KR100476502B1 - 항-헬리코박터 필로리 고역가 항체 제조방법 및 이를함유하는 식품 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 항-헬리코박터 필로리(anti-Helicobacter pylori) 고역가 항체 및 이를 함유하는 식품에 관한 것으로, 좀 더 구체적으로는 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori)의 균체파쇄액중 분자량 100,000이하의 단백질을 포함하는 항원으로 면역된 산란계가 생산하는 계란의 난황으로부터 얻어지는 항-헬리코박터 필로리(anti-Helicobacter pylori)의 항체 및 이를 유효량으로 함유하는 식품에 관한 것이다. 본 발명에 의해 제조된 면역 단백질 항원은 고역가의 항체를 함유한 계란을 제공하며, 또한 IgY 분리방법에 있어 종전의 방법보다 빠르고 효율적인 방법을 개발함으로 역가 측정시 시간적인 면 및 경제적인 면을 더욱 증대시키는 것을 특징으로 한다.
Description
본 발명은 항-헬리코박터 필로리(anti-Helicobacter pylori) 고역가 항체 및 이를 함유하는 식품에 관한 것으로, 좀 더 구체적으로는 산란계로부터 항-헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori)의 항체를 얻고, 이를 용이하게 분리하여 위 질환을 유발시키는 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori)의 감염 및 생육을 억제시키기 위해 첨가시킨 식품에 관한 것이다.
1954년 팔머(Palmer)의 위산이 없으면 궤양도 없다는 개념이 정설로 받아들여졌으나, 1983년 위염환자의 위 점막에서 서식하고 있는 그람 음성의 나선 막대형 박테리아인 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori)를 마셀(Marshall)과 워렌(Warren)이 분리 배양하는데 성공하였고 그 이후 많은 논문에서 위염 및 위궤양 등의 위 질환이 이 세균에 의한 감염성 질병이라는 사실이 규명되어 졌다.
헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori)의 감염은 식품 등과 함께 경구적으로 침입한 균이 위, 십이지장 점막에 부착함에 따라 시작되는데, 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori)의 병독 인자를 살펴보면 위내의 강산에서 생존하기 위해 분비하는 유레아제(urease), 자유롭게 운동성을 유지하는 프라겔라, 위 상피세포에 쉽게 부착하도록 도와주는 세포 표면의 외막단백질이 있다.
최근, 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori)에 대응하는 제제들의 개발동향을 보면, 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori)에 직접적으로 항균작용을 나타내는 항생제의 개발과 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori)에 대한 백신의 개발 및 항체의 이용으로 크게 나누어 볼 수 있다.
항생제를 이용하는 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori)에 의한 위 질환 치료제에 관한 것으로서, 얀센제약의 굴리레몬트 등은 퀴놀린 유도체를 개발했으며(1993), 쉬미드트 등은 데메티곤을 개발했다(1993). 후지사와 제약의 하모나 등은 H2 수용체 길항제인 4-티에닐-2-아미노-티아졸 화합물을 개발하였고(1995), 듀멕스사의 다이르스트린 등은 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori)를 사멸시키는 사카로스 옥타설페이트 아미노-글리코사이드 염을 개발했다(1995). 한편 메트로니다졸(metronidazole), 비스무스(bithmuth) 제제, 및 오메프라졸(omeprazol) 등을 혼합한 3중 요법이 많이 사용되고 있다. 이와 같은 제제들은 일단 치료효과에는 어느 정도 성공을 거두고 있으나, 재발되는 비율이 매우 높다. 재발율이 높은 이유로는 이러한 제재들이 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori)에 직접적으로 작용하지 않고 위산분비를 억제하는 것을 주된 약리 작용으로 하고 있으므로, 위 질환의 원인인 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori)가 제거되지 않고 항생제에 내성을 갖는 새로운 균주가 나타나기 때문이다.
백신과 항체를 이용하는 방법은 예방적인 차원에서 적용할 수 있는 방법이며, 특히 항체를 이용하는 방법은 일상적으로 섭취하는 식품을 통해서도 적용이 가능한 방법이다.
일본 특개평 제4-275232호에서는 항원으로서 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori) 전 세포에 대하여 면역된 산란계로부터 얻어진 항체를 사용하는 식품에 관해 개시하고 있다. 한국 공개특허 제2000-056981호에서는 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori)의 프라겔라, 유레아제(urase), 외막단백질을 항원으로 해서 면역한 산란계로부터 특이적 항체를 얻는 방법이 개시되어 있다. 그러나 이 같은 방법은 각각의 분리, 정제공정을 거쳐야 하는 번거러움과 함께 대량의 계군에 면역하는 데에는 면역원량 확보에 있어서 현실적으로 어려움이 있고 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori) 균체 파쇄액을 그대로 항원으로 사용한 경우와 비교하였을 때, 항체 역가의 차이는 크게 다르지 않았다.
