JPH11504633A

JPH11504633A - 多量体の組換えウレアーゼワクチン

Info

Publication number: JPH11504633A
Application number: JP8532724A
Authority: JP
Inventors: リー，シンシア・ケイ; モナース，トーマス・ピー; アッカーマン，サミュエル・ケイ; トーマス，ウィリアム・ディ・ジュニア; ソマン，ゴパラン; クリーンソース，ハロルド; ウェルツィン，リチャード・エイ; パッポ，ジャックス; アーマック，トーマス; ギラコー，ファーシャド; バガット，ハイテッシュ; サスマン，イレーネ
Original assignee: オラバックス・インコーポレイテッド
Priority date: 1995-04-28
Filing date: 1996-04-25
Publication date: 1999-04-27
Also published as: PL323048A1; NO974969L; DE69637947D1; BR9609871A; WO1996033732A1; EP0831892B1; NO974969D0; NZ307017A; EP0831892A4; HUP9801266A3; MX9708319A; CZ342697A3; AU5576496A; HUP9801266A2; EP0831892A1; AU723063B2; PL185013B1; KR19990008155A; CA2219201A1; ATE433325T1

Abstract

(57)【要約】ヘリコバクター（例えば、Ｈ．ピロリ）感染に対し、予防および／または処置する方法ならびに組成物を提供する。本発明の組成物は、本発明の方法（この組成物を粘膜投与する方法を含む）で使用され、医療上許容される担体または希釈剤中に、酵素的に不活性な組換ヘリコバクターウレアーゼの多量体複合体を含む組成物、および（ａ）ヘリコバクター抗原、および（ｂ）抗生物質、抗分泌剤、ビスマス塩、またはそれらの組み合わせを含む組成物である。

Description

【発明の詳細な説明】多量体の組換えウレアーゼワクチン発明の背景本発明は、ヘリコバクター感染を予防および／または処置するための方法および組成物に関する。ヘリコバクターは、温血動物の胃腸管にコロニー形成するラセン状グラム陰性菌属である。数種のもの、特にＨ．ピロリ、Ｈ．ヘリマニイ、Ｈ．フェリス、およびＨ．マステレは、胃にコロニー形成する。Ｈ．ピロリがヒトに感染する最も普通の種であり、Ｈ．ヘリマニイやＨ．フェリスもヒトに感染することが分かっているが、Ｈ．ピロリよりずっと頻度が少ない。ヘリコバクターは、先進国では成人人口の５０％以上に感染し、発展途上国および太平洋沿岸諸国ではほぼ１００％が感染するので、世界的にヒトに最も広く感染するものの一つとなっている。Ｈ．ピロリに感染すると、すべての宿主が慢性胃炎を起こすが、ヘリコバクター感染に伴う臨床的な胃十二指腸疾患は、一般に初回感染から数年ないし数十年を経過してから現れる。Ｈ．ピロリは、ヒトの多くの消化性潰瘍および慢性表皮性胃炎（Ｂ型）の原因となる要因である。Ｈ．ピロリ感染は、胃粘膜萎縮、胃の腺癌、および胃の非−ホジキンスリンパ腫を伴うことがある。（例えば、Blaster、J．Infect．Dis.161:626-633,1990; Scolni ck等，Infect．Agents Dis．1:294-309,1993; Goodwin等，Helicobacter pyrori ，Biology and Clinical Practice，CRC Press，Boca Raton，FL，465 pp,1993; Northfield等.，Helicobacter pyrori，Infection，Kluwer Acad．Pub.，Dordr echt，178pp，1994参照）発明の要約我々は、多量体の組換えヘリコバクターウレアーゼを含有するワクチン組成物が、ヘリコバクター感染の予防と処置に有効であることを示した。さらに、我々は、Ｈ．ピロリウレアーゼおよび粘膜アジュバントを、抗生物質およびビスマス塩とともに含有する組成物が、これらの成分の単独あるいは３つ以下を組み合わせたものより、ヘリコバクター感染の処置に一層有効なことを示した。従って、第１の態様では、（ａ）ヘリコバクター感染をまだ受けていないが発生危険のある状態（“予防的”免疫応答）の、あるいは（ｂ）既にヘリコバクターに感染している（“治療的”免疫応答）の、患者（例えば、ヒト患者）中でヘリコバクター（例えば、Ｈ．ピロリ）に対する免疫応答を誘起するワクチンが、本発明の特徴となる。このワクチンは、酵素的に不活性な組換えヘリコバクター（例えば、Ｈ．ピロリ）ウレアーゼの多量体複合体、および医療上許容される担体または希釈剤（例えば、滅菌水または２％重量／容量ショ糖溶液）を含有する。このワクチンは、８個のウレアーゼＡサブユニットと８個のウレアーゼＢサブユニットを含んで成る多量体複合体、６個のウレアーゼＡサブユニットと６個のウレアーゼＢサブユニットを含んで成る多量体複合体、および４個のウレアーゼＡサブユニットと４個のウレアーゼＢサブユニットを含んで成る多量体複合体、またはこれらの混合物を含んでいてもよい。さらに、このワクチンは、粘膜アジュバント、例えば、腸管毒性大腸菌の熱不安定性エンテロトキシン（ＬＴ）、コレラ毒素（ＣＴ）、クロストリジウムジフィシル毒素、それらのサブユニットまたは誘導体であって毒性はないがアジュバント活性はなお保有しているもの（例えば、断片、変異株、またはトキソイド）、またはそれらの混合物を含んでいてもよい。例えば、Ｃ.ジフィシル毒素Ａの７９４カルボキシル−末端アミノ酸を含有する断片（例えば、Dove等，上記，Ｃ．ジフィシルトキシンＡの配列について、参照）を用いてもよい。さらに、酵素的に不活性な組換えヘリコバクターウレアーゼの多量体複合体は、ワクチンに使用するに先立って凍結乾燥してもよい。第２の態様では、患者（例えば、ヒト患者）中でヘリコバクター（例えば、Ｈ．ピロリ）に対する予防的および／または治療的粘膜免疫応答を誘起する方法が、本発明の特徴となる。この方法では、免疫原的に有効量の酵素的に不活性な組換えヘリコバクター（例えば、Ｈ．ピロリ）ウレアーゼの多量体複合体を含有する組成物を、患者の粘膜表面に（例えば、口腔または鼻腔内表面に；あるいは直腸表面への肛門坐薬により）投与する。この組成物は、８個のウレアーゼＡサブユニットと８個のウレアーゼＢサブユニットを含んで成る多量体複合体、６個のウレアーゼＡサブユニットと６個のウレアーゼＢサブユニットを含んで成る多量体複合体、および４個のウレアーゼＡサブユニットと４個のウレアーゼＢサブユニットを含んで成る多量体複合体、またはこれらの混合物を含んでいてもよい。この組成物は、例えば重炭酸ナトリウムにより胃内を中和することなく投与できる。酵素的に不活性な組換えヘリコバクターウレアーゼの多量体複合体に加えて、この方法で用いる組成物はさらに粘膜アジュバントを含んでいてもよい。例えば、この組成物は、腸管毒性大腸菌の熱不安定性エンテロトキシン（ＬＴ）、コレラ毒素（ＣＴ）、クロストリジウムジフィシル毒素、それらのサブユニットまたは誘導体であって毒性はないがアジュバント活性はなお保有しているもの（例えば、断片、変異株、またはアジュバント活性を有するトキソイド類）、またはそれらの混合物を含んでいてもよい。例えば、Ｃ．ジフィシル毒素Ａの７９４カルボキシル−末端アミノ酸を含有する断片（例えば、Dove等，上記，Ｃ．ジフィシルトキシンＡの配列について、参照）を用いてもよい。さらに、酵素的に不活性な組換えヘリコバクターウレアーゼの多量体複合体は、ワクチンに使用するに先立って凍結乾燥してもよい。第３の態様では、患者（例えば、ヒト）におけるヘリコバクター（例えば、Ｈ．ピロリ）感染の処置用組成物が本発明の特徴となる。この組成物は、（ａ）ヘリコバクター（例えば、Ｈ．ピロリ）抗原（例えば、ウレアーゼ）、および（ｂ）抗生物質、抗分泌剤、ビスマス塩、またはそれらの組み合わせを含有する。この組成物に使用できるヘリコバクターウレアーゼ抗原の例は、上記したような、酵素的に不活性な組換えヘリコバクターウレアーゼの多量体複合体を含むものである。使用できる他のヘリコバクター抗原は、例えば、ＨspＡ、ＨspＢ、Ａ lpＡ、Ａ1pＢ、Ｃ1pＢ、およびモノクローナル抗体ＩgＧ５０を認識する抗原（後記参照）を含む。この組成物は、さらに、上で列挙したような、粘膜アジュバント（または、粘膜アジュバント類の組み合わせ）を含有してもよい。この組成物に含まれ得る抗生物質には、アモキシシリン、クラリスロマイシン、テトラサイクリン、メトロニジゾールおよびエリスロマイシン等が含まれるが、これらに限定されない。また、含有され得るビスマス塩には、例えば、ビスマスサブサイトレートや、ビスマスサブサリチレートがある。この組成物に含有され得る抗分泌剤には、例えば、プロトン・ポンプ・インヒビター(例えば、オメプラゾール、ランソプラゾール、およびパントプラゾール)、Ｈ₂−レセプターアンタゴニスト（例えば、ラニチジン、シメチジン、ファモチジン、ニザチジン、およびロクサチジン）、およびプロスタグランジン類似体（例えば、ミソプロスチルまたはエンプロスチル）がある。最後の態様では、患者（例えば、ヒト患者）における、ヘリコバクター（Ｈ．ピロリ）感染を処置する方法が本発明の特徴となる。この方法では、（ａ）ヘリコバクター（例えば、Ｈ．ピロリ）抗原（例えば、前記列挙の抗原類）、および（ｂ）抗生物質、抗分泌剤、ビスマス塩、または、それらの組み合わせ、を含有する組成物を患者に投与する。全ての標準的投与様式、あるいは、標準的投与様式の組み合わせを採用できる。例えば、粘膜投与（例えば、口腔表面または鼻腔内表面に；あるいは直腸表面への肛門坐薬により）を用いることができる。この方法で粘膜表面に投与する組成物は、さらに、例えば、前記したような、粘膜アジュバント（または、粘膜アジュバント類の組み合わせ）を含んでいてもよい。この方法で用いる組成物に含有されていてもよい抗生物質、ビスマス塩類、および抗分泌剤も前記したものである。 “ワクチン”とは、少なくとも一つの抗原（例えば、病原性微生物、例えば、Ｈ．ピロリ、由来の抗原）を含有し、そしてそれを患者に投与したとき、疾患（例えば、その微生物に感染することにより誘起される疾患）の予防、または、既に存在する疾患の処置に有効な、その抗原に対する免疫応答を誘発または増強する組成物を意味する。 “免疫原的に有効量”とは、それを患者、例えば、ヒト患者に投与したとき、免疫応答(例えば、体液性免疫応答または粘膜免疫応答)を誘発または増強する抗原(例えば、酵素的に不活性な組換えヘリコバクターウレアーゼの多量体複合体、あるいは、上で列挙したその他の抗原のいずれか)の量を意味する。 “ヘリコバクター”とは、ヘリコバクター属の全ての細菌、特にヒトに感染するヘリコバクター（例えば、Ｈ．ピロリ）を意味する。“ウレアーゼ”とは、尿素の水酸化アンモニウムと二酸化炭素への変換を触媒する酵素（例えば、Ｈ．ピロリウレアーゼ）を意味する。 “多量体複合体”とは、ポリペプチド類（例えば、ウレアーゼポリペプチド類）の巨大分子複合体を意味する。ポリペプチド類は、種々の分子間相互作用、例えば、共有結合（例えば、ジスルフィド結合）、水素結合、およびイオン結合などにより、複合体中で会合されていると思われる。 “粘膜アジュバント”とは、非特異的に粘膜免疫応答（例えば、ＩgＡ抗体類の産生）を刺激または増強する化合物（例えば、免疫モジュレーター）を意味する。粘膜アジュバントを免疫原性組成物と組み合わせて投与すると、組成物中の抗原に対する粘膜免疫応答の誘発を促進する。 “抗生物質”とは、カビあるいは細菌類に由来する、他の微生物の生育を妨げる化合物を意味する。本発明のその他の特徴および利点は、以下の詳細な記述および請求の範囲から明らかになるであろう。発明の詳細な説明まず、図面について記述する。図面第１図は、pＳＣＰ１からクローニングした２.５ｋｂＰＣＲ産物の制限酵素地図を示す図面である。地図上の数字は、ＢＬ１の最初の塩基対（ｂｐ）をヌクレオチド＃１と表示して、ヌクレオチドの位置を示している。ureＡとureＢ遺伝子の位置およびこれらの遺伝子の転写の方向が示されている。制限酵素切断部位の位置は遺伝子の下に示されている。各制限酵素名の次の数字は、指定した酵素の認識配列上の最初の塩基対の位置を示している。第２図は、発現プラスミドpＯＲＶ２１４の遺伝子地図を示す。ureＡおよびur eＢ遺伝子は、矢印を付けた中白棒で示してある。黒塗り矢印と黒塗り棒は、Ｔ７プロモーター配列およびターミネーター配列をそれぞれ表している。細い線はｐＢＲ３２２ＤＮＡを表している。ファージおよびプラスミドのプラスミド上の複製起点は、“ｆ１origin”および“ori”と付記した大きな陰塗り矢で示し、かつＤＮＡ合成の方向を示してある。カナマイシン耐性（kan）とラクトースリプレッサー（lacＩ）をコードする遺伝子は、陰塗り棒で示してある。ＰＣＲ産物のクローニングに用いたＢamＨＩならびにＥcoＲＩ部位が示されている。la cＩ、ureＡ、ureＢ、およびkan遺伝子を表している棒の中の矢印は、転写の方向を示している。第３図は、ureＡおよびureＢ遺伝子をコードするＨ．ピロリ遺伝子座のヌクレオチド配列を、ｐＯＲＶ２１４（配列番号１）由来の転写調節配列の概略表示である。ureＡ（配列番号２）およびureＢ（配列番号３）の解読されたアミノ酸配列は、ＤＮＡ配列の上に示してある。配列の左側の数字は、ヌクレオチド位置に対応しており、右側の数字はアミノ酸の位置を示している。ＰＣＲプライマーに対応する配列は、傍線を付してあり、さらにＰＣＲ産物のクローニングに用いたＢamＨＩおよびＥcoＲＩ部位が示されている。解読した転写開始部位（Ｇ）および転写方向は矢印で示してある。リボゾーム結合部位（ＲＢＳ）が示されている。転写開始（Ｔ７プロモーターおよびｌacオペレーター）および停止を調節する配列は、傍線を付しラベルしてある。第４図は、組換えウレアーゼに対する分析用サイズ排除ＨＰＬＣを示すグラフである。第５図は、組換えＨ．ピロリウレアーゼおよびコレラ毒素（ＣＴ）で免疫化したマウスグループ由来の細菌スコア対血清ＩgＡレベル、血清ＩgＧ、および糞便中のＩgＡ抗体群を示すグラフ群である。第６図は、組換えＨ．ピロリウレアーゼおよび腸管毒性大腸菌の熱不安定性トキシンで免疫化したマウスグループ由来の細菌スコア対血清ＩgＡレベル、血清ＩgＧ、および糞便中のＩgＡ抗体群を示すグラフ群である。第７図は、組換えウレアーゼの鼻腔内および経口免疫化経路の比較に用いた実験プロトコールを示す表である。第８図は、第７図に表示説明したプロトコールに従って処理したマウスグループ中の、血清ＩgＧ（血清Ｇ）、血清ＩgＡ（血清Ａ）、糞便ＩgＡ(糞便Ａ)、および唾液ＩgＡ（唾液Ａ）レベルを示すグラフ群である。第９図は、組換えウレアーゼの鼻腔内および胃内免疫化経路の比較に用いた実験プロトコールを示した表である。第１０図は、第９図に表示説明したプロトコールに従って処理したマウスグループについて実施したウレアーゼテストの結果を示したグラフ群である。第１１図は、Ｈ．フェリス感染の予防において、鼻腔内経路でＣＴ（５μg）と共に与えたｒウレアーゼ（１０μg）が、少なくとも経ロルートでＣＴ（１０ μg）と共に与えたｒウレアーゼ（２５μg）と同等の効力であることを示すグラフである。第１２図は、ｒウレアーゼ＋１０μg ＬＴでのマウスグループの免疫化が、定着しているＨ．フェリス感染を減少ないし根絶することを示すグラフである。これらの動物をＨ．フェリスで再感染させると、攻撃を防御した。第１３図は、組換えＨ．ピロリウレアーゼとＣＴ、またはＣＴ単独のいずれかによる治療的免疫処置後４週および１０週のマウスグループの平均抗体応答を示すグラフである。第１４図は、Ｈ．フェリスでの感染前、または感染後インターバルで、免疫化した、または免疫化しないマウスグループの胃粘膜中のＩgＡ抗体分泌細胞数を示すグラフである。第１５図は、予めＨ．ピロリウレアーゼとＣＴで免疫化したマウスグループにおける、組換Ｈ．フェリス感染除去を示すグラフである。ウレアＡおよびウレアＢ遺伝子のクローニングウレアーゼ、ureＡおよびureＢをコードする構造遺伝子は、クローン化(Clayt on et al.，Nucl．Acids．Res．18:362，1290;Labigne et al.，J．Bacteriol． 173:1920-1931，1991)されており、これらの遺伝子によりコードされた組換えウレアーゼが精製(Hu et al.,Infect．Immun．60:2657-2666，1992)されている。本発明において使用するため、ウレアーゼは、ロンドン大学、セントバーソロミュー医学部のソードタバッカリイ博士から提供を受けた臨床標本から採取した臨床単離体Ｈ．ピロリ（ＣＰＭ６３０）からクローン化した。ＣＰＭ６３０株のゲノムＤＮＡライブラリーは、ラムダファージベクターＥＭＢＬ３中で調製した。プラークをウサギの抗ヘリコバクターウレアーゼポリクローナル抗体との反応性についてスクリーンし、単一の反応性プラークを単離した。このクローンは、ureＡおよびureＢ遺伝子をコードする１７kb ＳalＩ断片を含有した。この１７kb断片をｐＵＣ１８上にサブクローン化し、ｐＳＣＰ１と定めた。２．７kb ＴagＩ断片をサブクローン（ｐＴＣＰ３）化し、完全に配列決定した。この２．７kbＴagＩ断片はureＡとureＢの両方をコードしていた。プライマーＢＬ１（ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＣＣＴＴＧＡＴＴＣＣＧＴＴＡＴＧＴＣＴ；配列番号４）およびＢＬ２（ＣＧＧＡＡＴＴＣＡＧＧＡＴＴＴＡＡＧＧＡＡＧＣＧＴＴＧ；配列番号５）は、ｐＳＣＰ１由来の２.５ｋｂ断片の増幅およびクローン化に用いた。ＢＬ１およびＢＬ２は、ジーンバンクの受託番号Ｍ６０３９８のヌクレオチド２６０５−２６２４（ＢＬ１プライマー）およびＥＭＢＬ受託番号Ｘ１７０７９のヌクレオチド２５１６−２４９９８（ＢＬ２プライマー）に相当する。２.５kb断片ＰＣＲ産物の制限酵素地図は第１図に示してある。この２.５kb断片は、ureＡとureＢのコード領域全体を、ureＡの上流にあるＨ．ピロリ由来の翻訳開始シグナルと共に含有する。組換えウレアーゼの発現 ureＡとureＢをコードする遺伝子を含有する精製２.５kbＰＣＲ断片をＥcoＲＩとＢamＨＩで消化し、発現ベクターｐＥＴ２４＋(Novagen，Madison，Wiscons in)中に挿入し、プラスミドｐＯＲＶ２１４（第２図）を産生する。ｐＥＴ２４＋は、colＥ１複製起点、一本鎖レスキューのフィラメント状ファージ(ｆ（ｆ１）複製起点、およびＴn９０３のカナマイシン耐性遺伝子を含有する。この断片をＴ７プロモーターの下流に挿入し、ウレアーゼ遺伝子の転写開始を与える。ラクトースオペレーター（ｌacＯ）配列は、Ｔ７プロモーターとウレアーゼ遺伝子の誘導発現を与えるクローニング部位との間に存在する。Ｔ７転写ターミネーターの配列は、このクローニング部位の下流に位置している。ベクターは発現の完全な抑制を保証するため、ラクトースリプレッサー遺伝子（ｌacＩ）も含んでいる。ベクター中に存在する他の配列は、ｐＢＲ３２２由来のものであり、ベクター構造のバックボーンとして役立つ。２.５kb ＰＣＲＥcoＲＩ−ＢamＨＩ断片およびＥcoＲＩとＢamＨＩで消化したｐＥＴ２４＋ベクターを含有する最初のライゲーション混合物は、ＣaＣl₂法で調製したＸＬ１ブルー(Stratagene，La Jolla，CA)を形質転換するのに用いた。ＸＬ１ブルーはＴ７ＲＮＡポリメラーゼを発現しない大腸菌株である。カナマイシン耐性コロニーはウレアーゼ特異的プライマー用いるＰＣＲによって直接スクリーンした。いくつかの陽性コロニー由来のプラスミドＤＮＡをキアゲン・ミニスピン・カラム（minispin columns）(Qiagen，Chatsworth，CA)を用いて抽出し、正しい制限消化パターンを示すかどうか検査した。精製ｐＯＲＶ２１４ＤＮＡは、ＣａＣｌ₂方法により製造されたＥ.coli 株ＢＬ２１−ＤＥ３（Novagen，Madison，Wisconsin）の形質転換に用いられた。ＢＬ２１−ＤＥ３はラムダファージＤＥ３で溶原化されたＥ．ｃｏｌｉＢ株であり、組換えファージはｌａｖＵＶ５プロモーターのコントロールの下にＴ７ＲＮＡポリメラーゼをコードする。ＢＬ２１は、ｈｓｄＳ_B制限／修飾系およびｄｃｍＤＮＡメチル化と同様にｌｏｎおよびｏｍｐＴプロテアーゼを欠いている。ＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎミニスピンカラムでカナマイシン耐性コロニーからつくられ、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩを用いて制限酵素解析によって選別されて、プラスミドの存在が確認された。ウレアーゼ発現は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットによるＢＬ２１−ＤＥ３（ｐＯＲＶ２１４）細胞溶解生成物検査によって調べられた。いくつかのポジティブクローンが正しい制限エンドヌクレアーゼ消化パターンを有し、ウレアーゼを発現した。ｐＯＲＶ１４を含有する単一クローンが選択され、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢプレート上で生育され、収集され、５０％グリセロール含有ＬＢで−８０℃に保存された。研究細胞バンクは、カナマイシン含有ＬＢプレート上のグリセロール・ストックからサンプルを生育せしめ、単離コロニーを選択し、カナマイシン含有ＬＢブロス培養物を接種することによりつくられた。この培養物は、５０％グリセロール含有の同量のＬＢ中で１.０のＯＤ₆₀₀に生長し、小球となり、再懸濁した。これらの研究細胞バンク（ＲＣＢ）アリコート（１００μ ｌ）は−８０℃で保存した。マスター細胞バンク（ＭＣＢ）を研究細胞バンクから単離コロニーを用いて、製造業者の実施細胞バンク（ＭＷＣＢ）をＭＣＢから単離コロニーを用いて製造した。ＭＣＢおよびＭＷＣＢは、生育でき、カナマイシン耐性であり、正常Ｅ．ｃｏｌｉコロニーの形態を示した。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ発現およびラムダファージ溶原性は、従来技術で知られている適当な試験法を用いて、確認した。ウレアーゼ発現は、ＩＰＴＧの存在下に生育した培養物の検査およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でのこれらの細胞培養物からの溶解生成物の分析によると、ＭＣＢおよびＭＷＣＢ細胞においてＩＰＴＧ誘導的であった。