KR100251391B1 - 헬리코박터 감염에 대한 우레아제 기재 백신 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항원으로서 면역학적 유효량의 락토바실루스 퍼멘툼 우레아제, 락토바실루스 로이테리 우레아제, 락토바실루스 퍼멘툼 우레아제 소단위 또는 락토바실루스 로이테리 우레아제 소단위를 숙주에 투여함으로써 포유 동물 숙주에서 헬리코박터 감염에 대한 보호면역 반응을 유발시키는 방법 및 백신에 관한 것이다.

Description

헬리코박터 감염에 대한 우레아제 기재 백신

인간 위장 상피의 헬리코박터 감염은 위염을 일으키며, 그것은 소화성 궤양 및 임파종 발병의 주원인이며, 위암발생의 위험 요인이 될 수 있다[문헌 1 내지 3참고]. 가장 빈번한 감염원은 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori)이며, 그 다음에 헬리코박터 헤일마니(Helicobacter heilmanii)에 의해 자주 감염된다. 에이치. 필로리는 가느다란 S형 그람 음성 미생물이며, 그것은 통상적으로 위염 또는 소화성 궤양의 조직학적 증거를 가진 성인 및 어린이의 위 생검법에 의해 회수된다. 에이치. 필로리 및 위십이지장 질병사이의 인과관계에 대한 증거는 궤양 및 위암 환자 지원자, 순수 격리 돼지 및 무균 설치류로 연구하여 얻었다. 병인에 관하여, 코호의 요청은 예전에 비감염되었던 개체에 조직학적으로 확인된 위염을 일으키고, 이어서 생존 미생물을 소비하고[문헌 4 내지 11 참고], 위염 치료 및 소화성 궤양 질환을 앓고 있는 환자에 있어서는 재발을 감소시키는 방법으로써 에이치. 필로리를 제거 처리하여 만족시켰다[문헌 12 참고].

많은 살균제에 대한 생체의 민감성에도 불구하고, 발병된 에이치. 필로리 감염증을 살균제로 생체외 근절시키는 것이 종종 어려울 때도 있다[문헌 13 참고]. 미생물은 위점막 소와(小窩) 내의 위 상피를 중첩하는 점막 내에서 발견된다. 이곳은 항생물질이 고투여량으로 경구 투여될 때에도 적당한 살균농도가 얻어지도록 하는 보이지 않는 위치이다. 현재 대부분의 기관은 2 내지 4주 동안 "삼중 치료", 즉 프로톤 펌프 저해제를 아목시실린 및 클라리쓰로마이신과 같은 약물과 병용하는 것을 추천한다. 그러나, 이러한 또는 다른 화학 치료 양생법의 효능은 최적 이하인 상태였다. 또한, 클라리쓰로마이신에 대한 높은 내성율이 보고되어[문헌 14 참고] 에이치. 필로리 감염증의 치료에 어려움이 지적되고 있다.

현재에는, 위에서의 점막 면역계의 역할에 관해 알려진 바가 거의 없다. 정상 위동(胃洞)에서의 면역글로부린(Ig) 생성 세포의 분포는 IgA 혈장 세포가 총혈장 세포 집단의 80%를 구성한다는 것을 나타낸다. 또한, 위동에 존재하는 혈장 IgA 세포의 수는 다른 점막과 비교할만 하다[문헌 15 및 16 참고]. 인간 모델에서의 많은 연구[문헌 16 참고] 및 동물 모델에서의 많은 연구[문헌 8 및 10 참고]에서 헬리코박터 감염에 대한 반응에 있어서 혈청 및 위 분비물에서의 특이적 IgG 및 IgA 반응이 증명되었다. 그러나, 에이치. 필로리 감염이 수년 동안 만성적 감염으로서 유지된 경우는, 국소적 및 전신적 면역반응을 유발시킨다 하더라도 면역화 방법이 전개될 수 없다는 것이 관찰되었다.

리(Lee) 등은 에이치. 필로리 및 재현성 조직학적 위염과 밀접한 관련이 있는 세균인 헬리코박터 펠리스(Helicobacter felis)로 무균 설치류를 감염시키는 능력에 대해 보고하였다. 그 이후에 이러한 세균-숙주 쌍은 헬리코박터 매개 위염 및 그의 개시 인자를 연구하기 위한 좋은 모델로서 이용되었다. 친(Czinn) 등은 에이치. 필로리의 조 용균액과 콜레라 독소 보조제에 의한 반복적인 경구 면역화는 마우스 및 페렛 동물(ferrets)에서 격렬한 위장 IgA 항-에이치. 필로리 반응을 유도한다는 것을 증명하였다[문헌 13 참고]. 또한, 첸(Chen) 및 친 등은 최근에 에이치. 펠리스의 조 용균액에 의한 경구 면역화는 마우스에서의 에이치. 펠리스 감염에 대한 보호를 유도한다는 것을 보고한 바 있다[문헌 22 및 23 참고]. 그러나, 이러한 보호를 유발시키는 항원(들)의 정확한 성질은 측정되지 않았으며, 이 병원체에 대한 보호를 유발시키는 에이치. 펠리스의 보호 항원(들)은 다른 헬리코박터종까지도 교차 반응 보호를 유도한다는 것을 제안한 바 없다. 한편 미체티(Michetti) 및 다빈(Davin)은 에이치. 필로리 및 에치치. 펠리스 음파 처리에 대해 최초로 증명하였으며, 에이치. 필로리에 대한 항체의 몇몇은 에이치. 펠리스와 교차 반응하고 또한 그 반대로 반응한다는 것을 보여주었다[문헌 25 및 26 참고]. 이러한 교차 반응성에 대한 근거는 알려지지 않았다.

다른 알려진 우레아제 아미노산 서열 사이에 존재하는 상동성에 기초하여 우레아제가 에이치. 필로리에 대한 백신으로서 사용될 수 있다는 것을 제안하였다[문헌 27 참고]. 그럼에도 불구하고, 교차 반응성은 규칙적이지 않았다. 구오 및 리오(Guo and Liu)는 수년전에 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 프로데우스 불가리스(Proteus vulgaris) 및 프로비덴시아 레트게리(Providencia rettgeri)의 우레아제는 서로 교차 면역성을 나타내는 반면, 작두콩(jack bean) 및 모르가넬라 모르가니(Morganella morganii)의 우레아제는 상기한 세가지 우레아제와 면역학적으로 상이하다는 것을 발표하였다. 에이치. 필로리 우레아제와 다른 헬리코박터 우레아제의 항원성 교차성이 있는 것으로 가정되었는데, 다빈(Davin)이 몇몇 에이치. 펠리스 모노클로날 항체가 에이치. 필로리 우레아제와 교차 반응한다는 것을 증명하여 이 경우를 실질적으로 입증하였다[문헌 26 참고].

에이치. 필로리 감염에 대한 백신으로서의 에이치. 필로리 우레라제, 또는 관련 우레아제의 사용은 라빈(A. Labigne)에 의해 유럽 특허 공개 제367,644호에 이미 제안되었다[문헌 29 참고]. 그러나, 이 출원은 어떠한 헬리코박터 감염에 대해 우레아제를 사용하여 임의의 포유 동물을 백신 접종한 증거를 갖고 있지 않다.

더욱이, 다른 세균 우레아제와 상동성인 서열이 에이치. 필로리 감염에 대한 백신으로서의 우레아제의 사용을 지지할 수는 있지만, 인간의 에이치. 필로리 감염에 대한 현재의 정보는 없다. 첫째, 감염된 개체가 종종 우레아제에 대한 강한 항체 반응을 하게 한다는 사실에도 불구하고, 항우레아제 면역 반응은 감염을 허용하거나 또는 제어하지 않는다. 두 번째로, 에이치. 필로리는 세포 밖으로 우레아제를 수송하고 그의 표면으로부터 그것을 방출시킬 수 있다[문헌 20 및 21 참고]. 따라서, 우레아제는 보호 점막 면역반응의 발생에 대한 적절한 타켓을 나타낼 수 없다. 사실상, 점막 면역 보호는 주로 분비 IgA에 의해 매개된다고 생각되며, 그 응집 활성은 인지된 항원이 타켓 병원체에 의해 방출될 수 있을 때 약화 되므로 보호 항체에 대한 유인체로서 작용한다. 세 번째로, 우레아제는 배양물 중의 상피세포에 대해 독성이 있는 것으로 나타나며 생체내 점막 분해 및 소화성 궤양에서의 역할에 지장을 받았다. 따라서, 항원으로서의 그의 사용은 독성이 될 수 있다.

