25항에 기재된 항체를 면역학적 유효량으로 포유류 숙주에 투여하여 숙주를 수동 면역화하는 것으로 구성되어, 상기 숙주내의 헬리코박터 감염을 치료 또는 예방하는 방법.
- 포유류 숙주내의 헬리코박터 감염을 치료 또는 예방하기 위한, 제24항 또는 제25항에 기재된 면역학적 유효량의 항체의 용도.
- 포유류 숙주내의 헬리코박터 감염을 치료 또는 예방하기 위한 백신 조성물의 제조에 사용하기 위한 제24항 또는 제25항에 기재된 항체의 용도.
- 제2항에 따른 헬리코박터 항원을 암호하고, 서열 번호 1, 3, 5, 7 또는 9중 어느 하나에 기재된 핵산 서열 전체 또는 그 일부, 또는 이의 상보 형태에 대해 낮은 스트린젠시 조건하에서 하이브리드하는 제2항에 기재된 헬리코박터 항원을 암호하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자.
- 서열 번호 1, 3, 5, 7 또는 9중 어느 하나에 기재된 것과 본질적으로 같은 뉴클레오티드 서열 또는 이의 일부분을 포함하는 핵산 분자.
- 제30항 또는 제31항에 기재된 핵산 분자에 작동가능하게 결합된 형질발현 조절 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자.
- 제32항에 있어서, 발현 조절 서열이 프로모토 서열 및 개시인자 서열을 포함하고, 이 프로모터와 개시인자 서열의 3' 위치에 뉴클레오티드 서열이 위치하는 것을 특징으로 하는 재조합 DNA 분자.
- 제32항 또는 제33항에 기재된 재조합 DNA 분자를 함유하는 재조합 DNA 클로닝 전파자 또는 벡터.
- 제34항에 있어서, 벡터가 플라스미드인 것을 특징으로 하는 재조합 DNA 클로닝 전파자 또는 벡터.
- 제32항 또는 제33항에 기재된 재조합 DNA 분자나, 제34항 또는 제35항에 기재된 재조합 DNA 클로닝 전파자 또는 벡터로 형질감염되거나 형질전환된 숙주 세포.
- 제36항에 있어서, 숙주 세포가 이.콜리인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
- 제36항 또는 제37항에 기재된 숙주 세포중에서 형질발현에 의해 제조된 재조합 폴리펩티드.
- 제2항에 기재된 분리된 헬리코박터 항원을 발현하는 백신 벡터나 이의 면역원성 단편을 함유하여, 포유류 숙주내의 헬리코박터 감염을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 제조물.
- 제39항에 있어서, 벡터가 포유류 숙주의 위장관에서 집락을 형성하는 박테리아인 제조물.
- 제39항에 있어서, 벡터가 살모넬라, 시겔라, 예르시니아, 비브리오, 에세리히아 또는 비씨지 박테리아인 것을 특징으로 하는 제조물.
- 제39항 내지 제41항중 어느 하나의 항에 기재된 제조물을 포유류 숙주에게 투여하는 것으로 구성되어, 상기 숙주내의 헬리코박터 감염을 치료 또는 예방하는 방법.
- 포유류 숙주내의 헬리코박터 감염을 치료 또는 예방하기 위한, 제39항 내지 제41항중 어느 하나의 항에 기재된 제조물의 용도.
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