６０ｋＤおよび２９ｋＤタンパク質（夫々ＵｒｅＢおよびＵｒｅＡ）のＭＣＢおよびＭＷＣＢ細胞による生成は、インキュベーション時間と共に増加した。プラスミドＤＮＡは、ＭＣＢおよびＭＷＣＢ細胞から分離され、制限酵素分析、制限フラグメント・レングス多形性（ＲＦＬＰ）およびＤＮＡ配列分析によって調べられて、プラスミド構造が確認された。ＭＣＢは、プラスミドの欠失および再編成のない適当な制限エンドヌクレアーゼ消化パターンを有するプラスミドを含んでいた。同様に、ＭＣＢおよびＭＷＣＢからのｐＳＣＰ１のＲＦＬＰフィンガープリントＤＮＡとプラスミドＤＮＡのＲＦＬＰフィンガープリントとに差異はなく、クローニング過程または細胞バンク製造においてウレアーゼ遺伝子が検出可能な（７５０ｂｐ）欠失および再編成を受けなかったことを示していた。ｕｒｅＡおよびｕｒｅＢのコード領域、プロモータの配列およびＭＣＢ細胞から分離されたプラスミドの終末領域について、配列決定された。配列決定の反応は、ジーデオキシ・サイクル配列決定キットを用いて、製造業者の指示（Applie d Biosystems,Inc.，Foster City CA）に従い、蛍光ラベルジデオキシヌクレオチドを用いて、実施された。ｕｒｅＡおよびｕｒｅＢ遺伝子の配列を推測タンパク質配列および両側領域ＤＮＡ配列とともに図３に示す。組換えウレアーゼの大規模製造用いる発酵槽をきれいにし、認められている手順に従って殺菌した。培地は、ＲＯ／ＤＩ水中に２４ｇ／Ｌイースト抽出物、１２ｇ／Ｌトリプトン、６−１５ｇ／Ｌグリセロールを含有した。ｐＯＲＶ２１４が抗生物質の不存在下で充分に安定であったので、大規模発酵培養物中に抗生物質は存在しなかった。泡止め剤を加え、ユニットをそのまま殺菌した。４０リットル発酵槽での製造のために、ＭＷＣＢの１バイアルを解凍し、抗生物質なしでＬＢブロス（１％トリブトファン、０．５％イースト抽出物、１％ＮａＣｌ）１リットルを含有する４リットルシェイカー・フラスコに接種するのに用いた。培養物を３７℃で１６−２４時間振盪した。接種物を上記の製造培地を含有する４０リットル発酵槽（３０リットル実効量）に移した。発酵は、ＯＤ₆₀ ₀ で測定した細胞密度が約８−１０になるまで、通気および撹拌しながら行った。イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度０．１ｍＭまで加え、誘導（induction）を１６−２４時間進行せしめた。細胞を遠心分離で採取し、ウェット・パスタをポリプロピレン保存容器にアリコート分取し、−８０℃で保存した。４００リットル規模（３００リットル実効量）での製造のために、４００リットル器中の接種物および培養物を上記のように調製した。４００リットル器が約５.０のＯＤ₆₀₀に達したときに、４００リットル発酵槽に接種するのに用いた。培養物を８−１０のＯＤ₆₀₀までさらにインキュベートした。培養物を上記のように誘導し、採取し、保存した。この過程には４０リットル方法より２−３世代を必要とした。組換えＨ.ピロリウレアーゼの精製上記の発酵工程で製造された細胞パスタの容器を保存から取り出し、室温にもどし、２０ｍＭリン酸ナトリウム／１ｍＭＥＤＴＡ緩衝液、ｐＨ６.８に再懸濁する。この懸濁細胞を圧下のナロウ・オリフィス（Microfluidizer Cell Disrup tor）での突出によって破壊した。破壊細胞を４℃で遠心分離して沈降細胞片とし、溶解性ウレアーゼを含有する上澄液を採取した。３Ｍ塩化ナトリウム液を最終濃度が０．１Ｍになるまで細胞上澄液に加えた。次いで上澄液を２０ｍＭリン酸ナトリウム／１ｍＭＥＤＴＡ中で平衡化されたＤＥＡＥ−セファローズカラムにかけ、続く工程のために通過物を集めた。通過物を１００ｋＤ切断膜で２０ｍＭリン酸ナトリウム／１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ６．８中にダイアフィルター（diafiltered）し、低分子夾雑物を除去し、イオン強度を低下せしめた。この物質を２０ｍＭリン酸ナトリウム／１ｍＭＥＤＴＡ中で平衡化された第２ＤＥＡＥ−セファローズカラムにかけた。通過物を捨て、カラムを２０ｍＭリン酸ナトリウム／１ｍＭＥＤＴＡｐＨ６.８でゆすいだ。結合物質を０.１ＭＮａＣｌ／１ｍＭ β−メルカプトエタノールの３カラム量で溶出した。結合ウレアーゼの実効溶出は、溶出緩衝液の量および流速で調整した。部分的精製ウレアーゼを２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８.６に対してダイアフィルターし、Ｑ−セファローズカラムにかけた。カラムを同じ緩衝液の約２カラム量で洗い、高度精製ウレアーゼ含有の通過物を採取した。Ｑ−セファローズからの通過物を濃縮し、注射用水（ＷＦＩ）中の２０％スクロース、ｐＨ７. ５にダイアフィルターした。精製組換えＨ.ピロリウレアーゼの抗原性の特徴およびサブユニット組成物組換えＨ.ピロリウレアーゼの抗原性およびサブユニット組成物を天然のＨ.ピロリウレアーゼと比較するために、天然Ｈ.ピロリウレアーゼを精製し、抗原として用いて、ポリクローナル抗ウレアーゼ抗原およびモノ−特異的ポリクローナル抗ＵｒｅＡ、抗ＵｒｅＢおよび抗ウレアーゼホロ酵素抗原を製造した。天然のＨ.ピロリウレアーゼは、Hu and Mobley(Infect．Immun．58:992-998,1 990)に報告されている方法を修正して用い、精製した。Ｈ.ピロリ株 ATCC 43504 (American Type Culture Collection，Rockville，MD)は、５％ヒツジ赤血球細胞（Crane Labs，Syracuse，NY）および抗生物質（５μｇ／ｍｌトリメトプリン、１０μｇ／ｍｌバンコマイシン、１０μｇ／ｍｌポリミキシンβ硫酸塩）（TV P，Sigma Chemical Co.,St．Louis，MO）を含有するMueller-Hinton 寒天（Difc o Laboratories，Detroit，MI）上で生育せしめた。プレートを３−４日間３７ ℃、７％ＣＯ₂および９０％湿度でインキュベートし、細菌を遠心分離により収集した。細菌は、プロテアーゼ阻害剤を含有する水、２０ｍＭリン酸塩、１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭ β−メルカプトエタノール（ｐＨ６．８）に懸濁し、音波処理で溶菌し、遠心分離で清澄にした。清澄上澄液に３Ｍ塩化ナトリウムをその最終濃度が０.１５になるまで加え、ＤＥＡＥ−セファローズ（速流）に通した。カラムを通過する活性ウレアーゼを収集し、Filtron Macrosep １００遠心分離濾過ユニット中で濃縮し、次いでスペローズ−１２またはスーパーデックス２００サイズ排除カラムを通した。Pharmacia ＦＰＬＣプレパックカラムを用いてサイズ排除クロマトグラフィーを実施した。ウレアーゼ活性の有するフラクションをプールし、濃縮し、PharmaciaによりあらかじめパックされたＭｏｎｏ−Ｑセファローズカラム上のＦＰＬＣアニオン交換クロマトグラフィーにより、さらに精製した。結合ウレアーゼを傾斜塩化ナトリウムを用いて溶出した。ウレアーゼ活性を有するフラクションをプールし、Filtron Inc.からのMacrosep １００遠心分離フィルターを用いて濃縮した。いくつかのロットについて、最終精製がスペローズ−１カラム上の分析的サイズ排除ＦＰＬＣにより達成された。Ｈ.ピロリウレアーゼに対するポリクローナル抗血清は、３匹の雌ニュージーランド白兎を精製天然Ｈ.ピロリウレアーゼで免疫することにより製造された。動物はあらかじめ採血されて、非免疫の状態であることが確認され、完全フロイント・アジュバント中のウレアーゼ１５０μｇの皮下投与で免疫した。２強化量の各１５０μｇを２７および４５日後にフロイント不完全アジュバントで皮下投与した。精製ウレアーゼに対するＥＬＩＳＡおよびウエスタン・ブロットによる免疫応答を確認した後、動物から瀉血した。血液を一夜４℃で凝固せしめ、血清を遠心分離で採取した。血清ＩｇＧは硫酸アンモニウム沈殿法（５０％）により一夜４℃で精製した。沈殿物をＰＢＳ中で再懸濁し、透析して、硫酸アンモニウムを除去した。各動物のＩｇＧ抗ウレアーゼ力価は１：１０７であり、３動物からの抗体をプールした。タンパク質濃度は１７.３ｍｇ／ｍｌであった。各０.２ｍｌのアリコートを調製し、−８０℃に保存した。Ｈ.ピロリウレアーゼホロ酵素（“ＭＰＡ３”）に対するマウスのポリクローナル腹水は、初日に完全フロイント・アジュバント中の天然ウレアーゼホロ酵素１０μｇを５匹のマウスに皮下注射することにより調製した。１０日および１７日目に免疫強化され、２４日目に採血して抗ウレアーゼ免疫応答が確認され、２６日目に更に免疫強化した。２８日目にマウスに内腫１８０細胞を腹腔内投与した。１０μｇウレアーゼの最終腹腔内強化量を３１日目に与え、７日後に腹水を採取した。腹水を室温で２時間、次いで４℃で１６時間インキュベートした。血塊を渦動により破壊し、１０,０００ｒｐｍの１０分間遠心分離で除去した。プラスチック・チューブ中で４℃一夜インキュベーション後、液体は固状の血塊を形成した。これを均等化し、ＰＢＳで５倍希釈し、再び１０,０００ｒｐｍ１０分間遠心分離で清澄にした。希釈腹水３５ｍｌを収集し、３００μｌアリコート中に−２０℃で凍結した。抗体がＵｒｅＡおよびＵｒｅＢサブユニットと反応することがウエスタンブロット解析により確認された。最終力価１：３００,０００がウレアーゼに対するＥＬＩＳＡで得られた。Ｈ.ピロリＵｒｅＡ（“ＭＰＡ４”）に対するマウスのポリクローナル腹水は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから電気溶出により単離された天然ＵｒｅＡサブユニットＨ.ピロリウレアーゼをマウスに皮下投与することにより調製された。抗ｕｒｅＡ腹水の調製における次の工程は、ホロ酵素に対する抗体の生成について上記したように、実施された。天然のＨ.ピロリＵｒｅＡ（“ＭＰＡ６”）に対するマウスのポリクローナル腹水は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから電気溶出により単離された天然ＵｒｅＢをマウスに皮下投与することにより調製された。抗ＵｒｅＢ腹水の調製における次の工程は、ホロ酵素に対する抗体の生成について上記したように、実施された。ＭＡＢ７１は、Ｂサブユニット上の保護エピトープを認識するＨ.フェリスウレアーゼに対するＩｇＡモノクローナル抗体である。この抗体の調製はCzinn et al.，J.Vaccine 11(6):637-642,1993に記載されており、それを製造するハイブリドーマ細胞ラインはＡＴＣＣに寄託されており、その番号はＨＢ１１５１４である。上記の抗体はウエスタンブロット法で精製組換えＨ.ピロリウレアーゼの特徴付に用いられた。組換えウレアーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット解析組換えウレアーゼは最初、低下せしめた条件のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２.５％）で分析された。２主要タンパク質バンド（２９ｋＤおよび６０ｋＤ）およびいくつかの軽バンド（約３８ｋＤ）が明白だった。