그럼에도 불구하고, 본 발명자들은 이러한 항원이 다음과 같은 경우라면 잠재적으로 효과적인 백신이 될 수 있다고 추론하였다.

- 첫째, 자연 발생 면역 반응보다 더 강력한 면역 반응을 유발시키기에 충분한 고투여량으로 경구 투여 하는 경우,

- 둘째, 형성된 항체의 양이 방출되거나 또는 방출되지 않은 모든 우레아제와 결합하기에 충분한 경우,

- 셋째, 비독성인 우레아제의 소단위 또는 분자종을 사용하는 경우.

개략적으로 보면, 인간의 에이치. 필로리 유도된 위 감염의 효과적인 치료 및 예방법이 요구되고 있다. 최근의 데이터는 이 감염에 대한 백신의 생산 가능성을 제안하였지만, 안전하고 효과적인 백신으로 혼입될 수 있는 에이치. 필로리의 모든 균주에 대해 공통적인 분명한 항원(들)의 명확한 동정법을 제공하지 않았다.

도 1은 마우스를 정제된 엘. 퍼멘툼 음파 처리물, 엘. 퍼멘툼 우레아제 또는 콜레라 독소와 히드록시아파타이트(대조군)로 경구 면역화시킨 후의 투 테일 피셔 정밀 시험 결과의 그래프이다.

도 2는 마우스를 정제된 엘. 로이테리 음파 처리물, 엘. 로이테리 우레아제 또는 콜레라 독소와 히드록시아파타이트(대조군)로 경구 면역화시킨 후의 투 테일 피셔 정밀 시험 결과의 그래프이다.

본 발명에서는 백신으로서 락토바실루스 로이테리와 락토바실루스 퍼멘툼의 산성 우레아제 항원을 동정하였으며 동물 모델에서의 그의 효능을 증명하였다.

본 발명자는 엘.로이테리와 엘. 퍼멘툼의 우레아제 에피토프를 이용하고 백신 타켓으로서 그것들을 사용함으로써 위장 헬리코박터 감염에 민감성인 포유동물에서 면역성이 유도될 수 있다는 것을 발견하였다. 면역성은 자연 우레아제로 면역화시킴으로써 유도될 수 있지만, 또한 효소적으로 불활성인 우레아제 소단위로 유도될 수도 있다. 본 발명은 포유동물의 점막 표면에 폴리아미노산 제제, 즉 적절한 보조제와 함께 사용되는 펩타이드 및/또는 단백질의 혼합물을 투여함으로써 헬리코박터 감염에 대한 면역성을 유발시키는 방법을 제공한다. 이러한 폴리아미노산 제제는 헬리코박터 감염에 대해 내인성인 우레아제 효소에 의해 발휘되는 많은 에피토프 특성을 갖는다. 폴리아미노산 제제는 경구 투여될 수 있다.

이 제제의 활성 성분은 자연 또는 생합성 에피토프로 이루어질 수 있으며 다양한 형태를 취할 수 있다. 가능한 제제의 비제한적 예로는 정제되고, 자연 발생된 또는 재조합적으로 생성된 세균 또는 다른 근원의 우레아제 제제, 우레아제의 소화물, 우레아제 에피토프로 이루어진 융합 단백질, 우레아제 효소의 절단 형태, 또는 우레아제 아미노산 서열과 상동성인 펩타이드를 들 수가 있다. 면역성 발생은 헬리코박터 감염 생물에 결합하는 체액 및/또는 세포 면역 반응의 유도에 좌우되기 때문에, 바람직한 제제는 감염생물에 대해 내인성인 우레아제의 에피토프와 가장 밀접하게 중복되는 것이다.

본 발명의 한 국면에 따라서, 보호 면역 반응을 우발시킬 수 있는 면역학적 유효량의 우레아제 항원, 바람직하게는 엘. 로이테리 우레아제 A 소단위 또는 엘. 퍼멘툼 우레아제 A 소단위가 숙주의 점막 표면에 투여되는 것으로 이루어지는, 포유류 숙주에서 헬리코박터 감염에 대한 보호 면역 반응을 유발시키는 방법이 제공된다.

본 발명의 다른 국면에 따라서, 제약학상 허용되는 담체 또는 희석제 중에 포함되어 있으며, 숙주에서 헬리코박터 감염에 대한 보호 면역 반응을 유발시킬 수 있는 유효량의 우레아제 항원, 바람직하게는 엘. 로이테리 우레아제 A 소단위 또는 엘. 퍼멘툼 우레아제 A 소단위로 이루어진, 헬리코박터 감염의 예방에 적합한 백신 조성물이 제공된다.

본 발명의 또다른 국면에 따라서, 헬리코박터 감염에 대한 보호 면역 반응을 유발시킬 수 있는 우레아제, 바람직하게는 엘. 로이테리 우레아제 A 소단위 또는 엘. 퍼멘툼 우레아제 A 소단위로 면역화된 숙주에서 생산되는 면역학적 유효량의 우레아제 특이적 항체를 숙주의 점막 표면에 투여하는 것으로 이루어지는, 헬리코박터 감염에 대한 수동적인 보호능을 포유류 숙주에 부여하는 방법이 제공된다.

본 발명의 범주에는 또한 인간을 포함한 포유류의 헬리코박터 감염에 대한 치료 또는 예방법이 포함되며, 이는 헬리코박터 감염에 대한 보호 면역 반응을 유발시킬 수 있는 면역학적 유효량의 우레아제 또는 그의 소단위를 환자의 점막 표면에 투여하는 것으로 이루어진다. 우레아제는 바람직하게는 엘. 로이테리 우레아제 A 소단위 또는 엘. 퍼멘툼 우레아제 A 소단위이며, 이는 단독으로 또는 예를 들어 담체 입자로서의 히드록 시아파타이트와 같은 히드록시화 칼슘 포스페이트에 결합되어 투여될 수 있다. 또한, 에이치. 필로리 우레아제는 점막 보조제, 콜레라 독소의 B 소단위, 뮤라밀 디펩타이드 또는 기타 보조제와 함께 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명자들은 어떠한 이론에도 구애됨이 없이, 우레아제 항원 또는 그의 A 소단위를 점막 표면에 투여하는 것이 통상의 점막 면역계 및 아마도 위장 점막의 국소적 면역계를 자극하여 위장 분비물 중 헬리코박터 감염을 예방하는 에이치. 필로리 특이적 IgA 항체의 출현을 포함한 면역 반응이 일어난다고 믿고 있다. 인간에게 사용하기 위한 새로운 백신의 예비 임상 실험을 동물 모델에서 수행하는 것은 일상적인 일이므로, 본 발명의 방법은 인간에서, 특히 위궤양, 위염, 위암 및 에이치. 필로리 및/또는 에이치. 헤일마니의 존재에 기인하여 발생되는 기타 증상의 예방 및 치료에 유효하다고 믿어진다.