이에 본 발명자들은 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori)의 항체역가를 높이는 동시에 난황에서 IgY를 빠르게 분리하여 식품에 첨가 또는 자체로 이용했을 때 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori)의 성장을 효과적으로 억제, 예방할 수 있는 방법을 예의 연구하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
따라서, 본 발명은 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori) 균체 파쇄액 중 헬리코박터 필로리의 항체 역가를 높일 수 있는 특정 분자량의 단백질을 추출하여 항원으로 사용하여 면역된 산란계가 생산하는 계란의 난황으로부터 얻은 항체 역가가 높은 항-헬리코박터 필로리 항체를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항체를 유효성분으로 함유하여 위 질환을 예방 및 치료할 수 있는 식품을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 난황에서 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori)에 대한 항체 분리시 다른 시약을 사용하지 않고 물로서만 분리하는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 항-헬리코박터 필로리 항체는 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori)의 균체파쇄액중 분자량 100,000이하의 단백질을 포함하는 항원으로 면역된 산란계가 생산하는 계란의 난황으로부터 얻어진다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위한 식품은 상기 항-헬리코박터 필로리(anti-Helicobacter pylori)의 항체를 유효성분으로 함유한다.
이하, 본 발명을 좀 더 구체적으로 살펴보면 다음과 같다.
일반적으로, 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori)는 강력한 위산으로 보호되어 있고 세균이 살지 못할 것으로 생각되었던 위에서 유레아제(urase)를 생산하여 주위를 감싸고 있는 pH 2∼3의 산성이 강한 위산으로부터 피해를 입지 않도록 자기 주위의 산도를 낮추어 생존하면서 위 질환을 유발한다.
따라서, 본 발명에서는 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori) 균체에서 분자량이 100,000 이하의 단백질을 추출하여 항원으로 사용함으로써 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori) 균체 파쇄액을 그대로 사용하는 방법과 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori)의 프라겔라, 유레아제, 외막단백질을 항원으로 사용하는 방법에 비해 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori)의 항체역가를 크게 향상시킬 수 있다. 상기 분자량이 100,000 이하의 단백질은 일반적으로 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori) 균체 파쇄액을 초음파(Sonication)로 처리한 후 상등액을 한외여과(Ultrafiltration) 시스템에서 기공크기(pore size)가 분자량 10만 이상은 걸리고 10만 이하는 빠지는 막(membrane)을 사용하여 그 용출(elution)된 용액을 동결 건조(Freeze drying)한 후 사용한다. 이때, 상기 단백질의 분자량을 100,000 이하로 한정하는 이유는 균주 표면항원 중 항원성이 높은 항원결정군(epitope)이 분자량 10만 이하로 이루어진 당단백질이므로 당연히 10만 이하의 항원을 선정하는 것이 10~30만사이 항원, 30~50만 사이 항원, 전체 혼합 항원액 보다 항원성이 높아 높은 역가의 항체를 생산 할 수 있기 때문이다.
본 발명에 따르면, 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori)의 특이적 항체를 제조하기 위하여, 균체 파쇄액을 한외여과(ultra filtration)하여 분자량이 100,000 이하인 단백질을 항원으로 사용하여 산란계에 면역하였다. 면역에 사용한 산란계는 30주령된 Hi-line을 사용하였고, 피하주사 또는 근육내 주사와 같은 방법을 통하여 항원을 접종하였다. 면역성을 증가시키기 위하여 상기 단백질과 함께 미네랄 오일 성분의 보조제(예를 들어, Montanide ISA 70)를 항원으로 사용하였다. 상기 단백질과 보조제의 혼합 비율이 항체 역가를 높이는 효율면에서 8:2∼2:8이 바람직하다. 상기 보조제의 기능은 단백질을 오일로 유화시켜 면역시 항원성을 높여 항체의 유발을 높이는데 있다. 상기 단백질과의 혼합비를 벗어나면 고항체 역가를 유발하지 못하므로 최적의 비율을 사용하는 것이 바람직하다.
항원의 투여는 단백질 및 보조제의 비율과 투여량 보조 실험의 결과에 따라 가장 항체 역가가 가장 높은 것을 선택하여 투여하였으며, 난황으로 이행된 특이적 항체값은 ELISA를 통해 측정하였고 상기 방법을 통해 적정한 항체 역가를 함유한 계란을 수집하였다. 따라서, 상기 산란계에 투여되는 상기 단백질의 양은 50∼200㎍/㎖이 바람직하며, 50㎍/㎖ 미만이면 산란계의 항체 형성이 떨어지며, 200㎍/㎖를 초과하면 투여된 량에 비례하여 항체 역가의 증가가 없어 비경제적이다. 항체의 투여시기는, 예를 들어, 140일령 산란계의 경우, 2주 간격으로 약 2∼3회를 투여하는 것이 바람직하다.