これらのバンドにおけるタンパク質を同定するために、上記した抗ウレアーゼおよび抗ウレアーゼサブユニット抗体を用いてウエスタンブロット法が実施された。６０ｋＤタンパク質は、ＭＰＡ３（抗ウレアーゼホロ酵素）およびＭＰＡ６（抗ＵｒｅＢ）と反応したが、ＭＰＡ４（抗ＵｒｅＡ）とは反応しなかった。２９ｋＤタンパク質は、ＭＰＡ３（抗ウレアーゼホロ酵素）およびＭＰＡ４（抗ＵｒｅＡ）と反応したが、ＭＰＡ６（抗ＵｒｅＢ）とはしなかった。軽３８ｋＤバンドは、ＭＰＡ３抗ウレアーゼホロ酵素）およびＭＰＡ６（抗ＵｒｅＢ）と反応し、このタンパク質がＵｒｅＢの部分であることを示した。２つの僅かな高分子量（２１５０ｋＤ）バンドがＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて明白であった。両バンドはＵｒｅＡおよびＵｒｅＢの両方に対する抗体と僅かに反応し、組換えウレアーゼサブユニットの小部分がスルフヒドリル還元に抵抗性の共有結合を用いた条件で形成することを示していた。他のタンパク質バンドはクーマシー着色ゲルで表れなかった。このように、精製産物において検出されるすべてのタンパク質は、ＵｒｅＡ、ＵｒｅＢまたはＵｒｅａあるいはＵｒｅＢの誘導体のいずれかである。ウェットのクーマシー着色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、ウルトラスキャンＸＬレーダ濃度計およびゲルスキャンＸＬソフトウェアプログラム（Pharmacia-LKB Bi otechnology，Piscataway，NJ）を用いてスキャンされた。濃度計データは、ＵｒｅＡ：ＵｒｅＢサブユニットの１：１分子比に一致し、天然のＨ.ピロリウレアーゼの構造から予想されるものであった。ＵｒｅＡおよびＵｒｅＢは、精製ウレアーゼ調製において存在する全タンパク質の９５％以上であった。結合ＵｒｅＡ＋ＵｒｅＢピークについて推測される平均値は９５．２％±１.２％であった。精製組換えウレアーゼの分析サイズ排除ＨＰＬＣ精製組換えウレアーゼの純度および分子組成は、分析サイズ排除高速液体クロマトグラフィーにより測定された。クロマトグラフィーは、パンプ１２６、ダイオード・アレイ・デイアル・ウエイブレングス検出器１６８，System Gold Soft ware Version V7.11，Proge1-TSK G4000SWXL(5mm x 30cm i.d.)カラム（Beckman Instruments，Brea，California）,およびＳＷＸＬガードカラムからなるSupel Co.社のBeckman System Gold HPLCを用いて実施された。クロマトグラフィーは、１００ｍＭリン酸塩、１００ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液、ｐＨ７.０を用いてアイソクラティク条件で行われた。カラムはPharmacia-LKBからの分子量マーカーを用いて目盛定めがなされた。代表的精製バルクサンプルの典型的ＨＰＬＣ分離の状態を図４に示す。精製ウレアーゼ産物は、チログロブリン（ＭＷ６６９ｋＤ）とフェリチン（ＭＷ４４０ｋＤ）の間に保持時間を有する顕著なタンパク質ピークを示す。５５０−６００ｋＤの明白な分子量は一連のランを基に算定された。このピークは仮に６量体ウレアーゼとした。この６量体ウレアーゼの領域は、種々のロットの産物において全タンパク質の少なくとも７０％であった。より低い保持時間（より高分子量）の第２の顕著なタンパク質ピークも検出された。このピーク領域は５−２０％であった。このピークは、分子量＞６００ｋＤであり、８量体ウレアーゼと考えられた。８量体プラス６量体ウレアーゼピークの全領域は９０％以上となった。これらの２つの特徴的なピークは、さらに特性化のために分離された。２ピークは、再構成、凍結乾燥ウレアーゼの調製からのＨＰＬＣにより精製され、１週間以上４℃で保存された。保存期間中に、８量体ウレアーゼは増加し、６量体型は減少する。分離されたピークフラクションは、ウレアーゼに対するモノクローナルおよびポリクローナル抗体とのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＥＬＩＳＡ反応活性によって分析された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥについて、両ピークは似たような率でウレアーゼＡおよびＢを示した。さらに、両者は、ポリクローナル抗ウレアーゼホロ酵素抗体（ＭＰＡ３）およびモノクローナル抗ＵｒｅＢ（ＭＡＢ７１）とＥＬＩＳＡにおいてほとんど同じ免疫反応活性を示した。組換えウレアーゼの酵素（尿素加水分解）活性組換えウレアーゼの酵素活性を調べるのに３種の方法が用いられた：ウレアーゼ特異的銀ステイン−電気泳動法、ｐＨ感知フェノールレッド尿素ブロス検定法およびアンモニア直接検出法である。ウレアーゼ特異的銀ステインは、deLlano et al.(Anal．Biochem．177:37-40,1989)に記載されており、尿素とのウレアーゼの反応でアンモニアを産生することを基にする。この反応はｐＨの局所的な増加をもたらし、それは金属銀の配置をおこす写真レドックス反応を容易にする。天然Ｈ.ピロリウレアーゼの酵素活性は、サンプル１.０μｇのみで検出された。一方、精製組換えウレアーゼ２０μｇはウレアーゼ活性を表さなかった。ｐＨ感知フェノールレッドブロス検定法は、よく知られた方法であり、尿素加水分解の結果としてのアンモニアの生成によるｐＨの変化を基とする。ウレアーゼ活性は、できるだけ少ない０.２μｇ／ｍｌの精製Ｈ.ピロリウレアーゼでもって表示した。一方、ウレアーゼ活性は、７５０μｇ／ｍｌ以上の濃度でも精製組換えウレアーゼと関連しなかった。ウレアーゼによる尿素加水分解で製造されたアンモニアの直接検査は、ネスラー試薬（Koch et al.，J.Am.Chem.Society 46:2066-2069,1924）を用いて調べられた。天然のＨ.ピロリウレアーゼのウレアーゼ活性は濃度１μｇ／ｍｌで検知された。活性は５００μｇ／ｍｌの精製組換えウレアーゼを含む検定において検出されなかった。ウレアーゼ特異的銀ステイン検定法、ｐＨ−感知フェノールレッドブロス検定法およびアンモニア直接検出法の結果に基づくと、組換えウレアーゼ産物において検出可能なウレアーゼ活性はなかった。精製組換えウレアーゼの保護および治療効果ヘリコバクター感染の予防および治療における組換えＨ.ピロリウレアーゼの効力を試験するために、Ｈ.フェリスマウス・モデルを用いた。このモデルにおいて、胃のコロニー形成は容易になされて消化管の炎症を伴っていた。この動物モデルはヘリコバクター研究について確立された系であり、ヘリコバクター誘発疾患の病理および治療に関する実験室的研究において非常によく用いられている。（参照、例えばFox et al.，Infect．Immun．61:2309-2315,1993;Goodwin and Worsley，Helicobacter pylori，Biology and Clinical Practice，CRC Press ，Boca Raton，FL,465 pp,1993）。Ｈ.ピロリおよびＨ.フェリスウレアーゼの抗原交叉反応活性は、Ｈ.フェリスで感染または続いて攻撃された動物を免疫するのに、本発明のヒトワクチン候補物、組換えＨ.ピロリウレアーゼ（ｒＵｒｅ）を用いることを可能にする。細菌のない、かつ通常のマウスは、Ｈ.フェリス感染に感受性であり、消化管上皮の生涯に渡る感染を起こす。これは炎症細胞浸潤を特徴とする（Fox et al 、後出）。用量反応試験によると、１００％のSwiss-Webster特異的病原菌のない（ＳＰＦ）マウスが１０⁴Ｈ.フェリスでの１回経口投与で感染した。他に特定しない限り、１０⁷の１回量が治療的免疫の前にマウスを感染せしめるのに、または予防的免疫の後にマウスを感染せしめる攻撃に用いられた。このヘリコバクターでの感染量（Ｉ.Ｄ.₉₀）の〜１０³倍の攻撃が免疫の厳格な試験を表す。消化系感染の検定消化器組織におけるヘリコバクターの検出のために、消化系ウレアーゼ活性、組織学的検査および消化器組織の培養を含むいくつかの方法が用いられた。消化系ウレアーゼ活性は、定性的（存在または不存在）および定量的に測定された。定性試験において、胃は、胃・十二指腸括約筋から幽門にかけて経線方向に２つに分割された。胃の約１／４である一つの経線片を尿素ブロス１ｍＬ（イースト抽出物０.１ｇ、リン酸一カルシウム０.０９１ｇ、リン酸二ナトリウム０.０９５ｇ、尿素２０ｇおよび０．１ｇ／Ｌフェノールレッド、ｐＨ６.９）に入れた。室温での４時間インキュベーション後、明白な色変化（酵素による尿素の加水分解、アンモニアの生成およびｐＨの上昇による）が正の結果を示した。定量試験において、ウレアーゼ活性は、４時間全胃片でのインキュベートされた清澄尿素ブロスの５５０ｎｍ吸光で測定された。この検定で１−２ｘ１０⁴胃組織の少量が検出され得る。この検定法は、ヒトサンプルに用いられた市販のウレアーゼテストキットと同じ感受性を提供する。市販キットは、生検／組織検査に比して１００％特異的および９０−９２％感受性であることが分かっている（Szeto et al.，Postgrad．Med．J．64:935-936,1988:Borromeo et al．J．Clin．Pathol ．40:462-468,1987）Ａ₅₅₀の分光測光測定による定量消化系ウレアーゼ検定は、視覚測定より僅かに感受性が高く、感染の重篤度を調べることができた。負のウレアーゼ検定についてのカットオフ価は、非感染／感染を試みていないマウスにおける平均Ａ₅₅₀ 以上２標準偏差として定義された。正の消化系ウレアーゼ検定についてのカットオフは、非免疫／それを試みていないマウスの平均Ａ₅₅₀以下の２標準偏差によって定義された。低度の感染の個々の動物は、負と正のカットオフの中間の値を有する。ウレアーゼ応答の視界的段階付けは正のサンプルの１１／１２（９２％）を同定した。組織学的検査は、１０％ホルマリンで胃組織を固定して行われた。組織はパラフィンで標本化され、切片とされ、Ｈ.フェリスが見えるように修飾Warthin-Sta rry銀ステインで着色され（Steiner's stain;Garvey，et al．Histotechnology 8:15-17,1985）、次いで組織における炎症応答が分かるようにヘマトキシリンおよびエオシン着色がなされた。着色切片は標本番号を明らかにしないで、経験ある病理学者により調べられた。半定量的段階付けシステムが細菌の数および炎症の強度を測定するために用いられた。このシステムは、ヒトにおける胃炎の組織的特徴付けのために広く受け入れられているSydneyシステムである（Price，Gastroenterol．Hepatol.6:209- 222,1991）。完全層の粘膜切片について、炎症の強度（リンパ球血漿細胞、好中球の増加およびリンパ小胞の存在）、これらの細胞の浸潤および０−４＋の段階評価のために調べられた。Ｈ.フェリスの段階評価は、消化器洞（または、特定されれば、内体）の完全経線切片における典型的ラセン状形態を有する細菌細胞の数を数えることにより、行われた。評価は観察された細菌の数（０＝なし；１＋＝１〜２０細菌；２＋＝２１〜５０細菌；３＋＝５１〜１００細菌；および４＋＝＞１００細菌）に従って割り付けられた。