A-세균 배양 및 우레아제 정제

본 연구에 사용되는 엘. 퍼멘툼(L. fermentum ATCC 11739)과 엘. 로이테리(L. reuterii ATCC 23272)는 표준균주로 MRS배지에서 혐기성 조건하에서 배양시킨다. 정제된 우레아제는 문헌[Kakimoto et al., Agric. Biol. Chem. 53, 1119-1125, Kakimoto et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 32, 538-543]에 기재된 일반적 방법에 따라 수득한다. 간단히 설명하면, 세균을 병 중에서 37℃에서 2일 동안 배양하여 액체 배양물을 생성시킨다. 배양후 세균을 티 완충액(1mM 2-머캅토에탄올, 50mM Tris-HCl, pH 7.0) 중에 수확하고 와동 회전시키고 다시 원심분리하여 상등액을 수득한다. 상등액에 찬 에탄올을 30%가 되도록 가한 후 원심분리하여 침전물을 티 완충액에 녹이고 Toyopearl HW-55F 칼럼상에서 크로마토그래피한다. 강한 우레아제 활성을 갖는 분획들을 모은 다음, 밤새 투석하고 DEAE-세파로즈 CL-6B 칼럼상에서 다시 크로마토그래피한다. 분획들을 증가되는 농도의 NaCl 완충액으로 용출시키고, 강한 우레아제 활성을 갖는 분획들을 수집하여 5mM 인산 완충액(pH 7.0)에서 밤새 투석하고 히드록시우레아를 고정시킨 Affi-Gel 202 칼럼상에서 친화성 크로마토그래피한다. 100mM 인산 완충액으로 용출시킨 후, 25mM 이미다졸-HCl 완충액(pH 7.4)에서 밤새 투석하고 PBE 94 칼럼상에서 크로마토포커싱한 후, 다시 Affi-Gel 202 칼럼상에서 크로마토그래피하여 SDS 겔 크로마토그래피를 수행한 다음 쿠마시 염색한다. 분자량 약 68, 16 및 8.8kDa에 해당하는 세가지의 뚜렷한 밴드는 우레아제로 판명된다. 우레아제를 함유하는 분획들을 모아서 순도가 95 내지 99%에 이르는 정제된 엘. 퍼멘툼 우레아제와 엘. 로이테리 우레아제를 수득한다.

B - 엘. 퍼멘툼 또는 엘. 포이테리로부터 정제된 우레아제를 사용한 경구 면역화

항원성 물질로서 상술한 바와 같이 수득된 정제 엘. 퍼메툼 우레아제 또는 정제 엘. 로이테리 우레아제를 사용하는 것이 바람직할 것이나, 자연에 존재하거나 재조합 DNA기술에 의해 수득된 우레아제 또는 우레아제의 소단위, 및 이들의 분해된 단편, 이러한 단편 또는 전체 우레아제를 포함하는 융합 단백질, 말단 절단된 우레아제 구조물, 또는 헬리코박터 감염에 대한 보호 면역 반응을 유발시킬 수 있는 우레아제 에피토프가 존재하는 기타 펩타이드 또는 단백질제제(하기 참조)는 또한 항원성 물질로서 사용 될 수 있음을 이해하여야 할 것이다. 따라서, 엘. 퍼멘툼 우레아제 또는 엘. 로이테리 우레아제에 관련하여 실질적 상동성을 가지며 헬리코박터에 대한 교차-보호 면역반응을 일으키는데 효과적인 우레아제를 사용할 수 있다. 본 발명은 따라서 완전한 우레아제로 한정되는 것은 아니며, 우레아제 에피토프를 나타내며 숙주내에서 헬리코박터 감염에 대해 보호면역반응을 유발시키는데 효과적인 어떠한 폴리아미노산 제제를 사용하여도 무방하다.

잠재적으로 유용한 우레아제 제제의 비제한적 예에는 정제된 우레아제(공금원은 상기한 바와 같다)로부터 물리적 및/또는 화학적 분해과정(즉, CnBr), 및/또는 단백질 분해(예를 들어, V8-프로테아제, 트립신 등의 프로테아제를 사용)에 의해 생성된 펩타이드, 또는 화학적으로 합성되었으며 우레아제와 일치하는 에피토프를 갖는 펩타이드가 포함된다.

잠재적으로 유용한 에피토프의 기타 공급원에는 항-우레아제 항체를 사용한 스크리닝 결과 우레아제와 교차 반응성을 갖는 것으로 확인된 에피토프가 포함된다. 이러한 펩타이드는 천연 펩타이드 또는 화학합성 펩타이드일 수 있다. 또한, 이러한 펩타이드는 재조합 랜덤 올리고뉴클레오타이드를 발현시켜 수득할 수 있다.

잠재적으로 유용한 에피토프의 또 다른 공급원에는 우레아제에 대한 항-인자형 항체를 생성시킴으로써 확인될 수 있는 우레아제와 유사한 에피토프가 포함된다. 어떠한 면역 적격 숙주에서나 생산되는 이러한 항-인자형 항체는 우레아제와 구조적 상동성을 갖는, 항-우레아제 항체에 대한 항체를 유발시킬 목적으로 이러한 숙주를 항-우레아제 항체로 면역화시켜 수득한다.

하기 표 1 내지 4, 제 1 및 2도는 마우스를 정제된 엘. 퍼멘툼 우레아제 또는 엘. 로이테리 우레아제로 경구 면역화시켰을 때 수득된 결과를 나타낸 것이다. 첫 번째 실험에서, 상기 A항에 기술된 바와 같이 정제되고 M 세포결합 및 흡수를 증진시키는 담체로 사용되는 히드록시아파타이트 결정에 커플링된 엘. 퍼멘툼 우레아제 또는 엘. 로이테리 우레아제를 마우스에 경구 투여하여 항원을 투여하였다. 콜레라 독소(Sigma사 제조)를 점막 보조제로 사용하였다. 이 실험에서 생후 5주된 SPF BALB/c 암컷 마우스의 군들을 제 0, 7, 14 및 21일에 1㎎의 히드록시아파타이트에 커플링된 30㎍의 정제 엘. 퍼멘툼 우레아제 또는 정제 엘. 로이테리 우레아제 및 10㎍의 콜레라 독소 보조제로 각각 경구 면역화시켰다. 마우스를 제 28, 30 및 32일에 10⁸에이치. 펠리스로 3회 공격하였다. 비교를 위해, 유사한 생후 5주된 SPF BALB/c 암컷 마우스를 제 0, 7, 14 및 21일에 전세포 엘. 퍼멘툼 용균액 또는 전세포 엘. 로이테리 용균액(음파처리물)과 10㎍의 콜레라 독소를 사용하여 경구 면역화시켰다. 마우스들을 제 28, 30 및 32일에 에이치. 펠리스로 공격하였다. 엘. 퍼멘툼 또는 엘. 로이테리 음파 처리물은 세포 배양물로부터 엘. 퍼멘툼 또는 엘. 로이테리를 수거하고 원심분리하여 펠렛화시킨 다음, 펠렛을 0.9% 염화나트륨 용액에 재현탁시키고 음파처리함으로써 제조하였다.

대조군으로서, 생후 5주된 SPF BALB/c 암컷 마우스를 제 0, 7, 14 및 21일에 10㎍의 콜레라 독소 및 1㎎이 히드록시아파타이트로 경구적으로 허위 면역화시켰다. 모든 마우스를 우리에 가두고, 동등하게 면역화 및 공격하였다. 본 연구에 사용된 모든 마우스는 39일째에 죽였다.

c - 에이치. 필로리 재조합 우레아제 소단위를 사용한 경구 면역화

엘. 퍼멘툼 우레아제의 구조 A, B 및 C 소단위 또는 엘. 로이테리 우레아제의 구조 A, B 및 C 소단위는 문헌[Kakimoto et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 32, 538-543]에 기재된 일반적 방법에 따라 수득한다. 간단히 설명하면, 정제된 우레아제를 Micropak Protein C 18-10 칼럼상에서 역상 크로마토그래피하고, 분획들을 증가되는 농도의 아세토니트릴 완충액으로 용출시켜 우레아제 소단위를 정제했다.