항체의 분리는 일반적인 방법에 따라 분리 할 수 있겠으나 경제적, 시간절약 및 식품의 안정성을 고려하여 물을 사용하여 분리한다. 본 발명에 따른 항체는 면역 후 계란에서 얻은 난황액을 물을 이용하여 리포-단백질(lipo-protein)을 제거한 후 사용하였다. 본 발명에 따르면, 상기 항체는 난황과 물을 1:5∼1:10으로 혼합한 다음, 원심분리시켜 난황 수용성 단백분획을 회수하여 분리된다. 난황분리 시 물과의 혼합비율을 벗어나면 지단백질층(침전)과 수용성 단백질층이 완전히 분리가되지 않아 역가측정시 저해작용이 발생되어 최적의 항체검사(ELISA)를 할 수 없다.
한편, 본 발명에 따른 식품은 상기 항-헬리코박터 필로리(anti-Helicobacter pylori)의 항체를 유효성분으로 함유한다. 바람직한 항체의 양은 상기 식품 총 중량의 0.05∼5중량%이다. 또한, 상기 식품은 발효유, 아이스크림, 빵, 과자, 조제분유, 음료, 마가린, 버터, 치즈, 또는 유아용 식품과 같은 일상적으로 섭취하는 일반식인을 포함하고, 바람직하게는 요구르트, 우유, 계란자체, 제과, 제빵, 아이스크림, 과자, 사탕 등이지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
이와 같이, 본 발명은 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori)의 균체 파쇄액 중 분자량 100,000이하의 단백질을 한외 여과를 통해 분리한 후 항원으로 사용함으로써 균체 파쇄액을 그대로 항원으로 사용하는 경우에 비해 항체 역가를 크게 향상시키고, 이 항체를 함유하는 식품을 통해 위질환을 효과적으로 예방할 수 있게 된다. 또한 본 발명에 따르면 난황의 항체 분리시 물을 사용하여 식품의 안전성 확보 및 원가 절하의 효과를 얻을 수 있다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 좀 더 구체적으로 살펴보지만, 하기 예에 본 발명의 범주가 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] 항원의 제조
헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori) ATCC 43504를 5% 소 혈청(Bovine Calf Serum)을 함유한 브르셀라 배지(Brucella agar)에 접종한 후 10% CO2 배양기(incubator)에서 48시간 배양한다. 배양 후 균체를 모아 5% 소 혈청(Bovine Calf Serum)을 함유한 브르셀라 배지에 현탁시키고 상기 배양기에서 72시간 흔들면서 배양한다. 2회의 게대 배양을 통해 활력이 좋고 목적으로 하는 양의 배양액을 얻는다. 게대 배양시 유레아제 테스트(urase test), 현미경 테스트(microscopy test) 및 촉매 테스트(catalase test)를 통해 오염여부를 체크한다. 최종 배양액을 10,000×g에서 20분간 원심분리한다. 원심분리에 의해 얻어진 균체를 인산완충생리식염수에 현탁시킨 후 초음파로 파쇄한다. 30분 동안 10,000×g에서 파쇄되지 않은 균체를 제거하고 상등액을 10,000×g, 30분 동안 원심분리하여 인산완충생리식염수에 현탁시켰다. 현탁액을 랩스케일(Labscale) TFF 시스템(System) (MILLIPORE)을 이용하여 바이오맥스(Biomax)-300(MILLIPORE)을 통과한 분자량 100,000 이하의 단백질을 모아 항원으로 사용하였다.
[실시예 2] 산란계의 면역
실시예 1에서 제조한 단백질 항원을 이용하여 면역을 실시하였다. 항원(약 100㎍/㎖의 단백질 함유)을 미네랄 오일(Montanide ISA 70)와 5 : 5의 비율로 혼합하여 0.5㎖∼1㎖씩 가슴 근육에 주사하였다. 처음 면역 2주와 4주 후에 추가 면역을 동일한 항원과 미네랄 오일(상품명: Montanide ISA 70)을 상기와 같은 방법으로 혼합하여 사용하였다. 최초 면역 약 4주 후부터 상기 면역된 산란계가 생산한 난황의 항체 역가가 현저하게 상승하는 것을 볼 수 가있었고 일정기간 항체역가가 유지되고 난 후 항체역가 낮아지면 추가면역(Boosting)을 실시하여 지속적으로 항체역가를 유지 하였다. 항체의 역가는 약 3개월 가량 안정성 있게 유지되었으며 감소시기에 추가 면역을 실시하여 항체의 역가를 회복하였다.