免疫経路本発明のワクチンの有効性に対する投与経路の効果は、マウス感染モデルで試験された。６−８週令の雌、特異的病原体なし（ＳＰＦ）Swiss-Websterマウスは、０.２４ＭＮａＨＣＯ₃とあるいはなしの、２００μｇ組換えＨ.ピロリウレアーゼで免疫された。組換えウレアーゼは、すべての動物において粘膜性アジュバントとして１０μｇコレラ毒素（ＣＴ）と共投与された。胃内（ＩＧ）免疫は、麻酔をかけた動物に２０−ゲージの注入針で０.５ｍｌ抗原を加えることにより実施された。経口免疫は麻酔をかけていない動物の口腔にピペット先端で５０ μｌ容量の抗原を加えることにより実施された。非経口免疫に関しては、１０μ ｇ組換えウレアーゼをマウスに皮下投与した。フロインド完全アジュバントは最初の皮下免疫で使用され、フロインド不完全アジュバントは続く追加免疫で使用された。すべての投与経路に関して、総計４用量のワクチンが７日間隔で投与された。マウスは最終ワクチン用量の２週間後、１０⁷ Ｈ.フェリスで攻撃され、次いで攻撃の２週間後、検死された。胃Ｈ.フェリス感染はウレアーゼ活性および組織検査によって検知された。単一マウスにおける保護は、ネガティブウレアーゼ検定および組織検査による０あるいは１＋細菌評点によって定義された。組換えウレアーゼの経口および胃内投与は、Ｈ.フェリスで攻撃するための有意義な保護を提供した（８６−１００％）（表１）。経口投与は、組換えウレアーゼとＮａＨＣＯ₃の共−投与ありまたはなしの両方において有効であった。胃内投与は組換えウレアーゼがＮａＨＣＯ₃と共−投与されたとき、より有効であった。ワクチン抗原の非経口注入は最も有効でなかった。免疫マウスの攻撃後の胃組織における細菌の数は、非免疫対照よりも著しく低かった。血清および分泌物におけるＩｇＡ抗体対応は、経口投与で免疫されたマウスにおいて最も高かった。ＩｇＡ抗体は、非経口免疫により誘発されなかった。抗ウレアーゼ抗体反応における免疫化経路の効果をマウスで試験した。Ｓwiss −Ｗebsterマウスを、１）経口投与により、ＮａＨＣＯ₃有りまたは無しで、組換え精製Ｈ.ピロリウレアーゼ２００μgとＣＴ１０μgで；２）胃内投与により、ＮａＨＣＯ₃有りで、組換え精製Ｈ.ピロリウレアーゼ２００μg（５ＣＴ１０μgで；または３）皮下投与により、組換え精製Ｈ.ピロリウレアーゼ１０μg とフロインドアジュバントで、１０日間隔で４回免疫化した。４回のワクチン投与一週間後、粘膜および血清抗体反応を、天然Ｈ.ピロリウレアーゼ０．５μgでコートしたマイクロタイタープレートを使用してELISAにより試験した。血清サンプルを１：１００に希釈し、ウレアーゼ−特異的ＩｇＡおよびＩｇＧについてアッセイした。プロテアーゼ阻害剤緩衝液(５％脱脂乾燥乳、０．２μＭＡＥＢＳＦ、１μgアプロチニン／mlおよび１０μＭロイペプチン含有ＰＢＳ)で抽出した新鮮糞便ペレットを、糞便抗ウレアーゼＩｇＡ抗体について試験した。ある実験において、糞便抗体価は、ELISAで測定して、各サンプルのＡ₄₀₅単位／mg全ＩｇＡで示したウレアーゼ特異的糞便ＩｇＡで、全ＩｇＡについて標準化した。唾液サンプルをケタミン麻酔下にピロカルピンで刺激後回収し、１：５希釈でウレアーゼ特異的ＩｇＡについて試験した。ＮａＨＣＯ₃有りまたは無しで、経口で免疫化したマウスの間の抗体応答に著しい差は検出されず、データを分析のために蓄積した。皮下抗原を投与したマウスは、ウレアーゼ特異的血清ＩｇＧを増殖させたが、血清および糞便ＩｇＡ応答は、抗原が粘膜経路(経口または胃内)で送達された場合にのみ増殖した。ウレアーゼ／ＣＴで経口または胃内で免疫化したマウスを、１０⁷のＨ.フェリスで攻撃した。経口または胃内免疫化マウスの前攻撃抗体レベルは、Ｈ.フェリス攻撃後の組織学的−測定細菌スコアと関連した(図５)。ＩｇＡ応答が、個々のマウスの間でかなり変化したが、全体として、高い血清および糞便ＩｇＡレベルのマウスは、減少した細菌スコアであった。これらのデータは、感染の抑制および感染からの防御におけるＩｇＡの役割を示す。比較して、血清ＩｇＧ抗体は防御と相関しなかった。ある保護マウスが、検出不可能なＩｇＡレベルを有するが、抗ウレアーゼＩｇＡの高レベルは、攻撃後４＋感染を発症させた動物において観察されなかった。これらの結果は、防御における粘膜免疫応答の役割を指示するだけでなく、糞便および血清ＩｇＡ以外の免疫伝達物質が、Ｈ.フェリス感染の根絶に役割を果していることを示す。これらのデータは：ｉ）粘膜免疫は、防御免疫に必要である；ii）免疫化の経口経路は、胃内経路と同程度か、またはより有効である；iii）胃酸のＮａＨＣＯ₃での中和は、胃内免疫で必要である(経口では必要ではない)；およびiv）非経口免疫化は、粘膜免疫を刺激しないか、または攻撃に対する有効な防御を提供しない。免疫化スケジュール別の免疫化スケジュールを、防御粘膜免疫応答を誘発するための最適免疫化時間を決定するために比較した。Ｓwiss−Ｗebsterマウスを、組換えウレアーゼ１００μgで、２、３または４回の経口投与で、表２に示すスケジュールにより免疫化した。粘膜アジュバントＣＴ(１０μg)を組換えウレアーゼと共投与した。定質的胃ウレアーゼアッセイで測定して、抗原を４週間投与されたマウスは最も高い防御レベルを示した。著しい防御がまた０、７および２１日に３回抗原投与されたマウスでも観察された。分泌型ＩｇＡ抗体応答は、１週間間隔で全４回の組換えウレアーゼを投与されたマウスで最も高かった。防御率および抗体応答を基本にして、後者のスケジュールをワクチンの治療的および予防的効果の更なる評価のために選択した。異なる免疫化スケジュールの抗ウレアーゼ抗体製造における効果を、マウスで試験した。表２に記載した、５つの異なる免疫化スケジュールの一つで免疫化されたマウスの抗体応答を試験した。著しい防御が、２１日目の追加免疫投与をした４週投与または２週投与されたマウスで観察された。これらの二つの免疫化スケジュールのいずれかで免疫化されたマウスは、また最も高い平均免疫応答を有した。血清ＩｇＧおよび唾液ＩｇＡレベルは、４週間投与のスケジュールでワクチン処理されたマウスで最も高かった。用量−防御関係組換えウレアーゼの勾配的に異なる量をマウスに経口投与し、免疫化および防御に必要な最少および最適量を測定した。５、１０、２５、５０および１００μ gの量の組換えウレアーゼを、８匹のマウスのグループに、ＰＢＳ中のＣＴ１０μgと共に投与した。抗原を、スケジュールに沿って４週間投与した。胃ウレアーゼおよび組織学的細菌スコアで評価して、Ｈ.フェリスでの攻撃に対するマウスの著しい防御が全ての量で、量毎で有意な差がなく、観察された(表３)。用量応答効果は、組換えウレアーゼに対する血清および粘膜抗体で明白に証明され、１００μg用量レベルで最も高い免疫応答である。抗ウレアーゼ抗体応答における組換えウレアーゼ投与の効果をマウスで試験した。Ｓwiss−Ｗebsterマウスを、勾配的に異なる量(０、５、１０、２５、５０または１００μg)の組換えウレアーゼ＋粘膜アジュバントとしてのＣＴ１０μ gで免疫化した。血清、糞便および唾液のＩｇＡ抗体応答は、投与した組み合えウレアーゼの量と共に増加した。組換えウレアーゼの１００μgの量が、最も高い抗体レベルを製造した。Ｓwiss−Ｗebsterマウスを、勾配的に異なる量(０、５、１０、２５、５０または１００μg)の組換えウレアーゼと、粘膜アジュバントとしての腸毒性Ｅ.コリ易熱性毒素(ＬＴ)２５μgで免疫化した。一つのマウスのグループは、比較のために組換えウレアーゼ２５μgおよび粘膜アジュバントとしてのＣＴ１０μg を投与された。マウスを、経口で７日毎に４回経口で免疫化した。血清、糞便および唾液を、最後の免疫化から１０−１３日後に回収し、ウレアーゼ特異的抗体レベルをELISAで測定した。組換えウレアーゼおよびＬＴで免疫化したマウスは、血清および分泌性抗体を、ウレアーゼに対して、明らかな用量−応答効果で増殖させた。強い唾液ＩｇＡ抗体応答が、これらの動物で観察された。上記のように、ウレアーゼおよびＬＴで免疫化したマウスを、１０⁷Ｈ.フェリスで攻撃した(図４参照)。ウレアーゼ／ＬＴ免疫化マウスの前攻撃抗体−応答は、組織学的測定細菌スコアと相関していた(図６)。完全に防御された動物(細菌スコア０)および低い程度の感染(細菌スコア１＋)は、より重い感染の動物よりも、全ての場所で抗体のレベルが高かった。あまり防御されていないマウスは、検出可能な免疫応答が無く、ＩｇＡ抗体以外の免疫伝達物質がＨ.フェリス感染の根絶に役割を果たすことを示す。高用量の組換えウレアーゼが粘膜免疫応答を誘発する能力を、アジュバント無しで１μg、２００μgまたは５mg胃内投与して試験した。マウスの一つのグループは、対照としてウレアーゼ２００μg＋ＣＴ１０μgで胃内的に免疫化した。血液、糞便および唾液を最後の免疫化５から８日後に回収した。次いで、動物を１０⁷Ｈ.フェリスで、最後の免疫化１０日後に攻撃し、攻撃１４日後に屠殺した。Ｈ.フェリス感染を、胃組織のウレアーゼ活性により検出した。組換えウレアーゼの高用量は、ELISAで検出して、ウレアーゼ特異的血清ＩｇＧを誘発するが、比較的低いレベルの粘膜抗体を誘発する。ウレアーゼ特異的血清ＩｇＧ応答を示す動物は、Ｈ.フェリス攻撃に十分感受性であり、血清ＩｇＧが防御に役割を果さないことを示す。要約すると、異なる投与経路、投与スケジュールおよび粘膜アジュバントを調べる上記実験のデータは、有効な粘膜アジュバントと投与した場合、相対的に低い用量の組換えウレアーゼの経口または胃内投与が、分泌型ＩgＡ抗体および血清ＩgＡおよびＩgＧ応答を誘発することを示す。分泌型ＩgＡ抗体は防御を提供するが、血清ＩgＧ応答は提供しない。防御を組織学的細菌計測で測定した場合、高ＩgＡ抗体力価の動物は、低ＩgＡ抗体力価の動物と比較して、十分保護されているか、または著しく減少した感染であった。検出可能ＩgＡ抗体レベルを示さない動物は、攻撃後重い感染症を発症した。抗体応答は用量依存的であり、抗原の投与スケジュールにより異なった。最も高いレベルは、１００−２００μg の抗原用量で達成された。１週間間隔の抗原の４回投与は、免疫化の最適スケジュールを提供した。更に鼻腔内投与経路を下記の様に調査した。組換えウレアーゼの鼻腔内ワクチン処理Ｓwiss−Ｗebsterマウスを、組換えウレアーゼまたはホルマリン固定ウレアーゼで、経口または鼻腔内(ＩＮ)で免疫化した。抗原およびアジュバントの量、投与経路(ＩＮまたは経口)および免疫化スケジュールを図７に示す。ホルマリン固定ウレアーゼ(Ｆorm-ure)は、以下のプロトコールに従って製造した： (１)組換えウレアーゼ１mg含有バイアルを、ＲＯ／ＤＩ水で再構成する； (２)ＲＯ／ＤＩ水で１：１０００に希釈したホルマリン５０μＬ(３７％ホルムアルデヒド)をバイアルに加える(ウレアーゼの最終濃度は５mg／ml)；および (３)バイアルを３５℃で４８時間インキュベートする。ＩＮ＋ＣＴグループの血清ＩｇＧ、ＩｇＡ、糞便ＩｇＡおよび唾液ＩｇＡ応答は、経口免疫化に使用したｒＵreaseおよびアジュバントの高用量にもかかわらず、経口＋ＣＴより高かった(図７および表４)。防御は、ウレアーゼ試験および屠殺した動物の胃組織の細菌スコアの測定により測定した。防御をウレアーゼ試験でアッセイした場合、１００％防御がＩＮグループで見られ、一方経口では８０％であった。８匹中７匹の経口免疫化マウスが、その胃組織で細菌陽性であったが、一方、ＩＮグループのマウスの１／１０のみが細菌陽性であった(表４および図８のグループ３および６参照)。