상술한 바와 같이 수득된 정제 엘. 퍼멘툼 우레아제 소단위 또는 정제 엘. 로이테리 우레아제 소단위를 항원성 물질로 사용하는 것이 바람직한 반면, 헬리코박터 감염에 대한 보호 면역 반응을 유발시킬 수 있으며 우레아제의 항원성 부위를 발현시키는, 재조합 기술에 의해 수득된 어떠한 우레아제 또는 우레아제 소단위(예를 들어, 융합단백질)를 항원성 물질로 사용하여도 무방함을 이해하여야 한다. 따라서, 엘. 퍼멘툼 우레아제 또는 엘. 로이테리 우레아제와 실질적인 상동성을 가지며 헬리코박터에 대한 교차 보호면역 반응을 일으키는데 효과적인 우레아제 유전자를 구조물로 사용할 수 있다. 본 발명은 엘. 퍼멘툼 우레아제 또는 엘. 로이테리 우레아제 유전자 및 그의 유전자 생성물의 사용에 국한되는 것이 아니라, 숙주에서 헬리코박터 감염에 대한 보호 면역 반응을 일으키는데 효과적인 어떠한 재조합 우레아제 또는 그의 소단위의 사용을 허용한다. 전형적으로는 엘. 퍼멘툼 우레아제 또는 엘. 로이테리 우레아제에 관련한 상동성이 70 내지 95%, 예를 들어 80 내지 90%인 재조합 우레아제를 본 발명의 재조합 우레아제 항원으로 사용할 수 있다.

본 명세서의 초점은 칼럼상에서 정제된 엘. 퍼멘툼 우레아제 또는 엘. 로이테리 우레아제의 A, B 및 C 소단위(상기 C항 참조)의 사용에 맞추어져 있다. 그러나, 목적하는 보호 면역 반응을 유발시킬 수 있는 상기의 정제된 우레아제, 그의 소단위 또는 구조물은 재조합 DNA 기술 및 원핵 및 진핵 발현 벡터를 사용하여 제조할 수 있음을 이해하여야 한다.

하기 표 5 내지 8은 정제된 엘. 퍼멘툼 우레아제 소단위 또는 엘. 로이테리 우레아제 소단위로 마우스를 경구 면역화 시켰을 때 수득된 결과를 나타낸 것이다. 이 실험에서, 전술한 바와 같이 정제되었으며, M세포 결합 및 흡수를 증진시키는 담체로 사용되는 히드록시아파타이트 결정에 커플링 된 엘. 퍼멘툼 우레아제 또는 엘. 로이테리 우레아제의 A, B 또는 C 소단위를 마우스에 경구 투여하여 항원의 투여를 수행하였다. 콜레라 독소(Sigma사 제조)를 점막 보조제로 사용하였다. 이 실험에서, 생후 5주된 SPF BALB/c 암컷 마우스의 군들을 제 0, 7, 14 및 21일에 1㎎의 히드록시아파타이트에 커플링된 50㎍의 정제된 엘. 퍼멘툼 우레아제의 A, B, C 소단위 또는 정제된 엘. 로이테리 우레아제의 A, B, C 소단위 및 10㎍의 콜레라 독소 보조제로 각각 경구 면역화시켰다. 마우스를 제 28, 30 및 32일에 10⁸의 에이치. 펠리스로 3회 공격하였다. 대조군으로서, 생후 5주된 SPF BALB/c 암컷 마우스를 제 0, 7, 14 및 21일에 10㎍의 콜레라 독소 및 1㎎의 히드록시아파타이트로 경구적으로 허위 면역화시켰다. 마우스를 제 28, 30 및 32일에 에이치. 펠리스로 공격하였다. 본 연구에 사용된 모든 마우스는 동등하게 면역화 및 공격하였다. 동물들을 제 46일(공격후 14일) 되는 날에 죽였다.

D. 위장 피검 조직, 혈액 및 장내 분비물의 분석

에이치. 펠리스 콜리니화에 대한 보호를 평가하기 위해 각 동물로부터의 위장 피검 조직을 공급자의 지시에 따라 시엘오 시험(CLO test, Delta West Pty Ltd)에 의해 우레아제 활성을 측정함으로써 에이치. 펠리스의 존재에 대해 선별하였다. 간단히 설명하면, 위장 피검 조직을 19게이지 주사침으로 시엘오 시험 겔에 침지시킨다. 3시간동안 37℃에서 보관 후 실온에서 보관하며 색의 변화를 관찰하여 24시간 후에도 변색되지 않고 노란색으로 남아 있는 경우에는 음성으로 판정한다.

상기 B항에 기술된 실험에 포함된 각 동물의 위장 피검 조직을 에이치. 펠리스의 검출을 위해 7%의 말 혈청을 함유하며 캄필로박터(Campylobacter) 선택적 보조제(Mikrobiologie, Merck) 및 암포테리신 비(amphotericin B)로 보충된 브루셀라(Brucella) 아가로오스 플레이트 상에서 배양시켰다. 미호기성 조건하에 3 내지 10일 동안 배양시킨후, 그램 염색 및 우레아제 활성의 측정, 카탈라제 활성의 측정으로 에이치. 펠리스의 존재를 확인하였다. 에이치. 펠리스의 검출은 두 가지 상이한 염색시약(아크리딘 오렌지 및 크레실 바이올렛)을 사용한 서로 무관한 두명의 검사자에 의한 현미경 검사에 의해 확인하였다.

정제된 엘. 퍼멘툼 우레아제로 면역화시킨 후, 에이치. 펠리스로 공격한 결과는 표 1 내지 2, 제 1도에 나타내었으며, 정제된 엘. 로이테리 우레아제로 면역화시킨 후, 에이치. 펠리스로 공격한 결과는 표 3 내지 4, 제 2도에 나타내었다. 정제된 엘. 퍼멘툼 우레아제 A, B 및 C 소단위로 면역화시키고 에이치. 펠리스로 공격한 결과는 표 5 및 6에 나타내었으며, 정제된 엘. 로이테리 우레아제 A, B 및 C 소단위로 면역화시키고 에이치. 펠리스로 공격한 결과는 표 7 및 8에 나타내었다.

면역화	마우스 번호	시엘오 시험24h	배양물그램
CT + HF	12345678910	++++++++++	에이치. 펠리스에이치. 펠리스에이치. 펠리스에이치. 펠리스에이치. 펠리스에이치. 펠리스에이치. 펠리스에이치. 펠리스에이치. 펠리스에이치. 펠리스
LF 음파처리물	11121314151617181920	0000000000	0000000000
LF 음파처리물 + HF	21222324252627282930	++00+0+0++	에이치. 펠리스에이치. 펠리스00에이치. 펠리스0에이치. 펠리스0에이치. 펠리스에이치. 펠리스

LF 우레아제	31323334353637383940	0000000000	0000000000
LF 우레아제 + HF	41424344454647484950	+00+0000+0	에이치. 펠리스00에이치. 펠리스00에이치. 펠리스0에이치. 펠리스0

면역화	공격	감염율(%)	보호율(%)
LF 음파 처리물	에이치. 펠리스	7/10 (70%)	3/10 (30%)
LF 우레아제	에이치. 펠리스	4/10 (40%)	6/10 (60%)
CT	에이치. 펠리스	10/10 (100%)	0/10 (0%)
* CT 대조군과 비교시 p=0.211 (투 테일 피셔(two tailed fisher) 정밀 시험)** CT 대조군과 비교시 p=0.0108 (투 테일 피셔 정밀 시험)

상기 B항에 기술된 실험의 결과를 나타낸 표 1 내지 4에서, h는 시간을,

우레아제+HF는 마우스를 우레아제(히드록시아파타이트에 커플링된 상태, 콜레라 독소도 함께 투여됨)로 면역화시킨 다음 에이치. 펠리스로 공격하였음을, 우레아제는 마우스를 우레아제(히드록시아파타이트에 커플링된 상태, 콜레라 독소도 함께 투여됨)로 면역화시키고 공격은 하지 않았음을, CT+HF는 마우스를 콜레라 독소로 허위 면역화시키고 에이치. 펠리스로 공격하였음을, LF 음파처리물+HF는 마우스를 엘. 퍼멘툼 음파처리물과 콜레라 독소로 면역화시키고 에이치. 펠리스로 공격하였음을, 그리고 LF 음파처리물은 마우스를 엘. 퍼멘툼 음파처리물과 콜레라 독소로 면역화시키고 공격하지 않았음을, LR 음파처리물+HF는 마우스를 엘. 로이테리 음파처리물과 콜레라 독소로 면역화시키고 에이치. 펠리스로 공격하였음을, 그리고 LR 음파처리물은 마우스를 엘. 로이테리 음파처리물과 콜레라 독소로 면역화시키고 공격하지 않았음을 의미한다.