[실시예 3] 항체가의 측정
난황 중의 특이적 항체의 역가는 ELISA법으로 측정하였다. 높은 역가의 항체가 함유된 계란을 수집하여 계란으로부터 난황을 분리하였다. 난황의 질량을 측정한 후 물을 첨가하여 실온에서 30분간 교반하였다(난황 : 물= 1 : 7). 10,000×g에서 15분간 원심 분리하여 특이적 항체를 함유하는 난황 수용성 단백분획을 회수하여 시료액으로 사용하였다.
시료액의 항체역가의 측정은 ELISA로 결정하고 과정은 다음과 같다. 항원(5㎍/㎖)을 50mM 카보네이트 완충액에 희석하여 96 웰(well) 폴리스티렌 플레이트(polystyrene plate)에 200㎕씩 웰에 넣어 4℃에서 하룻밤 고정화시킨다. PBS-T로 3회 세척한 다음 블럭킹(blocking)시키기 위해 1% BSA가 포함된 PBS-T를 250㎕씩 넣고 실온에서 1시간 반응시킨 후 상기와 같은 방법으로 세척하였다. PBS-T로 희석한 난황을 웰 당 200㎕씩 넣고 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후 다시 PBS-T로 3회 세척하였다. 적절히 희석된 효소 중합체를 웰 당 200㎕씩 첨가하고 1시간 후 세척한다. 발색 시약을 웰에 가한 다음 실온에서 발색시킨다. 10분후 50㎕의 2M H2SO4를 각 웰에 넣고 반응을 종결시킨다. 그런 다음 450nm에서의 흡광도를 ELISA 판독기(reader)로 측정한다.
[실시예 4] 항원에 따른 항체가의 측정
분자량 100,000 이하의 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori)의 균체 파쇄액(A), 2.0×109CFU/㎖ 균체수를 면역한 시료(B) 및 면역하지 않은 대조군(R)의 항체가를 측정하기 위하여 실시예 3과 같은 방법으로 20주간 측정하였다. 최고의 항체역가에 도달했을 때에는 희석 배율을 세분화하여 측정하였으며 그 결과는 다음의 표 1과 같다.
균체를 사용한 방법보다 균체 파쇄액을 항원으로 사용한 경우에 면역 후 4주부터 뚜렷한 역가의 차이가 나기 시작했으며 높은 항체 역가는 8주 동안 유지되었고 실험 기간 내내 우위의 항체 역가를 나타내었다.
또한 균체 파쇄액 중 분자량 100,000이하의 시료(1), 100,000∼300,000의 시료(2), 300,000∼500,000의 시료(3) 및 균체 파쇄액을 그대로 사용한 시료를 면역한 시료(4)의 항체의 역가를 상기와 같은 방법으로 측정하였고, 그 결과를 하기 표 2에 기재하였다.
균체 파쇄액을 분자량 별로 나뉘어 면역한 항원의 역가의 비교는 분자량 100,000이하였을 때 월등히 높았고, 균체 파쇄액을 사용한 경우보다 면역 후 3주 이후부터 뚜렷한 항체 역가의 증가세를 나타냈으며 고역가 항체는 12주간 지속되었다.
전술한 바와 같이, 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori)의 균체 파쇄액 중 분자량 100,000이하의 단백질을 한외 여과를 통해 분리한 후 항원으로 사용함으로써 균체 파쇄액을 그대로 항원으로 사용하는 경우에 비해 항체 역가를 크게 향상시키고, 이 항체를 함유하는 식품을 통해 위질환을 효과적으로 예방할 수 있게 된다. 또한 본 발명에 따르면 난황의 항체 분리시 물을 사용하여 식품의 안전성 확보 및 원가 절하의 효과를 얻을 수 있다.
Claims (6)
- 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori)의 균체파쇄액중 분자량 100,000이하의 단백질을 포함하는 항원 50∼200㎍/㎖과 미네랄 오일이 8:2 ~ 2:8로 혼합된 혼합물로 면역된 산란계가 생산하는 계란의 난황으로부터 얻어지며, 상기 난황과 물을 1:5 ~ 1:10으로 혼합한 다음, 원심분리시켜 난황 수용성 단백분회를 회수하여 분리되는 것을 특징으로 하는 항-헬리코박터 필로리(anti-Helicobacter pylori) 고역가 항체.
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- 제1항에 따른 항-헬로코박터 필로리(anti-Helicobacter pylori)의 항체를 식품 총 중량의 0.05% ~ 5중량%로 함유하는 식품.
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- 제4항에 있어서, 상기 식품은 요구르트, 계란, 제과, 사탕, 발효유, 아이스크림, 제빵, 조제분유, 음료, 마가린, 버터, 또는 치즈인 것을 특징으로 하는 식품.
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