第２の実験において、マウスを胃内(ＩＧ)または鼻腔内で、粘膜アジュバントとしてのＬＴとｒＵreaseを共投与して免疫化した(実験の詳細は図９および免疫化スケジュール参照)。この実験において、ＩＮ＋ＬＴグループの血清ＩｇＧ、血清ＩｇＡおよび唾液ＩｇＡ応答は、ＩＧ免疫化に使用した抗原およびアジュバントの高用量にもかかわらず、ＩＧ＋ＬＴより高かった(図１０および表５、グループ４および８)。ＩＮ＋ＬＴグループのマウスは、ウレアーゼ試験で測定して、Ｈ.フェリスに対して十分防御された(非処理グループ３／９に対して１０／１０)(表５のグループ４および５参照)。鼻腔内免疫化の効果の更なる支持は、図１１に示す。簡単に、この実験は、鼻腔内経路でＣＴ(５μg)と共に投与されたｒウレアーゼ(１０μg)は、Ｈ.フェリスの感染の防止において、経口経路でＣＴ(１０μg)と共に投与されたｒウレアーゼ(２５μg)と少なくとも同効果である。粘膜アジュバントの選択Ｅ.コリ易熱性毒素(ＬＴ)はＣＴに生化学的および免疫学的に非常に近いマルチサブユニット毒素である。ＬＴの毒性がＣＴより低いため、ＬＴはヒトへの使用に実際的な粘膜アジュバントである(ＷalkerおよびＣlements，Ｖaccine Ｒes ．2.1-10，1993)。マウスを、全４週間の５μg、２５μgまたは１００μgの組換えウレアーゼおよび組換えＬＴ２５μg(Ｓwiss Ｓerum Ｖaccine Ｉnstitute，Ｂerne，Ｓwit zerland)で経口免疫化した。対照マウスは、ＬＴのみまたはＣＴとウレアーゼワクチン２５μgを投与された。マウスを、４回目の投与の２週間後に攻撃し、攻撃２週間後に検死した。胃ウレアーゼアッセイは、全てのワクチン用量で、免疫化動物の感染の著しい防御または抑制を示した(表６)。組織学的評価は、＜５μgウレアーゼおよびＬＴを投与されたマウスにおける細菌スコアの著しい減少を確認した。防御は、胃ウレアーゼアッセイおよび組織学的試験の両方により測定して、用量と直接相関しており、最も高い防御は、ＬＴと共投与した組換えウレアーゼ１００μgにより付与された。抗体測定は、用量−応答相関を確認し、最も高い粘膜免疫応答は１００μg用量であった。組換えウレアーゼを等用量(２５μg)で投与した場合、ＬＴは粘膜アジュバントとしてＣＴより優れていた。これらのデータは、ＣＴが経口投与組換えウレアーゼに対する粘膜免疫応答を促進するが、ＬＴはより良い粘膜アジュバントであり、従って、組換えウレアーゼとの共投与にＣＴよりも好ましいことを示す。低用量のＬＴのアジュバント活性を測定するために、マウスを、１、５、１０または２５μgのＬＴと投与した組換えウレアーゼ２５μgで経口免疫化した。同様の防御率および抗体応答が、全てのＬＴ用量で観察された。幾つかの研究を行い、ＣＴおよびＬＴ以外のアジュバントを評価し、粘膜アジュバントの必要性が、高用量の抗原単独投与で無くなるか測定した。コレラ毒素Ｂサブユニット(ＣＴＢ)を、ウレアーゼ免疫化の粘膜アジュバントとしてＣＴと比較した。０.２４Ｍ炭酸水素ナトリウム中のＣＴＢ１００μg(Ｃalbiochem ，Ｌa Ｊolla，ＣＡ)と２００μgウレアーゼを胃内で共投与した場合、防御効果は見られなかったが、一方同量のウレアーゼをＣＴ１０μgと投与して、胃ウレアーゼ活性で測定して、１００％防御を得た。ムラミルジペプチド、ＧＭＤＰ、(Ｎ−アセチルグルコサミニルー(ｂ１−４) −Ｎ−アセチルームラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン)の経口活性半合成類似体を、２、２０および２００μgの用量で、ウレアーゼ２５μgと共投与した。組換えウレアーゼと共投与したＧＭＤＰは、Ｈ.フェリス攻撃に対してマウスを防御しなかった。大量(２００μg、１mgまたは５mg)の組み合えウレアーゼをＣＴ有りまたは無しで、週一回４週間、マウスに胃内投与した。胃内経路は、高抗原用量が再現可能な形で経口で投与できる量を越えているため、必要である。ＮａＨＣＯ₃を、胃酸を中和するために投与した。全４回、抗原を１０日間隔で投与した。血液、糞便および唾液を最後の免疫化後５から８日後に集めた。動物を１×１０⁷Ｈ.フェリスで攻撃し、感染を胃組織のウレアーゼ活性で測定した。ＣＴの非存在下、高抗原用量はＨ.フェリス攻撃に対する防御を付与しなかったが、一方、組換えウレアーゼ２００μgをＣＴと投与した対照は、著しく防御された(表７)。ウレアーゼ−特異的血清ＩｇＧはアジュバント無しで高組換えウレアーゼ量で誘発されたが、血清、糞便および唾液ＩｇＡ応答は無いか小さかった。ウレアーゼ５mgを投与された動物由来のコード化切片の組織学的試験は、擬免疫化動物と比較して、細菌スコアまたは白血球浸潤に差が無いことを確認した。Ｈ.フェリス胃炎のマウスの治療的免疫化組換えウレアーゼワクチンの、マウスにおけるヘリコバクター感染に対する効果を、１０⁷Ｈ.フェリスで胃内感染させ、感染４週間後、感染マウスに４週間、組換えウレアーゼ３００μgとＬＴ１０μgの投与をしたＢalb／ｃマウスで評価した。対照はＬＴのみを投与した(図１２)。各グループの１０匹のマウスを、定量的胃ウレアーゼによりヘリコバクター感染の程度を調べるために、最後の免疫化４週間後検死した。１０匹中９匹のＢal b／ｃマウスは定量的ウレアーゼアッセイで測定して無感染であり、一方全ての対照は感染していた。４週目、ＬＴを投与された１２匹の動物およびウレアーゼ＋ＬＴを投与された４０匹の動物を、Ｈ.フェリスで再感染させた。攻撃１０週後、動物を屠殺し、定量的ウレアーゼアッセイで感染の程度を測定した。ウレアーゼ＋ＬＴを投与したが、再感染させていない９匹の動物の内、５匹は、胃ウレアーゼ活性で測定して、まだ明らかに感染していた(５７％)。再攻撃した全１２匹のＬＴ処理動物は感染した。ウレアーゼ＋ＬＴを投与され、次いでＨ.フェリスで再攻撃した４０匹のうち３７匹のマウスは、減少した胃ウレアーゼ活性で測定して、防御された。この実験は、ウレアーゼワクチン処理が、ヘリコバクター感染の発症を根絶するだけでなく、再感染に対しても宿主を防御することを示す。１４匹中５匹(３６％)の免疫化Ｓwiss−Ｗebsterマウスは、感染が治癒したか軽くなったが、グループ間の感染率の差は有意でないが(ｐ＝０.２６、フィッシャーズ・イグザクト試験、トゥー・テイルド)、全ての対照動物は感染していた。Ｓwiss−Ｗebsterマウスの感染は、非免疫化動物の高い平均胃ウレアーゼ活性で測定して、Ｂalb／ｃよりひどく(ｐ＜０.０００１、一方向ANOVA)、恐らく、Ｓwiss−Ｗebster対Ｂalb／ｃマウスの低い治療率を説明する。マウス種のＨ.フェリスに対する感受性の差は示されている(Ｓakagami et al.，Ａm．Ｊ．Ｇastr oenterol 89:1345，1994)。組織学的評価により、全ての非免疫化Ｂalb／ｃマウスは４＋感染(＞１００細菌／セクション)であるが、一方、減少した細菌得点が４週目に４３％の免疫化マウスで見られた。１０週目に、６匹中４匹が減少したウレアーゼ活性を有したが、６匹中１匹のみが減少した細菌スコアであった。ヘリコバクター治療における抗体の役割ヘリコバクター治療、即ち、感染マウスからのＨ.フェリスの除去における抗ウレアーゼ抗体の役割を、１０⁷Ｈ.フェリスで最初に感染させたＢalb／ｃマウスで試験した。感染４週間後、マウスを組換えウレアーゼ２００μg＋ＣＴ１０μgで経口免疫化した。対照マウスはＣＴ１０μgのみを投与した。抗原を１週間間隔で４回投与した。動物を最後の免疫化４および１０週後に屠殺し、血清および糞便サンプルをELISAのために集めた。Ｈ.フェリスで感染させたマウスは、血清抗ウレアーゼＩｇＧ抗体を製造したが、分泌型抗ウレアーゼＩｇＡ応答は検出されなかった。しかしながら、ウレアーゼ／ＣＴで免疫化した感染動物は、高分泌型抗ウレアーゼＩｇＡ抗体応答を示した(図１３)。ウレアーゼ特異的粘膜ＩｇＡレベルは、感染したままの免疫化マウスと、減少した細菌スコアのもので有為な差はなかった。これらのデータは、Ｈ.フェリス感染が分泌型抗ウレアーゼ応答を誘発しないことを示す。従って、ＩｇＡ抗体応答の抑制は、Ｈ.フェリスの免疫系による除去の能力に役割を有し得る。比較して、Ｈ.フェリス感染マウスのウレアーゼおよび粘膜アジュバントによる免疫化は、強い粘膜抗ウレアーゼ応答をもたらし、これはＨ.フェリス感染の除去と相関している。ヘリコバクター感染に対する防御と胃免疫応答の相関マウス感染モデルを使用した幾つかの実験は、ある動物が、検出可能抗体応答を欠くか、または血清、唾液または糞便で低い抗体レベルを有する組換えウレアーゼワクチンにより感染に対する耐性を有することを示す。従って、免疫応答を、免疫応答の測定が、防御とより正確に相関しているか決定するために、胃粘膜それ自体で測定した。胃粘膜での免疫応答は、腸および胃マウス組織におけるＩｇＡ抗体およびＩｇＡ陽性抗体分泌細胞を、免疫組織学的に評価した。幽門−近接十二指腸、洞、体および噴門を含む胃の部分を、ＯＣＴ化合物にマウントし、フラッシュ凍結し、氷点切断した。切片(７μm厚さ)を冷アセトンに固定し、ＩｇＡ陽性細胞を、ビオチニル化モノクローナル抗ＩｇＡで染色し、次いでビオチニル化グルコースオキシダーゼとアビジン抱合(ＡＢＣ−ＧＯ、Ｖector Ｌaboratories，Ｂurlingam e，ＣＡ)させ、メチルグリーンで逆染色した。ウレアーゼ特異的抗体分泌細胞( ＡＳＣ)を、切片の組換えウレアーゼ、ウサギ抗ウレアーゼ、ビオチニル化ロバ抗ウサギＩｇ(Ａmersham，Ａrlington Ｈeights，ＩＬ),ＡＢＣ−ＧＯ、ＴＮＢＴおよびメチルグリーンとの連続インキュベートにより同定した。対照切片を、ウレアーゼ無しまたはウレアーゼ＋ウサギ抗ウレアーゼとインキュベートし、ロバ二次試薬との反応性およびバックグラウンドの内因性グルコースオキシダーゼ活性を測定した。細胞ペレットの、Ｈ.フェリスウレＢ(MAB71)および呼吸器合胞体ウイルスのＦグリコプロテインに対する無関係ＩｇＡモノクローナル(HNK20) モノクローナルＩｇＡ抗体を製造するハイブリドーマからの氷点切断は、それぞれ陽性および陰性対照として働いた。Ｓwiss−Ｗebsterマウスを、組換えウレアーゼ１００μg＋アジュバント(ＣＴ )の４週間の投与で経口的に免疫化した。対照マウスは、アジュバントのみを投与された。各３匹のマウスのグループを、最後の免疫化後３、７、１４または２１日に検死した。パイエル板を腸から除去し、固有層リンパ球(ＬＰＬ)を４０− ７０％パーコール勾配分離により単離した。ＩｇＡ陽性Ｂ細胞を、１μg／ウェル組換えウレアーゼでコートし、ウシ血清アルブミンでブロックした９６ウェルフィルタープレートでELISPOTアッセイにより、検出した。１×１０⁶細胞で出発して、ＬＰＬの１０倍の連続希釈をウェルに添加した。ＩｇＡ陽性ＡＳＣは、ビオチニル化抗マウスＩｇＡ試薬、続くストレプトアビジン−アルカリホスファターゼで検出し、陽性細胞を顕微鏡で計数した。抗ウレアーゼＩｇＡ陽性ＡＳＣを、腸固有層で、最後の免疫化３日程早くにEL ISPOTで発見し、ピークは７日目でその後減少した(表８)。ウレアーゼ特異的ＡＳＣは、〜１０％の免疫組織化学で観察された全ＩｇＡ陽性細胞を示す。二色免疫蛍光顕微鏡検査により、ウレアーゼ特異的ＡＳＣはまたＩｇＡ陽性であることが確認された。