위장 피검 조직 시엘오 시험 및 에이치. 펠리스 배양물의 그램 염색에 의해 수득된, B항에 기술된 실험의 결과는 표 2에 나타내었다. 감염은 우레아제 시험 또는 배양물의 그램 염색을 포함하여, 에이치. 펠리스에 의한 하나 이상의 콜로니와 표지를 갖는 마우스로 정의되었다.

표 1 및 2에서 알 수 있는 바와 같이, 엘. 퍼멘툼 음파처리물 또는 콜레라 독소를 사용하여 면역화시킨 경우와 비교할 때 엘. 퍼멘툼 우레아제를 사용하여 경구 면역화시킨 경우가 에이치. 펠리스 공격에 대해 통계학적으로 의미있는 보호율을 나타낸다. 표 2를 보면, 엘. 퍼멘툼 음파 처리물로 면역화시킨 동물 중 7마리 및 콜레라 독소로 면역화시킨 동물 중 10마리에 비하여, 엘. 퍼멘툼 우레아제로 면역화시킨 총 10마리의 동물 중 단 4마리만이 감염되었음을 알 수 있다. 엘. 퍼멘툼 음파 처리물로 면역화되고 에이치. 펠리스에 의해 공격받은 동물에 있어서의 30%, 및 콜레라 독소로 면역화되고 에이치. 펠리스에 의해 공격받은 동물에 있어서의 0%만이 보호되었음에 비하여, 엘. 퍼멘툼 우레아제로 면역화시킨 동물에 있어서는 60%가 에이치. 펠리스의 공격으로부터 보호되었다. 다시 말해서, 에이치. 펠리스에 노출된 대조 마우스의 100%가 병원체에 의해 감염되었음에 반해, 이와는 대조적으로 에이치. 펠리스에 노출되기 28일 전에 엘. 퍼멘툼 우레아제로 면역화된 마우스에 있어서는 감염율이 단지 40%에 지나지 않았다. 이는 감염율에 있어서의 상당한 감소를 의미한다(대조 마우스와 비교하여, 피셔 정밀 시험에서 p=0.0108). 마우스를 엘. 퍼멘툼 음파 처리물로 경구 면역화시킨 경우, 감염율은 70%였다(이는 대조군에 비하여 상당한 수치가 아님). 엘. 퍼멘툼 우레아제를 사용하여 수득한 보호율은 예상치 못한 것이었으며, 엘. 퍼멘툼 음파 처리물을 사용하여 얻은 결과에 기초하여 예견될 수 없었던 것이다.

표 3 및 4에서 알 수 있는 바와 같이, 엘. 퍼멘툼처럼 산성 우레아제를 생산하는 엘. 로이테리에 관해서도 유사한 결과가 관찰되었다. 엘. 로이테리 음파 처리물로 면역화되고 에이치. 펠리스에 의해 공격받은 동물에 있어서의 30%, 및 콜레라 독소로 면역화되고 에이치. 펠리스에 의해 공격받은 동물에 있어서의 0%가 보호되었음에 비하여, 엘. 로이테리 우레아제로 면역화시킨 동물에 있어서는 50%가 에이치. 펠리스의 공격으로부터 보호되었다. 다시 말해서, 에이치. 펠리스에 노출된 대조 마우스의 100%가 병원체에 의해 감염되었음에 반해, 이와는 대조적으로 에이치. 펠리스에 노출되기 28일 전에 엘. 로이테리 우레아제로 면역화된 마우스에 있어서는 감염율이 50%이었다. 이는 역시 감염율에 있어서의 통계학적으로 의미있는 보호율이다(대조 마우스와 비교하여 피셔 정밀 시험에서 p=0.0325).

면역화	마우스 번호	시엘오 시험24h	배양물그램
CT + HF	12345678910	++++++++++	에이치. 펠리스에이치. 펠리스에이치. 펠리스에이치. 펠리스에이치. 펠리스에이치. 펠리스에이치. 펠리스에이치. 펠리스에이치. 펠리스에이치. 펠리스

LR 음파처리물	11121314151617181920	0000000000	0000000000
LR 음파처리물 + HF	21222324252627282930	0000000000	에이치. 펠리스0에이치. 펠리스00에이치. 펠리스에이치. 펠리스0에이치. 펠리스0
LR 우레아제	31323334353637383940	0000000000	0000000000

LR 우레아제 + HF

41424344454647484950

00+00++00+

00에이치. 펠리스00에이치. 펠리스에이치. 펠리스00에이치. 펠리스

면역화	공격	감염율(%)	보호율(%)
LR 음파 처리물	에이치. 펠리스	7/10 (70%)	3/10 (30%)
LR 우레아제	에이치. 펠리스	5/10 (50%)	5/10 (50%)
CT	에이치. 펠리스	10/10 (100%)	0/10 (0%)
* CT 대조군과 비교시 p=0.211 (투 테일 피셔 정밀 시험)** CT 대조군과 비교시 p=0.0325 (투 테일 피셔 정밀 시험)

위장 피검물 우레아제 시험에 기초하여 얻은, C항에 기술된 실험(정제 우레아제 소단위)의 결과를 표 5 내지 8에 나타내었다. 표 5 내지 8에서, CT는 콜레라 독소를 의미하고, 우레아제 A는 정제 우레아제 A 소단위를 의미하고, B는 정제 우레아제 B 소단위를 의미하고, C는 정제 우레아제 C 소단위를 의미하며, HAP는 히드록시아파타이트 결정을 의미한다.

상기 표 5 및 6에 나타낸 결과로부터, 정제 엘. 퍼멘툼 우레아제 A 소단위 또는 콜레라 독소를 사용하여 얻은 결과를 정제 엘. 퍼멘툼 우레아제 B 및 C 소단위 또는 콜레라 독소를 사용하여 얻은 결과와 비교하여 정제 엘. 퍼멘툼 우레아제 A 소단위를 사용하는 경구 면역화의 경우, 에이치. 펠리스 공격에 대해 통계학적으로 유의 수준의 보호를 얻을 수 있음을 알 수 있다. 표 6에 있어서, 공격 후 14일에 우레아제의 엘. 퍼멘툼 C 소단위로 면역된 10마리 모두 및 콜레라 독소로 면역된 동물 10마리 모두가 감염되었으며 우레아제 B 소단위로 면역된 10마리의 군에서는 9마리가 감염된 것에 비하여 우레아제 A 소단위로 면역된 총 10마리의 군에서는 단지 4마리만 감염되었음을 알수 있다. 표 6은 정제 엘. 퍼멘툼 우레아제 C 소단위 및 콜레라 독소로 면역된 후 에이치. 펠리스 공격을 받은 동물의 0%가 보호되고 엘. 퍼멘툼 우레아제 B 소단위로 면역된 후 에이치. 펠리스 공격을 받은 동물의 10%가 보호된 것에 비하여, 우레아제 A 소단위로 면역된 경우 에이치. 펠리스 공격으로부터 60%가 보호된다는 것을 나타낸다. 즉, 에이치. 펠리스로 공격받은 마우스 대조군의 100%가 감염된 것과는 대조적으로 정제 엘. 퍼멘툼 우레아제 A 소단위로 면역된 마우스의 경우 감염율이 단지 40%였다. 이는 마우스 대조군에 비하여 현저히 감염 감소(p=0.0108, 피셔 정밀 시험)를 나타내는 것이다.

면역화	마우스 번호	시엘오 시험24h	배양물그램
CT	12345678910	++++++++++	에이치. 펠리스에이치. 펠리스에이치. 펠리스에이치. 펠리스에이치. 펠리스에이치. 펠리스에이치. 펠리스에이치. 펠리스에이치. 펠리스에이치. 펠리스
LF 우레아제 A + HAP + CT	11121314151617181920	0+00+0++00	0에이치. 펠리스00에이치. 펠리스0에이치. 펠리스에이치. 펠리스00
LF 우레아제 B + HAP + CT	21222324252627282930	+++0++++++	에이치. 펠리스에이치. 펠리스에이치. 펠리스0에이치. 펠리스에이치. 펠리스에이치. 펠리스에이치. 펠리스에이치. 펠리스에이치. 펠리스

LF 우레아제 C + HAP + CT

31323334353637383940

++++++++++

에이치. 펠리스에이치. 펠리스에이치. 펠리스에이치. 펠리스에이치. 펠리스에이치. 펠리스에이치. 펠리스에이치. 펠리스에이치. 펠리스에이치. 펠리스

면역화	공격	감염율(%)	보호율(%)
LF 우레아제 A 소단위	에이치. 펠리스	4/10 (40%)	6/10 (60%)
LF 우레아제 B 소단위	에이치. 펠리스	9/10 (90%)	1/10 (10%)
LF 우레아제 C 소단위	에이치. 펠리스	10/10 (100%)	0/10 (0%)
CT	에이치. 펠리스	10/10 (100%)	0/10 (0%)
* CT 대조군과 비교시 p=1.0108 (투 테일 피셔 정밀 시험)

엘. 퍼멘툼 우레아제로 관측된 보호가 전적으로 우레아제 A 소단위 면역화에 의해 제공된 결과이며, B 및 C 소단위는 사익의 효과가 없다는 사실은 정제 우레아제를 사용한 본 발명자들의 실험에 기초하여서는 예상할 수 없었다. 따라서, 보호성 면역 반응의 발달에 있어서 우레아제의 두 구조 소단위의 역할에 대한 사익 설명은 신규한 것이다. 또한, 효소적으로 불활성인 정제 우레아제 A 소단위를 사용하여 얻는 보호는 우레아제의 비독성 형태가 헬리코박터 감염에 대한 경구용 백신으로서 사용될 수 있음을 시사한다. 더욱이 상기 결과는 활성부위의 인지가 보호를 위해 요구되지 아니하며, 따라서 불활성 우레아제 A 소단위는 천연 우레아제의 촉매 부위를 인지하고 방해하는 항체를 유도하지 않을 가능성이 크다는 것을 강하게 암시한다.

표 8에 있어서, 정제 엘. 로이테리 우레아제 소단위를 사용하여 얻은 결과로부터, 정제 엘. 로이테리 우레아제 B 및 C 소단위 또는 콜레라 독소를 사용하여 얻은 결과와 비교하여 정제 엘. 로이테리 우레아제 A 소단위를 사용하는 경구 면역화의 경우, 에이치. 펠리스 공격에 대해 통계학적으로 유의 수준의 보호를 얻을 수 있음을 알 수 있다. 공격후 14일에 우레아제의 엘. 로이테리 B, C 또는 콜레라 독소로 면역된 동물 10마리 모두가 감염된 것에 비하여 우레아제 A 소단위로 면역된 동물 10마리의 군에서는 단지 5마리만 감염되었음을 알 수 있다. 즉, 에이치. 펠리스로 공격받은 마우스 대조군의 100%가 감염된 것과는 대조적으로 정제. 엘. 로이테리 우레아제 A 소단위로 면역된 마우스의 경우 감염율이 50%였다. 이는 마우스 대조군에 비하여 현저한 감염 감소(p=0.0325, 피셔 정밀 시험)를 나타내는 것이다.

면역화	마우스 번호	시엘오 시험24h	배양물그램
CT	12345678910	++++++++++	에이치. 펠리스에이치. 펠리스에이치. 펠리스에이치. 펠리스에이치. 펠리스에이치. 펠리스에이치. 펠리스에이치. 펠리스에이치. 펠리스에이치. 펠리스
LR 우레아제 A + HAP + CT	11121314151617181920	+00++0+00+	에이치. 펠리스00에이치. 펠리스에이치. 펠리스0에이치. 펠리스00에이치. 펠리스
LR 우레아제 B + HAP + CT	21222324252627282930	++++++++++	에이치. 펠리스에이치. 펠리스에이치. 펠리스에이치. 펠리스에이치. 펠리스에이치. 펠리스에이치. 펠리스에이치. 펠리스에이치. 펠리스에이치. 펠리스

LR 우레아제 C + HAP + CT

31323334353637383940

++++++++++

에이치. 펠리스에이치. 펠리스에이치. 펠리스에이치. 펠리스에이치. 펠리스에이치. 펠리스에이치. 펠리스에이치. 펠리스에이치. 펠리스에이치. 펠리스

면역화	공격	감염율(%)	보호율(%)
LR 우레아제 A 소단위	에이치. 펠리스	5/10 (40%)	5/10 (50%)
LR 우레아제 B 소단위	에이치. 펠리스	10/10 (100%)	0/10 (0%)
LR 우레아제 C 소단위	에이치. 펠리스	10/10 (100%)	0/10 (0%)
CT	에이치. 펠리스	10/10 (100%)	0/10 (0%)
* CT 대조군과 비교시 p=0.0325 (투 테일 피셔 정밀 시험)

또한, 본 발명은 헬리코박터 감염 예방에 적합한 백신 조성물을 제공한다. 조성물은 헬리코박터 감염에 대한 보호 면역 반응을 숙주에서 유발시킬 수 있는, 제약학상 허용되는 담체 또는 희석제 중에 포함된 유효량의 우레아제 항원, 바람직하게는 정제 엘. 퍼멘툼 우레아제, 정제 엘. 로이테리 우레아제, 정제 엘. 퍼먼툼 우레아제 소단위 또는 정제 엘. 로이테리 우레아제 소단위로 이루어진다.

본 발명의 백신은 당업자에 의해 용이하게 결정되는 양으로 투여한다. 즉, 성인의 경우 적합한 투여량은 10㎍ 내지 100㎎, 바람직하게는 50㎍ 내지 50㎎이다. 유사 투여량이 소아에게도 적용된다. 인체에서의 담체계는 위의 산성 환경으로부터 항원을 보호하는 장내 방출 캡슐제 및 융합 단백질로서 불용성 형태의 우레아제 항원을 포함한다. 백신은 성인 또는 소아에서는 1차 예방제로서, 감염된 숙주에서는 에이치. 필로리의 성공적인 제거 후 2차 예방제로서, 또는 에이치. 필로리 제거의 기여에 민감한 숙주의 면역 반응을 유도할 목적의 치료제로서 투여할 수 있다.

상기 언급한 바와 같이, 적합한 점막 보조제는 콜레라 독소이다. 이외의 뮤라밀디펩타이드 또는 그의 유도체, 콜레라 독소의 B 소단위를 포함하는 콜레라 독소의 비독성 유도체, 및/또는 우레아제 항원과 콜레라 독소 또는 그의 B 소단위와의 접합체 또는 유전 공학적 융합체가 사용될 수 있다. 기타 적합한 운반 방법으로는 생분해성 미소 캡슐 또는 면역 자극 복합체(ISCOM'S) 또는 리포좀, 바이러스 또는 세균과 같은 유전 공학적으로 감쇄된 생 벡터 및 재조합(키메릭) 바이러스형 입자, 예를 들면 블루텅(bluetongue)을 들 수 있다. 사용되는 점막 보조제의 양은 사용되는 점막 보조제의 유형에 의존한다. 예를 들면, 점막 보조제가 콜레라 독소인 경우, 5㎍ 내지 50㎍, 바람직하게는 10㎍ 내지 35㎍의 양이 적합하다. 미소 캡슐형으로 사용되는 경우, 사용량은 목적 투여량을 달성하기 위해 미소 캡슐의 기질 내에 사용된 양에 의존한다. 상기 양의 결정은 당업자의 수준내에서 가능하다. 본 발명에 따른 백신에 대한 담체로서는 장용피 캡슐 및 폴리악티드-글리콜리드(polyactide-glycolide)소구체가 적합하다. 희석제로는 0.2 N NaHCO₃및/또는 식염수가 적합하다.