これらの観察は、強い抗ウレアーゼＩｇＡ応答が、蛍光抗原刺激後腸粘膜のレベルで起こることを確認する。これらの応答の経時的表および動態は、他の経口ワクチンについての記載と類似である(Ｃzerkinsky et al.，Ｉnfe ct．Ｉmmun．59:996-1001，1991；ＭcＧheeおよびＫyono，Ｉnfect．Ａgents Ｈ um．Ｄis．2:55-73，1993)。ＩgＡ−陽性細胞が、胃粘膜に集まるかを測定するために、経口免疫化マウスの胃を、上記のように免疫組織化学的に試験した。ＩｇＡ陽性細胞は、免疫化のみおよび対照マウスの胃粘膜では実質上存在せず、胃が、ヘリコバクター攻撃により刺激されるまで免疫学的“沈黙”であることを示す。攻撃、免疫化マウスにおける免疫学的作動器官としての胃の役割を試験した。マウスに４週間、組換えウレアーゼ２００μgとＣＴ１０μgを経口投与した。対照マウスは、ＣＴのみを投与された。免疫化１週間後、マウスに攻撃した。マウスを、攻撃前、攻撃７、１４、２８、７０および１３３日後に検死した。攻撃前、ＩｇＡ陽性ＡＳＣは見られなかった。攻撃後の全ての時間間隔で、ＩｇＡ陽性ＡＳＣが免疫化マウスの胃粘膜に大量に存在し、７日目がピークであった(図１４)。ＩｇＡ陽性ＡＳＣの数は、非免疫化(ＣＴのみ)マウスにおいて、特に、攻撃７−２８日後に非常に多かった。ＩｇＡ陽性ＡＳＣの解剖学的位置もまた異なり、免疫化マウスは細胞を粘膜、固有層および小窩の回りに有したが、表面上皮下はほとんど無かった。ウレアーゼ特異的およびＩｇＡ陽性ＡＳＣは、胃粘膜の多くのウレアーゼ特異的細胞がＩｇＡ陽性であることを証明する。これらの観察は、先の免疫化により初回免疫化された動物の胃粘膜は、Ｈ.フェリスによる抗原刺激後にのみ免疫学的に活性となることを示す。得られる組織応答は、急速で、強く、長く続くＩｇＡ陽性Ｂ細胞の集合により特徴づけられ、これらの多くがウレアーゼ特異的である。これらの応答は、定量的に、投与後の免疫学的ナイーブマウスよりも大きい。更に、免疫化マウスのＩｇＡ陽性細胞の位置は、攻撃し、Ｈ.フェリスで持続的に感染させた免疫学的自生マウスと異なる。胃粘膜における促進されたＩｇＡ陽性ＡＳＣ応答は、Ｈ.フェリス攻撃に対する免疫化により付与された防御に基づくことを示す。これらのデータは、細菌攻撃から１時間内に誘発される免疫学的記憶応答は、防御を提供するのに十分であったという、コレラワクチンの研究一致する(ＬyckeおよびＨolmgren，Ｓcand ．Ｊ．Ｉmmunol．25:407-412，1987)。胃免疫応答および細菌導入の相関胃組織免疫応答と細菌感染の間の関係を、構造レベルで定義した。Ｓwiss−Ｗ ebsterマウスを組換えウレアーゼ２００μgとＣＴ１０μgで４週間免疫化した。最後の免疫化１週間後、マウスを１０⁷Ｈ.フェリスで攻撃した。動物を攻撃０、１、７、１４、２８、７０および１３３日後に屠殺し、Ｈ.フェリスコロニー形成を、光および電子顕微鏡で評価した。攻撃２４時間以内に、免疫化および非免疫化マウスの両方は、胃小窩の管腔内にかなりの数のＨ.フェリスを有した(図１５)。攻撃７日以内に、細菌は免疫化マウスから除去されたが、非免疫化マウスの胃小窩および管腔にはまだ多くの数で存在した。細菌はまた非免疫化マウスの粘液一分泌細胞の先端膜にもまた関連した。細菌の免疫化マウスの胃粘膜からの除去は、胃組織へのＩｇＡ陽性ＡＳＣおよび抗ウレアーゼＡＳＣの出現と対応した。これらの結果は、以下の連続した事象を示す：１）免疫化マウスの攻撃は、Ｈ．フェリスの胃上皮の移動コロニー形成をもたらす；２）非免疫化動物は感染したままであるが、一方組換えウレアーゼで免疫化した動物は、攻撃１週間に胃から細菌を除去する；および３）感染の除去は、ＩｇＡ要請ウレアーゼ特異的ＡＳＣの胃粘膜への集合に関連する。同様の機構が、治療的免疫化に付されている慢性感染動物の胃粘膜からの細菌の除去も担い得る。Ｈ.ピロリの株間のウレアーゼの抗原性保存種々の抗血清の、多くの臨床的単離Ｈ.ピロリに結合する能力を試験した。抗血清は、ＭＰＡ３、精製Ｈ.ピロリウレアーゼに対して製造した高度免疫ウサギ血清および組換えウレアーゼで免疫化したマウス由来の血清および分泌物(胃灯心サンプルおよび唾液)を含んだ。抗体調整物を、異種Ｈ.ピロリ株(Ｈｐ６３０) 、ＡＴＣＣ４３５０４タイプ株および細菌５年間に採集されたＳt．Ｂartholome w's Ｈolspital，Ｌondonでの潰瘍患者の５種の臨床的単離体の認識について、免疫ブロッティングで試験した。全ての抗血清は、全てのＨ.ピロリ株のウレＡおよびウレＢサブユニットおよび精製自生および組換えＨ.ピロリウレアーゼ、天然および組換えＨ.フェリスウレアーゼおよび自生Ｈ.マステラエウレアーゼを認識した。加えて、免疫化マウスの胃分泌物および唾液のウレアーゼ特異的ＩｇＡ抗体は、全てのＨ.ピロリ株のウレＡおよびウレＢの両方および異種ウレアーゼと反応した。免疫学的認識は、ウレＡよりウレＢの方が大きかった。擬免疫化マウスは、ウレアーゼサブユニットと反応性を示さなかった。これらの結果は、Ｈ.ピロリ株が抗原性レベルで非常に保存的なウレアーゼを発現することを証明する。従って、Ｈ.ピロリ株の抗原変化は、組換えウレアーゼワクチンの開発に重要な因子ではない。ヘリコバクター感染の処置のための組み合わせ法および組成物ヘリコバクター感染のような、胃十二指腸感染は、抗生物質、抗分泌剤、ビスマス塩、抗酸剤、スクラルファートまたはこれらの組み合わせと一緒のワクチン抗原(例えば、Ｈ．ピロリウレアーゼ)および粘膜アジュバントの経口投与により処置し得る。ワクチン抗原およびアジュバントと一緒に投与し得るこのような化合物の例は：例えば、マクロライド系、テトラサイクリン系、β−ラクタム系、アミノグリコシド系、キノロン系、ペニシリン系およびそれらの誘導体を含む抗生物質(本発明で使用し得る抗生物質の具体的例は、例えば、アミノキシリン、クラリスロマイシン、テトラサイクリン、メトロニジゾール、エリスロマイシン、セフロキシムおよびエリストマイシンを含む）；例えば、Ｈ₂−受容体アンタゴニスト(例えば、シメチジン、ラニチジン、ファモチジン、ニザチジンおよびロキサチジン)、プロトンポンプ阻害剤(例えば、オメプラゾール、ランソプラゾールおよびパントプラゾール)、プロスタグランジンアナログ(例えば、ミソプロシチルおよびエンプロスチル)および抗コリン原性剤(例えば、ピレゼピン、テレンゼピン、カルベノキソロンおよびプログルミド)を含む抗分泌剤；およびコロイド状次クエン酸ビスマス、次サリチル酸ビスマス、ビシトロペプチドおよびベプトービスモル(例えば、Ｇoodwin et al.，Ｈelicobacter pylori，Ｂiology and Ｃlinical Ｐractice，ＣＲＣＰress，Ｂoca Ｒaton，ＦＬ，pp366-395，1933 ；Ｐhysicians' Ｄesk Ｒeference，49^thedn.，Ｍedical Ｅconomics Ｄata Ｐr oduction Ｃompany，Ｍontvale，Ｎew Ｊersey，1995参照)を含むビスマス塩である。加えて、１種以上の上記成分を共に組み合わせて、例えば、次クエン酸ビスマスと組み合わせたラニチジンを含む、化合物を使用し得る。本発明の方法および組成物に使用する上記化合物の量は、当業者が容易に決定し得る。加えて、当業者は、処置／免疫化スケジュールを容易に設計できる。例えば、非ワクチン成分を、１−１４日に投与し、ワクチン抗原＋アジュバントを、７、１４、２１および２８日に投与し得る。ウレアーゼに加えて、他のヘリコバクター抗原を、組み合わせ治療を含む本発明の方法および組成物に使用し得る。例えば、ヘリコバクター熱ショックタンパク質ＡまたはＢ(ＨspＡまたはＨspＢ；ＷＯ９４／２６９０１)、ヘリコバクター接着リポタンパク質Ａ(ＡlpＡ；ＡlpＡをコードするヌクレオチド配列は、配列番号３および対応するＡlpＡのアミノ酸配列は配列番号７に記載する)、ヘリコバクター(例えば、Ｈ．ピロリ)clpＢ(clpＢは、細菌株XLOLR HP CP6のプラスミドの挿入物によりコードされ、Ｎational Ｃollections of Ｉndustrial ＆Ｍa rine Ｂacteria in Ａberdeen，Ｓcotlandに寄託され、受託番号は４０７４８である)またはモノクローナル抗体ＩｇＧ５０(ＩｇＧ５０は、ハイブリドーマ細胞系＃５０−Ｇ₆−Ｂ₇から得られ得、それはＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ−１１９５２と命名されている)により認識される１６−１９ｋＤヘリコバクター抗原を使用し得る。加えて、Ｈaas et al.のトランスポゾン・シャトル変異法を使用して同定されるヘリコバクター表面−露出または分泌抗原もまた本発明のワクチン抗原として使用し得る(Ｈaas et al.，Ｇeen 130:23-31，1993；Ｈ aas et al.，Ａbstruct from the VI^th Ｗorkshop on Ｇastroduodenal Ｐathol ogy and Ｈelicobacter pylori，Ｂrussels，Ｓeptember 21-25，1993；Ｏdenbr eit et al. Ｇut，Ａn Ｉnternational Ｊournal of Ｇastroenterology and Ｈepatology，Ａbstract from the VIII^th Ｉnternational Ｗorkshop on Ｇast ro-duodenal Ｐathology and Ｈelicobacter pylori，Ｅdinburgh，Ｓcotland， July 7-9，1995)。この方法において、クローン化Ｈ.ピロリ遺伝子を、トランスポゾン・挿入変異によりエシェリキア・コリに変異する。不活性遺伝子をＤＮＡ形質転換によりＨ.ピロリに再挿入し、対立遺伝子置換は、対応するＨ.ピロリ変異体の産生をもたらす。この方法の一つの変法に使用するトランスポゾンは、β −ラクタマーゼ遺伝子の５'−切断バージョンであるblaＭを有する。このトランスポゾンの使用は、ワクチン抗原の非常に有力な候補である、読み取りペプチド含有放出タンパク質(例えば、接着物およびサイトトキシンのような細胞表面タンパク質および他の可能性のある細胞表面毒素因子)をコードする遺伝子の添付を、従って、放出タンパク質の変異体を含むクローンの直接の分泌を容易にする。ヘリコバクター抗原に加えて、非ヘリコバクター胃十二指腸病原菌由来の抗原もまたその対応する病原体によりもたらされる感染症の予防および／または処置のための方法および組成物に使用し得る。上記抗原の防御的および／または治療的エピトープを含むポリペプチドフラグメントもまた本発明に使用し得る。本発明の方法および組成物に使用し得るアジュバントは、粘膜アジュバント、例えば、Ｅ.コリの易熱性腸毒素(ＬＴ)、コレラ毒素、Ｃ.ジフィシル毒素または誘導体(例えば、アジュバント活性を有するフラグメント、変異体またはトキソイド)、それらの組み合わせを含む。例えば、Ｃ.ジフィシル毒素Ａの７９４カルボキシル末端アミノ酸を含むフラグメント(例えば、Ｃ．ジフィシル毒素Ａの配列に関してはＤove et al.，前掲、参照)を使用し得る。本発明の組成物および方法に使用し得るワクチン抗原およびアジュバントの量は上記である。ヘリコバクター感染の処置におけるワクチン(Ｈ．