입자상 히드록실화 칼슘 포스페이트(HCP)는 점막 표면에 도포하기 위한 엘. 퍼멘툼 우레아제 또는 엘. 로이테리 우레아제용 담체로서 특히 유용하다. 엘. 퍼멘툼 우레아제-히드록실화 칼슘 포스페이트 접합체 또는 엘. 로이테리 우레아제-히드록실화 칼슘 포스페이트 접합체는 폴리 Ig 면역 반응이 일어나는 상피세포를 가로질러 이동되는 것으로 생각된다. 바람직하게는, 히드록실화 칼슘 포스페이트는, 특히 상피 세포를 가로질러 이동하도록 분화된 세포(M 세포)에 의해 상피 세포를 가로질러 이동하기에 적합한 미소입자 형태이다. 히드록실화 칼슘 포스페이트의 바람직한 형태는 시판되는 결정성 히드록실화 칼슘 포스페이트 Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂인 히드록시아파타이트이다.

통상적으로, 시판되는 히드록시아파타이트는 정상 골조직 중에 있는 무기 히드록시아파타이트와 화학적 및 물리적으로 유사한 플레이트형 결정체로 이루어진다. 기본골에서 유래된 칼슘/인 영양 보조제의 존재에 의해 입증된 바와 같이 섭취될 수 있도록 고안된 히드록시아파타이트의 섭취는 안전하다. 시판용 고분해성 히드록시아파타이트(CalBioChecm사 제품)는 다양한 크기의 결정으로 이루어져 있다. 길이가 1㎛를 넘는 결정은 M세포에 의해 흡수될 가능성이 없다. 따라서, 본 발명에 있어서, 시판용 히드록시아파타이트 결정을 예를 들면 음파 처리에 의한 것과 같이 작고, 비교적 균일한 결정성 단편으로 분쇄하여 사용한다. 바람직하게는 히드록시아파타이트의 상당한 부분이 약 0.01 내지 0.0㎛이 단편으로 존재한다. 단편화는 표준 방법을 사용하는 전자 현미경법 또는 광산란법에 의해 측정될 수 있다.

엘. 퍼멘툼 우레아제 또는 엘. 로이테리 우레아제 항원의 바람직한 투여 방식은 경구, 비강내, 직장내 또는 안구투여이다. 경구 투여는 장 점막을 포함한 다른 G. I. 점막으로 전달시킬 수 있다.

본 발명의 백신은 에어로졸, 현탁제, 캡슐제 및/또는 좌제 형태로 점막 표면에 투여될 수 있다. 투여 방법은 당업자에게는 명백할 것이다.

또한, 본 발명은 헬리코박터 감염에 대한 인간을 포함한 포유동물의 수동적인 면역화에 관한 것이다. 이는 유효량의 우레아제 특이적 항체, 바람직하게는 유효량의 엘. 퍼멘툼 우레아제 또는 엘. 로이테리 우레아제 특이적 IgA 모노클로날 항체를 환자의 점막 표면에 투여함으로써 달성할 수 있다.

엘. 퍼멘툼 우레아제 또는 엘. 로이테리 우레아제는 보호 면역의 유도에 관련된 항원을 나타내므로, 본 발명의 또 다른 면은 우레아제 기재 백신이 투여된 인체의 면역반응을 측정하거나 각 개인의 면역성 또는 민감성(즉, 백신 접종이 요구됨) 여부를 결정하기 위한 진단시약으로서의 에이치. 필로리 우레아제 용도이다. 또한, 본 발명은 헬리코박터 면역성의 진단, 헬리코박터에 대한 민감성의 평가, 및 백신에 대한 면역 반응의 확인을 위한 검정 시험 및 키트를 구성하기 위한 우레아제 및 우레아제 특이적 항체의 용도에 관한 것이다.

본 발명을 다음의 비제한적 실시예를 참고로 더 상세히 기재한다.

a) 세균균주

에이치. 펠리스, 엘. 퍼멘툼 및 엘. 로이테리는 모두 표준균주로 에이티시시(ATCC, American Type Cluture Collection)로부터 구입하였다.

b) 세균 배양

에이치. 펠리스 배양 - 세균을 미호기성 조건하에 37℃에서 3일간 트립티케이스소이 2(Trypticase soy Ⅱ), 5%의 양의 혈액이 함유된 한천 평판상에서 배양시켰으며, 10% 태 송아지 혈청을 함유하는 트립티케이스 소이 2 액체 배지상에서 배양하였다. 액체 배양의 경우, 세균을 미호기성 조건하에 37℃에서 2 내지 3일 동안 진탕 배양시켰다.

엘. 퍼멘툼 및 엘. 로이테리 배양 - 세균을 엠알에스(MRS) 배지 혐기성 조건하에서 배양시켰으며, 세균을 병 중에서 37℃에서 2일 동안 배양하여 액체 배양물을 생성시켰다.

정량화 - 세균의 양을 660nm에서 BHI 용액의 광학농도(1 광학농도 단위는 10⁸세균에 대응함)에 의해 측정하였다.

c) 음파 처리물의 제조

엘. 퍼멘툼 또는 엘. 로이테리를 0.15 M NaCl 중의 액체 배양물로부터 수집하고, 4℃에서 3000g로 5분간 회전시켰다. 펠렛을 NaCl 10㎖ 중에 재현탁시키고, 3분간 초음파 처리하였다. 단백질의 양을 로우리 법(Lowry method)에 의해 평가하였다.

d) 히드록시아파타이트와 면역 항원의 커플링

면역 항원(우레아제 또는 그의 소단위)을 4℃에서 히드록시아파타이트와 함께 1시간 동안 배양시켰다. 히드록시아파타이트 1.0㎎을 마우스 한 마리당 30㎍의 면역 항원에 대해 사용하였다. 배양 말기에, 콜레라 독소 10㎍을 최종적 200㎕의 PBS 중에 첨가하였다.

실시예 1

a) 추출

본 연구에 사용된 엘. 퍼멘툼 및 엘. 로이테리는 병 중에서 37℃에서 2일 동안 배양하여 액체 배양물을 생성시켰다. 배양 후 세균을 티 완충액(1mM 2-머캅토에탄올, 50mM Tris-HCl, pH 7.0) 중에 수확하고 와동 회전시키고 다시 원심분리하여 상등액을 수득하였다. 상등액에 찬 에탄올을 30%가 되도록 가한 후 원심분리하여 침전물을 티 완충액에 녹였다.

b) 우레아제의 정제

용액을 이동상으로서 0.1M을 포함한 티 완충액을 사용한 토요펄 HW-55F 칼럼(Toyo Sodia Mfg) 상에서 크로마토그래피시켰다. 강한 우레아제 활성을 나타내는 13ml의 수집 분획을 함께 합해 농축하고, 4℃에서 티 완충액 1ℓ에 대해 밤새 투석한 후, 이동상으로서 티 완충액을 사용하여 DEAE-Sepharose CL-6B 칼럼(Pharmacia)상에서 크로마토그래피시켰다. 이 분획들을 0 내지 1M NaCl 농도 구배로 용출시켰다. 강한 우레아제 활성을 갖는 14㎖의 수집 분획을 합하여, 4℃에서 피 완충액(1mM 2-머캅토에탄올, 5mM 인산칼륨 완충액, pH 7.0) 2ℓ에 대해 밤새 투석한 후, 이동상으로서 피 완충액을 사용하여 히드록시우레아를 고정시킨 Affi-Gel 202 칼럼(Bio-Rad) 상에서 크로마토그래피시켰다. 100mM의 피 버퍼로 용출시켜, 강한 우레아제 활성을 갖는 15㎖의 수집 분획을 합한 후, 25mM 이미다졸-하이드로클로라이드 완충액(pH 7.4) 1ℓ에 대해 밤새 투석했다. 25mM 이미다졸-하이드로클로라이드 완충액(pH 7.4)을 이동상으로서 PBE 94(Pharmacia) 칼럼상에서 크로마토포커싱시켰다. Polybuffer 74(Pharmacia)의 9배 희석액으로 용출시켜, pH 4.2에서 용출되는 강한 우레아제 활성 분획 4㎖을 합하여, 피 버퍼 1ℓ에 대해 밤새 투석하고, Affi-Gel 202 칼럼상에서 다시 크로마토그래피하여 SDS 겔을 걸고, 쿠마시(Coomassie) 염색하였다. MW-68, MW-16 및 MW-8.8 kDa에 대응하는 3개의 명확한 띠를 나타내는 5mM의 분획을 합쳐서 정제 우레아제로서 간주하였다.