ピロリウレアーゼ＋ＬＴ)、抗生物質(アモキシシリン)およびビスマス塩(ペプト−ビスモル)を含む組成物の効果を下記に説明する。マウスのヘリコバクター感染のための組み合わせ治療〜１０⁷Ｈ.フェリスで感染させた１月後、マウスを１日一回、１４日間アモキシシリン(１.５mg／３０ｇマウス)および／またはペプト−ビスモル(０.２mg／３０ｇマウス)で(１−１４日)、および／または組換えＨ.ピロリウレアーゼ１００μg＋ＬＴ５μgを含むワクチン組成物で７、１４、２１および２８日に処置した(使用した組み合わせの説明は表９参照)。これらのマウスにおけるヘリコバクター感染を、定量的胃ウレアーゼ検定(上記参照)で、処置の終了(２８日)後１週間および４週に測定した。表９に説明のように、最も有効な、１００％除去を達成する処置レジメは、ワクチン(ウレアーゼ＋ＬＴ)、抗生物質(アモキシシリン)およびビスマス塩(ペプト−ビスモル)の投与を含む。組換えＨ.ピロリウレアーゼワクチンの投与のためのヒト患者の同定本発明の組換えＨ.ピロリウレアーゼワクチンを、非感染個体に、予防手段として、またはヘリコバクターに感染した個体に抗微生物治療として投与し得る。組換えウレアーゼの予防的投与に選択される個体は、年令、地理的位置または個体がヘリコバクター感染の疑いがある状態が存在する個体を含む。特に感染の高い危険性がある個体または、感染により最も広く影響を受けているであろう個体は、開発途上国の個体、開発途上国および先進国の幼時および子供、先天的にまたは人工的に低い胃酸ｐＨの個体、潜水艦クルーおよび軍人を含む。組換えＨ.ピロリウレアーゼワクチンを治療的に投与し得る個体は、Ｈ.ピロリ感染に関連し得る胃炎の症状または他の胃腸疾患を示す個体を含む。胃粘膜の炎症である胃炎に関する臨床的症状は、余り定義されてない高範囲の、および一般的に不適切に処置され、消化不良、“胸焼け”、消化不全および過剰なげっぷのような症状を含む。胃炎の一般的記載は、ＳleisengerおよびＦordtran，Ｉn Ｇ astrointestinal Ｄesease，４th Ｅdn.，Ｓaunders Ｐublishing Ｃo.，Ｐhila delphia，ＰＡ，pp.772-902，1989に見られる。胃腸疾患の個体はまた本発明のワクチンの投与により処置し得る。胃腸疾患は、任意の疾患またはヒトまたは他の哺乳類の胃腸管の他の疾患を含む。胃腸疾患は、慢性または萎縮性胃炎、胃腸炎、非潰瘍性消化不良、流動性食道炎、胃能動性疾患および消化性潰瘍性疾患(例えば、胃および十二指腸潰瘍)のような、例えば、胃粘膜の潰瘍の存在により区別されない疾患(非潰瘍性胃腸疾患)を含む。消化性潰瘍は、食道、胃または十二指腸の粘膜の潰瘍および病変の形成を含み、一般に、消化酸、ペプシンまたは他の因子の活性による組織の損失により特徴付けられる。あるいは、ワクチンを無症状個体に、特に、個体Ｈ.ピロリにさらされている可能性のある場合、または、個体が感染の疑いのある症状を示す場合、投与することが望ましい。ヘリコバクターの感染は、例えば、血清学、¹³Ｃ呼気試験および／または胃カメラ試験を含む、当分野で既知の種々の方法により容易に診断できる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 31/71 Ａ６１Ｋ 31/71 39/39 ＡＣＬ 39/39 ＡＣＬ 45/00 45/00 51/00 43/00 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者アッカーマン，サミュエル・ケイアメリカ合衆国02193マサチューセッツ州ウエストン、キングズ・グラント・ロード175番 (72)発明者トーマス，ウィリアム・ディ・ジュニアアメリカ合衆国01890マサチューセッツ州ウィンチェスター、ジョージ・ロード42 番 (72)発明者ソマン，ゴパランアメリカ合衆国02178マサチューセッツ州ベルモント、レキシントン・ストリート 61番 (72)発明者クリーンソース，ハロルドアメリカ合衆国02160マサチューセッツ州ニュートンビル、マディソン・アベニュー89番 (72)発明者ウェルツィン，リチャード・エイアメリカ合衆国01462マサチューセッツ州ルーネンバーグ、フラット・ヒル・ロード188番 (72)発明者パッポ，ジャックスアメリカ合衆国02168マサチューセッツ州ニュートン、グールド・ロード56番 (72)発明者アーマック，トーマスアメリカ合衆国02146マサチューセッツ州ブルックリン、レジェント・サークル・ナンバー１、１番 (72)発明者ギラコー，ファーシャドアメリカ合衆国02176マサチューセッツ州メルローズ、チェスナット・ストリート 39番 (72)発明者バガット，ハイテッシュアメリカ合衆国01701マサチューセッツ州フラミンガム、ディンスモアー・アベニュー・ナンバー102、44番 (72)発明者サスマン，イレーネアメリカ合衆国02159マサチューセッツ州ニュートン、ソー・ミル・ブルック・パークウェイ 741番

Claims

【特許請求の範囲】１．患者中でヘリコバクターに対する粘膜免疫応答を誘起するためのワクチンであって：ａ）酵素的に不活性な組換えヘリコバクターウレアーゼの多量体複合体、およびｂ）医療上許容される担体または希釈剤を含んで成るワクチン。２．８個のウレアーゼＡサブユニットと８個のウレアーゼＢサブユニットを含んで成る多量体複合体、６個のウレアーゼＡサブユニットと６個のウレアーゼＢサブユニットを含んで成る多量体複合体、および４個のウレアーゼＡサブユニットと４個のウレアーゼＢサブユニットを含んで成る多量体複合体、またはこれらの混合物、を含んで成る、請求の範囲第１項記載のワクチン。３．８個のウレアーゼＡサブユニットと８個のウレアーゼＢサブユニットを含んで成る多量体複合体、６個のウレアーゼＡサブユニットと６個のウレアーゼＢサブユニットを含んで成る多量体複合体、および４個のウレアーゼＡサブユニットと４個のウレアーゼＢサブユニットを含んで成る多量体複合体、を含んで成る、請求の範囲第１項記載のワクチン。４．さらに粘膜アジュバントを含んで成る、請求の範囲第１項記載のワクチン。５．該粘膜アジュバントが、腸管毒性大腸菌の熱不安定性エンテロトキシン、コレラ毒素、クロストリジウムジフィシル毒素、それらのサブユニットまたは誘導体であって毒性はないがアジュバント活性はなお保有しているもの、またはそれらの混合物である、請求の範囲第１項記載のワクチン。６．該粘膜アジュバントが、腸管毒性大腸菌の熱不安定性エンテロトキシン、または、それらのサブユニットまたは誘導体であって毒性はないがアジュバント活性はなお保有しているものである、請求の範囲第４項記載のワクチン。７．該粘膜アジュバントが、コレラ毒素、またはそれらのサブユニットまたは誘導体であって毒性はないがアジュバント活性はなお保有しているものである、請求の範囲第４項記載のワクチン。８．該粘膜アジュバントが、クロストリジウムジフィシル毒素、またはそれらのサブユニットまたは誘導体であって毒性はないがアジュバント活性はなお保有しているものである、請求の範囲第４項記載のワクチン。９．該粘膜アジュバントが、クロストリジウムジフィシル毒素Ａのドメインに結合している炭化水素を含むものである、請求の範囲第８項記載のワクチン。１０．該酵素的に不活性な組換えヘリコバクターウレアーゼの多量体複合体が、凍結乾燥されたものである、請求の範囲第１項記載のワクチン。１１．該ヘリコバクターウレアーゼが、ヘリコバクター・ピロリウレアーゼである、請求の範囲第１項記載のワクチン。１２．患者における胃十二指腸感染の処置用組成物であって、（ａ）胃十二指腸病原菌由来の抗原、および（ｂ）抗生物質、抗分泌剤ビスマス塩、またはそれらの組み合わせ、を含んで成る組成物。１３．該胃十二指腸病原菌が、ヘリコバクターである、請求の範囲第１２項記載の組成物。１４．該ヘリコバクターが、ヘリコバクター・ピロリである、請求の範囲第１３項記載の組成物。１５．該抗原が、ウレアーゼである、請求の範囲第１３項記載の組成物。１６．該抗原が、酵素的に不活性な組換えヘリコバクターウレアーゼの多量体複合体を含んで成る、請求の範囲第１３項記載の組成物。１７．８個のウレアーゼＡサブユニットと８個のウレアーゼＢサブユニットを含んで成る多量体複合体、６個のウレアーゼＡサブユニットと６個のウレアーゼＢサブユニットを含んで成る多量体複合体、および４個のウレアーゼＡサブユニットと４個のウレアーゼＢサブユニットを含んで成る多量体複合体、またはこれらの混合物、を含んで成る、請求の範囲第１３項記載の組成物。１８．８個のウレアーゼＡサブユニットと８個のウレアーゼＢサブユニットを含んで成る多量体複合体、６個のウレアーゼＡサブユニットと６個のウレアーゼＢサブユニットを含んで成る多量体複合体、および４個のウレアーゼＡサブユニットと４個のウレアーゼＢサブユニットを含んで成る多量体複合体、を含んで成る、請求の範囲第１３項記載の組成物。１９．該ヘリコバクター感染がヘリコバクター・ピロリ感染である、請求の範囲第１２項記載の組成物。２０．さらに粘膜アジュバントを含んで成る、請求の範囲第１２項記載の組成物。２１．該粘膜アジュバントが、腸管毒性大腸菌の熱不安定性エンテロトキシン、コレラ毒素、クロストリジウムジフィシル毒素、それらのサブユニットまたは誘導体であって毒性はないがアジュバント活性はなお保有しているもの、またはそれらの混合物である、請求の範囲第２０項記載の組成物。２２．該粘膜アジュバントが、腸管毒性大腸菌の熱不安定性エンテロトキシン、または、それらのサブユニットまたは誘導体であって毒性はないがアジュバント活性はなお保有しているものである、請求の範囲第２０項記載の組成物。２３．該粘膜アジュバントが、コレラ毒素、または、それらのサブユニットまたは誘導体であって毒性はないがアジュバント活性はなお保有しているものである、請求の範囲第２０項記載の組成物。２４．該粘膜アジュバントが、クロストリジウムジフィシル毒素、または、その誘導体であって毒性はないがアジュバント活性はなお保有しているものである、請求の範囲第２０項記載の組成物。２５．該粘膜アジュバントが、クロストリジウムジフィシル毒素Ａのドメインに結合している炭化水素を含んで成る、請求の範囲第２４項記載の組成物。２６．該抗生物質が、アモキシシリン、クラリスロマイシン、テトラサイクリン、メトロニジゾールおよびエリスロマイシンからなる群から選ばれるものである、請求の範囲第１２項記載の組成物。２７．該ビスマス塩が、ビスマスサブサイトレートおよびビスマスサブサリチレートからなる群から選ばれるものである、請求の範囲第１２項記載の組成物。２８．該抗分泌剤が、プロトン・ポンプ・インヒビターである、請求の範囲第１２項記載の組成物。２９．該プロトン・ポンプ・インヒビターが、オメプラゾール、ランソプラゾール、およびパントプラゾールからなる群から選ばれるものである、請求の範囲第２８項記載の組成物。３０．該抗分泌剤が、Ｈ₂−レセプターアンタゴニストである、請求の範囲第１２項記載の組成物。３１．該Ｈ₂−レセプターアンタゴニストが、ラニチジン、シメチジン、ファモチジン、ニザチジン、およびロクサチジンからなる群から選ばれるものである、請求の範囲第３０項記載の組成物。３２．該抗分泌剤が、プロスタグランジン類似体である、請求の範囲第１２項記載の組成物。３３．該プロスタグランジン類似体が、ミソプロスチルまたはエンプロスチルである、請求の範囲第３２項記載の組成物。