실시예 2(B항 참조)

면역화 연구에 사용된 마우스를 위내 면역화에 앞서 에테르로 약하게 마취시켰다. 이어서, 음파 처리물 또는 정제 우레아제, 히드록시아파타이트 및 콜레라 독소를 PBS 중에 현탁시키고, 200㎕를 경구투여기를 사용하여 각각의 마우스의 위로 전달시켰다. 이 방법은 경구 면역화 방법으로서 인용될 것이다. 3개의 경구 면역화 프로토콜이 평가되었다. 이들을 이하에 기재한다.

프로토콜 B1-정제 우레아제를 사용한 백신 접종

생후 5주된 BALB/c 암컷 마우스(20)를 제 0일, 7일, 14일 및 21일에 정제 에이치. 필로리 우레아제 30㎍ 및 히드록시아파타이트 1㎎ 및 콜레라 독소 10㎍을 사용하여 경구 면역화시켰다. 10마리의 마우스를 제 28일, 30일 및 32일에 한천 배지에서 배양된 5×10⁷및 10⁸의 에이치. 펠리스를 사용하여 공격하였다.

프로토콜 B2-헬리코박터의 음파 처리물을 사용한 백신 접종

생후 5주된 BALB/c 암컷 마우스(20)를 제 0일, 7일, 14일 및 21일에 엘. 퍼멘툼 음파 처리물 또는 엘. 로이테리 음파 처리물 2㎎의 용액을 사용하여 경구 면역화시켰다. 10마리의 마우스를 28일, 30일 및 32일에 5×10⁷및 10⁸의 에이치. 펠리스를 사용하여 공격하였다.

크로토콜 B3-대조군

생후 5주된 BALB/c 암컷 마우스(20)를 제 0일, 7일, 14일 및 21일에 히드록시아파타이트 1㎎ 및 콜레라 독소 10㎍을 사용하여 경구 면역화시켰다. 10마리의 마우스를 제 28일, 30일 및 32일에 5×10⁷및 10⁸의 에이치. 펠리스로 공격하였다.제 39일에 모든 마우스를 죽이고, 위장으로부터 생검 시료를 취하였다.

보호 및 평가

보호를 평가하기 위해, 생검 조직을 시엘오 검사(CLO test : Delta West Pty Ltd)에 의해 공급원의 지시에 따라 우레아제 활성에 대해 탐색하였다. 생검 조직을 19게이지 주사침으로 시엘오 시험 겔에 침지시켜, 37℃에서 3시간 배양 후 실온에 보관하며 색의 변화를 관찰하여, 24시간 후에도 변색되지 않고 노란색으로 남아 있는 경우에는 음성으로 판정한다. 또한, 생검 조직을 에이치. 펠리스 존재하에 배양시키고, 그람 염색법으로 평가하였다. 위동 생검 조직을 균질화시키고, 0.15 M NaCl 중에 희석(1:10 및 1:1,000)시키고, 혈액 평판상에 압인 후, 미호기성 조건하에 37℃에서 4 내지 10일간 배양하였다.

실시예 3 (C항 참조)

면역화 연구에 사용된 마우스르루이내 면역화에 앞서 에테르로 약하게 마취시켰다. 이어서, 히드록시아파타이트가 결합되고 콜레라 독소가 보충된, 정제 엘, 퍼멘툼 우레아제 A, B 및 C 소단위 또는 정제 엘. 로이테리 우레아제 A, B 및 C 소단위 50㎍을 PBS중에 현탁시키고, 200㎕를 경구투여기를 사용하여 각각의 마우스의 위로 전달시켰다. 이 방법은 경구 면역화 방법으로서 인용될 것이다.3개의 경구 면역화 프로토콜이 평가되었다. 이들을 이하에 기재한다.

프로토콜 C1-정제 우레아제 A 소단위를 사용한 백신 접종

생후 5주된 BALB/c 암컷 마우스(20)를 제 0일, 7일, 14일 및 21일에 정제 엘. 퍼멘툼 우레아제 A 소단위 30㎍ 또는 정제 엘. 로이테리 우레아제 A 소단위 30㎍, 히드록시아파타이트 1㎎ 및 콜레라 독소 10㎍을 사용하여 경구 면역화시켰다. 각각 10마리의 마우스를 제 28일, 30일 및 32일에 한천 배지에서 배양된 5×10⁷및 10⁸의 에이치. 펠리스를 사용하여 공격하였다.

프로토콜 C2-재조합 우레아제 B 소단위를 사용한 백신 접종

생후 5주된 BALB/c 암컷 마우스(20)를 제 0일, 7일, 14일 및 21일에 재조합 에이치 필로리 우레아제 B 소단위 50㎍, 히드록시아파타이트 1㎎ 및 콜레라 독소 10㎍을 사용하여 경구 면역화시켰다. 각각 10마리의 마우스를 제 28일, 30일 및 32일에 한천 배지에서 배양된 5×10⁷및 10⁸의 에이치. 펠리스를 사용하여 공격하였다.

프로토콜 C3-대조군

생후 5주된 BALB/c 암컷 마우스(20)를 제 0일, 7일, 14일 및 21일에 히드록시아파타이트 1㎎ 및 콜레라 독소 10㎍을 사용하여 경구 면역화시켰다. 마우스를 제 28일, 30일 및 32일에 5×10⁷및 10⁸의 에이치. 펠리스를 사용하여 공격하였다.제 46일에 마우스를 죽이고, 위로부터 다수의 생검 시료를 취하였다.

보호 및 평가

보호를 평가하기 위해, 생검 조직을 시엘오 검사(CLO test : Delta West Pty Ltd)에 의해 공급원의 지시에 따라 우레아제 활성에 대해 탐색하였다. 생검 조직을 19게이지 주사침으로 시엘오 시험 겔에 침지시켜, 37℃에서 3시간 배양 후 실온에 보관하며 색의 변화를 관찰하여, 24시간 후에도 변색되지 않고 노란색으로 남아 있는 경우에는 음성으로 판정한다. 또한, 생검 조직을 에이치. 펠리스 존재하에 배양시키고, 그람 염색법으로 평가하였다. 위동 생검 조직을 균질화시키고, 0.15 M NaCl 중에 희석(1:10 및 1:1,000)시키고, 혈액 한천 평판상에 압인 후, 미호기성 조건하에 37℃에서 4 내지 10일간 배양하였다.

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본 발명은 인간을 포함한 포유류에서의 헬리코박터 감염의 예방 및 치료법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 인간을 포함한 포유류에서의 헬리코박터 감염의 예방 및 치료에 사용하기에 적합한 백신 및 위장 감염증, 만성 위염 또는 소화성 궤양과 같은 그의 후유증을 앓고 있는 인간의 치료 방법 및 위암의 예방법에 관한 것이다.

Claims (5)

1. 락토바실루스 퍼멘툼 우레아제 A 소단위 또는 락토바실루스 로이테리 우레아 제 A 소단위를 제약학상 허용되는 담체 또는 희석제와 함께 함유하여 포유 동물에서 헬리코박터 감염에 대한 보호 면역 반응을 유발시키기 위한 백신.
2. 제1항에 있어서, 상기 제제가 점막 보조제와 함께 투여되는 백신.
3. 제2항에 있어서, 상기 점막 보조제가 콜레라 독소인 백신.
4. 제1항에 있어서, 상기 제제가 히드록실화된 칼슘 포스페이트와 함께 투여되는 백신.
5. 제17항에 있어서, 상기 히드록실화된 칼슘 포스페이트가 히드록시아파타이트인 백신.

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